KR20240029062A - 항-protac 항체 및 복합체 - Google Patents

항-protac 항체 및 복합체 Download PDF

Info

Publication number
KR20240029062A
KR20240029062A KR1020247003823A KR20247003823A KR20240029062A KR 20240029062 A KR20240029062 A KR 20240029062A KR 1020247003823 A KR1020247003823 A KR 1020247003823A KR 20247003823 A KR20247003823 A KR 20247003823A KR 20240029062 A KR20240029062 A KR 20240029062A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
protac
gne987
cells
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020247003823A
Other languages
English (en)
Inventor
마르셀 리커
세바스찬 예거
니콜라스 라슈
도린 코에닝
크리스티안 슈뢰터
헨리크 슈나이더
Original Assignee
메르크 파텐트 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메르크 파텐트 게엠베하 filed Critical 메르크 파텐트 게엠베하
Publication of KR20240029062A publication Critical patent/KR20240029062A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39583—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials not provided for elsewhere, e.g. haptens, coenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Abstract

본 발명은 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)의 VHL 리간드 분해 모이어티(데그론) 및 임의적으로 표적 단백질에 결합할 수 있는 단일특이성 또는 이중특이성 항체, 또는 항체 단편 또는 그의 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 융합 단백질과 PROTAC의 복합체(PAX) 뿐만 아니라, 이들의 생산 방법, 및 이들 각각의 의학적 및 비의학적 용도에 관한 것이다.

Description

항-PROTAC 항체 및 복합체
본 발명은 단백질분해 표적화 키메라(proteolysis targeting chimera)(PROTAC)의 VHL 리간드 분해 모이어티(데그론(degron)) 및 임의적으로 표적 단백질에 결합할 수 있는 단일특이성 또는 이중특이성 항체, 또는 항체 단편 또는 그의 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체, 또는 항체 단편 또는 그의 융합 단백질과 PROTAC의 복합체(PAX) 뿐만 아니라, 이들의 생산 방법, 및 이들 각각의 의학적 및 비의학적 용도에 관한 것이다.
1. 원치 않는 단백질의 분해 - PROTAC
세포 유지 및 정상적인 기능은 세포 단백질의 분해를 제어해야 한다. 예를 들어, 조절 단백질의 분해는 DNA 복제, 염색체 분리 등과 같은 세포 주기의 사건을 촉발한다. 따라서, 이러한 단백질 분해는 세포의 증식, 분화 및 사멸에 영향을 미친다. 단백질 억제제는 세포 내 단백질 활성을 차단하거나 감소시킬 수 있지만, 단백질 분해는 활성을 감소시키거나 표적 단백질을 완전히 제거하는 또 다른 가능성이다. 그러므로, 세포의 단백질 분해 경로를 활용하면 단백질 활성을 감소시키거나 제거하는 수단을 제공할 수 있다. 세포의 주요 분해 경로 중 하나는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템으로 알려져 있다. 이 시스템에서, 단백질은 프로테아좀 분해를 위해, 단백질에 결합하고 유비퀴틴 분자를 단백질에 전달하는 E3 유비퀴틴 리가제에 의해 표지된다. E3 유비퀴틴 리가제는, 유비퀴틴을 단백질로의 E3 유비퀴틴 리가제 촉매화된 전달에 이용가능하게 만드는 E1 및 E2 유비퀴틴 리가제를 포함하는 경로의 일부이다. 목적하는 단백질에 대한 이러한 분해 경로를 이용하기 위해 PROTAC이 개발되었다. PROTAC은 목적하는 단백질이 유비퀴틴화되고 분해를 위해 표지되도록 E3 유비퀴틴 리가제를 목적하는 단백질과 근접하게 유지할 수 있다. PROTAC은 E3 유비퀴틴 리가제에 결합하는 구조적 모티프 및 분해하려는 단백질에 결합하는 또 다른 모티프를 포함하는 이종이작용성 분자이다. 이러한 기들은 전형적으로 링커로 연결된다.
약 600개의 E3 리가제 중 단지 적은 부분만이 표적화된 단백질 분해, 즉 MDM2, 세포자멸 단백질 억제제(IAP), HECT 및 RBR 계열 구성원, RNF4, DCAF16, EAP1-Nrf2, Von-Hippel-Lindau(VHL) 및 Cereblon(CRBN)(마지막 2가지가 가장 큰 역할을 함)에 성공적으로 적용되었다. VHL은 하이드록실화된 HIF-1α에 단단히 결합하는 안정된 E3 리가제 기질 수용체이다. HIF-1α의 하이드록실프롤릴 결합 부위 주위의 펩티드 구조에 기반하여, 키메라 단백질 분해제(degrader)를 생성하기 위해 성공적으로 적용된 더 많은 약물 유사 소분자 리간드가 유도되었다(문헌[Shanique, A. and Crews, C., J. Biol. Chem 296 (2021) 100647]).
널리 적용되는 리간드는 VH032(도 1A) - 강한 친화도 하에 VHL에 결합하는 VHL 리간드이다(문헌[Galdeano, C. et al. J. Med. Chem. 57 (2014) 8657-8663]). VH032는 특히 아세틸기의 치환을 허용하므로(문헌[Ciulli, A 및 Ishida, T. SLAS 7Discovery 26 (2021) 484-502]) VH298과 같은 추가 VHL 리간드의 개발의 길을 열었다(문헌[Soares, P. et al. J. Med. Chem. 61 (2018) 599-618]).
CRBN 리간드로서 탈리도마이드의 작용 방식이 밝혀짐에 따라, CRBN은 표적화된 단백질 분해에 적용할 수 있게 되었다. 다양한 표적 단백질이 CRBN의 결합에 의해 이미 분해되었다(문헌[Shanique, A. and Crews, C., J. Biol. Chem. 296 (2021) 100647]).
키메라 분해제를 사용하여 전술한 E3 리가제를 결합시킴으로써, 수많은 단백질에 대해 표적화 단백질 분해가 이미 달성되었다. 예로는 CRBN, VHL, Tau, DHODH, FKBP12, AR, ERα, RAR, CRABP-II, ALK, CK2, CDK8 및 CDK9, BTK, PI3K, TBK1, FLT3, BTK, RTK, 예를 들면, EGFR, HER2 및 cMET, ERK1 및 ERK2, BCR-ABL, RIPK2, BCL6, PCAF/GCN5, BRD4 및 HDAC6, TRIM24, SIRT2, BRD9가 포함된다(문헌[Scheepstra, M., Comput. Struct. Biotec. 17 (2019) 160-176]; US 2018/0125821호; US 2015/0291562 호; US 2017/0065719 A1호).
종합적으로, 이종이작용성 분해제의 조립을 위한 많은 전략이 있다. 한 예(US 2017/0065719 A1호)에서, 분해제는 주로 활성화된 카복실 작용기와 아미드의 축합 반응에 의해 합성되었다. 그러므로, VHL 리간드 VH032 및 그의 유도체를 링커 구조를 함유하는 활성화된 카복실산과 반응시켰다. 링커 구조는 탈보호 후 단백질 결합제의 활성화된 카복실산 작용기와 반응하는 말단 아민을 가졌다. 그러나, 합성 전략은 변형되어야 하는 리간드의 화학적 특성에 크게 의존한다. 또 다른 예에서, 7-하이드록시-탈리도마이드의 하이드록실기는 프로파길 브로마이드 또는 프로파길-토실레이트를 사용하는 알킬화 반응을 이용하여 변형되었다. 생성된 화합물은 구리(I)-촉매화된 아지드 알킨 부가환화(cycloaddition)에 의해 전체 분해제를 수득하는 데 후속적으로 사용되는 클릭 화학(click chemistry) 핸들을 가졌다(문헌[Wurz, R. P. et al. J. Med. Chem. 61 (2018) 453-461]).
안드로겐 수용체 분해 ARV-110 및 에스트로겐 수용체 분해 ARV-471(Arvinas, Inc.)은 최근 제2상에 도달한 임상 개발에서 가장 발전된 2개의 PROTAC이다. 그러나, 몇몇 이종이작용성 분해제는 BCL-XL의 PROTAC DT2216 분해제(Dialectic, Inc.) 및 IRAK4 분해제 KT474(Kymera/Sanofi S.A.)와 같은 다양한 표적에 대한 제1상 임상 개발에 이미 도달하였다.
수많은 보고된 PROTAC이 매우 효과적인 분해제이지만, 이들은 광범위한 발현 프로필을 가진 E3 리가제를 이용하기 때문에 일반적으로 조직-특이적이지는 않다. 조직-특이적 분해는 치료 범위를 최적화하고 광범위한 PROTAC에 대한 부작용을 최소화하여, 약물 또는 화학적 도구로서의 잠재력을 증가시킬 수 있다. 그러나, 제한된 조직 분포를 갖는 E3 리가제를 활용하는 PROTAC은 현재까지 보고되지 않았으며, 새로운 E3 리가제 리간드의 개발은 여전히 중요한 과제로 남아 있다(문헌[Maneiro, M. et al. ACS Chemical Biology 5 (2020) 1306-1312]). PROTAC 개발의 또 다른 과제는 마우스에서 몇 시간 범위의 짧은 순환 반감기이다(문헌[Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25]; 문헌[Burslem, G. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 140 (2018) 16428-16432]).
또한, PROTAC의 효능은 세포에 진입하여 단백질 분해를 유도하는 그의 능력을 제한하는 낮은 투과성(문헌[Klein, V. G. et al., ACS Med. Chem. Lett. 11 (2020) 1732-1738])으로 인해 종종 저해된다.
그러므로, 분해될 단백질 표적을 함유하는 세포에 대한 PROTAC의 증대되고 표적화된 전달이 당해 분야에서 계속 요구되고 있다.
이러한 요구를 해결하기 위해, 항체-약물 접합체(ADC)와 유사한 공유 항체-PROTAC 접합체를 사용하여 특정 세포에 대한 PROTAC의 전달을 증대시키려는 시도가 있었다. 이러한 구조물은 항체에 의해 부여되는 세포-표적 선택적 결합 및 향상된 약동학을 활용한다.
2. 표적 약물 전달 - 항체-약물 접합체(ADC)
ADC의 기본 개념은 다소 간단한다. 전제조건은, 예를 들어, 분자 기반에서 암세포와 건강한 세포를 구별할 수 있는 항원이다. 예를 들어, 이는 종양 세포에서 매우 상향조절되는 특정 세포 표면 수용체일 수 있다. 이러한 항원에 대한 항체는 매우 강력한 세포독성제인 "페이로드(payload)"에 대한 표적화 비히클로 작용할 수 있다. ADC를 형성하려면, 세포독성제가 페이로드의 조기 방출을 방지하기 위해 순환계에서 안정한 링커를 통해 항체에 공유적으로 부착되어야 한다. 투여 후, ADC는 환자의 신체 전체에 분포하고 종양 세포 표면의 항원에 결합한다. 이어서, 항체-항원 복합체는 세포에 내재화되고 내인성 세포내 수송 경로를 통해 리소좀으로 유도된다. 리소좀에 도달한 후, ADC는 분해되어 그의 독성 적하물을 방출한다. 이어서, 유리 독소는 그의 세포내 표적에 결합하고, 따라서 암세포의 세포자멸 및 사멸을 유도할 수 있다. 일부 경우에서, 독소는 암세포를 떠나 인접한, 이상적으로는 암성 세포에도 작용할 수 있다. 이 과정을 방관자 효과라고 하며, 그 정도는 적용된 링커 및 약물에 따라 달라진다. 다른 한편으로, 건강한 세포는, 항체가 항원을 발현하는 암세포에만 결합하여 독소를 전달해야 하기 때문에, 주로 살아남는다.
암 치료용으로 승인된 ADC로는 HER2 표적화 DM1 접합체 캐사일라(Kadcyla), 애드세트리스(Adcetris), 튜불린 억제제 MMAE를 운반하는 항-CD30 ADC 및 CD33-표적화-칼리키아마이신(Calicheamicin) ADC 마일로타그(Mylotarg)가 포함된다.
ADC의 설계는 이들이 생명공학적으로 생산된 생체분자 및 화학적으로 합성된 매우 강력한 소분자 약물로 이루어지기 때문에 여러 분야의 노력이 필요하다. 두가지 물질 모두 별도로 생산되고 나중에 매우 복잡한 하이브리드 분자로 결합된다. 따라서, 개별 성분의 설계부터 접합체의 최종 생산까지 ADC 개발의 전체 과정에는 상당한 기술적 과제가 수반된다. "항체-약물 접합체"라는 용어에 따르면, ADC의 주요 성분은 약물 및 항체이다. 그러나, 이들 물질을 커플링시키기 위해서는 mAb를 약물과 연결하는 링커가 필요하다. mAb 및 페이로드 둘 다를 고려하여, 상기 링커를 신중하게 선택하는 것은 최종 ADC의 효능 및 안전성에 결정적이다. 혈류에서, 링커는 달리 전신 표적외(off-target) 독성을 유발할 수 있는 조기 페이로드 방출을 방지하기 위해 가능한 한 안정적이어야 한다. 그러나, 일단 ADC가 표적 세포에 도달하면, 페이로드는 부착된 링커에 방해받지 않고 활성이어야 한다. 또한, 링커의 길이 및 화학적 특성은 ADC의 약동학 및 약력학에 강한 영향을 미칠 수 있다. ADC에 활용되는 링커는 주로 비절단성 및 절단성 링커로 분류된다. 비절단성 링커는 순환계 및 세포 둘 다에서 안정적인 반면, 절단성 링커는 표적 세포 내의 특정한 세포내 메커니즘에 의해 분해되도록 설계된다. 상기로부터, 주어진 ADC에 적절한 링커를 조작하는 것은 그 자체로 어려운 일이라는 것이 분명해진다.
ADC의 세 부분 - 항체, 링커 및 세포독성 페이로드 - 가 모두 최종 접합체의 핵심 특성을 결정하는 반면, 유사하게 중요한 매개변수는 이들 성분이 조립되는 방식이다. 링커 및 페이로드는 mAb에 직접 접합되는 결합된 링커-페이로드 구조로서 또는 ADC 생성 중에 연속적으로 조립되는 개별 성분으로서 화학적 합성에 의해 생산된다. 두 경우 모두에서, 소분자는 유리한 특성을 손상시키지 않고 mAb에 접합되어야 하는 데, 이는 주된 기술적 과제이다. ADC 생성 중에 제어되어야 하는 주요 매개변수는 각 항체에 접합된 링커-약물의 수(약물-대-항체 비(DAR)로 불림), 및 구조물이 부착된 항체 표면의 위치(접합 부위)이다. 두 매개변수 모두 안정성 및 약동학적 거동, 및 궁극적으로 또한 그의 독성 및 효능 프로필을 포함하여 ADC의 여러 특성에 결정적으로 영향을 미칠 수 있다. 한편으로, ADC에 사용되는 탄두(warhead)는 대부분 소수성이며 DAR이 증가하면 전체 소수성이 상당히 변경되고 최종 접합체의 단백질 안정성이 심각하게 방해될 수 있다. 다른 한편으로, 충분히 활성인 ADC에 도달하려면 효능에 따라 일정량의 약물이 필요하다. 그러나, DAR뿐만 아니라 접합 부위 및 화학도 이들 매개변수에 큰 영향을 미친다. 예를 들어, 여러 연구에서 특정 부위는 까다로운 페이로드에 대해 우수한 내성을 나타내며 항체 표면에 유리한 미세 환경 및 입체적 차폐를 제공함으로써 다른 부위보다 더 안정적인 접합체를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 개별 성분 링커, 약물 및 mAb의 유리한 조합뿐만 아니라 적합한 DAR, 접합 전략 및 접합 부위를 찾는 것이 효과적이고 안전한 치료법의 개발에 핵심이다(문헌[Dickgiesser, S. et al., Introduction to Antibody Engineering, Springer (2021) 189-214]).
3. PROTAC을 페이로드로 사용하는 ADC
ADC의 특별한 형태는 약물이 단백질 분해제로 대표되는 분해제-ADC이다. 이때, 항체에 대한 접합을 촉진하기 위해 링커가 분해제에 부착되어야 한다. 올바른 링커를 선택하는 것 이외에, 탄두, 데그론 또는 링커 부분에서 분해제 상의 적절한 부착 부위를 확인하는 것도 중요한다. 여러 출판물에서 이 개념의 타당성이 입증되었다.
한 가지 예는 조작된 시스테인에 대한 접합을 통해 HER2-표적화 항체에 공유적으로 부착된 에스트로겐 수용체 α(ERα) 분해제이다. 그러므로, ERα-표적화 모이어티 또는 XIAP 결합제 상의 프로테아제 절단성 링커를 사용하여 화학적으로 분해제를 변형시켜야 했다. 링커가 탄두에 부착된 분해제-ADC의 경우, ERα 분해가 HER2 과발현 MCF7 세포에서 달성된 반면, 모 MCF7 세포에서는 현저히 적은 분해가 관찰되었다. 추가적인 링커 옵션을 시험하였다. VHL 리간드의 하이드록시프롤릴 잔기의 하이드록실기를 활성화된 다이설파이드를 통해 HER2 항체에 접합된 카보네이트 링커로 변형시켰다. 추가로, 다이포스페이트 함유 링커를 VHL 리간드의 하이드록시프롤릴 잔기에 부착시켰다. 두 경우 모두에서, 접합체는 선택성이 결여되었다(문헌[Dragovich, P. S. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 30 (2020) 126907]).
분해제-ADC에 대한 세포내 PROTAC 표적으로서 ERα 외에, BRD4도 표적 단백질로서 집중적으로 연구되었다. 한 가지 예는 HER2-표적화 항체를 통해 BRD4 분해를 유도하는 HER2-양성 세포에 대한 BRD4 분해제의 선택적 전달을 보여준다. 분해제는 VHL 리간드의 하이드록시프롤릴 잔기에서 산-분해성 에스테르 결합을 이용하여 시스테인 접합 및 클릭 화학의 조합을 통해 접합되었다(문헌[Maneiro, M. et al. ACS Chemical Biology 5 (2020) 1306-1312]). 또 다른 예에서, BRD4 분해제 GNE987은 CLL1-표적화 항체의 조작된 시스테인에 접합되어 6의 DAR에 도달하였다. 그러므로, PROTAC은 접합을 위해 활성화된 다이설파이드를 포함하는 산-분해성 카보네이트 링커를 사용하여 변형시켰다. 접합체는 잘 허용되면서 마우스 이종이식 모델에서 PROTAC의 약동학적 프로필 및 생체내 효능을 크게 개선시켰다(문헌[Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25]).
BRD4 분해제 접합체는 2개의 추가 출판물에서 상기 기에 의해 깊이 있게 조사되었다(문헌[Dragovich, P. S. et al., J. Med. Chem. 64 (2021) 2534-2575]; 문헌[Dragovich, P. S. et al., J. Med. Chem. 64 (2021) 2576-2607]). BRD4 분해제의 다수의 접합체가 STEAP1 및 HER2 항체를 기반으로 제조되었다. 연구의 초점은 ADC와 분해제를 연결하는 이상적인 링커뿐만 아니라, 표적 단백질 리간드, E3 리가제 리간드 또는 표적 단백질 리간드와 E3 리가제 리간드 사이의 링커에 대한 상기 링커의 이상적인 부착 지점을 조사하는 것이었다. 그러므로, 링커 부착에 적합한 화학적 핸들을 혼입한 JQ1 유도체를 포함하여 여러 표적 단백질 리간드를 평가하였다. 표적 단백질과 E3 리가제 리간드 사이 링커의 경우, PEG 및 지방족 쇄 뿐만 아니라 링커 부착을 위해 혼입된 화학적 핸들을 갖는 변형을 포함한 여러 변이체를 시험하였다. 또한, 링커 부착을 허용하도록 화학적으로 변형된 VHL 리간드의 유도체를 평가하였다. 접합체는 수용체-선택적 단백질 분해를 유도할 수 있었지만, 소수만이 선택적 세포독성을 나타내었다. 상기 출판물들은 키메라 분해제와 항체의 접합의 복잡성을 강조한다. 언급된 분해제-접합체에 대해 2개의 특허 출원이 제출되었다(WO 2020/086858호; WO 2017/201449호).
그 외에도, BRD4 분해제 접합체는 HER2를 표적으로 한 특허 문헌(WO2019/140003A1호)에서도 확인되었으며, BRD4 및 PLK1의 이중 분해제가 CD33-표적화 항체에 대한 페이로드로서 조사되었다(WO2020/073930A1호). 또한, TGFβR2 분해제를 표적화 전달을 위해 HER2 및 TROP2 항체에 접합시켰다(WO2018/227018A1호; WO2018/227023A1호).
4. 표적 세포에 약물을 전달하는 비공유적 접근법
약물이 항상, 항체에 결합하거나 항체에 의해 결합될 수 있는 리간드 또는 합텐에 화학적으로 연결되어야 하는 비공유적 약물 전달에 대한 여러 접근법이 기술되었다.
예를 들어, 겜시타빈(Gemcitabine)은 항체의 여러 부위에 결합하는 친화성 리간드 4-머캅토에틸피리딘에 의해 화학적으로 변형되었다. 항체를 친화성 리간드 변형된 겜시타빈과 혼합함으로써, 표적 양성 암세포에 선택적 독성을 유도할 수 있고 변형되지 않은 항체와 필적하는 약동학적 프로필을 갖는 ADC가 조립되었다. 겜시타빈 ADC의 종양 퇴행이 마우스 이종이식 모델에서 관찰되었다(문헌[Gupta, N. et al., Nat. Biomed. Eng. 3 (2019) 917-929]).
추가로, 여러 접근법은 항암 약물 독소루비신 또는 형광단 Cy5, siRNA, GFP와 같은 단백질 및 사포린(Saporin)과 같은 소분자를 합텐 디곡시게닌으로 변형시키는 것을 이용하여 세포성 약물 전달을 촉진시켰다(문헌[Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (2011) 8194-8199]; 문헌[Schneider, B. et al., Mol. Ther. - Nucleic Acids 1 (2012) e46]; 문헌[Mayer, K. et al., Int. J. Mol. Sci 16, (2015) 27497-27507]).
더욱이, 세포독성 약물 듀오카르마이신(Duocarmycin) DM은 EGFR에 결합하는 동시에 코티닌에 결합하는 이중특이성 항체를 사용하여 EGFR-양성 세포에 전달될 수 있다. 듀오카르마이신 DM을 표적 세포에 전달하기 위해, 코티닌 C- 및 N-말단을 갖는 펩티드를 합성하고, 4개의 듀오카르마이신 DM 분자를 절단성 발린-시트룰린 링커를 통해 펩티드에 부착시켰다. 구조물은 마우스 EGFR-발현 A549 이종이식 모델에서 시험되었으며 이소타입 대조군 구조물의 항종양 효과를 초과하였다(문헌[Jin, J. et al., Exp. Mol. Med. 50 (2018), 67]). mPDGFRβ-양성 세포에 듀오카르마이신을 전달하기 위해 유사한 구조물이 사용되었다(문헌[Kim, S. et al., Methods 154 (2019) 125-135]).
다양한 다른 출판물에서는 합텐-변형 화합물 및 항-합텐 항체를 사용한 복합체화 개념에 대해 상술하고 있다(문헌[Yu, B. et al., Angew. Chemie - Int. Ed. 58 (2019) 2005-2010]; 문헌[Kim, H. et al. ., Mol. Pharm. 16 (2019) 165-172]; 문헌[Kilian, T. et al., Nucleic Acids Res., 47 (2019) e55).
비교할 만한 접근법은 표적화 약물 전달을 위한 항체와의 복합체를 조립하기 위해 단백질 A 또는 G와 같은 Fc 결합 단백질에 대한 튜불리신(Tubulysin) A의 공유 접합을 사용한다(문헌[Maso, K. et al., Eur J Pharm Biopharm 142 (2019) 49-60]).
항-합텐 항체 또는 항체에 결합하는 친화성 리간드/단백질과 함께 합텐화 화합물을 사용한 비공유적 약물 전달의 예는 많지만, 변형되지 않은 약물을 사용한 비공유적 약물 전달의 예는 거의 없다.
이러한 모든 시도에도 불구하고, 광범위하게 적용할 수 있는 표적에서 페이로드를 효과적으로 방출시키면서 PROTAC을 위한 잘 정의되고 효과적이면서 특이적인 전달 플랫폼이 여전히 필요하다.
본 발명은 단백질분해 표적화 키메라(PROTAC)의 VHL 리간드 분해 모이어티(데그론)에 결합할 수 있고, 이중특이성 항체의 경우 표적 단백질에 결합할 수 있는 단일특이성 또는 이중특이성 항체, 또는 항체 단편 또는 그의 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체의 복합체, 또는 항체 단편 또는 그의 융합 단백질, 및 PROTAC, 그의 생산 방법 뿐만 아니라, 이들 각각의 의학적 및 비의학적 용도에 관한 것이다. 이러한 PROTAC - 항체 복합체는 하기에서 "PAX"로 지칭된다.
한 실시양태에서, 표적 단백질은 PROTAC이 전달되는 표적 세포 상의 세포 표면 항원이다. 전달시, PROTAC은 표적 세포의 세포질로 방출되고 이때 분해 표적 단백질과 결합하여 세포 프로테아좀을 통해 분해를 개시한다.
공유 결합된 항체 약물 접합체(ADC)와 비교하여 PAX의 이점은 PROTAC을 항체에 연결하기 위해 특정한 제조 단계가 필요하지 않다는 것이다. 또 다른 이점은, PAX가 PROTAC 페이로드를 방출하면 PROTAC 결합 및 표적 전달(예를 들어, 이전에 전달되었던 표적 세포를 떠난 PROTAC 분자)의 새로운 주기에 대해 준비된다는 것이다.
또 다른 이점은 PAX의 PROTAC 복합체화가 환자 체내에서 PROTAC의 반감기를 연장할 것으로 예상된다는 점에서 개선된 약동학 프로필이다. PROTAC과 항-PROTAC 항체의 복합체화로 인해, 복합체 안정성이 PROTAC의 제거율(clearance)을 결정한다. PROTAC이 항체에 의해 복합체화되는 한, PROTAC은 항체의 고분자량으로 인해 신장에서 제거될 수 없다.
한 실시양태에서, 이중특이성 항체는 a) 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄(이때, 각 쇄는 하나의 가변 도메인만을 포함한다)로 이루어지는 단일특이성 2가 항체, b) 각각 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 및 상기 항체 중쇄 가변 도메인과 상기 항체 경쇄 가변 도메인 사이의 단일쇄-링커로 이루어지는 2개의 단일특이성 1가 단일쇄 항체(scFv), 임의적으로 c) 상기 scFv에 융합된 scFv (b)의 2개 이상의 추가의 복제본(copy), 및 임의적으로 d) a), b) 및/또는 c)를 연결하는 펩티드 링커를 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이성 항체는 a) 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄(이때, 각 쇄는 하나의 가변 도메인만을 포함한다)로 이루어지는 단일특이성 2가 항체, b) 각각 하나의 항체 가변 도메인으로 이루어지는 2개의 중쇄 단일 도메인(VHH) 항체, 임의적으로 c) 상기 VHHH에 융합된 VHH (b)의 2개 이상의 추가의 복제본, 및 임의적으로 d) a), b) 및/또는 c)를 연결하는 펩티드 링커를 포함한다.
당해 분야의 숙련자는 펩티드 링커의 존재 또는 그 길이가 본 발명의 성능에 영향을 미치지 않는다는 것을 이해한다. 그러나, 한 실시양태에서, 펩티드 링커는 1 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 1 내지 35개 아미노산, 더 바람직하게는 3 내지 20개 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 12 내지 18개 아미노산, 예를 들어 15개 아미노산으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 펩티드 링커는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단을 scFv 또는 VHH의 N-말단과 연결한다.
한 실시양태에서, scFv 또는 VHH는 항체 중쇄의 C-말단에 융합된다.
한 실시양태에서, 항체는 scFv 또는 VHH의 추가의 복제본을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 단일특이성 2가 항체의 가변 영역은 표적 단백질에 결합하고, scFv 또는 VHH는 PROTAC에 결합한다.
대안적인 실시양태에서, 단일특이성 2가 항체의 가변 영역은 PROTAC에 결합하고, scFv 또는 VHH는 표적 단백질에 결합한다.
한 실시양태에서, VHL 리간드는 VH032 또는 그의 유도체이다.
한 실시양태에서, 이중특이성 항체는, 표적 단백질이 세포 표면 항원, 예를 들어, 종양 항원인 것을 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 단백질은 HER2, CD33, CLL1, EGFR, CD19, CD20, CD22, B7H3(CD276), CD30, CD37, CEACAM5, cMET, MUC1, ROR1, CLDN18.2, TROP2, BCMA, CD25, CD70, CD74, CD79b, TROP2, cMET, STEAP1, NaPi2b, PSMA, 인테그린 알파(Integrin alpha)-V, FRα, MUC16, 메소텔린(Mesothelin), CEACAM5, CanAg - MUC1 당형태(glycoform), EpCAM, HER3 또는 TNC이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 표적 단백질은 HER2, CD33, CLL1 또는 EGFR이다.
그러나, 당해 분야의 숙련자는 본 발명이, 환자의 신체에 존재하는 임의의 세포와 비교하여, 표적화된 PROTAC 전달을 위한 세포의 부분집합을 확립하는 임의의 표적 단백질을 사용하여 작업할 것이라는 것을 이해한다.
본 발명의 또 다른 양태는 PAX를 그를 필요로 하는 환자에게 투여하는, 특정 표적 단백질의 분해에 민감한 질병을 치료하는 방법이다.
본원에 개시된 PAX는 다양한 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 예시적인 과증식성 장애로는 양성 또는 악성 고형 종양, 및 백혈병 및 림프성 악성종양과 같은 혈액학적 장애가 포함된다. 다른 것으로는 자가면역 장애를 포함하여 신경세포, 신경교세포, 성상세포, 시상하부, 선상, 대식세포, 상피, 간질, 배반골, 염증성, 혈관신생 및 면역학적 장애가 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 PAX를 포함하는 약학 조성물이다. 또 다른 양태에서, 상기 약학 조성물은 표적화 암 치료에 사용된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 PROTAC을 검출 및/또는 정량화하거나, 예를 들어, 제조 공정의 불순물/부산물로부터 관심 PROTAC을 정제하는 역할을 한다.
도 1: VHL 리간드 VH032 및 유도체의 화학 구조. (A) VH032의 구조. (B) VH032-기반 VHL-리간드의 마쿠쉬(Markush) 구조. (C) VH032-기반 데그론을 상이한 탄두에 연결하는 링커에 대한 상이한 출구 벡터(R1, R2, R3)를 보여주는 묘사(MZ1, AT1 및 ACBl1 탄두에 대해 예시적으로 나타냄). MIC2 항체는 출구 벡터 R1 및 R2를 허용하여 PROTAC MZ1 및 AT1의 결합을 야기한다.
도 2: 세포 표면 항원 및 PROTAC에 대한 이중특이성 융합 단백질의 아미노산 서열. 굵은 글씨: 밑줄 친 CDR 서열과 함께 항-PROTAC 항체 MIC2의 서열; 이탤릭체: 링커 서열; 밑줄: 항체 단편 서열(항-EGFR VHH 서열 또는 항-HER2 scFv)
도 3: 본 발명에 따른 다양한 가능한 BsAb 변이체의 그래픽 묘사
도 4: VH032-기반 합텐의 화학 구조
도 5: cBSA 및 huFc 및 MALDI-MS 측정으로부터 유도된 상응하는 개별 합텐에 대한 합텐-대-운반체 단백질 비
도 6: 항-VH032 항체를 확인하기 위한 하이브리도마 스크리닝에 대한 연구 계획
도 7: 친화도 측정을 위한 분석 원리. A) MIC2는 SPR 칩 상에 고정화된다. 분석물은 항체를 지나 흘러서 포획된다. PROTAC이 포획된 후, 완충액을 교체하고 PROTAC이 다시 분리될 수 있다. B) PROTAC과 항체의 결합은 신호의 증가로 관찰되는 반면 해리는 신호의 감소를 초래한다. 이것은 PROTAC MZ1에 대한 MIC2의 결합에 대해 예시적으로 나타낸 것이다.
도 8a 및 8b: SPR 분석에서 결합에 대해 시험된 VH032-기반 PROTAC
도 9: 여러 PROTAC에 대한 모 항체 MIC2와 비교한 이중특이성 항체 aEGFRxMIC2, aHER2xMIC2의 결합 평가. 친화도 매개변수는 결합 속도(on-rate) 및 해리 속도(off-rate) 뿐 아니라 친화도로 분류되었다.
도 10: SE-HPLC를 통해 분석된 부하량-의존성 복합체화. 비복합체화 항체(0% 부하량)(왼쪽), 절반-부하된(50% 부하량; 항체:PROTAC 몰비 = 1:1) 항체의 피크에서 완전히 부하된(100% 부하량; 항체:PROTAC 몰비 = 1:2) 항체의 피크 쪽으로 이론적 부하량이 증가함에 따라 피크 분포가 이동한다.
도 11: 비정제 및 정제된 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체의 SE-HPLC 프로필. 보라색: 비정제 샘플; 청록색: 탈염 샘플
도 12: 비정제 및 정제된 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체의 피크 분포
도 13: 시간 경과에 따른 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체의 피크 분포
도 14: 링커-변형된 GNE987의 화학 구조
도 15: BRD4 수준의 예시적인 형광 영상. 더 높은 녹색 형광은 더 높은 BRD4 존재량과 상관된다. 미처리 세포가 가장 강한 형광을 나타냈지만, 4 nM GNE987뿐만 아니라 EGFR 표적화 C225-L328C-GNE987 및 GNE987이 부하된 aEGFRxMIC2로 처리된 세포의 경우 형광이 감소하였다. GNE987이 부하된 4 nM 비결합 aHER2xMIC2로 처리한 경우 EGFR-표적화 복합체와 비교하여 형광이 증가하였다. 녹색 형광은 회색 음영으로 표시되어 있다.
도 16: BRD4 수준 정량화. A) GNE987, C225-L328C-GNE987 및 aEGFRxMIC2+GNE987은 조사된 전체 농도 범위에 걸쳐 BRD4 수준에 비슷한 영향을 미친 반면, aHER2xMIC2+GNE987은 BRD4를 더 작은 정도로 분해하였다. B) 모든 분석물의 4 nM 농도에서 BRD4 분해가 유도되었다.
도 17: aEGFRxMIC2+GNE987 및 대조군의 용량-반응 곡선 플롯. 시험 화합물의 연속 희석물을 MDAMB468 세포에 첨가하고, 3일 배양 후 각각의 개별 화합물의 세포 생존율에 대한 영향을 평가하였다. 50%(1:1) 부하량의 EGFR-표적화 aEGFRxMIC2+GNE987뿐 아니라 벤치마크 C225-L328C-GNE987 및 GNE987은 비슷한 효능을 나타낸 반면, 50%(1:1) 부하량에서의 비결합 대조군 MIC2+GNE987 및 aHER2xMIC2+GNE987은 감소된 효능을 나타내었다.
도 18: aEGFRxMIC2+GNE987 및 대조군의 용량-반응 곡선 플롯. PROTAC GNE987은 가장 높은 효능을 가지며 그 다음은 25% 부하량에서의 aEGFRxMIC2+GNE987이다. 50%(1:1) 부하량에서의 비결합 대조군 MIC2+GNE987 및 aHER2xMIC2+GNE987은 세포 생존율에 미치는 영향이 감소하였다.
도 19: N=3 생물학적 복제물에서 조사된 분자에 대한 IC50-값 플롯
도 20: PROTAC-ADC 및 PROTAC 셔틀로 처리된 HEPG2 세포의 용량-반응 곡선
도 21: BRD4 분해 GNE987, 및 PEG 링커를 갖는 그의 유사체 GNE987P의 분자 구조
도 22: 복합체화된 aEGFRxMIC2+GNE987P는 GNE987P 단독에 비해 0.1 내지 10 nM의 농도 범위에서 EGFR-발현 MDAMB468 세포에 대한 증가된 세포독성 효과를 나타내며, 이는 표적화된 전달을 시사한다. 비표적화 MIC2+GNE987P와의 복합체화는 GNE987P의 세포독성을 완전히 감소시킨다.
도 23: 72시간에 걸쳐 GNE987 단독 또는 aEGFRxMIC2와의 복합체의 마우스 혈장 안정성
도 24: 96시간에 걸쳐 GNE987과 복합체화된 이중특이성 항체 aEGFRxMIC2의 마우스 혈장 안정성
도 25: 마우스 혈장에서 96시간에 걸쳐 50% 부하량에서 복합체 aEGFRxMIC2+GNE987의 안정성 평가. aEGFRxMIC2+GNE987 복합체는 비드에 포획되었고, 비결합 GNE987의 LC-MS 분석을 위해 상등액을 수집하였다. 그 후, LC-MS를 사용하여 GNE987 정량화된 비드로부터 비드-결합된 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체를 용출하였다.
도 26: 항-합텐 항체를 생산하기 위한 신세계 낙타과 면역화를 위한 면역화 일정
도 27: 파지 디스플레이를 통한 항체 발견을 위한 비오틴화된 VH032
도 28: VHH 융합 단백질 대 비변형 모 항체의 발현율
도 29: VHH MIC5가 결여된 모 항체와 비교하여, CD33xMIC5 또는 EGFRxMIC5의 MV411 및 MDAMB468 각각에 대한 세포 결합의 유세포측정 분석
도 30: PROTAC GNE987이 부하되고 부하되지 않은 CD33-결합 CD33xMIC7의 CD33-발현 세포주에 대한 세포 결합의 비교
도 31: pH 반응성 VH032-pHAb 염료의 구조
도 32: 6시간에 걸쳐 CD33xMIC7의 CD33-양성 세포 MOLM13, MV411 및 U937 및 CD33-음성 RAMOS 세포로의 내재화에 대한 유세포측정 분석
도 33: CD33 양성 MV411 세포에서 CD33xMIC7+GNE987(1:1) 및 DIGxMIC7+GNE987(1:1)의 웨스턴 블롯(Western Blot). 플롯 위의 농도는 mol/L로 주어진다. 마커의 크기(오른쪽)는 kDa로 주어진다.
도 34: MV411 세포에서 CD33xMIC7+GNE987(1:1) 및 DIGxMIC7+GNE987(1:1)에 대한 분해 패턴의 웨스턴 블롯 분석
도 35: CD33 수용체 발현 수준에 따른 세포 생존율 데이터의 비교. 50% 부하량에서의 CD33xMIC5+GNE987은 CD33-양성 MV411 및 MOLM13 세포에서 세포독성을 유도하였지만 CD33이 결여된 RAMOS 세포에는 미미한 영향만 미쳤다.
도 36: CD33-양성 MV411 세포에서 GNE987의 세포 독성과 비교된, 25, 50 및 75% PROTAC GNE987이 부하된 CD33xMIC5의 세포 독성
도 37: PROTAC GNE987P 단독과 비교하여 항체 당 다양한 양의 PROTAC GNE987P가 부하된 CD33xMIC5 항체의 세포 생존율 데이터
도 38: PROTAC GNE987P 단독과 비교하여 항체 당 PROTAC FLT3d1이 부하된 CD33xMIC5 항체의 세포 생존율 데이터. 세포 생존율은 처리 6일 후에 분석하였다.
도 39: CD33-양성 MV411 및 CD33-음성 RAMOS 세포에서 미리 복합체화되거나 미리 복합체화되지 않은 75% 부하량(1:1.5)의 CD33xMIC5+GNE987의 세포 생존율 분석. 미리 복합체화되지 않은 샘플의 경우, 항체(CD33xMIC5) 및 PROTAC(GNE987)을 처리로서 세포 현탁액에 별도로 첨가하였다. PROTAC GNE987을 참조를 위해 세포에서 시험하였다.
도 40: CLL1-양성 MOLM13 및 U937, 및 CLL1-음성 K562 세포에서 75% 부하량(1:1.5)의 CLL1xMIC7+GNE987P 및 DIGxMIC7+GNE987P의 세포 생존율 분석. PROTAC GNE987 단독으로 참조를 위해 세포에서 시험하였다.
도 41: CLL1-양성 MV411 및 U937 세포, 및 CLL1-음성 RAMOS 및 K562 세포에서 75% 부하량(1:1.5)의 CLL1xMIC7+GNE987, CLL1xMIC7+GNE987P 및 CLL1xMIC7+SIM1의 세포 생존율 분석. PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1을 참조를 위해 세포에서 시험하였다.
도 42: B7H3-양성 MV411 및 U937 세포 및 B7H3-음성 RAMOS 세포에서 75% 부하량(1:1.5)의 B7H3xMIC7+GNE987P 또는 B7H3xMIC7+SIM1의 세포 생존율 분석. PROTAC 단독(GNE987P 및 SIM1)으로 참조를 위해 세포에서 시험하였다.
도 43: B7H3-양성 MV411 및 U937 세포 및 B7H3-음성 RAMOS 세포에서 75% 부하량(1:1.5)의 B7H3xMIC7+GNE987 및 DIGxMIC7+GNE987의 세포 생존율 분석. PROTAC GNE987을 참조를 위해 세포에서 시험하였다.
도 44: NAPI2B-양성 OVCAR3 및 NAPI2B-음성 SKOV3 세포에서 50% 부하량(1:1)으로 GNE987, GNE987P 또는 SIM1이 부하된 NAPI2BxMIC7 및 DIGxMIC7의 세포 생존율 분석. PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1을 참조를 위해 세포에서 시험하였다.
도 45: EGFR-음성 HEPG2 및 EGFR-양성 MDAMB468 세포에서 50% PROTAC이 부하된 EGFRxMIC5+GNE987 및 세툭시맙(Cetuximab)-기반 EGFR-결합 PROTAC-ADC(DAR=1.62)의 세포 독성 비교
도 46: IV 투여 후 암컷 SCID 베이지(Beige) 마우스에서 81.3% 부하량에서의 GNE987 및 MIC2+GNE987 복합체의 PK 연구
도 47: 30 mg/kg의 IV 투여 후 C57BL/6N 마우스에서 100%의 이론적 부하량을 갖는 CD33xMIC5+GNE987 및 CD33xMIC7+GNE987 PROTAC-항체 복합체의 PK 연구. GNE987의 검출된 농도를 나타내었다.
도 48: 비변형 항체 CD33 Ab, 항체-VHH 융합 단백질 CD33xMIC5 및 CD33xMIC7뿐만 아니라 GNE987이 부하된 CD33xMIC5 및 CD33xMIC7의 제거율 비교
도 49: 암컷 CB17 SCID 마우스에서의 CD33xMIC7+GNE987의 MV411 이종이식 효능 연구. 1회 또는 2회 제공된 0.38 mg/kg GNE987과 비교하여 30 mg/kg CD33xMIC7+GNE987을 1회 또는 2회 제공하였다(1일차 및 8일차). 추가로, 1회(1일차) 제공된 30 mg/kg CD33xMIC5+GNE987의 효능을 평가하였으며 대조군으로서 항체 단독(30 mg/kg CD33xMIC7)의 효과를 평가하였다.
도 50a 내지 50e: 신세계 낙타과의 면역화 및 파지 디스플레이 스크리닝으로부터 수득된 항체 VHH 서열
도 51: 항-CLL1 항체 6E7L4Hle의 서열
표들의 목록
표 1: 본 발명 항체의 결합 에피토프
표 2: MIC2에 대한 1:1 동역학 결합 모델을 사용하여 수득된 MIC2와 PROTAC의 조합에 대한 친화도 매개변수 KD, 결합 속도 kon, 해리 속도 koff(구조, 도 8 참조), 및 정상상태 모델로부터 유도된 MIC1에 대한 PROTAC의 결합에 대한 KD에 관한 개요. NM = 측정되지 않음; NB = 결합되지 않음
표 3: 목적하는 부하량을 달성하기 위해 필요한 최종 PROTAC 농도에 대한 개요
표 4: 25% 및 50% 부하량으로 GNE987과 복합체화된 EGFR-결합 aEGFRxMIC2 및 비결합 대조군 MIC2의 IC50-값
표 5: MDAMB468에서의 EGFR-결합 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체 및 대조군의 IC50-값. 효능 및 표준 편차는 세 번의 독립적인 실험에서 유도된다.
표 6: PBS(pH 6.8), 최종 5% DMSO에서 항체-PROTAC 복합체의 저장 안정성 평가
표 7: 파지 디스플레이를 사용한 항체 히트 발견 캠페인(antibody hit discovery campaign)에 대한 라이브러리 특성
표 8: SPR을 사용하여 측정된 PROTAC에 대한 VHH 클론의 친화도(KD). VHH는 항-CD33 또는 항-CLL1 항체의 중쇄에 C-말단 부가에 의한 항체 융합 단백질로서 연구되었다. N/D - 검출되지 않음(완전한 PROTACS 구조는 도 8에서 찾을 수 있음).
표 9: VHH 항체 단편과의 융합을 위한 IgG-유형 항체 주쇄
표 10: CD33을 표적으로 하는 PAX의 명명법
표 11: EGFR-양성 MDAMB468 세포 및 MDAMB468-음성 HEPG2 세포에서 PROTAC GNE987과 결합된 CD33-결합 겜투주맙(gemtuzumab)(G)- 및 EGFR-결합 세툭시맙(c)-기반 VHH 융합 단백질의 세포 프로파일링. IC50 값을 사용하여 선택성 지수를 계산하였다.
표 12: 웨스턴 블롯 분석에 사용된 1차 항체
표 13: CD33-양성 MV411 세포 및 CD33-음성 RAMOS 세포에서 PROTAC GNE987 및 GNE987P 또는 PROTAC 단독과 결합된 다양한 CD33xMIC7의 세포 프로파일링. IC50 값은 M으로 나타낸다.
표 14: PROTAC ARV771, GNE987, GNE987P 및 EGFR-양성 세포 및 EGFR-음성 HEPG2 세포의 세포 프로파일링. IC50 값은 M으로 나타낸다.
표 15: EGFR-양성 세포 및 EGFR-음성 HEPG2 세포에서 50% 부하량으로 PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1과 결합된 EGFRxMIC7의 세포 프로파일링. 비내재화 대조군으로서, 디곡시게닌(digoxigenin)-결합 DIGxMIC7 융합 단백질을 사용하였다. IC50 값은 M으로 나타낸다.
표 16: EGFR-양성 세포 및 EGFR-음성 HEPG2 및 EGFR-저발현 MCF7 세포에서 75% 부하량으로 PROTAC ARV771, GNE987, GNE987P 및 SIM1과 결합된 EGFRxMIC7의 세포 프로파일링. 비내재화 대조군으로서, 디곡시게닌-결합 DIGxMIC7 융합 단백질을 사용하였다.
표 17: HER2-양성 세포 및 HER2-음성 MDAMB468 세포에서 75% 부하량으로 PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1과 결합된 HER2xMIC7의 세포 프로파일링
표 18: TROP2-양성 세포 및 TROP2-음성 SW620 세포에서 75% 부하량으로 PROTAC GNE987과 결합된 TROP2xMIC7의 세포 프로파일링
표 19: PROTAC GNE987 및 모 항체 CD33 Ab가 부하되고 부하되지 않은 MIC5 및 MIC7과의 CD33-기반 VHH-융합물의 약동학적 매개변수 요약. 분석물은 30 mg/kg으로 투여되었으며, 정량화 총 항체(t항체) 및 PROTAC GNE987에 대한 PK 매개변수를 나타내었다. 약어: t1/2: 반감기; Cmax: 최대 혈청 농도; AUC0-inf: 무한 시간까지의 곡선하 영역; Cl: 제거율; Vss: 정상 상태 분포량. SD: 표준편차.
표 20: 이 작업의 범위 요약. 조사된 조합들은 표의 형식으로 나타내었다.
발명의 상세한 설명
1. 정의
"PROTAC"(단백질분해 표적화 키메라)는 2개의 활성 도메인 및 링커로 이루어진 이종이작용성 소분자로서, 원치 않는 특정 단백질을 제거할 수 있다. PROTAC은 통상적인 효소 억제제로 작용하기 보다는 선택적 단백질분해를 유도함으로써 작동한다. PROTAC은 2개의 공유 결합된 단백질-결합 분자: (많은 경우에) 결합할 수 있는 하나 및 분해를 위해 계획된 표적 단백질에 결합하는 또 다른 하나로 이루어진다. 표적 단백질에 E3 리가제의 동원은 유비퀴틴화 및 프로테아좀에 의한 표적 단백질의 후속 분해를 야기한다. 상기 개념은 2001년에 데샤이에스(Deshaies)와 동료들에 의해 처음 기술되었다(문헌[Skamoto, K.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 8554-8559]).
"항체"라는 용어에는 단일클론 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체 포함), 폴리-에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이성 항체, 특히 이중특이성 항체, 디아바디(diabody) 및 단일쇄 분자(예를 들면, scFv), 단일 도메인 항체(신세계 낙타과 종, 예를 들어, 라마에서 유래된 VHH와 같은 나노바디)뿐만 아니라, 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)도 포함된다.
용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다. 기본 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진 이종-사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄로 불리는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종-사량체 단위로 이루어지며 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, IgA 항체는 중합되어 J 쇄와 함께 다가 조립체(assemblage)를 형성할 수 있는, 2 내지 5개의 기본 4쇄 단위를 포함한다. IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 다이설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소타입에 따라 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 다이설파이드 가교를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에 가변 도메인(VH)에 이어, 알파 및 감마 중쇄 이소타입 각각에 대한 3개의 불변 도메인(CH) 및 뮤 및 엡실론 중쇄 이소타입에 대한 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N 말단에 가변 도메인(VL)에 이어, 다른 쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 경계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH와 VL의 쌍은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 다양한 부류의 항체들의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Schroeder, H., Cavacini, L., J. Allergy Clin. Immunol. 125 (2010), S41-S52])을 참조하시오. 임의의 척추동물 종의 L 쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파 및 람다로 불리는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인(CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소타입으로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 부류가 있으며, 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지정된 중쇄를 갖는다. 감마 및 알파 부류는 CH 서열 및 기능의 상대적으로 작은 차이에 기반하여 하위부류(subclass)로 더 분류된다, 예를 들어, 인간은 다음의 하위부류: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일 부류의 다른 항체에 비해) 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원 결합 부위를 함유한다.
"가변성"이라는 용어는 가변 도메인의 특정 분절이 항체들 중의 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 항원에 대한 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신, 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역(HVR)으로 불리는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 HVR로 연결된, 주로 베타-시트 구성을 취하는 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에서 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 HVR은 FR 영역에 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에 항체가 관여하는 것과 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR"은 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 CDR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3). 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 CDR 중 가장 다양성을 나타내며, 특히 H3은 항체에 미세한 특이성을 부여하는 데 고유의 역할을 하는 것으로 생각된다(예를 들어, 문헌[Xu et al., Immunity 13 (2000) 37-45]; 문헌[Johnson and Wu, Methods Mol. Biol. 248 (2003) 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003] 참조). 실제로, 중쇄로만 이루어진 천연 낙타과 항체는 경쇄 없이도 기능적이고 안정적이다(예를 들어, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363 (1993) 446-448]; 문헌[Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3 (1996) 733-736] 참조). 다수의 CDR 묘사가 사용되고 있다. ImMunGeneTics(IMGT) 고유 르프랑(Lefranc) 넘버링(IMGT 넘버링)(문헌[Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol. 27(2003) 55-77])은 서열 보존, X-선 회절 연구로부터의 구조적 데이터, 및 FR 및 HVR을 규정하기 위한 초가변 루프의 특성화를 고려한다. 카밧(Kabat) CDR은 서열 가변성에 기반하며 또한 일반적으로 사용된다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 초티아(Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917]). 본원에 사용된 CDR 묘사는 IMGT 넘버링에 따른 것이다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 CDR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
용어 "전장 항체", "온전한(intact) 항체" 또는 "전체(whole) 항체"는 항체 단편과 대조적으로, 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에서, 온전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 항체 단편으로부터 형성된 단일쇄 항체 분자 및 다중특이성 항체가 포함된다. 항체의 파파인 절단은 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하는 명칭인 잔류 "Fc" 단편을 생성하였다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인(VH) 및 1개 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이다. 즉, 상기 단편은 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원-결합 활성을 갖는 2개의 다이설파이드 결힙된 Fab 단편에 대략적으로 상응하고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 단일 대형 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇 개의 추가 잔기를 갖는다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 또한 공지되어 있다.
"scFv"(단일쇄 Fv)는 공유적으로 결합된 VH::VL 이종이량체이며, 이는 통상적으로 펩티드-암호화 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합물로부터 발현된다. 본 발명의 인간 scFv 단편은, 예를 들어, 유전자 재조합 기술을 사용하여 적절한 형태로 유지되는 CDR을 포함한다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv의 결합에 의해 자발적으로 형성될 수 있거나, 또는 2가 sc(Fv)2와 같이 펩티드 링커에 의해 1가 scFv를 커플링시킴으로써 생성될 수 있다. "dsFv"는 다이설파이드 결합에 의해 안정화된 VH::VL 이종이량체이다. "(dsFv)2"는 펩티드 링커에 의해 커플링된 2개의 dsFv를 의미한다.
"이중특이성 항체" 또는 "BsAb"라는 용어는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 의미한다. 따라서, BsAb는 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있다. 예를 들어, EP 2 050 764 A1호에 기술된 바와 같이 목적하는 결합 특성과 효과기 기능의 조합을 갖는 항체 또는 항체 유도체를 설계, 변형 및 생산하기 위해 유전 공학이 점점 더 빈번하게 사용되어 왔다.
"다중특이성 항체"라는 용어는 2개 이상의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 의미한다.
"하이브리도마"라는 용어는 비-인간 포유동물을 항원으로 면역화하여 제조된 B 세포를 항원 특이성을 갖는 목적하는 단일클론 항체를 생산하는 마우스 등으로부터 유래된 골수종 세포와 세포 융합시켜 수득되는 세포를 의미한다.
"디아바디"라는 용어는 V 도메인의 쇄간 쌍은 달성되지만 쇄내 쌍은 달성되지 않음으로써 2가 단편, 즉. 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편이 생성되도록, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커(약 5 내지 10개 잔기)를 갖는 scFv 단편(이전 단락 참조)을 구축하여 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이성 디아바디는 두 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에 존재하는 2개의 "교차(crossover)" scFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는, 예를 들어, EP0404097호; WO 93/11161호; 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]에 더 상세하게 기술되어 있다.
본원에서 단일클론 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종에서 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체뿐 아니라 목적하는 생물 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함한다.
비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR(하기에서 정의됨)의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 HVR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크("FR") 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 결합 친화도와 같은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 이때 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린 서열의 것에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 영역이지만, FR 영역은 결합 친화도, 이성질체화, 면역원성 등과 같은 항체 성능을 개선시키는 하나 이상의 개별 FR 잔기 치환을 포함할 수 있다. FR에서 이러한 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에 6개 이하 및 L 쇄에 3개 이하이다. 인간화 항체는 임의적으로 또한 면역글로불린, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부(Fc)를 포함할 것이다. 더 자세한 내용은, 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature 321 (1986) 522-525]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596]을 참조하시오. 또한, 예를 들어, 문헌[Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol. 1 (1998) 105-115]; 문헌[Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 (1995) 1035-1038]; 문헌[Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 (1994) 428-433]; 및 미국 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호를 참조하시오.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하여 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다(문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 (1991) 381]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222 (1991) 581]). 또한, 문헌[Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-74]에 기술된 방법을 인간 단일클론 항체의 제조에 이용가능하다. 인간 항체는, 항원 공격(antigenic challenge)에 반응하여 부분 또는 전체 인간 항체를 생성하도록 유전적으로 변형되었지만 그의 내인성 유전자좌가 비활성화된 유전자도입 동물, 예를 들어, OmniAb 치료 항체 플랫폼(Ligand Pharmaceuticals), 면역화된 제노마우스(Xenomouse)(예를 들어, 제노마우스 기술에 관한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조) 등에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 또한, 예를 들어, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. USA 103 (2006) 3557-3562]을 참조하시오.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아미드화)을 제외하고 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도된, 매우 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 달리, 각각의 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 특이성 이외에, 단일클론 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되고 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. "단일클론"이란 수식어는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득되는 것으로 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법(예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256 (1975) 495-497]; 문헌[Hongo et al., Hybridoma 14 (1995) 253-260], 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; 문헌[Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조), 파지-디스플레이 기술(예를 들어, 문헌[Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; 문헌[Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132] 참조), 및 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술(예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551]; 문헌[Jakobovits et al., Nature 362 (1993) 255-258]; 문헌[Bruggemann et al., Year in Immunol. 7 (1993) 33]; 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: (1996) 845-851]; 문헌[Neuberger, Nature Biotechnol. 14 (1996) 826]; 및 문헌[onberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 (1995) 65-93] 참조)을 포함한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
"친화도-성숙된" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도-성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 갖는다. 친화도-성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 예를 들어, 문헌[Marks et al., Biotechnology 10 (1992) 779-783]에는 VH- 및 VL-도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기술되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어, 문헌[Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994) 3809-3813]; 문헌[Schier et al. Gene 169 (1995) 147-155]; 문헌[Yelton et al. J. Immunol. 155 (1995) 1994-2004]; 문헌[Jackson et al, J. Immunol. 154 (1995) 3310-9]; 및 문헌[Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226 (1992) 889-896]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에 특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인"은, 생물 분자를 포함하는 분자들의 이종 집단의 존재하에서 표적의 존재를 결정하는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예를 들면, 표적과 항체 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력 하에, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속 시간으로 상기 표적에 결합하는 항체이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 상대(예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화도", "에 결합하다" 또는 "에 결합하는"은 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 Fab 단편과 항원) 사이의 1 대 1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 그 상대 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 방법을 포함하여 당해 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 더 오랫동안 결합을 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 방법을 본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있다. 결합 친화도, 즉 결합 강도를 측정하기 위한 특정한 예시적이고 대표적인 실시양태가 하기에서 기술된다.
본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값"은 항체 및 항원 분자의 Fab 변형을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해, 또는 BIACORE 기기(BIAcore, Inc., 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하는 표면-플라즈몬 공명 분석을 사용하여, 또는 옥텟(Octet) 기기(Forte bio, 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재)를 사용하는 생물층 간섭계 분석을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합체"는 항체의 가변 영역(CDR)에 의해 비공유 결합된 화학적(비-생물학적) 치료제를 의미하는 "복합체"와 대조적으로, 항체에 공유 결합된 화학적(비-생물학적) 치료제를 지칭한다.
"정제된" 또는 "단리된"은, 폴리펩티드(예를 들어, 항체) 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때, 표시된 분자가 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 존재한다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 중량 기준으로 적어도 75%, 85%, 95%, 96%, 97% 또는 98%의 동일한 유형의 생물학적 거대분자가 존재함을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는 대상 폴리펩티드를 암호화하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다; 그러나, 분자는 조성물의 기본 특성에 해로운 영향을 미치지 않는 일부 추가 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "데그론(degron)"은 Von-Hippel-Lindau(VHL) 리간드인 PROTAC의 분해 모이어티를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "탄두(warhead)"는 분해될 단백질(예를 들어, 억제제 또는 이러한 표적 단백질)에 결합하는 PROTAC의 모이어티를 지칭한다. 탄두 모이어티는 이하에서 "표적 단백질 결합제" 또는 "단백질 결합제" 또는 "PB"로도 지칭된다.
2. 본 발명의 항체 및 항체-PROTAC 복합체(PAX)
본 발명자들은 특정 항-PROTAC 항체, 특히 항-VHL-리간드 항체를 생성하고 선택하는 데 성공했으며, 이때 항체는 PROTAC의 VHL 리간드 데그론에 특이적으로 결합한다.
따라서, 한 양태에서 본 발명은 VH032와 같은 VHL 리간드 또는 그의 유도체에 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명자들에 의해 생성된 항-PROTAC 항체는, MIC1- 및 MIC2-유래 항체에 대해 도 1 및 표 1에 요약된 바와 같이 다양한 변형을 허용하면서 VHL 리간드 VH032에 결합할 수 있다. 항체는 VH032와 표적 단백질 결합제를 연결하는 별개의 여러 링커 구조를 포함하는 위치 R1 및 R2에서 조사된 모든 치환을 허용한다. R3에서는, 수소 및 하이드록실 치환이 허용되는 반면, 표적 단백질 결합 모이어티가 링커를 통해 R3에 연결된 경우 항체 결합이 억제된다. R4는 메틸의 수소일 수 있다. R5 및 R6은 각각의 다른 위치가 수소인 것을 고려하여 둘 다 하이드록실기를 함유할 수 있다. 허용되지 않는 위치 R1, R2, R5 및 R6에서는 치환이 확인되지 않았다.
문헌 검토-기반 구조 분석에서 VHL과 결합하는 PROTAC의 49.2%가 VHL 리간드 VH032를 기반으로 하는 것으로 나타났다. VHL-기반 PROTAC의 29.5%는 추가 메틸기를 갖는 VH032의 밀접한 유도체를 활용한다(R4=Me, 도 1). 탄두 부착을 위한 링커는 이때 위치 R1에 부착된다(도 1). 나머지 VHL-기반 PROTAC은 탄두에 대한 연결이 R3에 대한 링커 부착에 의해 실행되는 상이한 조성을 사용하거나 R4의 하이드록시메틸과 같은 다른 변형을 갖는다. 종합하면, 본 발명에서 개시된 항-PROTAC 항체는 현재 공개적으로 알려진 VHL-기반 PROTAC의 적어도 79%에 결합할 수 있다
[표 1] 본 발명 항체의 결합 에피토프
그러므로, 한 실시양태에서 VH032 유도체는 하기 화학식 I로 기술될 수 있다.
[화학식 I]
상기 식에서,
R1 또는 R2 중 하나는 탄두(표적 단백질 결합제, PB)에 연결된 링커이되,
R2가 탄두-링커이면, R1은 아세틸이고,
R1이 탄두-링커이면, R2는 메틸이고;
R3은 H, OH, 시아노, F, Cl, 아미노 또는 메틸이고;
R4는 H 또는 메틸이고;
R5, R6은 H 또는 OH이되,
R6이 H이면, R5는 OH이고,
R5가 H이면, R6은 OH이다.
보다 특정한 실시양태에서,
R1은 PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C=O)-이고,
이때,
PB는 단백질 결합 탄두이고,
Q는 NH, C=O이거나 부재하고,
n, m은 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
p는 0 내지 10이고;
R2는 메틸이고;
R3, R4, R5 및 R6은 전술한 바와 같다.
보다 더 특정한 실시양태에서,
R1은 PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C=O)-이고,
이때,
PB는 단백질 결합 탄두이고;.
Q는 NH, C=O이거나 부재하고;
(i) n, m, p는 1이거나;
(ii) n은 3 또는 4이고; m은 0이고, p는 1이거나;
(iii) n은 1이고; m은 0이고; p는 2이거나;
(iv) n은 2이고; m은 0이고; p는 2이거나;
(v) n, m은 0이고; p는 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
R2는 메틸이고;
R3, R4, R5 및 R6은 전술한 바와 같다.
매우 특정한 실시양태에서,
R1은 PB-NH-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C=O)-이고,
이때,
PB는 단백질 결합 탄두이고,
(vi) Q는 NH이고; n, m, p는 1이거나;
(vii) Q는 NH이고; n은 3 또는 4이고; m은 0이고, p는 1이거나;
(viii) Q는 부재하고; n은 1이고; m은 0이고; p는 2이거나;
(ix) Q는 부재하고; n은 2이고; m은 0이고; p는 2이거나;
(x) Q는 NH 또는 C=O이고; n, m은 0이고; p는 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
R2는 메틸이고;
R3, R4, R5 및 R6은 전술한 바와 같다.
또 다른 보다 특정한 실시양태에서,
R1은 아세틸이고;
R2는 PB-NH-(CH2)p-S-이며, 이때 PB는 단백질 결합 탄두이고 p는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
R3, R4, R5 및 R6은 전술한 바와 같다.
실시양태 (A)에서, 항체는 가변 영역이, 하기 서열을 갖는, PROTAC 결합을 담당하는 CDR을 포함하는 전장 항체이다:
HC CDR1: G Y S X1 T X2 X3 Y (서열번호 1);
HC CDR2: I T Y S G X4 T (서열번호 2);
HC CDR3: X5 X6 Y X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 (서열번호 3);
LC CDR1: Q X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 Y (서열번호 4);
LC CDR2: X25 X26 X27 (서열번호 5);
LC CDR3: X28 Q X29 X30 X31 X32 P Y T (서열번호 6);
이때, X1은 I 또는 A이고; X2는 G 또는 N이고; X3은 D 또는 N이고; X4는 G 또는 A이고; X5는 A 또는 G이고; X6은 K 또는 Y이고; X7은 G 또는 Y이고; X8은 부재하거나 A이고; X9는 부재하거나 V이고; X10은 부재하거나 P이고; X11은 D 또는 Y이고; X12는 G 또는 Y이고; X13은 G 또는 F이고; X14는 R 또는 A이고; X15는 D 또는 H이고; X16은 S 또는 G이고; X17은 L 또는 I이고; X18은 S이거나 부재하고; X19는 Y이거나 부재하고; X20은 S이거나 부재하고; X21은 D이거나 부재하고, X22는 G이거나 부재하고; X23은 N 또는 G이고; X24는 T 또는 N이고; X25는 L 또는 Y이고; X26은 V 또는 A이고; X27은 S 또는 T이고, X28은 V 또는 L이고; X29는 S 또는 Y이고; X30은 I 또는 D이고; X31은 H 또는 E이고; X32는 V 또는 Y이다.
바람직한 실시양태에서, CDR 서열은 다음과 같다:
HC CDR1: G Y S I T G D Y (서열번호 7);
HC CDR2: I T Y S G G T (서열번호 8);
HC CDR3: A K Y G D G G R D (서열번호 9);
LC CDR1: Q S L S Y S D G N T Y (서열번호 10);
LC CDR2: L V S (서열번호 11);
LC CDR3: V Q S I H V P Y T (서열번호 12).
매우 특정한 실시양태에서, 항체는 도 2에 나타낸 MIC 2 서열 서열번호 13 및 14로부터 선택된 경쇄 및 중쇄 서열의 쌍에 상응한다.
또 다른 매우 특정한 실시양태에서, 항체는 도 2(a)에 나타낸 바와 같이 서열번호 13 및 15, 또는 13 및 16의 중쇄 및 경쇄 서열을 가지고, 그의 중쇄에 HER2 결합 VHH, 또는 EGFR 결합 scFv가 각각 도 2(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이 펩티드 링커를 통해 융합된 BsAb이다.
실시양태 (B)에서, 항체는, 하기의 서열을 갖는, PROTAC 결합을 담당하는 CDR을 포함하는 VHH이다:
CDR1: G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 (서열번호 17);
CDR2: X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 (서열번호 18);
CDR3: X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33
X34 X35 X36 (서열번호 19);
이때, X1은 F 또는 R이고; X2는 T, A, S 또는 R이고; X3은 L 또는 F이고; X4는 D 또는 N이고; X5는 D 또는 T이고; X6은 Y 또는 L이고; X7은 A 또는 T이고; X8은 I, N 또는 L이고; X9는 S 또는 T이고; X10은 S 또는 W이고; X11은 S 또는 N이고; X12는 D 또는 G이고; X13은 G 또는 D이고; X14는 S 또는 N이고; X15는 A 또는 T이고; X16은 A, S 또는 T이고; X17은 A, V 또는 I이고; X18은 S, A, I 또는 D이고; X19는 T, Y, R 또는 A이고; X20은 R, Y 또는 G이고; X21은 V, S, L 또는 T이고; X22는 L, G, S 또는 C이고; X23은 S, A, C 또는 P이고; X24는 T, A, S 또는 N이고; X25는 P, I, V 또는 D이고; X26은 부재하거나, V 또는 A이고; X27은 D, S 또는 R이거나 부재하고; X28은 V, G 또는 P이고; X29는 D, T, G 또는 R이고; X30은 Q, I, T 또는 R이고; X31은 V, K 또는 R이고; X32는 R, I 또는 Y이고; X33은 Y, Q, F 또는 A이고; X34는 V 또는 L이고; X35는 E, P 또는 D이고; X36은 V, Y 또는 A이다.
이때, 보다 구체적으로: X1은 F이고; X2는 T 또는 S이고; X3은 L 또는 F이고; X4는 D이고; X5는 D이고; X6은 Y이고; X7은 A 또는 T이고; X8은 I이고; X9는 S 또는 T이고; X10은 S이고; X11은 S이고; X12는 D이고; X13은 G이고; X14는 S이고; X15는 A 또는 T이고; X16은 A 또는 S이고; X17은 V 또는 A이고; X18은 A 또는 I이고; X19는 T 또는 Y이고; X20은 G 또는 R이고; X21은 L 또는 S이고; X22는 C 또는 S이고; X23은 P 또는 C이고; X24는 A 또는 S이고; X25는 V 또는 D이고; X26은 부재하거나 V이고; X27은 R이거나 부재하고; X28은 G 또는 P이고; X29는 T 또는 G이고; X30은 Q 또는 I이고; X31은 K 또는 R이고; X32는 R, I 또는 Y이고; X33은 F 또는 A이고; X34는 L이고; X35는 E 또는 D이고; X36은 V 또는 Y이다.
바람직한 실시양태에서, CDR 서열은 도 50a에 나타낸 항체 YU734-F06(MIC7)의 서열(서열번호 20)
CDR1: G F T L D D Y A (서열번호 21)
CDR2: I S S S D G S T (서열번호 22)
CDR3: S A I Y R L S C S V V R P T I R Y A L D Y (서열번호 23)
또는 도 50a에 나타낸 항체 YU733-G10(MIC5)의 서열(서열번호 24)이다
CDR1: G F T F D D Y A (서열번호 25)
CDR2: I S S S D G S A(서열번호 26)
CDR3: A V A T G S C P A D G G Q K I F L E V (서열번호 27)
매우 특정한 실시양태에서, VHH는 도 50a 내지 50e에 나타낸 서열들로부터 선택된 서열에 상응한다.
바람직한 특정 실시양태에서, VHH는 도 50a에 나타낸 서열 YU734-F06(MIC7, 서열번호 20) 또는 YU733-G10(MIC5, 서열번호 24)에 상응한다:
한 실시양태에서, 실시양태 (B)에 대해 전술한 서열은 BsAb의 일부이고, 이때 상기 서열의 N-말단은, 임의적으로 펩티드 링커를 통해, 표적 단백질에 결합할 수 있는 전장 항체의 C-말단에 융합된다.
바람직한 실시양태에서, BsAb는 펩티드 링커를 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 펩티드 링커는 각각 GSGGGSGGSGGGGSG(서열번호 28)의 1, 2 또는 3개 반복서열로 이루어진다. 훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 펩티드 링커는 각각 GSGGGSGGSGGGGSG(서열번호 28)의 1개 반복서열로 이루어진다.
전장 항체인 경우, FcRn 수용체 결합을 가능하게 하기 위해 항체는 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 유형이다.
한 실시양태에서, 항체는 단일특이성이며 PROTAC에만 결합한다. 항체는 또한 이중특이성 항체(BsAb)일 수 있으며, 이때 두 번째 특이성은 표적 단백질에 대한 것이다.
BsAb의 경우, PROTAC 결합은 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 두 쇄 모두의 C- 또는 N-말단, 또는 두 말단 모두에 융합된 단일쇄 항체를 통해 수행될 수 있는 반면, 표적 단백질 결합은 전장 항체의 가변 영역의 6개 CDR을 통해 수행된다.
대안적으로, 표적 단백질 결합은 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 두 쇄 모두의 C- 또는 N-말단, 또는 두 말단 모두에 융합된 단일쇄 항체를 통해 수행되고, PROTAC 결합은 전장 항체의 가변 영역의 6개 CDR을 통해 수행된다.
본 발명에 따른 BsAb 변이체의 예는 도 3에 나타내었다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 BsAb의 표적 단백질은 세포 표면 단백질, 예를 들어 HER2 또는 EGFR과 같은 종양 항원이다.
3. 핵산, 벡터 및 숙주 세포
본 발명의 또 다른 양태는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단리된 핵산에 관한 것이다.
전형적으로, 상기 핵산은 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있는 DNA 또는 RNA 분자이다.
"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어는 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진하기 위해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 그에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 비히클을 의미한다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 대상에게 투여시 상기 폴리펩티드의 발현을 야기하거나 유도하기 위한 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터에 의해 형질감염, 감염 또는 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
"형질전환"이라는 용어는 "외래"(즉, 외인성) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 목적하는 물질, 전형적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 암호화되는 단백질 또는 효소를 생성하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하고 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"되었다.
본 발명의 핵산은 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. "발현 시스템"이라는 용어는, 예를 들어, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 암호화된 단백질의 발현을 위한 적합한 조건 하의 숙주 세포 및 적합성(compatible) 벡터를 의미한다.
통상적인 발현 시스템으로는 에스케리키아 콜라이(E. coli) 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바큘로바이러스(Baculovirus) 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터가 포함된다. 숙주 세포의 다른 예로는 제한하지 않고 원핵 세포(예를 들면, 세균) 및 진핵 세포(예를 들면, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)가 포함된다. 구체적인 예로는 에스케리키아 콜라이, 클루이베로마이에스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유동물 세포주(예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, HEK 세포, 3T3 세포, COS 세포 등)가 포함된다.
4. 본 발명의 항체를 생산하는 방법
본 발명의 항체는 제한하지 않고 임의의 화학적, 생물학적, 유전적 또는 효소적 기술과 같은 당해 분야에 공지된 임의의 기술을 단독으로 또는 함께 사용하여 생산될 수 있다.
목적하는 항체의 아미노산 서열을 알면, 당해 분야의 숙련자는 폴리펩티드 생산을 위한 표준 기술을 사용하여 상기 항체 또는 면역글로불린 쇄를 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들어, 이들은 상업적으로 이용가능한 펩티드 합성 장치(예를 들면, 미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 Applied Biosystems에서 제조한 것)를 사용하고 제조업체의 지시에 따라 잘 알려진 고체상 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 면역글로불린 쇄는 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 이들 폴리펩티드(예를 들어, 항체)는 목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 발현 벡터에 혼입시키고 상기 벡터를, 그로부터 나중에 잘 알려진 기술을 사용하여 단리할 수 있는, 목적하는 폴리펩티드를 발현할 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에 도입한 후 DNA 발현 산물로 수득될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (i) 본 발명에 따라 형질전환된 숙주 세포를 배양하고; (ii) 항체를 발현시키고; (iii) 발현된 항체를 회수하는 것으로 이루어지는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절하게 분리할 수 있다.
본 발명의 Fab는 본 발명의 항체(예를 들어, IgG)를 파파인과 같은 프로테아제로 처리함으로써 수득할 수 있다. 또한, 항체의 Fab의 두 쇄 모두를 암호화하는 DNA 서열을 원핵세포 발현용 또는 진핵세포 발현용 벡터에 삽입하고, 벡터를 (적절하게) 원핵 또는 진핵 세포에 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 Fab를 생산할 수 있다.
본 발명의 F(ab')2는 본 발명의 항체(예를 들어, IgG)를 프로테아제인 펩신으로 처리하여 수득할 수 있다. 또한, F(ab')2는 하기에 기술되는 Fab'를 티오에테르 결합 또는 다이설파이드 결합을 통해 결합시킴으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 Fab'는 본 발명의 F(ab')2를 다이티오트레이톨과 같은 환원제로 처리하여 수득할 수 있다. 또한, 항체의 Fab' 쇄를 암호화하는 DNA 서열을 원핵세포 발현용 벡터 또는 진핵세포 발현용 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 또는 진핵 세포에 (적절하게) 도입하여 발현을 수행함으로써 Fab'를 생산할 수도 있다.
5. PROTAC의 가용화 및 안정화
PROTAC은 종종 소수성이어서 생체내 적용성이 제한되는 반면, 항체는 일반적으로 충분히 가용성이다. 그러므로, 본 발명의 항-PROTAC 항체와 PROTAC의 데그론 부분의 결합은 주변 용매로부터 PROTAC을 부분적으로 차폐한다. 이것의 최종 결과는 항체 결합의 가용화 효과, 즉 개선된 용해도이며, 이는 생체내 투여 및 이종이식 연구에 유리하다.
더욱이, PROTAC은 탄두, 링커 및 데그론 부분에 여러 대사 취약 지점을 가지고 있으며(문헌[Goracci, L. et al., J. Med. Chem. 63 (2020) 11615-11638]), 이는 그들의 대사 안정성을 제한한다. PROTAC과 본 발명의 항체의 복합체화에 의해, 대사 효소에 대한 PROTAC의 입체적 접근성이 제한되어 개선된 대사 안정성으로 이어진다.
6. 약학 조성물
본 발명의 PAX는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제, 및 임의적으로 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 지질 또는 당류를 포함하지만 이로 제한되지 않는 서방성(sustained-release) 매트릭스와 조합되어 약학 조성물을 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 PAX 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
"약학적" 또는 "약학적으로 허용되는"은 포유동물, 특히 인간에게 적절하게 투여될 때 이상 반응, 알레르기 반응 또는 기타 원치 않는 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의 유형의 제형화 보조제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제 등을 포함한다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예로는 물, 아미노산, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 완충제 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 중 하나 이상; 히스티딘, 아르기닌, 글리신, 프롤린, 글리실글리신과 같은 아미노산 및 유도체; 염화나트륨 또는 염화칼슘과 같은 무기염; 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 슈크로스, 트레할로스, 만니톨과 같은 당 또는 다가알콜; 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20, 폴록사머 188과 같은 계면활성제; 등 뿐만 아니라 이들의 조합이 포함되나, 이로 제한되지는 않는다. 많은 경우에서, 약학 조성물에 당, 다가알콜 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 유용할 것이며, 제형은 또한 트립타민과 같은 항산화제 및/또는 Tween 20과 같은 안정화제를 함유할 수 있다.
약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 당연히 치료할 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 달라진다.
본 발명의 약학 조성물은 비경구, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
한 실시양태에서, 약학 조성물은 주사용 제형에 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 등장성, 멸균 식염수 용액(인산 일나트륨 또는 인산 이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가시 주사액 구성을 가능하게 하는 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있다.
약학 조성물은 약물 혼합 장치를 통해 투여될 수 있다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 매개변수의 함수로서, 및 예를 들어, 사용된 투여 방식, 관련 병리학 또는 대안적으로 목적하는 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다.
약학 조성물을 제조하기 위해, 본 발명의 PAX의 효과량은 약학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 형태로는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함되며; 이러한 모든 경우에서, 상기 형태는 멸균되고 분해없이 전달하기 위한 적절한 장치 또는 시스템으로 주사할 수 있어야 하며, 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
멸균 주사액은 필요한 대로 상기에서 열거된 임의의 기타 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 후 멸균 여과시켜 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기에서 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입시켜 제조할 수 있다. 멸균 주사액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다.
예를 들어, 수용액내 비경구 투여의 경우, 필요하다면 용액을 적절하게 완충시킬 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 되도록 한다. 이들 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 당해 분야의 숙련자에게 인지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 등장성 NaCl 용액 1 ml에 용해시키고 1000 ml의 피하주사액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투여량의 다소의 변화는 치료받는 대상의 상태에 따라 필연적으로 발생한다. 어떤 경우에도 투여 담당자는 개별 대상에게 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 발명의 PAX는, 예를 들어, 용량당 약 0.01 내지 100 mg 등을 포함하도록 치료 혼합물 내에 제형화될 수 있다.
특정 양태에서, 제1 약학 조성물은 PAX를 포함하고, 제2 약학 조성물은 상기 PAX의 PROTAC 성분만을 포함한다.
또 다른 특정한 양태에서, 제1 약학 조성물은 PAX의 항체 성분만을 포함하고, 제2 약학 조성물은 상기 PAX의 PROTAC 성분만을 포함한다.
7. 치료 방법 및 용도
상기 및 하기에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 PAX가 주어진 PROTAC을 표적 세포에 효과적으로 전달할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 PAX가 PROTAC 페이로드를 표적 세포의 세포질로 방출하고, 이때 PROTAC이 표적 단백질의 분해를 매개한다는 것을 밝혀내었다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 약제로 사용하기 위한 PAX 또는 그의 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 PAX 또는 약학 조성물을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, PROTAC의 표적 단백질의 분해로부터 이익을 얻는 질병, 예를 들어, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, PAX 또는 상기 PAX를 포함하는 약학 조성물을 먼저 투여한 후, PAX 단독의 PROTAC 성분 또는 상기 PROTAC을 포함하는 약학 조성물을 후속 투여하여, PROTAC 페이로드를 방출한 항체가 추가의 PROTAC 성분에 결합하고 이를 표적 세포에 전달하게 한다.
또 다른 특정 실시양태에서, PAX의 항체 성분 또는 상기 항체를 포함하는 약학 조성물을 먼저 투여하고, PAX의 PROTAC 성분 또는 상기 PROTAC을 포함하는 약학 조성물을 후속적으로 투여하여, 항체가 생체내에서 그들의 PROTAC "항원"에 결합하고 이를 표적 세포에 전달하게 한다.
추가의 양태에서, PAX의 항체 성분은 (i) PROTAC의 생체내 반감기를 증가시키기 위해(즉, 분해를 지연시키기 위해), (ii) PROTAC의 연장 방출 제형으로서(즉, 상기 제형이 보다 장기간에 걸쳐 효과적이도록), 또는 (iii) PROTAC을 일시적으로 중화시킴으로써 PROTAC의 독성 효과를 중화시켜 독성 임계값을 약화시키는 해독제로서 사용된다.
한 실시양태에서, PAX의 항체 성분은 Fc 단편과 같은 항체 단편이다.
8. 비치료적 용도
본 발명의 항-PROTAC 항체, 바람직하게 단일특이성 항체는 또한 PROTAC의 검출, 정량화 또는 정제와 같은 비치료적 용도를 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기와 같은 용도를 위해, 항체는 크로마토그래피 컬럼 또는 일부 다른 고체 지지체 상에 고정화된다.
9. 키트
마지막으로, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 PAX를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 PAX를 함유하는 키트는 단일요법 또는 병용 요법일 수 있는 치료 목적으로 사용될 수 있으며, 이 경우 키트는 추가의 약학 성분을 포함하는 하나 이상의 추가의 약학 조성물을 함유한다. 치료 키트는 또한 투여 지침이 포함된 패키지 삽입물을 함유할 수 있다.
본 발명의 항체를 함유하는 키트는 진단 또는 검출 목적으로 사용될 수도 있다. 상기 키트에서 항체는 전형적으로 고체 지지체, 예를 들어, 조직 배양 플레이트 또는 비드(예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링되고, 시험관내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 PROTAC를 검출 및/또는 정량화하는 데 사용된다. 검출에 유용한 상기와 같은 항체에는 형광 또는 방사성표지와 같은 표지가 제공될 수 있다.
실시예
1. 항-PROTAC 항체 MIC1 및 MIC2
1.1. 합텐 접합
면역원 및 스크리닝 화합물의 제조를 위해, VH032-기반 합텐(VHL-1, VHL-6, VHL-7, VHL-c(도 4))을 접합 완충액(0.1 M MES, 0.9 M NaCl, 0.02% 나트륨 아지드; pH 4.7)에 4 mg/mL의 최종 농도로 따로따로 용해시키고, 10 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 또는 10 mg/mL 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 10 mg/mL 양이온 BSA(cBSA) 및 7 mg/mL 인간 Fc(huFc)(1:100의 최종 단백질:합텐 몰 비)의 용액과 혼합하였다.
상기 혼합물에 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드(EDC)의 10 mg/mL 수용액을 첨가하고(최종 단백질 EDC 몰비 1:1750), 반응물을 밤새 배양하였다. 반응 혼합물을 포스페이트 완충 식염수(PBS, 0.137 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M Na 2 HPO4, 0.0018 M KH2PO4, pH 7.4)(7K MWCO, Thermo Scientific)중에서 미리 평형화된 Zeba Spin 탈염 컬럼을 사용하여 정제하였다. 표준물질로서 비접합 KLH 또는 BSA를 사용하여 Bradford 시약으로 단백질 농도를 측정하였다. MALDI-MS에 의해 BSA 및 huFc 접합체에 대한 접합 효율을 시험하였다. 각각의 개별 접합에 대해 대략적인 합텐-대-운반체 단백질 비를 도출할 수 있다(도 5).
1.2. 면역화 및 하이브리도마 스크리닝
BALB/c 및 CD-1 마우스뿐 아니라 SD 래트를 면역원성 운반체 단백질로서 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 접합된 합텐 VHL-1, VHL-6 및 VHL-7(도 4)의 등몰 혼합물로 면역화하였다. 면역원을 주사한 후, BSA-합텐 접합체를 3중으로 사용하여 ELISA로 모든 동물의 혈청에서 항체 반응을 확인하였다. 동물은 하이브리도마 스크리닝을 사용하여 VHL-리간드 결합 항체에 대한 면역 레퍼토리 스크리닝으로 이어지는 면역 반응을 나타내었다. 도 6은 상세한 작업 계획을 보여준다.
2. MIC 항체의 제조
단일특이성 항체는 Life Technologies의 상응하는 형질감염 키트 및 배지를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 Expi293F 세포에서 중쇄 및 경쇄의 일시적 형질감염에 의해 발현시켰다. 중쇄용 플라스미드 DNA 50 μg 및 경쇄용 플라스미드 DNA 100 μg을 10 mL의 OptiMEM 배지에 희석하였다. 536 μL ExpiFectamine을 10 mL OptiMEM에 첨가한 후 실온에서 5분간 배양하였다. 그런 다음, 플라스미드 희석액을 첨가하였다. 실온에서 20분간 배양한 후, 혼합물을 mL당 2.9x106개 생존 세포의 세포 밀도로 180 mL Expi293 세포에 첨가하였다. 세포 현탁액을 습한 대기에서 37℃, 5% CO2, 80 rpm에서 배양하였다. 18 내지 22시간 후, 1 mL의 인핸서 1 및 10 mL의 인핸서 2를 첨가하였다. 습한 대기에서 진탕하면서 5% CO2 하에 37℃에서 4일 동안 추가 배양한 후, 원심분리(3000 rpm에서 30분)에 의해 항체를 수집하고 0.22 μm 보틀-탑(bottle-top) 필터로 멸균 여과하였다.
상등액을 AKtaXpress 시스템을 사용한 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어 예비 SEC(HiLoad 16/60 Superdex 200 사전준비 등급)로 정제하여 응집물을 제거하였다. 초원심분리 필터 장치(30k MWCO, Amicon)를 사용하여 항체를 농축하고 멸균 여과하고, 280 nm에서 UV-VIS 분광법으로 단백질 농도를 측정하였다. 항체는 동일성에 관한 분석용 SEC, SDS-PAGE 및 LC-MS에 의해 특성화하였다.
3. PROTAC에 대한 항체 결합의 다용성(versatility)
VH032-기반 PROTAC(도 8)의 다양한 세트에 대한 히트(hit) 항체 MIC1 및 MIC2의 결합 친화도를 Biacore T200 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 측정하였다. 실행 완충액은 PBS, 0.05% Tween-20, 2% DMSO로 이루어지며, 온도 및 유량은 각각 30℃ 및 30 μL/분으로 설정하였다. 분석 설정은 도 7에 예시적으로 묘사되어 있다. CM5 센서 칩은 표준 EDC/NHS 화학을 사용하여 항체(= 리간드, 2500 RU)로 코팅하였다. PROTAC(=분석물)은 실행 완충액에 연속적으로 희석되었고(1 μM 내지 1.9 nM), 연속 실행으로 기기에 주입되었으며, 항체에 의해 포획되어 상응하는 SPR 반응의 증가를 야기하였다. 결합 단계(300초) 후, 실행 완충액을 600초 동안 주입하고 PROTAC이 항체에서 해리되어 신호 감소로 이어졌다. 각각의 실행 후, 10 mM 글리신/HCl (pH 1.5)를 2 x 30초동안 주입하여 잔류 결합 PROTAC을 고정화된 항체로부터 제거하여 다음 결합 및 해리 주기를 위해 항체를 재생시켰다. 매트릭스 효과를 상쇄하기 위해, 측정된 SPR 반응 신호에서 리간드를 제외시킨 비활성화된(EDC/NHS, 에탄올 아민) 기준 표면에 대한 분석물 반응을 차감하였다. 또한, DMSO 용매 보정을 수행하고, 분석물 반응을 실행 완충액 신호만큼 차감하였다. 보정된 반응은 1:1 동역학적 결합 모델로 맞춤화하여 PROTAC의 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)뿐 아니라 해리 상수(KD)를 수득하였다.
상응하는 KD, 결합 속도 kon 및 해리 속도 koff를 갖는 16개의 별개의 PROTAC과 결합된 MIC2에 대한 친화도 매개변수가 표 형식(표 2)으로 요약되어 있다. 16개 중 13개(81.3%)의 PROTAC이 나노몰 KD를 갖는 MIC2에 의해 결합되었다. 표 2는 또한 MIC2에 의해 결합되지 않은 1개의 PROTAC에 결합할 수 있었던 MIC1에 대한 친화도 데이터를 포함한다.
[표 2] MIC2와 PROTAC의 조합에 대한 친화도 매개변수 KD, 결합 속도 kon, 해리 속도 koff에 대한 개요(구조 참조, MIC2에 대한 1:1 동역학 결합 모델 및 정상 상태 모델로부터 유도된 MIC1에 대한 PROTAC의 결합에 대한 KD를 사용하여 수득된 도 8. NM = 측정되지 않음; NB = 결합되지 않음.
4. MIC2 및 PROTAC을 사용한 PAX의 제조
항체 MIC2는 글리신-세린 링커 서열에 이어 항-EGFR VHH 항체 서열 또는 항-HER2 scFv 서열을 MIC2의 중쇄에 C-말단에 유전적으로 융합시킴으로써 이중특이적 포맷으로 재포맷화하였다. 단일특이성 항체에 대해 전술한 바와 같이 생산이 이루어졌다. EGFR 및 HER2는 세포의 세포 표면에서 발현되는 종양-관련 항원이므로 항체 결합에 접근할 수 있기 때문에 선택되었다. 또한, 이들은 종양 모델의 이용가능성, 충분한 발현 및 내재화와 관련하여 표적으로서의 유용성을 뒷받침하는 항체-약물 접합체 개발에 이미 적용되었다.
복합체화는 다음과 같이 수행되었다: 10 μM(최종) aEGFRxMIC2 또는 aHER2xMIC2를 PBS(pH 7.4) 중에서 DMSO 중의 GNE987과 혼합하여 목적하는 부하량을 달성하였다(표 3). PBS(pH 7.4) 용액 중 5% Tween-20을 0.3%의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플을 650 rpm으로 진탕하면서 25℃에서 3시간 동안 ThermoMixer에서 배양하였다. 크기-배제 크로마토그래피를 사용한 복합체 조사를 위해 수성 Tween-20을 첨가하지 않았다.
[표 3] 목적하는 부하량을 달성하기 위해 필요한 최종 PROTAC 농도에 대한 개요
PROTAC 결합을 확인하기 위해 일련의 PROTAC에 대한 친화도를 다시 평가하였다. 전반적으로, 이중특이성 항체의 친화도는 MIC2의 친화도에 필적하였다(도 9).
4.1. 부하량-의존적 복합체화
EGFRxMIC2에 0, 10, 25, 50, 75 및 100% GNE987 PROTAC을 부하하고 SEC 시스템에 즉시 주입하였다. 항체 aEGFRxMIC2는 3.15분에서 용출된다. 두 번째 피크는 하나의 PROTAC 분자가 부하된 항체 aEGFRxMIC2에 상응하는 증가된 부하량과 함께 3.48분에서 나타난다. 부하량을 더 증가시키면 4.04분에서 세 번째 피크가 나타난다(항체당 2개의 PROTAC). 전반적으로, 피크 분포는 부하량이 증가함에 따라 늦은 용출 시간쪽으로 이동한다(도 10).
4.2. 완전히 부하된 복합체의 정제 및 복합체 안정성
aEGFRxMIC2 항체에 200% GNE987을 부하하였다. 샘플을 반으로 나누고 제조업체의 지시에 따라 Zeba Spin 탈염 컬럼, 40K MWCO, 75 μL를 사용하여 한 부분을 PBS(pH 7.4)로 탈염하였다. 크로마토그램은 약 5.7분에서 용출되는 DMSO 및 PROTAC의 제거를 보여준다(도 11).
도 11의 피크를 적분하고, 비정제 및 정제 항체-PROTAC 복합체에 대한 피크 분포를 플롯팅하였다(도 12). 피크 분포는 탈염 공정의 영향을 받지 않고 유지되며, 이는 PAX가 PROTAC 부하량에 영향을 주지 않고 과량의 PROTAC 또는 기타 소분자로부터 정제될 수 있음을 시사한다.
aEGFRxMIC2+GNE987 복합체를 PBS(pH 7.4)에서 시간 경과에 따른 복합체 안정성을 평가하기 위해 실온에서 70시간에 걸쳐 10 μM의 단백질 농도에서 연구하였다. 피크 분포는 증가된 배양 시간의 영향을 받지 않으며(도 13), 이는 70시간 이상의 복합체 안정성을 시사한다.
5. PAX 접근법의 기능
5.1. 공유 PROTAC-ADC
대조군 PROTAC-ADC는 WO 2020086858 A1호에 따라 L328C 돌연변이를 운반하는 항-EGFR 항체 세툭시맙(C225)에 1(도 14)을 접합시켜 제조하였다. 최종 접합체는 97.0%의 단량체 함량을 가지면서 질량 분석에 따른 약물-대-항체 비가 1.62였다.
5.2. BRD4 분해
BRD4는, BRD4의 분해시 유도되는 강력한 약리학적 효과(세포 사멸)로 인해 개시된 본 발명에 대한 모델 단백질로 선택되었다. 표적화된 BRD4 분해를 평가하기 위해, MDA-MB-468 세포를 검은색 96웰 투명 바닥 플레이트(10,000개 세포/웰)에 접종한 후 밤새 습한 챔버에서 배양하였다(37℃, 5% CO2). D300e 디지털 디스펜서(Tecan)를 사용하여 시험 화합물을 첨가하고 43시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2, 습한 챔버). 세포를 PBS로 3회 세척하고, 실온에서 2%(v/v) 포름알데히드에 15분 동안 고정한 후 다시 세척하였다(3회). 세포를 투과시키기 위해, 0.2%(v/v) Triton-X-100을 실온에서 10분 동안 첨가하고 PBS(3x)로 세척하여 제거하였다. 웰을 PBS 중 3%(w/v) BSA로 실온에서 60분 동안 차단하고, 3회 세척하고, 세포를 3% BSA/PBS에 희석된 2.3 μg/mL 토끼 항-BRD4 항체(Abcam)와 함께 60분 동안 4℃에서 밤새 배양하였다. PBS(3x)로 세척한 후, 세포를 2차 표지 AF488 염소 항-토끼 항체(3% BSA/PBS 중 5 μg/mL)와 함께 실온에서 어두운 상태로 120분 동안 배양하고, 3회 세척하고, 핵을 실온에서 어두운 상태로 Hoechst 33342(5 μg/mL 3% BSA/PBS)로 90분 동안 염색하였다. 최종 세척 단계 후, 세포를 0.1%(w/v) 나트륨 아지드에 보존하고 Cytation 5 세포 영상화 판독기(Biotek)로 옮겼다. DAPI(핵) 및 녹색 형광 단백질(BRD4) 필터 큐브를 적용하여 영상을 촬영하고, BioTek gen5 데이터 분석 소프트웨어로 처리하였다. 핵 BRD4 수준의 정량 분석을 위해, DAPI 염색과 공동-국소화된 녹색 형광(AF488)만 계수하였다. 녹색 형광은 세포 수에 따라 표준화하였으며 처리되지 않은 세포에 대해 나타내었다.
도 15는 BRD4 수준의 예시적인 영상을 보여준다. 형광이 높을수록 MDAMB468 세포에서 BRD4의 이용가능성이 높다는 것을 나타낸다는 것을 유의하는 것이 중요하다. 미처리 세포는 가장 강한 녹색 형광을 나타내는 데, 이는 GNE987, EGFR 항체 세툭시맙(짧은 C225) 및 50% GNE987이 부하된 aEGFRxMIC2를 기반으로 하는 항-EGFR PROTAC-항체-약물 접합체 C225-L328C-GNE987에 의해 매개되는 BRD4 분해에 의해 억제될 수 있다. 이들 분자는 BRD4 분해에 대해 필적하는 효과를 갖는다. GNE987에 의한 분해 유도는 MDAMB468 세포에 결합하지 않는 aHER2xMIC2와의 복합체화에 의해 감소될 수 있다.
핵의 형광을 사용하여 분석물의 분해 효과를 정량화할 수 있다(도 16). 형광 영상에서 이미 관찰된 경향은 전체 농도 범위에 걸쳐 다시 볼 수 있다(도 16A). 더 간단한 비교를 용이하게 하기 위해 4 nM 처리 농도에서 BRD4 값을 확대하였다(도 16B). GNE987은 남은 BRD4의 39.0%에 이르는 가장 강한 분해 효과를 나타냈다. GNE987이 부하된 aEGFRxMIC2 및 C225-L328C-GNE987는 거의 동일한 방식으로 BRD4를 분해하였다(각각 44.0% 및 44.2%). GNE987이 부하된 aHER2xMIC2에 의해 유도된 분해는 57.3%에 달하며 이는 상응하는 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체에 비해 13.3% 더 낮았다.
결론
GNE987과 복합체화된 aEGFRxMIC2는 PROTAC GNE987 및 PROTAC-항체-약물 접합체 C225-L328C-GNE987과 유사하게 EGFR-발현 MDAMB468 세포에서 BRD4 분해를 유도하였다. aHER2xMIC2+GNE987 복합체는 HER2 발현의 결여로 인해 MDAMB468 세포에 진입할 수 없기 때문에 GNE987과 복합체화된 aHER2xMIC2에 대해 감소된 BRD4 분해가 관찰되었다.
5.3. BRD4-분해 PROTAC의 항체-매개 전달을 통한 선택적 세포 사멸
BRD4 분해는 나노몰 내지 나노몰 이하 범위의 효능을 갖는 여러 세포주에서 강력한 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25]).
웰당 2000개의 세포를 백색-불투명 384-웰 플레이트에 접종한 후 37℃ 및 5% CO2의 습한 챔버에서 밤새 배양하였다. 복합체화는 4편에 기술된 바와 같이 수행하였다.
Tecan D300e 디스펜서를 사용하여 항체 농도를 기준으로 용액을 세포에 첨가하고, PBS(pH 7.4) 및 DMSO 중 0.3% TW20을 사용하여 모든 웰을 동일한 부피로 표준화하였다. 달리 언급되지 않는 한, 제조업체의 프로토콜에 기술된 바와 같이 CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석을 이용하여 3일 후에 분석을 개시하였다. 간략하게, 플레이트를 30분 동안 실온으로 평형화시켰다. 100 mL CellTiter-Glo 완충액을 CellTiter-Glo 기질 플라스크에 첨가하고 잘 혼합하였다. 30 μL의 시약을 각 웰로 옮겼다. 550 rpm으로 진탕하면서 실온에서 3분간 배양한 후, 플레이트를 실온에서 10분간 더 배양하였다. Envision 판독기에서 발광을 판독하였다. 샘플로 처리된 세포를 미처리 세포로 표준화함으로써 GraphPad Prism 8을 사용하여 평가를 수행하였다. IC50 값을 측정하기 위해 데이터를 4점 로지스틱 곡선(logistic curve)으로 맞춤화하였다.
EGFR 고발현 MDAMB468 세포에서, BRD4-분해 PROTAC GNE987뿐만 아니라 EGFR-결합 PROTAC-항체 접합 C225-L328C-GNE987(DAR=1.62) 및 50% GNE987과 복합체화된 EGFR-표적화 이중특이성 항체 aEGFRxMIC2(1:1)는 필적하는 효능을 가졌다. GNE987의 세포독성 효과는 VH032-결합 항체 MIC2 뿐만 아니라 비-결합 aHER2xMIC2+GNE987(1:1)과의 배양에 의해 억제되었다(도 17). PROTAC이 없는 이중특이성 항체는 시험된 농도 범위에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다.
이중특이성 항체 및 항-VH032 항체 MIC2의 부하량을 25%로 감소시키면 EGFR-표적화 복합체 aEGFRxMIC2+GNE987(1:0.5)의 효능이 감소되었다. 동시에, 비결합 대조군 aHER2xMIC2 및 MIC2의 세포 생존율에 대한 영향도 감소된 부하량에서 감소되었다(도 18).
비결합 대조군 복합체 MIC2+GNE987 및 EGFR-표적화 aEGFRxMIC2+GNE987의 효능은 복합체의 부하량에 따라 달라진다(표 4).
[표 4] 25% 및 50% 부하량에서 GNE987과 복합체화된 EGFR-결합 aEGFRxMIC2 및 비결합 대조군 MIC2의 IC50 값
선택성 지수는 비결합 대조군 복합체의 효능을 각각의 부하량에 대해 EGFR-표적화 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체로 나누어서 계산할 수 있다. 선택성 지수는 50%(1:1) 부하량의 경우 12.9이고 25%(1:0.5) 부하량의 경우 29.4에 이른다.
실험은 생물학적으로 3중으로 수행되었다. 분자의 효능은 표 5에 요약되어 있으며 도 19에 그래프로 묘사되어 있다.
[표 5] MDAMB468에서 EGFR-결합 aEGFRxMIC2+GNE987 복합체 및 대조군의 IC50 값. 효능 및 표준 편차는 세 번의 독립적인 실험에서 유도된다.
GNE987과 EGFR 결합 aEGFRxMIC2와의 복합체화는 비결합 aHER2xMIC2와 GNE987의 복합체에 비해 42배 더 높은 효능을 야기하고, 비결합 MIC2 항체와 GNE987의 복합체에 비해 21배 더 높은 효능을 야기한다.
또한, aEGFRxMIC2뿐 아니라 50% GNE987과 복합체화된 aHER2xMIC2를 PROTAC GNE987 단독, 비표적화 MIC2+GNE987 복합체 및 EGFR을 표적으로 하는 PROTAC-ADC(C225_L328C-GNE987)를 포함한 여러 벤치마크와 함께 EGFR-음성 세포주 HEPG2에서 조사하였다(도 20). PROTAC 자체는 3.1 nM의 IC50 값으로 HEPG2 세포에서 강한 항증식 효과를 가진 반면, 모든 항체-기반 구조물은 IC50 값 > 100 nM을 가졌다. GNE987과 복합체화된 aEGFRxMIC2 및 MIC2는 GNE987의 독성을 가장 강력하게 억제하였고 100 nM에서 최소한의 독성(약 10%)만 유도하였다.
결론
세포 생존율 분석 데이터는 BRD4 분해 데이터를 뒷받침한다. A) aEGFRxMIC2+GNE987(50%) 복합체는 PROTAC-ADC C225-L328C-GNE987 및 PROTAC GNE987과 비교하여 EGFR-발현 MDAMB468 세포에 대해 유사한 세포독성 효과를 나타낸다. B) 항체 복합체가 표적화 모이어티가 완전히 결여되어 있기 때문에(MIC2+GNE987(50%)) 또는 항체의 표적 수용체가 MDAMB468에서 발현되지 않기 때문에(aHER2xMIC2+GNE987(50%)) 세포에 진입할 수 없는 항체 복합체는 감소된 항-증식 효과를 갖는다. 또한, EGFR을 발현하지 않는 HEPG2 세포에서, 모든 항체-기반 복합체 및 접합체의 세포독성은 표적화 모이어티가 결여된 PROTAC 단독에 비해 감소하였다.
5.4. 추가 PROTAC의 표적화 전달
또 다른 PROTAC의 표적화 전달을 입증하기 위해, 친수성 PEG 링커를 갖는 GNE987 유사체인 GNE987P(도 21)를 MIC2 또는 aEGFRxMIC2와 복합체화하고 EGFR-발현 MDAMB468 세포에서 배양하였다(도 22). aEGFRxMIC2+GNE987P는 0.1 내지 10 nM의 농도 범위에서 GNE987P 단독에 비해 증가된 세포독성을 매개하며, 이는 aEGFRxMIC2에 의한 GNE987P의 표적화된 세포내 전달을 나타내는 반면, 비결합 대조군 구조물 MIC2+GNE987P는 독성이 현저히 낮았다.
6. 마우스 혈청 안정성
항체 aEGFRxMIC2를 GNE987과 최종 농도가 각각 40 μM이 되도록 혼합하였다. 혼합물을 650 rpm으로 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 15%(v/v) 2 M HEPES 완충액(pH 7.55)을 Biowest(Lot.no. S18169S2160)의 마우스 혈청에 첨가한 후 멸균 여과하였다.
aEGFRxMIC2+GNE987 및 GNE987을 마우스 혈청-HEPES 혼합물을 사용하여 5 μM로 희석하고 37℃ 및 5% CO2에서 0, 2, 4, 6, 24, 48, 72 및 96시간 동안 배양하였다. -20℃에서 동결하여 배양을 중단하였다.
PROTAC GNE987의 농도는 LC-MS를 이용하여 정량하였다. GNE987 및 aEGFRxMIC2와의 복합체로 GNE987은 72시간 동안 안정하였다(도 23).
또한, 96시간 동안 마우스 혈청에서 배양한 샘플에서 온전한 aEGFRxMIC2 항체의 농도를 정량화하였다. 총 항체 ELISA를 사용하여 정량화를 수행하였다(도 24). 온전한 항체의 농도는 영향을 받지 않았으며, 이는 이중특이성 항체의 높은 혈장 안정성을 입증한다.
또한, GNE987과 복합체를 이루는 aEGFRxMIC2를 마우스 혈청에서 0시간 및 96시간 동안 배양한 후 샘플에 친화성 포획 분석을 실시하였다. 그러므로, 비드를 볼텍싱하고 1.5 mL LoBind 튜브로 옮긴 후 500 μL HBS-E 완충액으로 3회 세척하였다. 0.2 μg/μL Biotin-SP(긴 스페이서) AffiniPure 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)를 비드에 첨가하고 회전기에서 2시간 동안 배양하였다. 비드를 500 μL HBS-E 완충액으로 3회 세척하였다. 20 μL의 0.5 μg/μL 샘플을 HBS-E 완충액으로 0.1 μg/μL로 희석하고, 비드에 첨가하고, 회전기에서 2시간 동안 배양하였다. 상등액을 수집한다. 100 μL 아세토니트릴을 비드에 첨가한 후 1000 rpm에서 30분간 배양하고 용출액을 수집하였다. GNE987은 LC-MS/MS를 사용하여 상등액 및 용출액으로부터 정량화하였다.
혈청 상등액에서는 GNE987이 검출되지 않았지만, 용출액은 여전히 항체에 결합된 온전한 GNE987 96.7%를 포함하였다. 놀랍게도, 항체-결합된 GNE987은 용출액에서 96시간 후에도 여전히 검출될 수 있었는 데, 이는 높은 안정성을 시사한다(도 25).
7. 저장 안정성
항체-PROTAC 복합체의 저장 안정성은 복합체화(6 mg/mL, 650 rpm, 3시간, 실온) 후에 냉장고에서 4℃에서 96시간 동안 배양하고 복합체를 급속 냉동하고 -80℃서 24시간 동안 또는 -20℃에서 96시간 동안 저장하여 평가하였다. 이어서, 샘플을 가시적인 변화에 대해 확인하고, DLS 측정을 이용하여 다분산성을 평가하고, 부하량을 SE-HPLC를 통해 측정하였다(표 6). 15% 이하의 다분산성을 갖는 샘플은 단분산성으로 간주된다.
[표 6] PBS(pH 6.8), 최종 5% DMSO에서 항체-PROTAC 복합체의 저장 안정성 평가
데이터는, 다분산성뿐 아니라 부하량도 크게 변하지 않았기 때문에 복합체의 높은 저장 안정성을 나타낼 뿐만 아니라 소수성 GNE987이 MIC2의 존재하에서 침전되지 않았기 때문에 PROTAC 소수성에 대한 차폐 효과가 관찰되었음을 나타낸다.
8. VHH 기반 항체 및 PAX
8.1. 면역화
신세계 낙타과(NWC)를 KLH-기반 면역원과 cBSA-기반 면역원으로 교대로 면역화하였다(일정 도 26). VHL 리간드 특이적 면역 반응을 모니터링하기 위해 huFc-합텐 접합체를 사용하여 혈청 ELISA 분석을 수행하였다. 모든 동물은 면역화 후에 면역 반응을 나타내었다.
8.2. 항체 유전자 라이브러리
VHL 리간드 특이성 항체의 선택을 위해 3개의 면역화된 NWC의 면역 레퍼토리로부터 면역 라이브러리를 생성하였다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 동물의 혈액에서 단리하였다. RNA를 추출, 정제하고 cDNA 합성에 사용하였다. 그런 다음, cDNA 풀을 PCR에 의한 VHH 유전자 서열의 증폭에 사용하고, VHH 항체-파지 디스플레이 벡터에 클로닝하여 에스케리키아 콜라이의 형질전환에 사용하였다. 항체-유전자 라이브러리의 크기는 연속 희석 및 콜로니 계수로 측정하였다. 추가로, 삽입물-비율은 cPCR로 측정하였고, 기능적 ORF를 갖는 클론의 수는 DNA 서열 분석으로 측정하였다. 그후에, 형질전환된 세균을 증식시켜 항체-파지 입자의 패키징에 사용하였다. 항체-파지 입자를 정제한 후, 항체-pIII 융합 단백질의 존재를 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯팅 및 항체-파지 입자의 항-pIII 면역블롯 염색을 통해 확인하였다. 라이브러리 특성에 대한 개요는 아래에 제공되어 있다(표 7).
[표 7] 파지 디스플레이를 사용한 항체 히트 발견 캠페인을 위한 라이브러리 특성
8.3. 항체 발견
먼저, 비특이적 또는 교차-반응성 항체-파지로부터 라이브러리를 제거하였다. 이를 위해, 라이브러리를 고정화된 스트렙타비딘, 자성 스트렙타비딘 비드 및 BSA의 존재 하에 배양하였다. 음성 항원에 결합된 항체-파지를 추가 선별로부터 제거하였다.
그 후, 제거된 라이브러리를 표적 항원 특이성 항체에 대해 선별하였다. 이를 위해, VH032 및 펜던트 아민을 갖는 PEG화 가교결합제의 접합체를 획득하고(Sigma-Aldrich; 도 27) 비오틴-NHS-에스테르 커플링을 통해 비오틴화시켰다. 비오틴화된 VH032를 정제하고 HPLC로 분석하였다. 먼저, 비오틴화된 VH032를 제거된 라이브러리 제제에 첨가하였다. 비오틴화된 표적 항원에 결합된 항체-파지를 자성 스트렙타비딘 비드를 사용하여 용액으로부터 포획하고 회수하였다. 비특이적이거나 약하게 결합된 항체-파지 입자를 제거하기 위해 비드를 BSA 용액(0.05% Tween20 함유) 및 PBS로 여러 번 세척하였다. 항원-특이적 항체 파지를 트립신 처리에 의해 비드로부터 용출하고 에스케리키아 콜라이 감염에 의해 활성화(rescue)시켰다. 짧은 증식 후, 세균을 M13K07 헬퍼파지로 동시-감염시키고 항체-파지 증폭을 유도하였다. 면역 라이브러리에서 유래된 증폭된 파지는 전술한 바와 같이 2회 이상의 선별 주기에 사용되었다.
8.4. 항체 스크리닝
항체-파지 선별 후, 단일클론 항체 클론의 결합 특성을 ELISA로 분석하였다. 면역 라이브러리의 경우, 선별 주기 2주기 및 3주기 후의 선별 산출물을 사용하였다. 세균에서의 VHH 항체 발현을 위해 384개의 단일 클론을 선택하였다. 생산물을 다음에서 ELISA로 결합 특이성에 대해 시험하였다.
* 스트렙타비딘 + 비오틴화 VH032
* 스트렙타비딘
* 인간 Fc-VHL-1
* 인간 FC
다음과 같은 경우, 항체 클론을 항원 특이적인 것으로 식별하였다:
양성 항원에 대한 ELISA 결합 신호가 ≥ 0.1인 경우
음성 항원에 대한 ELISA 결합 신호가 ≤ 0.1인 경우
양성 항원과 음성 항원 사이의 신호-대-잡음(S/N) 비가 ≥ 10인 경우
모든 562개 히트를 DNA-서열 분석에 사용하여 고유한 항체 서열(CDR에서 ≥1개 아미노산 차이)을 갖는 항체를 식별하였다. NWC 라이브러리에서 113개의 고유한 클론을 식별하였다.
가장 좋은 결합 친화도를 갖는 클론을 식별하기 위해, BLI 해리 속도 측정을 수행하였다. 먼저, VHH 함유 배양 상등액을 고유 클론중에서 생산하였다. 그 후, BLI 스트렙타비딘 센서에 고정화된 비오틴화 VHL에 대한 항체 단편의 결합 및 해리를 측정하였다. 결합 곡선을 1:1 결합 모델로 맞춤화하고 해리 속도를 계산하였다.
해리 속도 및 항체 서열 정보에 기반하여, 10개의 리드 클론(MIC5 내지 MIC14로 명명)을 선택하여 최종 포맷으로 전환시켰다.
8.5. 항체 전환
VHH 유전자를 PCR에 의해 파지미드 DNA로부터 증폭시키고 2개의 상이한 IgG 발현 벡터에 클로닝하였다. 하나의 발현 벡터는 EGFR-표적화 세툭시맙 IgG 항체를 암호화하였다. 다른 발현 벡터는 CD33-표적화 겜투주맙 IgG 항체를 암호화하였다. VHH 항체 단편을 발현 벡터에 삽입하기 위해, 상기 단편을 IgG 항체 중쇄의 C-말단에 유전적으로 융합시켰다. 항체 단편을 짧은 GS-링커(GSGGGSGGSGGGGSG(서열번호 28))를 통해 IgG 중쇄로부터 분리하여, 다음 포맷: HC-링커-VHH를 생성하였다.
서열 검증 및 형질감염-등급 DNA의 제조 후에, HEK 세포를 하나의 VHH 클론의 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 항체는 HEK 세포에 의해 생산되었으며 7일 동안 배양 배지로 분비되었다. 원심분리에 의해 세포로부터 배양 상등액을 제거한 후, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 IgG 항체를 정제하였다. 완충액을 PBS로 조정한 후, UV/VIS 분광법으로 항체의 단백질 농도를 측정하였다. 항체의 완전성 및 순도는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 평가하였다. 표적 항원에 대한 항체의 기능적 결합 활성을 ELISA로 측정하였다.
추가로, 모 항체 대 융합 단백질의 발현 속도를 비교할 수 있도록 동일한 절차를 사용하여 모 항체를 생산하였다. 세툭시맙 및 겜투주맙에 대한 VHH 융합에 대한 데이터는 도 28에 예시적으로 묘사되어 있으며, 이는 VHH 융합이 생산성에 큰 영향을 미치지 않음을 입증한다.
8.6. PROTAC에 대한 VHH 결합의 다용성
단백질-PROTAC 상호작용의 동역학 및 친화도 매개변수를 SPR로 평가하였다. 항-PROTAC VHH 클론 MIC5 내지 MIC14를 CD33 또는 CLL1 항체 융합물(융합 단백질의 제조 및 사용된 링커는 9편에 기술되어 있음)로서 25℃에서 표준 아민 커플링 절차를 통해 CM5(시리즈 S) 센서 칩 상에 고정화시켰다. 고정화 전에, 칩의 카복시메틸화된 표면을 400 mM 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 및 100 mM N-하이드록시숙신이미드로 7분 동안 활성화시켰다. CD33 및 CLL1 항체 융합물로서 히트 항-PROTAC VHH를 pH 4.5에서 10 mM 아세테이트에 10 μg/mL로 희석하고, 3,000 내지 6,000 반응 단위(RU)에 도달하기 위해, 활성화된 표면 칩에 7분 동안 고정화시켰다. 나머지 활성화된 카복시메틸화기는 1 M 에탄올아민(pH 8)을 10분간 주입하여 차단하였다. 10 mM HEPES(pH 7.4) 및 150 mM NaCl로 이루어진 HBS-N을 고정화 동안 배경 완충액으로 사용하였다.
PROTAC을 DMSO에 미리 희석하고, 실행 완충액(12 mM 포스페이트(pH 7.4), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% Tween20, 2% DMSO)에 1:50으로 희석하고, 2배 희석 시리즈를 사용하여 1 μM에서 0.002 μM까지 10개의 상이한 농도로 주입하였다. 벌크 신호의 변화를 고려하고 고품질 데이터를 얻기 위해 DMSO 용매 보정(1% 내지 3%)을 수행하였다. 상호작용 분석 주기는 300초의 샘플 주입(30 μL/분; 결합 단계)에 이어 900초의 완충액 유동(해리 단계)으로 구성되었다.
모든 센서그램은 먼저 대조군 표면(기준 유동-채널)에서 기록된 결합 반응을 차감하고, 이어서 활성 유동-채널(고정화된 표적 단백질)에서 완충액 블랭크 주입을 차감함으로써 처리되었다. 모든 데이터 세트는 동역학적 속도 상수를 측정하기 위해 단순 1:1 Langmuir 상호 작용 모델에 맞춤화하였다. 실험은 25℃에서 Biacore 8k+(Cytiva, 스웨덴 웁살라 소재)에서 수행하였으며, 상호작용은 제공된 Biacore Insight 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
결과는 표 8에 요약되어 있다. 이 연구의 PROTAC은 가능한 다양한 일련의 분자를 시험하기 위해 화학 구조를 기반으로 선택되었다. 일반적으로, 모든 항체는 나노몰이하에서 세-자릿수 나노몰까지의 친화도 하에 다양한 PROTAC에 결합하였다.
시험된 모든 변이체로부터, MIC7 항-PROTAC VHH는 한 자릿수 나노몰에서 심지어 나노몰이하까지의 친화도를 갖는 대다수의 PROTAC에 결합하는 가장 유리한 결합 프로필을 가졌다. MIC7 클론은 단백질 결합 모이어티에 대한 링커가 R1 및 R2에서 존재하지만 R3에는 존재하지 않는 모든 PROTAC를 허용한다. 링커 화학과 관련하여, 관찰된 어떤 종류의 MIC7-PROTAC 결합에도 부정적인 영향은 없었다. 또한, MIC7은 R4의 일반적인 메틸기를 허용한다. 마지막으로, CD33-결합 항체 융합물 대신 CLL1-결합 항체 MIC7 VHH 융합물(CLL1xMIC7)을 사용한 SPR PROTAC 결합 측정은, 결합 친화도가 영향을 받지 않았기 때문에 PROTAC 결합이 다른 항체에 대한 융합에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다(표 8).
[표 8] SPR을 사용하여 결정된 PROTAC에 대한 VHH 클론의 친화도(KD). VHH는 항-CD33 또는 항-CLL1 항체의 중쇄에 C-말단 첨가에 의해 항체 융합 단백질로서 연구되었다. N/D - 검출되지 않음(완전한 PROTAC 구조는 도 8에서 찾을 수 있음).
9. VHH-기반 PAX의 제조
다양한 질병-관련 세포주에 PROTAC을 전달하도록 VHH 항체 단편을 IgG-유형 항체의 중쇄 및 경쇄에 융합시켰다. 융합은 다음과 같이 이루어졌다: 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 및 경쇄를 링커(GSGGGSGGSGGGGSG(서열번호 28))에 이어 VHH(예를 들어, YU734-F06(MIC7))의 서열에 의해 c-말단으로 연장하였다. 이러한 방식으로, 세포 표면 수용체를 인식하고 동시에 PROTAC의 VHL-리간드에 결합할 수 있는 이중특이성 항체가 도 3에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다. 링커-VHH(링커: GSGGGSGGSGGGGSG(서열번호 28)) 서열은 반복 단위(예를 들면, 링커-VHH-링커-VHH, 즉 2개의 반복서열)로서 HC, LC 또는 둘 다에 여러 번 융합될 수 있다. 쇄당 최대 3개의 링커-VHH가 HC, LC 또는 둘 다에 융합되었다. 명명법은 다음과 같다: 하나의 MIC7 VHH가 상기 언급된 링커를 통해 각 중쇄의 C-말단에 융합된 CD33 표적화 항체를 CD33xMIC7으로 명명한다. 이것은 다른 모든 구조물에 사용된 하기의 명명법에 유일한 예외이다: 이때, 일반화된 공식: CD33xMIC7NHML이 적용되고, 이때 N과 M은 2, 4, 6이다. "H"는 융합이 중쇄에서 이루어졌음을 나타내고, "L"은 LC에 대한 융합을 나타낸다. VHH가 HC 또는 LC에 융합되지 않은 경우, 각각의 문자는 없어진다. 예를 들어, 2개의 MIC7 VHH(링커-VHH-링커-VHH, 즉 2개의 반복서열)가 각 중쇄의 C-말단뿐만 아니라 각 경쇄의 C-말단에 융합된 CD33 표적화 항체는 CD33xMIC74H4L로 불린다. 이중특이성 융합 단백질을 생성하기 위해 사용된 항체 주쇄 및 주쇄 변경을 표 9에 나타내었다. 표 10은 예로서 CD33을 표적으로 하는 PAX의 명명법을 보여준다.
[표 9] VHH 항체 단편과의 융합을 위한 IgG-유형 항체 주쇄
항체 생산은 2편에 기술된 바와 같이 수행하였다. PAX를 생성하기 위한 복합체화는 다음과 같이 수행하였다: 10 μM(최종) 항체-VHH 융합물을 PBS(pH 7.4)에서 DMSO 중의 VHL-기반 PROTAC과 혼합하여 목적하는 부하량을 달성하였다(표 3). 생체내 적용을 위해 결정된 PAX는 68.8 μM의 항체 농도에서 복합체화되었다.
분배를 위해, PBS(pH 7.4) 용액 중의 5% Tween-20을 0.3%의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플을 650 rpm으로 진탕하면서 25℃에서 3시간 동안 ThermoMixer에서 배양하였다.
[표 10] CD33을 표적으로 하는 PAX의 명명법
10. VHH-기반 PAX의 세포 특성화
10.1. 세툭시맙과 겜투주맙의 융합물로서 VHL-기반 PROTAC 결합 항체 단편의 세포 프로파일링
9편에 기술된 바와 같이 VHH를 링커(GSGGGSGGSGGGGSG(서열번호 28))를 통해 각 항체의 HC에 유전적으로 부착하여 겜투주맙 및 세툭시맙-기반 VHH 융합물을 생성하였다. 발현 및 정제 후에, 항체 융합 단백질에 GNE987을 1:1 비(50% 부하량)로 부하하였다. 이러한 방식으로, 10개의 VHH 항체 단편을, 표적-양성 세포에서 세포 사멸을 유도하거나(10.5편에 기술된 바와 같이) 또는 비-표적화 세포로의 비-선택적 흡수를 방지하는 능력과 관련하여 특성화할 수 있었다. 결과는 표 11에 나타내었다. 선택성의 척도로서 선택성 지수를 도입하였다. 첫째로, 겜투주맙-기반 구조물의 효능을 세툭시맙-기반 구조물의 효능으로 나누어 동일 세포 배경에서 구조물을 비교할 수 있는 선택성 지수를 수득한다. 이 경우, 클론 MIC5-MIC8은 세포 배지에서 3일 배양 시간 동안 상기 구조물이 PROTAC에 결합한다는 것을 입증하는 가장 높은 선택성 지수를 나타내었다. 둘째, EGFR-음성 HEPG2 세포에 대한 세툭시맙-기반 구조물의 효능을 수용체-발현 의존적 흡수에 의해 매개되는 선택성의 척도인 EGFR-양성 MDAMB468 세포에 대한 동일한 구조물의 효능으로 나누었다. 이 경우, 구조물 MIC7-MIC10이 최고의 선택성 지수를 산출하였다. 높은 선택성을 나타내는 한가지 추가 매개변수는 세포 독성이 예상되지 않은 HEPG2 세포에서 PROTAC이 부하된 융합 단백질의 효능이다. PROTAC 단독으로는 HEPG2에서 2.6 nM의 IC50 값을 갖는다. 이것은 PROTAC이 이미 세포 외부로 방출되어 강력한 세포 사멸을 유도한다는 것을 나타낸다. 이와 대조적으로, VHH-기반 구조물은 >100 nM의 효능으로 강한 해독 효과를 유도하였다. 전반적으로, 클론 MIC5, MIC7 및 MIC10은 특히 친화도(8.6편)를 고려할 때 유망한 프로필을 나타내었다.
[표 11] EGFR-양성 MDAMB468 세포 및 MDAMB468-음성 HEPG2 세포에서 PROTAC GNE987과 결합된 CD33-결합 겜투주맙(G)- 및 EGFR-결합 세툭시맙(c)-기반 VHH 융합 단백질의 세포 프로파일링. IC50 값을 사용하여 선택성 지수를 계산하였다.
10.2 주쇄 항체의 세포 결합은 VHH 융합 및 PAX에 PROTAC의 부하에 의해 영향 받지 않는다
CD33-결합 항체 겜투주맙(IgG4-PG-SPLE) 또는 EGFR-결합 항체 세툭시맙에 대한 9편에 기술된 링커(GSGGGSGGSGGGGSG(서열번호 28))를 통한 VHH 융합물의 세포 결합에 대한 영향을 유세포측정을 이용하여 조사하였다. 그러므로, CD33-발현 MV411 세포에 대한 VHH MIC5이 융합되지 않은 CD33xMIC5 및 CD33 Ab의 결합을 평가하였다. 1x105개의 MV411 또는 MDAMB468 세포를 둥근 바닥 96웰 플레이트에 접종하고, 1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후, 얼음 위에서 30분 동안 각각의 항체와 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS (pH 7.4), 1%(w/v) BSA로 3회 세척하고 형광 표지된 2차 항체 Alexa Fluor 488 AffiniPure Fab 단편 염소 항-인간 IgG(H+L)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS (pH 7.4), 1%(w/v) BSA로 3회 세척하였다. Intellicyt iQue3 스크리너에서 유세포측정으로 세포를 분석하고, IntelliCyt ForeCyt Enterprise Client Edition 8.0(R3) 소프트웨어를 통해 분석하였다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FCS에서 배양하였다. 직접 비교함으로써 VHH MIC5의 첨가가 세포 결합에 영향을 미치지 않음이 입증되었다(도 29).
이어서, PROTAC을 항체-VHH 융합물에 부하하는 것이 세포 결합 양상에 어느 정도 영향을 미치는지 조사하였다. 그러므로, HL60, MOLM13, MV411, RAMOS 및 U937에 대한 세포 결합을 CD33-결합 항체-VHH 융합 CD33xMIC7에 대해 측정하였다. 90% GNE987이 부하된 동일한 분자의 결합을 평가하였다. 이소타입 비결합 대조군으로서, 디곡시게닌 결합 항체를 사용하였다. 세포 염색에 사용하기 전에, CD33xMIC7을 25℃에서 1.8배 몰 과량의 5% DMSO-용해된 GNE987과 함께 1% FCS 함유 PBS에서 650rpm으로 진탕하면서 3시간 동안 배양하였다. 이소타입 비결합 대조군은 5% DMSO와 함께 배양하여 분석하였다. 각 세포주에서, 조건 당 200,000개의 세포를 채취하고, 원심분리하고, 10 μg/ml 농도로 1% FCS 함유 PBS 200 μl 중에서 각각의 항체, 항체-VHH 융합물 또는 PAX 조건과 함께 4℃에서 45분 동안 배양하였다. 1% FCS 함유 PBS로 담금질(quenching) 및 1회 세척 단계 후, 이어서 샘플을 플루오레세인-표지된 항인간 항체 #607(1:50)로 추가 45분 동안 처리하였다. 1% FCS 함유 PBS로 담금질 후, Becton Dickinson FACSCalibur 유세포측정기에서 수행된 분석동안 배제되도록 사멸 세포를 염색하는 1 μg/mL 프로피듐 요오드(PI) 함유 PBS에 세포를 재현탁하였다. Turku Bioscience의 Flowing 소프트웨어를 사용하여 정량 분석을 수행하였다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FCS에서 배양하였다.
PROTAC을 항체-VHH 융합물에 부하시키는 것은 도 30에서 입증되듯이 결합에 영향을 미치지 않았다. 이소타입 대조군 항체는 세포주 패널에 크게 감소된 결합을 나타내었다.
10.3. CD33 PAX(pHAb 염료 함유)는 CD33 양성 세포에 내재화된다
PAX 흡수가 수용체 매개 세포내도입에 의해 매개되는지 확인하기 위해, CD33xMIC7에 pH 반응성 VH032-pHAb 염료를 부하하였다(도 31). VH032-pHAb 염료는 pH >7에서는 최소한의 형광만 나타내지만 산성 pH에서는 상당히 증대된 형광을 나타내는 pH 센서이다. 그러므로, 수용체-매개 내재화시 CD33xMIC7+VH032-pHAb 염료를 산성 엔도솜 및 리소좀 소포로 수송하면 증대된 형광 신호를 야기해야 한다. 세포 염색에 사용하기 전에, CD33xMIC7을 어두운 상태에서 1.8배 몰 과량으로 5% DMSO-용해된 VH032-pHAb 염료와 함께 PBS 중에서 650 rpm으로 25℃에서 2시간 동안 배양하였다. CD33-양성 MOLM13, MV411, U937 및 수용체 음성 RAMOS 세포를 대조군으로서, 생성된 PAX 또는 VH032-pHAb 염료 단독으로 처리하였다. 각각의 세포주에서, 조건 당 200,000개의 세포를 채취하고, 원심분리하고, 37 ℃에서 어두운 상태에서 650 rpm으로 진탕하면서 10 μg/ml 농도로 1% FCS 함유 PBS 200 μL 중에서 PAX와 함께 6 시간동안 배양하였다. 대조군으로서, 세포를 등몰 농도의 VH032-pHAb 염료만으로 처리하였다. 1% FCS 함유 PBS로 1회 세척 단계 후, 세포를 1% FCS 함유 PBS 400 μl에 재현탁하고 Becton Dickinson FACSCalibur 유세포측정기에서 세포측정 분석을 수행하였다. VHL-pHAb 염료와의 간섭을 배제하기 위해 프로피듐 요오드(PI)를 사용한 사멸 세포의 염색은 수행하지 않았다. BD biosciences의 FlowJo를 사용하여 정량 분석을 수행하였다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FCS에서 배양하였다.
대조군과 비교하여, CD33xMIC7+VH032-pHAb 염료로 처리된 세포에 대한 증대된 형광 신호가 모든 CD33-양성 세포주에서 확인된 반면, 수용체-음성 RAMOS 세포에서는 증대된 평균 형광 강도가 확인되지 않았다(도 32). 이러한 결과는 PAX가 수용체-매개 항체 내재화를 통해 흡수된다는 것을 입증하였다.
10.4. CD33xMIC7+GNE987 PAX는 표적화 세포에서 BRD4 분해를 유도한다
PAX가 표적화 세포에서 표적 단백질의 분해를 매개할 수 있음을 입증하기 위해, BRD4 웨스턴 블롯 분해 분석을 수행하였다(도 33 및 도 34). 그러므로, CD33- 양성 MV411 세포를 비결합 PAX 대조군으로서 다양한 농도에서 CD33xMIC7+GNE987 또는 DIGxMIC7+GNE987로 처리하고 대조군으로 GNE987만으로 처리하였다. MV411 세포를 10% FCS 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. MV411 세포를 2 ml 배양 배지 중에 100만개 세포/ml로 12-웰 플레이트에 접종하고 37℃ 및 5% CO2의 세포 배양기에서 밤새 배양하였다. 복합체화는 4편에 기술된 바와 같이 수행하였다. GNE987만 항체의 부재하에 동일한 조건에서 미리 배양하였다. 이어서, Tecan 디스펜서를 사용하여 나노드롭 분배에 의해 CD33xMIC7+GNE987(1:1), DIGxMIC7+GNE987(1:1) 또는 GNE987으로 각각의 농도에서 세포를 처리하였다. 모든 조건은 0.0005%(v/v) DMSO 및 3.0E-5% Tween20으로 표준화하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2의 세포 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 처리된 세포를 수집하고, PBS에 세척하고 세포 펠릿을 Roche 완전 프로테아제 억제제 혼합물이 보충된 세포 용해 완충액(20 mM TRIS(pH7.4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% TritonX-100)에 용해시켰다. 얼음 위에서 10분간 배양한 후, 조(crude) 용해물을 15,000xg, 4℃에서 원심분리를 통해 제거하고, 제거된 용해물을 아세톤으로 침전시켰다. 건조된 펠렛을 SDS-부하 완충액에 용해시켰다. 단백질 농도는 Mettler Toledo UV5Nano 광도계를 통해 측정하였다. 샘플(50 μg/레인)을 4 내지 12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔(Thermo Fisher Scientific)에 적용하였다. 겔 주행 후, 샘플을 니트로셀룰로스 막(Sigma Aldrich)으로 옮기고, 상기 막을 0.1% TBS-Tween20 중 5% 탈지유로 차단하고 지시된 1차 항체와 함께 배양하였다(표 12).
[표 12] 웨스턴 블롯 분석에 사용된 1차 항체.
1:10,000 희석율로 해당 HRP-표지된 항-토끼/마우스 2차 항체(GE Healthcare)와 함께 배양한 후, ECL 용액(Advansta) 및 X-선 필름(GE Healthcare)을 사용하여 블롯을 검출하였다. 결과는 ImageJ 소프트웨어(버전 1.53K, NIH)를 사용하여 분석하였다. 배경 차감된 BRD4 신호는 상응하는 액틴 신호로 표준화되었으며 용매 대조군의 표준화된 BRD4 신호는 100%로 설정되었다.
예상한 바와 같이, BRD4 분해는 GNE987 단독으로 처리한 경우에서 확인되었다. 추가로, 농도 의존적 BRD4 분해가 CD33xMIC7+GNE987의 경우에 관찰된 반면, 모든 농도에서 비결합 PAX 대조군 DIGxMIC7+GNE987에서는 분해가 관찰되지 않았다(도 33 및 도 34). 이러한 결과는 PAX가 관심 세포내 단백질의 농도 의존적 및 세포-유형(표적 수용체) 선택적 분해를 매개할 수 있음을 입증하였다.
10.5. CD33xMIC5+GNE987 PAX는 수용체 발현 및 PAX 부하량에 따라 세포독성 효과를 유도한다
하기에 기술된 절차에 따라 여러 세포 생존율 실험을 수행하였다:
세포를 상이한 배지중에서 백혈구 배양-처리된 편평하고 투명한 바닥의 다중웰 플레이트에 접종한 후 37℃ 및 5% CO2의 습한 챔버에서 밤새 배양하였다. 복합체화는 4편에 기술된 바와 같이 수행하였다.
Tecan D300e 디지털 디스펜서를 사용하여 나노드롭 분배를 이용하여 항체 농도를 기준으로 용액을 세포에 첨가하고, 모든 웰을 PBS(pH 7.4) 중 0.3% TW20 및 DMSO을 사용하여 0.05% DMSO 및 0.003% TW20의 최종 용매 농도로 동일한 부피로 표준화하였다. 배양은 37℃에서 배지에 따라 5% 또는 10% CO2에서 수행하였다. 달리 언급되지 않는 한 제조업체의 프로토콜에 기술된 바와 같이 CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석을 이용하여 3일 후에 분석을 개시하였다. 간략하게, 플레이트를 30분 동안 실온으로 평형화시켰다. 100 mL CellTiter-Glo 완충액을 CellTiter-Glo 기질 플라스크에 첨가하고 잘 혼합하였다. 30 μL의 시약을 각 웰로 옮겼다. 550 rpm으로 진탕하면서 실온에서 3분간 배양한 후, 플레이트를 실온에서 10분간 더 배양하였다. Perkin Elmer의 Envision 판독기에서 발광을 판독하였다. 용매 단독 및 보르테조밉(Bortezomib)(1.0E-05 M)이 각각 높은 대조군(100% 생존율) 및 낮은 대조군(0% 생존율)으로 역할을 하였다. 원시 데이터(raw data)는 각각 100% 및 0%로 설정된 높은 대조군 및 낮은 대조군에 대한 세포 생존율 백분율로 전환하였다. IC50 계산은 아래 제한조건(bottom constraint)으로 0% 생존율 및 위 제한조건(top constraint)으로 100% 생존율을 사용하는 가변 기울기 S자형 반응 맞춤화 모델(variable slope sigmoidal response fitting model)을 갖춘 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 농도는 PAX 중 PROTAC의 농도에 상응한다.
PAX 기술이 세포 표면 수용체 발현을 기반으로 세포-선택적 표적화를 매개할 수 있는지 여부와 그 정도를 조사하였다. 그러므로, CD33-표적화 PAX는 MIC5를 HC에 유전적으로 융합한 다음 PROTAC GNE987을 부하하여 생성하였다. 그런 다음, PAX를 CD33-양성 및 CD33-음성 세포에서 시험하였다.
50% GNE987이 미리 부하된 CD33xMIC5의 연속 희석으로 CD33-양성 MV411 및 MOLM13 세포 및 CD33-음성 RAMOS 세포를 처리하면 MV411 및 MOLM13 세포의 경우 3일 배양 후 생존 세포가 감소했지만 RAMOS 세포는 그렇지 않았다(도 35). 이는 CD33xMIC5가 GNE987 PROTAC의 수용체-양성 세포로의 흡수를 매개하는 반면 수용체-음성 세포로의 흡수는 방지되며 따라서 PAX가 PROTAC을 표적화 세포로 선택적으로 전달할 수 있었음을 입증한다.
CD33xMIC5 구조물의 세포독성은 PROTAC GNE987의 부하량을 증가 또는 감소시킴으로써 조절될 수 있다(도 36). MV411 세포에서 GNE987과 결합된 CD33xMIC5의 세포독성은 부하량이 25%에서 50% 또는 심지어 75%로 증가할 때 증가될 수 있다. 이는 부하된 PROTAC의 양을 원하는 대로 조정하여 PAX의 세포-사멸 특성을 조정할 수 있음을 입증한다.
10.6. CD33xMIC5와 GNE987P의 복합체화는 PROTAC GNE987P 단독의 세포-사멸 효능을 개선할 수 있다
지금까지, PAX 기술이 PROTAC GNE987을 표적 세포에 전달하도록 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀졌으며 상기 PAX 기술이 다른 PROTAC에도 적합한지는 불분명하였다. 그러므로, 추가 연구를 위해 또 다른 PROTAC, 즉 GNE987P를 선택하였으며, PAX 기술이 이 PROTAC에 대해서도 선택성을 매개할 수 있는지를 조사하였다.
그러므로, CD33-양성 MV411 및 MOLM13뿐 아니라 CD33-음성 RAMOS 세포를 25 내지 75% 부하량의 CD33xMIC5+GNE987P 및 PROTAC GNE987P 단독으로 처리하였다. 두 CD33-양성 세포주 모두에 대해, CD33xMIC5+GNE987P의 조합이 PROTAC GNE987P 단독보다 더 효능이 있었으며, CD33xMIC5+GNE987P의 효능은 부하량에 따라 달라졌고, 이때 부하량이 높을 수록 더 높은 효능으로 이어졌다. 전반적으로, CD33-음성 세포에서는 150 nM까지 독성이 관찰되지 않았다. 두 번째 PROTAC이 CD33-발현 세포에 선택적으로 전달되었기 때문에, 항체-복합체화를 사용하여 PROTAC의 표적화 전달을 촉진하는 개념이 더 일반화될 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 추가로, 상기 기술은 세포 내로의 표적화 전달에 의해 특정 PROTAC의 효능을 개선시킬 가능성을 제공하는 것으로 관찰되었다.
10.7. CD33xMIC5는 FLT3 분해제를 CD33-양성 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다
PAX 접근법을 또 다른 세포내 표적으로 확장하기 위해, 항체-PROTAC 복합체를 사용하여 FLT3 분해제가 CD33-발현 세포에 특이적으로 전달될 수 있는지 여부를 조사하였다. 그러므로, CD33-양성 MOLM13 및 CD33-음성 RAMOS 세포를 75% 부하량을 갖는 CD33xMIC5+FLT3d1 및 대조군으로서 PROTAC FLT3d1 단독으로 처리하였다(도 38). CD33-양성 MOLM13 세포에서, CD33xMIC5+FLT3d1에 대해 세포독성을 관찰하였다. CD33-수용체 음성 RAMOS 세포에서는 세포독성이 관찰되지 않았다. 이는 CD33xMIC5가 FLT3 분해제를 CD33-양성 세포에 전달하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 분석은 세포를 PROTAC 또는 PAX로 6일 동안 처리하는 약간의 변형 하에 10.5편에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 실험으로부터 PAX가 수용체 상태에 따라 PROTAC을 표적 세포에 전달할 수 있음이 다시 입증되었다. 또한, 실험으로부터 PAX 기술이 FLT3를 분해하는 또 다른 PROTAC으로 전가될 수 있음이 입증되어 PAX 접근법의 다용성을 더욱 뒷받침하였다.
10.8. CD33xMIC5에 의한 PROTAC GNE987의 복합체화는 항체와 PROTAC을 세포에 별도로 적용하여 달성할 수 있다
또 다른 실험에서, CD33xMIC5와 PROTAC GNE987의 사전-복합체화가 세포-표적 수용체 의존성 세포 사멸에 필요한지 여부를 조사하였다. 그러므로, CD33xMIC5를 3시간 동안 75%의 부하량에 도달하도록 GNE987과 복합체화시키고, CD33-양성 MV411 및 CD33-음성 RAMOS 세포에 첨가하였다. 또한, CD33xMIC5를 전술한 세포에 첨가하고 75%의 부하량에 도달하도록 GNE987을 이어서 별도로 첨가하였다. 흥미롭게도, CD33xMIC5 및 GNE987을 별도로 첨가하면 동일한 부하량으로 사전-복합체화된 CD33xMIC5+GNE987 PAX와 동일한 결과를 제공하였다(도 39).
이러한 결과는 PAX의 사전-복합체화가 PAX를 통한 세포 표면 수용체 의존성 세포 사멸의 전제조건이 아니라는 것을 입증하였다.
10.9. PAX의 PROTAC 부하량은 표적화 항체에 융합된 VHH PROTAC 결합제의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다
단일 PAX 분자에 의해 표적 세포로 전달될 수 있는 PROTAC의 수를 증가시키기 위해, 세포-표적화 IgG에 부착된 융합된 PROATC-결합 VHH 단위의 수를 증가시켰다. 보다 상세하게, MIC7 PROATC-결합 VHH를 중쇄, 경쇄 또는 둘의 조합 상의 CD33-표적화 항체의 C-말단에 상이한 수로 융합시켰다. 항체 단편은 짧은 링커를 통해 IgG 중쇄 및 임의의 추가의 단편으로부터 분리되었다. 추가의 세부사항은 9편을 참조하시오. 그런 다음, VHH 단편의 표적화-항체의 상이한 부위로의 유전적 융합이 생성된 PAX의 효능에 어떻게 영향을 미치는지 조사하였다.
표 13에 나타낸 복합체화 비로 GNE987 또는 GNE987P와 복합체화된 VHH-항체 융합물을 7.10.5에 기술된 세포 생존율 분석 절차에 따라 CD33-양성 MV411 및 CD33-음성 RAMOS 세포에서 조사하였다. GNE987P와의 조합의 경우, 동일한 항체에 상이한 비의 GNE987P가 부하되었으므로 처리 농도는 항체 농도와 관련되었다. 모든 융합물은 세포 표면 수용체-의존성 세포독성을 나타내었다. GNE987P가 부하된 일부 VHH-항체 융합물은 PROTAC 단독에 비해 양성 MV411 세포에서 향상된 효능을 나타내었고 수용체 음성 RAMOS 세포에서는 감소된 세포독성을 나타내었다. 이는 복잡한 특성을 갖는 여러 PAX를 생성하는 이 접근법의 다용성을 더욱 입증하였다.
[표 13] CD33-양성 MV411 세포 및 CD33-음성 RAMOS 세포에서 PROTAC GNE987 및 GNE987P과 결합된 상이한 CD33xMIC7 또는 PROTAC 단독의 세포 프로파일링. IC50 값은 M으로 나타낸다.
10.10. CLL1xMIC7-PROTAC 복합체는 CLL1-매개 흡수에 따라 선택적 세포독성을 유도한다
본 발명의 범위는 지금까지 CD33-표적화 항체로 제한되었으므로, CD33-표적화 항체 외에 다른 항체를 사용하여 세포-선택적 방식으로 PROTAC을 전달하는 것이 가능한지 조사하였다.
CLL1을 발현하는 세포에 PROTAC을 표적화하기 위해, CLL1-결합 항체 및 PROTAC-결합 클론 MIC7을 사용하여 융합 단백질을 구축하였다. 그러므로, CLL1-결합 항체의 HC를 링커에 이어 MIC7의 서열에 의해 c-말단으로 연장시켜 CLL1xMIC7을 수득하였다. 추가로, 디곡시게닌 항체를 동일한 방식으로 변형하여 이소타입 대조군을 수득하였다. CLL1-양성 MOLM13 및 U937 세포와 CLL1-음성 K562 세포를 75% 부하량을 갖는 CLL1xMIC7+GNE987P 또는 DIGxMIC7+GNE987P, 또는 대조군으로서 PROTAC GNE987P 단독으로 처리하였다. 전술한 절차에 따라 분석을 수행하였다. 2개의 CLL1-양성 세포주 모두에서 CLL1xMIC7+GNE987P의 경우에는 세포독성이 관찰된 반면, DIGxMIC7+GNE987P의 경우에는 세포독성이 관찰되지 않았다(도 40). 이는 수용체-양성 세포의 흡수가 PAX를 목적하는 세포로 표적화함으로써 매개된다는 것을 다시 입증하였다. 또한, 이는 이 기술이 상이한 항체 주쇄에 적용될 수 있음을 입증하여 이 접근법의 다용성을 분명히 보여주었다.
추가 실험에서, CLL1-양성 MV411 및 U937 또는 CLL1-음성 RAMOS 및 K562 세포를 75% 부하량의 CLL1xMIC7+GNE987, CLL1xMIC7+GNE987P 또는 CLL1xMIC7+SIM1로, 또는 대조군으로서 GNE987, GNE987P 또는 SIM1 단독으로 처리하였다. 전술한 절차에 따라 분석을 수행하였다. 2개의 CLL1-양성 세포주 모두에서, CLL1xMIC7 PROTAC 조합의 경우에 세포독성이 관찰된 반면, CLL1-음성 K562 및 RAMOS 세포에서는 세포독성이 현저히 적거나 전혀 관찰되지 않았다(도 41). 이는 수용체-양성 세포의 흡수가 PAX를 목적하는 세포로 표적화함으로써 매개된다는 것을 다시 입증하였다. 또한, 이는 이 기술이 상이한 항체 주쇄에 적용될 수 있음을 입증하였고, 이는 본 발명의 다용성을 뒷받침한다. 또한, PAX 접근법을 사용하여 총 3개의 상이한 PROTAC이 CLL1-발현 세포에 전달되었으므로 PROTAC 선택이 매우 유연하다는 것이 입증되었다.
10.11. B7H3xMIC7-PROTAC 복합체는 B7H3-매개된 흡수에 따라 선택적 세포독성을 유도한다
본 발명의 범위를 더욱 확장하기 위해, B7H3-표적화 항체를 사용하여 세포-선택적 방식으로 PROTAC을 전달하는 것이 가능한지 조사하였다. B7H3을 발현하는 세포에 PROTAC을 표적화하기 위해, B7H3-결합 항체 및 PROTA- 결합 클론 MIC7을 사용하여 융합 단백질을 구축하였다. 그러므로, B7H3-결합 항체의 HC를 링커에 이어 MIC7의 서열에 의해 c-말단으로 연장시켜 B7H3xMIC7을 수득하였다. B7H3-양성 MV411, U937 및 MOLM13과 B7H3-음성 RAMOS 세포를 75% 부하량의 B7H3xMIC7+GNE987P 및 B7H3xMIC7+SIM1, 및 대조군으로서 PROTAC GNE987P 및 SIM1 단독으로 처리하였다. 전술한 절차에 따라 분석을 수행하였다. 모든 B7H3-양성 세포주에서, 모든 B7H3xMIC7 PROTAC 조합에 대해 세포독성이 관찰되었다(도 42). B7H3-수용체 음성 RAMOS 세포에서는 모든 B7H3xMIC7 PROTAC 조합에 대해 세포독성이 확인되지 않은 반면, PROTAC 단독으로 처리한 경우 가장 높았지만 세포-유형 특이적 세포독성은 그렇지 않았다. 이는 B7H3xMIC7이 GNE987P 및 SIM1의 수용체-양성 세포로의 흡수를 매개하는 반면 수용체-음성 세포로의 흡수는 방지된다는 것을 입증하였다. 실험으로부터 PAX가 수용체 상태에 따라 PROTAC을 표적 세포에 전달할 수 있음이 다시 입증되었다. 또한, 실험으로부터 PAX 기술이 또 다른 항체 주쇄로 전가될 수 있음이 입증되어 이 접근법의 다용성을 더욱 분명히 보여주었다.
또 다른 실험에서, B7H3-양성 MV411, U937 및 MOLM13과 B7H3-음성 RAMOS 세포를 75% 부하량의 B7H3xMIC7+GNE987 또는 DIGxMIC7+GNE987, 및 대조군으로서 PROTAC GNE987 단독으로 처리하였다. 전술한 절차에 따라 분석을 수행하였다. 모든 B7H3-양성 세포주에서, 모든 B7H3xMIC7+GNE987 구조물에 대해 세포독성이 관찰된 반면, 이소타입 대조군 DIGxMIC7+GNE987에 대해서는 독성이 현저히 낮은 것으로 확인되었다(도 43). B7H3-수용체 음성 RAMOS 세포에서는 PROTAC 단독에 비해 B7H3xMIC7+GNE987에 대한 세포독성이 더 적은 것으로 확인되었다. 이는 B7H3xMIC7이 GNE987P 및 SIM1 PROTAC의 수용체-양성 세포로의 흡수를 매개하는 동시에 수용체-음성 세포로의 흡수를 방지한다는 것을 추가로 입증하였다.
10.12. EGFRxMIC7-PROTAC 복합체는 PROTAC-부하량 의존성 및 EGFR-매개 세포-유형 선택적 세포독성을 유도한다
EGFR을 발현하는 세포에 PROTAC을 표적화하기 위해, EGFR-결합 항체 세툭시맙 및 PROTAC-결합 클론 MIC7을 사용하여 융합 단백질을 구축하였다. 그러므로, 세툭시맙의 HC를 링커에 이어 MIC7의 서열에 의해 c-말단으로 연장시켜 EGFRxMIC7을 수득하였다. 추가로, 디곡시게닌 항체를 동일한 방식으로 변형하여 이소타입 대조군을 수득하였다. EGFR-고발현 OVCAR3 및 SKOV3뿐만 아니라 EGFR-저발현 HEPG2를 전술한 바와 같이 50% PROTAC, GNE987, GNE987P 또는 SIM1이 부하된 EGFRxMIC7 및 DIGxMIC7로 처리하여 이들 구조물의 효능을 측정하였다(표 14). PROTAC 단독의 효능은 표 14에 요약되어 있다. 모든 DIGxMIC7+PROTAC 조합은 IC50>100nM을 가진 반면, PROTAC GNE987 및 SIM1과 조합된 EGFRxMIC7은 한 자릿수 nM 범위의 IC50 값으로 세포 사멸을 유도하였다. EGFR-저발현 HEPG2에서 모든 PROTAC과 결합된 EGFRxMIC7의 독성은 EGFR 고발현 OVCAR3 및 SKOV3에 비해 모든 구조물의 경우에 감소(두 자릿수 내지 세 자릿수 nM 범위)되었다. 전반적으로, GNE987P 조합은 비활성이었다. 실험으로부터 PAX가 수용체 상태에 따라 PROTAC을 표적 세포에 전달할 수 있음이 다시 입증되었다.
[표 14] PROTAC ARV771, GNE987, GNE987P 및 EGFR-양성 세포 및 EGFR-음성 HEPG2 세포의 세포 프로파일링. IC50 값은 M으로 나타낸다.
[표 15] EGFR-양성 세포 및 EGFR-음성 HEPG2 세포에서 50% 부하량으로 PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1과 결합된 EGFRxMIC7의 세포 프로파일링. 비내재화 대조군으로서 디곡시게닌-결합 DIGxMIC7 융합 단백질이 활용되었다. IC50 값은 M으로 나타낸다.
또 다른 실험에서, EGFRxMIC7에 PROTAC ARV771, GNE987, GNE987P 및 SIM1을 따로따로 75% 부하량으로 부하하고 다양한 EGFR 발현 수준을 갖는 다양한 세포를 처리하였다(표 16). 전반적으로, 75%의 GNE987, GNE987P 및 SIM1이 부하된 비결합 대조군 DIGxMIC7은 동일한 PROTAC이 부하된 EGFR-결합 EGFRxMIC7보다 효능이 낮았다.
[표 16] EGFR-양성 세포 및 EGFR-음성 HEPG2 및 EGFR-저발현 MCF7 세포에서 75% 부하량으로 PROTAC ARV771, GNE987, GNE987P 및 SIM1과 결합된 EGFRxMIC7의 세포 프로파일링. 비내재화 대조군으로 디곡시게닌-결합 DIGxMIC7 융합 단백질을 활용하였다.
결론적으로, PAX는 또한 고형 종양 세포에도 PROTAC을 표적화할 수 있다는 것이 입증되었다. 또한, 흡수는 EGFR-수용체 발현 수준에 의존하며 따라서 EGFRxMIC7+PROTAC 복합체에 의한 EGFR 결합에 이어 내재화 및 PROTAC 방출을 통한 활성 흡수에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. 활성 EGFR-매개 흡수에 의해 유도된 세포-선택성은 또한 세포독성이 현저히 더 낮은 비결합 이소타입 대조군 PAX를 시험함으로써 밝혀졌다.
10.13. GNE987, GNE987P 및 SIM1과의 NAPI2BxMIC7 복합체는 세포-선택적 세포독성을 나타낸다
NAPI2B를 발현하는 세포에 PROTAC를 표적화하기 위해, NAPI2B-결합 항체 XMT1535 및 PROTAC-결합 클론 MIC7을 사용하여 융합 단백질을 구축하였다. 그러므로, NAPI2B-결합 항체의 HC를 링커에 이어 MIC7의 서열에 의해 c-말단으로 연장시켜 NAPI2BxMIC7을 수득하였다. NAPI2B-양성 OVCAR3 및 NAPI2B-음성 SKOV3 세포를 NAPI2BxMIC7+GNE987, NAPI2BxMIC7+GNE987P, NAPI2BxMIC7+SIM1 또는 DIGxMIC7+GNE987, 50% 부하량의 DIGxMIC7+GNE987P 또는 DIGxMIC7+SIM1, 및 대조군으로서 PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1 단독으로 처리하였다. 전술한 절차에 따라 분석을 수행하였다. NAPI2B-양성 OVCAR3에서, 모든 NAPI2BxMIC7 PROTAC 조합에 대해 세포독성이 관찰되었다(도 44). NAPI2B-수용체 음성 SKOV3 세포에서는 모든 NAPI2BxMIC7 PROTAC 조합에 대해 세포독성이 확인되지 않은 반면, PROTAC 단독 처리는 NAPI2B 수용체 발현 상태와 관계없이 모든 세포주에서 가장 높은 세포독성이 관찰되었다. 이는 NAPI2BxMIC7이 GNE987, GNE987P 및 SIM1의 수용체-양성 세포로의 흡수를 매개하는 반면 수용체-음성 세포로의 흡수는 방지된다는 것을 입증하였다. 실험으로부터 PAX가 수용체 상태에 따라 PROTAC을 표적 세포에 전달할 수 있음이 다시 입증되었다. 추가로, 실험으로부터 PAX 기술이 또 다른 항체 주쇄로 전가될 수 있음이 입증되어 이 접근법의 다용성을 더욱 분명하게 보여주었다.
10.14. PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1과 결합된 HER2xMIC7은 HER2-의존성 세포독성을 나타낸다
HER2를 발현하는 세포에 PROTAC을 표적화하기 위해, HER2-결합 항체 트라스투주맙(trastuzumab) 및 PROTAC-결합 클론 MIC7을 사용하여 융합 단백질을 구축하였다. 그러므로, HER2-결합 항체의 HC를 링커에 이어 MIC7의 서열에 의해 c-말단으로 연장시켜 HER2xMIC7을 수득하였다. HER2-양성 SKBR3 및 NCIN87 세포 및 HER2-음성 MDAMB468 세포를 75% 부하량의 HER2xMIC7+GNE987, HER2BxMIC7+GNE987P, HER2xMIC7+SIM1, 및 대조군으로서 PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1 단독으로 처리하였다. 전술한 절차에 따라 분석을 수행하였다. HER2-양성 SKBR3 및 NCIN87에서는, 모든 HER2xMIC7 PROTAC 조합에 대해 세포독성이 관찰되었다(표 17). HER2-수용체 음성 MDAMB468 세포에서는 모든 HER2xMIC7 PROTAC 조합에 대해 세포독성이 확인되지 않은 반면, PROTAC 단독 처리는 HER2 수용체 발현 상태와 관계없이 모든 세포주에서 뚜렷한 세포독성을 야기하였다. 이는 HER2xMIC7이 GNE987, GNE987P 및 SIM1의 수용체-양성 세포로의 흡수를 매개하는 반면, 수용체-음성 세포로의 흡수는 방지된다는 것을 입증하였다. 실험으로부터 PAX가 수용체 발현 상태에 따라 PROTAC을 표적 세포에 전달할 수 있음이 다시 입증되었다. 추가로, 실험으로부터 PAX 기술이 또 다른 항체 주쇄로 전가될 수 있음이 입증되어 이 접근법의 다용성을 더욱 분명히 보여주었다.
[표 17] HER2-양성 세포 및 HER2-음성 MDAMB468 세포에서 75% 부하량으로 PROTAC GNE987, GNE987P 및 SIM1과 결합된 HER2xMIC7의 세포 프로파일링.
10.15. TROP2xMIC7+GNE987은 TROP2-의존성 세포독성을 매개한다
본 발명의 범위를 더욱 확장하기 위해, TROP2-표적화 항체를 사용하여 세포-선택적 방식으로 PROTAC을 전달하는 것이 가능한지 조사하였다. TROP2를 발현하는 세포에 PROTAC을 표적화하기 위해, TROP2-결합 항체 사시투주맙(sacituzumab) 및 PROTAC-결합 클론 MIC7을 사용하여 융합 단백질을 구축하였다. 그러므로, TROP2-결합 항체의 HC를 링커에 이어 MIC7의 서열에 의해 c-말단으로 연장시켜 TROP2xMIC7을 수득하였다. TROP2-양성 A431, SKBR3, MDAMB468, NCIN87, SKOV3 세포 및 TROP2-음성 SW620 세포를 75% 부하량의 TROP2xMIC7+GNE987 또는 대조군으로서 PROTAC GNE987 단독으로 처리하였다. 분석은 10.5편에 기술된 절차에 따라 수행하였다. 모든 TROP2-양성 A431에서 SKBR3, MDAMB468, NCIN87 및 SKOV3 세포의 세포독성이 TROP2xMIC7+GNE987에 대해 관찰되었다(표 18). GNE987 단독에 비해 TROP2xMIC7+GNE987에 대한 TROP2-음성 SW620 세포에서 감소된 세포독성이 확인되었다. 이러한 결과는 TROP2xMIC7이 수용체-양성 세포로의 GNE987 흡수를 매개하는 반면, 수용체-음성 세포로의 흡수는 감소된다는 것을 입증하였다. 실험으로부터 PAX가 수용체 발현 상태에 따라 PROTAC을 표적 세포에 전달할 수 있음이 다시 입증되었다. 추가로, 실험으로부터 PAX 기술이 또 다른 항체 주쇄로 전가될 수 있음이 입증되어 이 접근법의 다용성을 더욱 분명히 보여주었다.
[표 18] TROP2-양성 세포 및 TROP2-음성 SW620 세포에서 75% 부하량으로 PROTAC GNE987과 결합된 TROP2xMIC7의 세포 프로파일링
10.16. PAX와 PROTAC-ADC의 필적하는 세포독성
PAX 기술이 공유결합된 PROTAC-ADC와 어떻게 비교되는지 이해하기 위해, 5.1편에 기술된 EGFR-IgG1-L328C-GNE987 PROTAC-ADC(DAR 1.62)를 EGFR-양성 MDAMB468 및 EGFR-음성 HEPG2 세포에서 50% GNE987이 부하된 EGFRxMIC5와 함께 조사하였다. 더 나은 비교를 위해, 치료 농도는 항체 농도와 관련되었다. 2개 구조물 모두 MDAMB468 세포에 대해 동일한 효능을 가졌으며 HEPG2 세포에 대해 더 적지만 필적하는 세포독성 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 45). 이는, 비록 PROTAC이 비공유적으로만 결합되어 있음에도 불구하고 PAX가 공유 PROTAC-ADC의 효과에 필적하는 선택적 세포-사멸을 가능하게 할 수 있음을 입증하였다. 또한, 이 효과는 PROTAC-ADC에 비해 더 낮은 DAR로 달성할 수 있다.
11. PROTAC과 항-PROTAC 항체의 복합체화는 약동학적 프로필을 크게 향상시킬 수 있다
PROTAC GNE987과 PROTAC-결합 항체 MIC2의 복합체화가 PROTAC의 전반적인 약동학적 프로필에 영향을 미치는지 여부와 그 정도를 조사하였다. 그러므로, 약동학 연구는 다음과 같이 수행하였다:
암컷 SCID 베이지 마우스(n=9, 복합 프로필)는 물 중의 2%(v/v) DMSO/20%(v/v) (하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린) 클렙토스(Kleptose) 중 0.4 mg/kg의 PROTAC 단독(GNE987)을 5 mL/kg의 투여량으로 단일 꼬리 정맥 정맥내(i.v.) 볼루스 주사로 투여받았다. MIC2+GNE987(1:2의 항체:약물 비)의 경우, 암컷 SCID 베이지 마우스(n=12, 복합 프로필)는 PBS 중의 5%(v/v) DMSO에 0.4 mg/kg GNE987 및 30 mg/kg MIC2의 등가 용량으로 5 mL/kg의 투여량으로 PROTAC 셔틀의 단일 꼬리 정맥 정맥내(i.v.) 볼루스 주사를 투여받았다.
PROTAC 단독의 경우, 이소플루란 마취하에 항응고제로서 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(K3-EDTA)을 사용하여 설하로 정맥내 투여후 0.1(G(그룹)1), 0.5(G2), 1(G3), 2(G1), 4(G3), 6(G2) 및 24시간(G3)에서 연속 혈액 샘플을 채취하고(n=3), 추가 처리하여 혈장을 수득하였다.
MIC2+GNE987의 경우, 전술한 바와 같이 정맥내 투여후 0.1(G(그룹)1), 0.5(G2), 1(G3), 2(G4), 6(G2), 24시간(G1, G3), 30(G3), 48(G3, G4)), 72(G1, G2) 및 96시간(G2)에서 연속 혈액 샘플을 채취하고(n=3), 추가로 처리하여 혈장을 수득하였다.
샘플 준비를 위해, 혈장 10 μL를 10 μL의 메탄올로 희석하고, LowBind(단백질) 플레이트에서 Labetalol s 내부 표준물질(2.5 μg/mL)을 함유하는 아세토니트릴 80 μL로 침전시켰다. 1분간 진탕/볼텍싱한 후, 샘플을 여과하고(폴리프로필렌 필터 상에서의 Captiva 여과, 0.45 μm 기공 크기), 120 μL의 메탄올:물(1:1, v/v)을 여액에 첨가하고, 분석까지 4℃에서 저장하고, 주입 전에 오토샘플러에 넣는다. 분석은 QTRAP 6500+(Sciex) 질량 분석기에 연결된 UPLC로 이루어진 LC-MS/MS 시스템에서 수행하였다. 이동상 A는 0.1% 폼산을 함유한 물이었고 이동상 B는 0.1% 폼산을 함유한 메탄올이었다. 구배는 1.5분 내에 10% B에서 시작하여 95% B까지였으며, 2분 동안 95% B로 유지한 다음, 0.5분 내에 10% B로 감소시키고 2분 동안 10% B로 유지하였다. 크로마토그래피는 Agilent Technologies의 Poroshell 120 EC-C18 컬럼, 2.7 μm 입자, 3 x 50 mm에서 수행하였다. 유량은 0.6 mL/분이었고, 주기 시간(주입에서 주입까지)은 약 6분이었다. 샘플 주입 부피는 10 μL였다. GNE987의 MRM 전이는 라베탈롤(labetalol)(IS)의 경우 548.788(m/z, z = 2)에서779.2(m/z, z=1) 및 329.101(m/z, z=1)에서 91(m/z, z=1)이었다. 정량화를 위한 교정 곡선은 0.5(정량화 하한치)에서 10000(정량화 상한치) ng/mL까지 범위의 표준물질을 기준으로 했으며, 이때 최소 5개 교정 지점 및 교정 표준의 최소 75%가 그 표준값의 ± 20% 이내에 있어야 한다.
전체 항체 농도는 Meso Scale Diagnostics 기술(MSD, LLC., 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 기반으로 한 리간드 결합 분석(LBA)으로 측정하였다. 모든 배양 단계는 약하게 교반하면서 22℃에서 수행하였다. 모든 세척 단계(200 μL/웰)는, 플레이트 세척기 ELx405(BioTek Instruments Inc., 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 PBS(pH 7.4) 및 0.01% Tween 20을 함유하는 PBS-T로 수행하였다. 먼저, 2.5 μg/mL의 비오틴-SP-접합된, Fcγ 단편 특이적안 AfiniPure 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., JIR, 영국 케임브리지셔, #109-065-098)를 MSD GOLD 96-웰 스트렙타비딘 QUICKPLEX 플레이트(MSD, #L55SA)에 2시간 동안 코팅하였다. 그 후, 플레이트를 3회 세척하였다. 혈장 샘플, 표준물질 및 품질 대조군을 PBS(pH 7.4), 0.05% Tween 20 및 3.0%(w/v) BSA로 이루어진 희석 완충액에 연속적으로 희석하고, 플레이트에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 제조 절차에 따라 MSD GOLG SULFO-TAG(MSD, #R31AA-1)로 미리 표지된, F(ab')2 단편 특이적인 마우스 항-인간 IgG(JIR, #209-005-097) 0.6 μg/mL과 함께 1시간 동안 배양하였다. 최종 세척 단계 후에, 계면활성제(MSD, #R92TC)를 함유하는 2x MSD 판독 완충액 T 150 μL를 각 웰에 첨가하고 MESO Quickplex SQ120 플레이트 판독기(MSD)에서 플레이트를 판독하였다. 소프트웨어 Watson LIMS(버전 7.5, ThermoFisher Scientific Inc.)를 사용하여 5PL(Marquart) 방정식, 가중치 1/Y2로 표준 곡선을 맞추고, 혈장 샘플의 총 mAb 농도를 계산하였다. 정량화 하한치(LLOQ)는 50 ng/mL였다.
PROTAC GNE987의 반감기는 5.8시간인 것으로 측정되었으며 이는 문헌에 보고된 반감기와 동일한 범위 안에 있다(2.8시간, 문헌[Pillow, T. H. et al., ChemMedChem 15 (2020) 17-25]). MIC2에 의한 PROTAC GNE987의 복합체화는 마우스에서 14.7시간의 PROTAC GNE987의 반감기를 제공하였으며, 이는 반감기가 2.5배 개선된 것에 해당한다.
추가로, PAX CD33xMIC5+GNE987 및 CD33xMIC7+GNE987을 100%의 이론적 부하량으로 생성하였으며, 이탈리아 칼코 소재의 Charles River Laboratories Italia에서 제공한 C57BL/6N 근친계교배 마우스(각 군당 N=2의 수컷 및 암컷)에서 수행된 PK 연구에서 조사하였다. 7 내지 8주령 마우스에게 30 mg/kg(0.38 mg/kg PROTAC에 해당)의 CD33xMIC5+GNE987 및 CD33xMIC7+GNE987, CD33 항체 단독, CD33xMIC5 또는 CD33xMIC7을 단일 용량으로 꼬리 정맥에 정맥내로 주사하였다. 샘플은 마이크로샘플링 기술(각 혈액 채취 당 20 mL)을 사용하여 모든 동물로부터 연속적으로 수집하였다. 투여 후, 첫날에는 2개의 혈액 샘플을 채취했고, 이후 3주동안 7개의 혈액 샘플을 채취하였다. 각각의 샘플을 미리 냉각된(0 내지 4℃) Minivette POCT EDTA 튜브에 수집하고, Microvette CB300 EDTA로 옮기고, 4℃에서 10분간 2500 x g로 원심분리하였다. 수득된 혈장을 새 바이알로 옮기고, 추후 분석까지 즉시 -80℃에 저장하였다. PK 연구, 동물 취급 및 실험은 Italian D.Lvo 2014/26 및 Directive 2010/63/EU에 따라 수행하였다. 본 연구는 이탈리아 콜레레토 자코사의 Instituto di Ricerche Biomediche Antoine Marxer에서 수행되었다. 이 연구소는 이탈리아 보건부(Italian Ministry of Health)로부터 완전히 승인받았다.
전체 항체 농도는 Meso Scale Diagnostics 기술(MSD, LLC., 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 기반으로 한 리간드 결합 분석(LBA)에 의해 측정하였다. 모든 배양 단계는 약하게 교반하면서 22℃에서 수행하였다. 모든 세척 단계(200 μL/웰)는 플레이트 세척기 ELx405(BioTek Instruments Inc., 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여, PBS(pH 7.4) 및 0.01% Tween 20을 함유하는 PBS-T로 수행하였다. 먼저, 2.5 μg/mL의 비오틴-SP-접합된, Fcγ 단편 특이적안 AfiniPure 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., JIR, 영국 케임브리지셔, #109-065-098)를 MSD GOLD 96-웰 스트렙타비딘 QUICKPLEX 플레이트(MSD, #L55SA)에 2시간 동안 코팅하였다. 그 후, 플레이트를 3회 세척하였다. 혈장 샘플, 표준물질 및 품질 대조군을 PBS(pH 7.4), 0.05% Tween 20 및 3.0%(w/v) BSA로 이루어진 희석 완충액에 연속적으로 희석하고, 플레이트에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 제조 절차에 따라 MSD GOLG SULFO-TAG(MSD, #R31AA-1)로 미리 표지된, F(ab')2 단편 특이적인 마우스 항-인간 IgG(JIR, #209-005-097) 0.6 μg/mL과 함께 1시간 동안 배양하였다. 최종 세척 단계 후, 계면활성제(MSD, #R92TC)를 함유하는 2x MSD 판독 완충액T 150 μL를 각 웰에 첨가하고 MESO Quickplex SQ120 플레이트 판독기(MSD)에서 플레이트를 판독하였다. 소프트웨어 Watson LIMS(버전 7.5, ThermoFisher Scientific Inc.)를 사용하여 5PL(Marquart) 방정식, 가중치 1/Y2로 표준 곡선을 맞추고, 혈장 샘플의 총 mAb 농도를 계산하였다. 정량화 하한치(LLOQ)는 50 ng/mL였다.
MSC2734242의 농도는 양성 방식의 터보 이온 스프레이 공급원(ITS)을 갖는 SCIEX 5500 삼중 사중극자(SCIEX, 미국 캘리포니아주 레드우드 시티 소재)를 사용하여 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)으로 측정하였다. 크로마토그래피 분리는 100μL 확장 루프로 구성된, Waters ACQUITY I-클래스 UPLC 시스템(미국 메사추세츠주 밀퍼드)에 장착된 Waters ACQUITY UPLC BEH(C18, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm) 컬럼을 사용하여 달성되었다. 0.350 mL/분의 유량에서 상 A(H2O:ACN 95:5, 0.1% 폼산) 및 B(ACN:H2O 95:5, 0.1% 폼산)에 사용된 크로마토그래피 구배는 100% A 등용매의 0.25분에 이어, 100% B까지 2.25분의 구배였으며, 이때 100% B에서 후속 0.75분의 세척 단계 및 초기 조건에서 2.5분의 재생(reconditioning)이 이어진다.
C57BL/6N 마우스 혈장 샘플로부터 MSC2734242의 추출은 단백질 침전 기술을 통해 수행하였다. Phenomenex Impact 단백질 침전 플레이트(Phenomenex, 미국 캘리포니아주 토런스, CE0-7565)에서, 내부 표준물질로 사용되는 50 ng/mL의 MSC2737500을 함유하는 아세토니트릴 100 μL에 3 μL의 혈장 샘플을 침전시켰다. 5분 동안 진탕(900 rpm)한 후, 모든 웰을 진공으로 여과하고 깨끗한 96웰 플레이트에 수집한 다음, 2.5% 폼산을 함유한 수용액 100 μL로 희석하고 LC-MS/MS 분석을 실시하였다. 모든 시약은 LC-MS 등급 또는 이와 동등한 수준이었다.
소프트웨어 Watson LIMS(버전 7.5, ThermoFisher Scientific Inc.)를 사용하여 선형 회귀, 가중치 1/X2로 면적 비(분석물 신호/내부 표준물질 신호)에 대한 표준 곡선을 맞추고 혈장 샘플의 총 MSC2734242 농도를 계산하였다. 정량화 하한치(LLOQ)는 5 ng/mL였으며, 전체 정량화 범위는 5 내지 2000 ng/mL였다.
주요 PK 매개변수는 Phoenix WinNonlin 버전 8.3.4(Pharsight Corporation, USA)를 사용하여 비구획 분석(NCA)으로 추정하였다. 약동학적 매개변수는 전체 항체 및 MSC2734242 분석물의 개별 혈장 농도 대 투여 후 시간으로부터 수득하거나 계산하였다.
매개변수 추정을 위해 개별 혈장 농도-시간 프로필을 사용하였다. 정량화 한계 미만(BQL)으로 계산된 모든 PK 샘플의 농도는 AUC0-inf, 제거율 및 분포량을 더 잘 추정하기 위해 손실값(missing value)으로 간주되었다. 최종 반감기(t1/2) 및 λz(곡선의 최종 로그-선형 부분과 관련된 1차율 상수) 값은 선형 회귀의 최종 단계에서 적어도 3개 시점을 정량화할 수 있는 경우에만 계산되었다. 기술 통계(descriptive statistics)를 위해 BQL 미만의 값은 0 ng/mL로 간주되었다. 전반적으로, GNE987과 CD33xMIC5 및 CD33xMIC7의 복합체화는 마우스에서 각각 29.6시간 및 105시간으로 PROTAC의 상당히 더 긴 반감기를 유도하였다(도 47). 인상적으로, GNE987의 농도는 CD33xMIC7+GNE987을 투여한 군에서 21일(504시간) 후에도 마우스 혈장에서 평균 69 ng/mL인 반면, PROTAC GNE987 농도는 25시간 후에 이미 LLOQ 미만으로 떨어졌다. 상기 결과는 항체-복합체화가 PROTAC과 항체의 복합체화에 의해, 예를 들어, 종양 세포의 PROTAC에 대한 노출을 크게 증가시킬 수 있음을 보여준다.
VHH 융합물의 생성 및 PROTAC GNE987을 사용한 각 융합 단백질의 부하량이 제거율을 변경했는지 결론을 도출하기 위해 PK 연구의 항체 제거율을 비교하였다(도 48). 비변형된 CD33 항체의 제거율 및 동일한 항체와 VHL-PROTAC 결합 VHHs MIC5 및 MIC7의 융합물(CD33xMIC5/7)은 유사했으며, 이는 제거율에 대한 VHH 융합물의 미미한 영향을 시사한다. 더욱이, 항체-VHH 융합 단백질 CD33xMIC5 및 CD33xMIC7에 PROTAC GNE987을 부하하는 것은 항체 제거율에 영향을 미치지 않았다. 결론적으로, VHL-PROTAC 결합 VHH의 첨가 및 PROTAC과의 복합체화는 PK 프로필에 영향을 미치지 않았다.
후자 연구의 약동학적 매개변수는 표 19에 요약되어 있다.
[표 19] PROTAC GNE987이 부하되고 부하되지 않은 MIC5 및 MIC7과의 CD33-기반 VHH-융합물 및 모 항체 CD33 Ab의 약동학적 매개변수의 요약. 분석물은 30 mg/kg으로 투여되었으며 정량화 총 항체(t항체) 및 PROTAC GNE987에 대한 PK 매개변수를 나타내었다. 약어: t1/2: 반감기; Cmax: 최대 혈청 농도; AUC0-inf: 무한 시간까지의 곡선하 영역; Cl: 제거율; Vss: 정상 상태의 분포량. SD: 표준편차.
12. CD33xMIC7+GNE987 PROTAC-항체 복합체는 MV411 마우스 이종이식 모델에서 효과적이다
인간 백혈병 MV411 세포를 면역약화된 마우스에 이종이식하였다. 3백만 개의 MV411 세포를 미처리 암컷 CB17 SCID 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 평균 종양 크기가 45 mm2에 도달한 후에 상이한 처리 군에서의 동물의 무작위선정 및 치료 개시를 시작하였다. 대조군은 비히클로 처리하였다. 시험 군은 0.38 mg/kg GNE987 및 30 mg/kg CD33xMIC7+GNE987(0.38 mg/kg GNE987이 부하됨)로 1회(1일차) 처리하였다. 또한, 2개 군은 1일차에 30 mg/kg CD33xMIC7+GNE987(0.38 mg/kg GNE987이 부하됨)로 2회 처리한 후 8일차에 0.38 mg/kg GNE987로 처리하거나, 또는 1일 및 8일차에 0.38 mg/kg GNE987로 처리하였다. 또한, 한 군에는 30 mg/kg CD33xMIC5+GNE987(0.38mg/kg GNE987이 부하됨)을 1회(1일차) 투여하였고, 또 다른 군에는 PROTAC 없이 항체 대조군 30 mg/kg CD33xMIC7을 1회(1일차) 투여하였다. 종양이 최대 종양 크기(225 mm2)에 도달하기 전에 개별 군들을 중단하였다(도 49).
항체 단독으로는 비히클 대조군에 비해 유의미한 관련 효과가 없었지만, PROTAC GNE987은 항-종양 효과를 유도하였다. 그러나, 대략 4일차에 종양이 다시 진행되기 시작하여 비히클 대조군과 동일한 성장 속도를 보였다. 1일 및 8일차에 GNE987을 투여한 군에서 GNE987을 재투여하면 종양이 다시 성장하기 시작하는 재투여 후 대략 3일차까지 항-증식 효과가 유도되었다. CD33xMIC7+GNE987의 단일 용량은 종양이 진행된 후 15일차까지 종양-성장 억제를 유도하였다. 1일차에 30 mg/kg CD33xMIC7+GNE987(0.38 mg/kg GNE987이 부하됨)을 투여한 후 8일차에 0.38 mg/kg GNE987로 처리한 군에서는 재투여가 대략 23일차까지 지속적인 종양 성장 억제를 유도하였다. CD33xMIC5+GNE987 처리는 비히클에 비해 종양-성장 지연을 유도했지만, CD33xMIC7+GNE987에 비해 효과가 훨씬 덜 두드러졌다.
전반적으로, GNE987이 부하된 CD33xMIC7의 항-종양 효과는 동등한 PROTAC 용량에서 PROTAC 단독보다 우수하였다. 흥미롭게도, CD33xMIC7+GNE987의 항-종양 효과는 8일차에 GNE987을 단순히 재투여하는 것을 통해서도 향상될 수 있었다. 이는 CD33xMIC7+GNE987을 투여받은 군에 GNE987만 추가로 투여하는 것의 분명한 이점이 있으며, CD33xMIC7이 혈청에서 PROTAC GNE987을 포획하여 종양 부위에 축적할 가능성이 높음을 보여준다. 이러한 결과는 종양 특이적 항원뿐만 아니라 PROTAC에도 결합하는 이중특이성 항체를 투여한 후 비복합체화 PROTAC(예들 들어, 경구 적용가능한 것)을 투여함으로써 종양을 사전-표적화하는 길을 열어준다. 이 접근법을 사용하면 별도로 투여되는 PROTAC이 생체 외에서 먼저 PAX를 제조할 필요 없이 목적하는 조직으로 표적화될 수 있다.
항-PROTAC 클론 MIC5와 MIC7을 비교할 때, CD33xMIC7+GNE987이 CD33xMIC5+GNE987보다 더 강력한 항-종양 효과를 유도한다는 것이 분명해졌다. CD33의 결합은 CD33xMIC7로 처리함으로써 입증된 바와 같이 종양-성장에 영향을 미치지 않았으며, 이는 항-종양 효과가 CD33xMIC7에 PROTAC GNE987을 부하함으로써 유도된다는 것을 뒷받침한다.
요약
본 발명은 비공유 PROTAC 항체 복합체(PAX)를 통해 PROTAC의 표적화 전달을 가능하게 하는 전례없는 전달 기술을 개시한다. PAX 기술은, 활성 약물 물질이 통상적으로 합텐에 의해 변형되는 비공유적 약물 전달 분야의 다른 방법과 달리 비변형 활성 PROTAC의 표적화 전달을 가능하게 한다는 점에 유의하는 것이 중요한다. 본 발명은 세포 표면 수용체 발현에 따라 여러 세포 유형에 PROTAC을 전달하는 것을 포함한다. 이러한 수용체로는 CD33, CLL1, TROP2, HER2, EGFR, NAPI2B 및 B7H3이 포함되지만 이로 제한되지는 않는다. PROTAC과 관련하여, 본 발명의 다용성은 다양한 구조적으로 상이한 PROTAC(GNE987, ARV771, SIM1, GNE987P, SIM1 및 FLT3d1)의 선택적 전달에 의해 입증된다. 또한, 상기 플랫폼이 모듈식 항체-조작 전략을 활용함으로써 하나의 항체를 사용하여 12개 이하의 PROTAC 분자를 전달할 가능성을 제공한다는 것도 입증되었다. 더욱이, 본 발명은 항체-복합체화가 PROTAC에 대한 표적 세포의 노출을 상당히 개선시킬 수 있음을 입증한다. 마지막으로, 본 발명자들은 생체내 이종이식 모델에서 PAX 기술을 검증할 수 있었다. 표 20은 개요를 제공한다.
[표 20] 본 연구의 범위 요약. 조사된 조합은 표 형식으로 나타내었다.

Claims (34)

  1. PROTAC의 VHL 리간드 데그론(degron)에 결합할 수 있는, 단리된 항체,
  2. 제1항에 있어서,
    단일특이성 항체인, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    IgG 유형의 전장 항체 또는 그의 단편, 또는 단일 도메인 항체, 또는 단일쇄 항체인, 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    전장 항체가 IgG1 또는 IgG4 유형인, 항체.
  5. 제3항에 있어서,
    단일쇄 도메인 항체가 VHH 항체인, 항체.
  6. 제3항에 있어서,
    단일쇄 항체가 단일특이성 1가 단일쇄 항체(scFv)인, 항체.
  7. 제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    두번째 결합 능력이 표적 단백질에 대한 것인, 이중특이성 항체인, 항체.
  8. 제7항에 있어서,
    a) 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄로 이루어진 단일특이성 2가 항체로서, 각 쇄가 하나의 가변 도메인만을 포함하는, 단일특이성 2가 항체,
    b) 각각 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인, 및 상기 항체 중쇄 가변 도메인과 상기 항체 경쇄 가변 도메인 사이의 단일쇄-링커로 이루어진, 2개의 단일특이성 1가 단일쇄 항체(scFv), 및 임의적으로
    c) 파트 a)의 C-말단과 파트 b)의 N-말단을 연결하는 펩티드-링커
    를 포함하는, 항체.
  9. 제7항에 있어서,
    a) 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄로 이루어진 단일특이성 2가 항체로서, 각 쇄가 하나의 가변 도메인만을 포함하는, 단일특이성 2가 항체,
    b) 각각 1개의 항체 가변 도메인으로 이루어진, 2개의 가변성 2개 중쇄 단일 도메인(VHH) 항체, 및 임의적으로
    c) 파트 a)의 C-말단과 파트 b)의 N-말단을 연결하는 펩티드-링커
    를 포함하는, 항체.
  10. 제9항에 있어서,
    파트 b)의 2개의 중쇄 단일 도메인(VHH) 항체의 N-말단과 파트 a)의 단일특이성 2가 항체의 C-말단이 펩티드 링커를 통해 연결되는, 항체.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    파트 a)의 가변 도메인이 표적 단백질에 결합할 수 있고, 파트 b)의 가변 도메인이 PROTAC의 VHL 리간드 데그론에 결합할 수 있는, 항체.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    파트 b)의 가변 도메인이 표적 단백질에 결합할 수 있고, 파트 a)의 가변 도메인이 PROTAC의 데그론에 결합할 수 있는, 항체.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    PROTAC의 데그론이 하기 화학식 I의 VH032 유도체인, 항체:
    화학식 I

    상기 식에서,
    R1 및 R2 중 하나는 탄두(warhead)에 연결된 링커이되,
    R2가 링커이면, R1은 아세틸이고,
    R1이 링커이면, R2는 메틸이고;
    R3은 H, OH, 시아노, F, Cl, 아미노 또는 메틸이고;
    R4는 H 또는 메틸이고;
    R5 및 R6은 H 또는 OH이되,
    R6이 H이면, R5는 OH이고,
    R5가 H이면, R6은 OH이다.
  14. 제13항에 있어서,
    R1이 PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C=O)-이고,
    이때,
    PB가 단백질 결합 탄두이고,
    Q가 NH 또는 C=O이거나 부재하고,
    n 및 m이 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
    p가 0 내지 10이고;
    R2가 메틸이고;
    R3, R4, R5 및 R6이 제13항에 기술된 바와 같은,
    항체.
  15. 제14항에 있어서,
    R1이 PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C=O)-이고,
    이때,
    PB가 단백질 결합 탄두이고;.
    Q가 NH 또는 C=O이거나 부재하고;
    (xi) n, m 및 p가 1이거나;
    (xii) n이 3 또는 4이고; m이 0이고, p가 1이거나;
    (xiii) n이 1이고; m이 0이고; p가 2이거나;
    (xiv) n이 2이고; m이 0이고; p가 2이거나;
    (xv) n 및 m이 0이고; p가 6, 7, 8, 9 또는 10이고;
    R2가 메틸이고;
    R3, R4, R5 및 R6이 제13항에 기술된 바와 같은,
    항체.
  16. 제13항에 있어서,
    R1이 아세틸이고;
    R2가 PB-NH-(CH2)p-S-이고, 이때 PB가 단백질 결합 탄두이고, p가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
    R3, R4, R5 및 R6이 제13항에 기술된 바와 같은,
    항체.
  17. 제13항에 있어서,
    PROTAC이 도 8a 및 8b에 나타낸 PROTAC으로부터 선택되는, 항체.
  18. 제1항 및 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 단백질이 세포 표면 단백질인, 항체.
  19. 제18항에 있어서,
    세포 표면 단백질이 종양 항원인, 항체.
  20. 제19항에 있어서,
    세포 표면 단백질이 Her2, CD33, CLL1, TROP2, NAPI2B, B7H3 또는 EGFR인, 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PROTAC의 데그론에 결합할 수 있는 가변 도메인이 전장 항체의 가변 도메인이고, 하기의 CDR 서열을 포함하는, 항체:
    HC CDR1: G Y S X1 T X2 X3 Y (서열번호 1);
    HC CDR2: I T Y S G X4 T (서열번호 2);
    HC CDR3: X5 X6 Y X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 (서열번호 3);
    LC CDR1: Q X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 Y (서열번호 4);
    LC CDR2: X25 X26 X27 (서열번호 5);
    LC CDR3: X28 Q X29 X30 X31 X32 P Y T (서열번호 6);
    이때, X1은 I 또는 A이고; X2는 G 또는 N이고; X3은 D 또는 N이고; X4는 G 또는 A이고; X5는 A 또는 G이고; X6은 K 또는 Y이고; X7은 G 또는 Y이고; X8은 부재하거나 A이고; X9는 부재하거나 V이고; X10은 부재하거나 P이고; X11은 D 또는 Y이고; X12는 G 또는 Y이고; X13은 G 또는 F이고; X14는 R 또는 A이고; X15는 D 또는 H이고; X16은 S 또는 G이고; X17은 L 또는 I이고; X18은 S이거나 부재하고; X19는 Y이거나 부재하고; X20은 S이거나 부재하고; X21은 D이거나 부재하고, X22는 G이거나 부재하고; X23은 N 또는 G이고; X24는 T 또는 N이고; X25는 L 또는 Y이고; X26은 V 또는 A이고; X27은 S 또는 T이고, X28은 V 또는 L이고; X29는 S 또는 Y이고; X30은 I 또는 D이고; X31은 H 또는 E이고; X32는 V 또는 Y이다.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PROTAC의 데그론에 결합할 수 있는 가변 도메인이 VHH 항체의 가변 도메인이고, 하기의 CDR 서열을 포함하는, 항체:
    CDR1: G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 (서열번호 17);
    CDR2: X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 (서열번호 18);
    CDR3: X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35 X36 (서열번호 19);
    이때, X1은 F 또는 R이고; X2는 T, A, S 또는 R이고; X3은 L 또는 F이고; X4는 D 또는 N이고; X5는 D 또는 T이고; X6은 Y 또는 L이고; X7은 A 또는 T이고; X8은 I, N 또는 L이고; X9는 S 또는 T이고; X10은 S 또는 W이고; X11은 S 또는 N이고; X12는 D 또는 G이고; X13은 G 또는 D이고; X14는 S 또는 N이고; X15는 A 또는 T이고; X16은 A, S 또는 T이고; X17은 A, V 또는 I이고; X18은 S, A, I 또는 D이고; X19는 T, Y, R 또는 A이고; X20은 R, Y 또는 G이고; X21은 V, S, L 또는 T이고; X22는 L, G, S 또는 C이고; X23은 S, A, C 또는 P이고; X24는 T, A, S 또는 N이고; X25는 P, I, V 또는 D이고; X26은 부재하거나, V 또는 A이고; X27은 D, S 또는 R이거나 부재하고; X28은 V, G 또는 P이고; X29는 D, T, G 또는 R이고; X30은 Q, I, T 또는 R이고; X31은 V, K 또는 R이고; X32는 R, I 또는 Y이고; X33은 Y, Q, F 또는 A이고; X34는 V 또는 L이고; X35는 E, P 또는 D이고; X36은 V, Y 또는 A이다.
  23. 제22항에 있어서,
    X1이 F이고; X2가 T 또는 S이고; X3이 L 또는 F이고; X4가 D이고; X5가 D이고; X6이 Y이고; X7이 A 또는 T이고; X8이 I이고; X9가 S 또는 T이고; X10이 S이고; X11이 S이고; X12가 D이고; X13이 G이고; X14가 S이고; X15가 A 또는 T이고; X16이 A 또는 S이고; X17이 V 또는 A이고; X18이 A 또는 I이고; X19가 T 또는 Y이고; X20이 G 또는 R이고; X21이 L 또는 S이고; X22가 C 또는 S이고; X23이 P 또는 C이고; X24가 A 또는 S이고; X25가 V 또는 D이고; X26이 부재하거나 V이고; X27이 R이거나 부재하고; X28이 G 또는 P이고; X29가 T 또는 G이고; X30이 Q 또는 I이고; X31이 K 또는 R이고; X32가 R, I 또는 Y이고; X33이 F 또는 A이고; X34가 L이고; X35가 E 또는 D이고; X36이 V 또는 Y인, 항체.
  24. 제23항에 있어서,
    CDR1이 GFSFDDYA (서열번호 21)이고,
    CDR2가 ISSSDGST (서열번호 22)이고,
    CDR3이 SAIYRLSCSVVRPTIRYALDY (서열번호 23)인,
    항체.
  25. 제23항에 있어서,
    CDR1이 GFTFDDYA (서열번호 25)이고,
    CDR2가 ISSSDGSA (서열번호 26)이고,
    CDR3이 AVATGSCPADGGQKIFLEV (서열번호 27)인,
    항체.
  26. PROTAC을 검출, 정량화 또는 정제하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 단일특이성 항체의 시험관내 용도.
  27. 제1항 및 제3항 내지 제25항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체와 PROTAC의 복합체(PAX)로서, 이중특이성 항체가 PROTAC의 데그론에 결합하는, 복합체(PAX).
  28. 제26항에 있어서,
    PROTAC의 데그론 및 링커가 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기술된 바와 같은, 복합체(PAX).
  29. 제27항 또는 제28항의 복합체, 및 하나 이상의 추가의 약학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약학 조성물.
  30. 분해 표적 단백질을 발현하는 표적 세포에 PROTAC을 전달하기 위한, 제27항 또는 제28항의 복합체의 용도.
  31. 제27항 또는 제28항의 복합체를 그를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 질병을 치료하는 방법으로서, 상기 질병이 PROTAC의 분해 표적 단백질의 분해로부터 이익을 얻는, 방법.
  32. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    PROTAC의 분해 표적 단백질의 분해로부터 이익을 얻는 질병을 치료하는 데 사용하기 위한, 복합체(PAX).
  33. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    PAX가 먼저 투여된 후, 이어서 PAX의 PROTAC 성분 단독으로 투여되는, PROTAC의 분해 표적 단백질의 분해로부터 이익을 얻는 질병을 치료하는 데 사용하기 위한, 복합체(PAX).
  34. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    PAX의 항체 성분이 먼저 투여되고, 이어서 PAX의 PROTAC 성분이 투여되는, PROTAC의 분해 표적 단백질의 분해로부터 이익을 얻는 질병을 치료하는 데 사용하기 위한, 복합체(PAX).
KR1020247003823A 2021-07-02 2022-07-01 항-protac 항체 및 복합체 KR20240029062A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21183460.1 2021-07-02
EP21183460 2021-07-02
PCT/EP2022/068347 WO2023275394A1 (en) 2021-07-02 2022-07-01 Anti-protac antibodies and complexes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240029062A true KR20240029062A (ko) 2024-03-05

Family

ID=77042680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247003823A KR20240029062A (ko) 2021-07-02 2022-07-01 항-protac 항체 및 복합체

Country Status (6)

Country Link
KR (1) KR20240029062A (ko)
CN (1) CN117915951A (ko)
AU (1) AU2022304258A1 (ko)
CA (1) CA3225636A1 (ko)
IL (1) IL309780A (ko)
WO (1) WO2023275394A1 (ko)

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
KR20210132233A (ko) 2014-04-14 2021-11-03 아비나스 오퍼레이션스, 인코포레이티드 단백질분해의 이미드-기초된 조절인자 및 연관된 이용 방법
US10772962B2 (en) 2015-08-19 2020-09-15 Arvinas Operations, Inc. Compounds and methods for the targeted degradation of bromodomain-containing proteins
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
US11458123B2 (en) 2016-11-01 2022-10-04 Arvinas Operations, Inc. Tau-protein targeting PROTACs and associated methods of use
WO2018227023A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody construct conjugates
WO2018227018A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody conjugates of immune-modulatory compounds and uses thereof
JP2021510375A (ja) 2018-01-10 2021-04-22 ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジーＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 抗体ｐｒｏｔａｃコンジュゲート
CN111018857B (zh) 2018-10-09 2023-06-02 嘉兴优博生物技术有限公司 靶向蛋白酶降解平台(ted)
JP2022505450A (ja) 2018-10-24 2022-01-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト コンジュゲート化された化学的分解誘導物質および使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022304258A1 (en) 2024-02-15
IL309780A (en) 2024-02-01
CA3225636A1 (en) 2023-01-05
CN117915951A (zh) 2024-04-19
WO2023275394A1 (en) 2023-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI787796B (zh) 抗ｃｄ７１抗體類、可活化之抗ｃｄ７１抗體類及使用彼等之方法
US11833120B2 (en) Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives
JP7028648B2 (ja) 抗ｃｄ１６６抗体、活性化可能抗ｃｄ１６６抗体、およびその使用方法
JP2022064924A (ja) 抗ｐｄ－１抗体、活性化可能抗ｐｄ－１抗体、およびその使用方法
KR20190134654A (ko) Cd147 항체, 활성화가능한 cd147 항체, 그리고 이를 만들고, 이용하는 방법
AU2016258988A1 (en) Anti-ITGa3 antibodies, activatable anti-ITGa3 antibodies, and methods of use thereof
TW202039561A (zh) 基質金屬蛋白酶可切割且絲胺酸蛋白酶或半胱胺酸蛋白酶可切割之受質和彼之使用方法
TWI609887B (zh) 新穎的抗原結合蛋白及其作爲治療癌症之定址產物的用途
AU2018370279B2 (en) Antibodies to a-synuclein and uses thereof
JP2018509182A (ja) 抗ｐｄｌ１抗体、活性化可能抗ｐｄｌ１抗体、およびその使用方法
JP2022548310A (ja) 抗ｃｄ４７抗体、活性化可能抗ｃｄ４７抗体、およびその使用方法
JP7191134B2 (ja) Ｉｇｆ－１ｒ抗体および癌処置のためのアドレッシングビヒクルとしてのその使用
JP2021530436A (ja) Ａｘｌを標的とする抗体および抗体−薬物複合体ならびにその製造方法と使用
JP2023054356A (ja) 高親和性抗ｍｅｒｔｋ抗体およびその使用
EP4088739A1 (en) Method for producing eribulin-based antibody-drug conjugate
JP2021535209A (ja) ソルチリン受容体を標的化し血管擬態を阻害するための方法及び化合物
US10947316B2 (en) Antibody-drug conjugates containing anti-Globo H antibodies and uses thereof
CN116251196A (zh) 抗-edb抗体和抗体-药物缀合物
CN114746115A (zh) 抗原结合蛋白构建体及其用途
KR20240029062A (ko) 항-protac 항체 및 복합체
WO2021102445A1 (en) Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents
CN114786732A (zh) 抗原结合蛋白构建体及其用途