KR20230167302A - 베일로넬라 세미날리스 균주, 그의 유래의 배양액 및 그의 항염증 용도 - Google Patents

베일로넬라 세미날리스 균주, 그의 유래의 배양액 및 그의 항염증 용도 Download PDF

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KR20230167302A
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inflammatory
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이주혁
유승엽
강세원
김지선
박승환
이정숙
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한국생명공학연구원
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Abstract

신규한 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 및 이들의 항염증 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 균주 및 이의 유래의 배양액에 의하면, 염증 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

베일로넬라 세미날리스 균주, 그의 유래의 배양액 및 그의 항염증 용도{Veillonella seminalis strain, culture medium from thereof and anti-inflammation uses of thereof}
신규한 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 및 이들의 항염증 용도에 관한 것이다.
마이크로바이옴(Microbiome)은 특정 환경에 존재하고 있는 미생물들과 이들의 유전정보 전체를 말하는 것으로, 단일 생명체의 유전정보 전체를 뜻하는 게놈(Genome)들의 집합체를 의미한다. 따라서, 인체 마이크로바이옴(Human Microbiome)은 인간 몸체 안팎에 서식하고 있는 미생물들과 그들의 유전정보 전체를 의미한다. 인간의 몸은 많은 미생물과 공생관계를 이루며 살아가며, 특히 장내에는 미생물이 영양분을 섭취하고 체계적인 군집을 형성하기에 최적의 환경으로 체내에서 가장 많은 미생물이 존재한다. 장내 미생물은 숙주가 지닌 효소만으로는 생성할 수 없는 영양분을 공급하고 숙주의 대사 및 면역 체계와 깊은 연관을 지니는 한편 과민성 대장증후군, 비만, 아토피, 우울증, 류마티스 관절염, 자폐 스펙트럼 장애, 치매 등 다양한 질병의 발생과 관련되어 있다고 보고되고 있다. 최근에는 서구적인 식습관과 무분별한 항생제 사용으로 장내 미생물총(Microbiota)의 불균형이 일어나 장 건강이 악화되고 있으며, 장내 미생물과 관련된 다양한 질병에 대한 연구로 인해 장내 미생물에 대한 중요성이 부각되고 관심이 대두되고 있다.
이에, 인간의 장내 유래 미생물을 이용한 질병의 개선, 예방, 또는 치료를 위한 물질의 개발이 필요한 실정이다.
Aujoulat F, Bouvet P, Jumas-Bilak E, Jean-Pierre H, Marchandin H. Int J Syst Evol Microbiol 64,3526-3531, doi: 10.1099/ijs.0.064451-0. (2014).
일 양상은 기탁번호 KCTC 14932BP로 기탁된, 베일로넬라 속(Veillonella sp.)에 속하는 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 균주 유래의 파쇄액, 또는 배양액을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주, 그의 유래의 파쇄액, 이의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 베일로넬라 속(Veillonella sp.)에 속하는 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 14932BP로 기탁된 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 16S rRNA 유전자 또는 이와 뉴클레오타이드 서열 상동성이 97%이상인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 16S rRNA 유전자를 가지는 균주일 수 있다. 구체적으로, 본 명세서의 서열번호 1로 이루어진 뉴클레오티드 서열과 적어도 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% 또는 100%의 상동성을 가진다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 자연적으로 일어난 균주의 돌연변이인 균주일 수 있다.
상기 균주는 인체에서 유래한 것일 수 있으며, 특히 사람의 분변(feces) 시료에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 균주는 생균주 또는 약독화 균주(사균주)일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약독화"는 균주의 병원성을 감소시키도록 변형시킨 것을 의미한다. 약독화는 균주를 대상체에 투여할 경우 독성 및 다른 부작용을 감소시킬 목적으로 이루어질 수 있다. 약독화 균주는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 약독화는 균주가 숙주 세포에서 생존하도록 하는 독성인자(virulence factor)를 결실시키거나 파괴하여 달성될 수 있다. 상기 결실 및 파괴는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 상동성 재조합, 화학적 변이 유발, 조사 변이 유발 또는 트랜스포존 변이 유발 등과 같은 방법에 의해 실시되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 인간의 분변으로부터 분리된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 장내 항염증 또는 장내 균총 개선 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균주는 염증 유발된 세포에서 산화 질소의 생성을 억제하거나, 염증성 사이토카인(예를 들면, TNF-α 또는 IL-6)의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 항염성 사이토카인(예를 들면, IL-10)을 증가시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 염증 유발된 세포는 LPS(Lipopolysaccharide)자극을 통하여 염증이 유발된 마우스의 대식세포(RAW264.7)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 장내 항염증 활성은 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.
(a) 염증성 사이토카인의 발현량이 대조군 대비 30% 이상 감소
(b) 아질산염의 발현량이 대조군 대비 30% 이상 감소
(c) 장 투과성이 또는 장 움(crypt)의 탈락의 감소.
상기 장내 균총 개선 활성은 (d) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.
(d) 염증성 장 질환이 유도된 마우스 대비, 장내 균총 내 프로테오박테리아(proteobacteria) 문의 비율의 감소
(e) 염증성 장 질환이 유도된 마우스 대비, 장내 균총 내 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문의 비율 증가
(f) 염증성 장 질환이 유도된 마우스에서 감소된 종 풍부도의 회복
다른 양상은 상기 베일로넬라 속(Veillonella sp.)에 속하는 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 제공한다.
상기 균주, 장내 항염증 활성, 및 장내 균총 개선 활성에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 베일로넬라 세미날리스가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라 앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 균주 자체를 의미하는 것으로 분변 샘플 등으로부터 분리하여 선별한 균주 자체 또는 상기 균주를 배양하여 배양액으로부터 분리한 균주를 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 일정 시간 동안 가만히 두어 가라앉은 배양액의 하층 부분으로 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 베일로넬라 세미날리스를 적절한 배지(예를 들면, Reinforced Clostridial Medium 배지)에서 10℃초과 또는 40℃미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득 된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 베일로넬라 세미날리스를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들 정제한 정제물, 또는 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 단쇄 사슬 지방산 (short chain fatty acid)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 프로피온산(propionate)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어"단쇄지방산"은 탄소수가 6개 이하인 짧은 길이의 지방산을 의미하는 것으로서, 장내 미생물로부터 생성되는 대표적인 대사산물이다. 또한, 단쇄지방산은 면역력 증가, 장내 림프구 안정, 인슐린 신호 저하, 교감 신경 자극 등 체내에 유용한 기능을 가지고 있다. 이러한, 단쇄지방산은 대표적으로 아세트산(Acetate), 프로피온산(Propionate), 뷰티르산(Butyrate)이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "프로피온산"은 CH3CH2CO2의 화학식을 가지며, 탄소 3개의 카르복실산의 구조를 가지는 단쇄 지방산 중 하나로, 장내 미생물로부터 생성될 수 있으며, 항염증 활성을 가지고 있다.
또 다른 양상은 베일로넬라 세미날리스 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 질병 개선, 예방 또는 치료 용도를 제공한다. 본 명세서에서 용어 "치료(treat)"는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 염증 등이 치유되는 것을 의미할 수 있다. 상기 치료는 염증의 개선 또는 완화를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 염증으로부터 유발되는 증상의 치유 또는 회복을 의미할 수 있다.
상기 균주의 용도는 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료, 또는 장 건강의 예방 또는 개선을 포함할 수 있다.
상기 염증성 질환은 소화기계의 염증, 안 내 염증, 피부의 염증, 구강 내 염증, 폐를 포함하는 호흡계의 염증, 심장 혈관계 내 염증, 뇌의 염증, 귀 내 염증 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 염증성 질환은 소화기계의 염증성 질환인 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD); 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome); 베체트병(Behcet's disease); 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease); 궤양성 대장염(ulcerative colitis); 혈관염(vasculitis); 점막염(mucositis); 구내염(stomatitis); 임플란트 주위염(peri-implantitis); 치주염(periodontitis); 치수염(pulpitis); 치은염(gingivitis); 폐렴; 피부염(dermatitis); 아토피 피부염(atopic dermatitis); 접촉성 피부염(contact dermatitis); CREST 증후군; 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis); 피부근염(dermatomyositis); 전신성 공피증(systemic scleroderma); 결절성 홍반(erythema nodosum); 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura); 화농성 한선염(Hidradenitis suppurativa); 편평태선(Lichen planus); 마지드 증후군(Majeed syndrome); 슈니츨러 증후군(Schnitzler syndrome); 건선(psoriasis); 습진(eczema); 여드름(acne); 구강염(mouth ulcers); 포도막염(uveitis); 인두염(pharyngitis); 편도염(tonsillitis); 중이염을 포함하는 이염(otitis); 관절염(psoriatic arthritis); 활액막염(synovitis); 수막염(meningitis); 뇌염(encephalitis); 비커스테프 뇌염(Bickerstaff's encephalitis) 뇌척수염(encephalomyelitis); 척추염(spondylitis); 골수염(osteomyelitis); 길리안 바레 증후군(Guillain-barre syndrome); 척수염(myelitis); 시속신경수염(neuromyelitisoptica); 방광염(cystitis); 감염 또는 상처 부위에 급성 염증; 신염(nephritis); 및 사구체신염(glomerulonephritis)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 소화기계의 염증성 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD); 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome); 장염(enteritis); 크론병(Crohn’s disease); 베체트병(Behcet’s disease); 또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 상기 장 건강의 개선은 장내 유익균의 증식 및 유해균 억제에의 도움, 면역을 조절하여 장 건강에의 도움, 또는 배변활동 원활에 도움인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 베일로넬라 세미날리스 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.00001 중량% 내지 60 중량 %, 0.00001 중량% 내지 40 중량%, 0.00001 중량% 내지 30 중량%, 0.00001 중량% 내지 20 중량%, 0.00001 중량% 내지 10 중량%, 0.00001 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 상기 균주 유래의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션(formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
상기 조성물은 건강기능식품 조성물을 일 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성 분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등 의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 피부외용제 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제, 비타민 C, 아스 코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.
또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 염증과 관련된 상태일 수 있다.
상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 상기 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 염증과 관련된 상태의 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.00001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.00001 mg 내지 500 mg, 0.00001 mg 내지 100 mg, 0.00001 mg 내지 50 mg, 0.00001 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 민감도와 같은 요인 등에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료시 1일에서 30 일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 균주 및 이의 유래의 배양액에 의하면, 염증 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주의 배양액(VCFS)의 유도된 염증 반응에 농도 의존적 항염증 활성을 측정한 그래프이다; Dex: 양성대조군, VCFS: Veillonella seminalis cell free supernatant
도 2는 일 구체예에 따른 균주의 배양액(VCFS)과 V. seminalis 종의 다른 균주(KGMB05584, KGMB09975)의 배양액의 유도된 염증 반응에 대한 항염증 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주의 배양액(VCFS)의 유효성분을 규명하기 위해, 열 처리 이후 항염증 활성을 나타낸 그래프이다; RCM: 양성대조군, VCFS: Veillonella seminalis cell free supernatant
도 4는 일 구체예에 따른 균주의 배양액(VCFS)의 유효성분을 규명하기 위해, 단백질 분해효소 처리 이후 항염증 활성을 나타낸 그래프이다; RCM: 양성대조군, VCFS: Veillonella seminalis cell free supernatant
도 5는 일 구체예에 따른 균주의 배양액(VCFS)의 유효성분을 규명하기 위해, 유기용매 처리에 따른 유기용매 추출물의 항염증 활성을 나타낸 그래프이다; E.A: Ethyl Acetate, RCM: 양성대조군, VCFS: Veillonella seminalis cell free supernatant
도 6은 일 구체예에 따른 균주의 염증성 장 질환(IBD)의 치료 또는 예방효과를 확인하기 위해, 대조군(Control)과 DSS(Dextran Sulfate Sodium)에 의한 IBD 유도군(DSS), 실험군(DSS+V.seminalis), 및 양성대조군(DSS+5-ASA)으로 나눈 것을 도식화하여 나타낸 그림이다.
도 7은 일 구체예에 따른 IBD 마우스 모델에 균주의 항염증 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 IBD 마우스 모델에 균주의 장 투과성 감소의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 일 구체예에 따른 IBD 마우스 모델에 균주의 장 길이 축소 증상의 예방 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 IBD 마우스 모델에 균주의 몸무게 감소의 예방 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 일 구체예에 따른 IBD 마우스 모델에 균주의 설사, 혈변 및 장 움(crypt) 탈락의 예방 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 일 구체예에 따른 IBD 마우스 모델에 균주의 조직 병리학적 지표의 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 일 구체예에 따른 IBD 마우스 모델에 균주의 질병 활성 지표(DAI)의 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주 투여에 따른 장내 마이크로바이옴의 구성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다; CON: 대조군, DSS: Dextran Sulfate Sodium으로 IBD 유도군, VS: IBD 유도 후 V. seminalis 경구투여군
도 15는 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주 투여에 따른 알파 다양성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다; CON: 대조군, DSS: Dextran Sulfate Sodium으로 IBD 유도군, VS: IBD 유도 후 V. seminalis 경구투여군
도 16은 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주 투여에 따른 베타 다양성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다; CON: 대조군, DSS: Dextran Sulfate Sodium으로 IBD 유도군, VS: IBD 유도 후 V. seminalis 경구투여군
도 17은 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주 투여에 따른 장내 미생물간 상호관계를 과(family)수준에서 비교한 계층 열 지도(hierarchical heat map)나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주 투여에 따른 특정 미생물의 상대적 풍부도를 분석한 그래프이다; CON: 대조군, DSS: Dextran Sulfate Sodium으로 IBD 유도군, VS: IBD 유도 후 V. seminalis 경구투여군
도 19는 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주 배양액의 성분을 분석하기 위해 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석한 결과를 나타낸 그래프이다; RCM: 양성대조군, CFS: cell free supernatant, GM37: V. seminalis KGMB01456 균주, Aq 6.8: pH 6.8로 조절한 분획물의 수층, Aq 2.5: pH 2.5로 조절한 분획물의 수층
도 20은 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주의 총유전체 분석을 통해 프로피온산 생합성 경로 및 각 경로에 관여하는 유전자를 나타낸 도식이다.
도 21은 본 발명의 일 예에 따른 베일로넬라 세미날리스 균주 배양액과 또는 프로피온산 처리시 항염증 활성을 비교 분석한 그래프이다; VCFS: Veillonella seminalis cell free supernatant
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리 및 동정
건강한 사람의 분변으로부터 균주를 분리 및 동정하기 위해 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 건강한 사람에게서 수집한 분변 50g과 10% Glycerol이 혼합된 생리 식염수 용액 300ml을 소화되지 않은 음식 및 작은 입자 물질 등을 제거하기 위하여 Stomacher(Bagmixer 400, Interscience)에 넣고, 균질화하여 분변 혼합액을 제조하였다. 이후에, 상기 분변 혼합액을 0.25mm 체(sieves)에 한번 더 여과하여 여과물을 수득한 후, 250ml의 FMT 이식액을 제조하였다. 상기 미생물을 포함하는 조성물로부터 5% sheep blood을 함유하는 RCM 배지(Reinforced Clostridial Medium)에 연속 희석(Serial dilution)하여 Plate에 Spreading하였고 37℃에 2일간 배양하는 과정으로 균을 선별하였다. 배양이 완료된 콜로니에 대해 PCR 증폭을 수행하였고, 분리 배양된 미생물 콜로니 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석하였다. 비교 분석 결과 상동성 99.78%의 Veillonella seminalis 균주를 분리하였다. 선별된 Veillonella seminalis 균주를 2022년 4월 5일자로 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 14932BP를 부여받았고, Veillonella seminalis 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖는다.
실시예 2. 균주의 배양액(VCFS)의 분리
상기 실시예1.에서 분리된 균주 및 동일 종의 다른 Veillonella seminalis 균주(KGMB05584, KGMB09975)를 분양 받아 이의 배양액을 분리하였다.
구체적으로, 상기 분리된 균주를 RCM(Reinforced Clostridial Medium) 배지에서 혐기 상태로 30시간 동안 37℃조건에서 액체 배양하였고, 이를 원심분리 후 필터로 여과하여 균주의 배양액(VCFS, Veillonella seminalis cell free supernatant)을 분리하였다.
실험예 1. 항염증 활성 분석
상기 실시예 2에서 분리된 균주의 배양액의 항염증 활성을 분석하였다.
구체적으로, 항염증 활성을 평가하기 위해 염증성 사이토카인 IL-6과 산화질소(NO)의 간접지표인 아질산염(Nitrite)의 발현량을 측정하였다. 마우스 대식세포(Raw264.7)를 20% 소태아혈청(FBS: fetal bovine serum), 1% 항생제(100U/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신)를 포함하는 RCM(Reinforced Clostridial Medium)으로 5% CO2 존재 하에서 37℃로 배양하였다. 이후에, 상기 Raw 264.7 세포를 48 well 플레이트에 5X104세포/well의 농도로 300μL씩 분주하고, CO2 배양기에서 37℃및 24 시간 동안 배양하였다. well 상층액을 버리고 염증 유발을 위해 lipopolysaccharide(LPS) 10ug/ml가 첨가된 배지를 분주한 후 4 시간 동안 추가 배양하였다. LPS가 들어있는 상층액을 버리고 상기 균주의 배양액를 0%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%의 농도로 배지에 첨가하여 처리한 다음 37℃에서 16시간 배양하였다. 즉, 상기 균주의 배양액과 LPS를 동시 처리하였다. 이후에, 염증성 지표인 IL-6는 ELISA kit (BD bioscience, 미국)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 산화질소(NO)의 간접지표인 아질산염(Nitrite)은 Griess 시약(Sigma, USA)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
항염증 활성이 V. seminalis 기탁 균주 특이적인 활성인지를 확인하기 위해 상기 실시예 2에서 제조한 다른 균주들(KGMB05584, KGMB09975)의 배양액을 상기 와 동일한 방법으로 항염증 활성을 평가하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주의 배양액은 염증 유발된 세포의 IL-6와 아질산염(Nitrite)의 발현량을 농도 의존적으로 감소시킨 것을 알 수 있었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 V. seminalis 종의 다른 균주(KGMB05584, KGMB09975)의 배양액에서도 항염증 활성을 확인할 수 있었다.
이상의 결과는 기탁 균주에 한정하지 않은 V. seminalis 종의 일 구체예에 따른 배양액은 농도 의존적으로 항염증 활성이 있어 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실험예 2. 균주 배양액(VCFS)의 항염증 활성 유효성분 분석
상기 실시예 2에서 분리된 균주의 배양액의 항염증 활성의 유효성분을 확인하기 위해, 열 처리 또는 단백질 분해 효소에 영향을 받는지 또는 유기용매에 의해 추출되는지 분석하였다.
구체적으로, 열(heat)에 대한 민감성을 확인하기 위해 균주 배양액(VCFS)에 30 내지 90℃의 열을 5분 내지 80분간 가해준 후, 실험예 1과 마찬가지의 방법으로 IL-6와 아질산염(Nitrite)의 발현량을 측정하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
구체적으로, 균주 배양액(VCFS)의 유효성분이 단백질인지 확인하기 위해 단백질 분해 효소(Papain, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Protinase K)를 1 mg/ml의 농도로 37℃에서 1시간 동안 반응시켜준 후, 실험예 1과 마찬가지의 방법으로 IL-6와 아질산염(Nitrite)의 발현량을 측정하였고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
구체적으로, 균주 배양액(VCFS)의 유효성분이 유기 용매로 추출되는 물질인지 확인하기 위해 500ml 균주배양액(VCFS)와 동량의 Ethyl acetate를 넣어주었고, 상온에서 30분간 교반 후 그대로 두어 수층과 유기층을 분리하였다. 그 후 유기층만 분리해서 모은 후, 회전 증발 농축기(rotatory evaporator)를 이용하여 용액내 Ethyl acetate를 완전히 증발시키고, 남은 펠렛(pellet)의 무게를 측정한 후 40mg/ml의 농도로 20Mm sodium phosphate buffer에 녹여주었다. 용액내 미생물 감염을 제거하기 위해 필터-여과 과정을 거친 후, 실험예 1과 마찬가지의 방법으로 IL-6와 아질산염(Nitrite)의 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
이상의 결과로 일 구체예에 따른 균주의 배양액의 유효성분은 열 처리 및 단백질 분해 효소에 영향을 받지 않으며, Ethyl acetate로 추출되는 물질임을 알 수 있었다.
실험예 3. DSS로 IBD 유도된 마우스 모델에서 V.seminalis 의 효과 분석
3.1 DSS로 유도된 IBD 동물 모델
상기 실시예 2에서 분리된 균주의 배양액이 염증성 장 질환(IBD) 동물 모델에서 항염증의 활성 및 질병 치료 또는 예방의 효과를 분석하기 위해 하기의 실험을 수행하였다. 동물모델로는 정상 마우스(BALB/c; 5주령; SAMTAKO Co., Ltd. (Gyeonggi-do, Korea) 및 동일 모델에서 7일간 5% DSS(Dextran Sulfate Sodium) 처리된 음용수를 주어 IBD가 유도된 질병 동물 모델을 사용하였다.
도 3을 참조하여 설명하면, BALB/c 마우스 모델에 IBD를 유도하기 전, 7일간 대조군(Control, n=5) 및 DSS(Dextran Sulfate Sodium)를 통해 IBD 유도군(이하, 음성 대조군, DSS군 또는 DSS+PBS군이라고도 함, n=5), 실험군(이하, VS군이라고도 함, n=5)은 Veillonella seminalis live bacteria를, 양성대조군(n=5)은 기존의 IBD 치료제로 알려진 5-ASA(5-aminosalicylic acid)을 경구 투여하였다. 이후에, 모든 그룹에 7일간 5% DSS(Dextran Sulfate Sodium) 처리된 음용수를 주어 IBD를 유도하였다. 모든 그룹은 경구 투여 시 PBS 100μl/day 혹은 Veillonella seminalis 1x109CFU/day 혹은 5-ASA 100mg/kg/day로 투여하였다. DSS투여 7일 후에, Veillonella seminalis의 항염증 활성 및 IBD 치료 또는 예방의 효과를 확인하는 실험을 위해 마우스를 희생시켰다.
3.2 DSS로 IBD 유도된 마우스에서 V.seminalis 의 항염증 활성 분석
V.seminalis의 IBD의 치료제로 유효성을 평가하기 위해, 상기 실시예 3.1에서 DSS에 의해 IBD 유도하기 전 7일간 V.seminalis를 경구 투여한 마우스 모델에서의 항염증 효과를 확인하였다.
구체적으로, 항염증 활성을 평가하기 위해 희생된 마우스의 장 조직에에서 실험예 1과 마찬가지의 방법으로 염증성 사이토카인 IL-6과 TNF-α의 발현량을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주의 항염증 활성에 의해 DSS를 통한 IBD 유도군(DSS+PBS)에 비해 실험군에서 염증성 지표인 IL-6와 TNF-α의 발현이 50%가량 감소한 것을 관찰하였다.
3.3 V.seminalis 의 IBD 치료제 유효성 분석
V.seminalis의 IBD의 치료제로써 유효성을 평가하기 위해, 상기 실시예 3.1에서 DSS를 투여하는 기간 동안 마우스의 몸무게를 측정하였고, DSS에 의해 IBD 유도된 마우스를 희생시킨 후, 마우스의 장 투과성과 장 길이를 측정하였다.
구체적으로, 장 투과성을 확인하기 위해 FITC(Fluorescein isothiocyanate)로 표지된 Dextran을 마우스 경구 투여한 후, serum을 채취하여 serum에서 검출되는 FITC-Dextran의 양을 측정하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다. 장 투과성이 높을수록 채취한 serum에 FITC-Dextran의 양의 많이 검출된다. 그 후, 마우스를 희생시킨 후, 대장 길이 및 각 마우스 모델의 몸무게를 측정하였다. 그 결과는 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, DSS를 통한 IBD 유도군(DSS+PBS)은 장 투과성 증가로 인해 다량의 FITC-Dextran이 측정된 반면, 실험군은 그 양이 현저하게 감소하였음을 알 수 있었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control)을 기준으로 대비하였을 때, DSS를 통한 IBD 유도군(DSS+PBS)은 장 길이가 짧아진 반면, 실험군은 장 길이가 비슷하게 유지되었음을 알 수 있었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control)을 기준으로 대비하였을 때, DSS를 통한 IBD 유도군(DSS+PBS)은 몸무게가 줄어든 반면, 실험군은 몸무게가 비슷하게 양상을 보임을 알 수 있었다.
이상의 결과는 일 구체예에 따른 균주가 마우스 IBD 모델에서 장 벽 파괴를 보호하고, 장길이 축소 증상 및 몸무게 감소 예방의 효과가 있으며, 이는 일 구체예에 따른 균주가 염증성 질환, 특히 염증성 장 질환 또는 과민성 대장증후군의 예방, 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
3.4 V.seminalis 의 IBD 치료제 조직학적 유효성 분석
V.seminalis의 IBD의 치료제로써 유효성을 평가하기 위해, 상기 실시예 3.1에서 DSS에 의해 IBD 유도된 마우스를 희생시킨 후, 마우스의 항문과 장 조직 절단면을 관찰하였고, 조직병리학적 지표, 질병 활동성 지표를 측정하였다.
구체적으로, 장 조직의 변화를 확인하기 위해 마우스의 항문을 육안으로 관찰하였고, 마우스를 희생시켜 장 조직 절단면을 H&E 염색하였으며, 그 결과는 도 11에 나타내었다.
구체적으로, 조직학적으로 IBD의 치료 효과를 확인하기 위해 마우스를 희생시킨 후, 조직병리학적 지표와 질병 활성 지표(Disease Activity Index, DAI)를 측정하였고, 그 결과는 각각 도 12와 도 13에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, DSS를 통한 IBD 유도군(DSS)만 유일하게 육안으로 혈변 증상이 관찰되었으며, H&E 염색결과 대조군을 기준으로 대비하였을 때, DSS를 통한 IBD 유도군(DSS)은 장 움(crypt)의 탈락과 submucosa와 muscularis propria층이 두꺼워진 것이 관찰되었고, 실험군과 양성 대조군에서는 장 움(crypt)의 보존과 submucosa와 muscularis propria층의 두께가 비슷하게 유지되었음을 알 수 있었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, DSS를 통한 IBD 유도군(DSS+PBS)에 비해 실험군 병리학적 지표의 수치가 2.67±0.49 더 낮음을 알 수 있었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, DSS를 통한 IBD 유도군(DSS+PBS)에 비해 실험군에서 질병 활성 지표가 유의하게 감소하였으며, 이는 양성대조군과 비슷한 양상을 보임을 알 수 있었다.
이상의 결과는 일 구체예에 따른 균주가 마우스 IBD 모델에서 장 움(crypt)를 보존하고, 조직학적으로 질병의 발생을 억제, 예방의 효과가 있으며, 이는 일 구체예에 따른 균주가 염증성 질환, 특히 염증성 장 질환 또는 과민성 대장증후군의 예방, 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실험예 4. 메타지놈 데이터를 통해 V.seminalis의 장내 마이크로바이옴 회복능 분석
V. seminalis KGMB01456 균주의 장내 마이크로바이옴의 회복 효능을 평가하기 위해, 분변에서 추출한 미생물의 메타지놈 데이터 및 장내 마이크로바이옴의 상대적 풍부도를 분석하였다.
구체적으로, 각 대조군(Con), DSS(Dextran Sulfate Sodium)를 통해 IBD 유도군(DSS), IBD가 유도 후 V. seminalis KGMB01456 균주 경구투여군(VS)의 장내 마이크로바이옴 사이의 상호관계를 문(Phylum)수준에서 분석하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 각 그룹간 장내 마이크로바이옴 종류의 상대적 풍부도를 확인하기 위해 Shannon과 Chao 1 지수를 이용하여 알파 다양성을 분석하였고, 그룹간 장내 마이크로바이옴의 복잡성 및 구조적 변화 차이를 확인하기 위해 비가중 UniFrac Principle Coordinate Analysis (PCoA)를 통해 베타 다양성을 분석하였다. 그 결과를 각각 도 15 및 16에 나타내었다. 추가적으로, 각 그룹과 마이크로바이옴 사이의 상호관계를 과(family) 수준에서 계층 열 지도 (hierachical heat map)를 도 17에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, IBD 유도군(DSS)에서 Proteobacteria문의 비율이 높아지고, Bacteroidetes문의 비율이 낮아진 것으로 나타났으며, 이는 IBD 환자의 장내 마이크로바이옴과 비슷한 양상이다. 이에 반해, 대조군(Con)과 V. seminalis 균주를 경구투여한 그룹은 Proteobacteria문의 비율이 낮고, Bacteroidetes문의 비율이 높게 나타났다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 대조군(Con)에 비하여 IBD 유도군(DSS)의 풍부도가 눈에 띄게 감소하였으나, V. seminalis 균주를 경구투여군(VS)의 종 풍부도는 회복되는 것을 확인하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군(Con)과 IBD 유도군(DSS)의 장내 마이크로바이옴 구성은 명확하게 차이가 나타났으며, V. seminalis 균주 경구투여군(VS)의 장내 마이크로바이옴 구성은 대조군(Con)과 가까운 경향을 나타냈다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 대조군(Con)과 V. seminalis 균주 경구투여군(VS)의 positive cluster (Akkermansiaceae, Muribaculaceae, Oscillospiraceae, Prevotellaceae)와 negative cluster (Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae)가 유사하고, 전체적으로 대조군(Con)과 V. seminalis 균주 경구투여군(VS) 사이에서 군집 분류가 유사하게 묶이며 IBD 유도군(DSS)과는 뚜렷한 차이를 보임을 확인했다.
또한, 정상인과 비교하여 IBD 환자 그룹에서 감소한다고 알려진 장내 미생물 속 Duncaniella spp., Kineothrix spp., Muribaculum spp.과 IBD 환자에서 증가하는 장내 미생물 속 Phocaeicola spp., Butyricimonas spp., Prabacteroides spp.에 대해 각 그룹간 상대적 종 풍부도를 확인하였고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 대조군(NC)과 V. seminalis 균주 경구투여군(VS)은 positive 속 그룹과 negative 속 그룹간 풍부도 차이가 정상인에서와 유사한 경향을 나타냈으며, IBD 유도군(DSS)은 IBD 환자와 비슷한 양상을 나타냄을 확인했다.
위 결과들을 미루어 볼 때, V. seminalis KGMB01456 균주의 투여가 IBD로 인한 장내 마이크로바이옴의 불균형을 예방 및 완화시키는 효과를 가진다고 확인하였다.
실험예 5. V.seminalis 배양 상층액의 활성물질 분석
5.1. V.seminalis 배양 상층액의 크로마토그래피 분석
V. seminalis KGMB01456 균주의 항염증 활성물질 규명을 위해, 균주의 배양 상층액을 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 통해 분석하였다. 대조군으로 균주를 배양하지 않은 RCM 배지(Reinforced Clostridial Medium)의 상층액을 사용하였다.
구체적으로, 그 결과, 단쇄지방산 (Short-chain fatty acid)의 일종인 프로피온산 (propionate) 표준물과 동일한 피크 (peak)를 갖는 것을 확인하였으며, 정량 결과 약 12mM로 확인하였다. 또한 프로피온산이 갖는 4.88 산성도 (pKa)보다 낮은 pH에선 물에 잘 용해되지 않는 특성을 이용하여 KGMB01456 균주 배양액을 각각 pH 6.8, 2.5로 맞춘 뒤 수층 분획물을 HPLC로 분석한 결과, 배양액과 pH 6.8의 수층에서만 프로피온산이 있음을 확인하였다(도 19).
5.2. V.seminalis 배양 상층액 활성물질 프로피온산의 항염증 활성 분석
V. seminalis KGMB01456 균주의 항염증 활성이 프로피온산에 의한 것인지 검증하기 위해, 베일로넬라 세미날리스 KGMB01456 균주의 총 유전체(Whole genome sequencing) 분석을 통해 프로피온산의 생합성 경로를 조사하였고(도 20), 프로피온산의 항염증 활성을 in vitro 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, 프로피온산의 항염증 활성 RAW264.7 세포에 V. seminalis KGMB01456 균주의 배양액과 그 배양액에 존재하는 동량의 프로피온산을 처리하여 항염증 활성 효과를 비교하였고, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, V. seminalis KGMB01456 균주의 유전체는 구연산회로(Citrate cycle)로부터 프로피온산 생합성에 필요한 단백질들을 암호화하는 유전자를 모두 가지고 있어 프로피온산 생성이 가능함을 확인하였다.
도 21에 나타낸 바와 같이, V. seminalis KGMB01456 균주 배양액의 항염증 효과는 동량의 프로피온산 단일 처리 그룹과 비슷한 수치의 항염증 활성을 가지는 것으로 확인하였다.
이상의 결과들을 통해, V. seminalis KGMB01456 균주가 생산한 프로피온산에 의해 숙주로 하여금 항염증 활성을 나타내며, 또한 장내 마이크로바이옴 항상성 유지를 통해 결과적으로 IBD를 예방할 수 있음을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC14932BP 20220405

Claims (15)

  1. 기탁번호 KCTC 14932BP로 기탁된, 베일로넬라 속(Veillonella sp.)에 속하는 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA를 포함하는 것인 균주.
  3. 청구항 1에서, 상기 균주는 자연적으로 일어난 베일로넬라 세미날리스 균주의 돌연변이를 포함하는 것인 균주.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 인간의 분변으로부터 분리된 것인 균주.
  5. 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주, 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주 유래의 파쇄액, 이의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 프로피온산을 포함하는 것인 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서, 장내 항염증 또는 장내 균총 개선 활성을 갖는 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 장내 항염증 활성은 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인 조성물;
    (a) 염증성 사이토카인의 발현량이 대조군 대비 30% 이상 감소
    (b) 아질산염의 발현량이 대조군 대비 30% 이상 감소
    (c) 장 투과성이 또는 장 움(crypt)의 탈락의 감소.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 장내 균총 개선 활성은 (d) 내지 (f)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인 조성물;
    (d) 염증성 장 질환이 유도된 마우스 대비, 장내 균총 내 프로테오박테리아(proteobacteria) 문의 비율의 감소
    (e) 염증성 장 질환이 유도된 마우스 대비, 장내 균총 내 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문의 비율 증가
    (f) 염증성 장 질환이 유도된 마우스에서 감소된 종 풍부도의 회복.
  10. 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주, 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주 유래의 파쇄액, 이의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 염증성 질환은 소화기계의 염증성 질환인 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD); 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome); 장염(enteritis); 크론병(Crohn’s disease); 베체트병(Behcet’s disease); 또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)인 것인 약학적 조성물.
  13. 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주, 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주 유래의 파쇄액, 이의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD); 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome); 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease); 베체트병(Behcet’s disease); 또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  15. 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주, 베일로넬라 세미날리스(Veillonella seminalis) 균주 유래의 파쇄액, 이의 배양액, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 장 건강의 개선을 위한 건강기능식품.
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Aujoulat F, Bouvet P, Jumas-Bilak E, Jean-Pierre H, Marchandin H. Int J Syst Evol Microbiol 64,3526-3531, doi: 10.1099/ijs.0.064451-0. (2014).

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