KR20240012660A - Predicting biomarker for progression of Alzheimer’s dementia using alteration in DNA methylation of KRT32 gene - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition, kit, and method for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia by detecting the methylation level of the CpG region of the gene.
Description
본 발명은 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition, kit, and method for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia by detecting the methylation level of the CpG region of the gene.
한국의 빠른 경제 성장과 생활 방식의 서구화, 의학의 발전으로 인해 한국 국민의 평균 수명이 연장되는 한편, 한국은 전세계적으로 가장 빠르게 인구의 고령화가 진행되고 있다. 이에 따라 노화와 맞물려 발병하는 신경퇴행성질환 역시 가파르게 증가하고 있다. Due to Korea's rapid economic growth, westernization of lifestyle, and advancement in medicine, the average life expectancy of Koreans is increasing, while Korea's population is aging at the fastest pace in the world. Accordingly, neurodegenerative diseases that occur in conjunction with aging are also rapidly increasing.
치매는 사회경제적 부담이 큰 대표적인 질환으로서, 그 중에서 알츠하이머병 치매는 치매의 가장 흔한 종류이다. 알츠하이머병 치매는 기억력 감퇴로 시작하여 시간과 공간의 인지 능력 상실, 망상 및 성격변화, 언어 기능 마비, 및 운동 기능 마비 등의 증상으로 장기간에 걸쳐 점진적으로 진행하여 결국 사망에 이르는 대표적인 신경퇴행성 뇌질환이다. Dementia is a representative disease that causes a large socioeconomic burden, and among them, Alzheimer's disease dementia is the most common type of dementia. Alzheimer's disease Dementia is a representative neurodegenerative brain disease that begins with memory loss and gradually progresses over a long period of time with symptoms such as loss of cognitive ability in time and space, delusions and personality changes, paralysis of language function, and paralysis of motor function, ultimately leading to death. am.
알츠하이머병 치매를 치료하기 위한 연구가 지난 수십년간 지속적으로 진행되어 왔음에도 불구하고 현재까지 근본적인 치료제는 없으며 단지 증상을 완화하거나 병변의 진행을 늦추는 수준의 치료만이 행해지고 있는 실정이다. 따라서, 알츠하이머병 치매는 조기 진단 및 선제적 치료를 통해 치매의 발병시기를 지연시키는 것이 가장 효과적인 관리 방법으로 제시되고 있다.Although research into the treatment of Alzheimer's disease dementia has been continuously conducted for the past several decades, there is currently no fundamental cure, and only treatments that alleviate symptoms or slow down the progression of the lesion are being carried out. Therefore, delaying the onset of Alzheimer's disease dementia through early diagnosis and preemptive treatment has been suggested as the most effective management method.
그러나, 현재 알츠하이머병 치매 진단에 사용되고 있는 신경인지검사의 경우 환자의 연령, 교육수준, 또는 의도적 대답 거부 등이 검사 결과의 정확도에 크게 영향을 미치는 단점이 있고, MRI나 PET을 이용한 뇌영상검사의 경우, 고가의 장비를 시용하기 때문에 특별한 증상을 나타내지 않는 초기단계에 검사를 시행하기가 어려운 단점이 있다.However, the neurocognitive tests currently used to diagnose Alzheimer's disease dementia have the disadvantage that the patient's age, level of education, or intentional refusal to answer can significantly affect the accuracy of the test results, and brain imaging tests using MRI or PET have the disadvantage of significantly affecting the accuracy of the test results. In some cases, the use of expensive equipment has the disadvantage of making it difficult to perform tests in the early stages when no special symptoms are present.
이에, 알츠하이머병 치매의 진단을 위한 다른 방법으로, 뇌척수액 또는 혈청에서 베타 아밀로이드 단백질을 검출하는 방법, tau 단백질의 농도를 측정하는 방법, 신경아교원섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)-항체를 검출하는 방법 등의 생화학적 방법들이 제안되었으나, 진단 방법의 임상 적용의 효율성과 정확도 등의 문제가 제기되고 있다 (국제공개특허 제92/17152호; 미국특허 제4,666,829호; 국제공개특허 제89/06242호; 미국특허 제5,231,000호 등).Accordingly, other methods for diagnosing Alzheimer's disease dementia include a method of detecting beta amyloid protein in cerebrospinal fluid or serum, a method of measuring the concentration of tau protein, and a glial fibrillary acidic protein (GFAP)-antibody. Biochemical methods such as detection methods have been proposed, but problems such as efficiency and accuracy of clinical application of diagnostic methods have been raised (International Patent Publication No. 92/17152; US Patent No. 4,666,829; International Patent Publication No. 89/17152). No. 06242; U.S. Patent No. 5,231,000, etc.)
따라서, 알츠하이머병 치매의 조기진단을 위해 임상증상을 대변하거나, 증상이 나타나기 이전의 전임상 상태를 측정할 수 있는 새로운 진단 마커가 절실히 요구된다.Therefore, for early diagnosis of Alzheimer's disease dementia, there is an urgent need for new diagnostic markers that can represent clinical symptoms or measure preclinical conditions before symptoms appear.
본 발명자들은 KRT32 (Keratin 32) 유전자가 알츠하이머병 경도인지장애에 특이적으로 고메틸화(hypermethylation)되는 것을 확인하고, 이를 바이오마커로 이용하여 KRT32 유전자의 메틸화 정도를 측정함으로써 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors confirmed that the KRT32 (Keratin 32) gene is specifically hypermethylated in Alzheimer's disease mild cognitive impairment, and used this as a biomarker to measure the degree of methylation of the KRT32 gene to determine the risk of progression to Alzheimer's disease dementia. The present invention was completed by confirming that it was possible to predict.
이에, 본 발명의 일예는 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측용 조성물을 제공한다.Accordingly, an example of the present invention provides a composition for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, which includes an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the KRT32 gene promoter.
다른 예는 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측용 키트를 제공한다.Another example provides a kit for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, including the composition.
다른 예는 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측하는 방법을 제공한다.Another example provides a method for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia by measuring the methylation level at the CpG site of the KRT32 gene promoter.
다른 예는 개체의 시료로부터 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.Another example provides a method of providing information for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, which includes measuring the methylation level of the CpG region of the KRT32 gene promoter from a sample of an individual.
다른 예는 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 방법을 제공한다.Another example provides a method of measuring the methylation level at the CpG region of the KRT32 gene promoter from a sample of an individual to provide information necessary for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia.
본 발명은 KRT32 유전자가 알츠하이머병 경도인지장애에 특이적으로 고메틸화된다는 발견에 기초한 것으로, KRT32 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 특이적인 DNA 고메틸화 정도를 측정하여 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측하는 분자생물학적 진단 기술을 제공한다. The present invention is based on the discovery that the KRT32 gene is specifically hypermethylated in Alzheimer's disease mild cognitive impairment, and predicts the risk of progression to Alzheimer's disease dementia by measuring the degree of specific DNA hypermethylation that occurs at a specific CpG position in the KRT32 gene. Provides molecular biological diagnostic technology.
DNA 메틸화 변화는 DNA에 존재하기 때문에 검출이 용이하고, 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며, 한 유전자의 특정 위치에서 일어나므로 분석이 손쉬운 장점을 가진다. DNA methylation changes are easy to detect because they exist in DNA, are more stable than protein or RNA markers, and have the advantage of being easy to analyze because they occur at a specific location in a gene.
구체적으로, 본원의 일실시예에서는, 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군의 시료로부터 게놈 DNA를 추출하고, DNA 메틸화 변이 분석을 통해 DNA 메틸화 프로파일을 분석하였고, 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 비교하여 알츠하이머병 경도인지장애 환자군의 유전자 프로모터 부위의 CpG 부위에서 20% 이상 DNA 메틸화가 변화한 유전자를 선별하였다. 이 선별된 유전자들 가운데 KRT32 유전자가 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군에 비해 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 프로모터의 CpG 부위의 DNA 메틸화가 약 21% 증가되어 있음을 확인하였고 리시버-작동 특징 커브(ROC curve: receiver operating characteristics curve) 분석을 통해 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위의 고메틸화가 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군 대비 알츠하이머병 경도인지장애 환자군을 높은 정확도 (AUC = 0.8)로 구분할 수 있음을 확인하였다.Specifically, in one embodiment of the present application, genomic DNA was extracted from samples of a patient group with mild cognitive impairment without amyloid pathology and a patient group with mild cognitive impairment with Alzheimer's disease, DNA methylation profile was analyzed through DNA methylation mutation analysis, and amyloid pathology was analyzed. Compared to the mild cognitive impairment patient group without any findings, genes with more than 20% DNA methylation change in the CpG region of the gene promoter region of the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group were selected. Among these selected genes, it was confirmed that the DNA methylation of the CpG region of the promoter of the KRT32 gene was increased by approximately 21% in the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group compared to the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology, and the receiver-operator characteristic curve ( Through ROC curve (receiver operating characteristics curve) analysis, it was found that hypermethylation of the CpG region of the KRT32 gene promoter can distinguish with high accuracy (AUC = 0.8) the group of patients with mild cognitive impairment of Alzheimer's disease compared to the group of patients with mild cognitive impairment without amyloid pathology. Confirmed.
이러한 결과는 KRT32 유전자의 질환 특이적 고메틸화가, 비침습적인 방법으로 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측하기 위한 바이오마커로 활용할 수 있음을 나타낸다.These results indicate that disease-specific hypermethylation of the KRT32 gene can be used as a biomarker to predict the risk of progression to Alzheimer's disease dementia in a non-invasive manner.
따라서, 일 구체예는 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측용 조성물을 제공한다.Accordingly, one embodiment provides a composition for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, including an agent for measuring the methylation level of the CpG region of the KRT32 gene promoter.
다른 구체예는 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측용 키트를 제공한다.Another embodiment provides a kit for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, including the composition.
다른 구체예는 개체의 시료로부터 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측하는 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method of predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia by measuring the methylation level at the CpG region of the KRT32 gene promoter from a sample of an individual.
다른 구체예는 개체의 시료로부터 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method of providing information for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, comprising measuring the methylation level at the CpG region of the KRT32 gene promoter from a sample of an individual.
다른 구체예는 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 방법을 제공한다.Another embodiment provides a method of measuring the methylation level at the CpG region of the KRT32 gene promoter from a sample of an individual to provide information necessary for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia.
본 발명에서 용어, "메틸화" 또는 "메틸레이션"은 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자 프로모터의 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.In the present invention, the term “methylation” or “methylation” refers to the attachment of a methyl group to a base constituting DNA. Preferably, in the present invention, methylation refers to whether methylation occurs at cytosine in the CpG region of a specific gene promoter. When methylation occurs, the binding of transcription factors is disrupted and the expression of a specific gene is suppressed. Conversely, when unmethylation or hypomethylation occurs, the expression of a specific gene increases.
포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.In addition to A, C, G, and T, the genomic DNA of mammalian cells contains a fifth base called 5-methylcytosine (5-mC), which has a methyl group attached to the fifth carbon of the cytosine ring. do. Methylation of 5-methylcytosine occurs only at the C of CG dinucleotide (5'-mCG-3'), called CpG, and methylation of CpG suppresses the expression of alu or transposon and repetitive sequences of the genome. In addition, because the 5-mC of CpG is prone to natural deamination to become thymine (T), CpG is the site where most epigenetic changes frequently occur in mammalian cells.
본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 유전자 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정하거나, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 또는 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알츠하이머병이 아닌 사람의 시료에 비하여 또는 미리 결정된 임계값(cut-off)과 비교하여, 환자의 시료에서는 KRT32 유전자에서의 고메틸화가 특이적으로 나타나는 것을 통해서, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측할 수 있다.In the present invention, the term “methylation level measurement” refers to measuring the methylation level of a gene CpG region, using methylation-specific PCR, for example, methylation-specific polymerase chain reaction (MSP), real-time methylation-specific PCR. It can be measured through PCR (real time methylation-specific polymerase chain reaction), PCR using a methylated DNA-specific binding protein, or quantitative PCR. Alternatively, it can be measured by methods such as automatic base analysis such as pyrosequencing or bisulfite sequencing, DNA methylation microarray, or immunoprecipitation using a methylated CpG binding domain or anti-methylcytosine antibody. However, it is not limited to this. The risk of progression to Alzheimer's disease dementia can be predicted by specifically showing hypermethylation in the KRT32 gene in patient samples compared to samples from people without Alzheimer's disease or compared to a predetermined threshold (cut-off). there is.
인간 KRT32 유전자는 17번 염색체에 위치하며, NCBI Entrez database 에 Gene ID: 3882 로 등록되어 있다. The human KRT32 gene is located on chromosome 17 and is registered in the NCBI Entrez database as Gene ID: 3882.
본 발명에서, 유전자의 CpG 부위란, 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 유전자의 DNA 는, 유전자가 발현하는데 필요하며 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성 단위를 모두 포함하는 개념으로, 예를 들어, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역을 포함한다. 따라서, 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다. 바람직하게, KRT32 유전자에서 질환 특이적 고메틸화가 일어나는 CpG 부위는 유전자의 프로모터에 존재할 수 있다.In the present invention, the CpG site of a gene refers to a CpG site present on the DNA of the gene. The DNA of a gene is a concept that includes a series of structural units that are required for gene expression and are operably linked to each other, for example, a promoter region, a protein coding region (open reading frame, ORF), and a terminator region. Includes. Therefore, the CpG site of a gene may be present in the promoter region, protein coding region (open reading frame, ORF), or terminator region of the gene. Preferably, the CpG site where disease-specific hypermethylation occurs in the KRT32 gene may be present in the promoter of the gene.
일예로, 본 발명에서 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, KRT32 유전자의 프로모터 CpG 부위, 보다 상세하게는 17번 염색체의 41467764 내지 41467885번째 염기서열(서열번호 1) 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다:For example, in the present invention, the methylation level of the CpG region of the KRT32 gene promoter is measured by measuring the methylation level of the promoter CpG region of the KRT32 gene, more specifically, the CpG region appearing in the 41467764 to 41467885 base sequence of chromosome 17 (SEQ ID NO: 1). It may include measuring the methylation level of cytosine:
TCCCCATGGGAAGAGGCCTGGCTATTTAACAAGGAAATGTGTGGGTGGTAGAAACTGCTC C GATGCTGGCAGCGGCATAAATCCAGCAGAAAGGAACAGGAACCTCAGAGGCTTCCTAACAG (서열번호 1)TCCCCATGGGAAGAGGCCTGGCTATTTAACAAGGAAATGTGTGGGTGGTAGAAACTGCTC C GATGCTGGCAGCGGCATAAATCCAGCAGAAAGGAACAGGAACCTCAGAGGCTTCCTAACAG (SEQ ID NO: 1)
보다 구체적으로, 17번 염색체의 41467824번째 염기(서열번호 1의 61번째 염기)에 위치한 사이토신의 메틸화를 측정하는 것을 포함할 수 있다. More specifically, it may include measuring the methylation of cytosine located at base 41467824 of chromosome 17 (base 61 of SEQ ID NO: 1).
본 발명에서는 상기 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 최신 버전인 GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) 에 따라 표현하였지만 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) 에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.In the present invention, the nucleotide sequence of the human genome chromosomal region is expressed according to the latest version of GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38), but the specific sequence of the human genome chromosomal region is expressed as the results of genome sequence research are updated. This may be slightly changed, and depending on this change, the expression of the human genomic chromosomal region of the present invention may be different. Therefore, the human genome chromosomal region expressed according to the GRCh38 Genome Reference Consortium Human Reference 38 (GRCh38/hg38) of the present invention is a human reference sequence that has been updated after the filing date of the present invention to represent the human genomic chromosomal region. Even if it is changed differently from what it is now, it will be obvious that the scope of the present invention extends to the changed human genome chromosomal region. These changes can be easily known by anyone with ordinary knowledge in the technical field to which the present invention pertains.
본 발명에서 용어, "알츠하이머병 (Alzheimer’s disease, AD)"은 신경 퇴행성 뇌질환의 대표적인 질환으로 기억력저하를 초기 증상으로 하고, 이후 전반적인 인지기능의 저하를 보이는 병이다. 종래에는 알츠하이머병을 임상증상에 기반하여 정의하고, 뇌의 부검을 통해 확진하였으나, 최근에는 알츠하이머병과 관련된 신경병리학적 변화들이 밝혀지고 이를 임상검사로 활용할 수 있게 되면서, 이러한 변화를 생체 내(in vivo) 생물표지자를 통하여 확인함으로써 알츠하이머병을 정의할 수 있게 되었다. 현재도, 알츠하이머병의 확진은 사후 뇌의 부검소견이긴 하지만, 뇌의 부검소견의 대표적인 특징으로 알려져 있는 아밀로이드 단백 및 타우 단백의 병적인 축적을 PET 영상 또는 뇌척수액검사를 간접적으로 확인할 수 있게 되면서, 임상양상만으로 진단하던 시대에 비해 진단의 정확성이 획기적으로 발전하게 되었다. In the present invention, the term "Alzheimer's disease (AD)" is a representative neurodegenerative brain disease with memory decline as an initial symptom and subsequent decline in overall cognitive function. Previously, Alzheimer's disease was defined based on clinical symptoms and confirmed through brain autopsy, but recently, as neuropathological changes related to Alzheimer's disease have been discovered and these changes can be used as clinical tests, these changes can be measured in vivo. ) It became possible to define Alzheimer's disease by identifying it through biomarkers. Even now, the diagnosis of Alzheimer's disease is based on postmortem brain autopsy findings, but as pathological accumulation of amyloid protein and tau protein, which are known to be representative features of brain autopsy findings, can be indirectly confirmed through PET imaging or cerebrospinal fluid examination, clinical Compared to the era when diagnosis was based solely on symptoms, the accuracy of diagnosis has improved dramatically.
알츠하이머병을 정의하기 위한 생물표지자로는, 베타아밀로이드 관련 지표(예를 들어, 뇌피질의 amyloid-PET 리간드의 결합이나 뇌척수액에서의 Aβ42 의 감소), 신경원섬유매듭 형태의 타우 관련 지표 (예를 들어, 뇌척수액에서의 인산화 타우의 증가나 뇌피질의 tau-PET 리간드의 결합), 또는 신경퇴행의 지표 (예를 들어, 뇌척수액 총 타우의 증가 또는 MRI에서의 뇌위축과 FDG-PET에서의 뇌 대사저하) 등을 들 수 있다.Biomarkers for defining Alzheimer's disease include beta-amyloid-related indicators (e.g., binding of amyloid-PET ligand in the cerebral cortex or reduction of Aβ 42 in cerebrospinal fluid) and tau-related indicators in the form of neurofibrillary tangles (e.g. (e.g., increased phosphorylated tau in cerebrospinal fluid or binding of tau-PET ligands in the brain cortex), or indicators of neurodegeneration (e.g., increased cerebrospinal fluid total tau or brain atrophy on MRI and brain hypometabolism on FDG-PET). ), etc.
미국 국립노화연구소(National Institute of Ageing, NIA)와 알츠하이머협회(Alzheimer Association, AA)가 2011년에 발표한 NIA-AA 알츠하이머병의 진단기준을 업데이트한, 2018년 알츠하이머병의 연구용 진단기준(Jack CR, et al., NIA-AA Research Framework: toward a biological definition of Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement 2018;14:535-562)에 따르면, 알츠하이머병은 치매의 임상증상이 나타나기 전이라도 알츠하이머병의 병리적 특성(상술한 바와 같은 알츠하이머병 생물표지자)이 관찰된다면 알츠하이머병의 진단기준에 포함된다. 구체적으로, 생물표지자와 인지 단계의 조합을 통하여 알츠하이머병을 크게 알츠하이머병 정상인지기능 (preclinical Alzheimer’s disease), 알츠하이머병 경도인지장애 (prodromal Alzheimer’s disease) 및 알츠하이머병 치매 (Symptomatic Alzheimer’s disease)로 세분화하여 하나의 연속체(continuum) 개념으로 설명한다.The 2018 Alzheimer's Disease Research Diagnostic Criteria (Jack CR According to , et al., NIA-AA Research Framework: toward a biological definition of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement 2018;14:535-562), Alzheimer's disease is a pathological characteristic of Alzheimer's disease even before clinical symptoms of dementia appear. If Alzheimer's disease biomarkers (as described above) are observed, they are included in the diagnostic criteria for Alzheimer's disease. Specifically, through a combination of biomarkers and cognitive stages, Alzheimer's disease is largely subdivided into preclinical Alzheimer's disease, prodromal Alzheimer's disease, and symptomatic Alzheimer's disease. It is explained with the concept of continuum.
알츠하이머병 정상인지기능은 생물학적 표지자검사에서 알츠하이머병의 병리 소견을 보이나, 임상증상은 없는 임상전(preclinical) 단계에 해당한다. 다음 단계인 알츠하이머병 경도인지장애는 생물학적 표지자검사에서 알츠하이머병의 병리 소견을 보이나, 경도의 객관적 인지저하가 있고, 독립적인 일상생활 수행능력은 유지되는 단계로서, "경도인지장애 단계의 알츠하이머병(AD with mild cognitive impairment)" 또는 "알츠하이머병 전구단계(prodromal AD)라는 용어도 병기된다. 알츠하이머병 치매는 생물학적 표지자 검사에서 알츠하이머병의 병리 소견을 보이고, 치매 증상이 발현되어, 객관적인 인지기능의 저하로 인해 독립적인 일상생활능력이 손상된다. "치매 단계의 알츠하이머병(AD with dementia)" 또는 "증상이 있는 알츠하이머병(Symptomatic AD)라는 용어도 병기된다.Normal cognitive function in Alzheimer's disease corresponds to the preclinical stage, where biological marker tests show pathological findings of Alzheimer's disease but do not have clinical symptoms. The next stage, mild cognitive impairment of Alzheimer's disease, is a stage in which pathological findings of Alzheimer's disease are shown in biological marker tests, but there is mild objective cognitive decline and the ability to perform independent daily activities is maintained. It is called "Alzheimer's disease in the mild cognitive impairment stage ( The terms "AD with mild cognitive impairment" or "prodromal AD" are also used together. Alzheimer's disease dementia shows pathological findings of Alzheimer's disease in biological marker tests, symptoms of dementia develop, and objective cognitive function declines. As a result, the ability to live independently is impaired. The terms “AD with dementia” or “Symptomatic AD” are also used.
이에 따라, 본 발명에서 용어, "알츠하이머병 경도인지장애"는 알츠하이머병의 병리적 특성(생물표지자)을 나타내는 것을 전제로 하되, 객관적 인지저하가 있으나 일상생활수행능력은 보존되어 있어 치매가 아닌 상태로, 알츠하이머병 치매 발병 전의 단계를 말한다. Accordingly, the term "Alzheimer's disease mild cognitive impairment" in the present invention is premised on representing the pathological characteristics (biomarkers) of Alzheimer's disease, but is a condition that is not dementia because there is objective cognitive decline but the ability to perform daily life is preserved. This refers to the stage before the onset of Alzheimer's disease or dementia.
이와 대비하여, 일반적인 "경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI)"는 알츠하이머병뿐만 아니라, 다른 신경퇴행성질환 또는 다양한 요인으로 인하여 임상적으로 판단할 때, 인지능력이 감퇴되는 경우를 포함한다. 매년 일반 노인 인구의 1~2%에서 치매로 진행하는데 비하여, 경도인지장애 노인의 경우 1년에 5-20%에서 치매로 진행하는 것으로 알려져 있어, 경도인지장애는 치매의 고위험군으로 여겨진다. 그러나 경도인지장애는 알츠하이머병 치매가 아닌, 이마관자엽 치매나 혈관성 치매와 같은 다른 치매질환으로 진행되는 경우도 있고, 20~30%는 정상으로 회복되거나 치매로 진행되지 않고 경도인지장애 상태로 비슷하게 유지되는 것으로 알려져 있다. In contrast, the general "mild cognitive impairment (MCI)" includes cases where cognitive ability is clinically determined to be reduced due to not only Alzheimer's disease but also other neurodegenerative diseases or various factors. While 1-2% of the general elderly population progresses to dementia each year, it is known that 5-20% of elderly people with mild cognitive impairment progress to dementia per year, and mild cognitive impairment is considered a high-risk group for dementia. However, mild cognitive impairment may progress not to Alzheimer's disease dementia but to other dementia diseases such as fronto-temporal dementia or vascular dementia, and 20 to 30% of cases recover to normal or do not progress to dementia but similar to mild cognitive impairment. It is known to be maintained.
그러나, 본원에서 "알츠하이머병 경도인지장애"는 알츠하이머병으로 인한 경도인지장애, 즉 알츠하이머병의 병리적 특성(생물표지자)을 나타내는 경도인지장애를 말하는 것으로, 일반적인 경도인지장애에 비하여 알츠하이머병 치매로 진행될 가능성이 월등히 높다. 종래 보고에 따르면, 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 경도인지장애의 경우 3년내 알츠하이머병 치매로 진행하는 비율이 약 5%에 불과하였으나, NIA-AA 진단기준에 따른 알츠하이머병 경도인지장애의 경우 3년내 알츠하이머병 치매로 진행하는 비율이 약 59%로서 월등히 높았다 (Brain 2015: 138; 1327-1338).However, herein, "Alzheimer's disease mild cognitive impairment" refers to mild cognitive impairment caused by Alzheimer's disease, that is, mild cognitive impairment that shows the pathological characteristics (biomarkers) of Alzheimer's disease. Compared to general mild cognitive impairment, Alzheimer's disease dementia There is a very high possibility that it will proceed. According to previous reports, in the case of mild cognitive impairment not caused by Alzheimer's disease, the rate of progression to Alzheimer's disease dementia within 3 years was only about 5%, but in the case of mild cognitive impairment of Alzheimer's disease according to the NIA-AA diagnostic criteria, the rate of progression to Alzheimer's disease within 3 years was high. The rate of progression to dementia was significantly higher at approximately 59% (Brain 2015: 138; 1327-1338).
이에, 본원 발명의 메틸화 마커는, 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군 대비 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에 특이적으로 고메틸화되며, ROC 커브 분석을 통해 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군을 구별하는 유효성이 확인되었으므로, 알츠하이머병 경도인지장애에서 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 미리 예측하는, 알츠하이머병 치매 예측 진단 마커로 활용될 수 있다.Accordingly, the methylation marker of the present invention is specifically highly methylated in the mild cognitive impairment patient group with Alzheimer's disease compared to the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology, and through ROC curve analysis, the methylation marker of the present invention is more methylated in the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology and the Alzheimer's disease patient group. Since its effectiveness in discriminating between mild cognitive impairment patient groups has been confirmed, it can be used as a predictive diagnostic marker for Alzheimer's disease dementia, predicting the risk of progression from mild cognitive impairment to Alzheimer's disease dementia.
또한 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 알츠하이머성 치매 위험성을 미리 예측함으로써, 알츠하이머병 치매로의 진행가능성이 높은 환자를 선별하여 적극적인 예방관리 및 조기치료를 통해 질병의 악화를 지연시킬 수 있다. 또한 추후 임상적으로 활용될 경우, 조기 발견으로 인해 치매의 발병지연 및 유병률 감소 효과를 거둘 수 있으며, 궁극적으로 환자와 가족의 삶의 질을 향상시키고 나아가 국가가 부담하게 되는 사회경제적 비용을 크게 줄일 수 있다.In addition, the composition, kit, and method of the present invention can predict the risk of Alzheimer's dementia in advance, thereby selecting patients with a high likelihood of progressing to Alzheimer's disease dementia and delaying the worsening of the disease through active preventive management and early treatment. In addition, if used clinically in the future, early detection can delay the onset and reduce the prevalence of dementia, ultimately improving the quality of life for patients and their families and greatly reducing socioeconomic costs borne by the nation. You can.
본 발명에서 "진단"이란 질환의 존재, 질환 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 포괄적으로, 진단은 특정 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 확인하거나, 증상이 나타나기 이전의 상태를 측정하거나, 질환의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.In the present invention, “diagnosis” means confirming the existence of a disease or the presence or characteristics of a disease pathological state. Comprehensively, diagnosis includes determining whether a specific disease currently exists, measuring the condition before symptoms appear, determining the prognosis of the disease, and further determining whether the disease has progressed or worsened. can do.
본 발명에서 용어, "알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측"은 알츠하이머병 치매의 증상이 나타나기 이전의 단계에서 향후 알츠하이머병 치매가 발병되거나 알츠하이머병 치매로 진행될 위험성을 미리 평가하고 예측하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia" refers to assessing and predicting in advance the risk of developing Alzheimer's disease dementia or progressing to Alzheimer's disease dementia at a stage before symptoms of Alzheimer's disease dementia appear.
본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸화 DNA에 특이적으로 결합하는 메틸화 DNA항체 (예를 들어, 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체) 등을 포함할 수 있다.In the present invention, the agent for measuring the methylation level of a CpG site is a compound that modifies an unmethylated cytosine base, a methylation-sensitive restriction enzyme, a primer specific for the methylated allele sequence of the gene, or a compound specific for the unmethylated allele sequence. It may include a primer, a methylated CpG binding domain, or a methylated DNA antibody that specifically binds to methylated DNA (for example, an antibody that specifically binds to methylcytosine).
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 바이설파이트 변형된 DNA 는 서열분석 또는 메틸화 특이적 PCR 등 다양한 방법을 통하여 메틸화를 검출할 수 있으며, 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, WO01/26536; US2003/0148326A1).The compound that modifies the unmethylated cytosine base may be bisulfite or a salt thereof, but is not limited thereto, and is preferably sodium bisulfite. Methylation of bisulfite-modified DNA can be detected through various methods such as sequencing or methylation-specific PCR. The method of detecting methylation of a gene by modifying unmethylated cytosine residues using bisulfite is It is well known in the art (e.g. WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.Additionally, the methylation-sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme that can specifically detect methylation of a CpG site and may be a restriction enzyme that contains CG as a recognition site of the restriction enzyme. Examples include Sma I, Sac II, Eag I, Hpa II, Msp I, Bss HII, Bst UI, Not I, etc., but are not limited thereto. Depending on methylation or unmethylation at C of the restriction enzyme recognition site, cleavage by the restriction enzyme varies and can be detected through PCR or Southern blot analysis. Other methylation-sensitive restriction enzymes other than the above restriction enzymes are well known in the art.
개체의 유전자의 특정 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 일예로서, 환자의 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.As a representative example of measuring the methylation level at a specific CpG site of an individual's gene, genomic DNA is obtained from a patient's sample, and the obtained DNA is treated with a compound that modifies unmethylated cytosine bases or a methylation-sensitive restriction enzyme. Afterwards, the treated DNA can be amplified by PCR using primers and measured by confirming the presence or absence of the amplified product.
따라서, 본 발명의 제제는 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.Accordingly, the agent of the present invention may include primers specific for the methylated allele sequence of the gene and primers specific for the unmethylated allele sequence. In the present invention, the term “primer” refers to a short nucleic acid sequence having a short free 3 terminal hydroxyl group, which can form base pairs with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. Additionally, primers, both sense and antisense nucleic acids having a sequence of 7 to 50 nucleotides, may incorporate additional features that do not change the basic nature of the primer, which serves as an initiation point for DNA synthesis.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. The primers of the present invention can be preferably designed according to the sequence of the specific CpG site to be analyzed for methylation, and each primer pair is capable of specifically amplifying a cytosine that is methylated and has not been modified by bisulfite, And it may be a primer pair that can specifically amplify cytosine that is not methylated and thus modified by bisulfite.
한편, 메틸화 DNA 항체란, DNA 중의 메틸화된 염기에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 구체적으로는, 메틸사이토신에 대한 항체와 같이, DNA 사슬 중 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 가진 항체를 들 수 있다. 또한, 시판되고 있는 메틸화 DNA 항체 중에서, 본원에 기재된 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다. Meanwhile, a methylated DNA antibody refers to an antibody that specifically binds to a methylated base in DNA. Specifically, antibodies that have the property of recognizing and binding to methylated cytosine in the DNA chain, such as antibodies to methylcytosine, can be cited. Additionally, among commercially available methylated DNA antibodies, there may be an antibody that can specifically recognize and specifically bind to DNA in the methylated state described herein.
메틸화 DNA 항체는 메틸화된 염기, 메틸화 DNA 등을 항원으로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 메틸사이토신 항체를 제조하기 위해서는, 5―메틸사이티딘, 5―메틸사이토신, 또는 5―메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 항체를 제조한 후 DNA 중의 메틸사이토신으로의 특이적인 결합을 지표로서 선별할 수 있다. Methylated DNA antibodies can be produced by conventional methods using methylated bases, methylated DNA, etc. as antigens. For example, to produce a methylcytosine antibody, an antibody is prepared using 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine as an antigen, and then methylcytosine in the DNA is used as an antigen. The specific combination of can be selected as an indicator.
또한, 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸화 DNA 항체를 이용하여 메틸화 수준을 측정하는 경우, 이들을 이용하여 메틸화된 DNA 를 면역침강시킨 후, 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing) 등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다. 또한, 항체의 면역학적 검출 또는 정량을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질 표지, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 사용할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있고, 그 외 방사성 동위원소 표지, 라텍스 비드 표지, 콜로이드 표지, 비오틴 표지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, when measuring the methylation level using a methylated CpG binding domain (MBD) or methylated DNA antibody, methylated DNA is immunoprecipitated using these, and then analyzed by Southern blot, PCR, microarray, or sequence analysis. Specific CpG sites can be confirmed through sequencing. Additionally, for immunological detection or quantification of antibodies, a substrate, an appropriate buffer solution, a chromogenic enzyme or a fluorescent substance label, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent substance, and a chromogenic substrate can be used. In the above, the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, and a glass slide glass, and the coloring enzyme may be peroxidase or alkaline phosphatase. Fatase (alkaline phosphatase), etc. can be used, the fluorescent substance can be FITC, RITC, etc., and the coloring substrate solution is ABTS (2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphate). Ponic acid), OPD (o-phenylenediamine), or TMB (tetramethyl benzidine) can be used, and other radioactive isotope labels, latex bead labels, colloid labels, biotin labels, etc. can be used, but are limited to these. no.
상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 DNA 메틸화 마이크로어레이 형태로 구현될 수 있다.In addition to the above agents, the compositions and kits may additionally include polymerase agarose, buffer solutions required for electrophoresis, etc. Additionally, the kit may be implemented in the form of a DNA methylation microarray.
다른 구체예로, 본 발명은 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측하는 방법에 관한 것이다.In another embodiment, the present invention relates to a method for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia by measuring the methylation level at the CpG region of the KRT32 gene promoter.
또한, 본 발명은 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 방법에 관한 것이다.Additionally, the present invention relates to a method for detecting the methylation level of the CpG region of a gene promoter from a sample of an individual in order to provide information necessary for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia.
또한, 본 발명은 개체의 시료로부터 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.Additionally, the present invention relates to a method of providing information for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, which includes measuring the methylation level at the CpG region of the KRT32 gene promoter from a sample of an individual.
이를 위한 일 구현예로, 본 발명은 개체의 시료로부터 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 알츠하이머병이 아닌 대조군 시료의 해당 유전자의 메틸화 수준과 비교하거나 미리 결정된 임계값(cut-off)과 비교하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.In one embodiment for this purpose, the present invention includes the steps of measuring the methylation level of the CpG region of the KRT32 gene promoter from a sample of an individual; And providing information for predicting the risk of progression to Alzheimer's disease dementia, including comparing the methylation level with the methylation level of the corresponding gene in a non-Alzheimer's disease control sample or comparing it with a predetermined threshold (cut-off). It's about how to do it.
본 발명에서 용어 "시료"란 알츠하이머병에 의해 유전자의 메틸화 수준이 차이 나는 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료를 포함하나, 상기 예시에 제한되지 않고 DNA 추출이 가능한 모든 시료를 사용할 수 있다. 바람직한 구체예로는, 피부 조직 또는 피부 세포를 포함하고, 예를 들어 피부 섬유아세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "sample" includes samples such as cells, tissues, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, sputum, or urine in which the methylation level of genes is different due to Alzheimer's disease, but is not limited to the above examples and includes DNA. Any sample that can be extracted can be used. Preferred embodiments include skin tissue or skin cells, for example, but are not limited to skin fibroblasts.
먼저, 개체의 시료로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 검출하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.First, in order to obtain genomic DNA from a sample of an individual and detect the methylation level, genomic DNA was obtained using the phenol/chloroform extraction method and SDS extraction method (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB separation (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), or a commercially available DNA extraction kit.
상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, 메틸화된 염기와 메틸화되지 않은 염기의 차이를 이용한, 제한효소 또는 바이설파이트를 이용하는 방법, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강방법(예, MIRA, MeDIP), DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 이용한 방법 등을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 또는 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법 등을 사용하여 메틸화 수준을 측정 내지 검출할 수 있다.The step of detecting the methylation level of a specific CpG site of the gene includes a method using restriction enzymes or bisulfite, using the difference between methylated bases and unmethylated bases, a methylated CpG binding domain, or an anti-methylcytosine antibody. It can be performed through immunoprecipitation methods (e.g., MIRA, MeDIP), methods using DNA methylation microarray, etc. For example, methylation-specific polymerase chain reaction, real time methylation-specific polymerase chain reaction, PCR using methylated DNA-specific binding protein, quantitative PCR, The methylation level can be measured or detected using pyrosequencing, bisulfite sequencing, DNA methylation microarray, or immunoprecipitation using a methylated CpG binding domain or anti-methylcytosine antibody.
일예로, 본원의 방법은 (a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 DNA를 해당 유전자의 특정 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.As an example, the method herein includes the steps of (a) treating genomic DNA in the obtained sample with a compound that modifies unmethylated cytosine bases or a methylation-sensitive restriction enzyme; and (b) amplifying the treated DNA by PCR using primers capable of amplifying a specific CpG region of the gene.
상기 (a) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. The compound that modifies the unmethylated cytosine base in step (a) may be bisulfite, preferably sodium bisulfite. A method for detecting methylation of a gene by modifying unmethylated cytosine residues using bisulfite is widely known in the art.
또한, 상기 (a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. In addition, in step (a), the methylation sensitive restriction enzyme is a restriction enzyme capable of specifically detecting methylation of a specific CpG site, as described above, and may be a restriction enzyme containing CG as the recognition site of the restriction enzyme. , Examples include Sma I, Sac II, Eag I, Hpa II, Msp I, Bss HII, Bst UI, Not I, etc., but are not limited thereto.
상기 (b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.Amplification in step (b) may be performed by a conventional PCR method. As described above, the primers used at this time can be preferably designed according to the sequence of the specific CpG site to be analyzed for methylation, and each specifically amplifies cytosines that have been methylated and have not been modified by bisulfite. It may be a primer pair that can specifically amplify cytosine that is not methylated and thus modified by bisulfite.
상기 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 단계는, (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 (a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 해당 유전자의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다. The step of detecting the methylation level of a specific CpG region of the gene may further include the step of (c) confirming the presence or absence of the product amplified in step (b). The presence or absence of the amplified product in step (c) can be determined depending on whether a band at a desired position is detected by a method known in the art, for example, electrophoresis. For example, when a compound that modifies an unmethylated cytosine residue is used, two types of primer pairs are used in step (a), that is, a primer that can specifically amplify cytosine that is methylated and has not been modified by bisulfite. The degree of methylation can be determined based on the presence or absence of PCR results each amplified by a pair of primers that are not methylated and can specifically amplify cytosine modified by bisulfite. Preferably, methylation can be determined using a bisulfite genome sequencing method in which sample genomic DNA is treated with bisulfite, the CpG region of the gene is amplified by PCR, and the base sequence of the amplified region is analyzed. .
또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 CpG가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 CpG가 비메틸화 한 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.In addition, even when restriction enzymes are used, a method known in the art, for example, when a PCR result is obtained from mock DNA and a PCR result is obtained from DNA treated with a restriction enzyme, it is determined that the CpG is methylated, and the restriction enzyme is determined to be methylated. If there is no PCR result from the enzyme-treated DNA, whether the CpG is methylated can be determined by determining that it is unmethylated, and this is obvious to those skilled in the art. In the above, mock DNA refers to sample DNA that has been isolated from the sample and has not undergone any treatment.
유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 다른 예로, 메틸화 DNA 항체, 예를 들어 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸사이토신에 대한 항체를 이용한 면역침강방법을 예시할 수 있다. 예를 들어, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 5-메틸사이토신을 특이적으로 인지하는 항체를 이용하여 면역침강한 후 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing)등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다.Another example of detecting the methylation level of a specific CpG region of a gene may be an immunoprecipitation method using a methylated DNA antibody, for example, an antibody against a methylated CpG binding domain (MBD) or methylcytosine. . For example, after immunoprecipitation using an antibody that specifically recognizes the methylated CpG binding domain or 5-methylcytosine, specific CpG sites can be identified through Southern blot, PCR, microarray, or sequencing. You can.
이와 같은 방법에 따라, 대상 시료 내 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위가 고메틸화 상태로 검출되는 경우, 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 미리 예측할 수 있는 것이다.According to this method, if the CpG region of the KRT32 gene promoter in the target sample is detected in a highly methylated state, the risk of progression to Alzheimer's disease dementia can be predicted in advance.
따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, 유전자의 특정 CpG 부위의 메틸화 변화는 개체의 시료에서 특이적으로 나타나므로, 유전자의 메틸화 변화를 바이오마커로 사용하여 알츠하이머병 치매 예측에 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, KRT32 유전자의 특정 CpG 부위의 고메틸화를 바이오마커로 사용하여 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성 예측에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, according to the present invention, methylation changes in specific CpG regions of genes appear specifically in individual samples, and therefore, methylation changes in genes can be used as a biomarker to predict Alzheimer's disease dementia. For example, hypermethylation of a specific CpG region of the KRT32 gene can be used as a biomarker to predict the risk of progression to Alzheimer's disease dementia.
본 발명은 환자의 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 유전자 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하여 알츠하이머병 치매로의 진행 위험성을 예측하는 분자생물학적 진단법을 제공하며, 이는 간편하고 비침습적이며 경제적인 장점이 있다. 또한, DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고, 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다.The present invention provides a molecular biological diagnostic method that predicts the risk of progression to Alzheimer's disease dementia by measuring the degree of methylation of the CpG region of a specific gene in genomic DNA collected from a patient's sample. This method has the advantages of being simple, non-invasive, and economical. . Additionally, DNA methylation changes are easy to detect and have the advantage of being more stable and easier to analyze than conventional protein or RNA markers.
도 1은 DNA 메틸화 변이 분석에서 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군("MCI(non-AD)")과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군("Prodromal AD")에서 KRT32 유전자의 DNA 메틸화 정도의 차이를 나타낸 것이다.
도 2는 파이로시퀀싱 분석에서 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군("MCI(non-AD)")과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군("Prodromal AD")에서 KRT32 유전자의 DNA 메틸화 정도의 차이를 나타낸 것이다.
도 3은 KRT32 유전자의 DNA 메틸화 변화를 이용하여 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군("MCI(non-AD)")과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군("Prodromal AD")을 구별할 수 있는 유효성을 평가하기 위한 리시버-작동 특징 커브(ROC curve: receiver operating characteristics curve) 분석 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the difference in the degree of DNA methylation of the KRT32 gene in a group of patients with mild cognitive impairment without amyloid pathology (“MCI (non-AD)”) and a group of patients with mild cognitive impairment from Alzheimer’s disease (“Prodromal AD”) without amyloid pathology in DNA methylation mutation analysis. It is shown.
Figure 2 shows the difference in the degree of DNA methylation of the KRT32 gene in a group of patients with mild cognitive impairment without amyloid pathology (“MCI (non-AD)”) and a group of patients with mild cognitive impairment from Alzheimer’s disease (“Prodromal AD”) without amyloid pathology in pyrosequencing analysis. It is shown.
Figure 3 shows the effectiveness of distinguishing between a group of patients with mild cognitive impairment without amyloid pathology (“MCI (non-AD)”) and a group of patients with mild cognitive impairment from Alzheimer’s disease (“Prodromal AD”) using DNA methylation changes in the KRT32 gene. This shows the results of a receiver operating characteristics curve (ROC curve) analysis to evaluate .
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1. 연구대상Example 1. Research subject
알츠하이머병 환자군은 알츠하이머병 정상인지기능군 (preclinical Alzheimer’s disease, AD), 알츠하이머병 경도인지장애군 (prodromal Alzheimer’s disease), 알츠하이머병 치매군 (Symptomatic Alzheimer’s disease)의 세 군을 포함한다. 대조군으로는 정상 대조군 (정상인지기능이고, 아밀로이드 병리 소견이 없는 그룹), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 경도인지장애군 (mild cognitive impairment (MCI) due to non-AD), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 치매군 (dementia due to non-AD)의 세 군으로 구성된다. The Alzheimer's disease patient group includes three groups: preclinical Alzheimer's disease (AD), prodromal Alzheimer's disease, and Symptomatic Alzheimer's disease. The control group includes normal control group (normal cognitive function and no amyloid pathology), mild cognitive impairment (MCI) due to non-AD, and dementia not due to Alzheimer's disease. It consists of three groups: dementia due to non-AD.
상기 6군의 연구대상자의 진단 및 분류는 다음과 같은 네 단계에 따라 수행되었다:Diagnosis and classification of the six groups of study subjects were performed according to the following four steps:
첫 번째 단계로, 연구대상자와 대상자의 보호자와 함께, 신경과 의사의 구조화된 면담을 통해 병력을 청취하였다.In the first step, the medical history was taken through a structured interview by a neurologist, along with the research subjects and their guardians.
두 번째 단계로, 신경심리검사를 통해 현재 인지 기능의 저하된 정도 및 일상생활능력의 저하 여부를 판단하였다. 이 두 단계를 거치면서 인지기능 저하의 세 단계, 즉, 정상인지기능, 경도인지장애, 치매의 세 단계를 판단하였다. 정상인지기능군의 경우, 주관적 인지 저하의 호소와 별개로, 객관적인 신경심리검사의 모든 항목에서 표준 점수 (z score ≥-1.5) 이상의 검사 결과를 보여, 인지 저하의 객관적 소견이 없고, 일상생활능력의 손상이 없는 상태이다. 경도인지장애의 경우, 환자 또는 정보제공자의 기억력저하에 대한 호소가 있으며, 신경심리검사에서 표준점수에서 1.5 이하 (z score <-1.5)의 결과를 보여, 객관적인 기억력 저하가 있으나, 전반적인 인지기능과 일상생활능력이 유지되는 군이다. 치매군은 두 가지 이상의 인지영역에서 객관적인 저하 (표준점수 1.5 이하)의 소견을 보이고, 서서히 진행하는 임상양상과 함께, 일상생활능력의 손상으로 인해, 다른 사람의 보살핌이 필요한 군이다. In the second step, the degree of decline in current cognitive function and daily living skills were determined through neuropsychological testing. Through these two stages, three stages of cognitive decline were determined: normal cognitive function, mild cognitive impairment, and dementia. In the case of the normal cognitive function group, apart from complaints of subjective cognitive decline, all items of the objective neuropsychological test showed test results of standard scores (z score ≥-1.5) or higher, so there was no objective finding of cognitive decline and daily living ability. There is no damage. In the case of mild cognitive impairment, the patient or informant complains of memory decline, and neuropsychological tests show a standard score of 1.5 or less (z score <-1.5), indicating objective memory decline, but overall cognitive function and This is a group where daily living skills are maintained. The dementia group is a group that shows objective decline (standard score of 1.5 or less) in two or more cognitive domains, has a slowly progressive clinical pattern, and requires care from others due to impairment of daily living abilities.
세 번째 단계로, 혈액 검사 및 뇌의 구조적 영상 (computed tomography, CT 또는 magnetic resonance imaging, MRI), 뇌의 기능적 영상 (functional MRI, amyloid positron emission tomography, amyloid PET)을 시행하여, 인지 기능의 저하를 일으킬 수 있는 다른 원인을 배제하고, 뇌 안의 아밀로이드 병리소견의 축적 여부를 확인하였다. 인지 기능의 저하를 유발할 수 있는 다른 원인을 배제하는 것은 알츠하이머병 진단에서 중요한 단계로, 혈액검사에서 갑상선 호르몬의 기능 이상, 비타민 B12 또는 엽산 결핍증, 신경매독 등을 확인해서 이러한 가능성을 배제하는 것이 중요하며, 이외에도, 알코올 중독, 약물 중독, 주요 우울장애, 양극성 장애, 조현병, 경련 질환의 경우에도, 인지기능 저하와 연관이 있을 수 있으므로 배제하였다. 또한 뇌영상검사상, 구조적 뇌 이상, 예를 들면, 정상압수두증, 뇌졸중, 뇌종양 등의 이상을 배제하였고, 파킨슨병, 루이소체치매, 혈관성 치매와 같은 다른 신경퇴행성질환의 경우에도 배제하였다. 2018년 알츠하이머병의 연구용 진단기준에 따라, 아밀로이드 PET에서 양성인 경우 (Brain amyloid Plaque load, BAPL 2 or 3)의 경우, 알츠하이머병이 있다고 판단하였고, 임상 증상에 따라 preclinical, prodromal, 및 symptomatic AD 중 한 군으로 판단하였다. 아밀로이드 PET에서 음성 (BAPL 1)은 대조군으로 판단하고 임상 증상에 따라, 정상 대조군 (정상인지기능이고, 아밀로이드 병리 소견이 없는 그룹), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 경도인지장애군 (mild cognitive impairment (MCI) due to non-AD), 알츠하이머병에 의한 것이 아닌 치매군 (dementia due to non-AD) 중 한 군으로 결정하였다. 네 번째로, 이 세 단계의 임상 정보들을 종합하여, 6개의 군으로 최종적인 판단을 내렸다.In the third step, blood tests, brain structural imaging (computed tomography, CT or magnetic resonance imaging, MRI), and brain functional imaging (functional MRI, amyloid positron emission tomography, amyloid PET) are performed to detect decline in cognitive function. Other possible causes were ruled out, and the accumulation of amyloid pathology in the brain was confirmed. Ruling out other causes that may cause decline in cognitive function is an important step in diagnosing Alzheimer's disease. It is important to rule out these possibilities by checking blood tests for thyroid hormone dysfunction, vitamin B12 or folic acid deficiency, and neurosyphilis. In addition, alcoholism, drug addiction, major depressive disorder, bipolar disorder, schizophrenia, and convulsive disorders were also excluded because they may be associated with cognitive decline. In addition, structural brain abnormalities such as normal pressure hydrocephalus, stroke, and brain tumor were excluded on brain imaging tests, and other neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Lewy body dementia, and vascular dementia were also excluded. According to the 2018 research diagnostic criteria for Alzheimer's disease, if amyloid PET was positive (Brain amyloid plaque load, BAPL 2 or 3), it was determined that Alzheimer's disease was present, and depending on clinical symptoms, one of preclinical, prodromal, and symptomatic AD was diagnosed. It was judged as a group. Negative amyloid PET (BAPL 1) is considered as a control group and according to clinical symptoms, normal control group (group with normal cognitive function and no amyloid pathology), mild cognitive impairment (MCI) not caused by Alzheimer's disease. ) due to non-AD), or dementia not caused by Alzheimer's disease (dementia due to non-AD). Fourth, by combining the clinical information from these three stages, a final decision was made into six groups.
실시예 2. 피부생검 채취 및 피부 섬유아세포 배양Example 2. Skin biopsy collection and skin fibroblast culture
환자의 허벅지 안쪽에서 2 mm지름의 원통모양의 칼날을 이용하여 피부 생검을 채취하였다. 채취한 피부 생검을 6등분하여 피부 생검 조각이 잠길 정도의 배지 (DMEM/20% FBS)를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 24웰 세포 배양 플레이트에 넣고 7일 동안 피부 생검 조각 모서리에서 세포가 뻗어 나오는 것을 관찰하였다. 피부 생검 조각이 건조되는 것을 방지하기 위해 2-3일 간격으로 배지를 보충하였다. 7일 후 배지의 양을 500 μL로 늘리고 2-3일 간격으로 배지를 갈아주었고 14일 후 피부 생검 조각 주변으로 세포가 자라서 배양 웰의 외각까지 세포가 채워지면 35 mm 배양 디쉬로 옮겨서 배지의 우태아혈청(FBS)의 농도를 20%에서 10%로 낮춘 후 세포배양을 계속하였다. 세포가 35 mm 배양 디쉬의 80-90% 정도 채워지면 계대배양을 실시하였다. 계대배양을 2-3번 반복 실시하여 피부섬유아세포만 선택배양되면 SERPHINH1 항체를 이용하여 섬유아세포 마커인 SERPHINH1을 발현을 확인하였다.A skin biopsy was taken from the patient's inner thigh using a cylindrical blade with a diameter of 2 mm. The collected skin biopsy was divided into 6 parts, placed in a 24-well cell culture plate coated with 0.1% gelatin with medium (DMEM/20% FBS) sufficient to submerge the skin biopsy pieces, and cells were observed extending from the edges of the skin biopsy pieces for 7 days. observed. The medium was replenished every 2-3 days to prevent drying of the skin biopsy pieces. After 7 days, the amount of medium was increased to 500 μL and the medium was changed every 2-3 days. After 14 days, when the cells grew around the skin biopsy piece and the outer edge of the culture well was filled with cells, it was transferred to a 35 mm culture dish and cultured on the right side of the medium. After lowering the concentration of fetal serum (FBS) from 20% to 10%, cell culture was continued. Subculture was performed when the cells filled 80-90% of the 35 mm culture dish. When subculture was repeated 2-3 times and only skin fibroblasts were selectively cultured, the expression of SERPHINH1, a fibroblast marker, was confirmed using SERPHINH1 antibody.
실시예 3. Genomic DNA추출Example 3. Genomic DNA extraction
실시예 2에서 배양한 피부 섬유아세포에서 genomic DNA는 QIAmp DNA mini kit (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 추출방법은 제조사의 매뉴얼을 따라 실시하였다. 추출된 genomic DNA는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 정량하였으며, DNA 상태는 1% 아가로스 젤에서 전기영동하여 degradation 여부를 확인하였다.Genomic DNA was extracted from skin fibroblasts cultured in Example 2 using the QIAmp DNA mini kit (Qiagen). The extraction method was performed according to the manufacturer's manual. The extracted genomic DNA was quantified using a spectrophotometer, and the state of the DNA was checked for degradation by electrophoresis on a 1% agarose gel.
실시예 4. DNA 메틸레이션 변이 분석Example 4. DNA methylation mutation analysis
DNA 메틸레이션 변이 분석은 환자군과 대조군의 피부섬유아세포에서 DNA를 추출한 후 바이설파이트 전환(Bisulfite conversion)을 수행하여 비메틸화된 사이토신을 우라실로 바꾼 후, Infinium MethylationEPIC bead chip (illumina)을 사용하여 약 850,000 개의 CpG 부위에 대하여 메틸화 정도를 측정하였다. DNA 메틸화 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다. DNA methylation mutation analysis is performed by extracting DNA from skin fibroblasts of the patient and control groups, performing bisulfite conversion to change unmethylated cytosine to uracil, and then converting the unmethylated cytosine to uracil using an Infinium MethylationEPIC bead chip (illumina). The degree of methylation was measured for 850,000 CpG sites. The degree of DNA methylation is expressed as a β value ranging from 0 to 1. A β value of 0 means that the corresponding CpG site is completely unmethylated, and 1 means that it is completely methylated.
환자군과 대조군에서 차별적으로 메틸화되어 있는 유전자 (Differentially methylated genes, DMGs)를 확인하기 위하여 independent t-test 방법을 사용하였다. 최종적으로 p value<0.05이면서 절대값 β 차이≥0.3 인 프로모터 CpG 부위를 차별적으로 메틸화되어 있는 CpG 부위(differentially methylated CpG site)로 선정하고, 이 중에서 CpG 부위의 메틸화 정도가 변한 유전자를 DMG로 선정하였다.The independent t-test method was used to identify differentially methylated genes (DMGs) in the patient and control groups. Finally, the promoter CpG site with p value <0.05 and absolute value β difference ≥0.3 was selected as a differentially methylated CpG site, and among these, the gene in which the degree of methylation of the CpG site changed was selected as DMG. .
실시예 5. 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing) 분석Example 5. Pyrosequencing analysis
KRT32 (Keratin 32) 유전자의 특정 CpG 부위 (cg25598400, Chr17: 41467824)의 메틸레이션 정도를 측정하기 위하여 파이로시퀀싱 분석을 시행하였다. 바이설파이트를 처리한 gDNA를 주형으로 PCR을 시행하였다. 이때 PCR 프라이머는 PSQ assay design program (Qiagen, USA)를 이용하여 디자인하였다. 디자인된 PCR 프라이머의 염기서열은 아래와 같다:Pyrosequencing analysis was performed to measure the degree of methylation of a specific CpG region (cg25598400, Chr17: 41467824) of the KRT32 (Keratin 32) gene. PCR was performed using bisulfite-treated gDNA as a template. At this time, PCR primers were designed using the PSQ assay design program (Qiagen, USA). The base sequences of the designed PCR primers are as follows:
정방향 프라이머, 5'- AGTAGTGGTTGTTTTTTTTAATGAAAGTAT -3' (서열번호 2)Forward primer, 5'- AGTAGTGGTTGTTTTTTTTAATGAAAGTAT -3' (SEQ ID NO: 2)
비오티닐화된 역방향 프라이머, 5'- CCTCTAAAATTCCTATTCCTTTCTACT -3' (서열번호 3)Biotinylated reverse primer, 5'- CCTCTAAAATTCCTATTCCTTTTCTACT -3' (SEQ ID NO: 3)
PCR 반응액은 20 ng 이하의 바이설파이트-전환된 gDNA, 10 μl 2' Hot/Start PCR premix (Enzynomics), 1 μl 정방향 프라이머 (10 pmole/μl), 1 μl 비오티닐화된 역방향 프라이머 (10 pmole/μl)를 포함하여 총 부피가 20 μl가 되도록 준비하였다. PCR 반응은 95℃에서 10분간 초기 변성(Denature) 과정을 거친 후, 변성(Denature) 과정을 95℃에서 30초, 부착(anealing) 과정을 56℃에서 30초, 신장(extention) 과정을 72℃에서 30초 동안 실시하고 이 과정을 50회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분간 반응하여 최종 신장 과정을 거쳤다. PCR 반응이 끝난 후 반응액 2 μl를 취하여 2.5% 아가로스 겔에서 전기영동하고 브롬화에티듐 염색을 통해 PCR 최종산물의 염기서열 크기를 확인하였다.The PCR reaction solution contained 20 ng or less of bisulfite-converted gDNA, 10 μl 2' Hot/Start PCR premix (Enzynomics), 1 μl forward primer (10 pmole/μl), and 1 μl biotinylated reverse primer (10 μl). It was prepared so that the total volume, including pmole/μl), was 20 μl. The PCR reaction goes through an initial denaturation process at 95°C for 10 minutes, followed by a denaturation process at 95°C for 30 seconds, annealing process at 56°C for 30 seconds, and extension process at 72°C. This was performed for 30 seconds and this process was repeated 50 times. Finally, the final elongation process was performed by reacting at 72°C for 10 minutes. After the PCR reaction was completed, 2 μl of the reaction solution was electrophoresed on a 2.5% agarose gel, and the base sequence size of the final PCR product was confirmed through ethidium bromide staining.
PCR 최종산물을 스트렙타비딘 세파로스 HP 비즈 (Amersham Biosciences)를 이용하여 ssDNA 주형이 되도록 준비하였다. 반응액은 1-2 μl 비즈, 40 μl 결합 완충액, 16-18 μl PCR 산물, 고 순도수를 포함하여 총 부피가 80 μl가 되도록 샘플별로 준비한 후 PCR 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 플레이트를 봉입한 후 오비탈 쉐이커를 이용하여 1400 rpm에서 15-20분간 잘 섞어주었다. PyroMark annealing 완충액을 이용하여 시퀀싱 프라이머의 농도가 0.3 μM이 되도록 희석한 후 각 웰에 25 μl씩 분주하고 PCR 플레이트를 PyroMark Q48 (Qiagen)기기의 워크스테이션에 장착하여 시퀀싱 분석을 실시하였다. 이때 사용한 시퀀싱 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: 시퀀싱 프라이머 5'- GGGTGGTAGAAATTGT -3' (서열번호 4)The final PCR product was prepared as an ssDNA template using Streptavidin Sepharose HP beads (Amersham Biosciences). The reaction solution was prepared for each sample to have a total volume of 80 μl, including 1-2 μl beads, 40 μl binding buffer, 16-18 μl PCR product, and high purity water, and then dispensed into each well of the PCR plate. After enclosing the plate, it was mixed well at 1400 rpm for 15-20 minutes using an orbital shaker. After diluting the sequencing primer to a concentration of 0.3 μM using PyroMark annealing buffer, 25 μl was dispensed into each well, and the PCR plate was mounted on a PyroMark Q48 (Qiagen) workstation for sequencing analysis. The base sequence of the sequencing primer used at this time is as follows: Sequencing primer 5'- GGGTGGTAGAAATTGT -3' (SEQ ID NO: 4)
KRT32 유전자의 특정 CpG 부위 (cg25598400, Chr17:41467824)의 DNA 메틸화 백분율은 아래와 같이 산출하였다. 생성된 PCR 산물의 염기서열은 5'- AGTAGTGGTTGTTTTTTTTAATGAAAGTATTTTTTATGGGAAGAGGTTTGGTTATTTAATAAGGAAATGTGTGGGTGGTAGAAATTGTTT Y GATGTTGGTAGCGGTATAAATTTAGTAGAAAGGAATAGGAATTTTAGAGG -3' (서열번호 5)이며 Y (C 또는 T)로 표시된 위치의 사이토신 염기의 비율을 백분율로 계산하였다: C/C+T *100 (%)The DNA methylation percentage of a specific CpG site (cg25598400, Chr17:41467824) of the KRT32 gene was calculated as follows. The base sequence of the generated PCR product is 5'- AGTAGTGGTTGTTTTTTTTAATGAAAGTATTTTTTATGGGAAGAGGTTTGGTTATTTAATAAGGAAATGTGTGGGTGGTAGAAATTGTTT Y GATGTTGGTAGCGGTATAAATTTAGTAGAAAGGAATAGGAATTTTAGAGG -3' (SEQ ID NO: 5), and the ratio of cytosine bases at the position indicated by Y (C or T) was calculated as a percentage: C/C+T * 100 (%)
실험결과Experiment result
1. 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 질환 특이적 DNA 메틸화의 변화 확인1. Confirmation of disease-specific DNA methylation changes in Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group
2018년부터 2019년까지 이화여대 목동병원에 내원한 환자를 대상으로, 20명의 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 28명의 알츠하이머병 경도인지장애 환자군의 피부조직으로부터 피부섬유아세포를 배양하여 게놈 DNA를 추출하였다. Illumina Human MethylationEPIC bead chip을 이용하여 DNA 메틸화 프로파일을 분석하였고, 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 비교하여 알츠하이머병 경도인지장애 환자군의 피부섬유아세포 내 유전자 프로모터의 특정CpG 부위에서 에서 20% 이상 DNA 메틸화가 변화한 유전자를 선별하였다. 이 선별된 유전자들 가운데 KRT32 (Keratin 32) 유전자는 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군에 비해 알츠하이머병 경도인지장애 환자군의 피부섬유아세포에서 특정 프로모터 CpG 부위 DNA 메틸화가 21% 증가되어 있음을 확인하였다.Genomic DNA was obtained by culturing skin fibroblasts from skin tissue of 20 patients with mild cognitive impairment without amyloid pathology and 28 patients with mild cognitive impairment with Alzheimer's disease in patients who visited Ewha Womans University Mokdong Hospital from 2018 to 2019. was extracted. The DNA methylation profile was analyzed using the Illumina Human MethylationEPIC bead chip, and compared to the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology, more than 20% of DNA was found in the specific CpG region of the gene promoter in skin fibroblasts of the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group. Genes with changed methylation were selected. Among these selected genes, the KRT32 (Keratin 32) gene was confirmed to have a 21% increase in DNA methylation at the specific promoter CpG region in skin fibroblasts from the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group compared to the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology. .
(difference)(difference)
1)One)
아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 KRT32 유전자의 DNA 메틸화 정도의 차이를 도 1에 scatter dot plot으로 나타냈으며, 평균 ± 표준오차 (mean ± SEM) 값을 표시하였다.The difference in the degree of DNA methylation of the KRT32 gene between the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology and the mild cognitive impairment patient group with Alzheimer's disease is shown in a scatter dot plot in Figure 1, and the mean ± standard error (mean ± SEM) values are shown.
2. DNA 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머병 치매 예측진단 마커의 선정2. Selection of predictive diagnostic markers for Alzheimer's disease and dementia using DNA methylation changes
파이로시퀀싱 분석을 이용하여 KRT32유전자 특정 CpG 부위 (cg25598400)의 DNA 메틸화 정도를 측정한 결과, Human MethylationEPIC bead 결과와 유사하게 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군에 비해 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 KRT32유전자 특정 프로모터 CpG 부위 (cg25598400)의 DNA 메틸화가 21% 증가되어 있음을 확인하였다 (도 2).As a result of measuring the DNA methylation level of the KRT32 gene-specific CpG site (cg25598400) using pyrosequencing analysis, similar to the Human MethylationEPIC bead results, KRT32 was found in the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group compared to the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology. It was confirmed that DNA methylation of the gene-specific promoter CpG site (cg25598400) was increased by 21% (Figure 2).
또한, 리시버-작동 특징 커브(ROC curve: receiver operating characteristics curve) 를 이용하여 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군을 구별할 수 있는지 확인하였다. 일반적으로 ROC 커브의 곡선하 면적(AUC; Area under the curve) 수치에 따라 비정보적(AUC=0.5), 덜 정확한(0.5<AUC≤0.7), 중등도의 정확한(0.7<AUC≤0.9), 매우 정확한(0.9<AUC<1.0) 그리고 완벽한 검사(AUC=1.0)로 분류한다.In addition, the receiver operating characteristic curve (ROC curve) was used to determine whether it was possible to distinguish between a group of patients with mild cognitive impairment without amyloid pathology and a group of patients with mild cognitive impairment from Alzheimer's disease. In general, depending on the area under the curve (AUC) value of the ROC curve, it can be classified as uninformative (AUC=0.5), less accurate (0.5<AUC≤0.7), moderately accurate (0.7<AUC≤0.9), and very accurate. Classified as accurate (0.9<AUC<1.0) and perfect (AUC=1.0) tests.
KRT32의 경우 알츠하이머병 경도인지장애 환자군에서 고메틸화되어 있었으며 이 고메틸화는 아밀로이드 병리소견이 없는 경도인지장애 환자군과 알츠하이머병 경도인지장애 환자군을 높은 정확도(AUC = 0.8)로 구분할 수 있음을 확인하였다 (도 3). In the case of KRT32, it was highly methylated in the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group, and it was confirmed that this hypermethylation can distinguish the mild cognitive impairment patient group without amyloid pathology from the Alzheimer's disease mild cognitive impairment patient group with high accuracy (AUC = 0.8) ( Figure 3).
이러한 결과는 알츠하이머병 경도인지장애 환자의 피부 섬유아세포에서 나타나는 KRT32 유전자의 질환 특이적 고메틸화가, 비침습적인 방법으로 알츠하이머병 경도인지장애 환자 중 알츠하이머병 치매로의 진행 여부를 미리 예측하는 알츠하이머병 치매 예측진단 마커로 유효하다는 것을 나타낸다. These results show that disease-specific hypermethylation of the KRT32 gene, which appears in skin fibroblasts of patients with mild cognitive impairment from Alzheimer's disease, can be used to predict in advance whether patients with mild cognitive impairment from Alzheimer's disease will progress to Alzheimer's disease dementia in a non-invasive way. It indicates that it is effective as a predictive diagnostic marker for dementia.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art will understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing its technical idea or essential features. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as including the meaning and scope of the patent claims described below rather than the detailed description above, and all changes or modified forms derived from the equivalent concept thereof are included in the scope of the present invention.
Claims (10)
상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는, 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 조성물.According to paragraph 1,
Agents for measuring the methylation level of the CpG region of the gene promoter include a compound that modifies an unmethylated cytosine base or a methylation-sensitive restriction enzyme, a primer specific for the methylated sequence of the CpG region of the gene promoter, and an unmethylated sequence. A composition comprising a specific primer, a methylated CpG binding domain, or an antibody that specifically binds to methylcytosine.
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 조성물.According to paragraph 2,
A composition wherein the compound that modifies the unmethylated cytosine base is bisulfite or a salt thereof.
상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI인 조성물.According to paragraph 2,
The composition wherein the methylation sensitive restriction enzyme is Sma I, Sac II, Eag I, Hpa II, Msp I, Bss HII, Bst UI or Not I.
상기 메틸화 수준을 알츠하이머병이 아닌 대조군 시료의 해당 유전자에서의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 더욱 포함하는 방법.According to clause 6,
The method further comprising comparing the methylation level with the methylation level in the corresponding gene in a control sample not suffering from Alzheimer's disease.
상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준의 측정 단계는
(a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
(b) 상기 처리된 DNA를 KRT32 유전자 프로모터의 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 방법.According to clause 6,
The step of measuring the methylation level of the CpG region of the gene promoter is
(a) treating the genomic DNA in the obtained sample with a compound that modifies unmethylated cytosine bases or a methylation-sensitive restriction enzyme; and
(b) A method comprising the step of amplifying the treated DNA by PCR using primers capable of amplifying the CpG region of the KRT32 gene promoter.
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 방법.According to clause 8,
The method wherein the compound that modifies the unmethylated cytosine base is bisulfite or a salt thereof.
상기 메틸화 수준을 검출하는 방법은 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, DNA 메틸레이션 마이크로어레이, 및 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강법으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법. According to clause 6,
Methods for detecting the methylation level include methylation-specific polymerase chain reaction, real time methylation-specific polymerase chain reaction, and PCR using a methylated DNA-specific binding protein. , quantitative PCR, pyrosequencing, bisulfite sequencing, DNA methylation microarray, and immunoprecipitation using a methylated CpG binding domain or anti-methylcytosine antibody.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020220089815A KR20240012660A (en) | 2022-07-20 | 2022-07-20 | Predicting biomarker for progression of Alzheimer’s dementia using alteration in DNA methylation of KRT32 gene |
| PCT/KR2023/010461 WO2024019556A1 (en) | 2022-07-20 | 2023-07-20 | Predictive diagnostic marker for alzheimer's disease using dna methylation change in krt32 gene |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220089815A KR20240012660A (en) | 2022-07-20 | 2022-07-20 | Predicting biomarker for progression of Alzheimer’s dementia using alteration in DNA methylation of KRT32 gene |
Publications (1)
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