KR20230170442A - 내인성 항원 제시 기전을 이용한 저면역원성 줄기세포 및 이의 제조 방법 - Google Patents
내인성 항원 제시 기전을 이용한 저면역원성 줄기세포 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
유전자 재조합과 항원 제시 기작을 이용한 저면역원성 줄기세포 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 저면역원성 줄기세포에 의하면, HLA class I의 발현 제어를 통한 T 세포 유래 면역 억제와 HLA-G의 발현 유도를 통한 NK 세포에 의한 면역 억제를 동시에 유도하여 모든 환자에게 적용가능한 세포치료제 제작의 기반을 제공하는 점에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
유전자 재조합과 항원 제시 기작을 이용한 저면역원성 줄기세포 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 환자 내로 이식하기 위한 임의의 성체 세포 유형을 생성시키는 유용한 도구이다. 원칙적으로, hPSC-기반 세포 요법은 대부분의 퇴행성 질병을 치료하는 잠재력이 있지만, 대상체의 면역 반응에 의해 제한될 수 있다. 면역계는 특이성이 증가되는 층화된 방어로 유기체를 감염으로부터 보호한다. 구체적으로, 물리적 장벽이 병원체 예컨대 박테리아 및 바이러스가 유기체에 진입하는 것을 방지하고, 병원체가 이러한 장벽을 돌파하면 선천 면역계가 즉각적이지만 비-특이적인 반응을 제공한다. 병원체가 선천적 반응을 성공적으로 회피하면, 척추동물에는 선천적 반응에 의해 활성화되는 적응 면역계가 있다. 적응 면역계는 더욱 더 특이적인 반응을 생성시킨다. 여기서, 면역계는 감염 동안 그의 반응을 개조하여 그의 병원체 인식을 개선한다. 그 후, 이러한 개선된 반응이 병원체가 제거된 뒤에도 면역학적 기억의 형태로 유지되고, 이러한 병원체와 조우할 때마다 적응 면역계가 더욱 빠르고 더욱 강하게 공격을 개시하도록 허용한다. 적응 면역 반응은 항원-특이적이고, 항원 제시로 칭해지는 프로세스 동안 특이적인 "비-자가" 항원의 인식을 필요로 한다. 항원 특이성은 특이적인 병원체 또는 병원체-감염 세포에 맞춰진 반응의 생성을 허용한다. 인터페론 감마(IFN-γ)는 감염성 및 비-감염성 질환에 맞서는 것에서 필수적인 역할을 한다. 인간 면역 반응에서의 IFN-γ의 주요 공급원은 T 세포이다. NK 세포, 대식세포, 및 IFN-γ가 선천 및 후천 면역 둘 다에서 중요한 역할을 한다.
주요 조직적합성 복합체 (MHC)는 면역계의 조절에 필수적인 세포 표면 단백질이다. MHC 분자의 주요 기능은 병원체로부터 유래된 항원에 결합하고, 이를 적합한 T-세포에 의한 인식을 위해 세포 표면 상에 제시하는 것이다. MHC 유전자 패밀리는 클래스 I, 클래스 II, 및 클래스 III 3개의 하위군으로 나뉜다. 인간 MHC는 HLA (인간 백혈구 항원) 복합체 (종종 그냥 HLA)로도 칭해진다. NK 세포는 선천 면역과 적응 면역 사이의 계면에서 기능하는 림프구이다. NK 세포는 그의 이펙터 기능, 예컨데 세포독성 및 시토카인 분비를 통해, 그리고 선천 및 적응 면역 반응을 조절함으로써 면역 방어에 직접적으로 기여한다.
범용 인간 줄기 세포 제작에 대한 연구는 많이 진행되고 있으나, 분화된 세포에서도 지속적으로 저면역원성을 유지하는 것에 대한 연구는 아직까지 연구가 미비한 실정이다. 효율적 분화 생산 방법을 통해 이식 가능한 양의 세포치료제를 인간 전분화능 줄기세포로부터 제작할 수 있으나 공여자와 수여자에서 발생할 수 있는 면역 불일치 문제는 여전히 존재하고 있다. 하지만, 이는 다양한 세포치료제 제작을 위해서는 면역 회피 기술의 개발이 절대적으로 요구되는 부분이다. 면역 반응에 관여하는 HLA class I의 발현을 억제함으로써 공여자의 면역세포에 대한 저항성을 보이는 면역 적합성 범용 인간 만능 줄기세포에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.
HLA class I 하위 그룹 중에 하나인 베타 마이크로글로빈(β2-microglobulin, β2m)을 낙-아웃(Knock-Out) 시킴으로써 HLA class I의 발현을 억제할 수 있으며, HLA class I의 발현 억제는 T세포에 의한 면역반응을 회피할 수 있으나 오히려 NK세포에 의한 면역반응을 활성화시키는 부작용이 발생된다.
이와 같은 문제를 해결하고자 본 유전자 재조합 기술을 기반으로 NK세포의 활성화를 억제시키는 동시에, T세포에 의한 면역반응을 회피하는 인간 줄기세포를 제작하는 방법에 관한 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 β2m을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되고, 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된, 유전적으로 변형된 줄기세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 유전적으로 변형이 이루어진 줄기세포에서 분화된 계통-제한된 전구세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 유전적으로 변형이 이루어진 줄기세포에서 완전히 분화된 체세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 줄기세포를 제작하는 방법으로서, β2m을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되는 단계 및 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 유전적 변형 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 β2m을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되고, 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된, 유전적으로 변형된 줄기세포를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 줄기세포는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 중 적어도 하나의 유전자의 발현이 감소된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 β2m-HLA-G 융합 단백질, HLA-G, HLA-E, PD-L1, 및 CD47 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자는 NLRC5 또는 RelA인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 관용원성 인자(tolerogenic factor)는 β2m-HLA-G이고, 상기 APM 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 NLRC5를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형된 줄기세포는 세포 분화시 비변형된 세포와 비교하여 HLA-G의 발현이 증가된 상태가 유지되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 비변형된 세포와 비교하여 증가된 면역 회피를 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적 변형은 적어도 하나의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 다능성 줄기 세포(PSC), 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 성체 줄기 세포(ASC), 및 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 유전적으로 변형이 이루어진 줄기세포에서 분화된 계통-제한된 전구세포를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 처리되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자는 NLRC5 또는 RelA인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 분화된 계통-제한된 전구세포는 신경 전구세포, 혈액 내피 전구세포, 중간엽 전구 세포, 조혈 전구세포, 및 췌장 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 유전적으로 변형이 이루어진 줄기세포에서 완전히 분화된 체세포를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 처리되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자는 NLRC5 또는 RelA인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 완전히 분화된 체세포는 신경 세포, 혈액 세포, 간 세포, 상피 세포, 혈관 세포, 지방 세포, 연골 세포, 근육세포, 췌장 세포, 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 세포치료제를 제작하는 방법으로서, β2m을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되는 단계 및 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 유전적 변형 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 줄기세포는 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입되는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적 변형은 적어도 하나의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템인 것일 수 있다.
일 양상에 따른 저면역원성 줄기세포에 의하면, HLA class I의 발현 제어를 통한 T 세포 유래 면역 억제와 HLA-G의 발현 유도를 통한 NK 세포에 의한 면역 억제를 동시에 유도하여 모든 환자에게 적용가능한 세포치료제 제작의 기반을 제공하는 점에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 저항성 실험의 도식화 및 실험결과를 나타낸 그림이다; 녹색 형광: Live cell
도 2는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 단백질 HLA-G의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 β2m-HLA-G 발현 및 HLA Class Ⅰ 발현 저해를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 4는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 활성도 측정한 그림 및 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 endogenous β2m 유전자가 좌위에 β2m-HLA-G으로 치환된 전분화능 줄기세포 제작 기법에 대한 모식도이다.
도 7은 일 구체예에 따른 인델(indel)을 통해 endogenous β2m 유전자가 좌위에 β2m-HLA-G으로 치환된 세포주 A5, A9에 대한 모식도 및 유전자형분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 β2m-HLA-G 발현 및 HLA Class Ⅰ 발현 저해를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 9는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 β2m-HLA-G 발현을 형광염색으로 확인한 그림이다.
도 10은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현도를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 11은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현도를 형광염색으로 확인한 그림이다.
도 12는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 GC-banding 핵형분석으로 확인한 그림이다.
도 13은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현의 변화와 IFN-γ를 처리했을 시의 HLA-G의 변화를 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험을 통해 확인한 그래프이다.
도 14는 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현의 변화를 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 15는 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현을 IFN-γ을 처리했을 시와 비교하여 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 16은 일 구체예에 따른 저면역원성 유도된 줄기세포의 프로모터 부근에 형광단백질(GFP)을 융합한 모식도 및 형광 염색 발현을 확인한 사진이다.
도 17은 일 구체예에 따른 저면역원성 유도된 줄기세포의, IFN-γ을 처리했을 시와 미처리시 형광단백질의 발현양 및 세포 표면의 β2m 발현양을 비교한 그래프이다.
도 18은 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 신경줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 19는 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 혈액줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 20은 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 및 신경줄기세포의 IFN-γ을 처리했을 시 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21은 일 구체예에 따른 IFN-γ을 미처리와 대비하여 IFN-γ을 처리했을 시 다분화능 줄기세포와 신경줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 22는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 APM 관련 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 23은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화 FACS 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 24는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 FACS 분석에서 HLA Class I의 발현의 양을 IFN-γ처리시와 비교한 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 25는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화 면역화학염색을 통해 확인한 사진이다.
도 26는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 APM 관련 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 27은 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화 FACS 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 28는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 FACS 분석에서 HLA Class I의 발현의 양을 IFN-γ처리시와 비교한 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 29는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험을 한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 단백질 HLA-G의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 β2m-HLA-G 발현 및 HLA Class Ⅰ 발현 저해를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 4는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 활성도 측정한 그림 및 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 endogenous β2m 유전자가 좌위에 β2m-HLA-G으로 치환된 전분화능 줄기세포 제작 기법에 대한 모식도이다.
도 7은 일 구체예에 따른 인델(indel)을 통해 endogenous β2m 유전자가 좌위에 β2m-HLA-G으로 치환된 세포주 A5, A9에 대한 모식도 및 유전자형분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 β2m-HLA-G 발현 및 HLA Class Ⅰ 발현 저해를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 9는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 β2m-HLA-G 발현을 형광염색으로 확인한 그림이다.
도 10은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현도를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 11은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현도를 형광염색으로 확인한 그림이다.
도 12는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 GC-banding 핵형분석으로 확인한 그림이다.
도 13은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현의 변화와 IFN-γ를 처리했을 시의 HLA-G의 변화를 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험을 통해 확인한 그래프이다.
도 14는 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현의 변화를 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 15는 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현을 IFN-γ을 처리했을 시와 비교하여 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 16은 일 구체예에 따른 저면역원성 유도된 줄기세포의 프로모터 부근에 형광단백질(GFP)을 융합한 모식도 및 형광 염색 발현을 확인한 사진이다.
도 17은 일 구체예에 따른 저면역원성 유도된 줄기세포의, IFN-γ을 처리했을 시와 미처리시 형광단백질의 발현양 및 세포 표면의 β2m 발현양을 비교한 그래프이다.
도 18은 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 신경줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 19는 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 혈액줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 20은 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 및 신경줄기세포의 IFN-γ을 처리했을 시 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21은 일 구체예에 따른 IFN-γ을 미처리와 대비하여 IFN-γ을 처리했을 시 다분화능 줄기세포와 신경줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 22는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 APM 관련 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 23은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화 FACS 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 24는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 FACS 분석에서 HLA Class I의 발현의 양을 IFN-γ처리시와 비교한 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 25는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화 면역화학염색을 통해 확인한 사진이다.
도 26는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 APM 관련 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 27은 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화 FACS 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 28는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 FACS 분석에서 HLA Class I의 발현의 양을 IFN-γ처리시와 비교한 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 29는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험을 한 결과를 나타낸 그래프이다.
일 양상은 β2m을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되고, 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된, 유전적으로 변형된 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "β2m"은 또한 β2m 염색체 로커스에서 유전자에 의해 코딩된 예시적인 참조 서열의 대립유전자 변이체를 포괄한다. 인간 β2m은 염색체 15 상에 위치하고, 위치 15q21-q22.2에 맵핑된다.
본 명세서에서 용어 "핵산"과 상호 교환되어 사용될 수 있는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 생체분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 2개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 500개, 또는 임의의 수의 뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 게놈 DNA의 부위 또는 영역이다. 일 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비변형된 세포 또는 보편적 공여자 세포의 게놈 내에 포함된 내인성 유전자이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 게놈 DNA로 통합되지 않은 외인성 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 게놈 DNA로 통합된 외인성 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 폴리 뉴클레오타이드는 플라스미드 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 원형 또는 선형 분자이다.
본 명세서에서 용어 "유전적 결실" 또는 "낙-아웃"과 상호 교환되어 사용될 수 있는 용어 " 결실 "은 일반적으로 임의의 분자 생물학 방법, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해, 예를 들어 게놈 DNA의 부위에 엔도뉴클레아제 및 적어도 하나의 gRNA를 전달함으로써 게놈 DNA의 부위 또는 영역이 제거된 유전적 변형을 지칭한다. 임의의 수의 뉴클레오타이드가 결실될 수 있다. 일부 구현예에서, 결실은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 또는 적어도 25개의 뉴클레오타이드의 제거를 수반한다. 일부 구현예에서, 결실은 10-50개, 25-75개, 50-100개, 50-200개, 또는 100개 초과의 뉴클레오타이드의 제거를 수반한다. 일부 구현예에서, 결실은 전체 표적 유전자, 예를 들어 β2m 유전자의 제거를 수반한다. 일부 구현예에서, 결실은 표적 유전자의 일부, 예를 들어 β2m 유전자의 프로모터 및/또는 암호화 서열의 전부 또는 일부의 제거를 수반한다. 일부 구현예에서, 결실은 표적 유전자의 전사 조절자, 예를 들어 프로모터 영역의 제거를 수반한다. 일부 구현예에서, 결실은 암호화 영역에 의해 정상적으로 발현된 산물이 더 이상 발현되지 않거나 절단된 형태로 발현되거나 감소된 수준으로 발현되도록 암호화 영역의 전부 또는 일부의 제거를 수반한다. 일부 구현예에서, 결실은 비변형된 세포에 비해 유전자의 발현을 감소시킨다.
본 명세서에서 용어 “부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위"는 상기 유전자의 인트론 또는 엑스트론 성분이거나 상기 유전자의 근위로 위치한 게놈 DNA의 부위 또는 영역을 지칭한다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA의 부위는 상기 유전자의 인트론 또는 엑손의 적어도 일부를 포함하면 유전자 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 근처에 위치한 게놈 DNA의 부위는 상기 유전자의 5' 또는 3' 말단(예를 들어, 상기 유전자의 암호화 영역의 5' 또는 3' 말단)에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 근처에 위치한 게놈 DNA의 부위는 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 영역 또는 억제자 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 근처에 위치한 게놈 DNA의 부위는 상기 유전자와 동일한 염색체에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈 DNA의 부위 또는 영역은 상기 유전자의 5' 또는 3' 말단(예를 들어, 상기 유전자의 암호화 영역의 5' 또는 3' 말단)에 50Kb, 40Kb, 30Kb, 20Kb, 10Kb, 5Kb, 1Kb 내에 또는 더 가깝게 있으면 유전자 근처이다.
본 명세서에서 용어 "관용원성 인자"는 일반적으로 세포에서 증가되거나 감소될 때 세포, 예를 들어 보편적 공여자 세포가 비변형된 세포에 비해 더 높은 비율로 숙주 대상체에 대한 이식 또는 생착 후 면역 거부를 억제하거나 회피하게 하는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현된) 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 관용원성 인자는 인간 관용원성 인자이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 관용원성 인자의 유전적 변형(예를 들어, 적어도 하나의 관용원성 인자의 삽입 또는 결실)은 세포, 예를 들어 보편적 공여자 세포가 생착 후 비변형된 세포보다 적어도 1.05배, 적어도 1.1배, 적어도 1.25배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배 또는 적어도 50배 더 높은 비율로 면역 거부를 억제하거나 회피하게 한다. 일 구체예에서, 관용원성 인자는 세포, 예를 들어 보편적 공여자 세포로 삽입된다. 일부 구체예에서, 관용원성 인자는 세포, 예를 들어 보편적 공여자 세포로부터 결실된다. 일부 구현예에서, HLA-E, HLA-G, CTLA-4, CD47, 및/또는 PD-L1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 세포, 예를 들어 보편적 공여자 세포가 숙주 대상체로의 이식 또는 생착 후 면역 거부를 억제하거나 회피하게 한다.
본 명세서에서 용어 "유전적 변형"은 일반적으로 임의의 분자 생물학적 방법, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어 게놈 DNA의 부위에 엔도뉴클레아제 및 적어도 하나의 gRNA를 전달함으로써 유전적으로 편집되거나 조작된 게놈 DNA의 부위를 지칭한다. 유전적 변형의 예는 삽입, 결실, 중복, 역위 및 전좌, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 결실이다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 삽입이다. 다른 구현예에서, 유전적 변형은 삽입-결실 돌연변이(또는 indel)여서, 표적 유전자의 리딩 프레임은 이동하여 유전자 산물을 변경시키거나 유전자 산물을 생성하지 않는다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 줄기세포는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 중 적어도 하나의 유전자의 발현이 감소된 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "주요 조직적합성 복합체 클래스 I" 또는 "MHC-I"은 일반적으로 포유류, 예를 들어 인간을 포함하는 척추동물에서 모든 핵형성된 세포의 세포 표면에서 발견되고; 면역 반응을 자극하기 위해 세포 내로부터(즉, 사이토졸) 세포독성 T 세포, 예를 들어 CD8+ T 세포로 비자가 또는 외래 항원의 펩타이드, 예를 들어 단백질을 나타내도록 기능하는 생체분자의 클래스를 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-I 생체분자는 MHC-I 유전자 또는 MHC-I 단백질이다. MHC-I 단백질과 베타-2 마이크로글로불린(β2m) 단백질과의 복합체화는 모든 MHC-I 단백질의 세포 표면 발현에 필요하다. 일부 구현예에서, 비변형된 세포에 비해 MHC-I 인간 백혈구 항원(HLA)의 발현의 감소는 MHC-I 유전자의 발현에서의 감소(또는 축소)를 수반한다. 일부 구현예에서, 비변형된 세포에 비해 MHC-I 인간 백혈구 항원(HLA)의 발현의 감소는 MHC-I 단백질의 세포 표면 발현에서의 감소(또는 축소)를 수반한다.
인간 백혈구 항원 (HLA) 시스템은 인간 내 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 코딩하는 유전자 복합체이다. HLA 클래스 I 단백질은 모두 긴 알파 쇄 및 짧은 베타 쇄, β2m을 갖는다. 소규모의 HLA 클래스 I이 β2m의 부재 하에 발현될 수 있고 β2m의 발현은 HLA 클래스 I 단백질이 세포 내부로부터 펩티드를 제시하는데 필요하다. 본 개시내용은 비변형 정상 인간 줄기세포와 비교 시 감소된 양의 β2m을 발현하는 β2m-KO(Knock-Out), β2m-HLA-G가 KI(Knock-In)된 hPSC 세포를 제공한다. 이에 따라, 이들 세포는 세포독성 T 세포에 의한 면역 감시 및 공격을 피한다.
일 구체예에 있어서, 상기 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 β2m-HLA-G 융합 단백질, HLA-G, HLA-E, PD-L1, 및 CD47 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 줄기세포는 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항원 제시 기전(Antigen Processing and Presenting Machinery)" 또는 "APM"은 항원제시세포 (APCs)내에서 외부 항원(exogeneous antigen) 또는 내부 항원(endogeneous antigen)을 제시하고, 이들을 MHC와 결합하기에 적합한 작은 크기의 단편(fragment) 형태로 절단하는 모든 또는 일부의 과정을 포함하는 기전을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “세포막 전위(membrane translocation)”는 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정은 막 회합 단백질의 입체형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성 중 하나 이상의 조정을 포함하는 세포막 구조 또는 기능 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 막 회합 단백질은 수용체, 막횡단 수용체, 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 부착 단백질 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정은 칼슘 의존적 세포성 메시지 전달(messaging) 경로 또는 시스템의 조정; 포스포리파제 C 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것; 아데닐레이트 시클라제 (AC) 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것; 및 중추 신경 및 뇌에서의 만성 염증 및 중추 신경 및 뇌에서의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병태 또는 증상과 연관된 세포내 신호 전달을 조정하는 것 중 하나 이상을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함한다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자는 NLRC5 또는 RelA인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "비변형된 세포"는 MHC-I의 전사 조절자, 생존 인자, 및/또는 관용원성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자를 수반하는 유전적 변형으로 처리되지 않은 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 비변형된 세포는 줄기 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 비변형된 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 성체 줄기 세포(ASC), 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC), 또는 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)일 수 있다. 일부 구현예에서, 비변형된 세포는 분화된 세포일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적 변형은 적어도 하나의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "엔도뉴클레아제"는 일반적으로 폴리뉴클레오타이드 내에 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 DNA 폴리뉴클레오타이드 내에 포스포디에스테르 결합을 특이적으로 절단한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 호밍 엔도뉴클레아제(HE), 메가뉴클레아제, 메가TAL 또는 CRISPR-연관된 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. 소정의 양태에서, RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제, 예를 들어 II형 CRISPR Cas9 엔도뉴클레아제 또는 V형 CRISPR Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 이의 동족체, 이의 천연 발생 분자의 재조합, 이의 코돈 최적화된 버전, 또는 이의 변형된 버전, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 하나 이상의 단일-가닥 절단(SSB) 및/또는 하나 이상의 이중-가닥절단(DSB)을 도입할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 일반적으로 엔도뉴클레아제와 상호작용하는, 예를 들어 이것에 결합하고 표적 게놈 부위 또는 영역에 결합하거나 혼성화할 수 있는 짧은 리보 핵산을 지칭한다. 일부 구현예에서, gRNA는 단일-분자 가이드 RNA(sgRNA)이다. 일부 구현예에서, gRNA는 스페이서 연장 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 tracrRNA 연장 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 단일-가닥이다. 일부 구현예에서, gRNA는 천연 발생 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 화학적으로 변형된 gRNA이다. 일부 구현예에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 화학 변형, 예를 들어 2′메틸 당 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA이다. 일부 구현예에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 변형된 핵산 골격을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학적으로 변형된 gRNA는 2'-O-메틸-포스포로티오에이트 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 DNA 엔도뉴클레아제와 예비-복합체화될 수 있다.
CRISPR-엔도뉴클레아제 시스템은 유전자 편집에 사용된 RNA-가이드 DNA-표적화 플랫폼으로서 목적에 맞게 고쳐진 원핵생물에서의 자연 발생 방어 기전이다. CRISPR 시스템은 I형, II형, III형, IV형, V형 및 VI형 시스템을 포함한다. 일부 양태에서, CRISPR 시스템은 II형 CRISPR/Cas9 시스템이다. 다른 양태에서, CRISPR 시스템은 V형 CRISPR/Cprf 시스템이다. CRISPR 시스템은 DNA의 절단을 표적화하기 위해 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas9, 및 crisprRNA(crRNA) 및 전사촉진 RNA(tracrRNA)의 2개의 비암호화 RNA에 의존한다.
crRNA는 표적 DNA에서 전형적으로 20개의 뉴클레오타이드(nt) 서열과 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍짓기를 통해 CRISPR-엔도뉴클레아제 복합체의 서열 인식 및 특이성을 유도한다. crRNA에서의 5' 20 nt의 서열의 변경은 특이적 유전좌위로의 CRISPR-엔도뉴클레아제 복합체의 표적화를 허용한다. 표적 서열 뒤에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM: protospacer adjacent motif)라 칭하는 특이적 짧은 DNA 모티프(서열 NGG를 가짐)가 있으면 CRISPR-엔도뉴클레아제 복합체는 단일-가이드 RNA(sgRNA)의 처음 20개의 nt에 일치하는 서열을 함유하는 DNA 서열에만 결합한다.
tracrRNA는 촉매로 활성인 CRISPR-엔도뉴클레아제 복합체를 형성하기 위해 엔도뉴클레아제에 의해 결합된 RNA듀플렉스 구조를 형성하기 위해 crRNA의 3' 말단과 혼성화하고, 이후 이 복합체는 표적 DNA를 절단할 수 있다.
CRISPR-엔도뉴클레아제 복합체가 표적 부위에서 DNA에 결합되면, 엔도뉴클레아제 내의 2개의 독립적인 뉴클레아제 도메인은 각각 PAM 부위의 3개 염기 상류에 DNA 가닥의 하나를 절단하여서, 이중-가닥 절단(DSB)을 남기고, 여기서 DNA의 가닥 둘 다는 염기 쌍에서 종료한다.
일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9(CRISPR 연관된 단백질 9)이다. 일부 구현예에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래이지만, 다른 Cas9 동족체, 예를 들어 S. 아우레우스(S. aureus) Cas9, N. 메닌기티디스(N. meningitidis) Cas9, S. 써모필루스(S. thermophilus) CRISPR 1 Cas9, S. 써모필루스 CRISPR 3 Cas9 또는 T. 덴티콜라(T. denticola) Cas9가 사용될 수 있다. 다른 경우에, CRISPR 엔도뉴클레아제는 Cpf1, 예를 들어 L. 박테륨(L. bacterium) ND2006 Cpfl 또는 액시다미노코커스 종 (Acidaminococcus sp.) BV3L6 Cpfl이다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4,
Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부구현예에서, 야생형 변이체가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이전의 엔도뉴클레아제의 변형된 버전(예를 들어, 이의 동족체, 이의 천연 발생 분자의 재조합, 이의 코돈 최적화된 버전 또는 이의 변형된 버전)을 사용할수 있다.
CRISPR 뉴클레아제는 적어도 하나의 핵 국소화 신호(NLS)에 연결될 수 있다. 적어도 하나의 NLS는 CRISPR 뉴클레아제의 아미노 말단의 50개의 아미노산에 또는 내에 위치할 수 있고/있거나, 적어도 하나의 NLS는 CRISPR 뉴클레아제의 카복시 말단의 50개의 아미노산에 또는 내에 위치할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포는 다능성 줄기 세포(PSC), 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 성체 줄기 세포(ASC), 및 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 이후 소정의 상황 하에 실질적인 분화없이 증식하는 능력을 보유하며 특정 상황 하에 보다 특수화된 또는 분화된 표현형으로 분화하는 능력 또는 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 일 양태에서, 용어 전구세포 또는 줄기 세포는 후손(자손)이 분화에 의해, 예를 들어 배아 세포 및 조직의 진행적인 다양화에서 발생하는 것처럼 완전히 개별적인 특징을 획득함으로써 대개 상이한 방향으로 특수화하는 일반화된 모계 세포를 지칭한다. 세포 분화는 많은 세포 분열을 통해 전형적으로 발생하는 복잡한 과정이다. 분화된 세포는 자체가 다능성 세포로부터 유래된 다능성 세포 등으로부터 유래될 수 있다. 이들 다능성 세포의 각각이 줄기 세포로 고려될 수 있지만, 각각 생성할 수 있는 세포 유형의 범위는 상당히 변할 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 더 높은 발생 가능성의 세포를 생성시키는 능력을 갖는다. 이러한 능력은 천연일 수 있거나 다양한 인자에 의한 치료 시 인공 유도될 수 있다. 많은 생물학적 경우에, 줄기 세포는 하나 초과의 구별되는 세포 유형의 자손을 생성할 수 있으므로 "다능성"일 수 있지만 이것이 “줄기성”에 필요한 것은 아니다.
다른 양상은 상기 유전적으로 변형이 이루어진 줄기세포에서 분화된 계통-제한된 전구세포를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 약 유도 시스템(drug inducible system)을 도입한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약 유도 시스템(drug inducible system)은 유전적 변형을 도입함 없이 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 함유된 배지에서 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포를 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질은 독시사이클린(Doxycycline)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 상기 유전적으로 변형이 이루어진 줄기세포에서 완전히 분화된 체세포를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 "분화된 세포"는 이것이 고려되는 세포보다 발달 경로에 추가로 아래로 진행된 세포이다. 따라서, 줄기 세포는 계통-제한된 전구 세포(예컨대, 근세포 전구 세포)로 분화할 수 있고, 이는 결국 경로의 추가의 아래로 전구 세포의 다른 유형(예컨대, 근세포 전구체), 및 이후 말단 단계 분화된 세포, 예컨대 근세포로 분화할 수 있는데, 이 세포는 소정의 조직 유형에서 특징적인 역할을 하고, 추가로 증식하는 능력을 보유할 수 있거나 보유하지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포로부터 완전히 분화된 체세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 약 유도 시스템(drug inducible system)을 도입한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약 유도 시스템(drug inducible system)은 유전적 변형을 도입함 없이 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 함유된 배지에서 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포를 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질은 독시사이클린(Doxycycline)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 세포치료제를 제작하는 방법으로서, β2m을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되는 단계 및 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 유전적 변형 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 줄기세포는 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입되는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 APM 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 약 유도 시스템(drug inducible system)을 도입하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 약 유도 시스템(drug inducible system)은 유전적 변형을 도입함 없이 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 함유된 배지에서 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포를 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질은 독시사이클린(Doxycycline)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 줄기세포를 제작하는 방법으로서, β2m을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되는 단계 및 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 유전적 변형 단계 및 줄기세포의 분화시 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 유전적 변형 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 줄기세포를 제작하는 방법으로서, β2m을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되는 단계 및 상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 유전적 변형 단계 및 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 함유된 배지에서 분화를 유도하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 β2m-HLA-G 및 APM 관련 인자 도입의 유전적 변형이 이루어진 줄기세포 또는 이의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 세포치료제 또는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 β2m-HLA-G 및 APM 관련 인자 도입의 유전적 변형이 이루어진 줄기세포에서 분화된 계통-제한된 전구세포, 완전히 분화된 체세포 또는 이의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 세포치료제 또는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 세포치료제 또는 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
용어, "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 유효한 세포 집단 또는 조성물을 의미할 수 있다.
용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구현예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구현예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구현예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 폐 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 세포 집단 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 구체예 따른 약학적 조성물의 투여량은 부착형 세포를 기준으로 1.0× 103 내지 1.0× 1010 세포/kg(체중) 또는 개체, 또는 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중) 또는 개체일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 부착형 세포와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. β2m-HLA-G의 NK세포에 대한 면역 저항성 확인
NK세포에 대한 면역회피능을 구사하기 위해 β2m과 HLA-G가 직접적으로 연결된 융합단백질 β2m-HLA-G을 제작하였다. HLA class I 그룹에 속하는 유전자인 HLA-G는 경쇄인 β2m이 결합된 상태에서만 세포 표면으로 이동하여 발현되는 바 HLA-G를 발현시키는 동시에 다른 HLA class I 분자와 결합하지 못하도록 하기 위해 HLA-G와 β2m을 펩티드 결합으로 이어지도록 설계하였다. 이 때, 단백질 링커 (linker)는 서열번호 1의 (GGGGS)4 아미노산 서열의 유연한 구조(flexible linker)로 설계되었다. (GGGGS)4 링커는 β2m이 HLA-G와 적절히 결합하여 안정된 구조를 가질 수 있도록 하는 동시에 다른 HLA class I 분자와 결합하지 못하도록 할 수 있다. DNA서열은 상시발현 프로모터인 EF1a 프로모터에 의하여 발현하도록 하였다.
그 후, 융합단백질 β2m-HLA-G이 NK 면역세포에 저항성을 가지고 있는지 확인하기 위해 HLA class I을 보유하고 있지 않는 K562세포에 과발현을 유도 후 세포독성 실험(Calcein acetoxymethyl release assay, Calcein-AM)을 하였으며, 그 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1은 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 저항성 실험의 도식화 및 실험결과를 나타낸 그림이다; 녹색 형광: Live cell
도 1에 나타낸 바와 같이, K562세포에 융합단백질 β2m-HLA-G을 발현한 세포는 NK면역세포에 저항성을 가지고 있지 않음을 확인하였다.
K562세포내에 β2m-HLA-G의 발현이 제대로 유지되고 있음을 검증하기 위해 웨스턴 블랏(Western blot) 및 genomic DNA PCR을 진행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또, 혈구형광계 분석을 FACS Aria III 10 유동 세포측정기 상에서 수행하고, Flow Jo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 2는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 단백질 HLA-G의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 β2m-HLA-G 발현 및 HLA Class Ⅰ 발현 저해를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, K562세포는 HLA Class Ⅰ인 HLA-BC가 발현되지 않았고, K562에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포만 특이적으로 β2m-HLA-G를 과량 발현함을 확인하였다.
β2m-HLA-G를 도입한 K562세포의 면역억제능을 평가하기 위해 NK세포 매개 세포 독성 실험을 진행하였다. NK세포 매개 독성을 평가하기 위해 calcein-AM 염색 기반 NK세포 매개 독성 측정법 (calcein-AM release assay)을 수행하였으며, NK세포의 활성도를 평가하기 위해 CD107a 세포 표지 인자 검출 실험을 진행하였다.
Calcein-AM release assay를 위해 1ⅹ106 개의 타겟 세포를 1 mL의 배양배지에 10 uM calcein-AM을 첨가하여 30분간 염색하여 표지하였다. 표지된 타겟 세포를 DPBS를 이용하여 세척하였고, 원심분리 후 적절한 양의 배양배지를 첨가하여 재부유(resuspension)시켰다. 배양한 NK세포의 수를 카운팅한 뒤 인터루킨-2(interleukin-2) 200 IU를 포함한 배양배지로 재부유시키고, 설정된 이펙터:타겟 비율 (E:T ratio)에 따라 적절히 세포를 분배하였다. E:T ratio는 0.33:1, 0.5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1의 비율로 수행하였다. 최고 방출군 (maximum release group)과 자연 방출군 (spontaneous release group)은 각각 2% triton X-100를 포함한 배양배지, NK세포를 포함하지 않는 배양배지로 하였다. 96 multiwell round bottom plate의 각 well에 타겟 세포 100 uL와 NK 세포 100 uL를 배분한 뒤 파이펫을 이용하여 교반하였고, 500 rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤 4시간 동안 공배양하였다. 공배양 후 1000 rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤 상층액 중 75 uL를 96 multiwell assay plate에 옮긴 뒤 SpectraMax iD3 (Molecular Devices) 장비를 이용하여 488 nm 파장의 형광 강도를 측정하였다. 측정된 값을 이용하여 NK세포 매개 독성 (Specific lysis)의 값을 다음과 같은 공식으로 산출하였다.
[식 1]
NK세포 활성도 검사를 위한 CD107a 표지 인자 검출 실험 (CD107a degranulation assay)은 NK세포의 활성화시 방출되는 용해 과립 (lytic granule)의 막 단백질 CD107a를 검출하는 실험이다. 각각 1ⅹ106 개의 NK세포와 타겟 세포를 1:1의 비율로 96 multiwell round bottom plate에서 anti-CD107a APC 항체와 4시간 동안 공배양하였고, 공배양 시작 1시간 후 10 mg/mL Brefeldin A (Sigma)를 첨가하였다. 공배양을 마친 후 세포를 5 mL polystyrene tube로 옮긴 뒤 3% FBS를 포함한 DPBS로 세척하였고, anti-CD56 PE 항체를 이용하여 재염색하였다. 염색을 마친 세포를 3% FBS를 포함한 DPBS로 세척하고 재부유한 뒤 BD FACSAriaTMIII 장비를 이용하여 분석하였다. 확보한 결과에서 CD56 양성 NK세포를 게이팅한 뒤 해당 세포의 CD107a 발현도를 측정하여 비교했다.
도 4는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 K562세포에 β2m-HLA-G을 발현시킨 세포의 NK 면역세포에 대한 활성도 측정한 그림 및 그래프이다.
도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, β2m-HLA-G 발현하고 있는 세포는 면역세포에 대한 저항성을 보유하게 됨을 확인하였다.
실시예 2. β2m-HLA-G가 삽입된 hPSCs 제작
내인성(endogenous) β2m가 β2m-HLA-G로 치환된 전분화능 줄기세포를 제작하기 위해, CRISPR/Cas9을 활용한 유전자 편집을 이용하였다. guide RNA는 CRISPR design tool(Zhang Lab)을 이용하여 β2m 유전자의 exon 1 좌위를 타겟하여 설계하였다. Guide RNA의 서열은 서열번호 2의 5'-AGCCTGAAGTCCTAGAAT-3'이며, 이 서열을 CRISPR/Cas9 All-in-one system인 pCAG-SpCas9-GFP-U6-gRNA(Addgene #79144) 플라스미드에 삽입하였다. HDR(Homology-directed repair)을 유도하기 위한 상동성 서열 (homology arm)은 gRNA 타겟 서열 주위 각 약 1.5kb 서열을 사용하였으며, CRISPR/Cas9 플라스미드와 함께 Lonza Amaxa 3D nucleofector 장비를 이용한 전기천공법 (electroporation)을 통하여 전분화능 줄기세포에 투입하였다. 형질 전환된 전분화능 줄기세포는 TeSR-E8 배양배지에서 수일간 배양하며, 그 후 500 ug/mL Geneticin(Thermo)을 배지에 첨가하여 외래 유전자가 삽입된 세포를 선별하였다. 선별된 세포로 이루어진 콜로니는 이후 별도로 분리 배양한 뒤 핵산을 추출, PCR 기법을 통해 유전자의 삽입 여부를 확인하였다. 삽입된 유전자 또는 삽입되지 않은 DNA가닥의 서열을 Sanger sequencing을 통해 분석하여 적절한 클론을 취하였다. 즉, 유전자가위기반의 HDR(Homology Directed Repair, HDR)방법을 이용하였고, 내인성(endogenous) β2m은 인델(indel)에 의해서 낙-아웃(Knock-out) 유도되었다. 그 모식도를 도 6에, 이를 바탕으로 구축한 세포주(A5, A9) 및 대조군의 유전형 분석(genotyping)을 전기영동(gel electrophoresis)으로 확인한 결과는 도 7에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 endogenous β2m 유전자가 좌위에 β2m-HLA-G으로 치환된 전분화능 줄기세포 제작 기법에 대한 모식도이다.
도 7은 일 구체예에 따른 인델(indel)을 통해 endogenous β2m 유전자가 좌위에 β2m-HLA-G으로 치환된 세포주 A5, A9에 대한 모식도 및 유전자형분석 결과를 나타낸 그림이다.
유전적 변형이 이루어진 세포주(A5, A9)에서 β2m-HLA-G의 발현 유지 및 내인성(endogenous) β2m 낙-아웃(Knock-out)로 인한 HLA class I 발현 저해를 검증하기 위해, 실시예1.과 동일한 방법으로 유세포 분석을 시행하였고, 면역 세포 화학(immunochemistry)을 이용하여 HLA-G의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 β2m-HLA-G 발현 및 HLA Class Ⅰ 발현 저해를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 9는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 β2m-HLA-G 발현을 형광염색으로 확인한 그림이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, β2m 낙-아웃(Knock-out) 유전적 변형이 이루어진 세포주(β2m KO, A5, A9)에서만 HLA Class Ⅰ인 HLA-ABC가 발현되지 않았으며, β2m-HLA-G을 삽입한 세포주(A5, A9)에서만 동시에 HLA-G가 발현되었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 핵산을 염색하는 Hoechst(청색)은 모든 세포에서 관찰되었으나, β2m-HLA-G을 삽입한 세포주(A5, A9)에서만 세포 표면 근처에서 HLA-G(적색)이 관찰되었다.
유전자 편집 후 전분화능 줄기세포 마커(Oct4, Nanog, Sox2, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60)를 이용해 유전적 변형이 이루어진 세포주에서 전분화능을 유지하는지 확인하기 위해, 유세포분석과 형광염색으로 발현도 확인하였고, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. 유전자 편집 후 전분화능 줄기세포의 유전체 안정성 검사를 위해 GC-banding 핵형 분석(karyotyping)을 하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 10은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현도를 유세포 분석을 통해 확인한 그림이다.
도 11은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 전분화능 줄기세포 마커의 발현도를 형광염색으로 확인한 그림이다.
도 12는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 GC-banding 핵형분석으로 확인한 그림이다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 모든 세포주에서 유전자 편집 후 전분화능 줄기세포 마커가 발현되어 줄기세포능이 유지됨을 확인하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 모든 세포주에서 유전자 편집 후에도 정상적인 핵형이 유지됨을 확인하였다.
이상의 결과를 통해, 세포내(endogenous) β2m을 삭제함으로써 내인성 HLA class I의 발현을 차단하였고, 동시에 외부에서 넣어준 β2m이 HLA-G에만 결합됨으로써 내인성 HLA class I 발현에는 영향을 미치지 않음을 확인하였으며, HLA class I의 발현이 완전히 억제됨을 확인하였으며, 이는 T 면역세포에 의한 면역 회피 능력의 확보하였음을 의미한다.
실시예 3. 세포분화에 따른 β2m-HLA-G의 발현 저해 기전확인
줄기세포를 알려진 방법을 통하여 각각 신경세포 계열과 혈액세포 계열로 분화하였다. 신경세포 계열로의 분화는 줄기세포를 5분간 37℃에서 accutase (Stemcells) 처리하여 단일 세포로 해리한 뒤 96-multiwell ultra low attachment (ULA) round bottom plate의 각 well에 2000 개 세포를 분배한 뒤 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여 배아유사체(embryoid body)를 제작, 그 후 DMEM/F12 (Thermo Fisher), N2 (Themo Fisher), B27 (Thermo Fisher), 100 nM LDN193189 (Tocris), 10 μM SB431542 (Tocris) 배지에서 3일, 20 ng/mL rhFGF basic (R&D Systems)와 20 ng/mL rhEGF (R&D systems)를 추가한 배지에서 7일 배양하였다. 그 후 나타난 Neural rosette을 분리하여 DMEM/F12, N2, B27, 20 ng/mL rhFGF basic, 20 ng/mL rhEGF, 3 μM CHIR99021 (Tocris) 배양 배지에서 유지하였다. 혈액세포의 경우 StemDiffTM Hematopoietic Kit (Stem Cell Technologies) 키트를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 분화를 진행하였다. 분화된 신경계통 세포와 혈액계통 세포는 각각 유세포 분석 등을 통하여 표현형을 분석하였다. 유세포 분석에는 anti-CD34 (FITC, 1:100, BD Bioscience), anti-CD45 (FITC, PE-Cy7, 1:100, BD Bioscience), anti-Nestin (AlexaFluor488, 1:100, Millipore), anti-HLA-G (PE, 1:100, Abcam), anti-HLA-BC (APC, 1:100, eBioscience) 등의 항체가 사용되었다. BD FACS Aria III 장비를 이용하여 유세포 분석 데이터를 얻고, FlowJo software (Tree Star) 프로그램을 이용하여 분석하였으며 도 13 내지 도 15에 나타내었다.
도 13은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포 및 저면역원성 유도된 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현의 변화와 IFN-γ를 처리했을 시의 HLA-G의 변화를 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험을 통해 확인한 그래프이다.
도 14는 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현의 변화를 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 15는 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포의 혈액세포 및 신경세포로 분화시 HLA-G의 발현을 IFN-γ을 처리했을 시와 비교하여 유세포 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 전분화능 인간 줄기세포(hPSCs)를 조혈세포 계통(hematopoietic lineage)으로 분화를 시켰을 경우, HLA class I의 발현은 일정하게 유지되었으나, 신경세포 계통(neural lineage)으로 분화시 HLA class I의 발현은 감소되었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, β2m-HLA-G을 삽입한 세포주(A5, A9)에서 HLA-G의 발현이 혈액세포로 분화했을 시에 유사하게 유지되나, 신경 세포로 분화시 발현량이 현저하게 감소함을 확인하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, β2m-HLA-G을 삽입한 세포주(A5, A9)에서 IFN-γ를 처리했을 시 혈액세포로 분화 시에 비교하여 신경세포로 분화 시에 HLA-G의 발현량이 더욱 큰 폭으로 회복하는 것을 확인하였다.
이상의 결과를 통해, 범용 인간 유래 줄기세포(universal hPSCs)에서도 일정하게 유지되어야 하는 β2m-HLA-G의 발현이 세포분화가 진행됨에 따라 감소되는 경향을 관찰하였다. 구체적으로, RNA 전사체에서는 오히려 증가하지만 세포막으로의 전위가 저해되는 경향을 파악하였다. β2m-HLA-G universal hPSCs를 신경세포로 분화를 유도하였을 경우 HLA-G의 발현에서 변화가 생김을 관찰하였다.
β2m-HLA-G의 발현에 사용된 프로모터가 세포분화에 의해서 영향을 받는지 확인하기 위해 저면역원성 유도 플라스미드와 동일한 구조의 EGFP(Enhanced Green Fluorescent protein, EGFP) 발현 플라스미드를 구축하여, 이를 통해 세포주를 제작하였다. 세포주 제작에 CRISPR/Cas9 플라스미드와 gRNA 서열, 상동성 서열 등은 저면역원성 줄기세포 제작에 사용된 것과 모두 동일하며, β2m-HLA-G 서열만 EGFP 서열로 교체하여 녹색 형광 단백질을 이용하여 확인하였고 도 16에 나타내었다. 저면역원성 세포주 제작 방법과 동일하게 EGFP 세포주를 획득하였으며, 이를 신경계통 세포로 분화시키고 EGFP 발현량을 유세포 분석을 통해 측정하였다. 측정된 형광값의 Mean fluorescence intensity (MFI) 평균값을 비교하여 도 17에 나타내었다.
도 16은 일 구체예에 따른 저면역원성 유도된 줄기세포의 프로모터 부근에 형광단백질(GFP)을 융합한 모식도 및 형광 염색 발현을 확인한 사진이다.
도 17은 일 구체예에 따른 저면역원성 유도된 줄기세포의, IFN-γ을 처리했을 시와 미처리시 형광단백질의 발현양 및 세포 표면의 β2m 발현양을 비교한 그래프이다.
도 16 및 도 17에 나타낸 바와 같이, β2m-HLA-G와 달리 GFP의 발현은 세포 분화에 의해서 영향을 받지 않음을 확인하였다.
이상의 결과를 통해, 세포 분화시 β2m-HLA-G 발현 또는 발현된 단백질이 영향을 받음을 검증하였다.
실시예 4. APM에 의한 HLA class 1의 조절
HLA class I의 세포막으로 전위(translocation)를 유도하는 APM 관련 유전자(Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7)들의 신경세포 및 혈액세포로 분화시 발현 양을 측정하기 위해, qPCR 시행하였으며, 그 결과를 도 18 및 도 19에 나타내었다.
도 18은 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 신경줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 19는 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 혈액줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 줄기세포의 신경세포로 분화시 β2m 유전자의 RNA 양은 FACS 분석에서 관찰된 단백질의 양과 달리 반대로 증가하는 경향을 보이나, HLA class I의 localization에 중요한 역할을 한다고 알려진 APM 유전자는 신경세포 분화시 급격하게 감소함을 확인하였다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 줄기세포의 신경세포로 분화시와 달리 혈액세포로 분화시 APM 관련 유전자는 상대적으로 증가함을 확인하였다.
신경세포에서 염증 반응을 유도하는 INF-γ이 처리되었을 시, HLA class I의 세포막으로 전위(translocation)를 유도하는 APM 관련 유전자(Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7)들의 발현 양을 측정하기 위해, qPCR 시행하였으며, 그 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.
도 20은 일 구체예에 따른 다분화능 줄기세포의 및 신경줄기세포의 IFN-γ을 처리했을 시 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21은 일 구체예에 따른 IFN-γ을 미처리와 대비하여 IFN-γ을 처리했을 시 다분화능 줄기세포와 신경줄기세포의 β2m 및 APM 관련 유전자인 Tapasin, Tap1, Tap2, LMP2, 및 LMP7 유전자의 mRNA 발현량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 줄기세포의 신경세포로 분화시에도 IFN-γ를 처리하여 염증 신호 활성화 유도시 감소되었던 APM 유전자들이 큰 폭으로 증가함을 확인하였다.
도 21에 나타낸 바와 같이, IFN-γ을 미처리와 대비하여 IFN-γ을 처리했을 시 APM 관련 유전자의 발현양의 증가는 줄기세포 보다 분화된 신경세포에서 더욱 큰 폭으로 증가함을 확인하였다.
이상의 결과를 통해, 염증 반응을 유도하는 INF-γ는 감소된 β2m-HLA-G의 발현을 유도하며, 이때 APM이 중요한 인자로 작용함을 알 수 있었다. 따라서, APM 발현을 조절하는 NLR Family CARD Domain Containing 5 (NLRC5) 또는 activator subunit of nuclear factor kappa B (RelA)를 과발현 시켰을 경우 신경계 분화시 감소된 APM의 발현을 유도하며 이로 인해 β2m-HLA-G의 발현양 및 세포막 전위가 지속적으로 유지될 수 있음을 추론할 수 있다.
실시예 5. NLRC5, RelA기반 APM 조절에 의한 HLA class 1 발현 증가
유전적 변형을 가하지 않은 정상 인간 줄기세포(normal hPSC)의 유래 분화 신경세포에서 APM관련 유전자 NLRC5, RelA의 과발현을 유도하였을 때 감소되었던 APM 유전자와 HLA class I의 발현양 및 세포막 전위의 변화를 확인하고자 mRNA의 양을 측정하기 위해 qPCR을 시행하였고, 그 결과를 도 22에 나타냈으며, 단백질의 발현양을 측정하기 위해 FACS 분석을 시행하였고, 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 22는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 APM 관련 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 23은 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화 FACS 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 24는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 FACS 분석에서 HLA Class I의 발현의 양을 IFN-γ처리시와 비교한 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 22에 나타낸 바와 같이, 정상 인간 줄기세포(normal hPSC) 유래 줄기세포가 신경세포로 분화 후, 형질주입을 통한 NLRC5, RelA의 과발현이 유도된 결과 APM 유전자 (TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, Tapasin)의 mRNA량이 증가되었음을 확인하였다.
도 23 및 도 24에 나타낸 바와 같이, NLRC5, RelA의 과발현이 신경세포에서 감소된 HLA class I의 세포막 전위(membrane translocation)을 증가시킴을 확인하였다.
유전적 변형을 가하지 않은 정상 인간 줄기세포(normal Hpsc)의 유래 분화 신경세포에서 APM관련 유전자 NLRC5, RelA 각각을 과발현 유도시, 그렇지 않은 경우와 대비하여 β2m의 발현량을 비교하기 위하여 형광염색(immune cyto staining)을 시행하였고, 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25는 일 구체예에 따른 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA Class I의 발현의 변화를 면역화학염색을 통해 확인한 사진이다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 유전적 변형을 가하지 않은 정상 줄기세포에서 분화된 신경세포에 NLRC5, RelA의 과발현이 HLA class I의 세포막 전위(membrane translocation)을 증가시켜 MHC Class I의 하위그룹 중 하나인 β2m의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
실시예 6. NLRC5, RelA기반 APM 조절에 의한 β2m-HLA-G의 발현 증가 유도
β2m을 β2m-HLA-G으로 치환하는 유전적 변형을 가한 인간 줄기세포(gene-edited hPSC)의 유래 분화 신경세포에서 APM관련 유전자 NLRC5, RelA의 과발현을 유도하였을 때 감소되었던 APM 유전자와 β2m-HLA-G의 발현양 및 세포막 전위의 변화를 확인하고자 mRNA의 양을 측정하기 위해 qPCR을 시행하였고, 그 결과를 도 26에 나타내었으며, 단백질의 발현양을 측정하기 위해 FACS 분석을 시행하였고, 그 결과를 도 27에 나타내었다.
도 26는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 APM 관련 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 27은 일 구체예에 따른 저면역원성 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 HLA-G의 발현의 변화 FACS 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 28는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 FACS 분석에서 HLA Class I의 발현의 양을 IFN-γ처리시와 비교한 그래프이다; NTC: Non-treated control, Nmut: NLRC5 mut
도 26에 나타낸 바와 같이, 저면원성 줄기세포(β2m KO, β2m-HLA-G KI) 유래 줄기세포가 신경세포로 분화 후, 형질주입을 통한 NLRC5, RelA의 과발현이 유도된 결과 APM 유전자 (TAP1, TAP2, LMP2, LMP7, Tapasin)의 mRNA량이 증가되었음을 확인하였다.
도 27 및 도 28에 나타낸 바와 같이, 저면원성 줄기세포(β2m KO, β2m-HLA-G KI) 유래 줄기세포가 신경세포로 분화 후 NLRC5, RelA의 과발현이 신경세포에서 감소된 HLA class I의 세포막 전위(membrane translocation)을 증가시킴을 확인하였다.
면역억제능을 평가하기 위해 NK세포 매개 세포 독성 실험을 진행하였다. NK세포 매개 독성을 평가하기 위해 상기 실시예1.에서 전술한 바와 동일한 방법으로 calcein-AM 염색 기반 NK세포 매개 독성 측정법 (calcein-AM release assay)을 수행하였으며, 그 결과를 도 29에 나타내었다.
도 29는 일 구체예에 따른 저면원성 유도된 줄기세포에서 분화된 신경세포에 APM 관련 유전자 NLRC5, RelA을 과발현 유도시 NK 면역세포에 대한 세포독성 실험을 한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29에 나타낸 바와 같이, 저면원성 줄기세포(β2m KO, β2m-HLA-G KI) 유래 줄기세포가 신경세포로 분화시 NLRC5, RelA의 과발현이 유도되었을 경우 HAL-G의 발현이 증가함에 따라 IFN-γ 처리시와 유사한 정도로 NK 세포의 살해능을 감소시킴을 확인하였다.
이상의 결과로 NLRC5, RelA 발현 조절을 이용하여서 분화된 세포에서도 hypoimmunogenic feature를 지속적으로 유지할 수 있는 조건을 확보함으로써 모든 환자의 모든 조직에 적용 가능한 범용 전분화능 줄기세포 기반 세포치료제 제작 가능성을 증진할 수 있는 기반을 제공하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> KRIBB
<120> Hypoimmunogenic stem cell using antigen presenting machinery and
method thereof
<130> PN220379KR
<160> 2
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<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LINKER
<400> 1
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> guide RNA
<400> 2
agcctgaagt cctagaat 18
Claims (28)
- β2m을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되고,
상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된, 유전적으로 변형된 줄기세포. - 청구항 1에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 줄기세포는 HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C 중 적어도 하나의 유전자의 발현이 감소된 것인, 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 β2m-HLA-G 융합 단백질, HLA-G, HLA-E, PD-L1, 및 CD47 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드인 것인, 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 β2m-HLA-G 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드인 것인, 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 세포 분화시 비변형된 세포와 비교하여 HLA-G의 발현이 증가된 상태로 유지되는 것인, 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 비변형된 세포와 비교하여 증가된 면역 회피를 갖는 것인, 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 적어도 하나의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템을 포함하는 것인, 줄기세포.
- 청구항 7에 있어서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템인, 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 다능성 줄기 세포(PSC), 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 성체 줄기 세포(ASC), 및 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 계통-제한된 전구 세포 또는 완전히 분화된 체세포로 분화될 수 있는 것인 줄기세포.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 줄기세포에서 분화된 계통-제한된 전구세포.
- 청구항 11에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입된 것인 계통-제한된 전구세포.
- 청구항 12에 있어서, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 계통-제한된 전구세포.
- 청구항 11에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 처리되는 것인 계통-제한된 전구세포.
- 청구항 13에 있어서, 상기 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자는 NLRC5 또는 RelA인 계통-제한된 전구세포.
- 청구항 11에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포는 신경 전구세포, 혈액 내피 전구세포, 중간엽 전구 세포, 조혈 전구세포, 및 췌장 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 계통-제한된 전구세포.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 줄기세포에서 완전히 분화된 체세포.
- 청구항 17에 있어서, 상기 줄기세포로부터 완전히 분화된 체세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입된 것인 체세포.
- 청구항 18에 있어서, 상기 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 삽입인 체세포.
- 청구항 17에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 처리되는 것인 체세포.
- 청구항 19에 있어서, 상기 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자는 NLRC5 또는 RelA인 체세포.
- 청구항 17에 있어서, 상기 줄기세포로부터 완전히 분화된 체세포는 신경 세포, 혈액 세포, 간 세포, 상피 세포, 혈관 세포, 지방 세포, 연골 세포, 근육세포, 췌장 세포, 및 면역세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 체세포.
- 세포치료제를 제작하는 방법으로서,
β2m을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 그의 일부가 결실되는 단계; 및
상기 결실된 부위와 부분적으로 중첩하거나 완전히 중첩하는 부위에 관용원성 인자(tolerogenic factor)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 유전적 변형 단계를 포함하는 방법. - 청구항 23에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 줄기세포가 분화되는 과정에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형이 추가적으로 도입되는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 24에 있어서, 상기 APM 인자의 발현을 증가시키는 적어도 하나의 유전적 변형은 비변형된 세포에 비해 세포막 전위(membrane translocation)의 발현을 증가시키는 유전자 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 삽입되는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 줄기세포의 분화단계의 세포 또는 분화된 계통-제한된 전구세포에서 APM(Antigen Processing and Presenting Machinery) 인자의 발현을 증가하거나, 유지하거나 또는 발현의 감소를 억제시키는 물질이 처리하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 청구항 23 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적 변형은 적어도 하나의 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템을 이용하는 것인 방법.
- 청구항 27에 있어서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템인 것인 방법.
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