KR20240004718A - 스페솔리맙의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-IL36R 항체 스페솔리맙의 제조방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 감소된 구리 및 증가된 철 농도의 존재하에서 유가식 배양에서 무혈청 세포 배양 배지로 스페솔리맙을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 낮은 수준의 스페솔리맙 염기성 종 및/또는 높은 만노스 구조를 갖는 낮은 수준의 스페솔리맙 종을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

스페솔리맙의 제조방법

본 발명은 항-IL36R 항체 스페솔리맙의 제조방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 감소된 구리 및 증가된 철 농도의 존재하에 유가식 배양에서 무혈청 세포 배양 배지로 스페솔리맙을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 낮은 수준의 스페솔리맙의 염기성 종 및/또는 높은 만노스 구조를 갖는 낮은 수준의 스페솔리맙 종을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

재조합 단클론 항체(mAb)는 일반적으로 포유류 세포 배양에서 발현된다. 수확된 항체는 전하 및 크기와 같은 특성이 상이한 생성물 변이체(product variant)를 함유하며, 이를 생성물 이질성(product heterogeneity)이라고도 한다. 이질성의 주요 원인은 세포 배양 동안 발생하는 번역후 변형(post-translational modification) 및 분해(degradation)이다. 항체는 전형적으로 여러 단계의 여과 및 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그러나, 다운스트림 처리를 통해 모든 이질성을 제거하는 것은 실용적이지 않다. 따라서, 세포 배양 단계 동안 발생하는 변형 및 분해는 최종 생성물 품질에 가장 유의한 영향을 미친다. 번역후 변형으로 인한 이질성은 단클론 항체의 생성물 품질, 안전성 및 효능에 영향을 미칠 수 있다. 주요 품질 특성은 당화(glycosylation), 전하 변이체(산화, 탈아미드화 및 C- 및 N-말단 변형 종과 같은 염기성 및 산성 종), 응집체 및 저분자량 종(LMW)을 포함한다. 업스트림 공정은 번역후 변형 및 기타 변형을 포함하여 항체의 생성물 특성에 강한 영향을 미치며, 이들은 개별 항체 및 세포주에 따라 다를 수 있다. 바이오 의약품 생산에 가장 널리 사용되는 세포주는 원래 중국 햄스터 난소(CHO 세포)에서 유래되었으며 현재 대부분의 재조합 단클론 항체는 유가식 배양에서 생산된다.

항-IL-36 수용체(IL-36R) 항체 스페솔리맙은 IL-36 리간드-매개 신호전달을 감소시키거나 차단하며, 이러한 신호전달과 관련된 질환 또는 병태를 치료하는 데 유용하다.

인터루킨 36(IL-36)은 전염증성 효과를 갖는 IL-1 계열의 사이토카인 그룹이다. IL-36 계열에는 IL-36α(IL-1F6), IL-36β(IL-1F8), IL-36γ(IL-1F9) 및 IL-36Ra(IL-1F5)의 4가지 구성원이 있으며, 모두 IL-36R(이전에는 IL-1Rrp2라고 함)에 결합하여 IL-1RAcP와 이종이량체를 형성한다. IL-36R 리간드는 다수의 질환 상태에 관여하며 항IL-36R 항체 스페솔리맙은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 크론병(Crohn's disease, CD), 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UD), 아토피 피부염(atopic dermatitis, AtD), 손발바닥 농포증(palmoplantar pustulosis, PPP) 및 전신 농포성 건선(generalized pustular psoriasis, GPP)과 같은 염증성 질환 및 자가면역 질환의 치료에 효과적이다.

업스트림 공정 및 매개변수는 항체의 생성물 특성에 강한 영향을 미치며, 여기에는 온도 및 시딩 밀도와 같은 공정 단계 및 세포 배양 배지가 포함된다. 세포 배양 배지는 이들의 자연 기원과 달리 기술 시스템에서 현탁액에서 배양된 포유류 세포의 복잡한 영양 요건을 충족해야 한다.

세포 배양 배지는 대부분 에너지원, 예를 들어 탄수화물 또는 아미노산, 지질, 비타민, 미량 원소, 염, 성장 인자, 폴리아민, 및 비영양 성분, 예를 들어 완충액, 계면활성제 또는 소포제로 구성된다. 유가식 배양에 사용되는 배지는 두 가지 하위 그룹으로 나눌 수 있다: 공정 배지(P-배지) 또는 기초 배지 및 공급 배지(F-배지). 기초 배지는 모든 필수 성분을 초기 농도로 함유하며 접종에 사용된다. 공급 배지는 주로 배양 공정 동안 영양소를 고농도로 제공한다. 따라서, 세포 배양 배지는 다수의 상이한 화합물들의 복잡한 조성물이며, 개선된 성장, 생산성 또는 생성물 품질을 야기하는 화합물을 식별하는 것은 어렵다. 미량 금속은 락테이트 소비, 에너지 대사, 생산성 및 생성물 품질을 포함한 최적의 mAb 생산성 및 품질에 필요한 CHO 세포 배양에서의 다양한 세포내 및 세포외 기능을 용이하게 한다. 세포 배양 배지에서 일반적으로 사용되는 미량 금속은 철, 구리, 아연 및 망간이며, 이들은 전통적으로 태아 송아지 혈청과 함께 첨가되어 왔으며 로트간 변동성으로 인해 다양한 결과를 야기하였다. 화학적으로 규명된 배지에서, 미량 원소 및 영양소는 규명된 농도로 공급되며 미량 금속의 결핍 또는 과잉은 생산성 및 생성물 품질 뿐만 아니라 세포 성장 또는 생존력과 같은 세포 배양 성능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 아연 결핍은 포유류 세포의 조기 사멸을 유도하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 마그네슘 및 칼슘 결핍은 CHO 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났으며, 구리 결핍은 CHO 세포에서 락테이트 대사에 영향을 미치는 것으로 나타났다(Graham R. J., Bhatia H., Yoon S., Biotechnology and Bioengineering, 2019, 116: 3446-3456). 또한 과잉 구리는 mAb 생산성의 증가 뿐만 아니라 염기성 전하 변이체의 증가도 나타내는 것으로 보고되었다. 따라서, 수율에 큰 영향을 미치지 않으면서 생성물 품질을 개선하기 위해 배양 조건을 더욱 개선해야 할 필요성이 남아 있다.

본 발명에서, 본 발명자들은 낮은 염기성 종 및 낮은 수준의 만노스 5 구조를 갖는 종과 같은 특정 생성물 특성을 갖는 항체를 생성하는, 항체 스페솔리맙에 대한 효율적이고 효과적인 생산 공정을 가능하게 하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 (a) (i) 배양 배지에서 세포를 시딩하는 단계, 및 (ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 Cu^{2 +}는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다); (b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및 (c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, Cu^{2 +} 및 철은 단계 (i)에서 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 1일 이내에 배양 배지에 첨가된다. 하나의 양태에서, Cu^{2 +} 및/또는 철은 하나 이상의 볼루스 첨가로서 또는 연속적으로 배양 배지에 첨가된다. 하나 이상의 볼루스 첨가는 Cu^{2 +} 및/또는 철에 기본 배지를 제공하는 것을 포함한다. 특정 양태에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산은 CHO 게놈에 안정적으로 통합된다. 상기 방법은 세포에 공급 배지를 공급하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 공급 배지는 배양 0일째 내지 3일째부터 시작하여, 바람직하게는 1일째 내지 3일째부터 시작하여, 보다 바람직하게는 1일째 내지 2일째째부터 시작하여, 더욱 더 바람직하게는 1일째에 첨가된다. 본 발명의 방법에서, 배양 배지 중의 증가된 철 농도 및/또는 감소된 구리 농도는 감소된 % 염기성 피크 그룹(BPG)를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래한다. 특정의 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 항체 스페솔리맙은 ≤7.5% BPG를 갖는다.

상기 방법은 시딩 밀도를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 단계 (a)에서의 시딩 밀도는 ≥0.7x10⁶개 세포/ml, 바람직하게는 0.7x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게는 0.8x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게는 0.9x10⁶개 세포/ml 내지 1.3x10⁶개 세포/ml이다. 증가된 시딩 밀도는 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래한다. 상기 방법은 배양 온도 및/또는 용존 산소 농도를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 증가된 배양 온도 및/또는 감소된 용존 산소(DO)는 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래한다. 특정 양태에서, 세포는 36.0℃ 내지 37.5℃에서 세포에 공급 배지를 공급함을 포함하여 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에서 배양되고/되거나 상기 배양물 중의 용존 산소 농도는 30 내지 60%의 범위 내에서 유지된다. 특정 양태에서, 항체 스페솔리맙은 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조, 및/또는 ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG, 바람직하게는 ≤ 6% BPG를 갖는다.

임의의 CHO 세포가 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있지만, 예시적인 CHO 세포는 CHO-K1 및 CHO-DG44 세포이다.

또 다른 양태에서, (a) (i) 배양 배지에서 세포를 ≥0.7x10⁶개 세포/ml의 세포 밀도로 시딩하는 단계, 및 (ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 Cu^{2 +}는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다); (b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및 (c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명은 추가로, (a) ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG; 및/또는 (b) 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조; 및/또는 (c) 중쇄(HC)의 3% 미만 라이신 당화 변이체를 갖고/갖거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)은 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화는 0.3% 미만인 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 항체 스페솔리맙은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된다.

항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물은 수확 세포 배양액(HCCF), 친화성 포획 풀(affinity capture pool), 원료의약품(drug substance) 또는 의약품(drug product)일 수 있으며, 바람직하게는 원료의약품 또는 의약품일 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 7.5% 미만 BPG 및/또는 5% 미만 Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙을 포함하는 의약품이다. 특정 양태에서, 조성물 중의 항체 스페솔리맙은 ≤ 6% 중쇄(HC)의 라이신 당화 변이체를 포함하고/하거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)은 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화는 ≤ 0.3%이다.

본 발명은 추가로, 중쇄(HC)에 ≤ 3% 라이신 당화 변이체를 갖고/갖거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)이 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화가 ≤ 0.3%인 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물을 제공한다.

도 1은 DoE 접근법의 실시예에 기재된 바와 같이 다양한 Fe 농도(μM) 및 다양한 Cu^{2 +} 농도(μM)가 생성물 품질에 미치는 영향을 보여준다. (a) Cu^{2 +} 및 철에 대한 강한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC(HP-SCX)에 의해 측정된 바와 같은 BPG(%)에 대한 다양한 철 및 구리 농도의 영향을 등고선 플롯으로 보여준다. (b) 강한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC(HP-SCX)에 의해 측정된 바와 같은 BPG(%)에 대한 다양한 구리 농도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다. (c) 강한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC(HP-SCX)에 의해 측정된 바와 같은 BPG(%)에 대한 다양한 철 농도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다. 단일 요인 플롯의 점선은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 또한 (d) 생성물 농도(mg/L), (e) IVC(1e6 세포 *h/mL) 및 (f) 생존율(%)에 대한 다양한 철 및 구리 농도의 영향을 등고선 플롯으로 보여준다.
도 2는 DoE(시험 설계) 접근법의 실시예에 기재된 바와 같이 다양한 시딩 밀도(1e6 세포/ml, 요인 1), 배양 온도(℃, 요인 2), 용존 산소(DO %, 요인 3) 및 공급 속도(mL/L/일, 요인 4)가 생성물 품질에 미치는 영향을 보여준다. (a) 강한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC(HP-SCX)에 의해 측정된 바와 같은 BPG(%)에 대한 다양한 배양 온도 및 시딩 밀도의 영향을 등고선 플롯으로 보여준다. (b) 강한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC(HP-SCX)에 의해 측정된 바와 같은 BPG(%)에 대한 다양한 시딩 밀도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다. (c) 강한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC(HP-SCX)에 의해 측정된 바와 같은 BPG(%)에 대한 다양한 배양 온도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다. (d) 다양한 시딩 세포 밀도의 영향을 Man5 구조에 대한 단일 요인 플롯으로 보여준다(올리고 맵 피크(Oligo Map Peak) 3(%)). (e) 다양한 배양 온도의 영향을 Man5 구조에 대한 단일 요인 플롯으로 보여준다(올리고 맵 피크 3(%)). 단일 요인 플롯의 점선은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 또한 (f) 생성물 농도(역가, mg/L), (g) IVC(1e6 세포 *h/mL) 및 (h) 생존율(%)에 대한 다양한 온도 및 시딩 밀도의 영향을 등고선 플롯으로 보여준다.
도 3은 DoE 접근법의 실시예에 기재된 바와 같은 다양한 시딩 밀도(1e6 세포/ml, 요인 1), 배양 온도(℃, 요인 2), 용존 산소(DO %, 요인 3) 및 공급 속도(ml/L/일, 요인 4)의 영향을 보여준다. (a) 강한 양이온 교환 크로마토그래피 HPLC(HP-SCX)에 의해 측정된 바와 같은 BPG(%)에 대한 다양한 DO 농도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다. (b) Man5 구조에 대한 다양한 DO 농도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다(올리고 맵 피크 3(%)). (c) 생성물 농도(역가, mg/L)에 대한 다양한 DO 농도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다. (d) IVC(1e6 세포*h/mL)에 대한 다양한 DO 농도의 영향을 단일 요인 플롯으로 보여준다. 단일 요인 플롯의 점선은 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 4는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용한 스페솔리맙 이질성 프로파일을 보여준다. (a) 산성 및 염기성 피크의 주석이 있는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 크로마토그래프 프로파일을 보여준다. (b) 확대된 스케일에서 (a)에서와 동일한 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 크로마토그래프 프로파일을 보여준다. (c) 상이한 단일 산성 피크 분획으로부터 수집된 CEX 크로마토그램을 오버레이로 보여한다.
도 5는 형광 검출과 함께 HILIC-UHPLC를 사용한 스페솔리맙의 대표적인 올리고당 패턴을 보여준다. 피크 1 내지 6으로 표시된 주요 올리고 맵 피크를 보여준다. 피크 1 = A1FG0 (Asialylated-agalactosylated core-fucosylated monoantennary), 피크 2 = A2FG0 (Asialylated-agalactosylated core-fucosylated biantennary), 피크 3 = Man5 펜타만노스 코어, 피크 4 = A2FG1 (Asialylated-nogalactosylated core-fucosylated biantennary), 피크 5 = A2FG1 (Asialylated-monogalactosylated core-fucosylated biantennary), 피크 6) = A2FG2 (Asialylated-digalactosylated core-fucosylated biantennary). x축은 크로마토그램의 적분 범위를 분 단위로 보여주고 y축은 형광을 전압 신호로 보여준다.

일반적인 양태 "포함하는" 또는 "포함된"은 보다 구체적인 양태 "구성된"을 포함한다. 또한, 단수형 및 복수형은 제한적인 방식으로 사용되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "세포 배양 배지" 또는 "배양 배지"는 바람직하게 완충된 배지에 비타민, 미량 원소, 염, 벌크 염, 아미노산, 지질, 탄수화물과 같은 최소한의 필수 영양소 및 성분을 포함하는 포유류 세포를 배양하는 배지이다. 전형적으로, 포유류 세포를 위한 세포 배양 배지는 약 6.5 내지 약 7.5, 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.3, 보다 바람직하게는 약 7의 pH와 같은 약 중성 pH를 갖는다. 이러한 세포 배양 배지에 대한 비제한적인 예는 상업적으로 이용 가능한 배지, 예를 들어 Ham's F12(Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640(Sigma), 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM; Sigma), 최소 필수 배지(MEM; Sigma), Iscove의 개질된 둘베코 배지(IMDM; Sigma), CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invitrogen), 무혈청 CHO 배지(Sigma), 및 무단백질 CHO 배지(Sigma) 등 뿐만 아니라 제WO 2016/156476호에 개시된 것과 같은 다양한 출처로부터의 독점 배지를 포함하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 세포 배양 배지는 기초 세포 배양 배지일 수 있다. 세포 배양 배지는 또한 공급 배지 및/또는 첨가제가 첨가된 기초 세포 배양 배지일 수 있다. 세포가 발효기 또는 생물반응기에서 배양되는 경우, 세포 배양 배지는 또한 발효 브로스로 지칭될 수 있다.

용어 "세포 배양(cell cultivation)" 또는 "세포 배양(cell culture)"은 모든 상이한 공정 모드(예를 들어, 배치식, 유가식, 관류, 연속 배양), 모든 공정 제어 모드(예를 들어, 비제어된 시스템, 완전 자동화된 시스템, 및 예를 들어 pH, 온도, 산소 함량을 제어하는 제어 시스템), 모든 종류의 발효 시스템(예를 들어, 일회용 시스템, 스테인리스 강 시스템, 유리 제품 시스템)의 모든 규모(예를 들어, 미세 역가 플레이트에서 대규모 산업용 생물반응기까지, 즉, mL 미만 규모에서 > 10.000L 규모까지)의 세포 배양 및 발효 공정을 포함한다. 본 발명에 따르면 세포 배양은 포유류 세포 배양이며, 유가식 배양이다. 바람직한 양태에서 세포 배양은 > 10L, > 1.000L, > 5000L 및 보다 바람직하게는 > 10.000L 용적의 세포 배양이다.

본원에 사용된 용어 "유가식"은 세포에 영양소를 함유하는 공급 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 공급하는 세포 배양에 관한 것이다. 공급은 세포 배양을 시작한 직후 0일째에 보다 전형적으로는 배양을 시작한지 1일, 2일 또는 3일 후에 시작될 수 있다. 공급은 매일, 이틀마다, 3일마다 등과 같이 미리 설정된 일정을 따를 수 있다. 대안적으로, 세포 성장, 영양소 또는 독성 부산물에 대해 배양을 모니터링할 수 있으며 그에 따라 공급을 조정할 수 있다. 일반적으로, 다음 매개변수가 종종 매일 결정되며 생존 가능한 세포 농도, 생성물 농도(역가) 및 글루코스, pH, 락테이트, 삼투압(염분 함량에 대한 척도) 및 암모늄(성장 속도에 부정적인 영향을 미치고 생존 가능한 바이오매스를 감소시키는 성장 억제제)과 같은 여러 대사산물을 포함한다. 배치식 배양(공급 없이 배양함)과 비교하여, 유가식 모드에서 더 높은 생성물 역가가 달성될 수 있다. 전형적으로, 유가식 배양은 일정 지점에서 중단되고 세포 및/또는 배지가 수확되고 항체 스페솔리맙과 같은 관심 생성물이 단리 및/또는 정제된다. 유가식 공정은 전형적으로 약 2 내지 3주, 예를 들어 약 10 내지 24일, 약 12 내지 21일, 약 12 내지 18일, 바람직하게는 약 12 내지 16일 동안 유지된다.

본원에 사용된 용어 "기초 배지" 또는 "기초 세포 배양 배지"는 아래에 규명된 바와 포유류 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지이다. 이것은 세포 배양 실행의 시작부터 세포가 배양되는 배지를 지칭하며, 배지에 다양한 성분이 첨가될 수 있지만 또 다른 배지에 첨가제로서 사용되지 않는다. 기초 배지는 선택적으로 추가 첨가제(또는 보충제) 및/또는 공급 배지가 배양, 즉 세포 배양 실행 동안 첨가되어 세포 배양 배지를 야기할 수 있는 베이스로서 역할을 한다. 기초 세포 배양 배지는 세포 배양 과정의 시작부터 제공된다. 일반적으로, 기초 세포 배양 배지는 탄소원, 아미노산, 비타민, 벌크 염(예를 들어, 염화나트륨 또는 염화칼륨), 다양한 미량 원소(예를 들어, 철, 구리, 아연 및 망간), pH 완충제, 지질 및 글루코스와 같은 영양소를 제공한다. 주요 벌크 염은 통상적으로 기초 배지에서만 제공되며, 세포 배양이 합리적인 삼투압 스트레스에서 성장 및 증식할 수 있도록 세포 배양에서 약 280 내지 350 mOsmo/kg의 최종 삼투압을 초과해서는 안된다.

본원에 사용된 용어 "공급물" 또는 "공급 배지"는 포유류 세포의 배양에서 공급물로서 사용되는 영양소의 농축물/농축된 영양소 조성물에 관한 것이다. 이는 세포 배양물의 희석을 최소화하기 위해 "농축된 공급 배지"로서 제공되며, 전형적으로 공급 배지는 용기에서 배양 시작 용적(CSV, 0일째의 시작 용적을 의미함)에 기초하여 10 내지 50ml/L/일, 바람직하게는 15 내지 45ml/L/일, 보다 바람직하게는 20 내지 35ml/L/일로 제공된다. 이는 배양 시작 용적의 약 1 내지 5%, 바람직하게는 약 1.5 내지 4.5%, 보다 바람직하게는 약 2 내지 3%의 일일 첨가량에 해당한다. 고밀도 시딩 또는 초고밀도 시딩을 사용하는 배양의 경우 10 내지 50ml/L/일, 15 내지 45ml/L/일 또는 25 내지 45ml/L/일과 같이 더 높은 공급 속도가 유리할 수 있다. 이는 배양 시작 용적의 약 1 내지 5%, 약 1.5 내지 4.5% 또는 약 2.5 내지 4.5%의 일일 첨가량에 해당한다. 공급 속도는 공급 기간에 걸친 평균 공급 속도로 이해되어야 한다. 공급 배지는 전형적으로 기초 세포 배양 배지의 전부는 아니지만 대부분의 성분의 보다 높은 농도를 갖는다. 일반적으로, 공급 배지는 아미노산 및 탄수화물과 같이 세포 배양 동안 소비되는 영양소를 대체하는 반면, 염 및 완충제는 덜 중요하며 일반적으로 기초 배지와 함께 제공된다. 또한 미량 원소는 전형적으로 주로 기초 배지와 함께 제공되고, 공급 배지에 존재할 수 있다. 공급 배지는 전형적으로 유가식 모드에서 (기초) 세포 배양 배지/발효 브로스에 첨가된다. 기초 배지에 (반복적 또는 연속적으로) 첨가된 공급 배지는 세포 배양 배지를 생성한다. 공급물은 연속 또는 볼루스 첨가와 같은 다양한 모드로 또는 관류 관련 기술(케모스타트 또는 하이브리드-관류 시스템)을 통해 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 공급 배지는 매일 첨가되지만, 또한 더 빈번하게, 예를 들어 매일 2회 또는 덜 빈번하게, 예를 들어 이틀마다 첨가될 수 있다. 보다 바람직하게는 공급 배지는 연속적으로 첨가된다. 영양소의 첨가는 일반적으로 배양 동안(즉, 0일째 이후)에 수행된다. 기초 배지와 대조적으로, 공급 배지는 전형적으로 주요 벌크 염(예를 들어, NaCl, KCl, NaHCO₃, MgSO₄, Ca(NO₃)₂)과 같은 '고삼투압 활성 화합물'을 제외한 기초 배지와 유사한 모든 성분을 제공하는 고농축 영양 용액(예를 들어, > 6x)으로 구성된다. 전형적으로 벌크 염이 없거나 감소된 기초 배지의 6x배 이상의 농축물은 세포 배양에서 삼투압을 약 270 내지 550 mOsmo/kg, 바람직하게는 약 280 내지 450 mOsmo/kg, 보다 바람직하게는 약 280 내지 350 mOsmo/kg으로 유지하기 위해 화합물의 양호한 용해도 및 충분히 낮은 삼투압(예를 들어, 270 내지 1500 mOsmo/kg, 바람직하게는 310 내지 800 mOsmo/kg)을 유지한다. 공급 배지는 하나의 완전한 공급 배지로서 첨가될 수 있거나, 세포 배양에 별도로 첨가하기 위해 하나 이상의 공급 보충제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 공급 보충제의 사용은, 정규적인 공급 및 글루코스 첨가를 위해 종종 수행되는 주문형 공급과 같은 상이한 공급 스케줄로 인해 필요할 수 있으며, 따라서 전형적으로 적어도 또한 별도의 공급으로서 제공된다. 하나 이상의 공급 보충제의 사용은 또한 특정 화합물의 낮은 용해도, 특정 화합물의 상이한 pH에서의 용해도 및/또는 고농도의 공급 배지에서 화합물의 상호작용으로 인해 필요할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "공급 보충제"는 사용 전에 공급 배지에 첨가될 수 있거나 또는 공급 배지로부터 별도로 기초 배지 및/또는 세포 배양 배지에 첨가될 수 있는 영양소의 농축물에 관한 것이다. 따라서, 화합물은 공급 배지 또는 공급 보충제로 제공될 수 있거나 화합물은 공급 배지 및 공급 보충제로 제공될 수 있다. 예를 들어, 시스테인은 공급 배지 및 공급 보충제로 2-공급 전략으로 첨가될 수 있다. 공급 배지로서, "공급 보충제"는 세포 배양물의 희석을 피하기 위해 농축물로서 제공된다.

세포 배양 배지인 기초 배지 및/또는 공급 배지 둘 다는 바람직하게는 무혈청이거나, 화학적으로 규명되거나 화학적으로 규명되고 무단백질이다. 본원에 사용된 "무혈청 배지"는 동물 기원으로부터의 혈청을 함유하지 않는 시험관내 세포 배양을 위한 세포 배양 배지를 지칭한다. 이는 혈청이 바이러스와 같은 상기 동물로부터의 오염물질을 함유할 수 있기 때문에, 그리고 혈청이 불명확하고 배치마다 다르기 때문에 바람직하다. 본 발명에 따른 기초 배지 및 공급 배지는 무혈청이다.

본원에 사용된 용어 "화학적으로 규명된 배지"는 시험관내 세포 배양에 적합한 세포 배양 배지를 지칭하며, 여기서 모든 성분은 공지되어 있다. 보다 구체적으로, 이것은 동물성 혈청 또는 식물, 효모 또는 동물성 가수분해물과 같은 임의의 보충제를 포함하지 않는다. 이것은 모든 성분이 분석되고 이의 정확한 조성이 공지되고 재현 가능하게 제조될 수 있는 경우에만 가수분해물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 기초 배지 및 공급 배지는 바람직하게는 화학적으로 규명된다. 화학적으로 규명된 배지는 재조합 성장 인자, 특히 인슐린 또는 인슐린-유사 성장 인자(IGF)와 같은 재조합 단백질을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "무단백질 배지"는 배양될 세포에 의해 생산되는 단백질을 제외하고는 단백질을 포함하지 않는 시험관내 세포 배양을 위한 세포 배양 배지를 지칭하며, 여기서 단백질은 임의의 길이의 폴리펩티드를 지칭하지만, 단일 아미노산, 디펩티드 또는 트리펩티드는 제외한다. 구체적으로, 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자(IGF)와 같은 성장 인자는 배지에 존재하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 기초 배지 및 공급 배지는 화학적으로 규명되고 무단백질이다.

본원에 사용된 용어 "배지 플랫폼(medium platform)", 또는 "배지 플랫폼(media platform)"은 세포 배양 공정의 시작부터 제공되는 기초 세포 배양 배지 및 배양 동안 기초 세포 배양 배지에 첨가되는 공급 배지로 구성된다. 선택적으로 글루코스와 같은 추가 첨가제가 세포 배양 공정 동안 첨가될 수 있다. 공급 배지는 임의의 종류의 유기식 공정 모드(예를 들어, 연속적, 공급 속도를 변경하면서 또는 볼루스 공급 첨가로서)로 공급될 수 있다.

용어 "활력" 및 "생존력"은 동의어로 사용되며, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 자동-현미경 세포 계수에 기초한 Cedex 장치를 사용한 트리판 블루 배제(Roche Diagnostics, Mannheim)에 의해 결정된 바와 같은 세포 배양물 중의 생존 가능한 세포 %를 지칭한다. 그러나, 생존력의 측정을 위한 다수의 다른 방법들, 예를 들어 살아있는 세포의 에너지 대사를 반영하기 위해 사용되는 형광 측정(예를 들어, 프로피듐 요오드화물에 기초함), 열량 측정 또는 효소적 방법, 예를 들어, LDH 락테이트-탈수소효소 또는 특정 테트라졸륨 염, 예를 들어 알라마르 블루, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 또는 TTC(테트라졸륨 클로라이드)을 사용하는 방법이 존재한다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질" 또는 "생성물" 또는 "생성물 단백질" 또는 "아미노산 잔기 서열"은 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 임의의 길이의 아미노산의 중합체, 바람직하게는 본 발명의 맥락에서 단클론 항체, 더욱 더 바람직하게는 단클론 항체 스페솔리맙을 지칭한다. 이들 용어는 또한 글리코실화(glycosylation), 당화(glycation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation), 산화(oxidation), 아미드화(amidation) 또는 단백질 처리를 포함하지만 이에 제한되지 않는 반응을 통해 번역후 변형된 단백질 또는 항체를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "암호화하다(encodes)" 및 "코딩하다(codes for)"는 중합체 거대분자 내의 정보가 제1 분자와는 상이한 제2 분자의 생산을 지시하기 위해 사용되는 임의의 공정을 광범위하게 지칭한다. 제2 분자는 제1 분자의 화학적 성질과는 상이한 화학 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 용어 "암호화"는 반-보존적 DNA 복제의 과정을 설명하며, 여기서 이중-가닥 DNA 분자의 한 가닥이 DNA-의존성 DNA 중합효소에 의해 새롭게 합성된 상보적인 자매 가닥을 암호화하기 위한 주형으로서 사용된다. 다른 측면에서, DNA 분자는 (예를 들어, DNA-의존성 RNA 중합효소를 사용하는 전사 과정에 의해) RNA 분자를 암호화할 수 있다. 또한, RNA 분자는 번역 과정에서와 같이 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 번역 과정을 설명하기 위해 사용될 때, 용어 "암호화"는 아미노산을 암호화하는 삼중항 코돈으로 연장된다. 일부 측면에서, RNA 분자는 예를 들어, RNA-의존성 DNA 중합효소를 통합하는 역전사(reverse transcription)의 과정에 의해 DNA 분자를 암호화할 수 있다. 또 다른 측면에서, DNA 분자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있으며, 여기서 그 경우에 사용되는 "암호화"는 전사 및 번역의 과정 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산"은 항체 스페솔리맙의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 즉 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 분자 또는 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산은 CHO 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다.

본원에 사용된 용어 "스페솔리맙"은 또한 CAS 등록번호 2097104-58-8 하에 등록된 INN 명칭 스페솔리맙(spesolimab)을 갖는 인간화 단클론 IgG1 항-IL-36R 항체를 지칭한다. 스페솔리맙은 하기 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖는다:

중쇄(HC) 아미노산 서열:

경쇄(LC) 아미노산 서열:

가변 중쇄(VH) 아미노산 서열:

가변 경쇄(LC) 아미노산 서열:

본원에 사용된 용어 "항체 스페솔리맙"은 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 CHO 세포 배양에서 생산된 항체 스페솔리맙을 지칭하며, 따라서 특정 정도의 변이체 이질성을 갖는 다수의 항체 분자를 지칭한다. 따라서, 당업계의 숙련가는 이것이 다양한 스페솔리맙 종의 혼합물, 예를 들어 당화 변이체, 전하 변이체 및 당화 변이체 또는 종을 포함하는 다양한 번역후 변형을 포함하는 종을 지칭한다는 것을 이해할 것이다.

본원에 사용된 용어 "시딩(seeding)"은 CHO 세포와 같은 포유류 세포의 샘플을 수집하고, 이들을 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지에 배치하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 포유류 세포는 성장 또는 생산을 위한 기초 배지에 배치된다. 이 단계를 접종(inoculating)이라고도 할 수 있다. 포유류 세포는 상이한 시딩 밀도로 기초 배지에 접종될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 용어 "정상 시딩"은 약 0.7 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 1 x 10⁶개 세포/ml의 표준 시딩 밀도를 지칭하고, 용어 "고 시딩"은 1 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 4 x 10⁶개 세포/ml의 더 큰 시딩 밀도를 지칭하며, 용어 "초고 시딩"은 약 4 x 10⁶개 세포/ml 내지 20 x 10⁶개 세포/ml 또는 그 이상, 바람직하게는 약 6 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 15 x 10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게는 8 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 12 x 10⁶개 세포/ml의 시딩 밀도를 지칭한다. 본 발명에 따르면, CHO 세포는 바람직하게는 ≥ 0.7 x 10⁶개 세포/ml로 시딩된다. 특정 양태에서, CHO 세포는 0.7 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 2 x 10⁶개 세포/ml, 바람직하게는 0.7 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 1.5 x 10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게 0.8 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 1.5 x 10⁶개 세포/ml, 및 더욱 더 바람직하게는 0.9 x 10⁶개 세포/ml 내지 약 1.3 x 10⁶개 세포/ml로 시딩된다.

철은 (i) 미량 원소로서 및 (ii) 트랜스페린 대체물(예를 들어, 철 킬레이트로서의 철)로서 포유류 세포 배양 배지에서 필수 성분이다. 트랜스페린은 전형적으로 혈장에서 유래되며 부분적으로 철-포화된 인간 트랜스페린의 동결건조된 분말로서 공급될 수 있다. 트랜스페린은 상동 N-말단 및 C-말단 철-결합 도메인을 가진 당단백질이며 락토페린, 멜라노트랜스페린 및 오보트랜스페린을 포함한 여러 다른 철-결합 단백질과 관련이 있다. 트랜스페린은 동물 세포 배양에 사용하기 위해 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, Sigma-Aldrich, CAS 번호 11096-37-0). 세포 배양 배지에서 트랜스페린 대체재로 사용되는 수많은 철 화합물이 있다. 이들은 II/III 형태로, 다양한 염으로서 및 수화/탈수된 형태로서 존재한다. 예로는 인산철(III), 피로인산철(III), 질산철(III), 황산철(II), 염화철(III), 락트산철(II), 시트르산제2철(III), 시트르산제2철(III)암모늄, 철-덱스트란, 시트르산철(III)콜린 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 제2철 나트륨 염이 있지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 철 공급원은 피로인산철(Fe₄(P₂O₇)₃), 시트르산철암모늄((NH₄)₅[Fe(C₆H₄O₇)₂]), 시트르산철(C₆H₅FeO₇), 시트르산철콜린(C₃₃H₅₇Fe₂N₃O₂₄), 질산철(Fe(NO₃)₃), 인산 철(FePO₄), 황산철(FeSO₄) 및 염화철(FeCl₃)이다.

본원에 사용된 용어 "시트르산철콜린(iron choline citrate)"은 시트르산콜린철 복합체를 형성하는 CAS 번호 1336-80-7 하에 속하는 화합물 시트르산제2철콜린에 관한 것이다. 사용되는 일반적인 동의어는 예를 들어 시트르산페로콜리네이트, 시트르산제2철콜린, 시트르산콜린, 시트르산철(III)콜린, 시트르산제2철콜린, 시트르산트리콜린, 시트르산제2철콜린, 2-하이드록시에틸-트리메틸-암모늄, 2-하이드록시프로판-1,2,3-트리카복실레이트이다. 이 화합물은 기초 및 공급 배지 둘 다에 철 담체로서 첨가될 수 있다. 철: 콜린: 시트레이트 몰 비가 2:3:3인 시트르산철콜린(시트르산제2철콜린, CAS 번호 1336-80-7, 5% 결정 수분 함량으로 인해 분자량 Mw = 991.5g/mol +/- 49.57g/mol, 약 10.2 내지 12.4%의 철 함량을 갖는 철 복합체, 철: 콜린: 시트레이트에 대한 분자 비율 2:3:3, 분자식 C₃₃H₅₇Fe₂N₃O₂₄)는 예를 들어 Dr. Paul Lohmann GmbH KG로부터 수득 가능하다. 그러나, 다른 적합한 시트르산철콜린 구조가 철 농도에 기초하여 등몰량, 예를 들어, 1:1:1의 비율의 철: 콜린: 시트레이트, Mw = 348.11g/mol의 분자량 또는 (2):3:3의 비율의 (철): 콜린: 시트레이트, Mw = 501.61g/mol의 분자량, C₂₁H₄₇N₃O₁₀(철이 없는 합계 식)로 사용될 수 있다. 시트르산철콜린은 또한 철 공급원(예를 들어, 염화철), 콜린 공급원(예를 들어, 염화콜린) 및 시트레이트 공급원(예를 들어, 시트르산나트륨) 또는 콜린 공급원 및 시트르산제2철을 바람직하게는 상기한 시트르산철콜린에 제공되는 바와 같은 비율로 포함하는 별도의 성분으로서 제공될 수 있다.

포유류 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지는 아미노산 및 탄수화물을 포함하는 필수 영양소 및 비타민, 미량 원소, 염, 벌크 염 및 지질 또는 지질 전구체와 같은 성분을 바람직하게 완충된 배지에 포함한다. 또한, 성장 인자, 예를 들어, 재조합 인슐린-유사 성장 인자(IGF) 또는 재조합 인슐린이 기초 세포 배양 배지 또는 공급 배지에 첨가될 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 기초 세포 배양 배지 및/또는 공급 배지는 IGF 또는 재조합 인슐린의 존재를 제외하고는 화학적으로 규명된 무단백질이다.

본원에 사용된 용어 "아미노산"은 보편적 유전 암호에 의해 암호화되는 20개의 천연 아미노산, 전형적으로 L-형태(즉, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린)를 지칭한다. 아미노산(예를 들어, 글루타민 및/또는 티로신)은 증가된 안정성 및/또는 용해도를 갖는, 바람직하게는 글리실-글루타민 및 알라닐-글루타민과 같은 L-알라닌(L-ala-x) 또는 L-글리신 연장(L-gly-x)을 함유하는 디펩티드로서 제공될 수 있다. 또한, 시스테인은 L-시스틴으로서도 제공될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 이의 모든 상이한 염, 예를 들어 (이에 제한되지 않고) L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, L-아스파라긴 모노하이드레이트, L-시스테인 하이드로클로라이드 모노하이드레이트, L-시스틴 디하이드로클로라이드, L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 디하이드레이트, L-라이신 모노하이드로클로라이드 및 하이드록실 L-프롤린, L-티로신 이나트륨 데하이드레이트를 포함한다. 아미노산의 정확한 형태는 용해도, 삼투압, 안정성, 순도와 같은 특징이 손상되지 않는 한, 본 발명에 중요하지 않다. 전형적으로 그리고 바람직하게는, L-아르기닌은 L-아르기닌 x HCl로서 사용되고, L-아스파라긴은 L-아스파라긴 x H₂O로서 사용되고, L-시스테인은 L-시스테인 x HCl x H₂O로서 사용되고, L-시스틴은 L-시스틴 x 2 HCl로서 사용되고, L-히스티딘은 L-히스티딘 x HCl x H₂O로서 사용되고, L-티로신은 L-티로신 x 2 Na x 2H₂O로서 사용되고, 여기서 각각의 바람직한 아미노산 형태는 다른 형태와 독립적으로 또는 함께 또는 이들의 임의의 조합으로 선택될 수 있다. 또한 관련 아미노산 중 하나 또는 두 개를 포함하는 디펩티드가 포함된다. 예를 들어, L-글루타민은 안정성을 개선하고 저장시 또는 장기 배양 동안 축적된 암모늄을 감소시키기 위해 종종 L-알라닐-L-글루타민과 같은 디펩티드의 형태로 세포 배양 배지에 첨가된다.

본원에 사용된 용어 "배지 내의 모든 아미노산" 또는 "총 아미노산 함량"은 mM 단위의 상기 정의된 바와 같은 "아미노산"의 합계를 지칭한다. 디펩티드에서, 각 아미노산은 별개로 계산되며, 따라서 1mM 알라닐-글루타민은 1mM L-알라닌 및 1mM L-글루타민(몰 비 1:1)으로 계산된다. 마찬가지로, L-시스틴에서 각 시스테인은 별개로 계산되며, 따라서 1mM L-시스틴은 2mM L-시스테인(몰 비 1:2)으로 계산된다. 전형적으로, 총 아미노산 함량은 기초 세포 배양 배지와 비교하여 농축된 공급 배지에서 약 5 내지 20배, 바람직하게는 약 7 내지 15배, 보다 바람직하게는 약 10배 더 높다. 본 발명에 따른 기초 배지의 총 아미노산 함량은 약 25 내지 150mM, 바람직하게는 약 30 내지 130mM, 보다 바람직하게는 약 35 내지 120mM 및 더욱 더 바람직하게는 약 40 내지 100mM일 수 있다. 공급 배지의 총 아미노산 함량은 약 100 내지 1000mM, 바람직하게는 약 200 내지 900mM, 보다 바람직하게는 약 300 내지 800mM 및 더욱 더 바람직하게는 약 400 내지 700mM일 수 있다. 보편적인 유전 암호에 의해 직접 코딩되지 않는 다른 아미노산, 예를 들어 L-오르니틴, 하이드록실 L-프롤린 또는 이의 대사산물, 예를 들어 타우린이 기초 세포 배양 배지 또는 공급 배지에 추가로 존재할 수 있지만, 이들은 총 아미노산 함량에 대해 계산되지 않는다.

적합한 비타민에 대한 비제한적인 예는 비오틴(B7), 판토텐산칼슘, 시아노코발라민(B12), 엽산, 미오이노시톨, 니아신아미드(B3), 피리독살 염산염, 피리독신 염산염, 리보플라빈(B2) 및/또는 티아민(B1)이다. 미량 원소에 대한 비제한적인 예는 몰리브덴, 바나듐, 구리, 니켈, 셀레나이트, 실리케이트 및 아연이고, 미량 원소의 예시적인 공급원은 몰리브덴산암모늄, 바나듐산암모늄, 황산제2구리, 황산니켈, 아셀렌산나트륨, 규산나트륨, 및 황산아연 및/또는 염화아연이다. 지질 전구체의 비제한적인 예는 콜린 클로라이드, 에탄올아민, 글리세롤, 이노시톨, 리놀레산, 지방산, 인지질 또는 콜레스테롤-관련 화합물이다.

또한, 염은 염화칼슘, 질산칼슘, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화칼륨 및/또는 염화나트륨일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 염의 한 가지 기능은 배지에서 삼투압을 조정하는 것이다. 바람직하게는 기초 세포 배양 배지의 삼투압은 전형적으로 280 내지 350 mOsmo/kg의 최적 범위를 초과하지 않는다. 전형적으로, 농축된 공급 배지의 삼투압은 < 2000 mOsmo/kg, 바람직하게는 < 1500 mOsmo/kg, 보다 바람직하게는 < 1000 mOsmo/kg이다. 공급 배지의 삼투압은 더 높을 수 있지만, 첨가시 세포 배양에서 삼투압을 270 내지 550 mOsmo/kg, 바람직하게는 280 내지 450 mOsmo/kg, 보다 바람직하게는 280 내지 350 mOsmo/kg의 최적 범위를 초과하여 증가시켜서는 안된다.

바람직하게는, 공급 배지는 감소되거나 낮은 염 함량을 갖는다. 감소되거나 낮은 염 함량은, 예를 들어, 약 100mM 이하, 바람직하게는 약 50mM 이하의 총 염 농도(예를 들어, 염화나트륨이 없는 공급 배지, 및 염화칼륨의 감소된 농도)를 의미한다. 삼투압에 대한 가장 중요한 기여인자는 나트륨 이온, 염화물 이온, 및 중탄산염 뿐만 아니라 글루코스 및 기타 탄소원, 예를 들어, 아미노산이다. 또한, 일반적인 유가식 공정의 경우 배양 기간에 걸쳐 배양물 용적을 최소화하기 위해 공급 배지를 농축해야 한다. 생물반응기의 크기는 실제로 배양 시작 용적의 대략 35%(30 내지 40%) 또는 배양 시작 용적의 약 45%(40 내지 50%)의 총 공급 투여량만을 허용하는 공급 제약을 유발할 수 있다.

탄수화물은 글루코스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 수크로스 또는 글루코사민 등일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 탄수화물은 기초 세포 배양 배지 및/또는 공급 배지에 직접 첨가될 수 있거나 세포 배양물에 별도로 첨가될 수 있다. 다른 에너지원은 피루브산나트륨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

포유류 세포는 중성 pH, 예를 들어 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5, 바람직하게는 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.3, 보다 바람직하게는 약 pH 7에서 배양되어야 한다. 따라서 완충제가 기초 세포 배양 배지에 첨가되어야 한다. 공급 배지의 경우, 공급 배지가 농축물로서 첨가되기 때문에, 공급 배지의 첨가가 세포 배양물의 pH를 이 범위를 벗어나게 하지 않는 한, pH는 상기 범위를 약간 벗어날 수 있다. 공급 배지에서의 pH에 대한 바람직한 범위는 약 6 내지 약 8이다. 적합한 완충제는 HEPES, 포스페이트 완충액(예를 들어, 인산칼륨 일염기성 및 인산칼륨 이염기성 및/또는 인산나트륨 이염기 무수물 및 인산나트륨 일염기), 페놀 레드, 중탄산나트륨 및/또는 탄산수소나트륨을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일반적으로, 공급 배지는 아미노산 및 탄수화물과 같이 세포 배양 동안 소비되는 영양소를 포함하는 반면 염 및 완충제는 덜 중요한다. 따라서 일부 염은 공급 배지로부터 완전히 생략될 수 있다.

기초 세포 배양 배지 및/또는 공급 배지는 세포 배양의 시간 과정 동안 포유류 세포 배양의 세포 특이적 요구 사항 및 대사적 요구를 충족해야 한다. 즉, 이것은 (i) 포유류 세포의 세포 특이적 요구를, (ii) 세포 배양 시스템에서, (iii) 배양 실행의 수명 주기(약 10 내지 20일) 전반에 걸쳐 충족한다. 배양 중인 포유류 세포는 세포 배양 공정의 상이한 단계에서 상이한 영양 요구 사항을 갖는다.

세포 배양은 규모-확대(scale-up) 과정에서 접종 트레인에 필요한 세포 확장을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 배양 규모는 세포 은행의 해동(mL 규모)에서 생산 규모(>10.000L 규모)로 단계적으로 증가된다. 각 N-x 단계의 성장이 좋을수록(N-단계는 최종 생산 규모를 의미하고 N-x는 통상적으로 배치 모드에서 최종 생산 단계 이전의 세포 확장 단계를 의미함) 다음 단계로의 각 이전이 더 빠르고 더 잘 발생할 수 있다. 특히, 보다 양호한 세포 성장 및 더 높은 생존 가능한 세포 농도는 N-x 배양이 단축된 실행 시간(따라서 더 빠름)으로 수행될 수 있도록 한다. 보다 양호한 세포 성장 및 더 높은 생존 가능한 세포 농도는 또한 개선된 전달을 초래하여 전반적인 성능 개선을 초래한다. 예를 들어, 특정 N-x 단계가 특정 시딩 세포 밀도로 접종되어야 하고 생존 가능한 세포 농도가 높을 때, 상대적으로 낮은 용적의 세포 배양물을 한 단계에서 다음 단계로 전달되어야 한다(배양 시작 용적(CSV) 당 접종 용적의 전달은 스피트 비율(spit ratio)로 정의되며, 통상적으로 1:5 내지 1:20이 일반적임). 이는 동시에 "사용된" 세포 배양 배지의 감소된 용적만이 한 단계에서 다음 단계로 전달되고 최대 용적의 "새로운" 배지는 다음 단계(일정한 전체 배양 용적)에 추가될 수 있음을 의미한다. 이는 또한 최종 N-단계에서 전반적인 세포 배양 성능을 개선시킨다(예를 들어, 생성물 역가 증가).

대부분의 세포 배양에서 주요 탄소에 대한 이상적이지 않은 영양소 조성은 오버플로우 대사(overflow-metabolism)로 인해 결정될 수 있다. 이는 주요 탄소원 글루코스가 비효율적으로 사용되고 이로 인해 유기산, 에를 들어 락트산의 증가에 기여한다는 것을 의미한다. 증가된 락트산 수준은 6.65 이하로의 pH 강하에 기여할 수 있으며 이는 배양 배지의 완충 용량 및 이에 따라 배양 생존력에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 이러한 이유로, 배양 분위기에서 CO₂ 농도는 배양 배지의 산 수준을 최소화하기 위해 기하급수적 성장 단계 초기에 감소된다.

항체 스페솔리맙은 다운스트림 공정에서 다른 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질 및 오염 물질로부터 정제된다. 다양한 정제 단계에서 수득되고/되거나 분석된 샘플을 공정내 제어(in-process control, IPC) 샘플 또는 공정 중간체라고도 한다. 수확은 전형적으로 수확된 세포 배양액을 생산하기 위한 것과 같은 원심분리 및/또는 여과를 포함한다. 추가 공정 단계는 항체 스페솔리맙을 오염 물질로부터 분리하기 위한 친화성 크로마토그래피, 특히 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 추가 공정 단계는 바이러스를 불활성화하기 위한 산 처리, HCP 및 DNA와 같은 세포 오염 물질을 제거하기 위한, 바람직하게는 산 처리 후, 심층 여과에 의한 생성물 풀 정화를 포함할 수 있다. 추가 공정 단계는 다음을 이 순서로 또는 개별 사례에 적절할 수 있는 임의의 다른 순서로 포함할 수 있다: 이온 교환 크로마토그래피, 특히 오염된 세포 성분을 추가로 제거하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 응집체와 같은 생성물 관련 오염물질을 제거하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피. 또한, 바람직하게는 다음 공정 단계는 바이러스를 추가로 제거하기 위한 나노여과 및 각각 재조합 단백질을 농축하고 완충액을 교환하기 위한 한외여과 및 정용여과를 포함할 수 있다.

예를 들어, 단백질 A 컬럼, 산 처리, 심층 여과, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피 후 수확된 세포 배양액(HCCF)으로부터 정제된 항체 스페솔리맙을 포함하는 샘플은 "정제된 항체 생성물 풀"이라고도 지칭될 수 있다. 정제된 항체 생성물 풀은 추가로 정제될 수 있고, 부형제로 제형화될 수 있으나 그럴 필요는 없다. 따라서, 정제된 항체 생성물 풀은 원료의약품과 동일할 수 있지만 상이한 농도 및/또는 상이한 완충제 시스템에 존재할 수도 있다.

본원에 사용된 용어 "수확된 세포 배양액(harvested cell culture fluid, HCCF)"은 수확된 재조합 단백질, 본 경우에는 항체 스페솔리맙을 포함하는 유체를 지칭한다. 전형적으로, 생산에 사용되는 숙주 세포는 폴리펩티드를 세포 배양 배지로 분비하도록 조작되고, 따라서 세포 배양 상청액이 수확될 것이다. 그러나, 이론적으로 세포는 수확 전에 용해될 수도 있다. 수확은 수확된 세포 배양액을 생산하기 위한 원심분리 및/또는 여과를 포함한다. 따라서, 수확된 세포 배양액은 또한 정화된 수확 세포 배양액으로 지칭될 수 있다. 이것은 살아있는 세포를 함유하지 않으며 세포 파편 및 세포 성분이 제거되었다. 전형적으로, 이것은 정화된 세포 배양 상청액을 지칭하며, 여기서 정화는 원심분리 또는 여과, 바람직하게는 0.1μm 필터를 사용하는 것과 같은 여과를 의미한다. HCCF는 일부 양태에서 정화된 HCCF이다. 추가의 또는 대안적인 양태에서, HCCF는 약 1.8g/L 내지 약 5g/L의 항체 스페솔리맙, 바람직하게는 약 2.0g/L 내지 약 5.0g/L의 항체 스페솔리맙, 보다 바람직하게는 약 2.5g/L 내지 약 4.5g/L의 항체 스페솔리맙을 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 > 20kg, 또는 심지어 > 30kg의 스페솔리맙을 포함하는 HCCF에 대한 및/또는 ≥ 2,000L 발효기, 바람직하게는 ≥ 12,000L 발효기로부터의 HCCF에 대한 대규모 정제 방법이다.

본원에 사용된 용어 "생성물 풀(product pool)"은 공정 단계의 말기에 생성물, 즉 항체 스페솔리맙을 포함하는 용액을 지칭한다. 따라서 용어 "생성물 풀"은 "항체를 포함하는 생성물 풀"이라는 용어와 동의어로 사용된다. 이것은, 생성물의 주요 분획을 함유하는 한, 용출액 또는 통과액 또는 여과액일 수 있다. 따라서 용어 "생성물 풀 샘플"은 특히 본 발명의 방법에 따른 방법 단계 중 하나 후 항체 스페솔리맙을 포함하는 용액의 샘플을 지칭한다.

항체 스페솔리맙은 CHO 세포주에서 대규모로, 즉 ≥ 12,000L 규모로 생산된다. HCCF의 역가는 약 1.8g/L 내지 약 5g/L이다. 따라서, 본 발명에 따른 공정은 > 20kg, 또는 심지어 > 30kg 스페솔리맙을 포함하는 정제를 위한 출발 물질(HCCF)을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "오염시키는" 또는 "오염"은 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA 및/또는 가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 단백질 또는 물질과 같은 바람직하지 않은 및/또는 의도하지 않은 물질의 존재를 지칭한다.

용어 "원료의약품(drug substance, DS)"은 부형제와 함께 제형화된 활성 약제학적 성분(active pharmaceutical ingredient, API)을 지칭한다. API는 API의 전달을 돕는 부형제와 달리 신체에서 치료 효과를 갖는다. 생물학적 치료제의 경우, 부형제와 함께 제형화된 API는 전형적으로 의약품이라고도 하는 최종 투여 형태에 사용된 농도 중 적어도 가장 높은 농도의 최종 제형 완충액 내 API를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 DP로 약칭되는 용어 "의약품"은 원료의약품의 최종 시판 투여 형태, 예를 들어 정제 또는 캡슐 또는 생물제제의 경우 전형적으로 바이알 또는 주사기와 같은 적절한 용기 내의 주사용 용액을 지칭한다. 의약품은 또한 동결건조된 형태일 수 있다. 스페솔리맙은 유리 바이알에 60mg/ml 또는 유리 주사기에 150mg/mL의 수성 제형으로서 제공된다.

항체는 전형적으로 면역글로불린 중쇄의 C_H2-도메인의 Asn297(IgG)에 부착된 올리고당을 지닌다. 이러한 올리고당의 대부분은 바이안테너리(biantennary) 구조를 갖는다. 이것은 이들이 말단 GlcNAc 잔기에 임의의 Fuc(α1-6) 결합이 있는 코어 구조(Man(α1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc→Asn) 및 코어 구조의 말단 만노스에 연결된 두 개의 외측 암(Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)→>Man 및 Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)→>Man; 말단 갈락토스(Gal) 잔기는 선택적이다)을 가지는 것을 의미하며(Man = 만노스, GlcNAc = N-아세틸 글루코스, Gal = 갈락토스, Fuc = 푸코스), 각 외측 암의 말단 갈락토스는 선택적이어서, G(0), G(1) 및 G(2) 이소형을 초래하고, G(2) 이소형은 올리고당 구조의 각 외측 암에 말단 갈락토오스 잔기를 갖고, G(1) 이소형은 (α1-6) 또는 (α1-3) 연결된 외측 암 중 하나에 말단 갈락토스 잔기만 가지며, G(0) 이소형은 양쪽 외측 암에 갈락토스 잔기를 갖지 않는다.

용어 "Man5 구조" 또는 "만노스-5 당구조"는 본원에서 동의어로 사용되며, 5개의 만노스 잔기 및 2개의 N-아세틸 글루코스 코어 잔기를 포함하거나 이들로 구성된 폴리펩티드의 Asn 잔기에 연결되어 트리안테너리 구조를 형성하는 올리고만노스-구조를 지칭한다.

항체와 같은 폴리펩티드에 당구조(glycostructure)를 도입하는 것이 번역후 변형(post-translational modification)이다. 불완전한 글리코실화로 인해 모든 세포는 상이한 당구조를 포함하는 글리코실화 패턴 또는 프로파일을 갖는 항체와 같은 폴리펩티드를 발현한다. 전체 또는 개별 당구조를 글리코실화 패턴 또는 프로파일이라고 한다. 정제된 스페솔리맙 또는 단백질 A 풀의 올리고당은 방출된 올리고당을 2-아미노 피리딘으로 표지하고 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC-HPLC), 바람직하게는 친수성 상호작용 초고성능 액체 크로마토그래피(HILIC-UPLC)를 사용하여 분석함으로써 결정될 수 있다. 크로마토그래피 프로파일은 6개의 주요 피크를 나타내며, 그 중 피크 3은 Man5 피크(도 5)이고, (올리고 맵 피크 3)이라고도 한다. 본원에 사용된 용어 "% Man5 구조"는 총 합 피크 면적의 상대적 % 피크 면적(피크 3)을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 값의 10%의 변동을 지칭하며, 예를 들어, 약 50%는 45 내지 55%의 변동을 수반한다.

본 발명은 (a) (i) 배양 배지에서 세포를 시딩하는 단계, 및 (ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 구리(II)(Cu^{2 +})는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1,500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다); (b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및 (c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, Cu^{2 +} 및 철은 단계 (i)에서 시딩 전에 및/또는 시딩 후 1일 이내에 배양 배지에 첨가하고, 보다 바람직하게는 Cu^{2 +} 및 철은 단계 (i)에서 시딩 전에 또는 접종시(즉, 세포 시딩시)에 배양 배지에 첨가된다. 하나의 양태에서, Cu^{2 +} 및/또는 철은 하나 이상의 볼루스 첨가로서 또는 연속적으로 배양 배지에 첨가된다. 하나 이상의 볼루스 첨가는 Cu^{2 +} 및/또는 철에 기초 배지를 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, 단계 (i)는 0.35 내지 1.2μM의 Cu^{2 +} 및 1,500μM 이상의 철을 포함하는 기초 배지에서 세포를 시딩하는 것을 포함한다. 단계 (i)의 배양 배지는 또한 기초 배지로 지칭될 수 있다.

구리는 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전에 및/또는 시딩 후 2일 또는 1일 이내에 배양 배지에 0.35 내지 1.2μM로 첨가된다. 당업계의 숙련가는 배양 배지에 구리를 첨가하는 수단은 상관없으며, 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전의 첨가는 단계 (i)에 따른 배양 배지에 구리가 존재하거나 배양 배지의 일부인 것 및/또는 단계 (i)에서 시딩하기 전에 준비된 혼합 배양 배지에 구리 함유 보충물을 첨가하는 것을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 양태에서, Cu^{2 +}는 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전에 및/또는 시딩 후 2일, 바람직하게는 1일 이내에 배양 배지에 0.4 내지 1.0μM, 보다 바람직하게는 0.5 내지 0.8μM로 첨가된다. 구리(II)는 전형적으로 CuSO₄ 또는 CuCl₂를 포함하지만 이에 제한되지 않는 염 또는 이의 수화물, 적합하게는 염으로서 제공된다. 바람직하게는 구리는 CuSO₄로서 제공된다.

철은 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전에 및/또는 시딩 후 2일 또는 1일 이내에 배양 배지에 1,500μM 이상으로 첨가된다. 당업계의 숙련가는 배양 배지에 철을 첨가하는 수단은 상관없으며, 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전의 첨가는 단계 (i)에 따른 배양 배지에 철이 존재하거나 배양 배지의 일부인 것 및/또는 단계 (i)에서 시딩하기 전에 준비된 혼합 배양 배지에 철 함유 보충물을 첨가하는 것을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 양태에서, 철은 2,000μM 이상, 보다 바람직하게는 2,500μM 또는 3000μM 이상에서 첨가된다. 철은 10,000μM, 바람직하게는 5,000μM까지 첨가될 수 있지만, 주로 높은 철 농도의 존재하에서 배지 성분의 용해도 및 침전으로 인해, 또한 매우 높은 농도에서 철에 대한 잠재적인 독성 문제로 인해 전형적으로 보다 낮은 농도가 사용된다. 따라서, 특정 양태에서, 철 농도는 1,500μM 내지 10,000μM, 2,000μM 내지 10,000μM, 2,500μM 내지 10,000μM 또는 3,000μM 내지 10,000μM, 바람직하게는 1,500μM 내지 5,000μM, 2,000μM 내지 5,000μM, 2,500μM 내지 5,000μM 또는 3,000μM 내지 5,000μM이다. 철은 전형적으로 염으로서 및/또는 킬레이트화된 형태로, 적합하게는 피로인산철(Fe₄(P₂O₇)₃), 시트르산철암모늄((NH₄)₅[Fe(C₆H₄O₇)₂]), 시트르산철(C₆H₅FeO₇), 시트르산철콜린, 질산철-III, 인산철, 황산철 및 염화철과 같지만 이에 제한되지 않는 철 공급원으로 제공된다. 바람직한 철 공급원은 시트르산철, 시트르산철콜린 및 염화철이다. 추가적으로 적합한 철 공급원이 당업계에 공지되어 있으며, 당업계의 숙련가는 특정 킬레이트제, 예를 들어 시트레이트 및/또는 콜린의 첨가가 철의 세포 흡수를 증가시킬 수 있고, 이것은 또한 철 공급원에 별도로 첨가될 수 있음을 알고 있을 것이다.

본 발명의 맥락에서, 구리 및 철이 성장 단계의 시작시, 즉 시딩 전 및/또는 시딩 후 2일 또는 1일 이내에 명시된 농도로 첨가(및/또는 존재)되는 것이 중요하지만, 배양 전반에 걸쳐, 특히 생산 단계에 걸쳐 구리 및 철 농도는 덜 중요하다. 특히, PBG 및 Man5 함량에 대한 구리 감소 및 철 증가의 상승 효과로 인해, 추가 감소가 달성될 수 있거나 약간 더 높은 구리 농도에서 동일한 감소가 달성될 수 있으며, 이에 의해 너무 낮은 구리 농도의 부정적인 영향을 피할 수 있다.

특정 양태에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산은 CHO 게놈에 안정적으로 통합된다. CHO 세포를 항체로 형질감염 또는 형질도입하고 항체 생산 클론을 선택하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명에 따른 방법은 세포에 공급 배지를 공급하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 공급 배지는 배양의 0일째 내지 3일째부터, 바람직하게는 1일째 내지 3일째부터, 보다 바람직하게는 1일째 내지 2일째부터, 더욱 더 바람직하게는 1일째부터 시작하여 첨가한다. 필수는 아니지만, 공급 배지는 Cu^{2 +} 이온을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 공급 배지는 매일 15nM 미만, 12mM 미만, 10nM 미만, 바람직하게는 매일 7nM 미만, 보다 바람직하게는 6nM 미만으로 Cu^{2 +} 이온을 첨가할 수 있다. 공급 배지는 철 이온을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 공급 배지는 매일 최대 100μM의 철, 바람직하게는 매일 최대 50μM, 40μM, 30μM 또는 20μM 철을 첨가할 수 있다. 공급 배지는 명시된 농도의 Cu^{2 +} 및 철 이온을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 공급 배지는 기초 세포 배양 배지에서 배양된 세포에 첨가되어야 하며, 여기서, (a) 공급 배지는 배양 시작 용적에 기초하여 약 10 내지 50ml/L/일, 바람직하게는 20 내지 35ml/L/일로 첨가되고, (b) 공급 배지는 0, 1, 2 또는 3일째에 시작하여 첨가되고/되거나 (c) 공급 배지는 연속적으로, 또는 볼루스로서 하루에 수 회, 하루에 2회, 하루에 1회, 매 2일마다 또는 매 3일마다 첨가된다.

본 발명의 방법에서, 배양 배지 내의 증가된 철 농도 및/또는 감소된 구리 농도는 감소된 % BPG를 갖는 항체 스페솔리맙의 생성을 초래한다. 이러한 맥락에서 "감소된 % BPG"라는 용어는 항체 스페솔리맙이 본 발명의 방법에 따른 범위 내에서 또는 명시된 범위 미만의 철 농도 및/또는 명시된 청구된 범위 이상의 구리 농도를 사용하는 동일한 방법에 비해 더 낮은 철 및/또는 더 높은 구리 농도를 사용하여 동일한 방법에 의해 생산되는 경우와 관련하여 이해되어야 한다. 특정 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 항체 스페솔리맙은 ≤7.5% BPG, 바람직하게는 ≤7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤6% BPG를 갖는다. 본 발명에 따르면, 철 농도를 증가시키면 % BPG가 감소하고, 따라서 다른 측면으로 인해 더 이상 감소될 수 없는 약간 더 높은 구리 농도를 보상할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 (a) (i) 배양 배지에서 세포를 시딩하는 단계, 및 (ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, %BPG는 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전에 및/또는 시딩 후 2일 이내에 배양 배지에 제공되는 Cu^{2 +} 농도를 감소시키고 철 농도를 증가시킴으로써 감소되고, 여기서 배양 배지에 제공되는 구리 농도는 0.35 내지 1.2μM이고, 배양 배지에 제공되는 철 농도는 1500μM 이상이다); (b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및 (c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 항체 스페솔리맙의 % BPG를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, Cu^{2 +} 및 철은 단계 (i)에서 시딩 전에 및/또는 시딩 후 1일 이내에 배양 배지에 첨가되고, 보다 바람직하게는 Cu^{2 +} 및 철은 단계 (i)에서 시딩 전에 또는 접종시(즉, 세포 시딩시)에 배양 배지에 첨가된다. 하나의 양태에서, Cu^{2 +} 및/또는 철은 하나 이상의 볼루스 첨가로서 또는 연속적으로 배양 배지에 첨가된다. 하나 이상의 볼루스 첨가는 Cu^{2 +} 및/또는 철에 기초 배지를 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, 단계 (i)는 0.35 내지 1.2μM의 Cu^{2 +} 및 1500μM 이상의 철을 포함하는 기초 배지에 세포를 시딩하는 단계를 포함한다. 이러한 맥락에서 "감소된 % BPG"라는 용어는 항체 스페솔리맙이 본 발명의 방법에 따른 범위 내에서 또는 명시된 범위 미만의 철 농도 및/또는 명시된 청구된 범위 이상의 구리 농도를 사용하는 동일한 방법에 비해 더 낮은 철 및/또는 더 높은 구리 농도를 사용하여 동일한 방법에 의해 생산되는 경우와 관련하여 이해되어야 한다. 특정 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 항체 스페솔리맙은 ≤7.5% BPG, 바람직하게는 ≤7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤6% BPG를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "% 염기성 피크 그룹(basic peak group, BPG)"은 스페솔리맙 프로파일의 HPLC 크로마토그램에서 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의해 결정된 총 합 피크 면적의 상대적 % 피크 면적(총 항체의 상대적 %)을 지칭한다. 용어 "BPG"는 항체 스페솔리맙의 염기성 종 또는 염기성 변이체로 지칭될 수도 있다.

BPG는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX HPLC)를 사용하여 결정될 수 있다. 보다 구체적으로, 염기성 종은 스페솔리맙 프로파일의 HPLC 크로마토그램에서 주 피크보다 늦게 용출되는 피크에 상응한다. 하나의 양태에서, HPLC 크로마토그램은 10mM MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판설폰산, 4-모르폴린 프로판설폰산)(pH 7.6)의 제1 이동상 및 10mM MOPS, 100mM 염화칼륨(pH 7.6)의 제2 이동상을 사용하여 생성되고, 여기서 HPLC 크로마토그램은 280nm에서의 검출을 사용하여 생성된다.

BPG의 수준은 주로 업스트림 공정에 의해 결정되며 다운스트림 공정에 의해 거의 영향을 받지 않는다. 따라서, 스페솔리맙의 HCCF에서 %BPG는 원료의약품의 %BPG와 유사하다. 이는 예를 들어 전형적으로 다운스트림 공정에서 감소되는 고분자량 종(HMW) 또는 저분자량 종(LMW)과 대조된다.

본 발명에 따른 방법은 시딩 밀도를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 증가된 시딩 밀도는 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래한다. 따라서, 특정 양태에서, 단계 (a)에서의 시딩 밀도는 ≥0.7x10⁶개 세포/ml, 바람직하게는 0.7x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게는 0.8x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 더욱 더 바람직하게는 0.9x10⁶개 세포/ml 내지 1.3x10⁶개 세포/ml이다. "감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조"라는 용어는 이러한 맥락에서 항체 스페솔리맙이 본 발명의 방법에 따른 범위 내에서 또는 명시된 범위 미만의 시딩 밀도를 사용하는 동일한 방법에 비해 더 낮은 시딩 밀도를 사용하여 동일한 방법에 의해 생산되는 경우와 관련하여 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 방법은 배양 온도를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 세포는 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 36.0℃ 내지 37.5℃에서 배양된다. 바람직하게는 배양 온도는 36.0℃ 내지 37.3℃ 또는 36.5℃에서 37.0℃의 범위이다. 상기 방법은 또한 용존 산소(DO) 농도를 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 배양물 중의 용존 산소(DO) 농도는 30 내지 60%의 범위 내에서, 바람직하게는 40 내지 50%의 범위 내에서, 보다 바람직하게는 40 내지 45%의 범위 내에서 유지된다. 증가된 배양 온도 및/또는 감소된 용존 산소는 감소된 % BPG 및/또는 감소된 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래한다. 용어 "감소 된 % BPG" 및/또는 "감소된 % Man5 구조"는 항체 스페솔리맙이 본 발명의 방법에 따른 청구된 범위 내에서 또는 명시된 범위 미만의 배양 온도 또는 명시된 범위 이상의 용존 산소 농도를 사용하는 동일한 방법에 비해 더 낮은 배양 온도 및/또는 더 높은 DO 농도를 사용하여 동일한 방법에 의해 생산되는 경우와 관련하여 이해되어야 한다. 특정 양태에서 항체 스페솔리맙은 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조, 및/또는 ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG를 갖는다. 배양 온도는 또한 사용된 세포주에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들어, CHO-K1 세포는 약 36.0 내지 37.5℃, 바람직하게는 36.5 내지 37.0℃의 최적 배양 온도를 갖는 CHO-DG44에 비해 더 낮은 온도(예를 들어, 33 내지 36℃)에서 최적 배양 온도를 갖는 경향이 있다.

본원에 사용된 용어 "% Man5 구조"는 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC-HPLC), 바람직하게는 친수성 상호작용 초고성능 액체 크로마토그래피(HILIC-UPLC)에 의해 결정된 모든 글리코실화 피크(도 5에서)의 합 또는 전체 면적에 비한 % 만노스-5 피크 면적(피크 3)을 지칭한다. Man5 구조는 피크 3의 % 피크 면적으로 표시된다.

높은 만노스 구조, 특히 Man5 구조는 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 바람직하게는 친수성 상호작용 초고성능 액체 크로마토그래피(HILIC-UPLC)를 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 양태에서, Man5 분획은 효소적 올리고당 방출과 HILIC-UPLC를 사용한 N-글리코시다제 F(PNGase F) 및 2-아미노 벤즈아미드(2-AB) 표지화 후 측정된다.

BPG 수준과 유사하게, 높은 만노스, 특히 Man5 구조의 수준은 주로 업스트림 공정에 의해 결정되며 다운스트림 공정에 의해 거의 영향을 받지 않는다. 따라서, 스페솔리맙의 HCCF에서 % Man5 구조는 원료의약품의 % Man5 구조와 유사하다. 이는 예를 들어 전형적으로 다운스트림 공정에서 감소되는 고분자량 종(HMW) 또는 저분자량 종(LMW)과 대조된다.

본 발명의 방법에 사용되는 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 CHO-K1 세포, CHO-DG44 세포, DuxB11 세포 또는 CHO GS 결핍 세포이며, 바람직하게는 세포는 CHO-DG44 또는 CHO-K1 세포이다. 효율적인 세포주 개발 과정을 가능하게 하는 CHO 세포는 글루타민 합성효소(GS) 녹아웃 및/또는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 녹아웃에 의해서와 같이 대사적으로 조작되어 각각 메티오닌 설폭시민(MSX) 또는 메토트렉세이트로의 선택을 용이하게 한다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 CHO 세포는 CHO-K1, CHO-DXB11(CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 지칭됨), CHO-DUKX B1, CHO-S, CHO-DG44 및 CHO 글루타민 합성효소(GS) 결핍 세포 또는 이러한 세포주 중 어느 것의 유도체/자손을 포함한다. CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1, CHO-S 및 CHO-DG44 GS 결핍 세포주가 바람직하고, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포가 특히 바람직하며, CHO-DG44 세포가 더욱 더 바람직하다. 본 발명에 따르면, CHO 세포는 부유 세포로서 배양된다. 본 발명의 배지와 함께 사용할 수 있는 포유류 세포의 비제한적인 예는 표 1에 요약되어 있다.

상기 생산 CHO 세포는 세포가 증식할 수 있는 조건하에서 우선적으로 배양된다. 또한, 상기 생산 CHO 세포는 항체 스페솔리맙의 발현에 유리한 조건하에서 우선적으로 배양된다. 그후 항체 스페솔리맙은 세포 및/또는 세포 배양 상청액으로부터 단리된다. 바람직하게는 항체 스페솔리맙은 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수된다.

항체 스페솔리맙은 다운스트림 공정에서 HCCF, 기타 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질 및 오염 물질로부터 정제된다. 다양한 정제 단계에서 수득 및/또는 분석된 샘플을 공정내 제어(IPC) 샘플 또는 공정 중간체라고도 한다. 수확은 전형적으로 수확된 세포 배양액을 생산하기 위한 것과 같은 원심분리 및/또는 여과를 포함한다. 따라서, 수확된 세포 배양액은 또한 정화된 수확된 세포 배양액으로 지칭될 수 있다. 이것은 살아있는 세포를 함유하지 않으며 세포 파편 및 대부분의 세포 성분이 제거되었다. 정화는 전형적으로 원심분리 또는 여과, 바람직하게는 여과를 의미한다. 추가 공정 단계는 항체 스페솔리맙을 오염 물질로부터 분리하기 위한 친화성 크로마토그래피, 특히 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 추가 공정 단계는 바이러스를 불활성화하기 위한 산 처리, HCP 및 DNA와 같은 세포 오염 물질을 제거하기 위한, 바람직하게는 산 처리 후, 심층 여과에 의한 생성물 풀 정화를 포함할 수 있다. 추가 공정 단계는 다음을 이 순서로 또는 개별 사례에 적절할 수 있는 임의의 다른 순서로 포함할 수 있다: 이온 교환 크로마토그래피, 특히 오염된 세포 성분을 추가로 제거하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 응집체와 같은 생성물 관련 오염물질을 제거하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피. 또한, 바람직하게는 다음 공정 단계는 바이러스를 추가로 제거하기 위한 나노여과 및 각각 재조합 단백질을 농축하고 완충액을 교환하기 위한 한외여과 및 정용여과를 포함할 수 있다.

예를 들어, 단백질 A 컬럼, 산 처리, 심층 여과, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피 후 HCCF로부터 정제된 항체 스페솔리맙을 포함하는 샘플은 "정제된 항체 생성물 풀"이라고도 지칭될 수 있다. 정제된 항체 생성물 풀은 추가로 정제될 수 있고, 부형제로 제형화될 수 있으나 그럴 필요는 없다. 따라서, 정제된 항체 생성물 풀은 원료의약품과 동일할 수 있지만 상이한 농도 및/또는 상이한 완충제 시스템에 존재할 수도 있다.

또 다른 양태에서, (a) (i) 배양 배지에서 세포를 ≥0.7x10⁶개 세포/ml로 시딩하는 단계, 및 (ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 선택적으로 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 Cu^{2 +}는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다); (b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및 (c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법이 제공된다. 증가된 시딩 밀도는 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래한다. 특정 양태에서 단계 (a)에서의 시딩 밀도는 0.7x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게는 0.8x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 더욱 더 바람직하게는 0.9x10⁶개 세포/ml 내지 1.3x10⁶개 세포/ml이다. "감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조"라는 용어는 이러한 맥락에서 항체 스페솔리맙이, 선택적으로 본 발명의 방법에 따른 범위 내에서 또는 명시된 범위 미만의 시딩 밀도를 사용하는 동일한 방법에 비해 및 선택적으로 더 낮은 철 및/또는 더 높은 구리 농도를 사용하는 동일한 방법에 비해, 본 발명의 방법에 따른 범위 내에서 또는 명시된 범위 미만의 철 농도 및/또는 명시된 청구된 범위 이상의 구리 농도를 사용하는 동일한 방법에 비해, 더 낮은 시딩 밀도를 사용하여 동일한 방법에 의해 생산되는 경우와 관련하여 이해되어야 한다. 이전 측면과 관련한 양태 및 수정 또는 개시는 이 측면에 따른 방법에도 유사하게 적용된다. 배양 온도를 증가시키면 BPG 및/또는 Man5 구조가 더욱 감소될 수 있다. 정확한 배양 온도는 사용된 CHO 세포에 따라 좌우될 수 있으며, 바람직하게는 36.0℃ 내지 37.5℃이지만, 다른 CHO 세포의 경우 33 내지 36℃일 수 있다. 또한 용존 산소를 감소시키면(dO₂를 30 내지 60%로 유지시키면) BPG 및/또는 Man5 구조가 더욱 감소될 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 증가된 배양 온도 및/또는 감소된 용존 산소는 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래한다. 바람직한 양태에서, 생성된 항체 스페솔리맙은 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조, 및/또는 ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG를 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 항체 스페솔리맙은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된다. 특정 양태에서, 조성물은 (a) ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 바람직하게는 ≤ 6% BPG 7% BPG 미만, 바람직하게는 6% 미만 BPG; 및/또는 (b) 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 2% 미만 Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙을 포함한다. 상기 조성물은 수확 세포 배양액(HCCF), 친화성 포획 풀, 원료의약품 또는 의약품일 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 원료의약품 또는 의약품이다.

또 다른 측면에서, (a) ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG; 및/또는 (b) 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 2% 미만 Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 수확 세포 배양액(HCCF), 친화성 포획 풀, 원료의약품 또는 의약품일 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 원료의약품 또는 의약품이다.

본 발명에 따른 조성물 중의 항체 스페솔리맙은 임계 라이신, 즉 CDR의 3개 아미노산 이내와 같이 항체의 CDR에 가까운 라이신에서 낮은 전체 당화를 포함하고 특히 당화가 없는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서 항체 스페솔리맙은 ≤ 6% 중쇄(HC)의 라이신 당화 변이체, 바람직하게는 ≤ 3% HC의 라이신 당화 변이체를 갖고/갖거나 중쇄(HC)의 라이신 K38 및 K67은 당화되지 않고, K23에서의 당화는 ≤ 0.3%이다. 특정 양태에서 항체 스페솔리맙은 추가로 ≤ 2% 경쇄(LC)의 라이신 당화 변이체, 바람직하게는 ≤ 1% 경쇄(LC)의 라이신 당화 변이체를 갖는다. 생성된 LC 및 데글리코실화 HC를 역상 고성능 크로마토그래피(RP-HPLC)로 분리하고 ESI Q-TOF MS(Xevo G2 Q-TOF)로 온라인으로 분석하였다. 단백질 서브유닛 및 상응하는 글루코스 부가물(Mglucose 부가 = 162Da)을 분석하고 획득한 스펙트럼을 MaxEnt™ 알고리즘을 사용하여 비권취시킨다.

본원에 사용된 용어 "% 중쇄의 라이신 당화 변이체"는 총 중쇄(당화 및 비당화 HC)의 당화 중쇄(HC + 글루코스)의 백분율을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "% 경쇄의 라이신 당화 변이체"는 총 경쇄(당화 및 비당화 LC)의 당화 경쇄(LC + 글루코스)의 백분율을 지칭한다. LC 및/또는 HC의 라이신 당화 및 비당화 변이체는 역상 고성능 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 환원 및 데글리코실화된(예를 들어, N-글리코시다제 F 처리된) LC 및 HC를 분리하고 ESI Q-TOF MS에 의해 분석함으로써 결정될 수 있다.

단일 라이신의 당화는 역상 액체 크로마토그래피(LC-MS) 및 ESI-MS에 의해 스페솔리맙의 변성 및 요오드아세트산 알킬화 후 케모트립신 소화된 펩티드에서 분석될 수 있다. 당화 펩티드의 상대적인 양은 야생형 펩티드 및 글루코스 부가물(+ 162Da)을 지닌 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램에 기반하여 정량화된다.

또한, 본원에는 ≤ 6% HC의 라이신 당화 변이체, 바람직하게는 ≤ 3% HC의 라이신 당화 변이체를 포함하고/하거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)은 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화는 ≤ 0.3%인 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 양태에서, 항체 스페솔리맙은 추가로 ≤ 2% 경쇄(LC)의 라이신 당화 변이체, 바람직하게는 ≤ 1% 경쇄(LC)의 라이신 당화 변이체를 갖는다.

또한, 본원에는 1% 미만의 APG 하위분획 AP4 및 4% 미만의 AP3 분획, 특히 1% 미만의 AP4 및 1% 미만의 AP3b 분획을 포함하는 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물이 제공된다.

상기 측면에서, 본 발명은 또한 다음의 항목들을 포함하는 것을 인지할 것이다:

1. 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법으로서,

(a) (i) 배양 배지에서 세포를 시딩하는 단계, 및

(ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계;를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 Cu^{2 +}는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다);

(b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및

(c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.

2. 항체 스페솔리맙의 % BPG를 감소시키는 방법으로서,

(a) (i) 배양 배지에서 세포를 시딩하는 단계, 및

(ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계;를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, %BPG는 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전에 및/또는 시딩 후 2일 이내에 배양 배지에 제공되는 Cu^{2 +} 농도를 감소시키고 철 농도를 증가시킴으로써 감소되고, 바람직하게는 배양 배지에 제공되는 구리 농도는 0.35 내지 1.2μM이고, 배양 배지에 제공되는 철 농도는 1500μM 이상이다);

(b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및

(c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.

3. 상기 Cu^{2 +} 및 철이 단계 (i)에서 시딩 전 및/또는 시딩 후 1일 이내에 배양 배지에 첨가되는, 항목 1 또는 2의 방법.

4. 상기 Cu^{2 +} 및 철이 하나 이상의 볼루스 첨가로서 또는 연속적으로 배양 배지에 첨가되는, 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.

5. 상기 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산이 CHO 게놈 내에 안정적으로 통합되는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

6. 상기 공급 배지가 배양의 0일째 내지 3일째에 시작하여 첨가되는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

7. 선택적으로 상기 공급 배지가 15nM 미만 Cu^{2 +}을 매일 및/또는 최대 100μM 철을 첨가하는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

8. 상기 배양 배지에서 증가된 철 농도 및/또는 감소된 구리 농도가 감소된 % BPG를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래하는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

9. 상기 항체 스페솔리맙이 ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG를 갖는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

10. 상기 BPG가 양이온 교환 크로마토그래피(CEX HPLC)를 사용하여 결정되는, 항목 8의 방법.

11. 단계 (a)에서의 시딩 밀도가 ≥0.7x10⁶개 세포/ml, 바람직하게는 0.7x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게는 0.8x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 더욱 더 바람직하게는 0.9x10⁶개 세포/ml 내지 1.3x10⁶개 세포/ml인, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

12. 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법으로서,

(a) (i) 배양 배지에서 세포를 ≥0.7x10⁶개 세포/ml의 세포 밀도로 시딩하는 단계, 및

(ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계;를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 선택적으로 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 Cu^{2 +}는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다);

(b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및

(c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.

13. 증가된 시딩 밀도가 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래하는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

14. 상기 세포가 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 36.0℃ 내지 37.5℃에서 배양되고/되거나 상기 배양에서 용존 산소(DO) 농도가 30 내지 60%의 범위 내에서 유지되는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

15. 증가된 배양 온도 및/또는 감소된 용존 산소가 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래하는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

16. 상기 항체 스페솔리맙이 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조, 및/또는 ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG를 갖는, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

17. 상기 CHO 세포가 CHO-K1 또는 CHO-DG44 세포인, 선행 항목들 중 어느 하나의 방법.

18. (a) ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG; 및/또는

(b) 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.

19. 상기 항체 스페솔리맙이 항목 1 내지 17 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는, 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.

20. 상기 조성물이 수확 세포 배양액(HCCF), 친화성 포획 풀, 원료의약품 또는 의약품, 바람직하게는 원료의약품 또는 의약품인, 항목 18 또는 19의 조성물.

21. 상기 조성물이 7.5% 미만 BPG 및/또는 5% 미만 Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙을 포함하는 의약품인, 항목 18 내지 20 중 어느 하나의 조성물.

22. 상기 항체 스페솔리맙이 ≤ 6% 중쇄(HC)의 라이신 당화 변이체를 포함하고/하거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)은 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화는 ≤ 0.3%인, 항목 18 내지 21 중 어느 하나의 조성물.

23. ≤ 6% 중쇄(HC)의 라이신 당화 변이체를 포함하고/하거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)은 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화는 ≤ 0.3%인 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.

24. 1% 미만의 APG 하위분획 AP4 및 4% 미만의 AP3 분획, 특히 1% 미만의 AP4 및 1% 미만의 AP3b 분획을 포함하는 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.

실시예

세포주

CHO 세포주(CHO-DG44)를 무혈청 배지 조건에 맞게 조정하고 DNA로 추가로 형질감염시켜 재조합 mAb 스페솔리맙을 생산하였다. 구체적으로, 무혈청 배지(HEX II로 명명됨)에 독립적으로 적응된 BI HEX(Boehringer-Ingelheim High Expression) CHO-DG44 유래 CHO 세포주를 사용하였다. 이들 세포는 DHFR(디하이드로폴레이트-환원효소)이 결핍되어 있으며 메토트렉세이트가 선택 마커로 사용되었다.

분석 방법

세포 농도 및 세포 생존율은 CEDEX Hires(버전 2.2.3) 자동 세포 분석기(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 트리판 블루 배제 방법으로 결정하였다. 배지에서 생성된 재조합 mAb의 농도는 측광법에 기반하여 Konelab 60i(Thermo Scientific, Dreieich, Germany) 분석기로 정량하였다. Konelab 60i 기기는 세포 배양 상청액에서 글루코스, 락트산(락테이트), 글루타민, 글루타메이트 및 암모늄과 같은 대사산물의 정량에도 사용되었다. 삼투압 프로파일은 osmomat 자동 장치(Gonotec GmbH, Berlin, Germany)로 분석하였다. 이 방법은 용해된 입자의 양에 비례하는 특정 용액의 극저온 빙점(cryoscopic freezing point)에 기반한다. 용존 이산화탄소 pCO2, 용존 산소 pO2 및 pH는 Rapidlab 248/348 혈액 가스 분석기(Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn, Germany)를 사용하여 매일 측정하였다. 이러한 기기 및 필요한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 바이오 제약 공정 개발 및 제조에서 공정 모니터링 및 제어에 사용된다.

배치식 및 유가식 모드

항체 생산의 경우, 전형적으로 유가식 공정이 최종 생산 단계에서 사용되는 반면, 배치식 배양은 주로 최종 생산 단계 이전의 세포 확장 단계에서 수행된다. 일련의 배치식 배양은 세포 확장 동안 시드 트레인(seed train)으로 지칭되며, 이는 세포가 각 확장 단계에서 더 큰 배양 용적을 가진 배양 용기로 옮겨진다는 것을 의미한다. 최종 생산 단계의 배치 공정은 일반적으로 높은 생산성을 야기하지 못하며 이에 따라 재조합 단백질을 제조하는데 거의 사용되지 않는다. 유가식 공정에서는 신선한 배지로 영양소 보충을 보상하기 위해 배양 동안 농축된 공급 배지가 추가된다. 이러한 공정은 더 높은 생산성을 달성하며 이에 따라 재조합 단백질 생산에 주로 사용된다. 배치식 모드와 달리, 농축된 공급 배지를 추가하여 영양소를 보충하면 락테이트 또는 암모늄과 같은 원치않는 대사 부산물에 의한 세포 성장 억제도 줄어든다. 전형적으로 유가식 공정은 교반 탱크의 최대 용량보다 훨씬 낮은 용적에서 시작되므로 생물반응기 배양 시간에 걸쳐 농축된 영양 용액을 추가할 수 있다. 유가식 배양은 14일 동안 수행되었다.

생물반응기 배양

생물반응기 실험은 독점적인 기초 및 공급 배지를 사용하여 최대 15ml 용적을 갖는 제어된 48-미니-생물반응기 시스템(ambr 15 생물반응기 시스템) 또는 250ml의 공칭 용적을 갖는 제어된 24-미니-생물반응기 시스템(ambr 250 생물반응기 시스템)에서 수행하였다. 완전히 제어된 생물반응기는 유가식 모드로 수행되었다. 농축된 공급 용액을 33 ml/L/d의 공급 속도로 1일째 배양부터 공급 펌프에 의해 연속적으로 첨가하거나 표시된 바와 같이 (배양 시작 용적에 기초하여) 실험에서 다양하였다. 시딩 밀도는 1.0 x 10⁶개 세포/ml로 설정하거나 표시된 바와 같이 실험에서 다양하였다. 용존 산소 농도는 60%로 유지하거나 표시된 바와 같이 실험에서 다양하였다. 장기간에 걸친 세포의 확장은 표현형 안정성을 보장하기 위해 세포 성장 및 배양 분할을 위한 표준 시드 트레인 프로토콜을 따랐다. 이 절차는 상이한 시점에서 상이한 실험 설정 간의 비교를 보장한다. 표준 공정 포맷은 7.10 내지 6.95 (+/- 0.25)의 pH 범위 및 48-미니-생물반응기 시스템에서 1000 내지 1150rpm의 일정한 교반 속도 및 24-미니-생물반응기 시스템에서 614rpm의 일정한 교반 속도로 구성된다. 온도는 36.5℃로 유지하거나 실험에서 다양하였다. 글루코스는 배양 기간에 걸쳐 실제 글루코스 농도를 2 내지 4g/l 사이로 유지하기 위해 필요에 따라 공급하였다. 상기한 바와 같은 분석 방법은 세포 배양에 이상적인 영양소 공급을 제공하기 위해 세포 수, 세포 생존율 및 주요 탄소 대사산물 농도와 같은 주요 배양 매개변수를 결정하는 데 사용되었다. 생물반응기 시스템에서 pH 및 pO2는 온라인으로 모니터링하였다. 오프라인 공정 매개변수 및 설정값은 예를 들어, pH 제어, 영양소 공급 추가, 온도 제어, 교반 및 가스 발생을 모니터링하기 위한 자동 폐쇄-루프 시스템을 사용하는 제어 소프트웨어에 의해 완전히 제어되었다. 이러한 배양 공정은 2,000 및 12,000L까지 성공적으로 확대되었다.

전하 변이체의 검출

양이온 교환 크로마토그래피(CEX HPLC)는 전하에 따라 단백질 및 단백질 집단을 분리할 수 있는 반면 구배에서의 염 함량은 일정한 pH에서 증가한다. 단백질은 이들의 관능 그룹 및 미세-이질성(micro-heterogeneity)으로 인해 양전하 또는 음전하를 지닐 수 있다. CEX HPLC는 이러한 pH 의존적 전하를 사용하여 상이한 단백질/단백질 변형의 분리를 촉진한다.

이동상 A 중의 약 1mg/mL의 항체 농도를 포함하는 샘플을 제조하고 구배 용출을 갖는 HPLC 시스템, 온도 제어 자동샘플러 및 HPLC 컬럼 MAbPac SCX-10, 4 x 250nm, 10μm를 사용한 UV 검출기를 사용하여 분석하였다. HPLC 크로마토그램은 10mM MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판설폰산, 4-모르폴린 프로판설폰산)(pH 7.6)의 제1 이동상(용출액 A) 및 10mM MOPS, 100mM 염화칼륨(pH 7.6)의 제2 이동상(용출액 B)을 사용하여 생성된다. 용출은 0.8mL/분의 유속으로 15%에서 85% 용출액 A까지 40분의 선형 구배를 실행함으로써 수행하였다. 검출은 280nm 파장의 UV 검출기에서 수행하였다.

APG(산성 피크 그룹), 주 피크 및 BPG(염기성 피크 그룹)는 연속 기준선을 사용하여 분할하여 분리하였다. 적분 범위는 대략 2분에 시작하여 대략 44분에 끝난다. 산성 피크 그룹은 주 피크로부터 다음의 순서로 용출되는 7개의 하위종으로 더욱 분리될 수 있다. 다음 체류 시간에서 AP1(a,b,c), AP2, AP3(a,b) 및 AP4(표 2). 단일 피크의 적분은 아래 체류 시간을 사용하여 분할된 반면 주 피크는 기준 피크이다. 적분은 도 4a 내지 b에 표시된 기준 크로마토그램에 따라 수행하였다.

글리코실화 변이체의 검출

분석 샘플 및 참조 표준물질은 샘플당 0.2mg 단백질을 사용하여 이중으로 준비하였다. 올리고당을 PNGase F(NEB P0704L, 제조업체 지침에 따름)로 샘플/참조 표준물질로부터 효소적으로 방출시키고, 2-아미노 벤즈아미드(2-AB(Ludger; LT-KAB-A2), 제조업체 지침에 따름)로 표지하였다. 정제수를 블랭크 대조군으로 사용하였으며 샘플/참조 표준물질과 병행하여 준비하였다. 표지된 올리고당을 HILIC 컬럼(Glycan BEH Amide 컬럼, 130Å, 1.7μm, 2.1mm × 150mm) 및 형광 검출기(FLD)를 갖는 UPLC(예를 들어, Nexera, Fa. Shimadzu)를 사용하여 분석하였다. 이 방법은 올리고당 프로파일(Oligo Map)을 결정하고 스페솔리맙 원료의약품 또는 단백질 A 풀의 올리고당 구조를 정량하는 데 사용되었다. N-글리칸 방출 및 2-AB-표지화 후 분취량을 아미노프로필 카트리지(예를 들어, SepPak; Waters; 진공 챔버 또는 자동 고체상 추출 시스템을 사용하는 WAT020840)를 사용하여 정제하였다. 용출된 분획을 증발기를 사용하여 건조시키고 0.7mL/분의 유속 및 파장 FL 검출기(흡광 파장 330nm, 방출 파장 420nm), 이동상 A(0.05M 암모늄 포맷, pH 4.5/50% 아세토니트릴(ACN)) 및 이동상 B: 아세토니트릴 HPLC-등급(ACN))를 다음 구배로 사용하여 HPLC 분석 전에 80μl에 재현탁시켰다. 용출은 50%에서 80% 용출액 A까지 25분의 선형 구배를 실행함으로써 수행하였다.

참조 표준물질 및 샘플의 크로마토그램에 대한 적분 범위는 대략 4 내지 20분이다. 체류 시간은 사용된 장비 및 이동상에 따라 약간 달라진다. 피크 3의 상대적 피크 면적(도 5, (올리고 맵 피크 3)이라고도 함)은 아래 공식에 따라 계산된다:

피크 x = 1, 2, 3, 4, 5 또는 6

절대 피크 면적 = 모든 적분된 피크 면적의 합

한 번의 주입으로부터의 모든 피크의 상대적 피크 면적을 피크의 합(절대 피크 면적)이라고 한다. 피크 3은 높은 만노스(Man5) 구조를 포함한다.

실시예 1: BPG 및 높은 만노스에 대한 철 및 구리의 영향

산성 및 염기성 전하 변이체(산성 피크 그룹(APG) 및 염기성 피크 그룹(BPG)) 및 높은 만노스 종을 포함한, 세포 배양 성능 및 생성물 품질 매개변수에 대한 상이한 농도의 철 및 구리의 효과 및 이들의 상호작용을 실험 설계(design of Experiment, DOE) 접근법으로 조사하였다. DOE 연구는 다양한 다중 입력 요인을 허용하고 상이한 출력 매개변수에 대한 이들의 조합 및 단일 효과를 결정하는 데이터 수집 및 분석 도구이다. 따라서, 이러한 종류의 연구는 공정에서 동시에 다수의 입력의 수준을 변경함으로써 공정에서 여러 요인의 상호작용을 식별할 수 있다.

완전 자동화된 15mL 미니-생물반응기에서의 24개 배양 실험을 상기한 바와 같은 공정 조건으로 수행하였다. 세포를 1.0 x 10⁶개 세포/ml로 기초 배지에 시딩하였다. 기초 배지 중의 철 농도는 시트르산철콜린(Dr. Paul Lohmann GmbH KG)를 철 공급원으로 사용하여 1.4 내지 6.0mM 사이에서 다양하였다. 시트르산철콜린(0.7, 1.4, 2.1 및 3.0g/L 시트르산철콜린)를 멸균 여과 전에 5.8μM 철(질산제2철 및 황산제1철)을 포함하는 배지 제형에 직접 첨가하였다. 구리는 CuSO₄로서 제공되었고, 0.36 내지 1.71μM 사이에서 다양하였다. 추가 구리 용액(CuSO₄)을 접종 전에 생물반응기에서 0.139μM CuSO₄를 포함하는 기초 배지에 직접 사후 멸균 첨가로 보충하였다. 공급 배지를 1.13mM 철(시트르산철콜린으로서 제공됨; 565μM) 및 0.43m M CuSO₄을 포함하는 30ml/L/일로 매일 첨가하였다.

통계 소프트웨어 제품군(Design Expert, Stat Ease, Inc.)으로 평가된 출력 매개변수는 스페솔리맙 생성물 역가, 통합 생존 세포 밀도, 14일차 생존율 및 생성물 품질 매개변수 APG, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)로 측정한 BPG 및 HILIC UHPLC로 측정된 만노스 5 구조를 통해 표시된 높은 만노스 종이었다(표 3).

도 1a 내지 f에 나타낸 결과는 높은 철 농도 및 낮은 구리 농도에서 가장 낮은 BPG에 도달한다는 것을 입증한다(도 1a, b 및 c). 마찬가지로, 보다 높은 철 농도 및 보다 낮은 구리 농도는 역가(도 1d), 생존 세포 밀도(도 1e) 및 생존율(도 1f)에 유리한 것으로 보인다.

실시예 2: BPG 및 높은 만노스에 대한 공정 매개변수의 영향

세포 배양 공정 매개변수 시딩 세포 밀도, 배양 온도 및 용존 산소 농도를 DOE 접근법에서 평가하여 생성물 품질 매개변수 BPG 및 높은 만노스 종에 대한 이들의 영향을 조사하였다. 시딩 세포 밀도는 0.5 내지 150만개 세포/ml로 다양하였으며, 온도는 35℃ 내지 38℃로 다양하였으며, 생물반응기 내의 용존 산소 농도는 40 내지 80%까지 다양하였고, 공급 속도는 일일 배양 시작 용적에 기반하여 L당 29.7 내지 36.3 mL까지 다양하였다. 24개의 병렬 실행은 완전 자동화된 24-미니-생물반응기 시스템에서 14일 동안 유가식 모드로 수행하였다. 다른 배양 매개변수 및 분석 방법은 상기한 바와 같이 수행하였다. 통계 소프트웨어 제품군(Design Expert, Stat Ease, Inc.)으로 평가된 출력 매개변수는 스페솔리맙 생성물 역가, 통합 생존 세포 밀도, 14일차 생존율 및 생성물 품질 매개변수 APG, CEX로 측정된 BPG 및 HILIC-UHPLC로 결정된 높은 만노스5 종이었다(표 4).

도 2a 내지 h에 나타낸 결과는 높은 시딩 밀도 및 보다 높은 온도에서 가장 낮은 BPG에 도달하고(도 2a, b 및 c) 높은 시딩 밀도 및 낮은 온도에서 가장 낮은 높은 만노스(5Man) 구조에 유사하게 도달한다(도 2d 및 e)는 것을 보여준다. 마찬가지로, 역가(도 2f) 및 생존 세포 밀도(도 2g)는 시딩 밀도가 높고 배양 온도가 높을수록 증가한다. 배양 14일 후 생존율은 시딩 밀도가 높고 배양 온도가 높을수록 약간 감소하는 것으로 보이지만(도 2h), 이것이 역가에 부정적인 영향을 미치지는 않는 것으로 보인다. 도 3a 내지 d에 나타낸 결과는 용존 산소의 감소가 BPG(도 3a), 높은 만노스 구조(도 3b), 역가(도 3c) 및 생존 세포 밀도(도 3d)에 유리한 영향을 미친다는 것을 입증한다.

실시예 3: 상이한 이종 변이체(APG/BPG)의 IL36 및 FcRN 결합

스페솔리맙에 대해 수집된 CEX 분획의 효능을 결정하기 위해, IL36R 결합(SPR) 및 IL36R 생물검정을 수행하였다(표 5).

단리된 CEX 분획의 대부분은 원료의약품 소스 물질의 효능에 필적하는 효능을 보인다. 가장 산성 분획 AP4에 대해 및 - 덜한 정도로 - 산성 분획 AP3b에 대해 감소된 효능이 관찰되었다(FcRn 결합(SPR)에 대해서도 동일하게 적용됨). 분획 둘 다 및 특히 분획 AP4는 다소 불분명한 용출 프로파일을 보이며(도 4a 및 b), 낮은 상대 존재비(relative abundance) < 1%를 갖는다(표 5).

유사하게, 가장 염기성인 분획 BP3도 1.5% 미만의 낮은 상대 존재비를 갖는 다소 불분명한 용출 프로파일(도 4a 및 b)을 보인다(표 5). IL36R 결합(SPR) 내에서 이 분획은 감소된 회수율을 보였으며, 이는 도 4c에 도시된 이 분획 내에서 관찰된 올리고머의 증가에 부합하는 단백질 A/G 센서 칩에 대한 감소된 결합을 의미한다.

N.A. = 분석되지 않음(재료 부족으로 인해)

^(a) 회수율은 센서 칩에 고정된 단백질 A/G에 결합하는 종의 양을 나타낸다(SPR 분석의 첫 번째 단계).

^(b) 효능은 단백질 A/G에 결합된 종의 IL36R 결합 활성을 나타낸다(SPR 분석의 두 번째 단계).

BPG 종

염기성 피크 그룹은 특히 상이한 N-말단 및 C-말단 전하 변이체를 포함한다. 관찰된 N-말단 전하 변이체는 N-말단 파이로-글루타민 대신 N-말단 글루타민을 함유하는 스페솔리맙이다(주로 분획 BP2에서 경쇄의 N-말단에서 관찰되지만, 또한 덜한 정도로 분획 BP1에서 중쇄의 N-말단에서도 관찰됨). 또한, 중쇄의 N-말단에 추가 아미노산 VHS를 함유하는 스페솔리맙은 분획 BP3(N-말단 신호 펩티드의 잔재)에 풍부하다. 관찰된 C-말단 전하 변이체는 중쇄 중 하나(분획 BP1) 또는 둘 다(분획 BP3)의 C-말단에 추가 라이신을 함유하는 스페솔리맙이다. 또한, 중쇄 중 하나(분획 BP1) 또는 둘 다(분획 BP3)의 C-말단에 프롤린 아미드를 함유하는 스페솔리맙이 풍부하다(C-말단 글리신의 제거 및 인접 프롤린의 아미드화에 의해 생성됨).

APG 종

산성 피크 그룹은 특히 N-아세틸뉴라민산(NANA)을 함유하는 N-글리칸을 지닌 스페솔리맙 및/또는 N386+N391+N392(HC)에 탈아미드화를 지닌 스페솔리맙을 포함한다. 또한, 하나의 경쇄가 결손된 스페솔리맙으로 구성된 것으로 추정되는 단편의 적당한 농축이 보다 산성인 피크 내에서 관찰된다.

실시예 4: 라이신 당화 변이체

당화는 다양한 유형의 공유 부가물 형성의 결과이며, 여기서 글루코스는 라이신 잔기의 1급 아민 또는 N-말단과 반응하여 산성 변이체를 형성할 수 있다. 스페솔리맙의 당화는 글루코스가 배양 배지에 함유되어 있기 때문에 업스트림 제조 중에 발생한다. 당화된 종은 세포 배양에서 및 수확시 생성될 수 있으며, 여기서 세포 및 스페솔리맙 분자는 더 높은 헥소스 수준에 노출된다. 환원당은 다운스트림 제조 공정에 적용되지 않지만, 약제학적 제형, 즉 의약품에 존재하거나 형성될 수 있다.

당화에 대한 라이신 잔기의 민감도는 용매 접근성(3차 구조)과 이의 측쇄의 화학적 환경(1차 및 2차 구조)에 의해 결정된다. IgG에서, 대부분의 당화는 30개 이상의 라이신 잔기에 걸쳐 분포된다(Miller AK, Hambly DM, Kerwin BA, Treuheit MJ, Gadgil HS, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2011, 100(7): 2543-2550). 스페솔리맙은 당화를 겪을 수 있는, 경쇄(LC; 서열 번호 2)에 11개의 라이신 잔기를 갖고 중쇄(HC; 서열 번호 1)에 33개의 라이신 잔기를 갖는다. 중쇄의 CDR에 가까운 3개의 라이신 잔기가 있기 때문에(잠재적으로 임계 라이신: HC -K23, K38, K67; 서열 번호 1), 당화는 항체의 효율/효능에 중요할 수 있다.

LC-MS를 사용한 상대적 정량화를 통한 당화의 합(환원됨)

LC-MS로 환원된 전체 당화의 상대적 정량화를 결정하기 위해, 1mg/mL로 희석된 스페솔리맙 100μL 샘플을 1μL(1U/μL) N-글리코시다제 F(Roche PO11365193001 또는 균등물)로 처리하여 1μL의 1M DTT로 환원시키기 전에 N-결합된 올리고당을 제거하였다. 57℃에서 20분 동안 환원을 수행한다. 생성된 LC 및 데글리코실화된 HC를 역상 고성능 크로마토그래피(RP-HPLC)로 분리하고 ESI Q-TOF MS(Xevo G2 Q-TOF)로 온라인으로 분석하였다. 단백질 서브유닛 및 상응하는 글루코스 부가물(Mglucose 첨가 = 162Da)을 분석하고 획득된 스펙트럼을 MaxEnt™ 알고리즘을 사용하여 비권취(deconvoluted)시킨다(표 6).

LC-MS를 사용한 상대적 정량화(단일 당화 부위)

LC-MS로 단일 당화 부위의 상대적 정량화를 결정하기 위해, 샘플을 변성시키고 Tris 구아니디늄 하이드로클로라이드 완충액(7M 구아니디늄 하이드로클로라이드/100mM Tris/HCl, pH 8.3으로 샘플을 1mg/mL로 희석)으로 완충액 교환하고, 57℃에서 20분 동안 디티오트레이톨(DTT, 최종 농도: 10mM)로 환원시키고, 요오드아세트산(IAA, 최종 농도: 10mM)으로 암흑에서 실온에서 20분 동안 알킬화하였다. 그후, 50mM DTT를 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 환원 및 알킬화 후, 샘플을 다시 100mM 중탄산암모늄 완충액으로 완충액 교환하고, 계면활성제의 존재하에 키모트립신을 사용하여 효소적으로 소화시켰다. 37℃에서 30분 후에 포름산(1:120, 용적:용적)을 첨가하여 반응을 중단시킨다. 펩티드를 역상 액체 크로마토그래피로 분리하고 ESI-MS로 분석한다. 당화된 펩티드의 상대적인 양은 야생형 펩티드 및 글루코스 부가물(+ 162Da)을 지닌 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램에 기반하여 정량한다(표 7).

^(a) CDR에 가까움, ^(b) 높은 글루코스 스트레스 조건(예를 들어, 0.5M 글루코스) 하에서 증가된 당화, ^(c) 라이신은 동일한 펩티드 내에 있으며 단지 잔기들을 구별하지 않고 함께 분석됨, ^(d) 높은 글루코스 스트레스 조건(예를 들어, 0.5M 글루코스) 하에서 일부 당화

중쇄 및 경쇄에 대한 당화 라이신 변이체는 각각 ≤ 3% 및 ≤ 1%의 낮은 수준이지만 검출 가능하고(표 6) 5 내지 15%의 재조합 IgG에 대한 문헌에서 전형적으로 발견되는 낮은 범위이다(Eon-Duval A et al, J Pharm Sci.,　2012,　101(10): 3604-3618). 또한 놀랍게도, 임계 잔기에 대한 당화는 검출 한계 미만이거나 K23의 경우 0.3% 미만인 것으로 밝혀졌다(표 7, 임계 잔기는 굵은 글씨로 강조 표시됨).

본 발명의 특정 측면 및 양태가 기재되었지만, 이들은 단지 예시의 방식으로 제시된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 실제로, 본원에 기재된 신규한 방법 및 시스템은 이의 취지를 벗어나지 않으면서 다양한 다른 형태로 구현될 수 있다. 첨부된 특허청구범위 및 이들의 균등물은 본 발명의 범위 및 취지에 속하는 이러한 형태 또는 변형을 포괄하기 위한 것이다.

본 개시내용에 인용된 저널 논문을 포함한 모든 특허 및/또는 공개물은 본원에 참고로 명시적으로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> Method for producing spesolimab <130> 117008P1140PC <150> EP2117181.2 <151> 2021-05-03 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spesolimab heavy chain amino acid sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Val Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Arg Asn Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Val Val Phe Tyr Gly Glu Pro Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spesolimab light chain amino acid sequence <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spesolimab variable heavy chain amino acid sequence <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Val Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Arg Asn Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Val Val Phe Tyr Gly Glu Pro Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spesolimab variable light chain amino acid sequence <400> 4 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (16)

1. 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법으로서,
   (a) (i) 배양 배지에서 세포를 시딩하는 단계, 및
   (ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계;를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 Cu^{2 +}는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다);
   (b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및
   (c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 Cu^{2 +} 및 철이 단계 (i)에서 시딩 전 및/또는 시딩 후 1일 이내에 배양 배지에 첨가되는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배양 배지에서 증가된 철 농도 및/또는 감소된 구리 농도가 감소된 % 염기성 피크 그룹(% BPG)을 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래하는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 스페솔리맙이 ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG를 갖는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서의 시딩 밀도가 ≥0.7x10⁶개 세포/ml, 바람직하게는 0.7x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 보다 바람직하게는 0.8x10⁶개 세포/ml 내지 1.5x10⁶개 세포/ml, 더욱 더 바람직하게는 0.9x10⁶개 세포/ml 내지 1.3x10⁶개 세포/ml인, 방법.
6. 세포 배양에서 항체 스페솔리맙을 제조하는 방법으로서,
   (a) (i) 배양 배지에서 세포를 ≥0.7x10⁶개 세포/ml의 세포 밀도로 시딩하는 단계, 및
   (ii) 세포 배양에서 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계로서, 세포 배양에서 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 상기 단계;를 포함하는, 유가식 배양을 사용하여 무혈청 세포 배양 배지에서 항체 스페솔리맙을 암호화하는 핵산을 포함하는 CHO 세포를 배양하는 단계(여기서, 선택적으로 단계 (i)에서 세포를 시딩하기 전 및/또는 시딩 후 2일 이내에 Cu^{2 +}는 0.35 내지 1.2μM로 및 철은 1500μM 이상으로 배양 배지에 첨가된다);
   (b) 항체 스페솔리맙을 포함하는 세포 배양 상청액을 수확하는 단계; 및
   (c) 선택적으로 세포 배양 상청액으로부터 항체 스페솔리맙을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 시딩 밀도가 감소된 % 염기성 피크 그룹(% BPG) 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래하는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세포에 공급 배지를 공급하는 것을 포함하는 항체 스페솔리맙의 생산을 허용하는 조건하에 36.0℃ 내지 37.5℃에서 배양되고/되거나 상기 배양에서 용존 산소(DO) 농도가 30 내지 60%의 범위 내에서 유지되는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 배양 온도 및/또는 감소된 용존 산소가 감소된 % BPG 및/또는 % Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙의 생산을 초래하는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 스페솔리맙이 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조, 및/또는 ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG를 갖는, 방법.
11. (a) ≤ 7.5% BPG, 바람직하게는 ≤ 7% BPG, 보다 바람직하게는 ≤ 6.5% BPG, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 6% BPG; 및/또는
    (b) 5% 미만 Man5 구조, 바람직하게는 4% 미만 Man5 구조, 보다 바람직하게는 3% 미만 Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 7.5% 미만 BPG 및/또는 5% 미만 Man5 구조를 갖는 항체 스페솔리맙을 포함하는 의약품인, 조성물.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 스페솔리맙이 ≤ 6% 중쇄(HC)의 라이신 당화 변이체를 포함하고/하거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)은 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화는 ≤ 0.3%인 조성물.
15. ≤ 6% 중쇄(HC)의 라이신 당화 변이체를 포함하고/하거나 라이신 K38(HC) 및 K67(HC)은 당화되지 않고 K23(HC)에서의 당화는 ≤ 0.3%인 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.
16. 1% 미만의 산성 피크 그룹(APG) 하위분획 AP4 및 4% 미만의 AP3 분획, 특히 1% 미만의 AP4 및 1% 미만의 AP3b 분획을 포함하는 항체 스페솔리맙을 포함하는 조성물.

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