KR20230172384A - 자연 살해 t 세포의 리간드와 암 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 면역 예방 및 치료용 백신에 관한 것으로, 구체적으로 자연 살해 T 세포 리간드이자 당지질의 일종인 알파-갈락토실세라마이드 (alpha-galactosylceramide; 이하, α-GC)가 적재된 자연 살해 세포를 포함하는 면역 치료 백신에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 자연 살해 세포가 수지상 세포에 비해 수득이 용이하며 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 자연 살해 세포의 면역화는 유의한 수준의 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 뿐 아니라 악성종양의 치료 효과가 있으므로 항암 면역 치료제로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 암 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 백신에 관한 것이다.
자연 살해 세포는 퍼포린 (perforin)과 그랜자임 (granzyme)이 포함된 세포 독성 과립의 탈과립 반응, 세포사멸 수용체 (death receptor)를 매개한 세포 자살과 IFN-γ 생성을 통해 암 세포와 바이러스 감염된 세포를 제거하여 암의 발생, 성장 및 전이를 막는 중요한 선천성 면역 세포로 잘 알려져 있다 (Vivier et al., Science, 331: 44-49, 2011). 표적 세포의 세포 독성을 유발한다는 점이 세포 독성 CD8+ T 세포와 유사하나, 자연 살해 세포는 세포 독성 T 세포와 달리 항원 특이성이 없고 감작이나 면역화 과정을 필요로 하지 않으며 세포 독성 T 세포가 공격할 수 없는 MHC class I 발현이 낮은 암 세포를 사멸시킬 수 있어, 항암 면역에 있어 고유의 역할을 한다 (Uzhachenko and Shanker., Frontiers in Immunology, 10: 1906, 2019). 세포 독성 CD8+ T 세포와는 다른 자연 살해 세포만의 특성으로 인해 CAR-NK (Chimeric Antigen Receptor-NK)와 같은 자연 살해 세포의 세포 독성 기능 향상에 집중한 항암 면역 치료 연구가 활발히 이루어지고 있다 (Shimasaki et al., Nature Reviews Drug Discovery, 19: 200-218, 2020).
불변성 자연 살해 T 세포 (invariant natural killer T cell; iNKT)는 불변성 T 세포 수용체 (invariant T cell receptor)를 발현하는 선천성 면역 세포로, 주로 사이토카인 분비를 통해 암, 감염성 질환과 자가면역 질환 등 다양한 면역 질환에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다 (Bendelac et al., Annual Review of Immunology, 25: 297-336, 2007). 자연 살해 T 세포의 대표적인 리간드인 알파-갈락토실세라마이드 (α-GC)는 해면 동물 Agelas mauritianus 에서 추출된 당지질로, CD1d 분자에 의해 제시돼 자연 살해 T 세포의 Vα14-Jα18+ T 세포 수용체와 결합하여 불변성 자연 살해 T 세포를 활성화시킨다 (Kawano et al., Science, 278: 1626-1629, 1997). α-GC에 의해 활성화된 자연 살해 T 세포는 IL-4와 IFN-γ 등의 다양한 사이토카인을 빠르게 생산하여 자연 살해 세포를 활성화시키고 수지상 세포의 성숙과 T 세포 및 B 세포의 활성 및 분화를 촉진시키는 등 후천성 면역 반응을 유도한다 (Kaer et al., Nature Reviews Immunology, 5: 31-42, 2005).
α-GC가 적재된 암세포는 자연 살해 T 세포 및 자연 살해 세포 반응 및 암 항원 특이적 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 제시 세포로도 기능할 수 있음이 보고되었다 (Shimizu et al., The Journal of Immunology, 178: 2853-2861, 2007 & Chung et al., OncoImmunology, 1:2, 141-151, 2012). 또한 펩타이드나 바이러스 벡터를 통해 항원 전달한 α-GC 적재된 B 세포나 T 세포도 항원 제시 세포로의 특성을 획득할 수 있음도 밝혀져 있다 (Chung et al., Cancer Research, 66: 6843-6850, 2006 & Chung et al., OncoImmunology, 1:2, 141-151, 2012). 이는 CD1d 분자를 발현하는 세포에 α-GC 적재와 암 항원 전달시켜 항암 치료용 세포 백신으로 활용할 수 있음을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 세포 독성 효과를 가진 자연 살해 세포에 자연 살해 T 세포 리간드인 α-GC 적재와 항원 전달을 통해 자연 살해 세포의 면역원성을 변화시켜 항원 제시 세포의 기능을 추가하였으며, 상기 자연 살해 세포가 항암 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 자연 살해 T 세포의 리간드와 암 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 면역 치료 또는 예방용 백신을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 암 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 면역 치료 또는 예방용 백신을 제공한다.
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 면역 예방 및 치료용 백신에 관한 것으로, 구체적으로 자연 살해 T 세포 리간드이자 당지질의 일종인 알파-갈락토실세라마이드 (alpha-galactosylceramide; 이하, α-GC)가 적재된 자연 살해 세포를 포함하는 면역 치료 백신에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 자연 살해 세포가 수지상 세포에 비해 수득이 용이하며 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 자연 살해 세포의 면역화는 유의한 수준의 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 뿐 아니라 악성종양의 치료 효과가 있으므로 항암 면역 치료제로 이용될 수 있다.
도 1a는 α-GC 적재 및/또는 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신의 비장 내 자연 살해 T 세포 (NKT)와 자연 살해 세포 (NK)에서의 IFN-γ 생성능을 나타낸 도이다.
도 1b는 도 1a의 자연 살해 T 세포 (NKT)의 IFN-γ 생성을 나타낸 그래프이다.
도 1c는 도 1a의 자연 살해 세포 (NK)의 IFN-γ 생성을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 α-GC 적재 및/또는 암 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신의 세포 독성 T 세포 반응의 활성을 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 2b는 NK/α-GC, NK/Adk35GM, 또는 NK/α-GC/Adk35GM를 투여하고 CFSE로 표지된 GP10025-33 펩타이드가 적재된 표적 세포를 주입하여 생체 내 세포 독성 T 세포 활성을 측정한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 2c는 도 2b의 세포 독성 T 세포 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2d는 NK/α-GC/Ad-E6E7를 투여하고 CFSE로 표지된 HPV16 E649-57와 HPV16 E749-57 펩타이드가 적재된 표적 세포를 주입하여 생체 내 세포 독성 T 세포 활성을 측정한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 2e는 도 2d의 세포 독성 T 세포 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 α-GC를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신의 항암 효과를 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 3b는 α-GC를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/Ad-E6E7)의 항암 효과 (종양 크기 변화)를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 α-GC를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/Ad-E6E7)의 항암 효과 (마우스 생존율)를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포에 의한 항원 특이적인 세포 독성 T 세포의 활성화를 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 4b는 α-GC가 적재된 자연 살해 세포 (NK/α-GC), Ovalbumin257-264 펩타이드가 적재된 자연 살해 세포 (NK/OVA pep), 또는 α-GC와 Ovalbumin257-264 펩타이드가 함께 제시된 자연 살해 세포 (NK/α-GC/OVA pep) 백신의 생체 내 세포 독성 T 세포의 활성을 나타낸 히스토그램이다.
도 4c는 도 4b의 세포 독성 T 세포 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포 백신의 항암 효과를 확인하기 위한 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 5b는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/OVA pep)의 항암 효과 (종양 크기 변화)를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/OVA pep)의 항암 효과 (마우스 생존율)를 나타낸 그래프이다.
도 1b는 도 1a의 자연 살해 T 세포 (NKT)의 IFN-γ 생성을 나타낸 그래프이다.
도 1c는 도 1a의 자연 살해 세포 (NK)의 IFN-γ 생성을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 α-GC 적재 및/또는 암 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신의 세포 독성 T 세포 반응의 활성을 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 2b는 NK/α-GC, NK/Adk35GM, 또는 NK/α-GC/Adk35GM를 투여하고 CFSE로 표지된 GP10025-33 펩타이드가 적재된 표적 세포를 주입하여 생체 내 세포 독성 T 세포 활성을 측정한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 2c는 도 2b의 세포 독성 T 세포 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2d는 NK/α-GC/Ad-E6E7를 투여하고 CFSE로 표지된 HPV16 E649-57와 HPV16 E749-57 펩타이드가 적재된 표적 세포를 주입하여 생체 내 세포 독성 T 세포 활성을 측정한 결과를 나타낸 히스토그램이다.
도 2e는 도 2d의 세포 독성 T 세포 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 α-GC를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신의 항암 효과를 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 3b는 α-GC를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/Ad-E6E7)의 항암 효과 (종양 크기 변화)를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 α-GC를 적재하고 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 도입된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/Ad-E6E7)의 항암 효과 (마우스 생존율)를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포에 의한 항원 특이적인 세포 독성 T 세포의 활성화를 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 4b는 α-GC가 적재된 자연 살해 세포 (NK/α-GC), Ovalbumin257-264 펩타이드가 적재된 자연 살해 세포 (NK/OVA pep), 또는 α-GC와 Ovalbumin257-264 펩타이드가 함께 제시된 자연 살해 세포 (NK/α-GC/OVA pep) 백신의 생체 내 세포 독성 T 세포의 활성을 나타낸 히스토그램이다.
도 4c는 도 4b의 세포 독성 T 세포 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포 백신의 항암 효과를 확인하기 위한 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 5b는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/OVA pep)의 항암 효과 (종양 크기 변화)를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 α-GC와 펩타이드가 함께 적재된 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/OVA pep)의 항암 효과 (마우스 생존율)를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
알파-갈락토실세라마이드 (α-GC)가 적재된 수지상 세포(dendritic cell, DC)가 불변성 자연 살해 T (NKT) 세포를 활성화시킨다는 것은 공지되어 있다(van der Vliet HJ, et al., J Immunol Methods., 1;247(1-2):61-72, 2001), 본 발명자들은 α-GC가 적재된 B 세포, 단핵구 (monocyte) 및 미분화 골수성 세포 (Immature myeloid cells)에서 세포독성 T 림프구 반응을 유도하는 효과를 확인하였으며 (대한민국 공개특허 10-2007-0105662, 대한민국 공개특허 10-2009-0051598), α-GC가 적재된 자연 살해 세포에서도 유사한 효과를 나타내는 지 확인해 보았다.
이에, 본 발명자들은 세포 독성 효과를 가진 자연 살해 세포에 α-GC 적재와 항원 전달을 통해 자연 살해 세포의 면역원성을 변화시켜 백신을 제작하였다.
바이러스 벡터를 이용한 항원 전달은 암 항원을 높은 효율로 세포에 전달하여, 특정 암 항원을 발현하는 암종을 표적하는 세포 치료제의 대규모 생산에 적절하다. 상기 항원을 발현할 수 있는 바이러스를 이용할 경우 전체 항원을 도입할 수 있어 특정 주조직 적합성 복합체의 일배체형에 국한되지 않고 모든 사람에 적용가능하며, 세포성 면역 반응뿐만 아니라 체액성 면역 반응도 유도할 수 있다는 장점을 지닌다. 반면에, 바이러스 벡터는 암 환자 개별 맞춤 항암 치료에 적용하는데 한계가 있다.
펩타이드 적재를 통한 항원 전달 방식은 임상적으로 이용할 경우, 개인의 주조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex, MHC)의 일배체형에 제한적으로 사용되므로 누구에게나 보편적으로 사용될 수 없으며, 단일 항원결정기(epitope)만을 제시하는 단점이 있다. 그러나 정상 세포가 아닌 암세포에만 존재하는 종양 특이성이 높은 돌연변이로 인해 생성돼 암세포 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 펩타이드 서열인 네오에피톱은 암환자 개별 맞춤형 항암 면역 치료의 이상적인 표적으로 알려져 있다. 암환자 개별 맞춤으로 발굴된 네오에피톱을 전달한 면역 세포 백신을 적용한 항암 면역 치료는 기존의 면역요법에 비해 보다 암 세포 특이적인 T 세포의 발생을 강하게 유도할 수 있을 것으로 여겨져, 정상 세포의 손상을 막아 항암 치료의 부작용을 최소화하면서 동시에 강력한 항암 치료 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
따라서, 마우스로부터 자연 살해 세포를 분리하여 α-GC를 적재하고 두가지 방식으로 항원을 전달하여 (항원을 발현하는 바이러스 벡터로 항원 유전자를 전달 또는 펩타이드 적재) 자연 살해 세포 백신을 제작하였다 (실시예 1 참조).
먼저, α-GC가 적재되고, 항원을 발현하는 바이러스 벡터로 항원 유전자를 전달한 자연 살해 세포 백신을 제작하고, 상기 백신의 투여가 자연 살해 T 세포 및 자연 살해 세포의 활성화시킬 수 있는 지 확인하였다. 그 결과, α-GC가 적재된 자연 살해 세포와 α-GC을 적재하고 아데노바이러스로 암항원 GP100 및 MAGE-A3이 전달된 자연 살해 세포를 투여한 마우스의 체내 자연 살해 T 세포와 자연 살해 세포가 활성화됨을 확인하였다 (도 1a 내지 도 1c 참조). 또한 상기 백신이 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구를 활성화시켜 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험 (in vivo CTL assay)를 실시한 결과, α-GC을 적재하고 아데노바이러스로 암항원 (GP100 및 MAGE-A3 또는 HPV16/18 E6E7)이 전달된 자연 살해 세포 백신에서 효과적인 세포 독성 반응이 유도됨을 확인하였다 (도 2a 내지 도 2e 참조). 또한, 상기 백신의 항암 효과를 HPV16/18 E6E7를 이용하여 확인한 결과, 종양의 크기가 억제되고 마우스 생존율이 높아지는 유의한 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 3a 내지 도 3c 참조).
다음으로, α-GC 및 항원 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신을 제작하고, 상기 백신의 투여가 세포 독성 T 세포 반응이 유도되는 지 확인하였다. 그 결과, α-GC와 OVA257-264 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신에서 효과적인 세포 독성 반응이 유도됨을 확인하였다 (도 4a 내지 도 4c 참조). 또한, 상기 백신의 항암 효과를 확인한 결과, 종양의 크기가 억제되고 마우스 생존율이 높아지는 유의한 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 5a 내지 도 5c 참조). 본 발명의 자연 살해 세포는 세포 독성 기능을 가지고 있어 그 자체로 항암 효과가 있을 뿐만 아니라 자연 살해 T 세포의 리간드, 특히 α-GC 적재와 항원 전달을 통해 항원 특이적 세포 독성 T 세포 반응을 활성화시키는 항원 제시 세포로서 특성도 획득해 악성 종양의 치료 효과를 향상시킬 수 있으므로, 상기 세포를 포함하는 백신 조성물은 암 치료제로 이용될 수 있다.
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 암 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신을 제공한다.
상기 자연 살해 T 세포의 리간드는 알파-갈락토실세라마이드 (alpha-galactosylceramide; α-GC), 알파-글루쿠로노실세라마이드 (alpha-glucuronosylceramide), 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드, 이소글로보트리헥소실세라마이드 (isoglobotrihexosylceramide), 갱글리오사이드 GD3 (ganglioside GD3), 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨 (phosphatidylinositol), 설파타이드 (sulfitide), 베타-갈락토실세라마이드 (beta-galactosylceramide), 리포포스포글리칸 (lipophosphoglycan), 글리코이노시톨포스포리피드(glycoinositol phospholipids), 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드 (beta-anomeric galactosylceramide) 및 알파-아노머 갈락토실세라마이드 (alpha-anomeric galactosylceramide), 박테리아 지질 항원 및 알파 갈락토실세라마이드의 변이체를 포함한다.
상기 항원은 백신으로 사용되어 면역반응을 일으킬 수 있는 항원은 모두 사용 가능하며, 바람직하게 항원은 암 항원이며, 상기 항원의 전장 또는 단편일 수 있다.
상기 암 항원은 gp100, 멜라노마 항원 유전자 (MAGE, melanoma antigen gene), 인간 유두종 바이러스 (HPV: human papilloma virus) E6/E7, 티로시나제 (tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질- 1(TRP-1), 티로시나제-관련 단백질-2 (TRP-2), 뮤리노글로브린 1 (MUC-1: murinoglobulin 1), 암 배아항원 (CEA: carcinoembryonic antigen), p53, 알파-페토프로테인 (α-fetoprotein), Her-2/neu에 의해 발현되는 유방암 단백질, Proteinase 3, WT-1, PAP, PSA, PSMA, G250, BAGE, GAGE, NY-ESO- 1, MART-1, MCIR, Ig Idiotype, CDK4, caspase-8, β-catenin, CIA, BCR/ABL, EBV LMP2a, HCV, HHV-8, 5T4, 종양 특이적인 돌연변이 유래 신생항원 (neoantigen) 및 그의 조합을 포함한다.
또한, 상기 항원은 펩타이드, 지질다당류, 다당류, 당단백질 또는 DNA 및 RNA를 포함한 폴리뉴클레오티드의 형태를 갖음으로써 자연 살해 세포에 직접 적재될 수 있으며, 재조합 바이러스에 의해 자연 살해 세포에 형질 도입되어 발현되어 적재될 수 있다. 펩타이드를 적재한 세포 백신에 반해 바이러스를 매개로 하여 전체 항원을 도입한 세포 백신은 주조직 적합성 복합체의 일배체형에 국한되지 않고 모든 사람에 적용 가능하며, 여러 항원결정기에 특이적인 면역반응을 유도할 수 있으며, 특히 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다는 장점이 있다.
상기 항원의 발현은 재조합 바이러스에 의해 도입되어 발현될 수 있다. 상기에서 항원 발현을 위해 자연 살해 세포에 도입되는 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스(Pox virus), 신드비스(Sindbis virus) 등이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 바이러스를 이용한 방법 외에도 항원 유전자 전달로 적용 가능한 것은 1) DNA를 리포좀(liposome)에 결합시켜 형질 도입하여 효소 분해로부터 DNA를 보호하거나 엔도솜(endosome)으로 흡수하도록 하는 방법, 2) DNA에 단백질로 구성된 분자 콘쥬게이트(molecular conjugate)나 합성 리간드를 결합하여 세포로 DNA를 전달 효율을 높이는 방 법[예: 아시알로글리코프로테인(Asialoglycoprotein), 트랜스페린(transferrin), 폴리머 IgA(polymeric IgA)], 3) PTD(Protein transduction domain)을 이용한 새로운 DNA 전달 시스템으로 세포로 DNA의 전달 효율을 높임으로써 항원 유전자를 전달하는 방법[예: Mph-1], 4) 상기 방법 외에도 펩타이드를 사용하거나 항원 단백질을 자연 살해 세포에 적용함으로써 자연 살해 세포가 항원을 제시하도록 할 수 있다.
본 발명의 백신은 자연 살해 T 세포의 리간드와 자연 살해 세포에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 백신은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제 성분을 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등 과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근 판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 백신은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 자연 살해 T 세포의 리간드를 적재한 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포의 리간드와 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 또는 암 항원을 발현하는 바이러스로 감염된 자연 살해 세포는 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.
본 발명의 백신은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 백신은 주사용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 이용하여 냉동건조된 형태로 제조될 수 있다. 냉동건조된 백신은 전형적으로 약 4 ℃에서 유지되며, 보조제를 함유하거나 함유하지 않은 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 또는/및 HEPES에 의해 복원될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 백신의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할수록 이 제제를 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.
백신은 환자에게서 면역반응을 자극하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 백신은 인간에게 일 회내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 세포 수가 1×103 개/kg ~ 1×109 개/kg, 바람직하게는 1×104 개/kg ~ 1×108 개/kg이다. 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 자연 살해 세포 백신을 제작하는 경우, 자연 살해 세포 1×106 개/㎖ ~ 1×107 개/㎖ 당 알파-갈락토실세라마이드 1~2 ㎍/㎖가 든 배지를 사용하여 배양한다. 알파-갈락토실세라마이드와 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신을 제작하는 경우, 자연 살해 세포 1×106 개/㎖ ~ 1×107 개/㎖당 알파-갈락토실세라마이드 1~2 ㎍/㎖가 든 배지를 사용하고, 펩타이드는 자연 살해 세포 1×106 개/㎖ ~ 1×107 개/㎖ 를 1~10 ㎍/㎖ 펩타이드가 포함된 배지에서 배양하여 세포에 적재시킨다.
알파-갈락토실세라마이드는 설치류 및 원숭이에서 독성을 유도하지 않는 것으로 보이고 있다 (Nakata et al., Cancer Res 58:1202-1207, 1988). 2200 ㎍/㎏의 αGalCer가 주입된 마우스에도 부작용은 보고되고 있지 않다 (Giaccone et al., Clin Cancer Res 8:3702, 2002). 진행 중인 임상 시험에서도 αGalCer의 전신 투여에 의여 경미한 두통과 같은 부작용이 일부 보고되었으나 (Mie Nieda et al., Blood 103:383-389, Giaccone et al.,Clin Cancer Res 8:3702, 2002). 파라세타몰(paracetamol) 투여에 의해 예방될 수 있었고, 이들 대상에서도 미약한 전신적 부작용이 반드시 나타나는 것은 아니다 (Giaccone et al., Clin Cancer Res 8:3702, 2002).
<실시예 1> 자연 살해 세포 백신의 제작
<1-1> 항원을 발현하는 바이러스 벡터로 항원 전달한 자연 살해 세포 백신의 제작
마우스로부터 자연 살해 세포를 분리하기 위하여, 마우스 비장과 골수를 채취한 후 균질화 (homogenization)하였다. ACK lysing buffer (Gibco)를 사용해 적혈구 용해한 후, 마이크로비드 (Miltenyibiotec)를 이용해 세포 표면에 CD3ε, CD19 혹은 Ly6G를 발현하는 T세포, B 세포, 호중구를 제거한 다음 항-CD49b 마이크로비드 (Miltenyibiotec)를 이용하여 CD49b+ 세포를 얻은 후 BD FACSAria III 기기를 통해 순수한 자연 살해 세포를 분리하였다. 상기와 같이 분리 정제한 자연 살해 세포를 α-GC (1 μg/ml), 용매 (DMSO) 및/또는 암항원 (GP100과 MAGE-A3 암 항원 또는 인간 유두종 바이러스 HPV 16형과 18형의 E6와 E7암 항원) 유전자 전달용 아데노바이러스 (100 MOI)와 함께 혈청과 IL-2 (5 ng/mL)이 포함된 배지에 넣었다. 세포 배양 플레이트에 담은 상태로 20℃, 2000rpm에서 90분간 원심분리 후 37℃, 상대습도 80~95%, CO2 농도 5%의 배양조건으로 CO2 배양기에서 14~15시간동안 배양하여, α-GC를 적재한 자연 살해 세포, 아데노바이러스로 암항원을 발현하도록 형질전환시킨 자연 살해 세포, α-GC을 적재하고 아데노바이러스로 암항원을 발현하도록 형질전환시킨 자연 살해 세포를 제작하였다. 제작된 자연 살해 세포 백신은 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, Welgene)으로 3회 세척 후, DPBS에 풀어 마우스 꼬리 정맥에 투여하였다.
<1-2> 항원 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신의 제작
바이러스 벡터는 암세포 공통의 암 항원을 높은 효율로 세포에 전달하여, 특정 암 항원을 발현하는 암종을 표적하는 세포 치료제의 대규모 생산에 적절한 유전자 전달 수단이다. 그러나, 바이러스 벡터는 네오에피톱을 활용한 암 환자 개별 맞춤 치료에 적용하는데 한계가 있어, 펩타이드 적재를 통한 항원 전달 방식을 이용하여 자연 살해 세포 백신을 제작하였다.
구체적으로 실시예 1-1의 방법으로 C57BL/6 마우스에서 분리한 자연 살해 세포에 α-GC (1 μg/mL), 용매 (DMSO) 및/또는 Ovalbumin257-264 (OVA257-264) 펩타이드 (2 μg/mL)와 함께 혈청과 IL-2 (5 ng/mL)이 포함된 배지에 넣고, 15~16시간동안 37℃, 상대습도 80~95%, CO2 농도 5%의 배양조건으로 CO2 배양기에서 배양하여, α-GC가 적재된 자연 살해 세포, OVA257-264 펩타이드가 적재된 자연 살해 세포, 또는 α-GC와 OVA257-264 펩타이드가 함께 제시된 자연 살해 세포 백신을 제작하였다. 제작된 자연 살해 세포 백신은 DPBS로 3회 세척 후, DPBS에 풀어 마우스 꼬리 정맥에 투여하였다.
<실험예 1> 항원을 발현하는 바이러스 벡터로 항원 전달한 자연 살해 세포 백신 투여에 의한 효과 확인
<1-1> 자연 살해 T 세포 및 자연 살해 세포의 활성화 유도 확인
자연 살해 세포 백신 투여를 통해 체내 자연 살해 T 세포와 자연 살해 세포를 활성화시킬 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스에서 수득한 자연 살해 세포로 α-GC 적재한 자연 살해 세포 (NK/α-GC), 암항원 human GP100과 MAGE-A3 유전자 전달용 아데노바이러스 Adk35GM으로 형질도입한 자연 살해 세포 (NK/Adk35GM), α-GC을 적재하고 아데노바이러스 Adk35GM 항원 전달된 자연 살해 세포 (NK/α-GC/Adk35GM)를 제작한 후, 8.5 x 104 개의 자연 살해 세포를 정맥 투여하였다. 17시간 후, 비장 내 자연 살해 T 세포와 자연 살해 세포에서 IFN-γ 생산 정도를 유세포분석기를 통해 측정하였다.
그 결과, 도 1a 내지 도 1c에 나타난 바와 같이, α-GC가 적재된 자연 살해 세포 (NK/α-GC와 NK/α-GC/Adk35GM)을 마우스에 투여하면 형질도입만 된 세포 (NK/Adk35GM)의 투여군과 달리 체내 자연 살해 T 세포가 자극돼 결과적으로 자연 살해 세포를 활성화시키는 것을 확인하였다.
이러한 자연 살해 T 세포와 자연 살해 세포의 활성화는 세포 독성 T 세포 반응의 유도와 함께 항암 효과에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
<1-2> 세포 독성 T 세포 반응 유도 확인
<1-2-1> GP100과 MAGE-A3 항원을 도입한 자연 살해 세포 백신의 효능 평가
아데노바이러스로 형질도입된 자연 살해 세포 백신이 항원 특이적인 세포 독성 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 생체 내 세포 독성 시험 (in vivo CTL assay)를 실시하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스에서 수득한 자연 살해 세포로 α-GC 적재시키거나 아데노바이러스 Adk35GM 항원 전달시킨 자연 살해 세포 백신를 제작해 C57BL/6 마우스에 면역화시키고, 10일 후 세포 독성 시험을 진행하였다 (도 2a). 먼저 동종 마우스의 비장 세포를 동량의 두 군으로 나눈 후, GP10025-33 펩타이드 적재한 표적 세포는 3 μM CFSE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)로 표지하고 (CFSEhigh), 펩타이드 적용되지 않은 대조 세포는 0.3 μM CFSE로 표지하여 (CFSElow), 백신 면역화한 마우스에 동량 주입하였다. 하루 뒤 유세포 분석기를 통해 마우스 비장 세포 내 CFSEhigh: CFSElow 비율을 산출하여 표적 세포의 용해를 측정하였다 (도 2a). 항원 펩타이드가 적재된 CFSEhigh 세포의 비율이 낮을수록 항원 특이적인 세포 독성 T 세포 면역 반응이 높게 나타난 것을 의미한다.
그 결과, 도 2b 및 도 2c에 나타난 바와 같이, 아데노바이러스 벡터로 항원 도입된 자연 살해 세포 (NK/Adk35GM, NK/α-GC/Adk35GM)로 면역화한 경우에는 효과적으로 세포 독성 T 세포 면역 반응이 나타났다.
<1-2-2> 인간 유두종 바이러스 HPV 16형과 18형의 E6와 E7 항원을 도입한 자연 살해 세포 백신의 효능 평가
자연 살해 세포를 매개로 하는 백신 투여가 다른 암 항원에도 적용될 수 있는지 알아보기 위해, 인간 유두종 바이러스 (Human papillomavirus; HPV) 16형과 18형의 E6와 E7 암 항원을 도입한 자연 살해 세포 백신의 효능을 평가하였다.
구체적으로, α-GC를 적재하고 아데노바이러스 Ad-E6E7을 통해 HPV16/18 E6E7을 발현하도록 만든 6.5 x 105 개의 자연 살해 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥 투여하여 면역화시킨 다음 8일 후에 생체 내 세포 독성 시험을 실시하였다. HPV16 E649-57와 E749-57 펩타이드가 적재된 표적 세포는 CFSEhigh로 표지하고, 대조 세포는 펩타이드 적재없이 CFSElow 표지 후 두 군의 세포를 동량씩 혼합하여 면역화한 마우스에 주사하고, 하루 후 비장 단일 세포를 적출하여 CFSEhigh와 CFSElow 세포 집단의 비율을 유세포 분석기를 통해 측정하였다.
그 결과, 도 2d 및 도 2e에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 α-GC 적재하고 HPV16/18 E6E7을 발현하도록 만든 자연 살해 세포를 투여한 마우스군에서 체내 HPV16 E6E7에 대한 세포 독성이 유도됨을 확인하였다.
상기 실험예 1-1과 실험예 1-2를 종합하면, α-GC을 적재하고 아데노바이러스 벡터로 항원 전달된 자연 살해 세포 백신 투여에 의해 선천성 면역 반응인 자연 살해 T 세포, 자연 살해 세포 활성화와 후천성 면역 반응인 세포 독성 T 세포 면역 반응이 모두 유도될 수 있으며, 따라서 강력한 항암 치료 효과를 보일 것으로 유추해 볼 수 있다.
<1-3>
자연 살해 세포 백신의 항암 효과 확인
자연 살해 세포 백신 투여가 항암 면역을 유도하는지 조사하였다.
이를 위하여 C57BL/6 마우스의 옆구리에 2 x 105 개의 TC-1 암세포주를 피하로 이식한지 4일 후 2.6 x 105 개의 NK/α-GC 또는 NK/α-GC/Ad-E6E7를 투여하여 면역화한 후 (도 3a), 종양 크기 변화와 마우스 생존율을 측정하였다. 종양의 크기는 캘리퍼를 사용하여 종양의 가로, 세로, 높이를 측정하여 하기의 식으로 계산하였다.
(종양의 크기)= (가로) x (세로) x (높이) x (π / 6)
그 결과, 도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/Ad-E6E7) 투여한 경우 암의 성장이 억제되었으며 높은 생존율을 관찰하였다. 이와 달리, NK/α-GC를 투여한 마우스의 경우는 암 성장을 거의 지연시키지 못하였으며, 생존율도 낮음을 관찰하였다.
상기의 결과를 통하여 α-GC 만을 단독으로 적재한 자연 살해 T 세포와 자연 살해 세포의 활성화만으로는 항암 치료 효과를 유도할 수 없음을 확인하였다.
<실험예 2> 항원 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신 투여에 의한 효과 확인
<2-1> 세포 독성 T 세포 반응 유도 확인
실시예 1-2의 항원 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신이 세포 독성 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 확인하였다.
α-GC가 적재된 자연 살해 세포 (NK/α-GC), OVA257-264 펩타이드가 적재된 자연 살해 세포 (NK/OVA pep), 또는 α-GC와 OVA257-264 펩타이드가 함께 제시된 자연 살해 세포 (NK/α-GC/OVA pep)를 C57BL/6 마우스에 각각 정맥 투여하여 면역화시키고, 8일 후 생채 내 세포 독성 시험을 실시하였다 (도 4a).
그 결과, 도 4b 및 도 4c에 나타난 바와 같이, 오직 NK/α-GC/OVA pep를 투여한 마우스 군에서만 OVA257-264 펩타이드가 적재된 CFSEhigh 표적 세포가 대부분 용해되었다. 이를 통해 α-GC와 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신에 의해서도 세포 독성 T 세포가 활성화될 수 있음을 확인하였다.
그러나 <실험예 1-2>에서 α-GC 없이 아데노바이러스 벡터로 항원만 전달된 자연 살해 세포의 투여군 (도 2c 참조)에서도 세포 독성 T 세포 반응이 유도된 것과 달리, 펩타이드만 적재된 NK/OVA pep에서는 세포 독성 T 세포 반응이 관찰되지 않았다 (도 4c 참조). 이는 아데노바이러스를 통해 항원 전체를 전달해 여러 항원결정기 (에피톱)에 특이적인 다양한 면역 반응을 유도시키는 것이 단일 펩타이드만을 제시하는 방법보다 세포 독성 T 세포 면역 반응 유도에 탁월한다는 것을 의미한다.
<2-2> 자연 살해 세포 백신의 항암 효과 확인
항원 펩타이드를 적재한 자연 살해 세포 백신이 항암 치료 효과를 일으킬 수 있는지 확인하였다 (도 5a).
이를 위하여 C57BL/6 마우스에 1 x 105 개의 B16F10-OVA 암세포주를 피하로 이식한지 2일 후 2.5 x 105 개의 NK/OVA pep 또는 NK/α-GC/OVA pep로 각각 면역화하였다.
그 결과, 도 5b 및 도 5c에 나타난 바와 같이, 자연 살해 세포 백신 (NK/α-GC/OVA pep) 투여한 경우 암의 성장이 크게 억제되었으며 높은 생존율을 관찰하였다. 이와 달리, NK/OVA pep 세포를 투여한 마우스의 경우는 암 성장을 지연시키지 못하였으며, 생존율도 낮음을 관찰하였다. 따라서, 펩타이드 단독 적재만으로는 충분한 항암 치료 효과를 유도할 수 없음을 밝혔다.
실시예 1-3의 항암 효과 데이터 (도 3b 및 도 3c 참조)와 종합하면, α-GC를 적재하고 항원을 전달시켜 제작한 자연 살해 세포 백신은 α-GC 적재 단독이나 항원 전달 단독 세포 백신에 비해 강력한 항암 효과를 나타내 암 성장을 억제하고, 생존율을 향상시키는 것을 확인하였다.
Claims (6)
- 자연 살해 T 세포의 리간드와 암 항원을 적재한 자연 살해 세포를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제1항에 있어서,
자연 살해 T 세포의 리간드는 알파-갈락토실세라마이드, 알파-글루쿠로노실세라마이드, 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드, 이소글로보트리헥소실세라마이드, 갱글리오사이드 GD3, 포스파티딜콜린, 베타-갈락토실세라마이드, 리포포스포글리칸, 글리코이노시톨포스포리피드, 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드 및 알파-아노머 갈락토실세라마이드, 박테리아 지질 항원 및 알파 갈락토실세라마이드의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제1항에 있어서,
상기 암 항원은 gp100, 멜라노마 항원 유전자 (MAGE, melanoma antigen gene), 인간 유두종 바이러스 (HPV: human papilloma virus) E6/E7, 티로시나제 (tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질- 1(TRP-1), 티로시나제-관련 단백질-2 (TRP-2), 뮤리노글로브린 1 (MUC-1: murinoglobulin 1), 암 배아항원 (CEA: carcinoembryonic antigen), p53, 알파-페토프로테인 (α-fetoprotein), Her-2/neu에 의해 발현되는 유방암 단백질, Proteinase 3, WT-1, PAP, PSA, PSMA, G250, BAGE, GAGE, NY-ESO- 1, MART-1, MCIR, Ig Idiotype, CDK4, caspase-8, β-catenin, CIA, BCR/ABL, EBV LMP2a, HCV, HHV-8 및 5T4 및 종양 특이적인 돌연변이 유래 신생항원 (neoantigen)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제1항에 있어서,
상기 암 항원은 펩타이드, 지질다당류, 다당류, 당단백질 또는 DNA 및 RNA를 포함한 폴리뉴클레오티드의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는, 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제1항에 있어서,
상기 암 항원의 발현은 재조합 바이러스에 의해 도입되어 발현되는 것을 특징으로 하는, 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제5항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 암 항원을 발현하는 유전자가 도입된 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 신드비스 바이러스 (Sindbis virus)인 것을 특징으로 하는, 면역 치료 및 예방용 백신.
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