KR20240025035A - Cd19-car 발현 nk 세포에 의한 cd19-양성 림프성 악성종양의 제거 - Google Patents
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Abstract
CD19 CAR, CD16 및 IL2를 발현하는 NK-92® 세포의 조성물, 및 이러한 세포를 사용하여 환자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
Description
본 출원은 2018년 10월 31일에 출원된 일련 번호 제62/753,719호를 갖는 본원의 동시계류 중인 미국 가출원을 우선권으로 주장한다.
서열 목록
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발명의 분야
본 발명의 분야는 암 요법과 관련하여 조작된 세포이다.
배경기술의 설명은 본 발명을 이해하는 데 있어서 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 본원에 청구되는 발명과 관련이 있거나, 구체적으로 또는 암시적으로 언급되는 임의의 간행물이 선행 기술이라는 것에 대한 허용이 아니다.
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자연 살해(Natural killer: NK) 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구이다. 일반적으로 순환 림프구 중 약 10% 내지 15%를 나타내는 자연 살해(NK) 세포는, 항원에 대해 비-특이적으로 그리고 선행 면역 감작 없이, 바이러스-감염된 세포 및 많은 악성 세포를 포함하여 표적화된 세포에 결합하고 이를 사멸시킨다. 문헌[Herberman et al., Science 214:24 (1981)]. 표적화된 세포의 사멸은 세포 용해를 유도함으로써 발생한다. 자가 NK 세포 이식에 사용된 NK 세포는 대상체의 혈액의 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte: "PBL") 분획으로부터 단리되고, 충분한 수의 세포를 얻기 위해 세포 배양으로부터 증대되고, 이어서 대상체 내에 재주입된다. 이러한 자가 NK 세포는 생체내 치료에서 다소 효과적인 것으로 보여졌다. 그러나, 이러한 요법은 자가 유래에 국한되고, 모든 NK 세포가 세포용해성은 아니라는 점 때문에 추가적인 복잡성을 띤다.
NK-92®은 비호지킨 림프종을 앓고 있는 대상체의 혈액에서 발견된 후 시험관내에서 불멸화된 세포용해성 암 세포주이다. NK-92® 세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 나타나는 주요한 억제성 수용체가 결여되는 반면, 대다수의 활성화 수용체를 보유한다. 그러나, NK-92® 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고, 이들은 인간에서 허용 가능하지 않은 면역 거부 반응을 유발하지도 않는다. NK-92® 세포주의 특징화는 제WO 1998/049268호 및 미국 특허 출원 공개 제2002-0068044호에 개시되어 있다. NK-92® 세포는 특정 암의 치료에 있어서 치료제로서 평가되었다.
일부 구현예에서, 본 개시는 CD19 CAR 및 Fc 수용체를 발현하는 NK-92® 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 CD19 CAR 및 Fc 수용체를 인코딩하는 다중-시스트론성 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 수용체는 CD16이다. 일부 구현예에서, Fc 수용체는 SEQ ID NO: 2를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-시스트론성 전이유전자는 IL-2 또는 이의 변이체를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체는 erIL-2이다. 일부 구현예에서, CD19 CAR, Fc 수용체, 또는 erIL-2 중 하나 이상에 대한 코딩 서열은 인간계에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포는 CD19-발현 세포, 예를 들어, 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 SUP-B15 세포이다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 scFv 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv 항체 단편은SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 다중-시스트론성 작제물은 SEQ ID NO: 9의 서열을 포함하고, 여기서 서열은 scFv 항체 단편을 인코딩한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 자기-절단 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하고, 여기서 서열은 CD19 CAR과 CD16 사이에 위치되며, 서열은 CD19 CAR과 FcR의 등몰 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 CD16을 인코딩하는 서열과 IL-2 또는 이의 변이체를 인코딩하는 서열 사이에 내부 리보솜 도입 서열(internal ribosomal entry sequence: IRES)을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19-발현 세포에 대한 NK-92® 세포의 직접 세포독성은 표적에 대한 이펙터 비율이 10일 때 70% 내지 100%이다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포의 ADCC 활성은 표적에 대한 이펙터 비율이 10일 때 30% 내지 90%이다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 SEQ ID NO: 10에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 개시된 NK-92® 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 NK-92® 세포를 생성시키기 위한 방법으로서, 벡터를 제공하는 단계(여기서, 벡터는 CD19 CAR 및 CD16을 인코딩함), 및 벡터를 NK-92® 세포에 도입하여 NK-92® 세포를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터는 IL-2를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 자기-절단 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하고, 여기서 서열은 CAR과 CD16 사이에 위치되며, 서열은 CAR과 CD16의 등몰 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 CD16 코딩 서열과 IL-2 코딩 서열 사이에 내부 리보솜 도입 서열(IRES)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 조성물은 에러! 참조 출처를 찾을 수 없음 내지 에러! 참조 출처를 찾을 수 없음 중 어느 한 항의 복수의 NK-92® 세포를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체의 체표면적의 m2 당 약 1×108개 내지 약 1×1011개의 변형된 세포가 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 암은 백혈병 또는 림프종이다.
일부 구현예에서, 암은 B-세포 악성종양, HSCT 후 B-세포 악성종양, CLL, B-ALL, 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL), UCBT 후 B-계통 림프구성 악성종양, 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), B-비호지킨 림프종(B-Non-Hodgkin's Lymphoma: B-NHL), HSCT 후 ALL; 림프종, 불응성 여포성 림프종(refractory follicular lymphoma), 또는 림프아구성 백혈병 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, B-세포 악성종양은 맨틀 세포 림프종(Mantle cell lymphoma)이다. 일부 구현예에서, 복수의 NK-92® 세포는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 복수의 NK-92® 세포는 종양내로 투여된다.
상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 예시적이고 설명적인 것이고, 개시의 추가 설명을 제공하기 위해 의도된 것이다. 다른 목적, 이점 및 신규한 특징은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 하기 개시 내용을 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이다.
도 1은 1세대, 2세대, 및 3세대 CAR의 구조 도메인의 개략도이다.
도 2는 CAR 코딩 서열, P2A 서열, CD16 코딩 서열, 및 erIL-2 코딩 서열을 포함하는 삼중시스트론성 플라스미드의 구성요소를 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 CD19 t-haNK™ 세포의 표면 상에서 CD16 및 CD19-CAR의 발현을 나타내는 유세포 분석의 결과를 나타낸 것이다. 각 플롯의 우측 피크는 CD16 또는 CD19를 발현하는 세포의 집단을 나타낸다.
도 4a는 K562 세포에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 세포독성 효과를 나타낸 것이다. 16B1 및 18B1은 서로 다른 두 날에 수행된 두 가지 전기천공 사례로부터 얻어진 두 CD19 t-haNK™ 집단이다. 도 4b는 세포독성 검정에서 K562에 대한 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 세포독성 효과를 나타낸 것이다.
도 5a는 SUP-B15 세포에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 세포독성 효과를 나타낸 것이다. 16B1 및 18B1는 서로 다른 두 날에 수행된 두 가지 전기천공 사례로부터 얻어진 두 CD19 t-haNK™ 집단이다. 도 5b는 세포독성 검정에서 SUP-B15에 대한 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 세포독성 효과를 나타낸 것이다.
도 6a는 헤르셉틴(항-Her2 항체)과 조합되는 경우 SKBr3 세포에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 ADCC 활성을 나타낸 것이다. 항 CD20 항체 리툭산이 대조군으로서 사용되었다. 도 6b는 항-CD20 항체 리툭시맙과 조합되는 경우 CD19KO/CD20+인 SUP-B15 세포에 대한 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 배가 시간을 나타낸 것이다.
도 8은 배양 조건에서 선택된 CD19 t-haNK™ 클론으로부터의 IL-2 방출을 나타낸 것이다.
도 9는 IV Raji 종양 보유 동물의 생존 곡선을 나타낸 것이다. 통계 분석은 로그-순위(맨텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험에 의해 수행되었다. ****, P < 0.0001.
도 10은 IV Raji 종양 모델에서 동물 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다. SEM은 표준 편차를 N의 제곱근으로 나누어 계산되었다.
도 11은 SC Raji 모델에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 2-원 ANOVA 그리고 이어서 튜키 시험(Tukey test)에 의한 다중 비교를 이용하여 수행되었다; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
도 12는 SC Raji 종양-보유 마우스의 간에서 CD19 t-haNK™ 감소된 전이성 질병 부담을 나타낸 것이다. (a) 13 일째 지정된 치료군으로부터의 동물의 전체 간 이미지. 노랑색 화살표는 전이성 병변을 지시한다. 간은 사진촬영 전 적어도 24시간 동안 10% 포르말린에서 고정되었다. (b) 지정된 날에 간에서 종양 세포의 관여 비율의 정량화(H&E 염색에 의해 평가됨). 13일째: *, 짝지어지지 않은 2-꼬리 t 검정에 의해 P = 0.0257. 11일째 및 15일째 통계 분석은 제한된 샘플 크기로 인해 수행될 수 없었다. 로우 데이터에 대해서는 표 4를 참조하라.
도 13은 SC Raji 종양 모델에서 동물 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다.
도 1은 1세대, 2세대, 및 3세대 CAR의 구조 도메인의 개략도이다.
도 2는 CAR 코딩 서열, P2A 서열, CD16 코딩 서열, 및 erIL-2 코딩 서열을 포함하는 삼중시스트론성 플라스미드의 구성요소를 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 CD19 t-haNK™ 세포의 표면 상에서 CD16 및 CD19-CAR의 발현을 나타내는 유세포 분석의 결과를 나타낸 것이다. 각 플롯의 우측 피크는 CD16 또는 CD19를 발현하는 세포의 집단을 나타낸다.
도 4a는 K562 세포에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 세포독성 효과를 나타낸 것이다. 16B1 및 18B1은 서로 다른 두 날에 수행된 두 가지 전기천공 사례로부터 얻어진 두 CD19 t-haNK™ 집단이다. 도 4b는 세포독성 검정에서 K562에 대한 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 세포독성 효과를 나타낸 것이다.
도 5a는 SUP-B15 세포에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 세포독성 효과를 나타낸 것이다. 16B1 및 18B1는 서로 다른 두 날에 수행된 두 가지 전기천공 사례로부터 얻어진 두 CD19 t-haNK™ 집단이다. 도 5b는 세포독성 검정에서 SUP-B15에 대한 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 세포독성 효과를 나타낸 것이다.
도 6a는 헤르셉틴(항-Her2 항체)과 조합되는 경우 SKBr3 세포에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 ADCC 활성을 나타낸 것이다. 항 CD20 항체 리툭산이 대조군으로서 사용되었다. 도 6b는 항-CD20 항체 리툭시맙과 조합되는 경우 CD19KO/CD20+인 SUP-B15 세포에 대한 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 배가 시간을 나타낸 것이다.
도 8은 배양 조건에서 선택된 CD19 t-haNK™ 클론으로부터의 IL-2 방출을 나타낸 것이다.
도 9는 IV Raji 종양 보유 동물의 생존 곡선을 나타낸 것이다. 통계 분석은 로그-순위(맨텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험에 의해 수행되었다. ****, P < 0.0001.
도 10은 IV Raji 종양 모델에서 동물 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다. SEM은 표준 편차를 N의 제곱근으로 나누어 계산되었다.
도 11은 SC Raji 모델에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다. 통계 분석은 2-원 ANOVA 그리고 이어서 튜키 시험(Tukey test)에 의한 다중 비교를 이용하여 수행되었다; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
도 12는 SC Raji 종양-보유 마우스의 간에서 CD19 t-haNK™ 감소된 전이성 질병 부담을 나타낸 것이다. (a) 13 일째 지정된 치료군으로부터의 동물의 전체 간 이미지. 노랑색 화살표는 전이성 병변을 지시한다. 간은 사진촬영 전 적어도 24시간 동안 10% 포르말린에서 고정되었다. (b) 지정된 날에 간에서 종양 세포의 관여 비율의 정량화(H&E 염색에 의해 평가됨). 13일째: *, 짝지어지지 않은 2-꼬리 t 검정에 의해 P = 0.0257. 11일째 및 15일째 통계 분석은 제한된 샘플 크기로 인해 수행될 수 없었다. 로우 데이터에 대해서는 표 4를 참조하라.
도 13은 SC Raji 종양 모델에서 동물 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SEM이다.
개요
본 개시는 CD19 CAR 및 Fc 수용체를 발현하는 NK-92® 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 IL-2를 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 CD19 CAR 및 Fc, 및 IL2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 삼중시스트론성 작제물을 포함한다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 하기 청구항에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의될 다수의 용어가 언급될 것이다.
본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 기재하기 위한 것일 뿐이며, 제한하고자 함은 아니다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태 또한 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어, "자연 살해 세포"에 대한 언급은 복수의 자연 살해 세포를 포함한다.
모든 숫자로 나타낸 명칭, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도 양, 및 분자량 (범위 포함)은 적절한 경우에 0.1 또는 1.0의 증분에 의해 (+) 또는 (-)로 달라지는 근사치이다. 항상 분명하게 언급되지는 않지만, 숫자로 나타낸 명칭 모두는 그 앞에 용어 "약"이 있을 수 있는 것으로 이해해야 한다.
본원에 사용된 "+"는, 특정 세포 마커의 존재를 나타내기 위해 사용될 때, 세포 마커가 이소형 대조군에 비해 형광 활성화 세포 분류에서 검출 가능하게 존재하거나; 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR에서 배경 위에 검출 가능하다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "-"는, 특정 세포 마커의 존재를 나타내기 위해 사용될 때, 세포 마커가 이소형 대조군에 비해 형광 활성화 세포 분류에서 검출 가능하지 않게 존재하거나; 정량적 또는 반-정량적 RT-PCR에서 배경 위에 검출 가능하지 않다는 것을 의미한다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위해, 특히 서면 기재사항을 제공하는 관점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 이의 하위범위의 조합을 포괄한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위가 적어도 2등분, 3등분, 4등분, 5등분, 10등분 등으로 분해되는 것을 충분하게 기재하고 가능하게 함으로써 용이하게 인식될 수 있다. 비-제한적 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 용이하게 분해될 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 모든 언어 예컨대 "최대", "적어도", "초과", "미만" 등은 언급된 수를 포함하고, 상기 논의된 바와 같은 하위범위로 후속적으로 분해될 수 있는 범위를 지칭한다. 최종적으로, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1개 내지 3개의 세포를 갖는 군은 1개, 2개, 또는 3개의 세포를 갖는 군을 지칭한다. 유사하게, 1개 내지 5개의 세포를 갖는 군은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 세포를 갖는 군 등을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "필적 가능한", 또는 "실질적으로 유사한"과 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은, NK-92® 세포의 특정 정량화 가능한 성질, 예컨대, 세포독성, 생존율 또는 세포 배가 시간 등을 언급하는 경우, 이러한 성질의 두 측정치가 서로 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 또는 5% 이하 상이하다는 것을 지칭한다.
또한, 항상 명확하게 명시되지는 않지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시적인 것이고, 그의 등가물이 당해 기술 분야에 공지되어 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 목적을 위해 그리고 달리 지시되지 않는 한, 용어 "NK-92®™"은 본래의 NK-92® 세포주뿐만 아니라 NK-92® 세포주, NK-92® 세포의 클론, 및 변형되지 않은 NK-92® 세포(예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해)를 지칭하기 위해 의도된 것이다. NK-92® 세포 및 예시적인 및 비-제한적 이의 변형예는 미국 특허 제7,618,817호; 제8,034,332호; 제8,313,943호; 제9,181,322호; 제9,150,636호; 및 미국 공개 출원 제10/008,955호에 기재되어 있고, 이들 모두 그 전체가 참조로서 본원에 포함되며, 야생형 NK-92®, NK-92®-CD16, NK-92®-CD16-γ, NK-92®-CD16-ζ, NK-92®-CD16(F176V), NK-92®MI, 및 NK-92®CI를 포함한다. NK-92® 세포는 당업자에게 공지되어 있으며, 이러한 세포는 NantKwest®, Inc.로부터 용이하게 입수 가능하다.
본원에 사용된 용어 "NK-92® 세포"는 Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest®가 소유한다(이하에서, "NK-92® 세포").
본원에 사용된 용어 "aNK 세포"는 Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 변형되지 않은 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest®가 소유한다(이하에서, "aNK 세포").
본원에 사용된 용어 "haNK 세포"는 세포 표면 상에서 CD16을 발현하도록 변형된, Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest®가 소유한다(이하에서, "CD16+ NK-92® 세포" 또는 "haNK 세포").
본원에 사용된 용어 "taNK 세포®"는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형된, Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantKwest®가 소유한다(이하에서, "CAR-변형된 NK-92® 세포" 또는 "taNK 세포®").
본원에 사용된 용어 "t-haNK™"는 세포 표면 상에서 CD16을 발현하고 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형된, Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)]에 기재된 매우 강력한 고유 세포주로부터 유래된 자연 살해 세포를 지칭하며, 이의 권리는 NantkWest®가 소유한다(이하에서, "CAR-변형된 CD16+ NK-92® 세포" 또는 "t-haNK™ 세포"). 일부 구현예에서, 종양 특이적 항원은 CD19이고, 이러한 NK-92® 세포들은 CD19 t-haNK™ 세포로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "다중-시스트론성 작제물"은 단일 mRNA 분자로 번역될 재조합 DNA 작제물을 지칭하며, 단일 mRNA 분자는 둘 이상의 전이유전자를 인코딩한다. 다중-시스트론성 작제물은 두 개의 전이유전자를 인코딩하는 경우 이중시스트론성 작제물로, 세 개의 유전자를 인코딩하는 경우 삼중시스트론성 작제물로, 그리고 네 개의 유전자를 인코딩하는 경우 사중시스트론성 작제물 등으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)는 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인을 지칭한다. CAR은 T 세포 또는 NK 세포에서 발현되어 세포독성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 세포외 항원-결합 도메인은 관심 대상의 세포에서 발견되는 항원에 특이적인 scFv이다. CAR-발현 NK-92® 세포는 scFv 도메인의 특이성에 기초하여, 세포 표면 상에 특정 항원을 발현하는 세포에 표적화된다. scFv 도메인은 종양-특이적 항원 및 바이러스-특이적 항원을 포함하는 임의의 항원을 인식하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, CD19 CAR은 일부 암에 의해 발현되는 세포 표면 마커인 CD19를 인식한다.
본원에 사용된 용어 "종양-특이적 항원"은 암 또는 신생물성 세포에 존재하나 암 세포와 동일한 조직 또는 계열로부터 유래된 정상 세포에서는 검출 가능하지 않은 항원을 지칭한다. 본원에 사용된 종양-특이적 항원은 또한 종양-관련 항원, 즉, 암 세포 상에서 암 세포와 동일한 조직 또는 계열로부터 유래된 정상 세포에 비해 보다 높은 수준으로 발현되는 항원을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "표적"은, 종양의 표적화를 지칭하는 경우, 종양 세포(즉, 표적 세포)를 인식하고 사멸시키는 NK-92® 세포의 능력을 지칭한다. 이러한 문맥에서 용어 "표적화된"은, 예를 들어, 종양에 의해 발현된 세포 표면 항원을 인식하고 이에 결합하는 NK-92® 세포에 의해 발현된 CAR의 능력을 지칭한다.
용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이적 결합을 위한 온전한 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 온전한 면역글로불린 또는 이의 단편을 지칭하고, 키메라, 인간화, 완전 인간, 및 이중특이성 항체를 포함한다. 온전한 항체는 일반적으로 적어도 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 예에서 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타과에서 자연 발생한 항체와 같이 더 적은 사슬을 포함할 수 있다. 항체는 오로지 단일 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 항체의 상이한 부분이 두 개의 상이한 항체로부터 유래되는 "키메라"일 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 하이브리도마에서 생산될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 외에, 이의 유도체, 변이체, 단편, 및 뮤테인을 포함한다. 또한, 달리 분명하게 배제되지 않는 한, 항체는 단클론성 항체, 이중특이성 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 합성 항체(본원에서 종종 "항체 모사체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(본원에서 종종 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 이의 단편을 각각 포함한다. 일부 구현예에서, 이 용어는 또한 펩티바디(peptibody)를 포함한다.
용어 "대상체"는 고양이, 개, 소, 말, 돼지, 양, 및 염소와 같은 포유동물을 포함한 비-인간 동물, 및 인간을 지칭한다. 용어 대상체는 또한 본원에 기재된 질병에 대한 치료를 필요로 하는 환자를 지칭한다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기재되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 그 기재가 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하나, 다른 요소는 제외하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. "~로 본질적으로 이루어지는"은, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우, 조합에 대해 임의의 본질적인 유의성이 있는 다른 요소를 제외하는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어지는 조성물은 청구범위의 기본 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 요소는 제외하지 않을 것이다. "~로 이루어지는"은 미량보다 많은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계를 제외하는 것을 의미한다. 각각의 이러한 과도기적 용어에 의해 정의된 구현예는 개시의 범주 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "세포독성" 및 "세포용해"는, 이펙터 세포, 예컨대, NK 세포의 활성을 기재하는 데 사용되는 경우, 동의어인 것으로 의도된다. 일반적으로, 세포독성 활성은 임의의 다양한 생물학적, 생화학적 또는 생물물리학적 메카니즘에 의한 표적 세포의 사멸과 관련된다. 세포용해는 보다 구체적으로 이펙터가 표적 세포의 형질막을 용해시키고, 그에 따라 이의 물리적 온전성을 파괴하는 활성을 지칭한다. 이는 표적 세포의 사멸을 일으킨다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, NK 세포의 세포독성 효과는 세포용해로 인한 것으로 여겨진다.
세포/세포 집단에 대한 용어 "사멸시키다"는 그 세포/세포 집단의 죽음에 이르게 할 임의의 유형의 조작을 포함하도록 지시된다.
용어 "시토카인" 또는 "시토카인들"은 면역계의 세포에 영향을 미치는 일반적인 부류의 생물학적 분자를 지칭한다. 예시적인 시토카인은 FLT3 리간드, 인터페론 및 인터류킨(IL), 특히 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
용어 "환자", "대상체", "개체" 등은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 본원에 기재된 방법에 적용 가능한 임의의 동물, 또는 시험관내이든지 또는 계내이든지 이의 세포를 지칭한다. 특정 비-제한적 구현예에서, 환자, 대상체, 또는 개체는 인간이다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대, 인간에서, 본원에 기재된 질병 또는 장애의 치료를 포함하고, (i) 질병 또는 장애를 억제, 즉 이의 진행을 정지시키는 것; (ii) 질병 또는 장애를 경감, 즉 장애의 퇴행을 유발하는 것; (iii) 장애의 진행을 저속화시키는 것; 및/또는 (iv) 질병 또는 장애 중 하나 이상의 증상의 진행을 억제, 경감 또는 저속화시키는 것을 포함한다. 대상체에 대한 단클론성 항체 또는 자연 살해 세포의 "투여하는" 또는 "투여"라는 용어는 의도된 기능을 수행하기 위해 항체 또는 세포를 임의의 경로로 도입 또는 전달하는 것을 포함한다. 투여는 세포 또는 단클론성 항체의 전달에 적합한 임의의 경로에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 전달 경로는 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하 전달을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는, 예를 들어, 종양 내로의 주사에 의해 종양에 직접 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재되는 변형된 NK-92® 세포는 비경구로, 예를 들어, 주사, 주입 또는 이식(피하, 정맥내, 근육내, 수포내, 종양내, 또는 복강내)에 의해 투여된다.
용어 "발현"은 유전자 산물의 생산을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성"은 이펙터 세포, 예컨대, NK 세포의 활성을 기재하는 데 사용되는 경우, 임의의 다양한 생물학적, 생화학적, 또는 생물물리학적 메카니즘에 의한 표적 세포의 사멸을 지칭한다.
용어 "감소시키다", "저하된", "저하", 및 "감소시키다"는 모두 본원에서, 참조 수준과 비교하여 적어도 10%만큼의 감소, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼 또는 최대 100% 및 그를 포함하는 감소(즉, 참조 샘플과 비교하여 부재하는 수준), 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 감소를 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "암"은 백혈병, 암종 및 육종을 포함한, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물, 또는 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 두경부암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 및 수모세포종을 포함한다. 추가적인 예는 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 방광암, 전암성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신 피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립선암을 포함한다.
용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 치료되지 않은 환자에 비해 질병의 증상을 경감시키는 데 필요한 양을 지칭한다. 질병의 치료적 처치를 위해 본 개시를 실시하는 데 사용되는 활성 화합물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중, 및 전반적인 건강에 따라 다르다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사가 적절한 양 및 투여 방식을 결정할 것이다. 이러한 양은 "유효"량으로 지칭된다.
표제 또는 부표제는 독자의 편의를 위해 본 명세서에 사용될 수 있으며, 이는 본 개시의 범주에 영향을 미치도록 의도된 것은 아니다. 추가적으로, 본 명세서에 사용된 일부 용어는 하기에 보다 구체적으로 정의되어 있다.
NK-92® 세포
NK-92®은 비호지킨 림프종을 앓고 있는 대상체의 혈액에서 발견된 후, 시험관내에서 불멸화된 세포용해성 암 세포주이다. NK-92® 세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 나타나는 주요한 억제성 수용체가 결여되는 반면, 대다수의 활성화 수용체를 보유한다. 그러나, NK-92® 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고, 이들은 인간에서 허용 가능하지 않은 면역 거부 반응을 유발하지도 않는다. NK-92® 세포주의 특징화는 제WO 1998/049268호 및 미국 특허 출원 공개 제2002-0068044호에 개시되어 있다. NK-92® 세포는 또한 특정 암의 치료에 있어서 잠재적인 치료제로서 평가되었다.
벡터
본원에 기재된 변형된 세포를 생산하기 위해 세포를 형질감염시키기 위한 벡터가 본원에 기재된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 일과성 발현 벡터이다. 이러한 벡터를 사용하여 도입된 외인성 전이유전자는 세포의 핵 게놈에 통합되지 않으므로; 벡터 복제의 부재 하에서, 외래 전이유전자는 시간 경과에 따라 저하되거나 희석될 것이다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 세포의 안정한 형질감염을 가능하게 한다. 일 구현예에서, 벡터는 세포의 게놈으로 전이유전자(들)의 혼입을 가능하게 한다. 일 구현예에서, 벡터는 양성 선택 마커를 갖는다. 양성 선택 마커는 유전자를 발현하지 않는 세포를 사멸시킬 조건 하에 세포가 성장되게 하는 임의의 유전자를 포함한다. 비-제한적 예는 항생제 내성, 예를 들어, 제네티신(Tn5로부터의 Neo 유전자)을 포함한다.
일 구현예에서, 벡터는 플라스미드 벡터이다. 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 임의의 적합한 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 세포는 관심 대상의 단백질을 인코딩하는 mRNA로 형질감염된다(예를 들어, CAR). mRNA의 형질감염은 단백질의 일과성 발현을 야기한다. 일 구현예에서, mRNA의 NK-92® 세포로의 형질감염은 세포의 투여 직전에 수행된다. 일 구현예에서, 세포의 투여 "직전"은 투여하기 약 15분 내지 약 48시간 전을 지칭한다. 바람직하게는, mRNA 형질감염은 투여 약 5시간 내지 약 24시간 전에 수행된다.
CD19
CD19는 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 막관통 당단백질이다. 이는 단일 막관통 도메인, 세포질 C-말단, 및 세포외 N-말단을 갖는다. CD19는 정상 및 신생 B 세포, 뿐만 아니라 여포 수지상 세포에 대한 바이오마커이며, B-세포 수용체-의존적 및 독립적 신호전달 둘 모두를 조절함으로써 내인성 B 세포 신호전달 임계를 확립하는 데 결정적으로 관여한다.
CD19는 대부분의 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 B 세포 림프종에서 발현된다. 대다수의 B 세포 악성종양은 CD19를 정상 내지 고수준으로(ALL 80%, B 세포 림프종 88% 및 B 세포 백혈병 100%) 발현한다. B 세포 특징이더라도 CD19는 2%의 AML인 경우를 포함하여 골수성 악성종양의 경우에도 관찰되었다. 문헌[Wang et al., Exp. Hematol. Oncol. Nov. 29, 2012; 1:36]. CD19와 관련된 악성종양의 비-제한적 예는 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
CD19 및 관련 악성종양
CARS
종양 세포를 동일한 조직으로부터 유래된 정상 세포와 구별하는 표현형 변화는, 정상 세포 표면 성분의 상실 또는 다른 것(즉, 상응하는 정상, 비-암성 조직에서는 검출 불가능한 항원)의 수득을 포함하여, 흔히 특정한 유전자 산물의 발현에서의 하나 이상의 변화와 연관된다. 신생물성 또는 종양 세포에서 발현되지만 정상 세포에서는 발현되지 않거나, 정상 세포에서 발견되는 수준보다 실질적으로 높은 수준으로 신생물성 세포에서 발현되는 항원은 "종양-특이적 항원" 또는 "종양-관련 항원"으로 칭해졌다. 종양-특이적 항원은 암 면역요법을 위한 표적으로서 사용되었다. 하나의 이러한 요법은, T 세포 및 NK 세포를 포함하는 면역 세포의 표면 상에 발현된 키메라 항원 수용체(CAR)를 이용하여, 암 세포에 대항하는 세포독성을 개선한다. CAR은 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인에 연결된 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. scFv는 표적 세포(예를 들어, 암 세포) 상의 항원을 인식하여 결합하고, 이펙터 세포 활성화를 촉발한다. 신호전달 도메인은 수용체에 의한 세포내 신호전달에 중요한 면역수용체 티로신-기반 활성화 도메인(ITAM)을 함유한다.
본 개시는 세포 표면 상에서 적어도 하나의 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 NK-92® 세포를 제공한다. CAR은 특이적 항원이 인식되면 세포용해 반응을 촉발할 수 있는 세포외 항원 인식 부분(대개 특이적 항체의 가변 도메인으로부터 유래됨)을 세포내 신호전달 도메인(단일 또는 추가 공동-자극 요소와 함께)에 조합한다. 다중 유형의 CAR이 존재하는데, 이들 모두 적용에 사용될 수 있다. 1세대 CAR은 하나의 세포질 신호전달 도메인을 함유한다. 신호전달 도메인은, 예를 들어, 하나의 ITAM을 함유하는 Fc 엡실론 수용체 감마(FcεRIγ) 또는 3개의 ITAM을 함유하는 CD3ζ로부터 유래될 수 있다. CD3ζ CAR은 FcεRIγ CAR보다 종양 박멸에 보다 효율적인 것으로 사료된다. 예를 들어, 문헌[Haynes, et al. 2001, J. Immunology 166:182-187; Cartellieri, et al. 2010, J. Biomed and Biotech, Vol. 2010, 논문 ID 956304]을 참조하라. 2세대 및 3세대 CAR은 다중 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인 및 공동자극성 신호전달 도메인, 예컨대, CD28/CD134/CD137/ICOS 및 CD28/CD134을 단일 CAR에 조합하여 NK-92® 세포의 활성화 및 증식을 촉진한다. 따라서, 일부 구현예에서, CD19 t-haNK™ 세포에 의해 발현된 CD19 CAR은 CD8으로부터의 힌지 영역, 및/또는 CD28의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 FcεRIγ의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 힌지 영역, CD28의 막관통 도메인 및 FcεRIγ 또는 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 가출원 제62/674,936호에 개시되어 있다.
선행 간행물, 예컨대, 문헌[Haynes, et al. 2001, J. Immunology 166:182-187 및 Cartellieri, et al. 2010, J. Biomed and Biotech, Vol. 2010, 논문 ID 956304]에는 CD3ζ CAR이 FcεRIγ CAR보다 종양 박멸에 보다 효율적일 수 있다고 개시되어 있지만, 이러한 경우에, 본 발명자들은 놀랍게도 그리고 예기치 않게도 본원에 개시된 세포, 조성물, 및 방법에 대한 경우에는 그렇지 않다는 것을 발견하였다. 실제로, 본 발명자들은 본원에 개시된 바와 같은 NK-92® 세포가 FcεRIγ CAR 도메인을 갖는 경우, CD3ζ CAR을 갖는 것만큼 효과적이거나, 일부 구현예에서는 이보다 훨씬 더 효과적이라는 것을 발견하였다.
선택적으로, CAR은 CD19에 대해 특이적이다. 일부 구현예에서, CD19는 인간 CD19이다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 scFv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 t-haNK™ 세포는 SEQ ID NO: 10을 인코딩하는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 t-haNK™ 세포는 SEQ ID NO: 12를 인코딩하는 SEQ ID NO: 11의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 t-haNK™ 세포는 SEQ ID NO: 13의 삼중시스트론성 작제물을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 CAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO:10에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-에피토프 태그 펩티드 단클론성 또는 다클론성 항체를 사용함으로써 세포 표면 검출을 돕기 위해 에피토프 태그 펩티드, 예컨대, FLAG, myc, 폴리히스티딘 또는 V5가 폴리펩티드의 아미노 말단 도메인에 첨가될 수 있다.
예에서, 변이체 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대, 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 제조된다. 부위 지정 돌연변이유발(Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987), 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발(Wells et al., 1985) 또는 다른 공지된 기술이 클로닝된 DNA에 대해 수행되어 CD16 변이체를 생산할 수 있다(Ausubel, 2002; Sambrook and Russell, 2001).
일부 구현예에서, CD19 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAR의 기능을 변경하지 않으면서 CAR에 대하여 인코딩하는 아미노산 서열을 변경하도록 돌연변이된다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 폴리뉴클레오티드 치환은 SEQ ID NO:9 또는 11에서 이루어질 수 있다.
한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 또 다른 아미노산으로 교체되는 SEQ ID NO:10 또는 12에서의 보존적 치환은 치환이 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한 개시된 변이체의 범주 내에 속한다. 보존적 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있다. (1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예컨대, β-시트 또는 α-나선 입체형태, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위의 측쇄의 부피에 영향을 미치는 비-보존적 치환은 폴리펩티드 기능 또는 면역학적 동일성을 변형시킬 수 있다. 비-보존적 치환은 이러한 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다. 치환은 보존적 치환 부위내로, 또는 보다 바람직하게는 비-보존 부위 내로 도입될 수 있다.
예에서, 변이체 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대, 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 생산된다. 부위 지정 돌연변이유발(Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987), 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발(Wells et al., 1985) 또는 다른 공지된 기술이 클로닝된 DNA에 대해 수행되어 CD16 변이체를 생산할 수 있다(Ausubel, 2002; Sambrook and Russell, 2001).
선택적으로, CD19 t-haNK™ 세포는 암, 특히, CD19을 발현하는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 암은 백혈병(급성 백혈병(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병 포함)) 및 만성 백혈병(예를 들어, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성 다혈구혈증, 림프종(예를 들어, 호지킨병 및 비호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로불린혈증, 중쇄 질병, 육종 및 암종, 예컨대, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담즙 관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아성 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
FC 수용체
일부 구현예에서, NK-92® 세포는 적어도 하나의 Fc 수용체를 발현하도록 변형되고, 이로써 적어도 하나의 Fc 수용체가 NK-92® 세포의 세포 표면 상에 디스플레이된다. Fc 수용체는 항체의 Fc 부분에 결합한다. 여러 Fc 수용체는 공지되어 있고, 이의 바람직한 리간드, 친화도, 발현, 및 항체에 대한 결합 후 효과에 따라 상이하다.
[표 2]
예시적인 Fc 수용체
일부 구현예에서 NK-92® 세포는 세포 표면 상에서 Fc 수용체 단백질을 발현하도록 변형된다.
일부 구현예에서, Fc 수용체는 CD16이다. 본 개시의 목적 상, CD16의 특정 아미노산 잔기는 SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:1에 대해 한 위치에서 상이한 SEQ ID NO:1을 참조하여 지정된다. 따라서, CD16 폴리펩티드의 "위치 158"에서 아미노산 잔기는 CD16 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:2가 최대로 정렬되는 경우에 SEQ ID NO:2(또는 SEQ ID NO:1)의 위치 158에 상응하는 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 성숙 형태의 단백질, 예를 들어, SEQ ID NO:1의 위치 158에 페닐알라닌을 갖는 인간 CD16을 발현하도록 변형된다. 전형적인 구현예에서, NK-92® 세포는 성숙 형태의 단백질, 예를 들어, SEQ ID NO:2의 위치 158에 발린을 갖는 고친화도 형태의 인간 CD16을 발현하도록 변형된다. 성숙 단백질의 위치 158은 네이티브 신호 펩티드를 포함하는 CD16 서열의 위치 176에 상응한다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 전구체(즉, 네이티브 신호 펩티드를 가짐) 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 따라서, 일 구현예에서, Fc 수용체는 FcγRIII-A(CD16)를 포함한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 SEQ ID NO:1(위치 158에 페닐알라닌을 갖는 FcγRIII-A 또는 CD16(F-158))과 적어도 90% 서열 동일성; 또는 SEQ ID NO:2(위치 158에 발린을 갖는 CD16(F158V), 보다 높은 친화도 형태)에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 Fc 수용체를 발현하도록 유전자 변형된다.
일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전장 CD16의 위치 176(성숙 CD16 단백질의 위치 158에 상응함)에 페닐알라닌을 갖는, 신호 펩티드를 포함하여 전장 자연 발생 CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70% 폴리뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 위치 176(성숙 단백질의 위치 158에 상응함)에 발린을 갖는, 신호 펩티드를 포함하여 전장 자연 발생 CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70% 폴리뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:13에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖고, 신호 펩티드를 포함하여 전장 CD16 폴리펩티드의 위치 176을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 위치에 발린을 인코딩하는 코돈을 포함한다. 일부 구현예에서, CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전장 CD16의 위치 176에 발린을 인코딩하는 코돈과 함께 SEQ ID NO:13을 포함한다.
일부 구현예에서, CD16 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2에 대해 적어도 70% 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, SEQ ID NO:2를 참조로 결정되는 위치 158에서 발린을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2를 인코딩한다. 일부 구현예에서, CD16 폴리뉴클레오티드는 신호 서열이 존재하거나 또는 존재하지 않는 CD16의 세포외 도메인, 또는 전장 CD16의 임의의 다른 단편, 또는 또 다른 단백질의 아미노산 서열에 융합된 CD16의 적어도 부분적인 서열을 포괄하는 키메라 수용체를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 항-에피토프 태그 펩티드 단클론성 또는 다클론성 항체를 사용함으로써 세포 표면 검출을 돕기 위해 에피토프 태그 펩티드, 예컨대, FLAG, myc, 폴리히스티딘 또는 V5가 성숙 폴리펩티드의 아미노 말단 도메인에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 상동 CD16 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 150개 내지 약 700개, 약 750개, 또는 약 800개의 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 700개 내지 800개 초과의 폴리뉴클레오티드를 갖는 CD16 변이체도 본 개시의 범주 내에 포함된다.
상동 폴리뉴클레오티드 서열은 CD16의 변이체를 코딩하는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 것들을 포함한다. 상동 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 SEQ ID. NO: 1과 관련된 자연 발생 대립유전자 변이를 포함한다. NK-92® 세포를 SEQ ID. NO: 1 또는 SEQ ID. NO: 2에 제시된 아미노산 서열, 이의 자연 발생 변이체, 또는 SEQ ID. NO: 1 또는 SEQ ID. NO: 2에 대해 적어도 70% 동일하거나 또는 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 것은 본 개시의 범주 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 상동 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에서 보존적 아미노산 치환을 인코딩한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 네이티브 폴리뉴클레오티드 서열과는 상이하지만 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 축중성 상동 CD16 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 형질감염된다.
다른 예에서, CD16 아미노산 서열을 변화시키는 다형성을 갖는 cDNA 서열은, 예를 들어 CD16 유전자에서 유전적 다형성을 나타내는 개체 간 대립유전자 변이와 같이 NK-92® 세포를 변형시키는 데 사용된다. 다른 예에서, SEQ ID NO:1의 서열과 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 다른 종으로부터의 CD16 유전자가 NK-92® 세포를 변형시키는 데 사용된다.
변이체 폴리펩티드는 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대, 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 제조될 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발(Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987), 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발(Wells et al., 1985) 또는 다른 공지된 기술이 클로닝된 DNA에 대해 수행되어 CD16 변이체를 생산할 수 있다(Ausubel, 2002; Sambrook and Russell, 2001).
일부 구현예에서, CD16을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CD16의 기능을 변경하지 않으면서 CD16에 대하여 인코딩하는 아미노산 서열을 변경하도록 돌연변이된다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 폴리뉴클레오티드 치환은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2에서 이루어질 수 있다.
한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 또 다른 아미노산으로 교체되는, SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID NO:2 내의 보존적 치환은 치환이 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한, 개시된 CD16 변이체의 범주 내에 속한다. 보존적 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있다. (1) 폴리펩티드 골격의 구조, 예컨대, β-시트 또는 α-나선 입체형태, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위의 측쇄의 부피에 영향을 미치는 비-보존적 치환은 CD16 폴리펩티드 기능 또는 면역학적 동일성을 변형시킬 수 있다. 비-보존적 치환은 이러한 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반한다. 치환은 보존적 치환 부위내로, 또는 보다 바람직하게는 비-보존 부위 내로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 길이가 적어도 200개의 아미노산이고 SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID. NO:2에 대해 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 길이가 적어도 225개의 아미노산이고 SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID. NO:2에 대해 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID. NO:2를 참조하여 결정된 바와 같이 위치 158에 발린을 갖는다.
일부 구현예에서, CD16 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 CD16 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. CD16 융합 폴리펩티드는 비-CD16 폴리펩티드와 융합된 CD16의 임의의 부분 또는 전체 CD16을 포함한다. 융합 폴리펩티드는 재조합 방법을 사용하여 편리하게 생성된다. 예를 들어, CD16 폴리펩티드, 예컨대, SEQ ID. NO:1 또는 SEQ ID. NO:2를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 비-CD16 인코딩 폴리뉴클레오티드(예컨대, 이종 단백질의 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)와 인-프레임으로 융합된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드 서열이 CD16의 C-말단에 융합되거나 또는 CD16의 내부에 위치하는 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 전형적으로, CD16 세포질 도메인의 최대 약 30%가 교체될 수 있다. 이러한 변형은 발현을 증진시키거나 또는 세포독성(예를 들어, ADCC 반응성)을 증진시킬 수 있다. 다른 예에서, 키메라 단백질, 예컨대, Ig-a, Ig-B, CD3-e, CD3-d, DAP-12 및 DAP-10을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다른 림프구 활성화 수용체로부터의 도메인은 CD16 세포질 도메인의 일부로 교체된다.
융합 유전자는 자동 DNA 합성기 및 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이의 상보적 오버행을 일으키는 앵커 프라이머를 사용하는 PCR 증폭을 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다(Ausubel, 2002). 융합 모이어티에 CD16을 인-프레임으로 서브클로닝하는 것을 용이하게 하는 많은 벡터가 상업적으로 입수 가능하다.
시토카인
NK-92® 세포의 세포독성은 시토카인(예를 들어, 인터류킨-2 (IL-2))의 존재에 의존적이다. 상업적 규모의 배양에서 NK-92® 세포를 유지하고 증대시키는 데 필요한, 외인성으로 첨가된 IL-2를 사용하는 비용은 상당하다. NK92 세포의 활성화를 계속하기에 충분한 양으로 IL-2를 인간 대상체에게 투여하는 것은 유해 부작용을 일으킬 것이다.
일 구현예에서, NK-92® 세포는 적어도 하나의 시토카인을 발현하도록 변형된다. 특히, 적어도 하나의 시토카인은 IL-2(SEQ ID NO:6), IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 시토카인은 IL-2, IL-15, 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, IL-2는 내형질 세망에 표적화된 변이체이고, IL-15는 내형질 세망에 표적화된 변이체이다.
일 구현예에서, IL-2는 클로닝되고, IL-2를 내형질 세망(erIL-2)(SEQ ID NO: 7)으로 지시하는 신호 서열과 함께 발현된다. 이는 IL-2를 세포외로 방출하지는 않으면서 자가분비 활성화에 충분한 수준의 IL-2의 발현을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Konstantinidis et al "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92® cells" Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64]을 참조하라. FcR-발현 NK-92® 세포의 지속적인 활성화는, 예를 들어, 자살 유전자의 존재에 의해 방지될 수 있다.
자살 유전자
용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포의 음성 선택을 가능하게 하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 유전자를 발현하는 세포가 선택적 작용제의 도입에 의해 사멸될 수 있게 하는 안전 시스템으로 사용된다. 이는 재조합 유전자가 비제어된 세포 성장을 유도하는 돌연변이를 일으키거나, 세포 자체가 그러한 성장이 가능한 경우에 바람직하다. 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(thymidine kinase: TK) 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 수두-조스터 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 에스케리키아 콜라이 gpt 유전자 및 E. 콜라이 Deo 유전자를 포함하는 다수의 자살 유전자 시스템이 확인되었다. 전형적으로, 자살 유전자는 세포에 질병-효과를 주지 않으나, 특정 화합물의 존재에서 세포를 사멸시킬 단백질에 대하여 인코딩한다. 따라서, 자살 유전자는 전형적으로 시스템의 일부이다.
일 구현예에서, 자살 유전자는 NK-92® 세포에서 활성이다. 일 구현예에서, 자살 유전자는 티미딘 키나제(TK) 유전자이다. TK 유전자는 야생형 또는 돌연변이체 TK 유전자(예를 들어, tk30, tk75, sr39tk)일 수 있다. TK 단백질을 발현하는 세포는 간시클로비르를 사용하여 사멸될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 5-플루오로시토신의 존재에서 세포에 독성인 시토신 데아미나제이다. 문헌[Garcia-Sanchez et al. "Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells: a potential purging method for autologous transplantation." Blood. 1998 Jul 15;92(2):672-82].
또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 이포스파미드, 또는 시클로포스파미드의 존재에서 독성인 시토크롬 P450이다. 예를 들어, 문헌[Touati et al. "A suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response." Curr Gene Ther. 2014;14(3):236-46]을 참조하라.
또 다른 구현예에서, 자살 유전자는 iCas9이다. 문헌[Di Stasi, (2011) "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy." N Engl J Med 365: 1673-1683]. 또한, 문헌[Morgan, "Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic" Molecular Therapy (2012); 20: 11-13]을 참조하라. iCas9는 소분자 AP1903의 존재에서 아폽토시스를 유도한다. AP1903은, 임상 연구에서 내약성 우수한 것으로 밝혀진 생물학적 불활성 소분자로, 입양 세포 요법의 맥락에서 사용되어 왔다.
코돈 최적화
일부 구현예에서, aNK 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 작제물의 서열은 인간계에서 CD19 CAR, CD16, 및/또는 erIL-2의 발현 효율을 최대화하도록 코돈-최적화된다. 코돈 최적화는 전형적으로 네이티브 서열에서 적어도 하나, 하나보다 많은, 또는 상당수의 코돈을 발현 시스템의 유전자에서 더욱 빈번히 또는 가장 빈번히 사용되는 코돈으로 교체하여 핵산 서열을 변형시킴으로써 수행된다. 코돈 최적화는 비-최적화된 서열을 사용하여 생산된 전사물과 비교할 때 요망되는 성질, 예컨대, 더 긴 반감기를 갖는 재조합 RNA 전사물을 생산하기 위해 또는 번역률을 위해 사용될 수 있다. 코돈 최적화를 위한 방법, 예를 들어, Thermo Fisher Scientific(월섬, MA)으로부터의 GeneArt™; http://genomes.urv.es/OPTIMIZER에서 무료로 접근 가능한 최적화기(Optimizer), 및 DNA 2.0으로부터의 GeneGPS 발현 최적화 기법(뉴어크, 캘리포니아)이 용이하게 이용 가능하다. 특정 구현예에서, CD19 CAR에 대한 코딩 서열은 코돈-최적화되고, SEQ ID NO: 9에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다.
전이유전자 발현
전이유전자는 당업자에게 공지된 임의의 메카니즘에 의해 발현 벡터 내로 조작될 수 있다. 다중 전이유전자가 세포 내로 삽입될 경우, 전이유전자는 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 내로 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 발현될 전이유전자 단백질을 인코딩하는 mRNA로 형질감염된다.
전이유전자 및 mRNA는, 비-제한적 예로서, 감염, 전기천공, 리포펙션, 뉴클레오펙션, 또는 "유전자-총"을 포함하여, 당해 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 형질감염 방법을 이용하여 NK-92® 세포로 도입될 수 있다.
CD19 CAR을 발현하는 NK-92® 세포
본 개시는 CD19 CAR 및 FcR을 발현하는 변형된 NK-92® 세포를 제공한다. 선택적으로, 변형된 NK-92® 세포는 추가로 IL-2를 발현한다.
일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 다중-시스트론성 전이유전자를 포함하고, 다중-시스트론성 전이유전자는 키메라 항원 수용체 및 Fc 수용체, 및 선택적으로 IL-2를 인코딩한다.
일부 구현예에서, FcR은 CD16이다. 일부 구현예에서, CD16은 SEQ ID NO:2를 포함하거나 이로 이루어진 고친화성 CD16이다. 일부 구현예에서 IL-2는 SEQ ID NO: 7을 포함하거나 이로 이루어진 erIL-2이다.
일부 구현예에서, CD19 CAR-코딩 서열 및 CD16 CAR-코딩 서열은 동일한 mRNA로부터 인코딩된 등몰 발현 수준의 CD19 CAR 및 CD16을 생산하기 위해 자기-절단 펩티드를 인코딩하는 서열에 의해 분리된다. 자기-절단 펩티드 및 이들의 코딩 서열은, 예를 들어, 문헌[Wang et al., Scientific Reports 5, 논문 번호 16273 (2015)]에 개시된 바와 같이 널리 공지되어 있으며, 이의 관련 개시는 참조로서 본원에 포함된다. 자기-절단 펩티드의 비-제한적 예는 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1 2A(P2A), 토세아 아시그나 바이러스(thosea asigna virus) 2A(T2A), 에퀸 리니티스 A 바이러스(equine rhinitis A virus) 2A(E2A), 세포질 다각체병 바이러스(cytoplasmic polyhedrosis virus)(BmCPV 2A), 및 B. 모리의 무름병 바이러스(flacherie virus)(BmIFV 2A)를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기-절단 펩티드는 SEQ ID NO: 8: ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct에 의해 인코딩된 P2A 펩티드이다.
일부 구현예에서, CD16 코딩 서열 및 erIL-2-코딩 서열은 핵산 서열로부터 번역된 mRNA의 내부 영역으로부터 번역의 개시를 가능하게 하는 내부 리보솜 도입 서열(IRES)에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포는 단일 mRNA로부터 CAR, 고친화성 CD16, 및 erIL-2를 발현하는 삼중시스트론성 작제물을 포함한다. CAR의 통합은 이펙터 세포가 CAR에 의해 인식되는 표적을 발현하는 표적 세포를 특이적으로 결속하고 사멸시키는 것을 가능하게 하고; CD16의 통합은 치료적 단클론성 항체와 조합될 때 ADCC를 가능하게 하고; erIL2는 외인성 IL-2의 부재에서 세포 증대를 가능하게 하고, 전이유전자 발현을 위한 선택적 압력을 유지한다. 한 가지 예시적인 삼중시스트론성 작제물은 도 2에 나타나 있다.
CAR 및 CD16(예를 들어, 고친화성 CD16), 및 erIL-2를 발현하는 변형된 NK-92® 세포를 생산하기 위해, 다중-시스트론성 플라스미드가, 예를 들어, 전기천공에 의해 aNK™ 세포에 도입된다. 형질전환된 NK-92® 세포는 IL-2가 없는 배지에서 성장되며, 개별 클론이 제한 희석 클로닝에 의해 형질전환된 NK-92® 세포로부터 선택되고, 예를 들어, 고수준의 CAR 및 CD16 발현, 세포독성, ADCC, 성장률, 및/또는 IL-2 분비를 포함하는 기준을 기초로 특징화될 수 있다. 적합한 클론은 또한 aNK™ 세포의 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 표면 마커, 예를 들어, CD3, CD16, CD54, CD56, NKG2D, 및/또는 NKp30을 발현할 수 있다. 선택적으로, 전장 게놈 시퀀싱(whole genome sequencing: WGS)은 전이유전자 통합 부위를 결정하기 위해 수행된다. 이러한 기준들 중 하나 이상을 충족시키는 클론이 추가 개발을 위해 선택되고, 클리닉에서 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
발현
IL-2의 발현은 IL-2 비함유 조건에서 변형된 NK-92® 세포의 능력에 의해 확인될 수 있다. CAR 및 CD16의 발현은 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. CD19 CAR, CD16, 및 IL-2(예를 들어, erIL-2)의 코딩 서열을 포함하는 삼중시스트론성 작제물로 형질전환된 NK-92® 세포의 경우, 전형적으로 IL-2-비함유 조건을 성장시킬 수 있는 형질전환된 세포 중 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%는 또한 높은 발현 수준의 CAR과 CD16 둘 모두를 나타낸다.
선택적으로, 형질전환된 NK-92® 세포의 IL-2 분비 수준은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, ELISA에 의해 다양한 시점에 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 상청액에서의 IL-2 수준은 세포 배양 배지에 방출된 IL-2의 수준을 결정하기 위해 측정된다. 일부 구현예에서, 세포 펠렛에서 IL-2 수준은 IL-2의 총 세포내 수준을 평가하기 위해 측정된다. 일부 구현예에서, 상청액에서의 IL-2 양과 세포 펠렛에서의 IL-2 양 둘 모두는 형질전환된 NK-92® 세포에 의해 생산된 IL-2의 총량을 결정하기 위해 측정된다.
선택적으로, 형질전환된 NK-92® 세포의 다른 표면 마커는 유세포 분석에 의해 측정될 수 있다. 이들 마커는 CD54, CD56, NKG2D, NKp30, 및 CD3를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 적합한 클론은 동일한 성장 조건 하에 aNK™ 세포에 대해 이러한 마커와 실질적으로 유사한 발현 수준을 보인 것들이다.
세포독성
선택적으로, 삼중시스트론성 플라스미드로 형질전환된 NK-92® 세포의 세포독성은 유세포 분석-기반 세포독성 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 이펙터 세포(NK-92® 세포) 및 형광단-표지된 표적 세포, 예를 들어, 종양 세포는 상이한 이펙터 대 표적 비로 혼합된다. 프로피듐 아이오다이드(PI)가 세포에 첨가될 수 있고, 샘플은 유세포 분석기로 분석될 수 있다. 바람직하게는, 표적 세포를 표지하는 데 사용되는 형광단은 유세포 분석기에서의 PI와 구별될 수 있다. 일부 구현예에서, 형광단은 CFSE이다. 일부 구현예에서, 형광단은 PKHGL67이다. 세포독성은 형광단-양성 표적 집단 내 PI-양성 세포의 %에 의해 결정될 수 있다.
선택적으로, 삼중시스트론성 플라스미드로 형질전환된 NK-92® 세포의 세포독성은 또한 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 시험될 수 있다. NK-92® 세포의 세포독성은 이들의 직접 세포독성 또는 ADCC 활성에 의해 반영될 수 있다. 생산된 NK-92® 세포의 직접 세포독성, 비정상 세포, 예컨대, 종양 세포를 표적화하고 사멸시키는 능력은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어, Klingemann 등의 문헌[Cancer Immunol. Immunother. 33:395-397 (1991)]에 기재된 절차를 이용하여 51Cr 방출 검정(Gong 등의 문헌[Leukemia, Apr; 8(4): 652-8 (1994)])에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 t-haNK™ 세포의 표면 상에 발현된 CAR에 의해 인식될 수 있는 항원을 발현한다. 간략히, 51Cr-표지된 표적 세포는 NK-92® 세포와 혼합되고, 용해된다. 특이적 세포독성의 백분율은 방출된 51Cr의 양을 기초로 계산될 수 있다. 특허 공개 제US20020068044호를 참조하라.
대안적으로, 생산된 NK-92® 세포의 직접 세포독성은 또한 칼세인 방출 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, NK-92® 세포(검정에서 이펙터로 지칭됨)는 칼세인 담지 표적 세포(검정에서 표적으로 지칭됨)와 특정 비율로 혼합될 수 있다. 소정의 기간 동안 인큐베이션 후, 표적 세포로부터 방출된 칼세인은, 예를 들어, 형광 플레이트 리더에 의해 평가될 수 있다.
각 검정에서 사용되는 이펙터 및 표적의 비는 다를 수 있고, 선택적으로 이펙터:표적 비는 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 또는 5:1일 수 있고; 바람직하게는 이펙터:표적 비는 10:1이다. 표적 세포는 NK-92® 세포(t-haNK™ 세포) 상에서 CAR에 의해 인식될 수 있는 항원 분자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, SUP-B15 세포는 CD19 CAR 및 CD19 t-haNK™ 세포에 대한 표적 세포에 의해 인식될 수 있다. NK-92® 세포의 세포독성의 값은 사용되는 표적 세포의 유형뿐만 아니라 이펙터:표적 비에 따라 다를 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생산된 NK-92® 세포는 60% 내지 100%, 예를 들어, 70% 내지 100% 또는 80% 내지 100%의 세포독성을 가질 수 있다. 일부 경우에, NK-92® 세포는 1:10의 이펙터:표적 비를 이용할 때 칼세인 방출 검정에 의해 80% 내지 100%, 예를 들어, 82% 내지 100%, 85% 내지 100%, 87% 내지 100%, 88% 내지 100%, 또는 89% 내지 100%의 세포독성을 가질 수 있다.
선택적으로, 평가되는 NK-92® 세포, 예를 들어, t-haNK™ 세포의 세포독성은 항체 의존적 세포독성(ADCC)이다. NK-92® 세포의 ADCC 활성을 측정하기 위한 방법은 표적 세포를 인식할 수 있는 항체가 또한 첨가된다는 점을 제외하고 상술된 바와 같은 직접 세포독성을 측정하는 방법과 유사하다. NK 세포의 Fc 수용체는 세포-결합 항체를 인식하고, 세포용해 반응을 촉발하여 표적 세포를 사멸시킨다. 한 가지 예시적인 예에서, t-haNK™ 세포는 헤르셉틴(항-Her2 항체) 및 SKBr3(표적 세포)와 인큐베이션될 수 있고, SKBr3 세포의 사멸은, 상술된 바와 같이, 표적 세포의 내부 성분, 예를 들어, 51Cr 또는 칼세인의 방출에 의해, 또는 표적 세포의 PI 염색에 의해 측정될 수 있다.
배가 시간
NK-92® 세포, 예를 들어, t-haNK™ 세포의 성장률은 세포 배가 시간, 즉, 세포가 초기 세포 수의 두 배에 이르도록 증식하는 데 소요되는 시간을 이용하여 평가될 수 있다. 배가 시간은 NK-92® 세포의 성장률과 역관련되는데; 배가 시간이 길수록 성장률이 낮아진다.
WGS
선택적으로, 형질전환된 NK-92® 세포의 전장 게놈 시퀀싱(WGS)은 다중-시스트론성 작제물의 삽입 부위를 확인하기 위해 수행된다.
치료 용도
본 개시는 또한 질병의 임의의 병기에 대상체에서 임의 유형의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 적합한 암의 비-제한적 예는 암종, 흑색종, 또는 육종을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 백혈병 또는 림프종과 같은 조혈 기원의 암을 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 대상체에서 임의 유형의 암을 치료하는 방법은 치료적 유효량의 상술된 바와 같은 NK-92® 세포를 환자에게 투여하고, 이에 의해 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 SEQ ID NO:2에 기재된 서열을 갖는 Fc 수용체, 예를 들어, 고친화성 Fc 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 CD19 CAR, Fc 수용체 및 IL-2를 발현한다. 일부 구현예에서, 변형된 NK-92® 세포는 다중-시스트론성 작제물을 포함하고, 여기서 다중-시스트론성 작제물은 키메라 항원 수용체 및 Fc 수용체를 인코딩한다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 NK-92® 세포로 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 대상체 또는 환자는 암 또는 감염성 질병, 예컨대, 바이러스 감염을 앓고 있다.
변형된 NK-92® 세포는 개체에게 세포의 절대적인 수만큼 투여될 수 있고, 예를 들어, 상기 개체는 약 1000개의 세포/주사 내지 최대 약 100억 개의 세포/주사, 예컨대 주사당 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 5×103개 (등)의 NK-92® 세포, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 복수의 NK-92® 세포를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 세포수는 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 또는 5×103개 (등)이다.
다른 구현예에서, 상기 개체는 약 1000개의 세포/주사/m2 내지 최대 약 100억 개의 세포/주사/m2, 예컨대, 주사 당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1×108개/m2, 1×107개/m2, 5×107개/m2, 1×106개/m2, 5×106개/m2, 1×105개/m2, 5×105개/m2, 1×104개/m2, 5×104개/m2, 1×103개/m2, 5×103개/m2 (등)의 NK-92® 세포, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, NK-92® 세포는 이러한 개체에게 세포의 상대적인 수만큼 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램당 약 1000개의 세포 내지 최대 약 100억 개의 세포, 예컨대, 개체의 킬로그램당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 또는 5×103개 (등)의 NK-92®, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 총 용량은 m2 당 약 1×1011개, 1×1010개, 1×109개, 1×108개, 1×107개, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위를 포함하여, 체표면적 m2에 의해 계산될 수 있다. 평균 사람은 약 1.6 m2 내지 약 1.8 m2이다. 바람직한 구현예에서, 약 10억 개 내지 약 30억 개의 NK-92® 세포가 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 용량당 주사되는 NK-92® 세포의 양은 m2 당 1×1011개, 1×1010개, 1×109개, 1×108개, 1×107개를 포함하여 체표면적 m2에 의해 계산될 수 있다. 사람에 대한 평균 체표면적은 1.6 m2 내지 1.8 m2이다.
다른 구현예에서, NK-92® 세포는 이러한 개체에게 세포의 상대적인 수만큼 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램당 약 1000개의 세포 내지 최대 약 100억 개의 세포, 예컨대, 개체의 킬로그램당 약, 적어도 약, 또는 최대 약, 1×108개, 1×107개, 5×107개, 1×106개, 5×106개, 1×105개, 5×105개, 1×104개, 5×104개, 1×103개, 또는 5×103개 (등)의 NK-92®, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
NK-92® 세포는 암을 갖는 환자에게 1 회 투여될 수 있거나, 이들은 다수회, 예를 들어, 요법 동안 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간 또는 23시간마다 1회, 또는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일마다 1회, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 또는 그 초과의 주마다 1회, 또는 종점을 포함하여 임의의 2개의 수 사이의 임의의 범위로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포는 NK-92® 세포 및 매질, 예컨대, 인간 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 조성물을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 매질은 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 인간 혈장을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 약 1% 내지 약 15% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 약 1% 내지 약 10% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, 매질은 약 1% 내지 약 5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 매질은 약 2.5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청은 인간 AB 혈청이다. 일부 구현예에서, 인간 치료에서 사용하는 데 허용 가능한 혈청 대체물이 인간 혈청 대신에 사용된다. 이러한 혈청 대체물은 당해 기술 분야에 공지되어 있을 수 있거나, 또는 추후 개발될 수 있다. 15% 초과의 인간 혈청의 농도가 사용될 수 있지만, 약 5% 초과의 농도가 비용-제한적일 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 NK-92® 세포 및 세포 생존율을 보조하는 등장성 액체 용액을 포함하는 조성물을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 동결보존된 샘플로부터 재구성된 조성물을 통해 투여된다.
NK-92® 세포를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물은 다양한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이고 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 적합한 담체 및 부형제 및 이의 제형은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B Troy, ed, Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용되는 담체란 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 즉, 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 또는 이를 함유한 약제학적 조성물의 다른 구성성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 대상체에게 투여된다. 대상체에게 투여되는 경우에, 담체는 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체에서 유해 부작용을 최소화하도록 선택적으로 채택된다. 본원에 사용된 용어 약제학적으로 허용되는은 생리학적으로 허용되는 및 약리학적으로 허용되는과 동의어로 사용된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 저장 시 완충 및 보존을 위한 작용제를 포함할 것이고, 투여 경로에 따라, 적절한 전달을 위한 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.
생체내 또는 시험관내에서 사용하기 위한 이들 조성물은 세포에 대해 사용되는 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 가까워지도록 필요에 따라 허용 가능한 보조 물질, 예컨대, pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 및/또는 다른 작용제 중 세포의 농도는 달라질 수 있고, 선택된 특정한 투여 방식 및 대상체의 요구에 따라, 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다.
일 구현예에서, NK-92® 세포는 치료되는 암에 대한 하나 이상의 다른 치료 또는 작용제와 함께 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 치료되는 암에 대한 하나 이상의 다른 치료는, 예를 들어, 항체, 방사선, 화학요법제, 줄기 세포 이식, 또는 호르몬 요법을 포함한다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포 및 기타 암 제제/치료는 동시에 또는 거의 동시에(예를 들어, 서로 약 1분, 5분, 10분, 15분, 20분, 또는 30분 이내) 투여된다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포 및 기타 암 제제/치료는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 다른 암 치료/제제는 NK-92® 세포의 투여 1일, 2일, 또는 3일 후에 투여된다.
일 구현예에서, 다른 암 제제는 항체이다. 일 구현예에서, NK-92® 세포는 질병이 있는 세포를 표적화하는 항체와 함께 투여된다. 일 구현예에서, NK-92® 세포 및 항체는 환자에게 함께, 예를 들어, 동일한 제형에서; 별개로, 예를 들어, 별개의 제형에서, 동시에 투여되거나; 별개로, 예를 들어, 상이한 투약 계획 또는 상이한 날짜 시점에 투여될 수 있다. 별개로 투여될 때, 항체는 임의의 적합한 경로, 예컨대, 정맥내 또는 종양내 주사를 통해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 NK-92® 세포는 치료 항체 및/또는 다른 항암제와 조합하여 사용된다. 치료 항체는 암-관련 또는 종양-관련 마커를 발현하는 세포를 표적화하는 데 사용된다. 암 치료 단클론성 항체의 예는 표 4에 나타나 있다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 SEQ ID NO:2에 기재된 서열을 갖는 Fc 수용체, 예를 들어, 고친화성 Fc 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 haNK® 세포이다. 일 구현예에서, 치료 항체는 아벨루맙이다.
[표 3]
예시적인 치료 단클론성 항체
이러한 NK-92® 세포의 투여는 단클론성 항체의 투여와 동시에, 또는 순차적인 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 대상체가 단클론성 항체로 치료된 후에 대상체에게 투여된다. 대안적으로, NK-92® 세포는 단클론성 항체와 동시에, 예를 들어, 이의 24시간 이내에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, NK-92® 세포는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 골수 내로 직접 주입될 수 있다.
따라서, 본 개시는 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 것을 필요로 하는 환자에서 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법으로서, 방법은 치료적 유효량의 본원에 개시된 NK-92® 세포를 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
키트
또한, 본원에 기재된 바와 같은 복수의 NK-92® 세포를 포함하는 조성물을 사용하여 암 또는 감염성 질병의 치료를 위한 키트가 개시된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키트는 또한 적어도 하나의 단클론성 항체를 포함할 수 있다. 키트에 포함되는 NK-92® 세포는 CAR 및 Fc 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 추가로 IL-2, 예를 들어, erIL-2, 또는 IL-15, 예를 들어, erIL-15를 발현한다. 일부 구현예에서, NK-92® 세포는 다중-시스트론성 작제물을 포함하고, 여기서 다중-시스트론성 작제물은 키메라 항원 수용체, Fc 수용체, 및 선택적으로 IL-2 또는 IL-15를 인코딩한다.
특정 구현예에서, 키트는 NK-92® 세포의 투여 전에, 이와 동시에 또는 그 후에 투여될 추가적인 화합물, 예컨대, 치료 활성 화합물 또는 약물을 함유할 수 있다. 이러한 화합물의 예는 항체, 비타민, 미네랄, 플루드로코르티손, 이부프로펜, 리도카인, 퀴니딘, 화학요법제 등을 포함한다.
다양한 구현예에서, 키트의 사용에 대한 설명서는 암 또는 감염성 질병의 치료에서 키트 구성성분을 사용하는 것에 대한 지시사항을 포함할 것이다. 설명서는 NK-92® 세포의 취급 방법(예를 들어, 해동 및/또는 배양)에 관한 정보를 추가로 함유할 수 있다. 설명서는 투여량 및 투여 빈도에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 키트는 추가로 본원에 기재된 하나 이상의 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 NK-92® 세포를 포함하는 조성물로 충전된 하나 이상의 내용물을 포함한다. 선택적으로, 본원에 기재된 것들과 같이 키트가 암 치료용임을 지시하는 라벨이 그러한 내용물과 관련될 수 있다. 선택적으로, 라벨은 또한 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형식의 고지를 포함하며, 이러한 고지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다.
개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이를 위한 제조에서 사용될 수 있거나, 이의 산물인 물질, 조성물, 및 구성성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질이 본원에서 개시되고, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되는 경우에 각각의 다양한 개별적 및 포괄적 조합의 구체적 참조 및 이들 화합물의 순열은 명백히 개시되지 않을 수 있으나, 각각 본원에 구체적으로 고려되고 기재되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되고 그러한 방법을 포함하여 다수의 분자에 대해 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우에, 방법의 각각 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형이 달리 구체적으로 반대로 지시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합이 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 본 개시의 모든 측면에 적용된다. 이에 따라, 수행될 수 있는 다양한 추가적인 단계가 존재하는 경우에, 각각의 이들 추가적인 단계가 개시된 방법의 임의의 구체적 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합 또는 조합의 하위세트가 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 제한으로 해석되어서는 안 된다. 유사하게 하기 실시예를 성공적으로 수행할 수 있게 하는 당업자가 이용 가능할 다양한 대체 기술 및 절차가 존재한다.
실시예 1: CD19 CAR 변형된 NK-92® 세포의 생산
CD19 CAR을 CD16 및 erIL-2 전이유전자를 또한 함유한 삼중시스트론성 플라스미드 pNEUKv1 FcR_IL-2 벡터에 클로닝시켰다. 삼중시스트론성 플라스미드를 aNK™ 세포로 전기천공하였다. CD19 CAR-발현 NK-92® 세포가 IL-2-고갈 배지에 의해 선택되었는데, 그 이유는 IL-2 의존성인 형질전환되지 않은 aNK 세포가 IL-2 고갈 배지에서 생존할 수 없기 때문이다.
제한 희석 클로닝
분취량의 다클론성 CD19 t-haNK™ 풀 배양물을 IL-2 보충이 없는 성장 배지에 3개 세포/ml의 밀도로 희석하였다. 이러한 세포 현탁액을 평균적으로 웰당 0.6 개 세포에 상응하는 웰당 200 μl의 부피로 96-웰 플레이트에 분취하였다. 플레이트를 37℃에서 10일 동안 인큐베이션한 후, 세포 성장을 육안으로 확인하였다. 이제 클론으로 명명된 총 20개의 배양물을 고르고, 더 큰 용기로 옮기고, 이들의 초기 성장 속도에 따라 번호를 매겼으며, 클론 # 1 내지 클론 # 10을 먼저 계대시켰다.
실시예 2. 생물분석 방법
세포 배양:
다클론성 및 클론성 CD19 t-haNK™ 세포를 IL-2 없이 5% 열불활성화된 인간 AB 혈청(CMV-음성 검사된 공영자로부터의)이 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
aNK 세포를 5% 열불활성화된 인간 AB 혈청(CMV-음성 검사된 공여자로부터의) 및 500 IU/ml의 재조합 인간 IL-2가 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
haNK 세포를 IL-2 없이 5% 열불활성화된 인간 AB 혈청(CMV-음성 검사된 공여자로부터의)가 보충된 성장 배지에서 배양하였다.
K562 세포를 10% 열불활성화된 소 태아 혈청 및 항생제/항진균제의 혼합제가 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. K562 세포를 2일 내지 5일마다, 또는 배양 배지가 황색으로 보일 때마다 계대시켰다.
SUP-B15 및 SUP-B15CD19KO/CD20+ 세포를 20% 열불활성화된 소 태아 혈청, 55 uM의 베타-머캅토에탄올, 및 항생제/항진균제의 혼합제가 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 그 외의 경우에는 세포를 상기 K562 세포로서 계대시켰다.
유세포 분석을 위한 항체 염색:
세포를 원심분리에 의해 채취하고, FACS 완충액(1X D-PBS 중 5% FBS)에서 2회 세척하고, 1 ml의 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 표면 단백질의 직접 형광단-접합 항체 염색을 위해, 세포를 적절한 접합 항체(또는 이소형 대조군)와 함께 20분 동안 4℃에서 암흑 하에 인큐베이션한 후, FACS 완충액으로 2회 세척하였다. CAR 단백질의 검출을 위해, 세포를 비오틴화된 항 F(ab')2 단편 항체와 인큐베이션하고, 이어서 스트렙타비딘-APC 항체와 인큐베이션하였다. 샘플을 MACSQuant 유세포 분석기에서 분석하였다.
성장 검정:
5% 열불활성화된 인간 AB 혈청이 보충된 성장 배지에 재현탁된 1 × 105개 세포/mL의 초기 농도에서부터(1 일째), 배양물을 자동 세포 계수기에 의해 3일째, 5일째, 및 7일째에 계수하였다. 성장률을 하기 식에 의해 계산하였다:
배가 시간(시) =
[기간(시) × log(2)] / [log(최종 세포 밀도) - log(초기 세포 밀도)]
세포독성:
현탁-성장 세포주를 세포 배양물의 위아래 피펫팅에 의해 재현탁시켰다. 세포 생존율을 자동 계수(트리판 블루 배제 방법)에 의해 결정하였다. 표적 세포를 CFSE 염료로 표지하고, 10% 열불활성화된 FBS 및 항생제/항진균제가 보충된 RPMI-1640에서 필요한 세포 농도로 표적 및 이펙터 세포의 희석을 수행하였다. 이펙터 및 표적 세포를 96-웰 플레이트에서 상이한 이펙터 대 표적(20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1, 0.62:1, 0.31:1, 및 0.15:1의 E:T) 비로 혼합하고, 5% CO2 대기 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 함께 인큐베이션하였다. PI를 이후 죽은 세포의 형광단 표지를 위해 첨가하고, 검정을 MACSquant 유세포 분석 장치에서 분석하였다.
ADCC:
현탁-성장 세포주를 세포 배양물의 위아래 피펫팅에 의해 재현탁시켰다. 세포 생존율을 자동 계수(트리판 블루 배제 방법)에 의해 결정하였다. 표적 세포를 PKH67-GL 염료로 표지하고, 10% 열불활성화된 FBS 및 항생제/항진균제가 보충된 RPMI-1640에서 필요한 세포 농도로 표적 및 이펙터 세포의 희석을 수행하였다. 표적 세포를 단클론성 항체 트라스투주맙, 리툭시맙과, 또는 항체 부재 하에 R.T.에서 30분 동안 예비-인큐베이션하였다. 항체-표지된 표적 세포(및 항체-부재 대조군)를 이후 이펙터 세포와 96-웰 플레이트에서 상이한 이펙터 대 표적 비(20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1, 0.62:1, 0.31:1, 및 0.15:1의 E:T)로 혼합하고, 5% CO2 대기 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 함께 인큐베이션하였다. PI를 이후 죽은 세포의 형광단 표지를 위해 첨가하고, 검정을 MACSquant 유세포 분석 장치에서 분석하였다.
IL-2의 정량화
분석을 위한 세포를 D-PBS 1x에서 세척하여 잔여 배지를 제거하고, 신선한 성장 배지에 재현탁시키고, 각각 105개 세포/웰(= 200 μl/웰)의 밀도로 두 개의 96-웰 플레이트에 삼중으로 분취하고, 플레이트를 37℃에서 5% CO2 가습 인큐베이터에 인큐베이션하였다. 24시간의 인큐베이션 후 분석을 위해 한 세트의 플레이트를 취하고, 다른 것은 48시간에 취하였다. 세포를 제거하는 500 x g에서 5분 동안의 첫 번째 원심분리 단계, 그리고 이어서 세포 잔해를 제거하는 2000 x g에서 5분 동안의 두 번째 원심분리 단계에 의해 분석을 위한 샘플 상청액을 제조하였다. 샘플 상청액을 분석까지 -80℃에서 동결시켰다. 500 x g 원심분리 단계로부터의 세포 펠렛을 재현탁시키고, 삼중으로 풀링시키고, 세포 밀도를 기록하였다. 샘플 상청액에서 IL-2의 농도를 제조업체의 지시에 따라 ThermoFisher Scientific(월섬, MA)으로부터 입수 가능한 인간 IL-2 ELISA 검출 키트를 사용하여 측정하고, 제공된 표준과 비교하였다. IL-2 농도를 24시간 및 48시간에 세포 수로 표준화시키고, pg/ml/105개 세포로 표현하였다.
실시예 3:
변형된 NK-92® 세포의 표현형
CD19 t-haNK™ 세포에서 CD19 CAR의 발현을 유세포 분석에 의해 측정하였고, 결과는 CD19 t-haNK™ 세포가 IL-2의 부재에서 성장할 수 있었고, 80%가 넘는 세포가 CD16(도 3a)와 CAR(도 3b) 둘 모두를 고수준으로 발현한다는 것을 보여주었다.
별개의 실험에서, 20개의 선택된 클론을 유세포 분석에 의해 CD19CAR(비오틴화된 F(ab')2 단편 특이적 일차 항체 및 스트렙타비딘-APC 이차 항체에 의해 검출) 및 CD16(3G8 단클론성 항체에 의해 검출)의 표면 발현에 대하여 스크리닝하였다. 다중 양성 집단, CD16에 대한 낮은 염색 강도, 또는 높은 배경 발현을 나타낸 클론은 폐기하였다.
[표 4]
CD19 t-haNK™ 클론에 대한 CD19CAR 및 CD16의 발현의 비율 및 강도 결정
선택된 CD19 t-haNK™ 클론에서 6개의 NK-세포 마커의 발현 프로파일을 항체 염색 및 유세포 분석에 의해 결정하고, aNK와 비교하였다. CD3 발현에 대해 모든 클론 및 aNK이 음성인 반면, CD16 발현에 대해서는 aNK만이 음성이었다. 모든 클론은 CD54, CD56, NKp30, 및 NKG2D의 발현에 대해 양성이었고, 이들의 발현 수준은 aNK 대조군과 유사했다.
[표 5]
CD19 t-haNK™ 클론에 대한 NK 세포 표면 마커의 발현의 비율 및 강도 결정
실시예 4:
표적 세포주에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 세포독성
CD19 t-haNK™ 세포의 세포독성을 표적 세포 K562 세포, SUP-B15 세포, 및 SKBr 세포와 인큐베이션함으로써 분석하였다. 도 4a는 CD19 t-haNK™ 세포가 K562 세포(표적 세포)를 사멸시키는 데 있어서 모 aNK 세포에 필적 가능한 세포독성을 유지했다는 것을 나타낸다. 16B1 및 18B1은 다른 날에 실시된 두 개의 전기천공 경우로부터 얻어진 두 개의 CD19 t-haNK™ 집단이다.
별개의 실험에서, 선택된 CD19 t-haNK™ 클론을 K562 표적 세포주(CD19-, NK-민감)에 대항하는 유세포 분석-기반 시험관내 세포독성 검정에서 이펙터로서 사용하였다. 모든 클론은 4시간 세포독성 검정에서 K562에 대항하는 효율적인 세포용해 활성을 나타냈다. NK 대조군의 경우의 84.1%±2.4%에 비해, CD19 t-haNK™ 클론에 대한 평균 최대 사멸 효율은 10:1 비에서 70.9%±10.1% 내지 84.4%±0.6%였다(n=2 내지 5). 도 4b를 참조하라.
도 5a는 CD19 t-haNK™ 세포가 aNK™ 내성의 CD19-양성 SUP-B15 세포주의 향상된 특이적 사멸을 보였다는 것을 나타낸다(10의 표적에 대한 이펙터 비율로 aNK 세포에 의해 세포의 단지 약 10% 내지 20%만이 사멸된 것에 비해, CD19 t-haNK™ 세포에 의해 세포의 약 80%내지 90%가 사멸됨).
별개의 실험에서, 선택된 CD19 t-haNK™ 클론을 SUP-B15 표적 세포주(CD19+, NK-내성)에 대항하는 유세포 분석-기반 시험관내 세포독성 검정에서 이펙터로서 사용하였다. 모든 클론은 4시간 세포독성 검정에서 내성 SUP-B15를 효율적으로 표적화하고 사멸시킬 수 있었다. NK 대조군의 경우의 10.8%±7.4%에 비해, CD19 t-haNK™ 클론에 대한 평균 최대 사멸 효율은 10:1 비에서 85.7%±0.1% 내지 92.2%±1.2%였다(n=2 내지 5). 도 5b를 참조하라.
도 6a는 SKBr3 세포(CD19-, Her2/neu+)에 대한 CD19 t-haNK™ 세포의 ADCC 활성이, 항-Her2/neu 항체 헤르셉틴과 조합될 때, CD16(158V) 수용체만을 발현하는 haNK® 세포에 필적 가능했다는 것을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 선택된 CD19 t-haNK™ 클론을, 항-CD20 리툭시맙 단클론성 항체와 또는 항-Her2-neu 트라스투주맙 단클론성 항체와 조합하여, 변형된 SUP-B15 표적 세포주(CD19-, CD20+, Her2-neu-, NK-내성)에 대항하는 유세포 분석-기반 시험관내 ADCC 검정에서 이펙터로서 사용하였다. 4시간 세포독성 검정에서, 모든 클론은, 항-CD20 항체 리툭시맙과 조합될 때, 내성 SUP-B15CD19KO/CD20+를 효율적으로 표적화하고 사멸시킬 수 있었다. haNK® 대조군의 경우의 67.1%에 비해, CD19 t-haNK™ 클론에 대한 평균 사멸 효율은 10:1 비에서 63.7% 내지 77.8%였다(n=1 내지 2). haNK®이나 CD19 t-haNK™ 클론 어느 것도, 항-Her2/neu 대조군 항체 트라스투주맙과 조합될 때, 표적 SUP-B15CD19KO/CD20+ 세포를 사멸시킬 수 없었다(CD19 t-haNK™ 클론의 경우 10:1 비에서 7.7% 내지 21.9%의 최대 사멸 효율, 및 haNK®의 경우 4.1%). haNK® 대조군의 경우의 62.7%에 비해, CD19 t-haNK™ 클론에 대한 ADCC-매개된 사멸은 10:1 비에서 46.4% 내지 65.2%였다. 도 6b를 참조하라.
실시예 5:
CD19 t-haNK™ 세포의 기타 성질
선택된 CD19 t-haNK™ 클론의 집단 배가 시간을 배지 변화 없이 7 일에 걸쳐 세포 성장 분석에 의해 결정하고, 평균 배가 시간을 계산하였다. aNK® 대조군의 경우의 34.5시간에 비해, 모든 클론은 33.1시간 내지 54.5시간 범위의 집단 배가 시간을 가졌다. 도 7을 참조하라.
CD19 t-haNK™ 클론을 IL-2 없이 10e5개 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트에서 배양물에 넣고, 24시간 및 48시간 후에 배양 상청액을 채취하였다. CD19 t-haNK™ 세포에 의한 ERIL-2의 잠재적 방출을 검출하고 측정하기 위해 상청액을 ELISA에 의해 분석하였다. 24시간의 배양 시, CD19 t-haNK™ 클론이 16.1 내지 1278.5 pg/ml/105개 세포로 방출되었다. 도 8을 참조하라.
실시예 6: CD19 t-haNK™: NSG 마우스에서 Raji 인간 버킷 림프종의 정맥내 및 피하 모델에서 CD19-표적화 t-haNK™ 세포의 항-종양 활성 평가
CD19 t-haNK™은 B-세포 계통의 혈액암을 치료하기 위해 CD19에 대항하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해 세포이다. 본 연구에서, CD19 t-haNK™의 반복된 정맥내(IV) 투여의 항-종양 효과를 NSG 마우스에서 IV와 피하(SC) 둘 모두의 Raji 이종이식 모델에서 평가하였다. 둘 모두의 모델에서, CD19 t-haNK™ 세포는 유의한 치료 효능을 보였다. 특히, IV 종양 모델에서, CD19 t-haNK™ 세포는 비히클 대조군에 비해 동물 생존을 유의하게 개선하였다. SC 종양 모델에서, CD19 t-haNK™는 유의하게 종양 성장을 억제하고, 동물 이환/사망 사례를 감소시키고, 간에서 전이성 질병 부담을 현저히 감소시킬 수 있었다.
이전에, CD19에 대항하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 표적화된 aNK 세포는, 가장 가능성 있게는 CAR-발현 세포에서 표적-특이적 세포 독성으로 인해, Raji 종양-보유 NSG 마우스에서 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 문헌[Oelsner et al, Cytotherapy, 2017] 참조). 이 연구에서, CD19 t-haNK™ 세포의 효능을 Raji 이종이식 모델에서 두 가지 상이한 변형예로 평가하였다: 1) 정맥내(IV) 접종된 Raji 세포; 및 2) 피하(SC) 접종된 Raji 종양, 둘 모두의 모델은 반복된 IV 용량의 CD19 t-haNK™ 세포를 받았다. 추가 동물 그룹(그룹 B 및 그룹 E)이 또한 이 모델에서 평가하고자 하는 원래의 연구 프로토콜에 포함되었지만, CD19 t-haNK™ 효능 결정과 관련성이 없기 때문에 이 보고에는 포함되지 않는다는 점을 주지하라(축약된 실험 설계에 대하여 표 6 참조).
실시예 7: CD19 t-haNK™ 연구를 위한 물질
CD19 t-haNK™ 세포(클론 19.6): CD19 t-haNK™ 세포를 Process Development, NantKwest®, Inc.(토레이 파인스)에 의해 제공된 프로토콜을 따름으로써 5% 열불활성화된 인간 AB 혈청이 보충된 성장 배지에 배양하였다.
시험 동물: 이용된 시험 동물은 연구 개시 시(검역 후) 9 내지 10주령이고, 연구 개시 시 체중이 20 그램 내지 27 그램인 암컷 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ(NSG) 마우스였다. 20 마리의 동물은 IV 종양 모델을 위한 것인 반면, 12 마리는 SC 종양 모델을 위한 것이었다. 동물의 공급업체는 The Jackson Laboratory(610 Main Street Bar Harbor, ME 04609 US)였다. 식별을 위해 휴대용 어플리케이터로 멸균 스테인리스 강 이어 태그를 각 마우스에 적용하였다. 또한, 각 케이지에는 연구 번호와 동물 번호 정보가 함유된 케이지 카드가 있었다.
Raji 암 세포주: Raji 세포는 원래 ATCC(카탈로그# CCL-86TM; 로트# 61723871)에서 구입된 후, Preclinical Development, NantKwest®, Inc.에서 증대되고 제조되었다. 세포는 2018년 3월 18일에 IDEXX에 의해 인증되었다(인증 보고에 대하여 부록 2 참조). 세포 배양 배지는 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL)과 10% 소 태아 혈청이 보충된 ATCC-제형화된 RPMI-1640 배지였다. 지수기에서 Raji 세포(계대 12)를 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 세척하고, IV 접종을 위해 5 × 105개 생존 세포/mL의 농도로 무혈청 배지에, 및 SC 이식을 위해 2.5 × 106개 생존 세포/mL 농도에서 배지/매트리겔(1 : 1 v/v)에 재현탁시켰다. 세포를 동물 주사 전 얼음 위에 저장하였다. 생체내 연구에 사용된 세포는 96%의 생존율을 가졌다.
Raji IV 모델: 20 마리의 동물에게 27-게이지 바늘(1 × 105개 세포 접종원)로 0.2 mL의 Raji 세포 현탁액을 측면 꼬리 정맥을 통해 IV로 주사하였다.
Raji SC 모델: 12 마리 동물에게 25-게이지 바늘(2.5 × 105개 세포 접종원)로 0.1 mL의 Raji 세포 현탁액을 양쪽 옆구리 위에 SC로 이식하였다.
실시예 8: CD19 t-haNK™ 연구를 위한 실험 절차
IV Raji 모델: 1 일째로 규정한 암 세포 접종 후 24시간 이내에, 그룹 간에 유사한 평균 체중이 달성되도록 20 마리의 동물들을 체중에 따라 10 마리의 두 그룹으로 의사-무작위화시켰다. 2일째, 5일째, 8일째, 10일째, 12일째 및 17일째에, 지수기에서 성장된 CD19 t-haNK™ 세포를 원심분리에 의해 채취하고, 200 μL의 주사 부피로 마우스 당 1 × 107개 세포의 용량으로 IV 투여를 위해 5 × 107개 세포/mL의 농도로 성장 배지에서 제형화하였다. 표 6에 나타나 있는 바와 같이, 그룹 A의 동물들은 비히클 대조군을 받은 반면, 그룹 C의 동물들은 CD19 t-haNK™ 세포를 받았다.
종양 세포 주사 전에 주 2회 동물들의 체중을 쟀다. 동물들을 사망/이환(G0 내지 G4) 및 독성의 임상 징후(T1 내지 T12, 표 6 참조)에 대하여 매일 관찰하였다. 마비 또는 빈사 상태의 동물들은 안락사시켰다. 동물들을 CO2 흡입 그리고 이어서 자궁경부 탈구로 안락사시켰다. 사망 사례(안락사 또는 자연사)는 데스 로그(Death Log)에 기록하고, 생존 곡선을 계산하기 위해 집계하였다.
SC Raji 모델: SC 종양 이식 후, 동물들을 종양 확립을 위해 적어도 주 2회 검사하였다. 종양이 명료한 경우, 디지털 휴대용 캘리퍼로 주 1회 내지 2회 종양 부피(TV)를 측정하고, 다음 식을 이용하여 계산하였다: TV = 길이 × 너비2 / 2[길이는 종양의 가장 큰 직경이고, 너비는 가장 짧은 직경임]. 평균 종양 부피가 주사 가능한 크기(이러한 경우, 195 mm3; 이식 후 24일째)에 이르면, 그룹 간에 유사한 종양 부피가 달성되도록 12 마리의 종양-보유 동물들을 6 마리의 두 그룹으로 의사 무작위화시켰다. 이를 0일째로 규정했다. 1일째, 4일째, 7일째, 9일째, 11일째, 및 13일째에, 지수기에서 성장된 CD19 t-haNK™ 세포를 원심분리에 의해 채취하고, 1000 cGy 감마 조사를 거치게 하고, 200 μL의 주사 부피로 마우스 당 1 × 107개 세포의 용량으로 IV 투여를 위해 5 × 107개 세포/mL의 농도로 성장 배지에서 제형화하였다. 표 6에 나타나 있는 바와 같이, 그룹 D에서의 동물들은 비히클 용액을 받은 반면, 그룹 F에서의 동물들은 CD19 t-haNK™ 세포를 받았다. 종양 세포 주사 전에 이후 주 2회 동물들의 체중을 쟀다.
동물들을 사망/이환(G0 내지 G4) 및 독성의 임상 징후(T1 내지 T12)에 대하여 매일 관찰하였다. 마비 또는 빈사 상태의 동물들은 안락사시켰다. 빈사 상태의 동물들은 이환을 나타내자마자 안락사시킨 반면, 생존한 동물들은 조직 채취를 위해 일정을 정해 안락사시켰다. 구체적으로, 생존한 동물들의 절반(최대 3 마리 마우스/그룹)을 13일째에 마지막 용량의 시험 항목 투여 6시간 후에 안락사시켰다. 나머지 동물들은 15일째에 마지막 투여 48시간 후에 안락사시켰다. 동물들이 말기 심장내 출혈 후 깊은 마취 하에 있는 동안 자궁경부 탈구에 의해 안락사를 수행하였다. 혈액/혈청 샘플이 연구의 이 부분에서 분석되지 않았으므로, 이 보고에 포함되지 않았다.
종료 시, 부검을 수행하고, 육안의 심한 병변이 있는 기관을 채취하고, 10% 포르말린에서 고정하고, 종양/전이성 질병 부담의 조직학적 평가를 위해 지정된 병리학 실험실(Seventh Wave Laboratories)에 제출하였다.
[표 6]
연구 설계(축약됨)
실시예 9: CD19 t-haNK™ 연구를 위한 데이터 분석
종양 부피를 다음 식을 이용하여 계산하였다: 종양 부피 = 길이 × 너비2 / 2(길이 및 너비는 각각 종양의 가장 긴 및 가장 짧은 직경임).
종양 성장 억제(TGI) 계산을 다음과 같이 수행하였다: TGI = (TC-Tt) / △TC × 100%(여기서, TC 및 Tt는 각각 연구 종료 시 대조군 및 치료군에 대한 평균 종양 부피이고, △TC는 대조군에서 평균 종양 부피의 변화임).
종양 성장 곡선을 2-원 ANOVA 그리고 이어서 튜키 시험에 의한 다중 비교에 의해 분석하였다. 생존 곡선을 로그-순위(맨텔-콕스) 시험에 의해 분석하였다. 개별 일수에 간 전이성 질병 부담의 차이를 짝지어지지 않은 2-꼬리 t 검정에 의해 분석하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다. 모든 통계 분석을 GraphPad Prism 버전 7을 사용하여 수행하였다.
실시예 10: CD19 t-haNK™ 연구를 위한 IV Raji 모델 결과
IV 종양 모델에서 주요 판독은 동물 생존이었다. 동물이 죽은 것으로 확인되거나 질병-관련 이환 및/또는 마비로 인해 안락사된 경우 사망 사례를 계수하였다. 도 9에 나타나 있는 바와 같이, 비히클 대조군에 비해, CD19 t-haNK™ 세포 치료는, 비히클 대조군에서의 21.5일에 비해 27일의 평균 생존을 야기하여(P < 0.0001), 동물의 생존률을 유의하게 개선할 수 있었다. 동물 체중 변화를 또한 연구 전반에 걸쳐 모니터링하였다. 도 10에 나타나 있는 바와 같이, CD19 t-haNK™ 치료된 동물은 치료가 처음 시작되었을 때 중등 정도(10% 미만) 및 단기간 체중 감소를 보였는데, 이는 IV NK 주입을 받은 동물에서는 드문 현상이 아니고, CD19 t-haNK™ 세포에 대해 특이적인 것이 아니다. 이들의 체중은 질병 진행으로 인해 다시 감소하기 전에는 치료 첫 주 후에 회복될 수 있었다.
실시예 11: CD19 t-haNK™ 연구를 위한 SC Raji 모델 결과
SC 종양 모델의 일차 판독은 종양 성장이었다. 도 11에 나타나 있는 바와 같이, CD19 t-haNK™ 세포는, 연구 종료 시(13일째) 49%의 TGI로, 비히클 대조군에 비해 7일째 및 그 이후에 분명하고 통계적으로 유의한 종양 성장 억제를 보였다.
또한, Raji는 공격적인 림프종 모델이기 때문에, SC로 접종한 경우에도, 암세포가 여러 전이 부위로 확산되고 발달될 수 있었는데, 이는 결국 동물 이환 및/또는 사망으로 이어진다. 11일째와 13일째 사이에 빈사 상태였고 그에 따라 비히클 그룹에서 안락사된 동물들은 총 3마리(50%)였다. 대조적으로, CD19 t-haNK™ 세포 그룹에서는 예정되지 않은 사망 사례가 없었다(표 7).
또한, 부검 동안 CD19 t-haNK™ 치료 동물에서 간 전이의 정성적 감소가 관찰되었다(도 12a). 질병 부담의 반-정량적 추정을 대표적으로 샘플링된 H&E 염색된 간 절편에 대하여 지정된 병리학 실험실(Seventh Wave Laboratories)에 의해 수행하였다. 도 12b 및 표 8에 요약된 바와 같이, 연구가 진행됨에 따라 질병 부담이 증가하는 경향이 분명히 있었다. CD19 t-haNK™ 치료 동물의 간은 비히클 대조군에 비해 현저히 더 낮은 비율의 암 침윤 부위를 나타냈다. 적은 샘플 수 및 대조군에서 예정되지 않은 조기 사망으로 인해, 통계 분석은 13일째 데이터에서만 수행될 수 있었다. 이러한 분석은 대조군에서 30%에 비해 CD19 t-haNK™ 치료 동물에서 평균 10% 침윤으로, 질병 부담에서 유의한 차이를 나타냈다. 연구 전반에 걸쳐 체중 변화를 모니터링했으며, IV Raji 모델과 유사하게, CD19 t-haNK™ 치료 동물은 치료 계획 초기에 중등 정도(10% 미만) 및 일시적 체중 감소를 보였다(도 13).
[표 7]
SC Raji 모델에서 동물에 대한 사망/데스 로그
[표 8]
간에서 종양 세포의 관여 %
실시예 12: CD19 t-haNK™ 연구의 결론
반복된 IV 투여 방식에서 CD19 t-haNK™ 세포의 항-종양 효능을 평가하기 위해, 각각 IV 및 SC 종양 접종된 Raji 이종이식 모델의 두 가지 변형예를 이 연구에 이용하였다. IV 종양 모델에서, CD19 t-haNK™ 세포는 비히클 대조군에 비해 평균 생존을 5.5일까지 연장시켜(26% 증가) 동물 생존을 유의하게 개선할 수 있었다. SC 종양 모델에서, CD19 t-haNK™ 세포는 연구 종료 시 49%의 TGI를 야기하여 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있었다. 또한, CD19 t-haNK™ 치료는 동물 이환/사망 사례의 수를 줄이고(대조군에서 3/6에 비해 CD19 t-haNK™ 치료 동물에서 0/6), SC Raji-종양 보유 동물의 간에서 전이성 질병 부담을 현저히 감소시킬 수 있었다. 전반적으로, CD19 t-haNK™ 세포는 Raji 이종이식 모델의 두 가지 변형예 모두에서 비히클 대조군에 비해 유의한 치료 효능을 나타냈다.
본원에서 발명의 개념에서 벗어나지 않고 이미 기재된 것들 이외의 다수의 더 많은 수정이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 주제는 첨부된 청구항의 범주 내를 제외하고 제한되지 않아야 한다. 더욱이, 명세서와 청구항 둘 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥에 일관되게 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 비-배제적인 방식으로 요소, 성분, 또는 단계들을 언급하는 것으로 해석되어야 하는데, 이는 언급된 요소, 성분, 또는 단계가 분명하게 언급되지 않은 다른 요소, 성분, 또는 단계와 제시되거나, 이용되거나, 조합될 수 있다는 것을 지시하는 것이다. 명세서 청구항이 A, B, C.... 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 것 중 적어도 하나를 언급하는 경우, 문맥은 A에 더하여 N, 또는 B에 더하여 N 등이 아니라, 그러한 군으로부터 단지 하나의 요소만을 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> NantKWest
<120> ELIMINATION OF CD19-POSITIVE LYMPHOID MALIGNANCIES BY CD19-CAR
EXPRESSING NK CELLS
<130> 104077.0008PCT
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 236
<212> PRT
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<220>
<223> Laboratory sequence
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ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
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<211> 813
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laboratory sequence
<400> 9
atggactgga tctggcggat tctgtttctc gtgggagctg ccacaggcgc tcattctgct 60
cagcctgccg atatccagat gacccagaca acaagcagcc tgagcgcctc tctgggcgat 120
agagtgacaa tcagctgcag agccagccag gacatcagca agtacctgaa ctggtatcag 180
cagaaacccg acggcaccgt gaagctgctg atctaccaca caagcagact gcacagcggc 240
gtgccaagca gattttctgg cagcggcagc ggcaccgatt acagcctgac catcagcaac 300
ctggaacagg aagatatcgc tacctacttc tgtcagcagg gcaacaccct gccttacacc 360
tttggcggcg gaacaaagct ggaactgaaa agaggcggcg gaggaagcgg aggcggagga 420
tctgggggcg gaggctctgg cggaggggga tctgaagtgc agctgcagca gtctggacct 480
ggactggtgg ctccttctca gtccctgtct gtgacctgta cagtgtctgg cgtgtccctg 540
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atcaaggaca acagcaagag ccaggtgttc ctgaagatga acagcctgca gaccgacgac 720
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tggggccagg gcaccaccgt gacagtgtca tct 813
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<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laboratory sequence
<400> 10
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Ala Gln Pro Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
35 40 45
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
50 55 60
Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro
145 150 155 160
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser
165 170 175
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro
180 185 190
Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
195 200 205
Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn
210 215 220
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp
225 230 235 240
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr
245 250 255
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laboratory sequence
<400> 11
atggactgga tctggcggat tctgtttctc gtgggagctg ccacaggcgc tcattctgct 60
cagcctgccg atatccagat gacccagaca acaagcagcc tgagcgcctc tctgggcgat 120
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ggactggtgg ctccttctca gtccctgtct gtgacctgta cagtgtctgg cgtgtccctg 540
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laboratory sequence
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Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Ala Gln Pro Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
35 40 45
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
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Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
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115 120 125
Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro
145 150 155 160
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser
165 170 175
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro
180 185 190
Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
195 200 205
Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn
210 215 220
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225 230 235 240
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Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laboratory sequence
<400> 13
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 60
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<210> 14
<211> 683
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laboratory sequence
<400> 14
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Ala Gln Pro Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser
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Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
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Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp
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Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro
145 150 155 160
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser
165 170 175
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro
180 185 190
Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
195 200 205
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Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp
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Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr
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Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
260 265 270
Ala Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val
275 280 285
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660 665 670
Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
675 680
<210> 15
<211> 160
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> laboratory sequence
<400> 15
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu
145 150 155 160
Claims (22)
- 전이성 부담을 감소시키는 용도로 사용되는 NK 세포로서, 상기 NK 세포는 Fc 엡실론 수용체 감마(FcεRIγ)를 포함하는 CD19 CAR를 발현하고, 상기 CD19 CAR은 CD19-특이적인 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 제1도메인 및 제1도메인과 융합되며 SEQ ID NO:12의 아미노산 275-407의 아미노산 서열을 가지는 막관통(transmembrane) 및 세포질 신호 전달 도메인을 포함하는 제2도메인을 포함하는,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 CD19 CAR을 인코딩하는 서열은 인간계(human system)에서의 발현을 위해 코돈 -최적화되는,
NK세포. - 제1항 또는 제2항 에 있어서, NK세포는 CD-19 발현 세포를 사멸시킬 수 있는,
NK세포. - 제3항에 있어서, 상기 CD-19 발현 세포는 종양 세포인,
NK세포. - 제4항에 있어서, 상기 종양 세포는 SUP-B15 세포인,
NK세포. - 제1항에 있어서, scFv 항체 단편은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 NK세포는 SEQ ID NO: 9의 서열을 갖는 핵산을 포함하며, 상기 서열은 scFv 항체 단편을 인코딩하는,
NK세포. - 제1항에 있어서, CD19-발현 세포에 대한 상기 NK 세포의 직접 세포독성(direct cytotoxicity)은 표적에 대한 이펙터 비율이 10일 때 70%내지 100%인,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 NK세포의 ADCC 활성은 표적에 대한 이펙터(effector) 비율이 10일 때 30%내지 90%인,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 CD19 CAR은 SEQ ID NO: 12에 대하여 적어도 90% 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하는,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 NK세포는 세포 표면에 CD16을 발현하는,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 NK세포는 IL-2 또는 IL-15를 발현하는,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 NK세포는 CD19-CAR, CD16 및 IL2 또는 IL15를 인코딩하는 트리시스트론(tricistronic) 벡터를 포함하는,
NK세포. - 제13항에 있어서, 상기 트리시스트론 벡터는 SEQ ID NO: 13의 핵산 서열을 포함하는,
NK세포. - 제1항에 있어서, 상기 NK세포는 일차(primary) NK 세포인,
NK세포. - 제15항에 있어서, 상기 일차 NK 세포는 NK-92 세포인,
NK세포. - 제16항에 있어서, 상기 NK-92 세포는 CD19-CAR, CD16 및 IL2 또는 IL15를 인코딩하는 트리시스트론 벡터를 포함하는,
NK세포. - 제17항에 있어서, 상기 트리시스트론 벡터는 SEQ ID NO: 13의 핵산 서열을 포함하는,
NK세포. - 제1항의 NK세포를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는,
키트. - 전이성 부담을 줄이기 위한 용도를 갖는 NK세포를 생성시키기 위한 방법으로서:
CD19 CAR, CD16 및 IL-2 또는 IL-15를 인코딩하는 멀티시스트론 벡터 - 상기 CD19 CAR은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함함 - 를 제공하는 단계; 및
전이성 부담을 줄이기 위한 용도를 갖는 상기 NK세포를 생성하기 위해 상기 벡터를 NK세포에 도입하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제20항에 대하여, 상기 벡터는 자기-절단 펩티드(self-cleaving peptide)를 인코딩하는 서열을 포함하고, 상기 서열은 CAR을 인코딩하는 서열과 CD16을 인코딩하는 서열 사이에 위치되며, 자기-절단 펩티드를 인코딩하는 상기 서열은 CAR과 CD16의 등몰(equimolar) 발현을 가능하게 하는,
방법. - 제21항에 있어서, 상기 벡터는 CD16을 인코딩하는 서열과 IL-2를 인코딩하는 서열 또는 IL-15를 인코딩하는 서열 사이에 내부 리보솜 도입 서열(IRES)을 포함하는,
방법.
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IL277413B1 (en) | 2023-01-01 |
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