KR20230165808A

KR20230165808A - 스태필로코쿠스 아우레우스 백신 조성물

Info

Publication number: KR20230165808A
Application number: KR1020237037504A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 모로우; 세르게이 콘스탄티노브; 제로엔 게르첸; 진콴 루오; 산딥 소마니; 피터 티. 버클리; 빅터 제이. 토레스; 잔 테우니스 풀만
Original assignee: 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드; 뉴욕 유니버시티
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2023-12-05
Also published as: BR112023019605A2; TW202241496A; AU2022246874A1; EP4313303A1; JP2024512751A; CA3215751A1; AU2022246874A9; IL307178A; UY39714A; WO2022212667A1; MX2023011640A

Abstract

본 개시내용은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 감염의 치료 및/또는 예방을 위해 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본원에 개시된 면역원성 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 및 S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 A(LukA) 및/또는 류코시딘 B(LukB) 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시내용은 또한 개시된 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

스태필로코쿠스 아우레우스 백신 조성물

본 출원은 2021년 4월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/170,089호, 및 2021년 9월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/249,452호의 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

기술분야

본 개시내용은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 면역원성 조성물, 및 스태필로코쿠스 감염의 치료 및/또는 예방을 위해 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 기술된 조성물의 용도에 관한 것이다.

스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 덜 심각한 피부 및 연조직 감염과 함께, 패혈증, 감염성 심내막염 및 독성 쇼크를 포함한, 광범위한 침습성 질환을 야기한다 (Tong 등, “Staphylococcus aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Manifestations, and Management,” Clin. Microbiol. Rev. 28(3):603-661 (2015)). 현재로서는, S. 아우레우스(S. aureus)와 싸우도록 승인된 백신이 없으며, 항생제 내성의 등장으로 인해 치료 옵션이 더욱 제한되고 있다 (Sause 등, “Antibody-Based Biologics and Their Promise to Combat Staphylococcus aureus Infections,” Trends Pharmacol. Sci. 37(3):231-241 (2016)). 다양한 임상 증후군을 유발하는 S. 아우레우스(S. aureus)의 능력은 종종 게놈 내용물(content)의 주요 변화와 연관이 있다 (Copin 등, “After the Deluge: Mining Staphylococcus aureus Genomic Data for Clinical Associations and Host-Pathogen Interactions,” Curr. Opin. Microbiol. 41:43-50 (2018) 및 Recker 등, “Clonal Differences in Staphylococcus aureus Bacteraemia-Associated Mortality,” Nat. Microbiol. 2(10):1381-1388 (2017)). 특히, 게놈의 대략 40%가 모든 S. 아우레우스(S. aureus) 단리물에 의해 공유되지 않으며(Bosi 등, “Comparative Genome-Scale Modelling of Staphylococcus aureus Strains Identifies Strain-Specific Metabolic Capabilities Linked to Pathogenicity,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(26):E3801-3809 (2016)), 이에 의해 백신 및 생물학적 제제의 생성을 위한 보존된 표적의 식별을 더욱 복잡하게 만든다.

본 개시내용은 당 기술분야에서 이들 및 다른 한계를 극복하는 것에 관한 것이다.

본 개시내용의 제1 측면은 (i) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA, Staphylococcus aureus protein A) 폴리펩티드, 및 (ii) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 A(LukA, Leukocidin A) 변이체 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 대안적인 측면에서, 본 발명은 (i) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드, 및 (ii) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 A(LukA) 변이체 폴리펩티드를 함께 포함하는, 2개 이상의 조성물의 조합을 제공한다.

일 측면에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

본 개시내용의 추가 측면은 면역원성 조성물 또는 전술한 것들에 대한 하나 이상의 추가 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하는 2개 이상의 면역원성 조성물의 조합에 관한 것이다.

본 개시내용의 다른 측면은 (i) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드, (ii) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 A(LukA) 변이체 폴리펩티드, 및 (iii) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 류코시딘 B(LukB) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 함께 포함하는, 면역원성 조성물 또는 2개 이상의 면역원성 조성물의 조합에 관한 것이다.

본 개시내용의 추가 측면은 본원에 기술된 면역원성 조성물의 S. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체, LukA 변이체 폴리펩티드, 및 LukB 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물 또는 2개 이상의 면역원성 조성물의 조합에 관한 것이다.

본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기술된 면역원성 조성물의 S. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체, LukA 변이체 폴리펩티드, 및 LukB 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 또는 2개 이상의 면역원성 조성물의 조합에 관한 것이다.

본 개시내용의 다른 측면은 숙주 세포를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로서, 여기서 숙주 세포는 본원에 기술된 하나 이상의 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다.

본 개시내용의 다른 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 스태필로코쿠스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체에서 스태필로코쿠스감염을 치료 또는 예방하기에 효과적인 조건 하에서 본원에 기술된유효량의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시내용의 다른 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 상기 면역 반응을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 본원에 기술된 유효량의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 스태필로코쿠스 박테리아의 탈집락화 또는 집락화 또는 재집락화를 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체에서 스태필로코쿠스 박테리아의 탈집락화 또는 집락화 또는 재집락화를 예방하기에 효과적인 조건 하에서 본원에 기술된 유효량의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시내용의 다른 측면은 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 생성하는 방법에서 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합의 용도에 관한 것이다.

스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(S. 아우레우스(S. aureus))는 다수의 병원 및 지역사회 획득 감염에 대한 원인이 된다. 면역계에 의한 제거를 회피하기 위해, S. 아우레우스(S. aureus)는 광범위한 전략을 사용한다. 표면 단백질인 스태필로코쿠스 단백질 A(SpA)는 감염 촉진과 연관된 적어도 2개의 기능을 나타내는 S. 아우레우스(S. aureus)의 하나의 주요 독성 인자(virulence factor)이다. 먼저, 박테리아 표면 상의 세포 벽-고정 SpA는 IgG의 Fcγ-도메인에 결합하여 항체의 효과기 기능을 비활성화시킨다. 항체는 비특이적으로 “하방으로(upside down)” 결합되어 숙주 면역 세포에 의한 옵소닌식균 사멸(OPK, opsonophagocytic killing)로부터 스태필로코쿠스를 보호하고 적절한 제거를 방지한다. 두 번째로, SpA는 S. 아우레우스(S. aureus) 집락화 및 감염 동안 보호 면역의 발생을 방지하는 주요 면역 회피 결정인자로서 기능한다. 집락화 및 침습성 질환 동안, 방출된 SpA는 VH3 클론 B 세포 수용체를 가교결합시키고 스태필로코쿠스 결정인자를 항원으로서 인식할 수 없는 S. 아우레우스(S. aureus)에 특이적이지 않은 항체의 분비를 유발한다. 이러한 B 세포 초항원 활성(즉, 방출된 SpA의 VH3-결합 활성)은 집락화 또는 침습성 질환 동안 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 보호 면역의 발생을 예방할 책임이 있다. 면역 글로불린 결합 활성을 상실한 백신 항원으로서 SpA 변이체를 사용하면, (1) Fcγ를 통해 IgG에 결합하는 능력을 중화시키고, (2) VH3-이디오타입(idiotype) 중쇄를 통해 IgG에 결합하는 능력을 중화시키고, 항-스태필로코쿠스 면역이 발생할 수 있게 하고, (3) 표면 결합된 SpA를 통해 옵소닌식균작용 제거를 유도하는 SpA 특이적 항체를 유도한다.

스태필로코쿠스 류코시딘 A 및 B는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 촉진하는 데 있어서 상이한 작용 방식을 갖는 이성분 독소(LukAB)를 형성한다. LukAB는 식균작용 세포에 결합 시, 기공 내로 조립되고, 막 내로 삽입되고, 숙주 세포를 용해시키는 분비된 독소이다. 이는 S. 아우레우스(S. aureus)가 호중구로부터 공격을 탈출하고 숙주에 의한 제거를 탈출할 수 있게 한다. LukA, LukB, 또는 LukAB 톡소이드로 면역화함으로써 유도된 항체는 LukAB 독소 활성을 중화시켜 S. 아우레우스(S. aureus)를 제거할 수 있는 살아있는 식균작용 세포를 생성할 것이다.

이들 항원, 즉, SpA, LukA, LukB, 및 LukAB의 조합을 포함하는 면역원성 조성물은 2개의 S. 아우레우스(S. aureus) 독성 인자를 중화시키고 S. 아우레우스(S. aureus)의 2개의 독립적인 주요 탈출 메커니즘을 방지하여 항체 매개 옵소닌식균작용이 효과적일 수 있게 하는 항체를 유도할 것이다.

도 1a 내지 도 1c는 클론 복합체(CC) 8 (서열번호 1); CC45 (서열번호 2); CC30의 HMPREF0772_044(TCH60) (서열번호 27); CC30의 SAR2108(MRSA252) (서열번호 36); CC45의 SALG_02329(A9635) (서열번호 34); CC398의 SAPIG2061(ST398) (서열번호 35); CC10의 SATG_01930(D139) (서열번호 37); CC8의 NEWMAN (서열번호 26); CC151의 SAB1876C(RF122) (서열번호 32); CC5의 SAV2005(Mu50) (서열번호 38); CC5의 SA1813(N315) (서열번호 31); CC8의 SACOL2006 (서열번호 33); CC7의 HMPRE0776_0173 USA300(TCH959) (서열번호 29); CC72의 HMPREF0774_2356 TCH130 (서열번호 28); 및 CC1의 MW1942(MW2) (서열번호 30)의 LukA를 포함하는 15개의 상이한 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) LukA 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 서열의 비교로부터 생성된 대부분의 LukA 서열의 아미노산 서열은 서열번호 25로서 제공된다. 본원에 기술된 아미노산 치환의 위치 또한 각각의 LukA 서열 내에서 확인된다.
도 2a 내지 도 2c는 LukB CC8(서열번호 15); CC45 (서열번호 16); CC45의 A9635 (서열번호 40); CC30의 E1410 (서열번호 43); CC30의 MRSA252 (서열번호 45); CC10의 D139 (서열번호 42); CC5의 Mu.50 (서열번호 46); CC239의 JKD6008 (서열번호 44); CC8의 COL (서열번호 41); CC8의 USA300_FPR3757 (서열번호 115); CC8의 NEWMAN (서열번호 116); CC151의 RF122 (서열번호 98); CC1의 MW2 (서열번호 47); 및 CC72의 TCH130 (서열번호 99)을 포함하는 14개의 상이한 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) LukB 아미노산 서열의 정렬이다. 정렬된 서열의 비교로부터 생성된 대부분의 LukB 서열의 아미노산 서열은 서열번호 39로서 제공된다. 본원에 기술된 아미노산 치환의 위치 또한 각각의 LukB 서열 내에서 확인된다.
도 3은 면역화에 사용된 상이한 LukAB 변이체의 세포독성을 보여준다. 상이한 LukAB 변이체의 적정으로 일차 인간 다형핵 백혈구(“PMN, polymorphonuclear leukocytes” (n=4)의 중독을 1시간 동안 수행하였다. 세포 생존력을 CellTiter로 평가하였다. 데이터는 2개의 별도 실험에서 수득된, 4명의 공여자로부터의 평균 ± SEM이다.
도 4a 내지 도 4b는 상이한 LukAB 변이체로 면역화된 마우스에서 LukAB CC8 또는 CC45에 대한 항체 역가를 보여준다. Envigo Hsd:ND4(4주령) 마우스(n=5/항원)에게 50 μl의 애쥬번트, TiterMax® Gold와 혼합된 50 μl의 10% 글리세롤 1X TBS 중 20 μg의 LukAB를 피하 투여하였다. 5마리 마우스의 코호트도 동일한 부피의 10% 글리세롤 1X TBS 및 TiterMax® Gold로 이루어진 모의 면역화를 받았다. 동일한 항원 애쥬번트 칵테일의 2회 추가 투여(2주 간격 추가 투여) 후, 마우스를 심장 천자를 통해 채혈하고 혈청을 수득하였다. 표시된 면역화 항원으로 면역화된 마우스로부터의 혈청을 풀링하고 연속 희석하여 CC8 LukAB(도 4a) 또는 CC45 LukAB(도 4b)에 대한 항체 역가를 결정하였다. 플레이트를 2 μg/ml의 CC8 또는 CC45 LukAB로 코팅하였다. 히트맵은 중복 측정으로부터의 평균 흡광도 값을 나타낸다.
도 5는 다양한 LukAB 독소에 대해 상이한 LukAB 변이체로 면역화된 마우스 유래의 혈청에 대한 중화 프로파일을 제공한다. 표시된 항원으로 면역화된 마우스로부터의 4-0.031% 혈청의 존재 하에 표시된 LukAB 변이체(LD90) 0.156 μg/ml로 1시간 동안 인간 PMN(n=4)의 중독. 표시된 면역 항원으로 면역화된 마우스 유래의 혈청을 풀링하고 사용 전에 열 불활성화시켰다. CellTiter로 세포 생존력을 결정하였다. 히트맵은 4명의 공여자의 사멸 세포의 평균 백분율을 나타내며, 흑색은 세포 사멸이 없음을 나타내고, 백색 100% 세포 사멸을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 표시된 항원으로 면역화된 마우스 유래의 2%(도 6a), 1%(도 6b), 및 0.5%(도 6c) 마우스 혈청의 부재 또는 존재 시, LukAB 독소 서열 변이체의 LD₉₀으로의 중독 후 사멸된 인간 다형핵 백혈구의 백분율을 보여주는 표이다. 데이터는 사멸된 세포의 백분율로서 제시된다. 음영이 없는 세포는 가장 낮은 세포 사멸을 나타내고, 가장 어두운 회색 음영이 있는 세포는 가장 높은 세포 사멸을 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 고농도에서 LukAB RARPR-33의 중독이 세포독성이 아님을 보여준다. 건강한 공여자(n=4-6)로부터 새로 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 CellTiter의 흡광도에 의해 결정하였다(도 7a 및 도 7b). 사멸 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 사멸 상태로 설정된 Triton X100으로 처리된 세포로 정규화함으로써 계산하였다. 평균 ± SEM이 표시되어 있다. 건강한 공여자(n=4-6)로부터 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 LDH 방출에 의해 결정하였다. (도 7c 및 7d). 평균 ± SEM이 표시되어 있다.
도 8a 내지 8d는 고농도에서 LukAB RARPR-33 및 D39A/R23E 톡소이드의 중독을 보여준다. 건강한 공여자(n=5)로부터 새로 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 CellTiter의 흡광도에 의해 결정하였다(도 8a 및 8b). 사멸 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 사멸 상태로 설정된 Triton X100으로 처리된 세포로 정규화함으로써 계산하였다. 평균 ± SEM이 표시되어 있다. 건강한 공여자(n=5)로부터 분리된 인간 PMN을 상이한 농도의 LukAB 변이체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 세포 생존력은 LDH 방출에 의해 결정하였다 (도 8c 및 8d). 평균 ± SEM이 표시되어 있다.
도 9는 다양한 LukAB 독소에 대해 2개의 상이한 LukAB 톡소이드로 면역화된 마우스 유래의 혈청의 중화 프로파일을 보여준다. 2개의 상이한 항원으로 면역화된 마우스의 0.125% 혈청의 존재 하에 표시된 LukAB 독소 변이체(LD₉₀) 0.156 μg/ml로 1시간 동안 인간 PMN(n=4)의 중독. 표시된 면역 항원 모두로 면역화된 마우스 유래의 혈청을 풀링하고 사용 전에 열 불활성화시켰다. CellTiter로 세포 생존력을 결정하였다. 막대 그래프는 4개의 상이한 공여자의 평균 + SEM을 보여준다. 통계적 유의성은 비대응 t 검정을 사용하여 결정하였고, P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다. *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0001.
도 10은 수컷 괴팅겐 미니피그(Gttingen Minipig)에 대한 면역화 일정의 개략도이다. 괴팅겐(Gttingen) 미니피그를 3주 간격으로 3번에 걸쳐 근육내 면역화하였다. 최종 면역화 후 3주차에, 미니피그에게 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 8일 후, 박테리아 부담을 결정하였다. 도 14b의 표는 시험한 실험군의 개요를 제공한다.
도 11a 내지 도 11b는 미니피그의 SSI 모델에서 LukAB RARPR-33 및 Spa* +/- GLA-SE의 효능을 보여준다. 미니피그를 3주 간격으로 3번에 걸쳐 근육내 면역화하였다. 최종 면역화 후 3주차에, 미니피그에게 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 8일 후, 박테리아 부담을 결정하였다. 중간 근육에서의 박테리아 부하(도 15a) 및 심부 근육(도 15b)는 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종한 후 8일차에 도시되어 있다. 각 점은 1마리의 미니피그를 나타내고, 기하 평균이 표시되어 있다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. 통계적 유의성은 다중 비교를 보정하기 위해 Dunnett 사후 검정을 이용한 ANOVA를 사용하여 결정하였다, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 12는 수컷 괴팅겐 미니피그에 대한 면역화 일정의 개략도이다. 미니피그는 3주 간격으로 3회의 근육내 면역화를 받았다. 세 번째 면역화 후 3주차에, 동물에게 수술 부위 감염 모델에서 10⁶ CFU S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 접종 후 8일차(71일차)에 수술 부위 및 비장에서 박테리아 부담을 결정하였다. 여러 시점에 혈액을 채취하고 혈청을 수집하였다. 표는 3개의 실험군의 세부 사항을 보여준다.
도 13a 내지 도 13c는 LukAB RARPR-33 및 SpA*의 면역원성을 보여주는 그래프이다. 괴팅겐 미니피그(n=3)를 AS01b (25 μg MPL 및 25 μg QS-21) 또는 10 μg GLA-SE와 조합된 100 μg LukAB RARPR-33 + 100 μg SpA*로 면역화하였다. 대조군은 항원 제형화 완충액을 받았다. 혈청을 각 면역화 전 및 3차 면역화 후 3주차에 수집하였다. LukAB CC8(도 13a), LukAB CC45(도 13b) 또는 SpA*(도 13c)에 대한 특이성을 ELISA에 의해 결정하였다. EC₅₀ 역가가 도시되어 있다. 각 점은 단일 동물을 나타낸다. 각 군의 기하 평균 ± 기하 표준편차가 도시되어 있다. 점선은 검출 한계를 나타내며 30으로 설정된다. 이 값 미만의 샘플은 30으로 검열된다. 다중 비교를 보정하기 위해 Bonferroni 보정이 있는 일원 Tobit 모델을 사용하여, 완충 대조군에 대해 AS01b 또는 GLA-SE와 조합된 LukAB RARPR-33 + SpA*로 면역화된 동물 사이에서 3회 면역화한 후, 통계적 유의성을 결정하였다, **P<0.01, ***P<0.001, ****<0.0001.
도 14a 내지 도 14d는 백신 유도된 항체에 의한 LukAB의 교차 중화를 보여준다. 괴팅겐 미니피그(n=3)를 AS01b (25 μg MPL 및 25 μg QS-21) 또는 10 μg GLA-SE와 조합된 100 μg LukAB RARPR-33 + 100 μg SpA*로 면역화하였다. 대조군은 항원 제형화 완충액을 받았다. 혈청을 각 면역화 전 및 3차 면역화 후 3주차에 수집하였다. THP-1 세포를 면역화 전 및 면역화 후 미니피그 유래의 연속적으로 희석된 혈청의 존재 하에 LukAB 독소의 상이한 서열 변이체(CC8 (도 14a), CC45 (도 14b), CC22a (도 14c), CC398 (도 14d))와 함께 인큐베이션하였다. 혈청 샘플과 기준 LukAB 단클론 항체 간의 IC₅₀ 역가(50%의 세포독성이 관찰된 혈청 희석물)의 차이를 나타내는 상대 역가가 도시되어 있다. 그래프는 기하 평균 ± 기하 표준편차를 보여준다. 각 점은 1마리의 동물을 나타낸다. AS01b 또는 GLA-SE와 조합된 LukAB RARPR-33 + SpA*로 3회 면역화한 후 동물로부터 유래된 샘플에 대해 통계적 유의성을 결정하고 완충액 대조군과 비교하였다. 다중 비교를 보정하기 위해 Dunnett 사후 검정을 이용한 일원 ANOVA를 사용하였다, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 15a 내지 도 15c는 상이한 애쥬번트와 조합되고 S. 아우레우스(S. aureus)로 접종된 LukAB RARPR-33 + SpA*로 면역화된 동물에서 수술 부위 및 비장에서의 면역 반응의 효능을 보여준다. 괴팅겐 미니피그(n=3)를 100 μg LukAB RARPR-33 및 100 μg SpA*로 면역화하고, AS01b(25 μg MPL 및 25 μg QS-21) 또는 10 μg의 GLA-SE로 보강하였다. 대조군은 완충액만을 받았다. 3차 면역화 후 3주차에, 동물에게 SSI 모델에서 10⁶ CFU S. 아우레우스(S. aureus) CC398을 접종하였다. 접종 후 8일차에, 박테리아 부담(Log10 CFU/조직의 그램)을 수술 부위에서 중간 근육(도 15a), 심부 근육(도 15b), 및 비장(도 15c)에서 결정하였다. 각 점은 단일 동물을 나타낸다. 각 군의 기하 평균이 표시되어 있다. 통계적 유의성은 다중 비교를 보정하기 위해 Dunnett 사후 검정을 이용한 ANOVA를 사용하여 결정하였다, *P <0.05, **P <0.01.
도 16a는 수컷 괴팅겐 미니피그에 대한 면역화 일정의 개략도이다. 괴팅겐 미니피그를 3주 간격으로 3번에 걸쳐 근육내 면역화하였다. 최종 면역화 후 3주차에, 미니피그에게 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 8일 후, 박테리아 부담을 결정하였다. 도 16b의 표는 시험한 실험군의 개요를 제공한다.
도 16c 내지 도 16d는 미니피그의 SSI 모델에서 LukAB RARPR-33 및 Spa*의 효능을 보여준다. 미니피그를 3주 간격으로 3번에 걸쳐 근육내 면역화하였다. 최종 면역화 후 3주차에, 미니피그에게 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 8일 후, 박테리아 부담을 결정하였다. 중간 근육(도 16c) 및 심부 근육(도 16d)에서의 박테리아 부하는 S. 아우레우스(S. aureus)를 사용한 접종 후 8일차에 도시되어 있다. 각 점은 1마리의 미니피그를 나타내고, 기하 평균이 표시되어 있다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. 통계적 유의성은 다중 비교를 보정하기 위해 Dunnett 사후 검정을 이용한 ANOVA를 사용하여 결정하였다, *P <0.05.
도 17a는 수컷 괴팅겐 미니피그에 대한 면역화 일정의 개략도이다. 괴팅겐(Gttingen) 미니피그를 3주 간격으로 3번에 걸쳐 근육내 면역화하였다. 최종 면역화 후 3주차에, 미니피그에게 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 8일 후, 박테리아 부담을 결정하였다. 도 17b의 표는 시험한 실험군의 개요를 제공한다.
도 17c 내지 도 17d는 미니피그의 SSI 모델에서 LukAB RARPR-33 및 SpA*의 효능을 보여준다. 미니피그를 3주 간격으로 3번에 걸쳐 근육내 면역화하였다. 최종 면역화 후 3주차에, 미니피그에게 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 8일 후, 박테리아 부담을 결정하였다. 중간 근육(도 17c) 및 심부 근육(도 17d)에서의 박테리아 부하는 S. 아우레우스(S. aureus)를 사용한 접종 후 8일차에 도시되어 있다. 각 점은 1마리의 미니피그를 나타내고, 기하 평균이 표시되어 있다. 점선은 검출 한계를 나타낸다. 통계적 유의성은 다중 비교를 보정하기 위해 Dunnett 사후 검정을 이용한 ANOVA를 사용하여 결정하였다, **P<0.01, ****P<0.0001.
도 18a 내지 도 18e는 상이한 애쥬번트와 조합된 LukAB RARPR-33 및 SpA*의 면역원성을 보여준다. 실험적 셋업이 도 18a에 도시되어 있으며, 여기서 Swiss Webster 마우스를 2주 간격으로 3회에 걸쳐 별도로 피하 면역화한 다음, 표시된 시점에 혈액을 채취하였다. 도 18Bb는 포함된 군의 개요이다. LukAB CC8(도 18c), LukAB CC45(도 18d) 또는 SpA*(도 18e)에 대한 항체 특이성을 ELISA에 의해 결정하였다. EC₅₀ 역가가 도시되어 있다. 각 점은 단일 동물을 나타낸다. 각 군의 기하 평균 ± 기하 표준편차가 도시되어 있다. 점선은 검출 한계를 나타내며 30으로 설정된다. 이 값 미만의 샘플은 30으로 검열된다.
도 19a 및 도 19b는 LukAB CC8 및 CC45 독소 중화 검정의 결과를 각각 보여주며, 이는 최종 면역화 후 2주차에 단리한, 1-5군(도 18b에 열거되어 있음) 유래의, 5마리 마우스 유래의 혈청 샘플로 수행하였다. 혈청 샘플과 기준 LukAB 단클론 항체 간의 IC₅₀ 역가(50%의 세포독성이 관찰된 혈청 희석물)의 차이를 나타내는 상대 역가가 도시되어 있다. 그래프는 기하 평균 ± 기하 표준편차를 보여준다. 각 점은 1마리의 동물을 나타낸다.

정의

본 조성물 및 방법을 설명하기 전에, 본 발명이 설명된 특정 조성물 또는 방법론에 한정되지 않는 것으로 이해해야 하는데, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 설명에 사용된 용어는 단지 특정 버전 또는 실시예를 설명하기 위한 목적을 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본원의 실시예의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본원의 실시예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 이제 설명하기로 한다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 전체가 참조로서 통합된다. 본원에서의 어느 것도 본원의 실시예가 종래 발명으로 인해 이러한 개시를 앞질러야 할 권리가 없다고 인정하는 것으로 해석되어선 안된다.

본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a," "an," 및 "the")는 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것을 주목해야 한다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에 기술된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 “약”에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 일반적으로 인용된 값의 ± 10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10%(w/v)의 농도 범위는 0.9%(w/v) 내지 11%(w/v)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위를 명시적으로 포함하며, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 이러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 포함하여, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값을 포함한다.

달리 명시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에 있는 용어 “적어도”는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당 분야의 숙련자는, 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시예에 대한 많은 균등물을, 통상적인 실험 정도로 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되도록 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “포함하다(comprises)”, “포함하는(comprising)”, “포함한다(includes)”, “포함하는(including)”, "가진다(has)", “갖는(having)”, “함유한다(contains)” 또는 “함유하는(containing)”, 또는 이들의 임의의 다른 변형은, 언급된 정수 또는 정수들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군을 배제하지 않고 비-배타적이거나 개방적인 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 이들 요소에만 한정되지는 않지만, 이러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 명시적으로 열거되거나 내재되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 또한, 반대로 명시적으로 언급되지 않는 한, “또는”은 포괄적인 또는을 지칭하며 배타적인 또는을 지칭하지 않는다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 다음 중 어느 하나에 의해 충족된다: A는 참(또는 존재)이고 B는 거짓(또는 존재하지 않음)이고, A는 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B는 참(또는 존재)이고, A 및 B 모두가 참(또는 존재)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 인용된 요소 사이의 접속어 “및/또는”은 개별 및 조합된 옵션 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소가 “및/또는”에 의해 결합되는 경우, 첫 번째 옵션은 제2 요소가 없는 제1 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 두 번째 옵션은 제1 요소가 없는 제2 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 세 번째 옵션은 제1 및 제2 요소의 적용 가능성을 함께 지칭한다. 이들 옵션 중 어느 하나가 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 둘 이상의 옵션의 동시 적용 가능성 또한 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 용어 “및/또는”의 요건을 충족시킨다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는, 용어 "~으로 이루어진다", 또는 "~으로 이루어진다" 또는 "~으로 이루어지는"과 같은 변형은, 임의의 인용된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 특정 방법, 구조 또는 조성물에 추가 정수 또는 정수의 군을 추가할 수 없음을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는, 용어 “필수적으로 ~으로 이루어진다”, 또는 “필수적으로 ~으로 이루어진다” “필수적으로 ~으로 이루어지는”과 같은 변형은 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 포함하는 것과, 특정 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 선택적으로 포함하는 것을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “대상체”는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 “포유동물”은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간 등, 보다 바람직하게는 인간을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

바람직한 본 발명의 구성요소의 치수 또는 특징을 지칭할 때 본원에서 사용되는, 용어 “약”, “대략”, "대체로", “실질적으로” 및 유사한 용어는 설명된 치수/특징이 엄격한 경계 또는 파라미터가 아니며, 당 분야의 숙련자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 기능적으로 동일하거나 유사한 작은 변형을 배제하지 않음을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 최소한, 수치 파라미터를 포함하는 이러한 참조는 당 기술분야에서 용인되는 수학적 및 산업적 원리(예를 들어, 반올림, 측정 또는 기타 체계적인 오차, 제조 허용 오차 등)를 사용하는 변형을 포함할 것이고, 이는 최소한의 유효 숫자를 변화시키지 않을 것이다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 스태필로코쿠스(Staphylococcus) LukA, LukB, SpA 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 맥락에서, 용어 “동일한” 또는 “동일성” 백분율은, 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 육안 검사에 의해 측정될 때, 최대한의 대응을 위해 비교하고 정렬할 때, 동일한 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다.

서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열이 기준 서열로서 작용하며, 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 그런 다음, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 기준 서열에 대한 시험 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국부 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사도 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., 위스콘신 메디슨), 또는 육안 검사(일반적으로, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등, eds., Current Protocols, (1995 Supplement) 참조)에 의해 수행 가능하다.

서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 예는 Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 및 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402 각각에서 설명되는, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다.

서열 동일성 백분율을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 척도는 최소 합 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산 대 기준 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가의 표시는, 후술하는 바와 같이, 제1 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어, 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 제2 폴리펩티드와 일반적으로 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 2개의 분자가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화된다는 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “폴리뉴클레오티드”는 “핵산 분자”, “뉴클레오티드” 또는 “핵산”으로 동의어로 지칭되며, 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. “폴리뉴클레오티드”는, 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일-가닥 및 이중-가닥 RNA, 및 단일-가닥 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 보다 통상적으로는, 이중-가닥 또는 단일-가닥 영역과 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한, “폴리뉴클레오티드”는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다. “변형된” 염기는, 예를 들어, 트리틸화된(tritylated) 염기 및 이노신과 같은 비정상적인(unusual) 염기를 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있다; 따라서, “폴리뉴클레오티드”는 자연에서 일반적으로 발견되는 바와 같이, 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드를 비롯하여, 바이러스 및 세포의 특징적인 화학적 형태의 DNA 및 RNA를 포괄한다. “폴리뉴클레오티드”는 또한 흔히 올리고뉴클레오티드로 지칭되는, 비교적 짧은 핵산 사슬을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “벡터”는, 예를 들어, 유전적 환경 간의 수송을 위해 또는 숙주 세포에서의 발현을 위해, 원하는 서열이 삽입될 수 있는, 예를 들어, 제한 및 결찰일 수 있는, 임의의 수의 핵산을 지칭한다. 핵산 벡터는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지, 파지미드, 박테리아 게놈, 바이러스 게놈, 자가-증폭 RNA, 레플리콘을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “숙주 세포”는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포를 지칭한다. “숙주 세포”는 임의의 유형의 세포, 예를 들어 일차 세포, 배양 중인 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 일 실시예에서, “숙주 세포”는 본 발명의 핵산 분자로 형질감염되거나 형질도입된 세포이다. 또 다른 실시예에서, “숙주 세포”는 이러한 형질감염되거나 형질도입된 세포의 후손 또는 잠재적 후손이다. 세포의 후손은, 예를 들어, 후속 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 핵산 분자의 숙주 세포 게놈 내로의 통합으로 인해, 부모 세포와 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 “발현”은 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 이 용어는 RNA로의 유전자의 전사를 포함한다. 이 용어는 또한 RNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함하며, 또한 모든 자연 발생 전사-후 및 번역-후 변형을 포함한다. 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 세포질 내에, 세포 배양물의 성장 배지와 같은 세포 외 환경 내로 또는 세포막에 고정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “펩티드”, “폴리펩티드”, 또는 “단백질”은 아미노산으로 구성된 분자를 지칭할 수 있고 당 분야의 숙련자에 의해 단백질로서 인식될 수 있다. 아미노산 잔기에 대한 종래의 1글자 또는 3글자 코드가 본원에서 사용된다. 용어 “펩티드”, “폴리펩티드”, 및 “단백질”은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이러한 용어는 또한 자연적으로 또는 개재에 의해 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당질화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은, 임의의 다른 조작 또는 변형을 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)를 함유하는 폴리펩티드뿐만 아니라 당 분야에 공지된 다른 변형도 본 정의 내에 포함된다.

본원에 기술된 폴리펩티드 서열은 펩티드의 N-말단 영역이 좌측에 있고 C-말단 영역이 우측에 있는 통상적인 관례에 따라 작성된다. 아미노산의 이성질체 형태가 알려져 있지만, 달리 명시적으로 명시되지 않는 한, 표시되는 아미노산의 L-형태이다.

용어 “단리된”은 실질적으로 그의 기원 소스의 세포 물질, 박테리아 물질, 바이러스 물질, 또는 (재조합 DNA 기술에 의해 생산된 경우) 배양 배지, 또는 (화학적으로 합성된 경우) 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 또한, 단리된 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드로서 대상체에게 투여될 수 있는 것을 지칭하며; 즉, 폴리펩티드가 컬럼에 부착되거나 겔에 매립되는 경우, 폴리펩티드는 단순히 “단리된” 것으로 간주되지 않을 수 있다. 또한, “단리된 핵산 단편” 또는 “단리된 펩티드”는 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고/않거나 전형적으로 기능적인 상태로 되지 않은 핵산 또는 단백질 단편이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “면역 반응” 또는 이와 균등한 “면역학적 반응”이라는 구절은 수용자 대상체에서 본 개시내용의 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 폴리펩티드에 대해 유도된 체액성(항체 매개), 세포성(항원-특이적 T 세포 또는 이의 분비 산물에 의해 매개) 또는 체액성 및 세포성 반응 모두의 발생을 지칭한다. 이러한 반응은 면역원의 투여에 의해 유도된 능동 반응 또는 항체, 항체 함유 물질, 또는 프라이밍된 T 세포의 투여에 의해 유도된 수동 반응일 수 있다. 세포성 면역 반응은, 항원-특이적 CD4 (+) T 헬퍼 세포 및/또는 CD8 (+) 세포독성 T 세포를 활성화시키기 위해, 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 관련된 폴리펩티드 에피토프의 제시에 의해 유도된다. 반응은 또한 단핵구, 대식세포, NK 세포, 호염기구, 수지상 세포, 성상 세포, 소교세포, 호산구, 또는 선천 면역의 다른 성분의 활성화를 수반할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “능동 면역(active immunity)”은 항원의 투여에 의해 대상체에게 부여된 임의의 면역을 지칭한다.

본 개시내용은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 면역 반응을 유도하기에 적합한 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본원에 기술된 바와 같이, 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 및 S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 A(LukA) 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 B(LukB) 폴리펩티드 또는 이의 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus) SpA 단백질 및 S. 아우레우스(S. aureus) LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시내용은 또한 S. 아우레우스(S. aureus) 감염의 치료 및/또는 예방에서 면역원성 조성물을 사용하는 용도 및 방법에 관한 것이다.

따라서, 일반적인 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드, 및

(ii) S. 아우레우스(S. aureus) LukA 변이체 폴리펩티드로서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

특정 실시예에서, 조성물은 (iii) S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 B(LukB) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 조성물은 (iv) 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함한다.

조성물의 성분 (i), (ii), (iii) 및 (iv)는 단일 생성물로서, 즉 단일 조성물로서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 성분 (i), (ii), (iii) 및 (iv)는 각각 단일 조성물로 또는 2개 이상의 성분의 조합을 함께 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 2개 이상의 조성물의 조합을 제공하며, 상기 2개 이상의 조성물은 다음을 포함한다:

특정 실시예에서, 2개 이상의 조성물의 조합은 (iii) S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 B(LukB) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 2개 이상의 조성물의 조합은 (iv) 애쥬번트를 추가로 포함한다.

특정 실시예에서, 조성물들의 조합은 사용 전에 단일 조성물로 조합될 수 있다. 다른 실시예에서, 조성물의 조합은 서로 조합하여 투여될 별도의 조성물로서 사용된다.

면역원성 조성물의 S. 아우레우스( S. aureus ) 류코시딘 A(LukA) 폴리펩티드

일 측면에서, 본 개시내용의 면역원성 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus) LukA 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 적절한 LukA 변이체 폴리펩티드는 이러한 LukA 변이체를 함유하는 LukAB 이성분 복합체를 비-세포독성으로 만드는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 치환, 및/또는 결실을 포함한다. LukA 변이체 폴리펩티드는 또한 LukAB 이종이량체를 안정화시키고, 용융 온도를 증가시키고/시키거나 이종이량체의 가용성을 증가시킨다.

모든 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 전장 성숙 LukA 단백질 서열에 대응하는 모든 아미노산 잔기를 포함하는 전장 LukA 단백질의 변이체일 수 있다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, “성숙한” 류코시딘 단백질 서열은, 일반적으로 아미노 말단 상의 첫 27-28개 아미노산 잔기를 포함하는, 아미노 말단 분비 신호가 결여된 류코시딘 단백질의 서열이다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 전장 성숙 LukA 단백질 미만의 변이체일 수 있다. 임의의 실시예에서, 변이체 LukA 폴리펩티드는 적어도 100개 아미노산 잔기 길이이다. 임의의 실시예에서, 변이체 LukA 폴리펩티드는 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개, 적어도 170개, 적어도 180개, 적어도 190개, 적어도 200개, 적어도 210개, 적어도 220개, 적어도 230개, 적어도 240개, 적어도 250개, 적어도 260개, 적어도 270개, 적어도 280개, 적어도 290개, 적어도 300개 아미노산 잔기 길이이다.

본원에 기술된 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 단백질 및 폴리펩티드는 클론 복합체 CC8(서열번호 1) 및 CC45(서열번호 2)(하기 표 1 참조)의 변이체 LukA 단백질이지만, 당 분야의 숙련자라면 서열번호 1 및 서열번호 2의 맥락에서 식별된 LukA의 아미노산 치환 및/또는 결실이 다양한 클론 복합체에 걸쳐 보존되거나, 다양한 클론 복합체에 걸쳐 고도로 보존되는 LukA의 영역 내에 있는 아미노산 잔기임을 쉽게 알 것이다. 실제로, S. 아우레우스(S. aureus)의 15개의 상이한 균주로부터의 LukA 단백질 서열의 정렬(도 1a~c 참조)은 변이의 대상이 되는 잔기로서 본원에서 식별된 아미노산 잔기가 정렬된 LukA 아미노산 서열의 15개 모두에 걸쳐 보존되는 잔기임을 보여준다. 식별된 변이 잔기의 위치는 개별 LukA 서열 간에 상이할 수 있지만, 서열 정렬은 이들 위치 간의 대응관계를 보여준다. 명확성을 위해, 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 LukA 공통 서열을, 서열 정렬로부터 생성하고, 특정 아미노산 변이체의 위치를 할당하기 위한 목적으로 사용하였다. 예를 들어, 서열번호 25 내의 리신 잔기 83에서의 아미노산 치환은 서열번호 1의 LukA 서열에서의 위치 80에서의 리신 잔기, 서열번호 2의 LukA 서열에서의 위치 81에서의 리신 잔기, 및 서열번호 26-38의 LukA 서열에서의 위치 83에서의 리신 잔기에 대응한다. 따라서, 본원에 기술된 식별된 아미노산 변이는 현재 또는 미래에 알려진 임의의 LukA 아미노산 서열의 대응하는 아미노산 잔기에 보편적으로 적용될 수 있다.

본 개시내용의 본 측면에 따르면, 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193 잔기에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전술한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 치환 및/또는 결실에 추가하여 서열번호 25의 Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, Glu323에서의 아미노산 치환 또는 결실은 서열번호 25의 위치 323(Glu323Ala)에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함한다.

임의의 실시예에서, LukA (및 본원에 기술된 S. 아우레우스(S. aureus) 단백질)의 하나 이상의 식별된 위치에서의 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 이러한 보존적 치환은 동일한 부류의 구성원인 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 수반하며, 이는 기능적 등가물로서 작용하여, 침묵 변경을 초래한다. 즉, 본래의 서열에 대한 변화는 LukA의 기본 특성을 눈에 띄게 감소시키지 않을 것이다. 이들 부류의 아미노산 잔기는 비극성(소수성) 아미노산(예를 들어, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌); 극성 중성 아미노산(예를 들어, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민); 양으로 하전된 (염기성) 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 리신 및 히스티딘; 및 음으로 하전된 (산성) 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산)을 포함한다.

다른 실시예에서, 본원에 기술된 변이체 류코시딘 또는 SpA 폴리펩티드의 하나 이상의 식별된 위치에서의 아미노산 치환은 비보존적 변경(즉, 식별된 영역의 서열, 구조, 기능 또는 활성을 파괴하는 치환)이다. 이러한 치환은 단백질의 세포독성을 감소시키거나 완화시키기 위한 목적으로 바람직할 수 있다. 비보존적 치환은 하나의 특정 부류의 아미노산 잔기를 상이한 부류의 아미노산 잔기로 치환하는 것을 수반한다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산 잔기를 극성 중성 아미노산으로 치환하거나 그 반대. 또 다른 실시예에서, 비보존적 치환은 양으로 하전된 (염기성) 아미노산 잔기를 음으로 하전된 (산성) 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산으로 치환하는 것, 또는 그 반대를 수반한다. 이러한 분자 변경은 단일 가닥 템플릿(Kunkel 등의 Proc. Acad. Sci., USA 82:488-492 (1985), 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 이중 가닥 DNA 템플릿(Papworth, 등의 Strategies 9(3):3-4 (1996), 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)을 사용하는 플라스미드 템플릿 상의 프라이머 연장을 포함하여, 당 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해, 그리고 PCR 클로닝(Braman, J. (ed.), 시험관 내 MUTAGENESIS PROTOCOLS, 2nd ed. Humana Press, Totowa, N.J. (2002), 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 의해 달성될 수 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 83에서 리신에 대응하는 잔기에서 리신에서 메티오닌으로의 치환(Lys83Met)을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 141에서 세린에 대응하는 잔기에서 세린에서 알라닌으로의 치환(Ser141Ala)을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 113에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환(Val113Ile)을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 위치 193에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환(Val193Ile)을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 잔기에서의 치환 중 어느 하나 이상에 추가하여, 서열번호 25의 글루탐산 잔기 위치 323에 대응하는 잔기에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환(Glu323Ala)을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 전술한 아미노산 잔기 중 2개에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 갖는 단백질 또는 이의 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전술한 아미노산 잔기 중 3개에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전술한 아미노산 잔기의 4개 전부에서 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, 및 Val193Ile에 대응하는 전술한 아미노산 잔기에서 리신에서 메티오닌으로, 세린에서 알라닌으로, 및 발린에서 이소류신으로의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 변이체 LukA 단백질 또는 이의 폴리펩티드는 서열번호 25의 Glu323Ala에 대응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다, 즉, 변이체 LukA는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala에 대응하는 치환을 포함한다.

본원에 기술된 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25에서의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala에 대응하는 아미노산 치환을 보유한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1에서의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Glu320Ala로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체이다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1에서의 각각의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Glu320Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체이다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2에서의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, 및 Glu321Ala에 대응하는 임의의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2에서의 각각의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, 및 Glu321Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 다른 예시적인 변이체 LukA 단백질은 서열번호 25에서의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala의 치환에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 전술한 잔기에서의 아미노산 치환은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하여 LukAB 이종이량체 구조의 형태를 안정화시킨다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본원에 기술된 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Tyr74(Tyr74Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 티로신에서 시스테인으로의 치환을 포함하고, 서열번호 25의 Asp140(Asp140Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 아스파라긴에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 위치 74 및 140에서 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써 야생형 LukA에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 본원에 기술된 다른 변이체 LukA 단백질 및 폴리펩티드에 비해 변이체 LukA의 열안정성을 증가시킨다.

또 다른 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Gly149에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환(Gly149Cys)을 포함하고, 서열번호 25의 Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환(Gly156Cys)을 포함한다. 위치 149 및 156에서 도입된 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써 야생형 LukA에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 본원에 기술된 다른 변이체 LukA 폴리펩티드에 비해 변이체 LukA의 열안정성을 증가시킨다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 변이체 LukA 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술된 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 변이체 LukA 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 잔기 Tyr71, Asp137, Gly146, 및 Gly153에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술된 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 변이체 LukA 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 잔기 Tyr72, Asp138, Gly147, 및 Gly154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술된 시스테인 잔기의 도입을 수반한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환과 조합된 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323 및 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190, Glu320, Tyr71, Asp137, Gly146, 및 Gly153 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, 및 Gly153Cys 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 이러한 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81, Ser139, Val111, Val191, Glu321, Tyr72, Asp138, Gly147, 및 Gly154 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, 및 Gly154Cys 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 이러한 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

면역원성 조성물의 다른 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, Glu323Ala, Tyr74Cys, Asp140Cys, Gly149Cys, 및 Gly156Cys에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체는 Thr249에 대응하는 잔기에서 치환을 포함하며, 여기서 치환은 이 잔기에서 (Thr249Val) 트레오닌에서 발린으로의 치환이다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 LukA 변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 기술된 다른 아미노산 잔기 치환 중 어느 하나, 즉, 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 잔기에서의 치환과 조합된 서열번호 25의 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 본원에 기술된 LukA 변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 기술된 다른 아미노산 잔기 치환 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 9개 전부와 조합된 서열번호 25의 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, 및 Thr249에 대응하는 각각의 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 잔기 Thr246에서의 아미노산 치환을 단독으로 또는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190, 및 Glu320 각각에 대응하는 임의의 하나 이상의 아미노산 치환과 조합하여 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190, Glu320, 및 Thr246 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, 및 Thr246Val 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 잔기 Thr247에서의 아미노산 치환을 단독으로 또는 서열번호 2의 Lys81, Ser139, Val111, Val191, 및 Glu321 각각에 대응하는 임의의 하나 이상의 아미노산 치환과 조합하여 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81, Ser139, Val111, Val191, Glu321, 및 Thr247 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, 및 Thr247Val 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

면역원성 조성물의 다른 예시적인 변이체 LukA 단백질은 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, 및 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서 상기 설명된 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, Thr249, Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80, Ser138, Val110, Val190, Glu320, Tyr71, Asp137, Gly146, Gly153, 및 Thr246 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Glu320Ala, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys, 및 Thr246Val 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81, Ser139, Val111, Val191, Glu321, Tyr72, Asp138, Gly147, Gly154 및 Thr247 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Glu321Ala, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys 및 Thr247 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드이다. 일 실시예에서, 전술한 위치의 각각에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 10의 아미노산 서열, 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

면역원성 조성물의 다른 예시적인 LukA 변이체 단백질은 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, Thr249, Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 잔기의 상기 설명된 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 26-38의 LukA 단백질 중 어느 하나를 포함한다.

아래 표 1은 본원에 개시된 면역원성 조성물의 예시적인 변이체 LukA 아미노산 서열을 제공한다.

예시적인 LukA 폴리펩티드 아미노산 서열

서열번호	명칭	설명
1	LukA CC8 WT	HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYHVDFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWSVIANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYKEG
2	LukA CC45 WT	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYHVDFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWSVVANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYKEG
3	LukA CC8 W95 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile	HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
4	LukA CC45 W95 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
5	LukA CC8 W95W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys	HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSSG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
6	LukA CC45 W95W72 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSLG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
7	LukA CC8 W97 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val	HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVN A TFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
8	LukA CC45 W97 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
9	LukA CC8 W97 W72 E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys	HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYH I DFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSSG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWS I IANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
10	LukA CC45 W97 W72 E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPT C DKNVLLVK M QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKV CA TFSYSLG C KFDSTK C IGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
11	LukA CC45 W94 E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK L QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
12	LukA CC45 W96 E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVK L QGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYH I DFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVD A TFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWS I VANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFL V YISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
13	LukA CC8 Glu320Ala	HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYHVDFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWSVIANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKYSDDNKPYK A G
14	LukA CC45 Glu321Ala	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYHVDFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWSVVANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKYSDQNKPYK A G
113	LukA CC8 델타 10	HKDSQDQNKKEHVDKSQQKDKRNVTNKDKNSTAPDDIGKNGKITKRTETVYDEKTNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHKEEKNSNWLKYPSEYHVDFQVKRNRKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSSGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKTISYNQQNYDTIASGKNNNWHVHWSVIANDLKYGGEVKNRNDELLFYRNTRIATVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYLSNEKSNEKTQFEVTYTRNQDILKNRPGIHYAPPILEKNKDGQRLIVTYEVDWKNKTVKVVDKY
114	LukA CC45 델타 10	ANKDSQDQTKKEHVDKAQQKEKRNVNDKDKNTPGPDDIGKNGKVTKRTVSEYDKETNILQNLQFDFIDDPTYDKNVLLVKKQGSIHSNLKFESHRNETNASWLKYPSEYHVDFQVQRNPKTEILDQLPKNKISTAKVDSTFSYSLGGKFDSTKGIGRTSSNSYSKSISYNQQNYDTIASGKNNNRHVHWSVVANDLKYGNEIKNRNDEFLFYRNTRLSTVENPELSFASKYRYPALVRSGFNPEFLTYISNEKTNDKTRFEVTYTRNQDILKNKPGIHYGQPILEQNKDGQRFIVVYEVDWKNKTVKVVEKY

면역원성 조성물의 S. 아우레우스( S. aureus ) 류코시딘 B(LukB) 폴리펩티드

일부 측면에서, 본 개시내용의 면역원성 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 B(LukB) 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 실시예에서, 아우레우스(S. aureus) LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 야생형 단백질 또는 폴리펩티드이다. 적절한 LukB 폴리펩티드는 본원에 개시된 LukB 폴리펩티드 중 어느 하나, 예를 들어 서열번호 15, 16, 및 39-51로부터 선택되는 임의의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 실시예에서, LukB 폴리펩티드는 CC8 LukB 폴리펩티드이다. 적절한 CC8 LukB 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukB 폴리펩티드는 CC45 LukB 폴리펩티드이다. 적절한 CC45 LukB 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 LukB 폴리펩티드는 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 적합한 LukB 변이체 폴리펩티드는 LukB 안정성을 개선함으로써 LukAB 톡소이드 안정성에 기여하는 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 치환, 및/또는 결실을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이들 변이체 LukB 단백질 및 폴리펩티드는 이상적인 백신 항원 후보물질이며, SpA 폴리펩티드 단독과 함께 또는 류코시딘 A(LukA) 변이체 단백질 또는 폴리펩티드와 조합하여 면역원성 조성물에 포함될 수 있다. 면역원성 조성물이 LukB 및 LukA 폴리펩티드의 조합을 포함할 때, 생성된 톡소이드는 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 독소의 구조를 모방하며, 이에 의해 S. 아우레우스(S. aureus)의가장 강력한 독소 중 하나에 대한 강력한 면역 반응의 생성을 용이하게 한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 전장 성숙 LukB 단백질 서열에 대응하는 아미노산 잔기를 모두를 포함하는 전장 LukB 단백질의 변이체이다. 임의의 실시예에서, LukA 변이체 폴리펩티드는 전장 성숙 LukA 단백질 미만의 변이체이다. 임의의 실시예에서, 변이체 LukB 폴리펩티드는 적어도 100개 아미노산 잔기 길이이다. 임의의 실시예에서, 변이체 LukB 폴리펩티드는 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 적어도 150개, 적어도 160개, 적어도 170개, 적어도 180개, 적어도 190개, 적어도 200개, 적어도 210개, 적어도 220개, 적어도 230개, 적어도 240개, 적어도 250개, 적어도 260개, 적어도 270개, 적어도 280개, 적어도 290개, 적어도 300개의 아미노산 잔기 길이이다.

본원에 기술된 예시적인 LukB 변이체 단백질은 클론 복합체 CC8(서열번호 15) 및 CC45(서열번호 16)의 변이체 LukB 단백질이지만(아래 표 2 참조), 당 분야의 숙련자라면 서열번호 15 및 서열번호 16의 맥락에서 식별된 LukB의 아미노산 치환 및/또는 결실이 다양한 클론 복합체에 걸쳐 보존되는 아미노산 잔기이거나 다양한 클론 복합체에 걸쳐 고도로 보존되는 LukB의 영역 내에 있다는 것을 쉽게 알 것이다. S. 아우레우스(S. aureus)의 14개의 상이한 균주로부터 LukB 단백질 서열의 정렬(도 2a~c 참조)은, 변이의 대상이 되는 잔기로서 본원에서 식별된 아미노산 잔기가 정렬된 LukB 아미노산 서열의 14개 모두에 걸쳐 보존되는 잔기임을 보여준다. 식별된 변이 잔기의 위치는 개별 LukB 서열 간에 다를 수 있지만, 서열 정렬은 이들 위치 간의 대응관계를 보여준다. 명확성을 위해, 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는, LukB 컨센서스 서열을 서열 정렬로부터 생성하고, 특정 아미노산 변이의 위치를 할당하기 위한 목적으로 사용하였다. 예를 들어, 서열번호 39에서의 글루탐산 잔기 109에서의 아미노산 치환은 서열번호 15, 42, 44 및 46-51의 LukB 서열에서 위치 109에서의 글루탐산 잔기, 서열번호 16, 40, 43 및 45의 LukB 서열에서의 위치 110에서의 글루탐산 잔기, 및 서열번호 41에서 위치 60에서의 글루탐산 잔기에 대응한다. 따라서, 본원에 기술된 식별된 아미노산 변이는 현재 또는 미래에 알려진 임의의 LukB 아미노산 서열 내의 대응하는 아미노산 잔기에 보편적으로 적용될 수 있다.

임의의 실시예에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함한다. 임의의 실시예에서, Val53에서의 아미노산 치환은 발린에서 류신으로의 치환(Val53Leu)을 포함한다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39에서의 Val53Leu 치환에 대응하는 치환을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 위치 53에 대응하는 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환을 갖는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 위치 53에서 발린에서 류신으로의 치환을 갖는 예시적인 CC8 LukB 서열은 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환을 갖는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 발린에서 류신으로의 치환을 포함하는 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

다른 예시적인 변이체 LukB 단백질은 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 40-51의 LukB 단백질 중 어느 하나를 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 하나 이상의 전술한 잔기에서의 아미노산 치환은 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 도입하여 LukAB 이종이량체 구조의 형태를 안정화시킨다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본원에 기술된 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 39의 Glu45(Glu45Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환을 포함하고, 서열번호 39의 Thr121(Thr121Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 트레오닌에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 위치 45 및 121에서 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써 야생형 LukB에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 본원에 기술된 다른 변이체 LukB 단백질 및 폴리펩티드에 비해 변이체 LukB의 열안정성을 증가시킨다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 39의 Glu109(Glu109Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환을 포함하고, 서열번호 39의 Arg154(Arg154Cys)에 대응하는 아미노산 잔기에서 아르기닌에서 시스테인으로의 치환을 포함한다. 위치 109 및 154에서 도입된 이들 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성함으로써 야생형 LukB에 비해 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 쌍을 이룬 시스테인 잔기를 함유하지 않는 본원에 기술된 다른 변이체 LukB 단백질 및 폴리펩티드에 비해 변이체 LukB의 열안정성을 증가시킨다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술된 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 임의의 실시예에서, Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 잔기에서 시스테인 아미노산 치환을 포함하는 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술된 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 임의의 실시예에서, Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 잔기에서 시스테인 아미노산 치환을 포함하는 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 22의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 잔기 치환과 조합된 서열번호 39의 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Val53, Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Val53, Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Val53Leu, Glu45Cys, Glu110Cys, Thr123Cys, 및 Arg155Cys에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 20의 아미노산 서열, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

면역원성 조성물의 다른 예시적인 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 39의 Val53, Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 잔기에서 상기 설명된 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 40-51의 LukB 단백질 중 어느 하나를 포함한다.

아래 표 2는 본원에 개시된 면역원성 조성물의 예시적인 변이체 LukB 아미노산 서열을 제공한다.

예시적인 LukB 폴리펩티드 아미노산 서열

서열번호	명칭	설명
15	LukB CC8 WT	KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLTEPNYDKETVFIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSYRTLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
16	LukB CC45 WT	EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLTEPNYDKETVFIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSYRTLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK
17	LukB CC8 Val53Leu	KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLTEPNYDKET L FIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSYRTLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
18	LukB CC45 Val53Leu	EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLTEPNYDKET L FIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQDESREVKYTYGYKTGGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSYRTLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK
19	LukB CC8 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys	KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLT C PNYDKET L FIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSY C TLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
20	LukB CC45 Val53Leu, Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys	EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLT C PNYDKET L FIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSY C TLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK
21	LukB CC8 Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys	KINSEIKQVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDSQKNITQSLQFNFLT C PNYDKETVFIKAKGTIGSGLRILDPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKESNYSETISYQQPSY C TLLDQSTSHKGVGWKVEAHLINNMGHDHTRQLTNDSDNRTKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKDKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKKDKGKSQFVVHYKRSMDEFKIDWNRHGFWGYWSGENHVDKKEEKLSALYEVDWKTHNVKFVKVLNDNEKK
22	LukB CC45 Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys	EIKSKITTVSEKNLDGDTKMYTRTATTSDTEKKISQSLQFNFLT C PNYDKETVFIKAKGTIGSGLKILNPNGYWNSTLRWPGSYSVSIQNVDDNNNSTNVTDFAPKNQD C SREVKYTYGYK C GGDFSINRGGLTGNITKEKNYSETISYQQPSY C TLIDQPTTNKGVAWKVEAHSINNMGHDHTRQLTNDSDDRVKSEIFSLTRNGNLWAKDNFTPKNKMPVTVSEGFNPEFLAVMSHDKNDKGKSRFIVHYKRSMDDFKLDWNKHGFWGYWSGENHVDQKEEKLSALYEVDWKTHDVKLIKTFNDKEKK

면역원성 조성물의 스태필로코쿠스 단백질 A(SpA) 폴리펩티드

본원에 기술된 면역원성 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus) 단백질 A 폴리펩티드를 함유한다. “단백질 A” 또는 “SpA”는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 감염될 숙주의 선천 및 적응 면역 반응으로부터 박테리아 회피를 제공하는 기능을 하는 S. 아우레우스(S. aureus)의 세포 벽 고정 표면 단백질을 지칭한다. 단백질 A는 이들의 Fc 부분에서 면역글로불린에 결합할 수 있고, B 세포 증식 및 세포자멸사를 적절히 자극함에 있어서 B 세포 수용체의 V_H3 도메인과 상호작용할 수 있고, 폰 빌레브란트 인자 A1 도메인에 결합하여 세포내 응고를 활성화할 수 있고, 또한 TNF 수용체-1에 결합하여 스태필로코쿠스 뉴모니아의 발병기전에 기여할 수 있다.

대부분의 S. 아우레우스(S. aureus) 균주는, 세포벽 고정 표면 단백질 산물(SpA)이 E, D, A, B, 및 C로 지정된 5개의 고도로 상동성인 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 잘 특성화된 독성 인자인 단백질 A(SpA)에 대한 구조적 유전자를 발현한다. 아미노산 수준에서 약 80%의 동일성을 나타내는 면역글로불린 도메인은 길이가 56 내지 61개의 잔기이고, 직렬 반복으로서 조직된다. 각각의 면역글로불린 결합 도메인은 3개의 나선 다발로 조립되고 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인, IgM의 V_H3 중쇄(Fab), A1 도메인에서의 폰 빌레브란트 인자, 및 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 수용체 1(TNFR1)에 결합하는 항-평행 α-나선으로 구성된다.

SpA는 IgG의 Fc 성분에 결합하여 스태필로코쿠스의 호중구 식균작용을 방해한다. 또한, SpA는 폰 빌레브란트 인자 A1 도메인에 대한 결합을 통해 혈관내 응고를 활성화시킬 수 있다. 피브리노겐 및 피브로넥틴과 같은 혈장 단백질은 스태필로코쿠스(ClfA 및 ClfB)와 혈소판 인테그린 GPIIb/IIIa 사이의 가교로서 작용하며, 이는 스태필로코쿠스가 GPIb-α 혈소판 수용체를 통해 혈소판을 포획할 수 있게 하는 vWF A1과의 SpA 결합을 통해 보충되는 활성이다. SpA는 또한 TNFR1에 결합하고, 이러한 상호작용은 스태필로코쿠스 뉴모니아의 발병기전에 기여한다. SpA는 TRAF2, p38/c-Jun 키나아제, 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK), 및 Rel-전사 인자 NF-κB의 TNFR1 매개 활성화를 통해 전염증성 신호전달을 활성화시킨다. SpA 결합은 TNF-전환 효소(TACE)를 필요로 하는 것으로 보이는 활성인 TNFR1 쉐딩(shedding)을 추가로 유도한다. 개시된 활성 각각은 5개의 IgG 결합 도메인을 통해 매개되고, 단백질 A와 인간 IgG1 사이의 상호작용에 대한 이들의 요건에 의해 초기에 정의되는 동일한 아미노산 치환에 의해 교란될 수 있다(Cedergren 등, (1993)).

SpA는 또한 IgM, B 세포 수용체를 보유하는 V_H3의 Fab 영역을 포획함으로써 B 세포 초항원으로서 기능한다. 정맥내 접종 후, 스태필로코쿠스 SpA 돌연변이는 기관 조직에서 스태필로코쿠스 부하의 감소를 나타내고, 비장을 형성하는 능력을 극적으로 감소시킨다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 폴리펩티드는 야생형(비변이체) SpA 폴리펩티드이다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E IgG 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 적어도 SpA A 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA A 도메인은 서열번호 55 또는 48의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 적어도 SpA B 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA B 도메인은 서열번호 56 또는 49의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 적어도 SpA C 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA C 도메인은 서열번호 57 또는 50의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 적어도 SpA D 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA D 도메인은 서열번호 58 또는 51의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 적어도 SpA E 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA E 도메인은 서열번호 59 또는 52의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 SpA IgG 도메인 중 적어도 2개, SpA IgG 도메인 중 적어도 3개, SpA IgG 도메인 중 적어도 4개, 또는 SpA IgG 도메인 중 5개 모두를 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 폴리펩티드는 서열번호 53의 아미노산 서열 또는 서열번호 53과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예시적인 SpA 도메인 및 전장 서열이 아래 표 3에 제공되어 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 폴리펩티드는 SpA 변이체 폴리펩티드이다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 “단백질 A 변이체,” “SpA 변이체,” “단백질 A 변이체 폴리펩티드,” 및 “SpA 변이체 폴리펩티드”는 Fc 및 V_H3에 대한 결합을 파괴하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 SpA IgG 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 A 도메인, 변이체 B 도메인, 변이체 C 도메인, 변이체 D 도메인, 및/또는 변이체 E 도메인을 포함한다. 적절한 SpA 변이체 폴리펩티드는 비독성이고 스태필로코쿠스 박테리아 단백질 A 및 단백질 A-유사 단백질 및/또는 이를 발현하는 박테리아에 대한 면역 반응을 자극하는 변이체 및 이의 단편을 포함한다.

면역글로불린에 결합하지 않고, 따라서 야생형 SpA 폴리펩티드의 비세포독성 변이체인 SpA 변이체 폴리펩티드가 본원에 기술된다. SpA 변이체 폴리펩티드는 비독성이고 체액성 면역 반응을 자극하여 스태필로코쿠스 감염 및 질병으로부터 보호한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 변이체 E, D, A, B, 또는 C 도메인을 포함하는 전장 SpA 변이체이다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 전장 SpA 폴리펩티드의 단편을 포함한다. SpA 변이체 폴리펩티드 단편은 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 IgG 결합 도메인을 포함할 수 있다. IgG 결합 도메인은, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 변이체 A, B, C, D, 및/또는 E 도메인일 수 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 변이체 A 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 변이체 B 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 변이체 C 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 변이체 D 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 변이체 E 도메인을 포함한다.

임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드의 변이체 A 도메인은, 예를 들어, 서열번호 55 또는 48의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 변이체 B 도메인은, 예를 들어, 서열번호 56 또는 49의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 변이체 C 도메인은, 예를 들어, 서열번호 57 또는 50의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 변이체 D 도메인은, 예를 들어, 서열번호 58 또는 51의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 변이체 E 도메인은, 예를 들어, 서열번호 59 또는 52의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.

특정 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 59 또는 52, 서열번호 58 또는 51, 서열번호 55 또는 48, 서열번호 56 또는 49, 및 서열번호 57 또는 50 각각에 대해 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변이체 E, D, A, B, 및/또는 C 도메인을 포함한다.

임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 59의 아미노산 위치 6, 7, 33, 및/또는 34에서의 치환을 포함하는 변이체 E 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 58의 아미노산 위치 9, 10, 36, 및/또는 37에서 치환을 포함하는 변이체 D 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 55의 아미노산 위치 7, 8, 34, 및/또는 35에서의 치환을 포함하는 변이체 A 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 56의 아미노산 위치 7, 8, 34, 및/또는 35에서의 치환을 포함하는 변이체 B 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 57의 아미노산 위치 7, 8, 34, 및/또는 35에서의 치환을 포함하는 변이체 C 도메인을 포함한다. 변이체 E, D, A, B, 및/또는 C 도메인에서의 아미노산 치환은 WO2011/005341 및 WO2020232471에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA 도메인 D의 IgG Fc 결합 하위-도메인에서 및/또는 다른 IgG 도메인의 대응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나 이상의 아미노산 치환은 IgG Fc에 대한 SpA 변이체 폴리펩티드의 결합을 파괴하거나 감소시킬 수 있다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA 도메인 D의 V_H3 결합 하위-도메인에서 및/또는 다른 IgG 도메인의 대응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 하나 이상의 아미노산 치환은 V_H3에 대한 결합을 파괴하거나 감소시킬 수 있다.

SpA 도메인 D에서의 전술한 아미노산 치환(즉, IgG Fc 하위-도메인 결합 영역 또는 V_H3 결합 하위-도메인 영역에서의 치환)은 각각의 도메인의 대응하는 위치에서 SpA A, B, C, 및/또는 E 도메인에 통합될 수 있다. 대응하는 위치는 SpA 도메인 A, B, C, 및/또는 E와 SpA 도메인 D의 정렬에 의해 정의되어 SpA 도메인 A, B, C, 및/또는 E의 잔기가 변이체 SpA D 잔기에 대응하는지 결정한다. 예를 들어, SpA 도메인 D의 서열번호 58의 위치 9에서의 글루타민 잔기에서의 아미노산 치환은 SpA 도메인 A의 서열번호 55의 위치 7에서의 글루타민 잔기, SpA 도메인 B의 서열번호 56의 위치 7에서의 글루타민 잔기, SpA 도메인 C의 서열번호 57의 위치 7에서의 글루타민 잔기, 및 SpA 도메인 E의 서열번호 59의 위치 6에서의 글루타민 잔기에 대응한다. 따라서, 본원에 기술된 식별된 아미노산 변이는 현재 또는 미래에 공지된 임의의 SpA 도메인 아미노산 서열의 대응하는 아미노산 잔기에 보편적으로 적용될 수 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 (a) SpA 도메인 D의 IgG Fc 결합 하위-도메인에서의 및/또는 다른 IgG 도메인에서의 대응하는 아미노산 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환; 및 (b) SpA 도메인 D의 V_H3 결합 하위-도메인에서의 및/또는 다른 IgG 도메인에서의 대응하는 아미노산 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나 이상의 아미노산 치환은 SpA 변이체 폴리펩티드가 숙주 유기체에서 독성을 감소시키거나 제거하도록 IgG Fc 및 V_H3에 대한 SpA 변이체 폴리펩티드의 결합을 감소시킨다.

임의의 실시예에서, 서열번호 58의 SpA D 도메인의 IgG Fc 결합 하위-도메인의 아미노산 잔기 F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31, 및/또는 K35는 IgG Fc에 대한 결합이 감소되거나 제거되도록 변형되거나 치환된다. 임의의 실시예에서, 대응하는 변형은 SpA A, B, C, 및/또는 E 도메인에 통합된다. 대응하는 위치는 SpA 도메인 D와 SpA 도메인 A, B, C, 및/또는 E의 정렬에 의해 정의되어 SpA 도메인 D의 관심 잔기에 대응하는 SpA 도메인 A, B, C, 및/또는 E의 잔기가 결정된다.

임의의 실시예에서, 서열번호 58의 SpA D 도메인의 VH3 결합 하위-도메인의 아미노산 잔기 Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, 및/또는 E47은 V_H3에 대한 결합이 감소되거나 제거되도록 변형되거나 치환된다. 대응하는 변형은 SpA A, B, C, 및/또는 E 도메인에 통합될 수 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 변이체 D 도메인을 포함한다. 변이체 D 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 잔기 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 아미노산 잔기 치환 또는 변형은, 예를 들어, SpA 도메인 D(서열번호 58)의 IgG Fc 결합 하위-도메인의 아미노산 잔기 F5, Q9, Q10, S11, F13, Y14, L17, N28, I31, 및/또는 K35 및/또는 SpA 도메인 D(서열번호 58)의 VH3 결합 하위-도메인의 아미노산 잔기 Q26, G29, F30, S33, D36, D37, Q40, N43, 및/또는 E47에서 발생할 수 있다. 임의의 실시예에서, 아미노산 잔기 치환 또는 변형은 서열번호 58의 아미노산 잔기 Q9 및 Q10에서 이루어진다. 임의의 실시예에서, 아미노산 잔기 치환 또는 변형은 서열번호 58의 아미노산 잔기 D36 및 D37에서 이루어진다. 변이체 A, B, C, D, 및/또는 E 도메인에서의 아미노산 치환은 WO2011/005341에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 53 또는 72와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%(100%는 아님)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 53 또는 72 또는 서열번호 53 또는 72의 적어도 n개의 연속 아미노산의 단편과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 75개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개, 적어도 175개, 적어도 200개, 적어도 225개, 적어도 250개, 적어도 275개, 적어도 300개, 적어도 325개, 적어도 350개, 적어도 375개, 적어도 400개, 또는 적어도 425개 아미노산이다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 72의 카르복시 (C)-말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35개 아미노산) 및/또는 아미노산 (N)-말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실(예를 들어, 적어도 1a~c, 2a~c, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35개 아미노산)을 포함할 수 있다. 임의의 실시예에서, 최종 35개의 C-말단 아미노산이 결실된다. 특정 실시예에서, 처음 36개의 N-말단 아미노산이 결실된다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 72의 아미노산 잔기 37 내지 327을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단까지 배열된 5개의 SpA IgG 결합 도메인 모두를 포함하고, 이는 E 도메인, D 도메인, A 도메인, B 도메인, 및 C 도메인을 순서대로 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA의 E, D, A, B, 및 C 도메인을 연속적으로 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 천연 E, D, A, B, 및/또는 C 도메인을 포함한다. 천연 도메인의 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 천연 도메인이 결실되는 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA가 B 세포 초항원으로서 기능하는 경우 발생할 수 있는 과도한 B 세포 증식 및 세포자멸사를 방지할 수 있다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E 도메인만을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA D 도메인만을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA A 도메인만을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA B 도메인만을 포함한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA C 도메인만을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 72에 대해 11개의 디펩티드 서열 반복(예를 들어, QQ 디펩티드 반복 및/또는 DD 디펩티드 반복) 중 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 예로서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 아미노산 위치 7 및 8, 34 및 35, 60 및 61, 68 및 69, 95 및 96, 126 및 127, 153 및 154, 184 및 185, 211 및 212, 242 및 243, 및 269 및 270에서의 XX 디펩티드 반복은 면역글로불린에 대한 SpA 변이체 폴리펩티드의 친화도를 감소시키기 위해 치환된다. Gln-Gln(QQ) 디펩티드에 대한 유용한 디펩티드 치환은 Lys-Lys(KK), Arg-Arg(RR), Arg-Lys(RK), Lys-Arg(KR), Ala-Ala(AA), Ser-Ser(SS), Ser-Thr(ST), 및 Thr-Thr(TT) 디펩티드를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, QQ 디펩티드는 KR 디펩티드로 치환된다. Asp-Asp(DD) 디펩티드에 대한 유용한 디펩티드 치환은 Ala-Ala(AA), Lys-Lys(KK), Arg-Arg(RR), Lys-Arg(KR), His-His(HH), 및 Val-Val(VV) 디펩티드를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 디펩티드 치환은, 예를 들어 인간 IgG의 Fc 부분 및 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대한 SpA 변이체 폴리펩티드의 친화도를 감소시킬 수 있다.

따라서, 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 78을 포함할 수 있으며, 여기서 XX 디펩티드 반복체 중 하나 이상, 바람직하게는 11개 모두는 서열번호 72의 대응하는 디펩티드와 상이한 아미노산으로 치환된다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 79를 포함하며, 여기서 위치 60 및 61에서의 아미노산 이중체(doublet)는 각각 Lys 및 Arg(K 및 R)이다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 80 또는 서열번호 81을 포함한다. 특정 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 75를 포함하며, 여기서 서열번호 75의 바람직한 예는 서열번호 76 또는 서열번호 77이다(서열번호 77은 N-말단 메티오닌을 갖는 서열번호 76임).

임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드 N-말단은 서열번호 72의 처음 36개의 아미노산의 결실을 포함하고, C-말단은 서열번호 72의 마지막 35개의 아미노산의 결실을 포함한다. 서열번호 72의 36개 아미노산의 N-말단 결실 및 서열번호 72의 35개 아미노산의 C-말단 결실을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드는 제5 Ig-결합 도메인의 결실(즉, 서열번호 72의 Lys-327의 하류)을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 SpA 변이체는 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 XX 디펩티드는 아미노산으로 치환될 수 있어서, 아미노산은 서열번호 72의 대응하는 디펩티드 서열과 상이하다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 74를 포함한다.

임의의 실시예에서, 전술한 바와 같이, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 1, 2, 3, 또는 4개의 천연 A, B, C, D, 및/또는 E 도메인을 포함한다. 예를 들어, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E 도메인만을 포함하고 D, A, B, 또는 C 도메인은 포함하지 않을 수 있다. 따라서, SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 SpA E 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 SpA E 도메인은 서열번호 83의 적어도 하나의 아미노산 잔기에서의 치환을 포함한다. 치환은, 예를 들어 서열번호 83의 아미노산 위치 60 및 61에 있을 수 있다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 또는 서열번호 82를 포함할 수 있다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 또는 서열번호 82를 포함할 수 있다. SpA 변이체 폴리펩티드는 WO2015/144653에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 84의 아미노산 43Q, 44Q, 96Q, 97Q, 162Q, 163Q, 220Q, 221Q, 278Q, 및 279Q에서의 아미노산 치환을 포함한다. 서열번호 84의 아미노산 43Q, 44Q, 96Q, 97Q, 162Q, 163Q, 220Q, 221Q, 278Q, 및 279Q에서의 아미노산 치환은, 예를 들어 리신(K) 또는 아르기닌(R) 치환일 수 있다. 특정 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 84의 아미노산 70D, 71D, 131D, 132D, 189D, 190D, 247D, 248D, 305D, 및 306D에서의 아미노산 치환을 포함한다. 서열번호 84의 아미노산 70D, 71D, 131D, 132D, 189D, 190D, 247D, 248D, 305D, 및 306D에서의 아미노산 치환은, 예를 들어 알라닌(A) 또는 발린(V) 치환일 수 있다. 특정 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87 및 서열번호 100으로부터 선택될 수 있다. SpA 변이체 폴리펩티드는 US2016/0304566에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 A 도메인, 예를 들어 서열번호 62, 67, 88 또는 93의 아미노산 서열, 또는 서열번호 62, 67, 88 또는 93의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 A 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 B 도메인, 예를 들어 서열번호 63, 68, 89, 또는 94의 아미노산 서열, 또는 서열번호 63, 68, 89, 또는 94의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 B 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 C 도메인, 예를 들어 서열번호 64, 69, 90, 또는 95의 아미노산 서열, 또는 서열번호 64, 69, 90, 또는 95의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 C 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 D 도메인, 예를 들어 서열번호 66, 71, 91, 또는 96의 아미노산 서열 또는 서열번호 66, 71, 91, 또는 96의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 D 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 E 도메인, 예를 들어 서열번호 65, 70, 92, 또는 97의 아미노산 서열, 또는 서열번호 65, 70, 92, 또는 97의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 E 도메인을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드의 변이체 A 도메인은, 예를 들어 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변이체 B 도메인은, 예를 들어 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변이체 C 도메인은, 예를 들어 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변이체 D 도메인은, 예를 들어 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 변이체 E 도메인은, 예를 들어 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 A, B, C, D, 및 E 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 각각 서열번호 62 또는 67, 서열번호 63 또는 68, 서열번호 64 또는 69, 서열번호 66 또는 71, 및 서열번호 65 또는 70과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 A, B, C, D, 및 E 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 각각 서열번호 88 또는 93, 서열번호 89 또는 94, 서열번호 90 또는 95, 서열번호 91 또는 96 및 서열번호 92 또는 97과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 변이체 D 도메인을 포함하며, 여기서 변이체 D 도메인은 서열번호 58의 위치 9, 10 및/또는 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 (i) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 SpA A-E 도메인 각각에서의 글루타민 아미노산 잔기에 대한 리신 치환; 및 (ii) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 SpA A-E 도메인 각각에서의 세린 아미노산 잔기에 대한 글루타메이트 치환을 포함한다. SpA 변이체 폴리펩티드는 음성 대조군에 비해, 혈액 중 IgG 및 IgE를 검출가능하게 가교 결합시키지 않고/않거나 호염기구를 활성화시키지 않는다. 혈액 중 IgG 및 IgE를 검출가능하게 가교 결합하지 않고/않거나 호염기구를 활성화시키지 않음으로써, SpA 변이체 폴리펩티드는 인간 환자에게 유의한 안전성 또는 독성 문제를 제기하지 않고/않거나 인간 환자에서 유의한 아나필락시스 쇼크 위험을 제기하지 않는다.

임의의 실시예에서, 인간 IgG로부터의 V_H3에 대해 본원에 기술된 SpA 변이체 폴리펩티드의 K_A 결합 친화도는 SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 9 및 10에 대응하는 SpA A-E 도메인 각각에서의 글루타민 잔기에 대한 리신 치환 및 SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 36 및 37에 대응하는 SpA A-E 도메인에서의 아스파르트산에 대한 알라닌 치환으로 이루어진 SpA 변이체 폴리펩티드(SpA_KKAA)와 비교하여 감소된다. 도메인 D(서열번호 58)의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 도메인 A-E 각각에서의 글루타민에서 리신으로의 치환, 및 도메인 D의 위치 36 및 37에 대응하는 아미노산 위치에서의 도메인 A-E 각각에서의 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환으로 이루어진 SpA 변이체 폴리펩티드는 비교자로서 사용되고, SpA_KKAA로 명명된다. SpA_KKAA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 인간 IgG로부터의 V_H3에 대한 K_A 결합 친화도를 가지며, 이는 SpA_KKAA와 비교하여 적어도 두 배(2배)만큼 감소된다. 특정 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 인간 IgG로부터의 V_H3에 대한 K_A 결합 친화도를 가지며, 이는 SpA_KKAA와 비교하여 적어도 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3배 이상 또는 그 사이의 임의의 값 감소된다. 특정 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 인간 IgG로부터의 V_H3에 대한 K_A 결합 친화도를 가지며, 이는 SpA_KKAA와 비교하여 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300% 이상 또는 그 사이의 임의의 값 감소된다. 특정 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 인간 IgG로부터의 V_H3에 대한 K_A 결합 친화도를 가지며, 이는 약 1 x 10⁵ M^-1 미만이다. 특정 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 인간 IgG로부터의 V_H3에 대한 K_A 결합 친화도를 가지며, 이는 약 3, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1 x 10⁵ M^-1 또는 그 사이의 임의의 값 미만이다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 36 및 37에 대응하는 SpA A-E 도메인 중 어느 하나에서 치환을 갖지 않는다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 (i) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 9 및 10에 대응하는 위치에서의 SpA A-E 도메인 각각의 글루타민 아미노산 잔기에 대한 리신 치환; 및 (ii) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 33에 대응하는 위치에서 SpA A-E 도메인 각각에서의 세린 아미노산 잔기에 대한 글루타메이트 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 65의 아미노산 서열 또는 서열번호 65와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA E 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA D 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA A 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 63의 아미노산 서열 또는 서열번호 63과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA B 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA C 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열 또는 서열번호 60과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 (i) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 9 및 10에 대응하는 위치에서의 SpA A-E 도메인 각각에서의 글루타민 아미노산 잔기에 대한 리신 치환; 및 (ii) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 33에 대응하는 위치에서의 SpA A-E 도메인 각각에서의 세린 아미노산 잔기에 대한 트레오닌 치환을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA E 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA D 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 67의 아미노산 서열 또는 서열번호 67과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA A 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA B 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 69의 아미노산 서열 또는 서열번호 69와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SpA C 도메인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 61의 아미노산 서열 또는 서열번호 61과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함한다.

SpA 변이체 폴리펩티드는 음성 대조군에 비해, 혈액 중 IgG 및 IgE를 검출가능하게 가교 결합시키지 않고/않거나 호염기구를 활성화시키지 않는다. 혈액 중 IgG 및 IgE를 검출가능하게 가교 결합하지 않고/않거나 호염기구를 활성화시키지 않음으로써, SpA 변이체 폴리펩티드는 인간 환자에게 유의한 안전성 또는 독성 문제를 제기하지 않거나 인간 환자에서 유의한 아나필락시스 쇼크 위험을 제기하지 않는다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 SpA 변이체 폴리펩티드는 WO2020232471에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.

아래 표 3은 본원에 개시된 면역원성 조성물의 예시적인 SpA 폴리펩티드 아미노산 서열을 제공한다.

예시적인 SpA 폴리펩티드 아미노산 서열

서열번호	명칭	설명
48	WT SpA A 도메인 길이	ADNNFNKEQQ NAFYEILNMPNLNEEQRNGF IQSLKDDPSQ SANLLSEAKKLNESQAPK
49	WT SpA B 도메인 길이	ADNKFNKEQQ NAFYEILHLPNLNEEQRNGF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKKLNDAQAPK
50	WT SpA C 도메인 길이	ADNKFNKEQQ NAFYEILHLPNLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKKLNDAQAPK
51	WT SpA D 도메인 길이	ADAQQNNFNK DQQSAFYEILNMPNLNEAQR NGFIQSLKDD PSQSTNVLGEAKKLNESQAPK
52	WT SpA E 도메인 길이	AQHDEAQQNA FYQVLNMPNLNADQRNGFIQ SLKDDPSQSA NVLGEAQKLNDSQAPK
53	전장 WT SpA	AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAQQLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAQQLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAQQLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
54	전장 SpA_KKAA	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
55	WT SpA A 도메인	NNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNES
56	WT SpA B 도메인	NKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDA
57	WT SpA C 도메인	NKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDA
58	WT SpA D 도메인	QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNES
59	WT SpA E 도메인	QHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDS
60	SpAS33E	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQELKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQELKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQELKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQELKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQELKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
61	SpAS33T	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQTLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQTLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQTLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQTLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQTLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
62	SpA_S33EA 도메인	NNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQELKDDPSQSANLLSEAKKLNES
63	SpA_S33EB 도메인	NKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQELKDDPSQSANLLAEAKKLNDA
64	SpA_S33E C 도메인	NKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQELKDDPSVSKEILAEAKKLNDA
65	SpA_S33E E 도메인	QHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQELKDDPSQSANVLGEAQKLNDS
66	SpA_S33E D 도메인	QQNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQELKDDPSQSTNVLGEAKKLNES
67	SpA_S33T A 도메인	NNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQTLKDDPSQSANLLSEAKKLNES
68	SpA_S33T B 도메인	NKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQTLKDDPSQSANLLAEAKKLNDA
69	SpA_S33T C 도메인	NKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQTLKDDPSVSKEILAEAKKLNDA
70	SpA_S33T E 도메인	QHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQTLKDDPSQSANVLGEAQKLNDS
71	SpA_S33T D 도메인	QQNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQTLKDDPSQSTNVLGEAKKLNES
72	SpA 길이	MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL
73	SpAXX	AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDXXSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKXXPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEXXNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKXXPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
74	SpAkkAA	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
75	SpAkR	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAXXNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
76	SpAkR	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
77	SpAkR	MAQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
78	SpAkR	AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAXXNNFNKDXXSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKXXPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEXXNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKXXPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
79	SpAkR E 도메인	AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAXXNNFNKD
80	SpAkR E 도메인	AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKD
81	SpAkR E 도메인	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKD
82	SpA E 도메인	MAQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKRNNFNKD
83	SpA E 도메인	AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKD
84	SpA 252	MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL
85	SpA5 (KKAA)	GPLGSAQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKKNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
100	SpA5 (RRAA)	GPLGSAQHDEARRNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADARRNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKERRNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKERRNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKERRNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
86	SpA5 (KKVV)	GPLGSAQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKVVPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAKKNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKVVPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKVVPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKVVPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKVVPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
87	SpA5 (RRVV)	GPLGSAQHDEARRNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKVVPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADARRNKFNKDQQSAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKVVPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKERRNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKVVPSQSANLLAEAKKLNESQAPKADNKFNKERRNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKVVPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKERRNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKVVPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
88	SpA_S33EA 도메인 길이	ADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQELKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPK
89	SpA_S33EB 도메인 길이	ADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQELKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
90	SpA_S33E C 도메인 길이	ADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQELKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
91	SpA_S33E D 도메인 길이	ADAQQNNFNKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQELKDDPSQSTNVLGE AKKLNESQAPK
92	SpA_S33E E 도메인 길이	AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQELKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK
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본 개시내용의 모든 측면에 따르면, 본원에 개시된 LukA 변이체 폴리펩티드, LukB 폴리펩티드, 및 면역원성 조성물의 SpA 폴리펩티드는 하나 이상의 이종 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 적절한 이종 아미노산 서열은 태그 서열, 면역원, 신호 서열 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 태그 서열은, 폴리히스티딘-태그, 폴리아르기닌 태그, FLAG 태그, Step-태그 II, 유비퀴틴 태그, NusA 태그, 키틴 결합 도메인, 칼모둘린-결합 펩티드, 셀룰로오스-결합 도메인, Hat-태그, S-태그, SBP, 말토오스-결합 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제( Terpe K., “Overview of Tag Protein Fusions: From Molecular and Biochemical Fundamentals to Commercial Systems,” Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33 (2003) 참조, 참조로서 본원에 통합됨)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 면역원은 T-세포 에피토프, B-세포 에피토프를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 신호 서열은 PelB 신호 서열, Sec 신호 서열, Tat 신호 서열, AmyE 신호 서열(Freudl R., “Signal Peptides for Recombinant Protein Secretion in Bacterial Expression Systems,” Microbial Cell Factories 17:52 (2018) 참조, 참조로서 본원에 통합됨)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 LukA, LukB, 및 SpA 폴리펩티드는 PelB 서열(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA; 서열번호 23)을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 기술된 LukA, LukB, 및 SpA 폴리펩티드는 His-태그(예를 들어, NSAHHHHHHGS; 서열번호 24)를 포함한다. 일부 실시예에서, 따라서 본원에 기술된 SpA, LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드는 전술한 PelB 서열 및 His-태그 둘 다를 포함한다.

S. 아우레우스( S. aureus ) LukA, LukB, 및 SpA 폴리뉴클레오티드 및 작제물

본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기술된 LukA 변이체 폴리펩티드, LukB 폴리펩티드, 및 SpA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본원에 기술된 핵산 분자는 단리된 폴리뉴클레오티드, 재조합 폴리뉴클레오티드 서열, 발현 벡터의 부분 또는 시험관 내 또는 생체 내 전사/번역에 사용된 선형 DNA 서열을 비롯한, 선형 DNA 서열의 부분, 및 본원에 기술된 변이체 LukA, LukB, 및 SpA 폴리펩티드의 원핵 세포 및 진핵 세포 발현 및 분비와 호환가능한 벡터를 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 자동화된 폴리뉴클레오티드 합성기 상에서의 고상 폴리뉴클레오티드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 생산될 수 있고, 완전한 단일 또는 이중 가닥 분자로 조립될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 PCR 후 이어서 일상적인 클로닝과 같은 다른 기술에 의해 생산될 수 있다. 주어진 서열의 폴리뉴클레오티드를 생산하거나 수득하기 위한 기술은 당 기술분야에 잘 알려져 있다.

임의의 실시예에서, 본원에 개시되는 면역원성 조성물은 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 83에서 리신에 대응하는 잔기에서 리신에서 메티오닌으로의 치환(Lys83Met)을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 141에서 세린에 대응하는 잔기에서 세린에서 알라닌으로의 치환(Ser141Ala)을 포함하는 변이체 LukA 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 113에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환(Val113Ile)을 포함하는 변이체 LukA 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 193에서 발린에 대응하는 잔기에서 발린에서 이소류신으로의 치환(Val193Ile)을 포함하는 LukA 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 전술한 아미노산 잔기에 대응하는 잔기, 즉, 서열번호 25의 Lys803Met, Ser141Ala, Val113Ile, 및 Val193Ile에서 리신에서 메티오닌으로의 아미노산 치환, 세린에서 알라닌으로의 아미노산 치환, 및 발린에서 이소류신으로의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체 LukA 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 Glu323Ala에 대응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 이의 변이체 LukA 폴리펩티드를 암호화하며, 즉, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala 치환에 대응하는 치환을 포함하는 변이체 LukA를 암호화한다.

일 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC8 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 1에서 Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Glu320Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 1의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. CC8 LukA를 암호화하는 예시적인 핵산 분자가 서열번호 101로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 101의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 101의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3(LukA CC8 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile)의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 103과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 CC45 LukA 변이체 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들어, 서열번호 2에서 Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, 및 Glu321Ala에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 서열번호 2의 변이체를 암호화하는 핵산 분자이다. CC45 LukA를 암호화하는 예시적인 핵산 분자가 서열번호 102로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 102의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 102의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 면역원성 조성물의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4(LukA CC45 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile)의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 이러한 LukA CC45 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 104와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Tyr74에 대응하는 아미노산 잔기에서 티로신에서 시스테인으로의 치환(Tyr74Cys)을 포함하는 LukA 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하고, 서열번호 25의 Asp140에 대응하는 아미노산 잔기에서 아스파라긴에서 시스테인으로의 치환(Asp140Cys)을 포함한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Gly149에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환(Gly149Cys)을 포함하는 LukA 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하고, 서열번호 25의 Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서 글리신에서 시스테인으로의 치환(Gly156Cys)을 포함한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술된 시스테인 잔기이다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환과 조합된 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323 및 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 5(LukA CC8 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys)의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 임의의 실시예에서, 본 개시내용의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 6(LukA CC45 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys)의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 위치 249에 대응하는 이러한 잔기에서 트레오닌에서 발린으로의 치환을 포함하는 LukA 변이체를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25의 Lys83, Ser141, Val113, Val193, Glu323, Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 잔기에서 아미노산 치환 중 어느 하나 또는 전부와 조합된 Thr249에 대응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 7(LukA CC8 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, 및 Thr246Val)의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 8(LukA CC45 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val)의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다.

임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 9(LukA CC8 Glu320Ala, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, 및 Gly153Cys)의 LukA 변이체 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 임의의 실시예에서, 서열번호 9의 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 105와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 105의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 10(LukA CC45 Glu321Ala, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, 및 Gly154Cys)의 LukA 변이체 서열 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이다. 임의의 실시예에서, 서열번호 10의 이러한 LukA CC45 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 106과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 106의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 LukB 폴리펩티드를 추가로 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 암호화한다. CC8 LukB를 암호화하는 예시적인 핵산 분자가 서열번호 107로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 107의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 107의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 암호화한다. CC45 LukB를 암호화하는 예시적인 핵산 분자가 서열번호 108로서 본원에 제공된다. 따라서, 임의의 실시예에서, 예시적인 핵산 분자는 서열번호 108의 변이체이며, 여기서 상기 변이체는 서열번호 108의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 변이체 LukB 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, Val53에서의 아미노산 치환은 발린에서 류신으로의 치환(Val53Leu)을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본 개시내용의 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17(LukB CC8 V53L)의 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 이러한 LukB CC8 V53L 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 109와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC8 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 109의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본 개시내용의 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18(LukB CC45 V53L)의 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 이러한 LukB CC45 V53L 변이체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 110과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA CC45 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 110의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 하나 이상의 전술한 잔기에서의 아미노산 치환은 이황화 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입하여 LukAB 이종이량체 구조의 형태를 안정화시킨다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 Glu45에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환(Glu45Cys), 및 서열번호 39의 Thr121에 대응하는 아미노산 잔기에서 트레오닌에서 시스테인으로의 치환(Thr121Cys)을 포함하는 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 Glu109에 대응하는 아미노산 잔기에서 글루탐산에서 시스테인으로의 치환(Glu109Cys), 및 서열번호 39의 Arg154에 대응하는 아미노산 잔기에서 아르기닌에서 시스테인으로의 치환(Arg154Cys)을 포함하는 LukB 변이체 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 이들 아미노산 잔기의 각각에서의 아미노산 치환은 전술된 시스테인 잔기의 도입을 수반한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 21(LukB CC8 Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys)의 아미노산 서열, 또는 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22(LukB CC45 Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys)의 아미노산 서열, 또는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 잔기 치환과 조합된 서열번호 39의 Val53에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19(LukB CC8 Val53Leu, Glu45Cys, Glu109Cys, Thr121Cys, 및 Arg154Cys)의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20(LukB CC45 Val53Leu, Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys)의 아미노산 서열, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체 서열 및 서열번호 16의 CC45 LukB 서열을 암호화한다. 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-15)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 108(CC45 LukB)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 104(CC45 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 108의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본 개시내용의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체 서열 및 서열번호 18의 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-30)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 110(CC45 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 104(CC45 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 110의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본 개시내용의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체 서열 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열을 암호화한다. 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-32)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 107(CC8 LukB)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 103(CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 107의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본 개시내용의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체 서열 및 서열번호 18의 CC45 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-33)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 110(CC45 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 103(CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 110의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본 개시내용의 예시적인 핵산 분자는 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체 서열 및 서열번호 17의 CC8 LukB 변이체 서열을 암호화한다. 이러한 LukAB 이종이량체(RARPR-34)를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 109(CC8 LukB 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 103(CC8 LukA 변이체)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 LukAB 이종이량체를 암호화하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 109의 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 개시내용의 예시적인 LukA 및 LukB 핵산 분자 서열은 아래 표 4에 제공된다.

예시적인 LukA 및 LukB 폴리뉴클레오티드 서열

작제물 명칭	서열번호	DNA 서열
CC8 LukA^wt	101	GCT CAC AAA GAT TCT CAG GAT CAA AAT AAG AAG GAG CAC GTC GAC AAG TCT CAG CAG AAA GAC AAG CGT AAT GTT ACA AAC AAG GAC AAA AAC AGC ACT GCT CCA GAC GAC ATT GGA AAA AAC GGT AAG ATT ACT AAA CGC ACC GAA ACG GTA TAT GAC GAA AAA ACG AAC ATT TTG CAA AAC TTG CAG TTC GAT TTC ATT GAC GAC CCC ACT TAT GAC AAG AAT GTC CTT CTG GTG AAG AAG CAG GGC AGC ATT CAC TCA AAC TTG AAA TTT GAG TCT CAC AAG GAG GAG AAG AAC TCC AAT TGG CTG AAA TAC CCA TCA GAG TAC CAC GTT GAT TTT CAA GTG AAA CGT AAC CGC AAA ACG GAA ATT TTG GAC CAA TTG CCG AAA AAC AAG ATC TCC ACC GCG AAA GTA GAC TCA ACA TTC AGT TAC TCT TCC GGC GGA AAG TTC GAC AGC ACT AAG GGG ATC GGG CGC ACT TCT TCC AAT TCG TAC TCG AAA ACG ATT TCT TAC AAT CAG CAG AAT TAT GAC ACT ATC GCA TCT GGT AAA AAT AAT AAC TGG CAC GTG CAT TGG TCG GTG ATT GCT AAT GAT TTA AAG TAT GGA GGT GAG GTA AAA AAT CGT AAT GAC GAG CTG CTG TTT TAC CGT AAC ACT CGC ATC GCA ACC GTT GAA AAC CCG GAA TTG TCC TTT GCC TCG AAA TAC CGC TAC CCT GCA TTA GTT CGT TCA GGC TTT AAT CCC GAG TTT TTG ACT TAT CTT TCC AAT GAA AAA TCG AAC GAG AAG ACT CAG TTC GAG GTT ACG TAC ACC CGC AAT CAG GAC ATT TTG AAG AAC CGT CCG GGA ATT CAC TAT GCG CCT CCC ATC TTA GAG AAG AAT AAG GAT GGA CAA CGT TTG ATC GTT ACA TAT GAA GTT GAC TGG AAA AAT AAG ACC GTA AAG GTT GTG GAT AAG TAT TCG GAT GAT AAT AAG CCC TAT AAA GAA GGG
CC45 LukA^wt	102	GCG AAC AAA GAT TCT CAG GAC CAG ACC AAA AAG GAG CAC GTA GAC AAG GCC CAG CAA AAA GAG AAG CGT AAT GTG AAC GAC AAA GAT AAG AAT ACT CCG GGG CCA GAT GAT ATC GGC AAG AAC GGT AAA GTC ACG AAG CGT ACA GTG TCT GAG TAT GAC AAA GAA ACA AAC ATC CTG CAG AAC TTA CAA TTC GAC TTT ATT GAT GAT CCA ACT TAC GAT AAG AAT GTG TTG CTG GTT AAG AAA CAA GGT TCA ATC CAT TCT AAC TTG AAG TTC GAG TCA CAC CGT AAC GAA ACG AAC GCG TCG TGG TTG AAA TAT CCG TCA GAG TAT CAT GTT GAT TTT CAA GTA CAA CGT AAT CCC AAA ACG GAA ATT TTG GAC CAA TTA CCT AAA AAT AAG ATT AGC ACC GCC AAG GTT GAC TCA ACT TTC TCC TAC TCA TTA GGA GGA AAG TTC GAT TCG ACA AAA GGG ATC GGG CGT ACA TCT TCG AAT AGC TAC AGT AAG AGC ATT AGC TAT AAC CAG CAG AAC TAT GAT ACG ATT GCT TCA GGG AAA AAT AAC AAC CGT CAC GTA CAT TGG TCA GTG GTT GCG AAC GAT CTT AAA TAT GGA AAC GAG ATT AAG AAT CGT AAC GAC GAA TTT TTG TTT TAC CGC AAT ACA CGC CTT AGT ACC GTG GAA AAT CCC GAG CTG TCC TTC GCG TCG AAG TAT CGC TAT CCG GCC CTT GTG CGT TCG GGT TTC AAT CCC GAG TTC TTA ACA TAT ATT TCC AAT GAG AAA ACT AAC GAC AAG ACT CGC TTC GAA GTC ACC TAC ACT CGC AAC CAG GAC ATT CTG AAA AAC AAG CCT GGA ATT CAT TAC GGG CAA CCA ATT TTA GAG CAG AAT AAG GAT GGA CAG CGC TTT ATT GTG GTA TAT GAG GTG GAC TGG AAG AAT AAG ACA GTA AAA GTT GTG GAA AAG TAC TCT GAC CAG AAT AAG CCC TAT AAA GAA GGA
CC8 LukAΔ10C	111	GCT CAC AAA GAT TCT CAG GAT CAA AAT AAG AAG GAG CAC GTC GAC AAG TCT CAG CAG AAA GAC AAG CGT AAT GTT ACA AAC AAG GAC AAA AAC AGC ACT GCT CCA GAC GAC ATT GGA AAA AAC GGT AAG ATT ACT AAA CGC ACC GAA ACG GTA TAT GAC GAA AAA ACG AAC ATT TTG CAA AAC TTG CAG TTC GAT TTC ATT GAC GAC CCC ACT TAT GAC AAG AAT GTC CTT CTG GTG AAG AAG CAG GGC AGC ATT CAC TCA AAC TTG AAA TTT GAG TCT CAC AAG GAG GAG AAG AAC TCC AAT TGG CTG AAA TAC CCA TCA GAG TAC CAC GTT GAT TTT CAA GTG AAA CGT AAC CGC AAA ACG GAA ATT TTG GAC CAA TTG CCG AAA AAC AAG ATC TCC ACC GCG AAA GTA GAC TCA ACA TTC AGT TAC TCT TCC GGC GGA AAG TTC GAC AGC ACT AAG GGG ATC GGG CGC ACT TCT TCC AAT TCG TAC TCG AAA ACG ATT TCT TAC AAT CAG CAG AAT TAT GAC ACT ATC GCA TCT GGT AAA AAT AAT AAC TGG CAC GTG CAT TGG TCG GTG ATT GCT AAT GAT TTA AAG TAT GGA GGT GAG GTA AAA AAT CGT AAT GAC GAG CTG CTG TTT TAC CGT AAC ACT CGC ATC GCA ACC GTT GAA AAC CCG GAA TTG TCC TTT GCC TCG AAA TAC CGC TAC CCT GCA TTA GTT CGT TCA GGC TTT AAT CCC GAG TTT TTG ACT TAT CTT TCC AAT GAA AAA TCG AAC GAG AAG ACT CAG TTC GAG GTT ACG TAC ACC CGC AAT CAG GAC ATT TTG AAG AAC CGT CCG GGA ATT CAC TAT GCG CCT CCC ATC TTA GAG AAG AAT AAG GAT GGA CAA CGT TTG ATC GTT ACA TAT GAA GTT GAC TGG AAA AAT AAG ACC GTA AAG GTT GTG GAT AAG TAT
CC45 LukAΔ10C	112	GCAAATAAAGACTCTCAAGATCAGACTAAAAAGGAACATGTTGATAAGGCGCAACAAAAAGAAAAGCGTAATGTCAATGATAAGGACAAGAATACTCCGGGACCCGACGACATTGGCAAGAACGGAAAGGTGACAAAGCGTACCGTTAGTGAGTACGACAAGGAAACAAATATCCTGCAGAACTTACAGTTCGATTTTATTGACGATCCTACCTATGACAAGAATGTCCTGTTGGTGAAGAAACAGGGCAGCATTCATTCCAATTTAAAATTTGAAAGCCATCGTAACGAAACAAATGCATCTTGGCTTAAATACCCTTCTGAGTACCACGTAGATTTTCAGGTACAACGCAACCCAAAAACCGAAATTCTGGATCAACTGCCCAAGAATAAAATTTCTACGGCTAAAGTTGACAGTACATTTAGCTACAGTTTAGGGGGAAAGTTTGATAGTACAAAAGGAATTGGTCGTACTTCCAGTAACTCCTATTCGAAATCTATTTCCTATAATCAACAGAATTACGACACCATCGCATCCGGTAAAAACAATAATCGCCACGTACATTGGAGTGTTGTCGCGAATGACTTAAAGTACGGTAACGAAATCAAGAACCGCAACGACGAATTCTTATTCTATCGTAACACGCGTTTAAGCACCGTCGAGAACCCCGAGTTATCCTTTGCTAGCAAATATCGCTATCCTGCGTTAGTACGCTCAGGGTTCAATCCTGAGTTCTTAACCTACATCTCCAACGAGAAAACTAATGATAAGACACGCTTCGAGGTGACCTACACCCGTAATCAGGATATCCTTAAAAATAAACCGGGTATTCATTACGGGCAACCCATTTTAGAACAGAATAAGGACGGCCAACGTTTTATCGTGGTCTATGAGGTTGATTGGAAGAACAAGACAGTGAAAGTGGTTGAAAAGTAT
CC8 LukA W95	103	CATAAAGATTCGCAGGATCAAAATAAGAAGGAGCATGTTGACAAGAGCCAGCAGAAAGACAAGCGCAATGTTACAAACAAAGATAAGAACTCTACAGCGCCCGATGACATTGGTAAGAACGGCAAGATAACTAAGCGGACGGAAACCGTGTATGACGAGAAAACTAACATTCTGCAAAATTTGCAATTTGACTTTATCGACGATCCAACCTATGACAAGAATGTCTTGCTTGTCAAAATGCAAGGTTCGATTCATTCAAACCTTAAATTTGAATCCCACAAAGAGGAGAAAAACTCTAATTGGTTAAAGTATCCTTCAGAATATCACATAGATTTCCAGGTAAAGAGAAACCGTAAAACGGAGATACTGGATCAACTGCCTAAAAACAAGATCTCGACAGCTAAGGTGGACGCTACGTTCTCGTACTCGTCTGGTGGGAAGTTCGACTCGACCAAAGGCATTGGGCGTACATCATCAAATAGCTATTCAAAGACTATTAGCTATAATCAGCAGAACTATGATACGATAGCTTCGGGTAAGAATAACAACTGGCACGTTCATTGGTCGATCATTGCAAATGACTTGAAGTATGGCGGAGAGGTAAAGAATCGCAACGATGAGCTGTTATTCTATCGCAATACGAGAATTGCGACTGTAGAGAACCCGGAATTGTCTTTTGCCTCCAAATATCGGTACCCGGCATTGGTACGCTCTGGTTTCAATCCTGAGTTTTTAACTTACCTTTCCAACGAAAAGAGTAATGAGAAGACCCAATTTGAGGTTACCTACACCCGTAACCAGGATATTTTGAAGAATCGGCCGGGCATCCATTATGCCCCACCAATCCTGGAGAAAAATAAAGACGGTCAGCGGCTTATTGTGACTTACGAGGTCGATTGGAAAAATAAGACGGTCAAGGTAGTGGACAAATATTCTGATGACAATAAACCGTACAAAGCTGGC
CC45 LukA W95	104	GCTAATAAGGACTCCCAGGACCAGACAAAGAAGGAACACGTCGACAAAGCCCAGCAAAAAGAAAAACGCAACGTAAACGATAAGGACAAGAACACCCCAGGACCCGATGATATTGGGAAGAACGGTAAAGTCACAAAACGCACAGTGAGCGAGTACGATAAAGAAACAAATATCCTGCAAAATCTGCAATTTGACTTCATCGATGACCCTACCTATGATAAGAATGTGTTGTTGGTTAAGATGCAGGGAAGTATTCATTCCAACTTGAAATTCGAGAGCCACCGTAACGAAACGAATGCGAGTTGGTTAAAGTACCCTTCAGAATACCACATTGATTTTCAGGTGCAGCGTAACCCGAAAACCGAAATCTTAGACCAGCTGCCTAAAAACAAGATTTCTACGGCCAAGGTGGACGCAACTTTCAGTTATAGTCTTGGAGGAAAGTTCGACAGTACCAAAGGTATCGGCCGCACATCCTCAAACAGCTATTCGAAATCCATTTCTTACAACCAGCAAAATTATGACACGATCGCCTCAGGTAAGAACAACAATCGTCATGTGCATTGGAGCATCGTGGCTAACGATTTGAAATATGGTAACGAAATCAAAAATCGCAATGACGAGTTCTTGTTTTACCGCAATACTCGCCTTTCTACGGTAGAGAATCCTGAGCTTAGCTTTGCGAGCAAGTATCGTTACCCTGCTCTTGTACGTTCGGGTTTCAACCCAGAGTTCCTTACTTATATCTCCAATGAGAAGACGAACGATAAAACCCGTTTTGAAGTTACATACACGCGTAATCAGGACATCTTAAAGAATAAACCGGGGATTCATTATGGGCAGCCGATCTTAGAGCAAAATAAGGATGGACAGCGTTTCATTGTAGTGTATGAGGTTGACTGGAAGAACAAGACGGTAAAAGTAGTTGAAAAGTATTCCGACCAAAACAAGCCTTATAAGGCGGGT
CC8 LukA W97 W72	105	CACAAAGACAGCCAGGATCAAAACAAGAAAGAGCACGTGGACAAGAGCCAGCAAAAGGATAAACGTAACGTTACCAACAAGGACAAAAACAGCACCGCGCCGGACGATATCGGCAAGAACGGCAAAATTACCAAGCGTACCGAGACCGTGTACGATGAAAAAACCAACATCCTGCAGAACCTGCAATTCGACTTTATTGACGATCCGACCTGCGATAAAAACGTGCTGCTGGTTAAGATGCAGGGCAGCATCCACAGCAACCTGAAATTCGAAAGCCACAAAGAGGAAAAGAACAGCAACTGGCTGAAGTACCCGAGCGAGTATCACATTGACTTTCAGGTGAAACGTAACCGTAAGACCGAAATCCTGGATCAACTGCCGAAGAACAAAATTAGCACCGCGAAGGTTTGCGCGACCTTCAGCTACAGCAGCGGTTGCAAATTTGACAGCACCAAGTGCATCGGCCGTACCAGCAGCAACAGCTATAGCAAAACCATCAGCTACAACCAGCAAAACTATGATACCATTGCGAGCGGCAAGAACAACAACTGGCACGTGCACTGGAGCATCATTGCGAACGACCTGAAATACGGTGGCGAGGTTAAGAACCGTAACGATGAACTGCTGTTCTATCGTAACACCCGTATCGCGACCGTGGAGAACCCGGAACTGAGCTTTGCGAGCAAATACCGTTATCCGGCGCTGGTGCGTAGCGGTTTCAACCCGGAGTTTCTGGTTTACCTGAGCAACGAGAAAAGCAACGAAAAGACCCAGTTCGAAGTTACCTACACCCGTAACCAAGACATCCTGAAGAACCGTCCGGGTATCCACTATGCTCCGCCGATTCTGGAGAAGAACAAAGATGGCCAACGTCTGATTGTGACCTATGAAGTTGACTGGAAGAACAAAACCGTTAAAGTGGTTGATAAGTACAGCGACGATAACAAACCGTATAAGGCGGGT
CC45 LukA W97 W72	106	GCAAACAAAGACTCACAAGATCAGACAAAGAAAGAGCATGTAGACAAAGCTCAACAGAAGGAAAAGCGCAATGTGAACGACAAGGATAAAAATACTCCTGGTCCAGATGACATTGGTAAGAATGGTAAAGTTACTAAGCGGACCGTCTCTGAATATGATAAGGAGACAAATATTCTCCAGAATTTGCAATTCGATTTCATTGATGATCCGACGTGCGATAAGAACGTATTGCTCGTTAAAATGCAGGGCTCCATCCATTCGAATCTCAAGTTCGAATCCCATCGCAACGAGACAAACGCTTCCTGGCTCAAATATCCTAGCGAGTATCATATCGACTTCCAAGTTCAACGGAACCCTAAAACTGAAATCCTTGATCAACTCCCTAAGAACAAAATCTCAACTGCCAAGGTCTGTGCCACATTTTCTTATTCTCTTGGCTGCAAATTCGATTCAACAAAGTGTATTGGTCGTACATCAAGTAATAGCTATAGTAAAAGCATCAGTTATAACCAGCAAAACTATGATACAATCGCGTCAGGCAAAAACAATAATCGTCATGTCCATTGGTCCATTGTCGCGAACGACCTTAAGTACGGTAACGAAATTAAGAATCGGAACGATGAGTTTTTGTTCTATCGCAACACCCGTCTGTCTACTGTCGAAAACCCGGAGTTGTCCTTCGCAAGTAAATATCGCTATCCTGCTTTGGTACGTTCTGGGTTTAACCCGGAATTTCTCGTCTACATCAGCAACGAGAAAACAAATGACAAAACGCGCTTTGAAGTCACGTACACACGTAATCAGGACATCTTAAAAAATAAACCAGGGATTCACTATGGTCAGCCAATCTTGGAGCAGAATAAAGACGGCCAGCGTTTCATTGTCGTTTATGAAGTGGACTGGAAAAACAAAACTGTTAAGGTGGTTGAGAAATATTCCGACCAAAACAAACCGTATAAGGCCGGT
CC8 LukB^wt	107	AAAATCAATTCTGAAATTAAGCAAGTGTCCGAAAAAAATTTGGATGGAGACACGAAGATGTATACGCGTACTGCTACGACGTCAGACTCCCAGAAGAACATTACACAGAGTCTGCAATTTAATTTTCTGACAGAACCAAACTATGACAAGGAAACTGTCTTTATTAAGGCTAAAGGGACTATCGGAAGCGGCTTACGCATTTTAGACCCCAACGGTTATTGGAATAGCACGCTGCGCTGGCCGGGCAGTTACTCAGTATCAATCCAAAATGTCGATGATAACAATAACACCAATGTTACCGATTTCGCCCCCAAGAACCAGGATGAATCGCGCGAGGTTAAATACACATACGGCTACAAGACAGGCGGTGACTTTAGCATCAACCGTGGGGGCTTGACAGGGAATATTACTAAGGAATCAAATTATAGTGAGACTATCTCTTATCAACAACCGTCCTATCGTACCTTATTAGACCAGAGTACCTCCCACAAAGGTGTAGGGTGGAAAGTTGAAGCGCACCTGATTAATAATATGGGTCACGATCACACACGCCAACTGACCAACGACAGTGACAACCGCACAAAAAGTGAAATTTTTAGTCTTACCCGTAACGGAAATCTGTGGGCCAAAGACAATTTTACACCGAAAGATAAGATGCCGGTCACTGTATCTGAGGGGTTCAATCCCGAGTTTTTAGCAGTAATGTCGCATGACAAAAAGGACAAAGGGAAATCCCAGTTTGTTGTCCACTATAAGCGTAGCATGGATGAATTCAAAATCGACTGGAACCGTCACGGTTTCTGGGGTTACTGGTCAGGTGAGAACCACGTAGACAAGAAAGAGGAGAAACTGAGCGCATTATATGAGGTTGATTGGAAAACGCACAATGTGAAATTTGTTAAAGTCCTGAATGACAACGAGAAAAAG
CC45 LukB^wt	108	GAAATTAAGTCTAAGATCACAACAGTATCGGAGAAAAACCTGGATGGCGATACTAAGATGTATACACGCACCGCCACTACTTCGGACACGGAGAAGAAGATCTCACAATCGTTACAGTTTAATTTTCTTACAGAACCGAACTACGACAAAGAGACCGTCTTCATTAAAGCTAAAGGTACGATTGGTTCGGGATTAAAAATTCTGAATCCGAATGGCTATTGGAACAGTACCTTACGTTGGCCGGGGTCATATTCTGTATCCATTCAAAACGTGGACGACAATAACAACAGCACCAATGTGACAGATTTCGCTCCAAAGAATCAGGATGAGTCCCGCGAGGTGAAATATACCTATGGGTACAAAACAGGAGGTGACTTTAGCATTAACCGTGGTGGCTTGACTGGTAATATCACGAAGGAAAAAAATTACTCTGAGACTATTTCCTACCAACAGCCGTCGTATCGCACCTTGATCGACCAACCAACGACTAACAAAGGGGTCGCGTGGAAAGTTGAGGCCCACAGTATTAACAATATGGGCCACGATCACACTCGTCAGCTTACTAACGATTCGGATGACCGCGTCAAGTCGGAAATTTTCAGCCTGACGCGTAACGGAAATTTGTGGGCTAAAGACAATTTCACTCCTAAGAACAAGATGCCCGTGACTGTTTCCGAAGGCTTTAATCCCGAATTCTTAGCGGTGATGTCTCATGATAAAAATGATAAAGGAAAATCGCGCTTCATTGTGCATTATAAGCGTTCTATGGACGACTTCAAATTGGATTGGAATAAGCACGGATTCTGGGGGTACTGGTCCGGGGAAAATCACGTAGATCAAAAGGAAGAGAAGTTGTCCGCTTTGTATGAAGTGGACTGGAAGACTCACGACGTTAAGTTGATCAAGACCTTCAATGACAAAGAGAAGAAA
CC8 LukB Val53Leu	109	AAGATCAATTCGGAAATTAAACAGGTAAGTGAGAAAAATTTGGATGGCGATACCAAAATGTACACCCGCACCGCTACCACGTCAGATTCACAAAAAAATATTACACAGTCCTTGCAGTTCAATTTCCTGACAGAACCGAATTACGACAAGGAGACTTTGTTCATTAAAGCCAAGGGAACCATCGGGTCCGGATTGCGTATCTTGGACCCGAACGGATATTGGAACTCGACCTTACGTTGGCCGGGGTCTTACAGTGTTAGTATCCAAAACGTAGATGATAACAATAACACAAACGTGACAGATTTTGCACCTAAAAACCAGGACGAAAGCCGCGAGGTAAAGTACACATATGGGTATAAAACAGGGGGGGACTTTTCCATCAACCGTGGTGGTTTGACCGGGAACATCACCAAAGAGTCAAATTACAGTGAGACCATCAGTTATCAGCAGCCGTCCTATCGTACATTATTGGATCAGTCGACTTCACATAAAGGGGTCGGATGGAAAGTAGAGGCTCATTTGATCAACAACATGGGTCACGATCATACACGTCAGTTAACGAACGATAGCGATAATCGCACGAAGTCAGAAATCTTTAGTCTGACTCGTAACGGTAACTTGTGGGCCAAGGACAATTTCACGCCCAAAGATAAGATGCCTGTGACGGTATCGGAGGGGTTCAATCCAGAATTCCTTGCTGTAATGTCCCATGACAAAAAAGACAAGGGCAAATCGCAATTTGTAGTCCACTATAAGCGTTCTATGGACGAGTTCAAGATTGACTGGAACCGCCACGGCTTCTGGGGGTACTGGAGTGGTGAGAATCATGTGGATAAAAAGGAGGAGAAACTTAGCGCCCTGTATGAGGTAGATTGGAAAACACACAATGTCAAGTTCGTGAAAGTTCTTAATGACAACGAAAAAAAA
CC45 LukB Val53Leu	110	GAGATCAAGAGCAAAATTACCACCGTGAGCGAAAAGAACCTGGACGGTGATACCAAAATGTATACCCGTACCGCGACCACCAGCGACACCGAGAAGAAAATTAGCCAGAGCCTGCAATTCAACTTTCTGACCGAGCCGAACTACGATAAGGAAACCCTGTTCATCAAGGCGAAAGGCACCATTGGTAGCGGCCTGAAAATCCTGAACCCGAACGGTTATTGGAACAGCACCCTGCGTTGGCCGGGTAGCTACAGCGTGAGCATCCAGAACGTTGACGATAACAACAACAGCACCAACGTGACCGACTTCGCGCCGAAGAACCAAGATGAGAGCCGTGAAGTTAAATACACCTATGGTTACAAAACCGGTGGCGACTTTAGCATTAACCGTGGTGGCCTGACCGGCAACATCACCAAGGAGAAAAACTATAGCGAAACCATTAGCTATCAGCAACCGAGCTACCGTACCCTGATCGATCAGCCGACCACCAACAAGGGTGTGGCGTGGAAAGTTGAGGCGCACAGCATTAACAACATGGGCCACGACCACACCCGTCAACTGACCAACGATAGCGACGATCGTGTGAAGAGCGAAATCTTCAGCCTGACCCGTAACGGTAACCTGTGGGCGAAAGACAACTTTACCCCGAAGAACAAAATGCCGGTGACCGTTAGCGAGGGTTTCAACCCGGAATTTCTGGCGGTGATGAGCCACGACAAGAACGATAAGGGCAAAAGCCGTTTCATTGTTCACTACAAACGTAGCATGGACGATTTCAAGCTGGACTGGAACAAACACGGTTTTTGGGGCTATTGGAGCGGCGAGAACCACGTTGATCAGAAAGAGGAGAAACTGAGCGCGCTGTACGAAGTGGACTGGAAGACCCACGATGTTAAGCTGATCAAAACCTTTAACGATAAAGAAAAGAAA

임의의 실시예에서, 본원에 개시되는 면역원성 조성물은 SpA 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 야생형 또는 비-변이체 SpA 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 55 또는 48의 아미노산 서열을 포함하는 SpA A 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 56 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 SpA B 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 57 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는 SpA C 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 서열번호 58 또는 51의 아미노산 서열을 포함하는 SpA D 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 서열번호 59 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 SpA E 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 SpA IgG 도메인 중 적어도 2개, SpA IgG 도메인 중 적어도 3개, SpA IgG 도메인 중 적어도 4개, 또는 SpA IgG 도메인 중 5개 모두를 포함하는 SpA 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 53의 아미노산 서열 또는 서열번호 53과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 SpA 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 변이체 E, D, A, B, 및/또는 C 도메인을 암호화화며, 이는 서열번호 55 또는 48, 서열번호 56 또는 49, 서열번호 57 또는 50, 서열번호 58 또는 51, 및 서열번호 59 또는 52와 각각 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 한다. 예시적인 변이체 E, D, A, B, 및 C SpA 도메인은 전술한 바와 같다.

임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 59의 아미노산 위치 6, 7, 33, 및/또는 34에서의 치환을 포함하는 변이체 E 도메인을 갖는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 58의 아미노산 위치 9, 10, 36, 및/또는 37에서 치환을 포함하는 변이체 D 도메인을 갖는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 55의 아미노산 위치 7, 8, 34, 및/또는 35에서의 치환을 포함하는 변이체 A 도메인을 갖는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 56의 아미노산 위치 7, 8, 34, 및/또는 35에서 치환을 포함하는 변이체 B 도메인을 갖는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 57의 아미노산 위치 7, 8, 34, 및/또는 35에서 치환을 포함하는 변이체 C 도메인을 갖는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 53 또는 72와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%(100%는 아님)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 53 또는 72 또는 이의 단편과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 SpA 도메인 D에서, 또는 다른 SpA IgG 도메인에서 대응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화하며, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환은 IgG Fc에 대한 SpA 변이체 폴리펩티드의 결합을 파괴하거나 감소시킨다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 V_H3에 대한 결합을 파괴하거나 감소시키는, D 도메인의 V_H3 결합 하위-도메인에서, 또는 다른 IgG 도메인에서의 대응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 변이체 A 도메인, 예를 들어 서열번호 62, 67, 88, 또는 93의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 A 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 변이체 B 도메인, 예를 들어 서열번호 63, 68, 89, 또는 94의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 B 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 변이체 C 도메인, 예를 들어 서열번호 64, 69, 90 또는 95의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 C 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 변이체 D 도메인, 예를 들어 서열번호 66, 71, 91, 또는 96의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 D 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 변이체 E 도메인, 예를 들어 서열번호 65, 70, 92, 또는 97의 아미노산 서열을 포함하는 변이체 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 62 또는 67, 서열번호 63 또는 68, 서열번호 64 또는 69, 서열번호 66 또는 71, 및 서열번호 65 또는 70과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 A, B, C, D, 및 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 88 또는 93, 서열번호 89 또는 94, 서열번호 90 또는 95, 서열번호 91 또는 96, 및 서열번호 92 또는 97과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 A, B, C, D, 및 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 변이체 D 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화하며, 여기서 변이체 D 도메인은 서열번호 58의 위치 9, 10 및/또는 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 다음을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다: (i) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 각각의 SpA A-E 도메인에서의 글루타민 아미노산 잔기에 대한 리신 치환; 및 (ii) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 각각의 SpA A-E 도메인에서의 세린 아미노산 잔기에 대한 글루타메이트 치환. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 SpA E 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 SpA D 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 SpA A 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 63의 아미노산 서열을 갖는 SpA B 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 SpA C 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 (i) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 각각의 SpA A-E 도메인에서의 글루타민 아미노산 잔기에 대한 리신 치환; 및 (ii) SpA D 도메인(서열번호 58)의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 각각의 SpA A-E 도메인에서의 세린 아미노산 잔기에 대한 트레오닌 치환을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 SpA E 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 SpA D 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 SpA A 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 SpA B 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 SpA C 도메인을 암호화한다. 임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물의 폴리뉴클레오티드는 변이체 A, B, C, D, 및/또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다. 임의의 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 암호화한다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 S. 아우레우스(S. aureus) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 코돈-최적화 방법은 공지되어 있고 이전에 기술되었다(예를 들어, Seed의 국제 특허 출원 공개번호 WO1996/09378, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 비-선호 코돈이 더 선호되는 코돈으로 대체되는 경우, 서열은 코돈 최적화된 것으로 간주된다. 여기에서, 비-선호 코돈은 동일한 아미노산에 대해 코딩하는 다른 코돈보다 유기체에서 덜 빈번하게 사용되는 코돈이고, 더 선호되는 코돈은 비-선호 코돈보다 유기체에서 더 빈번하게 사용되는 코돈이다. 특이적 유기체에 대한 코돈 사용 빈도는 당 기술분야에 잘 알려져 있고 이용 가능한 코돈 빈도 표에서 확인할 수 있다. 바람직하게는, 하나 초과의 비-선호 코돈, 예를 들어, 10%, 40%, 60%, 80% 초과의 비-선호 코돈, 바람직하게는 대부분 (예를 들어, 적어도 90%) 또는 모든 비-선호 코돈은, 더 선호되는 코돈으로 대체된다. 바람직하게는, 유기체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 코돈 최적화된 서열에 사용된다. 바람직한 코돈에 의한 대체는 일반적으로 더 높은 발현을 초래한다.

본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 서열은 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 클로닝되거나, DNA 합성에 의해 새롭게 생성될 수 있으며, 이는 DNA 합성 및/또는 분자 클로닝 분야에서 사업을 하는 서비스 회사(예를 들어, GeneArt, GenScript, Invitrogen, Eurofins)에 의한 통상적인 절차를 사용하여 수행될 수 있다.

일부 실시예에서, 전술한 핵산 분자는 벡터, 예를 들어, 본원에 기술된 면역원성 조성물에 사용하기 위한 발현 벡터에 삽입된다. 대안적으로, 이들 핵산 분자는 본원에 개시된 암호화된 SpA 폴리펩티드, LukA 변이체 폴리펩티드, LukB 단백질, 또는 LukAB 복합체(안정적인 이종이량체로서)의 발현 및 단리를 위해 적절한 숙주 세포 내로 형질전환되거나 형질감염되는 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다.

본 개시내용의 이러한 측면에 따르면, 본원에 기술된 S. 아우레우스(S. aureus) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 발현 벡터 내로 통합될 수 있다. 적절한 발현 벡터는 이러한 벡터에 의해 암호화된 폴리펩티드의 발현을 제어, 조절, 유발 또는 허용하는 핵산 서열 요소를 포함한다. 이러한 요소는 전사 인핸서 결합 부위, RNA 중합효소 개시 부위, 리보솜 결합 부위, 및 주어진 발현 시스템에서 암호화된 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하는 다른 부위를 포함할 수 있다. 적절한 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 선형 핵산, 및 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

일 실시예에서, 발현 벡터는 원형 플라스미드이다(예를 들어, Muthumani 등의 “Optimized and Enhanced DNA Plasmid Vector Based In vivo Construction of a Neutralizing anti-HIV-1 Envelope Glycoprotein Fab,” Hum. Vaccin. Immunother. 9: 2253-2262 (2013) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 플라스미드는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체 외로 존재할 수 있다(예를 들어, 복제 원점을 갖는 자가 복제 플라스미드). 예시적인 플라스미드는, 제한 없이, pCEP4, pREP4, pVAX, pcDNA3.0, provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 변이체 LukA 및/또는 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 발현 벡터는 선형 발현 카세트(“LEC”)이다. LEC는 전기천공을 통해 대상체에게 효율적으로 전달되어 본원에 기술된 재조합 핵산 분자에 의해 암호화된 SpA, LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드를 발현할 수 있다. LEC는 인산염 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. 일 실시예에서, LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 골격을 함유하지 않는다. 또 다른 실시예에서, LEC는 원하는 유전자 발현과 무관한 다른 핵산 서열을 함유하지 않는다.

LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 본원에 기술된 재조합 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 예시적인 플라스미드는, 제한 없이, pNP(Puerto Rico/34), pM2(New Caledonia/99), WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 재조합 핵산 서열 작제물에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터를 포함한다.

또 다른 실시예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 폴리펩티드를 발현할 수 있는 적절한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, Krause 등, “Delivery of Antigens by Viral Vectors for Vaccination,” Ther. Deliv. 2(1):51-70 (2011); Ura 등, “Developments in Viral Vector-Based Vaccines,” Vaccines 2: 624-641 (2014); Buning 등, "Recent Developments in Adeno- associated Virus Vector Technology," J. Gene Med. 10:717-733 (2008), 참조, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 렌티바이러스 벡터(예를 들어., Ura 등, “Developments in Viral Vector-Based Vaccines,” Vaccines 2: 624-641 (2014); 및 Hu 등, “Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infection Diseases,” Immunol. Rev. 239: 45-61 (2011)참조, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 레트로바이러스 벡터(예를 들어, Ura 등, “Developments in Viral Vector-Based Vaccines,” Vaccines 2: 624-641 (2014)참조, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 우두바이러스, 복제 결핍성 아데노바이러스 벡터, 및 거트리스 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 미국 특허 번호 5,872,005, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)를 포함한다. 벡터로서 사용하기에 적합한 아데노-연관 바이러스(AAV)를 생성하고 단리하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Grieger & Samulski, "Adeno-associated Virus as a Gene Therapy Vector: Vector Development, Production and Clinical Applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145 (2005); Buning 등, "Recent Developments in Adeno- associated Virus Vector Technology," J. Gene Med. 10:717-733 (2008) 참조, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).

본원에 기술된 SpA, LukA 및/또는 LukB 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 최대 발현을 달성하기 위해 발현 벡터 작제물에서 프로모터, 번역 개시, 3’ 미번역 영역, 폴리아데닐화, 및 전사 종결의 서열과 조합된다. 본원에 기술된 폴리펩티드의 발현을 유도하기에 적합한 프로모터 서열은 제한 없이, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 극초기 유전자 프로모터(CMV), 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), 거대세포바이러스 인핸서/닭 베타-액틴 프로모터(CAG), 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), 트랜스티레틴 프로모터(TTR), 시미안 바이러스 40 프로모터(SV40) 및 CK6 프로모터를 포함한다. 당 기술분야에 공지된 숙주 세포에서 유전자 발현을 유도하기에 적합한 다른 프로모터도 본원에 개시된 발현 작제물에 혼입하기에 적합하다.

본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기술된 S. 아우레우스(S. aureus) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에 기술된 SpA, LukA, 및 LukB 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 발현 작제물은 숙주 세포 내로 공동 형질감염되거나, 연속 형질감염되거나, 별도로 형질감염될 수 있다. 적합한 숙주 세포는, 당 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 제한 없이, 일차 세포, 세포주의 세포, 혼합 세포주, 불멸화 세포 모집단, 또는 불멸화 세포들의 클론 모집단을 포함한다(예를 들어, Ausubel 등, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^ndEdition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan 등, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan 등, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 이들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 이러한 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 고세균 세포일 수 있다.

일부 실시예에서, 본원에 기술된 S. 아우레우스(S. aureus) 폴리뉴클레오티드에 적합한 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 적절한 박테리아 숙주 세포는, 제한 없이, 에스케리치아(Escherichia) 숙주 세포, 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포, 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 숙주 세포, 스트렙토미세스(Streptomyces) 숙주 세포, 미코박테륨(Mycobacterium) 숙주 세포, 및 바실루스(Bacillus) 숙주 세포를 포함한다. 임의의 실시예에서, 숙주 세포는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 숙주 세포이다. 임의의 실시예에서, 숙주 세포는 S. 아우레우스(S. aureus) 숙주 세포이다.

일부 실시예에서, 본원에 기술된 S. 아우레우스(S. aureus) 폴리뉴클레오티드에 적합한 숙주 세포는 진핵 세포이다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원일 수 있다. 포유동물 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0 (ATCC(American Type Culture Collection)), 마나사스, 버지니아, CRL-1581), NSO (ECACC(European Collection of Cell Cultures)), 솔즈베리, 윌트셔, 영국, ECACC 번호 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 쥣과 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 CHO-K1SV(Lonza Biologics, 워커스빌, 메디슨), CHO-K1(ATCC CRL-61) 또는 DG44와 같은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 유래된 것들을 포함한다.

본원에 기술된 SpA, LukA, 및 LukB 폴리펩티드는 전술한 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 다양한 기술 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 단백질은 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 단백질 또는 폴리펩티드를 회수하는 데 일반적으로 사용되는 표준 클로닝 및 세포 배양 기술에 의해 생산된다. 숙주 세포를 형질감염시키는 것은, 예를 들어 전기천공, 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등에 의해, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 데 일반적으로 사용되는 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.

본원에 기술된 폴리펩티드는 당질화, 이성질체화, 탈당질화 또는 비-자연 발생 공유 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티의 첨가(pegylation) 및 지질화 과정에 의해 번역-후 변형될 수 있다. 이러한 변형은 생체 내 또는 시험관 내에서 발생할 수 있다.

일부 실시예에서, 본원에 기술된 SpA, LukA, 및 LukB 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드는 바람직하게는 “단리된” 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드이다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 설명하는 데 사용될 때, “단리된”은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 그의 생산 환경의 성분으로부터 식별, 분리 및/또는 회수되었음을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 그의 생산 환경으로부터 다른 성분과 결합되지 않는다. 재조합 형질감염된 세포로부터 발생하는 것과 같은, 그의 생산 환경의 오염 성분은 일반적으로 약학적 사용을 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양으로부터 회수되고 정제된다. 고성능 액체 크로마토그래피(“HPLC”)가 정제에 사용될 수도 있다.

면역원성 조성물의 애쥬번트

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “애쥬번트(adjuvant)”는 본원에 기술된 면역원성 조성물과 함께 또는 이의 일부로서 투여될 때 SpA 폴리펩티드, LukA 폴리펩티드, LukB 폴리펩티드, 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 증강, 강화 및/또는 부스팅시키는 화합물을 지칭한다. 그러나, 애쥬번트 화합물이 단독으로 투여될 때, 이는 전술한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 생성하지 않는다. 애쥬번트는, 예를 들어, 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 항원 제시 세포의 자극을 포함하는 여러 메커니즘에 의해 면역 반응을 향상시킬 수 있다.

SpA, LukA, 및 LukB 폴리펩티드 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물은 애쥬번트를 포함하거나 애쥬번트와 병용하여 투여된다. 본 발명의 면역원성 조성물과 병용하여 투여하기 위한 애쥬번트는 면역원성 조성물의 투여 전, 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다.

애쥬번트의 구체적인 예는, 알루미늄 염 (alum) (예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄, 및 산화 알루미늄, 예로 명반 또는 nanoalum 제형을 포함하는 나노입자), 인산칼슘(예를 들어, Masson JD 등, Expert Rev Vaccines 16: 289-299 (2017), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL) (예를 들어, 영국 특허 GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), AS01, AS02, AS03 및 AS04 (예를 들어, EP1126876, US7357936 (AS04의 경우), EP0671948, EP0761231, US5750110 (AS02의 경우) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 이미다조피리딘 화합물(WO2007/109812 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 이미다조퀴녹살린 화합물(WO2007/109813 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 델타-이눌린(예를 들어, Petrovsky N and PD Cooper, Vaccine 33: 5920-5926 (2015), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), STING-활성화 합성 환형-디-뉴클레오티드(예를 들어, US20150056224, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 레시틴 및 카보머 동종중합체의 조합 (예를 들어 US6676958), 및 사포닌, 예컨대 Quil A 및 QS21(예를 들어 Zhu D and W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 선택적으로 QS7 (Kensil 등, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US 5,057,540 참조, 이들은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)과 조합하여 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 프로인드 애쥬번트(완전 또는 불완전)이다. 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 Quil-A, 예를 들어, Brenntag(현재의 Croda) 또는 Invivogen으로부터 상업적으로 수득할 수 있는 것을 포함한다. QuilA는 키라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 몰리나 나무에서 추출 가능한 사포닌 분획을 함유하고 있다. 이들 사포닌은 일반적인 트리테르페노이드 골격 구조를 갖는, 트리테르페노이드 사포닌 군에 속한다. 사포닌은 T-의존적 항원뿐만 아니라 T-독립적 항원에 대한 강한 애쥬번트 반응뿐만 아니라, 강력한 세포독성 CD8+ 림프구 반응을 유도하고 점막 항원에 대한 반응을 강화하는 것으로 알려져 있다. 이들은 또한 콜레스테롤 및 인지질과 조합되어 면역자극 복합체(ISCOM, immunostimulatory complexe)를 형성할 수 있으며, 여기서 QuilA 애쥬번트는 상이한 기원으로부터의 광범위한 항원에 대한 항체-매개 및 세포-매개 면역 반응 둘 모두를 활성화시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 애쥬번트는 AS01, 예를 들어 AS01B이다. AS01은 MPL(3-O-데스아실-4’-모노포스포릴 지질 A), QS21(키라야 사포나리아 몰리나, 분획 21), 및 리포솜을 함유하는 애쥬번트 시스템이다. 특정 실시예에서, AS01은 상업적으로 이용 가능하거나 WO 96/33739에 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 특정 애쥬번트는 유화액을 포함하며, 이는 예를 들어 오일과 물의, 2개의 불혼화성 유체의 혼합물이며, 이들 중 하나는 다른 하나의 내부에 작은 방울로서 현탁되고 표면 활성제에 의해 안정화된다. 수중유 유화액은 오일의 작은 액적을 둘러싸는, 연속 상을 형성하는 물을 가지는 반면, 유중수 유화액은 연속 상을 형성하는 오일을 갖는다. 특정 수중유 유화액은 스쿠알렌(대사 가능한 오일)을 포함한다. 특정 애쥬번트는 블록 공중합체를 포함하며, 이는 2개의 단량체가 함께 클러스터링되고 반복 단위의 블록을 형성할 때 형성된 공중합체이다. 블록 공중합체, 스쿠알렌 및 미세미립자형 안정화제를 포함하는 유중수 유화액의 예는 TiterMax®이며, 이는 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 입수할 수 있다.

선택적으로, 유화액은 TLR4 작용제와 같은, 추가 면역자극 성분과 조합되거나 이를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 조성물에 사용하기 위한 애쥬번트 조합의 적절한, 그러나 비제한적인 예는, MF59(예를 들어 EP0399843, US 6299884, US6451325 참조) 및 AS03에서도 사용되는 수중유 유화액(예컨대 스쿠알렌 또는 땅콩 오일)을 포함하며, 선택적으로, 면역 자극제, 예를 들어 AS02에서와 같은 모노포스포릴 지질 A 및/또는 QS21와 조합된다(Stoute 등, 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 애쥬번트의 추가 예는, AS01E 및 AS01B에서와 같은, MPL 및 QS21과 같은 면역 자극제를 함유하는 리포솜이다(예를 들어, US 2011/0206758, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 애쥬번트의 다른 예는 CpG 및 이미다조퀴놀린(예를 들어 이미퀴모드 및 R848)이다(예를 들어, Reed G, 등, 2013, Nature Med, 19: 1597-1608 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 본 발명에 따른 특정 바람직한 실시예에서, 애쥬번트는 Th1 애쥬번트이다.

임의의 실시예에서, 애쥬번트는 사포닌, 바람직하게는 키라야 사포나리아로부터 수득된 사포닌의 수-추출성 분획을 포함한다. 특정 실시예에서, 애쥬번트는 QS-21을 포함한다.

임의의 실시예에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 애쥬번트는 톨-유사 수용체 4(TLR4) 작용제를 단독으로 또는 또 다른 애쥬번트와 조합하여 함유한다. TLR4 작용제는 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Ireton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807을 참조하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 임의의 실시예에서, 애쥬번트는 지질 A, 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 TLR4 작용제이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “지질 A”는 글루코사민을 포함하고, 그램-음성 세균의 외막의 외엽 내에 LPS 분자를 고정시키는, 케토시드 결합을 통해 LPS 분자의 내부 코어에서 케토-데옥시옥툴로소네이트에 연결되는 LPS 분자의 소수성 지질 모이어티를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 지질 A는 자연적으로 발생하는 지질 A, 이의 혼합물, 유사체, 유도체 및 전구체를 포함한다. 상기 용어는 단당류, 예를 들어, 지질 X로 지칭되는 지질 A의 전구체; 이당류 지질 A; 헵타-아실 지질 A; 헥사-아실 지질 A; 펜타-아실 지질 A; 예를 들어, 지질 IVA로서 지칭되는, 지질 A의 테트라-아실 전구체, 테트라-아실 지질 A; 디포스포릴 지질 A; 모노포스포릴 지질 A; 디포스포릴 지질 A, 예컨대 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 및 로도박터 세파에로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 지질 A를 포함한다. 몇몇 면역 활성화 지질 A 구조는 6개의 아실 사슬을 함유한다. 글루코사민 당에 직접 부착된 4개의 일차 아실 사슬은 일반적으로 10 내지 16개의 탄소 길이인 3-히드록시 아실 사슬이다. 2개의 추가 아실 사슬은 종종 일차 아실 사슬의 3-히드록시기에 부착된다. 예로서, E. 콜리(E. coli) 지질 A는 일반적으로 당에 부착된 4개의 C14 3-히드록시 아실 사슬 및 2’ 및 3’ 위치에서 일차 아실 사슬의 3-히드록시 기에 부착된 1개의 C12 및 1개의 C14를 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “지질 A 유사체 또는 유도체”는 지질 A의 구조 및 면역학적 활성과 유사하지만, 자연에서 반드시 자연적으로 발생하는 것은 아닌 분자를 지칭한다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 단축되거나 축합되고/되거나, 위치 4’에서 인산염 대신 갈락투론산 모이어티를 가지도록, 환원 말단에서 글루코사민-1-포스페이트 대신 2-데옥시-2-아미노글루콘산을 함유하도록, 또 다른 아민 당 잔기, 예를 들어 갈락토사민 잔기로 치환된 이들의 글루코사민 잔기를 갖도록 변형될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어, 화학적 유도에 의해, 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조되거나, 예를 들어, 선호되는 지질 A의 구조를 먼저 결정하고 이의 유사체 또는 유도체를 합성함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 또한 TLR4 작용제 애쥬번트로서 유용하다(예를 들어 Gregg KA 등, 2017, MBio 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).

예를 들어, 지질 A 유사체 또는 유도체는 야생형 지질 A 분자의 탈아실화에 의해, 예를 들어 알칼리 처리에 의해 수득될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조될 수 있다. 이러한 분자는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체의 또 다른 예는 지질 A 생합성 및/또는 지질 A 변형에 관여하는 효소의 돌연변이, 또는 결실 또는 삽입을 보유하는 박테리아 세포로부터 단리된 지질 A 분자이다.

MPL 및 3D-MPL은 지질 A 독성을 약화시키도록 변형된 지질 A 유사체 또는 유도체이다. 지질 A, MPL, 및 3D-MPL은 긴 지방산 사슬이 부착되는 당 골격을 가지며, 여기서 골격은 글리코시드 연결에서 2개의 6-탄소 당을 함유하고, 4 위치에서 포스포릴 모이어티를 함유한다. 통상적으로, 5 내지 8개의 장쇄 지방산(일반적으로 12 내지 14개의 탄소 원자)이 당 골격에 부착된다. 천연 공급원의 유도체화로 인해, MPL 또는 3D-MPL은 다양한 지방산 길이를 가지면서, 다수의 지방산 치환 패턴, 예를 들어 헵타-아실, 헥사-아실, 펜타-아실 등의 복합물 또는 혼합물로서 존재할 수 있다. 이는 본원에 기술된 다른 지질 A 유사체 또는 유도체 중 일부에 대해서도 사실이지만, 합성 지질 A 변이체가 정의되고 균질할 수도 있다. MPL 및 이의 제조는, 예를 들어 US 4,436,727에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 3D-MPL은, 예를 들어 US 4,912,094B1(그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 기술되어 있고, 위치 3에서 환원-말단 글루코사민에 연결된 에스테르인 3-히드록시미리스트 아실 잔기의 선택적 제거에 의해 MPL과 상이하다. 본원에 기술된 면역원성 조성물에 포함시키기에 적합한 지질 A(유사체, 유도체)의 예는 MPL, 3D-MPL, RC529(예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 EP1385541), PET-지질 A, GLA(글리코피라노실 지질 애쥬번트, 합성 이당류 당지질; 예를 들어 US20100310602 및 US8722064 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), SLA(예를 들어 Carter D 등, 2016, Clin. Transl. Immunology. 5: e108 (doi:10.1038/cti.2016.63) 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합되고, 인간 백신에 대한 TLR4 리간드를 최적화하기 위한 구조-기능 접근법을 기술함), PHAD (인산화 헥사아실 이당류; 그 구조가 GLA와 동일함), 3D-PHAD, 3D-(6-아실)-PHAD(3D(6A)-PHAD)(PHAD, 3D-PHAD, 및 3D(6A)PHAD는 합성 지질 A 변이체임, 이는 또한 이러한 분자의 구조를 제공함), E6020(CAS 번호 287180-63-6), ONO4007, OM-174 등을 포함한다. 특정 바람직한 실시예에서, TLR4 작용제 애쥬번트는 3D-MPL, GLA, 또는 SLA로부터 선택된 지질 A 유사체 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시예에서, 지질 A 유사체 또는 유도체는 리포솜으로 제형화된다.

바람직하게는 TLR4 작용제를 포함하는, 애쥬번트는, 다양한 방식으로, 예를 들어, 유화액, 예컨대 유중수(w/o) 유화액 또는 수중유(o/w) 유화액(예는 MF59, AS03임), 안정적 (나노-)유화액 (SE), 지질 현탁액, 리포솜, (중합체) 나노입자, 비로솜, 흡착된 명반, 수성 제형(AF), 기타 등등으로 제형화될 수 있어서, 애쥬번트의 면역조절 분자 및/또는 면역원에 대한 다양한 전달 시스템을 나타낸다(예를 들어 Reed 등, 2013, 전술됨; 및 Alving CR 등, 2012, Curr Opin Immunol 24: 310-315 참조, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).

임의의 실시예에서, 면역자극 TLR4 작용제는 선택적으로 다른 면역조절 성분, 예컨대 스쿠알렌 수중유 유화액(SE)(예를 들어MF59; AS03); 사포닌(예를 들어 QuilA, QS7, QS21, 매트릭스 M, 이소콤, 이소코매트릭스, 등); 알루미늄 염; 다른 TLR에 대한 활성화제(예를 들어 이미다조퀴놀린, 편모, dsRNA 유사체, TLR9 작용제, 예를 들어 CpG 등); 등(예를 들어 Reed 등, 2013, 전술됨)과 조합될 수 있다.

임의의 실시예에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 애쥬번트는 안정한 유화액으로서 제형화된, TLR4 작용제, 예를 들어, GLA의 조합 (즉, GLA-SE)이다. GLA-SE에 사용되는 안정한 유화액은 수중유 유화액이며, 여기서 오일은 스쿠알렌이다(예를 들어, WO2013/119856 참조). 임의의 실시예에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물의 애쥬번트는 사포닌과 조합된, TLR4 작용제, 예를 들어, GLA의 조합(예를 들어, GLS-QS21)이다. 임의의 실시예에서, 전술한 애쥬번트는 리포솜으로서 제형화될 수 있다. 따라서, 예시적인 애쥬번트는 또한, 리포솜으로 제형화된, 합성 TLR4 작용제(예를 들어, MPL [GLA]) 및 사포닌(예를 들어, QS21)을 포함하는, GLA-LSQ를 포함한다.

지질 A 유사체 또는 유도체를 포함하는 본원에 기술된 면역원성 조성물에 사용하기 위한 추가적인 예시적인 애쥬번트는 SLA-SE(합성 MPL [SLA], 스쿠알렌 오일/물 유화액), SLA- Nanoalum(합성 MPL [SLA], 알루미늄 염), GLA-Nanoalum(합성 MPL [GLA], 알루미늄 염), SLA-AF(합성 MPL [SLA], 수성 현탁액), GLA-AF(합성 MPL [GLA], 수성 현탁액,), SLA-alum(합성 MPL [SLA], 알루미늄 염), GLA-alum(합성 MPL [GLA], 알루미늄 염), AS01(MPL, QS21, 리포솜), AS02(MPL, QS21, 오일/물 유화액), AS25(MPL, 오일/물 유화액), AS04(MPL, 알루미늄 염), 및 AS15(MPL, QS21, CpG, 리포솜)을 포함한다. 예를 들어, 다음을 참조한다: WO2008/153541; WO2010/141861; WO2013/119856; WO2019/051149; WO 2013/119856; WO 2006/116423; 미국특허 4,987,237; 미국특허 4,436,727; 미국특허 4,877,611; 미국특허 4,866,034; 미국특허 4,912,094; 미국특허 4,987,237; 미국특허 5,191,072; 미국특허 5,593,969; 미국특허 6,759,241; 미국특허 9,017,698; 미국특허 9,149,521; 미국특허 9,149,522; 미국특허 9,415,097; 미국특허 9,415,101; 미국특허 9,504,743; Reed G, 등, 2013, 전술됨, Johnson 등, 1999, J Med Chem, 42:4640-4649, 및 Ulrich and Myers, 1995, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell and Newman, Eds.; Plenum: New York, 495-524, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

S. 아우레우스( S. aureus ) 면역원성 조성물 및 사용 방법

일 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 본원에 기술된 SpA 폴리펩티드 및 LukA 변이체 폴리펩티드 중 임의의 하나 이상, 또는 본원에 기술된 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 다른 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 본원에 기술된 SpA 폴리펩티드 및 LukB 변이체 폴리펩티드 중 임의의 하나 이상, 또는 본원에 기술된 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 본원에 기술된 SpA 폴리펩티드, LukA 변이체 폴리펩티드, 및 LukB 폴리펩티드 중 임의의 하나 이상, 또는 본원에 기술된 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물은 하나 이상의 SpA 폴리펩티드(변이체 또는 비변이체), CC45 LukA 변이체 폴리펩티드, CC45 LukB 폴리펩티드(변이체 또는 비변이체), 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 면역원성 조성물은 SpA 변이체 폴리펩티드, CC45 LukA 변이체 폴리펩티드, CC45 LukB 비변이체 폴리펩티드 또는 본원에 기술된 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 실시예에 따른 예시적인 면역원성 조성물은 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 글루타메이트 치환을 갖는다. 예시적인 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 2의 위치 81에 대응하는 아미노산 위치에서 리신에서 메티오닌으로의 치환, 서열번호 2의 위치 139에 대응하는 아미노산 위치에서 세린에서 알라닌으로의 치환, 서열번호 2의 위치 111 및 191에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 이소류신으로의 치환, 및 서열번호 2의 위치 321에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 조성물은 CC45 LukB 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 16의 폴리펩티드, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.

전술한 실시예에 따른 다른 예시적인 면역원성 조성물은 SpA 변이체 폴리펩티드, CC45 LukA 변이체 폴리펩티드 e, CC45 LukB 변이체 폴리펩티드 또는 본원에 기술된 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 면역원성 조성물은 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 글루타메이트 치환을 갖는다. 예시적인 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 2의 위치 81에 대응하는 아미노산 위치에서 리신에서 메티오닌으로의 치환, 서열번호 2의 위치 139에 대응하는 아미노산 위치에서 세린에서 알라닌으로의 치환, 서열번호 2의 위치 111 및 191에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 이소류신으로의 치환, 및 서열번호 2의 위치 321에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 조성물은 서열번호 16에서 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 실시예에 따른 다른 면역원성 조성물은 서열번호 60의 서열, 또는 서열번호 60과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호2의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, CC45 LukB 변이체 서열은 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 6의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 8의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 10의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 11의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 12의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB와 조합된 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB와 조합된 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB와 조합된 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체와 조합된 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukA 변이체를 포함한다.

다른 실시예에서, 면역원성 조성물은 SpA 폴리펩티드, CC8 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 CC8 LukB 폴리펩티드(변이체 또는 비변이체), 또는 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 SpA 변이체 폴리펩티드, CC8 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 CC8 LukB 폴리펩티드 또는 본원에 기술된 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 조성물은 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 글루타메이트 치환을 갖는다. 예시적인 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서 리신에서 메티오닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서 세린에서 알라닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 이소류신으로의 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 CC8 LukB 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 15의 폴리펩티드, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.

본 실시예에 따른 다른 면역원성 조성물은 SpA 변이체 폴리펩티드, CC8 LukA 변이체 폴리펩티드, CC8 LukB 변이체 폴리펩티드 또는 본원에 개시된 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 면역원성 조성물은 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 글루타메이트 치환을 갖는다. 예시적인 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서 리신에서 메티오닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서 세린에서 알라닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 이소류신으로의 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 15의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 실시예에 따른 다른 면역원성 조성물은 서열번호 60의 서열, 또는 서열번호 60과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, CC8 LukB 서열 변이체 서열은 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19, 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열과 조합된 서열번호 5의 CC8 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 7의 CC8 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19, 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 9의 CC8 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19, 및 21로부터 선택된 CC8 LukB 변이체 서열을 포함한다.

다른 실시예에서, 면역원성 조성물은 SpA 폴리펩티드(변이체 또는 비변이체), CC8 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 CC45 LukB 폴리펩티드(변이체 또는 비변이체) 또는 본원에 개시된 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 SpA 변이체 폴리펩티드, CC8 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 CC45 LukB 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 실시예에 따른 예시적인 면역원성 조성물은 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 글루타메이트 치환을 갖는다. 예시적인 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서 리신에서 메티오닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서 세린에서 알라닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 이소류신으로의 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 CC45 LukB 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 16의 폴리펩티드, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.

본 실시예에 따른 다른 면역원성 조성물은 SpA 변이체 폴리펩티드, CC8 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드 또는 본원에 개시된 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 실시예에 따른 예시적인 면역원성 조성물은 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 글루타메이트 치환을 갖는다. 예시적인 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서 리신에서 메티오닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서 세린에서 알라닌으로의 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 이소류신으로의 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 16에서 Val53Leu에 대응하는 아미노산 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열, 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 실시예에 따른 다른 면역원성 조성물은 서열번호 60의 서열을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드, 또는 서열번호 60과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 서열번호 1의 CC8 LukA 변이체, 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, CC45 LukB 변이체 서열은 서열번호 18, 20 및 22로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 3의 CC8 LukA 변이체, 및 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 5의 CC8 LukA 변이체, 및 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 7의 CC8 LukA 변이체, 및 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 9의 CC8 LukA 변이체, 및 서열번호 16의 CC45 LukB 서열 또는 서열번호 16의 CC45 LukB와 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 18, 20, 및 22로부터 선택된 CC45 LukB 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CC8 LukA 변이체 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CC45 LukB 변이체를 포함한다.

다른 실시예에서, 면역원성 조성물은 SpA 폴리펩티드(변이체 또는 비변이체), CC45 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 CC8 LukB 폴리펩티드(변이체 또는 비변이체), 또는 본원에 개시된 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 면역원성 조성물은 SpA 변이체 폴리펩티드, CC45 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 CC8 LukB 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예시적인 면역원성 조성물은 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서 글루타메이트 치환을 갖는다. 예시적인 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 조성물은 서열번호 2의 위치 81에 대응하는 아미노산 위치에서 리신에서 메티오닌으로의 치환, 서열번호 2의 위치 139에 대응하는 아미노산 위치에서 세린에서 알라닌으로의 치환, 서열번호 2의 위치 111 및 191에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 이소류신으로의 치환, 및 서열번호 2의 위치 321에 대응하는 아미노산 위치에서 글루탐산에서 알라닌으로의 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 조성물은 CC8 LukB 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 15의 LukB 폴리펩티드, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 대안적으로, 조성물은 위치 서열번호 15의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 실시예에서, 이러한 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 실시예에 따른 다른 면역원성 조성물은 서열번호 60의 서열을 포함하는 SpA 변이체 폴리펩티드, 또는 서열번호 60과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 변이체 서열과 조합된 서열번호 2의 CC45 LukA 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, CC8 LukB 변이체 서열은 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 4의 CC45 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 6의 CC45 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 8의 CC45 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 9의 CC45 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 10의 CC45 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 11의 CC45 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 면역원성 조성물은 서열번호 60의 SpA 변이체 폴리펩티드, 서열번호 12의 CC45 LukA 변이체, 및 서열번호 15의 CC8 LukB 서열 또는 서열번호 15의 CC8 LukB 서열과 >85%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체, 예를 들어, 서열번호 17, 19 및 21로부터 선택된 변이체 서열을 포함한다.

본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기술된 SpA 폴리펩티드 및 본원에 기술된 임의의 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 본원에 기술된 SpA 및 LukB 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특히, 면역원성 조성물의 변이체 LukB 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 기술된 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시예에서, 조성물은 서열번호 60의 서열, 또는 서열번호 60과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열번호 15(CC8)의 LukB 변이체를 포함한다. 예시적인 CC8 LukB 변이체는 서열번호 17, 19, 및 21의 LukB 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 조성물은 서열번호 60의 서열, 또는 서열번호 60과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열번호 16(CC45)의 LukB 변이체를 포함한다. 예시적인 CC45 LukB 변이체는 서열번호 18, 20, 및 22의 LukB 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 실시예에 따른 면역원성 조성물은 LukA 단백질 또는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 전술한 단락에 기술된 SpA 변이체 및 LukB 변이체를 포함하는 조성물은 서열번호 1의 CC8 LukA 서열 또는 서열번호 1과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 변이체 서열을 추가로 포함한다. 대안적으로, 전술한 단락에 기술된 SpA 변이체 및 LukB 변이체를 포함하는 면역원성 조성물은 서열번호 2의 CC45 LukA 서열 또는 서열번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 변이체 서열을 추가로 포함한다.

본원에 기술된 면역원성 조성물은 하나 이상의 추가 S. 아우레우스(S. aureus) 항원을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 S. 아우레우스(S. aureus) 항원은 혈청형 336 다당류 항원, 응집 인자(clumping factor) A, 응집 인자 B, 피브리노겐 결합 단백질, 콜라겐 결합 단백질, 엘라스틴 결합 단백질, MHC 유사 단백질, 다당류 세포내 부착, 베타 용혈소, 델타 용혈소, 판톤-발렌틴 류코시딘, 류코시딘 M, 박리성 독소 A, 박리성 독소 B, V8 프로테아제, 히알루론산 분해효소, 리파아제, 스태필로키나아제, 장독소, 장독소 초항원 SEA, 장독소 초항원 SAB, 독성 쇼크 증후군 독소-1, 폴리-N-숙시닐 베타-1→6 글루코사민, 카탈라아제, 베타-락타마아제, 테이코산, 펩티도글리칸, 페니실린 결합 단백질, 화학주성 억제 단백질, 보체 억제제, Sbi, 5형 항원, 8형 항원, 및 리포티코산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 면역원성 조성물에 포함되는 다른 적합한 S. 아우레우스(S. aureus) 항원은, 제한 없이, CP5, CP8, Eap, Ebh, Emp, EsaB, EsaC, EsxA, EsxB, EsxAB(융합), IsdA, IsdB, IsdC, MntC, rTSST-1, rTSST-1v, TSST-1, SasF, vWbp, vWh 비트로넥틴 결합 단백질, Aaa, Aap, Ant, 자가리신 글루코사미니다아제, 자가리신 아미다아제, Can, 콜라겐 결합 단백질, Csa1A, EFB, 엘라스틴 결합 단백질, EPB, FbpA, 피브리노겐 결합 단백질, 피브로넥틴 결합 단백질, FhuD, FhuD2, FnbA, FnbB, GehD, HarA, HBP, 면역우성 ABC 수송체, IsaA/PisA, 라미닌 수용체, 리파아제 GehD, MAP, Mg2+ 수송체, MHC II 유사체, MRPII, NPase, RNA III 활성화 단백질 (RAP), SasA, SasB, SasC, SasD, SasK, SBI, SEA 엑소독소, SEB 엑소독소, mSEB, SitC, Ni ABC 수송체, SitC/MntC/살리바 결합 단백질, SsaA, SSP-1, SSP-2, Spa5, SpAKKAA, SpAkR, Sta006, 및 Sta011을 포함한다.

본 개시내용의 면역원성 조성물은 본원에 기술된 SpA, LukA, 및/또는 LukB 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 제형화함으로써 제조된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “약학적으로 허용 가능한 담체” 및 “약학적으로 허용 가능한 부형제”(예를 들어, 희석제, 면역자극제, 애쥬번트, 항산화제, 보존제 및 가용화제와 같은 첨가제)는 사용된 용량 및 농도에서 조성물을 투여하는 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예로는, 예를 들어, 인산염, 구연산염 및 다른 유기산으로 완충된, 물을 포함한다. 본 개시내용에서 유용할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 부형제의 대표적인 예로는 아스코르브산과 같은 항산화제; 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 고분자, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린를 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 갖는 약학적 활성 성분의 제형은 당 기술분야에 공지되어 있다, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (예: 제21판 (2005) 및 이후 판). 추가 성분의 비제한적인 예로는: 완충제, 희석제, 용매, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제, 및 킬레이트제를 포함한다. 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 약학적 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 액체 제형이다. 액체 제형의 바람직한 예는 수성 제형, 즉, 물을 포함하는 제형이다. 액체 제형은 용액, 현탁액, 유화액, 미세유화액, 겔 등을 포함할 수 있다. 수성 제형은 통상적으로 적어도 50% w/w의 물, 또는 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% w/w의 물을 포함한다.

임의의 실시예에서, 면역원성 조성물은, 예를 들어, 주사 디바이스(예를 들어, 주사기 또는 주입 펌프)를 통해 주사될 수 있는 주사식으로서 제형화될 수 있다. 주사는, 예를 들어, 근육내, 복강내, 유리체강내, 또는 정맥내로 전달될 수 있다.

본 개시내용의 면역원성 조성물은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 조성물의 용액, 현탁액 또는 유화액은 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 오일 중의 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물에서 제조될 수 있다. 예시적인 오일은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 또는 광물유이다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 특히 주사 가능한 용액에 대해 바람직한 액체 담체이다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.

주사용 용도에 적합한 약학적 면역원성 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균 상태여야 하며, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 상태 하에서 안정적이어야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은, 미생물의 오염 작용에 맞서 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

임의의 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 고형 제형, 예를 들어, 냉동 건조된 또는 분무 건조된 조성물이며, 이는 그대로 사용될 수 있거나, 사용 전에 의사 또는 환자가 여기에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다. 고형 투여 형태는 정제, 예컨대 압축된 정제, 및/또는 코팅된 정제, 및 캡슐(예를 들어, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐)을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은, 예를 들어, 재구성을 위한 낭, 드래지, 분말, 과립, 로젠지 또는 분말 형태일 수도 있다.

면역원성 조성물의 투여 형태는 즉시 방출형일 수 있고, 이 경우 이들은 수용성 또는 분산성 담체를 포함할 수 있거나, 지연 방출, 서방형, 또는 변형 방출형일 수 있고, 이 경우 이들은 위장관 또는 피부 아래에서 투여 형태의 용해 속도를 조절하는 수불용성 고분자를 포함할 수 있다.

다른 실시예에서, 면역원성 조성물은 비강내, 구강내, 또는 설하로 전달될 수 있다.

면역원성 조성물의 수성 제형 내의 pH는 pH 3 내지 pH 10일 수 있다. 일 실시예에서, 면역원성 조성물의 pH는 약 7.0 내지 약 9.5이다. 또 다른 실시예에서, 면역원성 조성물의 pH는 약 3.0 내지 약 7.0이다.

본 개시내용의 다른 측면은 본원에 기술된 면역원성 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 일 측면은 본원에 개시된 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 스태필로코쿠스 감염을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면은 본원에 개시된 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 스태필로코쿠스 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면은 본원에 개시된 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 스태필로코쿠스 박테리아의 집락화 또는 재집락화를 탈집락화 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 측면에 따르면, 본원에 기술된 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 스태필로코쿠스 박테리아의 단기 및 지속성 집락화 또는 재집락화를 예방하는 데 적합하다.

본 개시내용의 방법은 전술한 면역원성 조성물 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 이들 측면에 따른 치료에 적합한 대상체는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염이 발생할 위험이 있는 대상체, S. 아우레우스(S. aureus) 박테리아에 노출될 위험이 있는 대상체, 및/또는 스태필로코쿠스 S. 아우레우스(S. aureus) 박테리아에 노출된 대상체이다.

본 개시내용의 이러한 측면에 따르면, 예방적으로 유효한 양의 면역원성 조성물이 대상체에게 투여되어 S. 아우레우스(S. aureus) 감염에 대한 면역 반응을 생성한다. 예방적으로 유효한 양은 체액성(즉, 항체 매개) 및 세포성(T-세포) 면역 반응을 생성하거나 유도하는 데 필요한 양이다. 유도된 체액성 반응은 그렇지 않으면 이러한 반응이 없을 때 발생할 수 있는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염의 정도를 예방하거나 적어도 감소시키기에 충분하다. 바람직하게는, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 예방적 유효량을 투여하면 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 중화 면역 반응이 유도된다. 대상체에서 효과적인 면역 반응을 유발하기 위해, 조성물은 전술한 하나 이상의 추가 S. 아우레우스(S. aureus) 항원 또는 애쥬번트를 추가로 함유할 수 있다. 대안적인 실시예에서, 애쥬번트는 본 개시의 조성물의 투여 전, 후, 또는 투여와 동시에, 조성물과 별도로 대상체에게 투여된다.

본 개시의 본 측면의 목적을 위해, 표적 “대상체”는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 포함한다. 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염 및 S. 아우레우스(S. aureus) 집락화의 중증도를 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 목적으로 면역원성 조성물을 투여하는 맥락에서, 표적 대상체는 S. 아우레우스(S. aureus)에 감염될 위험이 있는 임의의 대상체를 포함한다. 특히 취약한 대상체는 면역손상 영유아, 청소년, 성인 및 노인을 포함한다. 그러나, S. 아우레우스(S. aureus) 감염에 대한 위험이 있는 임의의 영유아, 청소년, 성인 또는 노인은 본원에 기술된 방법 및 면역원성 조성물에 따라 치료될 수 있다. 특히 적합한 대상체는 메티실린-내성 S. 아우레우스(S. aureus) (MRSA) 또는 메티실린 감수성 S. 아우레우스(S. aureus) (MSSA)에 감염될 위험이 있는 대상체를 포함한다. 다른 적합한 대상체는 S. 아우레우스(S. aureus) 감염, 즉, S. 아우레우스(S. aureus) 관련 병태, 예를 들어, 피부 상처 및 감염, 조직 농양, 모낭염, 골수염, 폐렴, 가피성 피부 증후군, 패혈증, 패혈성 관절염, 심근염, 심내막염, 및 독성 쇼크 증후군으로 인한 병태를 갖거나 이에 의해 발생할 위험이 있는 대상체를 포함한다.

일부 실시예에서, 대상체는 적어도 또는 최대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 또는 90세(또는 그 안에서 파생 가능한 모든 범위)이다. 특정 실시예에서, 본원에 기술된 대상체 또는 환자는, 인간 대상체와 같은 소아 대상체이다. 소아 대상체는 18세 미만으로 정의되는 대상체이다. 일부 실시예에서, 소아 대상체는 2세 이하이다. 일부 실시예에서, 소아 대상체는 1세 미만이다. 일부 실시예에서, 소아 대상체는 6개월 미만이다. 일부 실시예에서, 소아 대상체는 2개월 이하이다. 일부 실시예에서, 인간 환자는 65세 이상이다. 일부 실시예에서, 인간 환자는 의료 종사자이다. 일부 실시예에서, 환자는 수술 절차를 받게 될 것이다.

강력한 면역 반응을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 면역원성 조성물을 투여할 때 다수의 다른 인자가 또한 고려될 수 있다. 이들 인자는, 예를 들어, 제한 없이, 조성물 중의 활성제의 농도, 투여 방식 및 빈도, 및 연령, 체중 및 전반적 건강 및 면역 상태와 같은 대상체의 세부사항을 포함한다. 일반 지침은, 예를 들어, 국제 조화 회의(International Conference on Harmonization) 및 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Publishing Company 1990)의 간행물에서 일반적인 지침을 찾을 수 있으며, 이는 전체 내용이 참조로 포함된다. 임상의는 원하는 또는 요구되는 예방적 효과, 예를 들어 원하는 항체 역가를 제공하는 투여량에 도달할 때까지 본원에 기술된 면역원성 조성물을 투여할 수 있다. 예방적 반응의 진행은 통상적인 분석법에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.

본 개시내용의 일 실시예에서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus)에 감염될 위험이 있거나 관련 병태가 발생할 위험이 있는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염의 발생을 예방, 지연 또는 억제하기 위해 예방적으로 투여된다. 본 개시의 일부 실시예에서, 면역원성 조성물의 예방적 투여는 개체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 완전히 예방하는 데 효과적이다. 다른 실시예에서, 예방적 투여는 그렇지 않으면 이러한 투여의 부재 시 발생할 감염의 완전한 정도를 예방, 즉, 개체에서 S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 실질적으로 예방하거나 억제하는 데 효과적이다.

S. 아우레우스(S. aureus) 감염을 예방하기 위해 예방적 조성물을 사용하는 맥락에서, 조성물의 투여량은 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 매개 세포독성 및 SpA 매개 바이러스(virulent) 활성을 중화시킬 수 있는 항체 역가를 생성하기에 적합하고, 다수의 증상의 감소, 적어도 하나의 증상의 중증도 감소, 또는 적어도 하나의 증상의 추가 진행의 지연, 또는 심지어 감염의 완전 완화를 달성할 수 있는 것이다.

본원에 기술된 면역원성 조성물의 예방적 유효량은 애쥬번트가 공동 투여되는지 여부에 따라 달라지며, 애쥬번트가 없는 경우 더 높은 투여량이 요구된다. 투여를 위한 SpA, LukA, 및 LukB 폴리펩티드 및/또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 양은 환자 당 1 μg 내지 500 μg으로 다양할 수 있다. 일부 실시예에서, 5, 10, 20, 25, 50 또는 100 μg이 각각의 인간 주사에 사용된다. 때때로, 주사 당 1-50 mg의 더 높은 투여량이 사용된다. 일부 실시예에서, 약 10, 20, 30, 40 또는 50mg이 각각의 인간 주사에 사용된다. 주사 시기는 1년에 한 번에서 10년에 한 번까지 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로, 유효 투여량은, 당 기술분야에 잘 알려져 있고 측정될 특정 항원에 쉽게 적응할 수 있는 방법을 사용하여, 대상체로부터의 유체 샘플, 일반적으로 혈액 혈청 샘플을 수득하고, SpA, LukA, LukB 또는 LukAB 에 대해 개발된 항체의 역가를 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 이상적으로, 샘플은 초기 투여 전에 채취되고 후속 샘플은 각각의 면역화 후에 채취되고 역가가 측정된다. 일반적으로, 1:100의 혈청 희석에서 대조군 또는 “배경” 수준보다 적어도 4배 더 큰 검출 가능한 역가를 제공하는 투여량 또는 투여 일정이 바람직하며, 여기서 배경은 ELISA 분석법에서 대조군 혈청에 대해 또는 플레이트 배경에 대해 정의된다.

본 개시내용의 면역원성 조성물은 예방적 치료를 위한 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 복강내, 비강내 또는 근육내 수단에 의해 투여될 수 있다.

실시예

본 발명은 다음의 비제한적인 실시예를 제공한다.

실시예 1은 면역원성 조성물로서

(ii) S. 아우레우스(S. aureus) LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

실시예 2는 2개 이상의 면역원성 조성물의 조합으로서,

(ii) S. 아우레우스(S. aureus) LukA 변이체 폴리펩티드를 함께 포함하며, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

실시예 3은 실시예 1의 면역원성 조성물 또는 실시예 2의 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

실시예 4는 실시예 1 내지 3 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

실시예 5는 실시예 4의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 아미노산 치환은 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala를 포함한다.

실시예 6은 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 7은 실시예 1 내지 6 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

실시예 8은 실시예 7의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 아미노산 치환은 Tyr74Cys, Asp140Cys, Gly149Cys, 및 Gly156Cys를 포함한다.

실시예 9는 실시예 7 또는 8의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 10은 실시예 1 내지 9 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.

실시예 11은 실시예 10의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 12는 실시예 1 내지 11 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 폴리펩티드는 SpA 변이체 폴리펩티드이다.

실시예 13은 실시예 12의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 Fc 결합을 파괴하는 적어도 하나의 아미노산 치환 및 VH3 결합을 파괴하는 적어도 제2 아미노산 치환을 갖는다.

실시예 14는 실시예 12 또는 13의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA D 도메인을 포함하고, 상기 SpA D 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 15는 실시예 14의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E, A, B, 및/또는 C 도메인을 추가로 포함한다.

실시예 16은 실시예 15의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA E 도메인은 서열번호 59의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA A 도메인은 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA B 도메인은 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; SpA C 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 17은 실시예 12 또는 13의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E, D, A, B, 또는 C 도메인을 포함하고, 여기서 SpA E 도메인은 서열번호 52의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA D 도메인은 서열번호 51의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA A 도메인은 서열번호 48의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA B 도메인은 서열번호 49의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; SpA C 도메인은 서열번호 50의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 18은 실시예 12 내지 17 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E, D, A, B, 및 C 도메인을 연속적으로 포함한다.

실시예 19는 실시예 18의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E, D, A, B, 및 C 도메인을 포함하고 서열번호 53의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

실시예 20은 실시예 12 내지 17 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 각각의 SpA E, D, A, B, 및 C 도메인은 서열번호 58의 아미노산 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서 아미노산 치환을 갖는다.

실시예 21은 실시예 20의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 하나 또는 둘 모두의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 글루타민 잔기에 대한 리신 잔기이다.

실시예 22는 실시예 21의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E, D, A, B, 및 C 도메인을 포함하고 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

실시예 23은 실시예 12 내지 22 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 (i) 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 글루타민 잔기에서의 리신 치환 및 (ii) 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖는다.

실시예 24는 실시예 23의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA E 도메인은 서열번호 65의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA D 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA A 도메인은 서열번호 62의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA B 도메인은 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; SpA C 도메인은 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 25는 실시예 23의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA E 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA D 도메인은 서열번호 91의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA A 도메인은 서열번호 88의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA B 도메인은 서열번호 89의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; SpA C 도메인은 서열번호 90의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 26은 실시예 23의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열, 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 27은 실시예 12 내지 22 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 (i) 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 글루타민 잔기에서의 리신 치환 및 (ii) 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 트레오닌 치환을 갖는다.

실시예 28은 실시예 27의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA E 도메인은 서열번호 70의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA D 도메인은 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA A 도메인은 서열번호 67의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA B 도메인은 서열번호 68의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; SpA C 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 29는 실시예 27의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA E 도메인은 서열번호 97의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA D 도메인은 서열번호 96의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA A 도메인은 서열번호 93의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SpA B 도메인은 서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; SpA C 도메인은 서열번호 95의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 30은 실시예 27의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 61의 아미노산 서열, 또는 서열번호 61의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 31은 실시예 12 내지 22 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 (i) 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 글루타민 잔기에서의 리신 치환 및 (ii) 서열번호 58의 위치 29에 대응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 갖는다.

실시예 32는 실시예 1 내지 31 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 S. aureus(S. 아우레우스) 류코시딘 B(LukB) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다.

실시예 33은 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 LukB 폴리펩티드는 서열번호 15의 LukB 폴리펩티드 또는 서열번호 16의 LukB 폴리펩티드이다.

실시예 34는 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 LukB 폴리펩티드는 LukB 변이체 폴리펩티드이다.

실시예 35는 실시예 34의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 36은 실시예 35의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15 및 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.

실시예 37은 실시예 36의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 아미노산 치환은 발린에서 류신으로의 치환이다.

실시예 38은 실시예 34 내지 37 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

실시예 38은 실시예 34 내지 37 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함한다.

실시예 40은 실시예 34 내지 39 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 17 내지 22로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 41은 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 포함한다.

실시예 42는 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 포함한다.

실시예 43은 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 포함한다.

실시예 44는 실시예 41 내지 43 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA폴리펩티드는 SpA 변이체 폴리펩티드이다.

실시예 45는 실시예 44의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 적어도 하나의 도메인은 (i) 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 글루타민 잔기에서의 리신 치환 및 (ii) 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖는다.

실시예 46은 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 (i) SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖고 (ii)LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서의 메티오닌 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서의 이소류신 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하고 (iii) LukB 폴리펩티드는 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서의 류신 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다.

실시예 47은 실시예 46의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 48은 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 (i) SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖고; (ii) LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서의 메티오닌 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서의 이소류신 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하고 (iii) LukB 폴리펩티드는 서열번호 15의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서의 류신 치환을 포함하는 CC8 LukB 변이체 폴리펩티드이다.

실시예 49는 실시예 48의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 50은 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 (i) SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖고; (ii)LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서의 메티오닌 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서의 이소류신 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하고 (iii) LukB 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CC8 LukB 폴리펩티드이다.

실시예 51은 실시예 50의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 52는 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 (i) SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖고; (ii)LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 81에 대응하는 아미노산 위치에서의 메티오닌 치환, 서열번호 2의 위치 139에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환, 서열번호 2의 위치 111 및 191에 대응하는 아미노산 위치에서의 이소류신 치환, 및 서열번호 2의 위치 321에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하고 (iii) LukB 폴리펩티드는 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서의 류신 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다.

실시예 53은 실시예 52의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 54는 실시예 32의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 (i) SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖고; (ii)LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 81에 대응하는 아미노산 위치에서의 메티오닌 치환, 서열번호 2의 위치 139에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환, 서열번호 2의 위치 111 및 191에 대응하는 아미노산 위치에서의 이소류신 치환, 및 서열번호 2의 위치 321에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환을 포함하는 CC45 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하고 (iii) LukB 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드이다.

실시예 55는 실시예 54의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 60의 아미노산 서열 또는 서열번호 60의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

실시예 56은 실시예 1 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합이며, 애쥬번트를 더 포함한다.

실시예 57은 실시예 56의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄, 및 산화알루미늄과 같은 알루미늄 염을 포함한다.

실시예 58은 실시예 56의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄을 포함한다.

실시예 59는 실시예 56의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 안정적인 수중유 유화액을 포함한다.

실시예 60은 실시예 56의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 사포닌을 포함한다.

실시예 61은 실시예 60의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 사포닌은 QS21이다.

실시예 62는 실시예 56의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 TLR4 작용제를 포함한다.

실시예 63은 실시예 62의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 TLR4 작용제는 지질 A 또는 이의 유사체 또는 유도체이다.

실시예 64는 실시예 62의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 TLR4 작용제는 MPL, 3D-MPL, RC529, GLA, SLA, E6020, PET-지질 A, PHAD, 3D-PHAD, 3D-(6-아실)- PHAD, ONO4007, 또는 OM-174를 포함한다.

실시예 65는 실시예 62의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 TLR4 작용제는 글리코피라노실 지질 애쥬번트(GLA, glycopyranosyl lipid adjuvant)이다.

실시예 66은 실시예 62의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 안정적인 수중유 유화액과 조합된 TLR4 작용제를 포함한다.

실시예 67은 실시예 62의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 안정적인 수중유 유화액으로 제형화된 TLR4 작용제를 포함한다.

실시예 68은 실시예 65의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 GLA-SE를 포함한다.

실시예 69는 실시예 62의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 사포닌과 조합된 TLR-4 작용제를 포함한다.

실시예 70은 실시예 65의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 애쥬번트는 GLA-LSQ를 포함한다.

실시예 71은 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 실시예 1 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물의 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체, LukA 변이체 폴리펩티드, 및 LukB 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 포함한다.

실시예 72는 실시예 71의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 및 LukAB 이종이량체(RARPR-15)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 LukAB 이종이량체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 108의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 결합된 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

실시예 73은 실시예 71의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 및 LukAB 이종이량체(RARPR-30)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 LukAB 이종이량체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 110의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 결합된 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

실시예 74는 실시예 71의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 및 LukAB 이종이량체(RARPR-32)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 LukAB 이종이량체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 107의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 결합된 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

실시예 75는 실시예 71의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 및 LukAB 이종이량체(RARPR-33)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 LukAB 이종이량체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 110의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 결합된 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

실시예 76은 실시예 71의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 상기 조성물은 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 및 LukAB 이종이량체(RARPR-34)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 LukAB 이종이량체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 109의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 결합된 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

실시예 77은 실시예 71의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 여기서 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 벡터에 함유된다.

실시예 78. 실시예 71 또는 77의 면역원성 조성물로서, 여기서 상기 조성물은 숙주 세포를 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 상기 하나 이상의 핵산 분자 또는 상기 하나 이상의 벡터를 포함한다.

실시예 79는 스태필로코쿠스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 실시예 1 내지 78 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

실시예 80은 스태필로코쿠스 박테리아에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체에서 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 실시예 1 내지 78 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

실시예 81은 스태필로코쿠스 박테리아의 탈집락화 또는 집락화 또는 재집락화의 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 탈집락화 또는 집락화 또는 재집락화를 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 실시예 1 내지 78 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

실시예 82는 대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법에 사용하기 위한 실시예 1 내지 78 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합이다.

실시예 83은 의약으로서 사용하기 위한 실시예 1 내지 78 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합이다.

예

다음의 예는 본 개시내용의 실시예를 예시하기 위해 제공되지만, 그 범위를 제한하도록 의도된 것은 아니다.

예 1: 예시적인 LukA 변이체 폴리펩티드, LukB 변이체 폴리펩티드, 및 안정한 LukAB 이종이량체 복합체

LukAB 이종이량체 단백질의 발현을 위해, E. coli BL21(DE3) 세포를 pCDFDuet-1에 클로닝된 lukA 작제물 및 pETDuet-1에 클로닝된 lukB 작제물로 공동-형질전환시켰다. 형질전환체를 50 μg/mL 암피실린 및 50 μg/mL 스펙티노마이신에서 배양하여, 37℃의 Luria-Bertani 브로스에서 pETDuet-1 및 pCDFDuet-1에 대해 각각 선택하고, 190 rpm으로 밤새 진탕하였다. 발현을 위해, 신선한 Terrific Broth 배지를 37℃에서 1:50 희석의 밤새 배양물로 접종하고, 배양물이 OD₆₀₀ = 2에 도달할 때까지 190 rpm에서 진탕시켰다. 그런 다음, 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드를 첨가하여 1 mM의 최종 농도로 발현을 유도하고, 37℃에서 추가로 5시간 동안 유도를 계속하였다. LukA 및/또는 LukB에서 시스테인 치환 쌍을 포함하는 LukAB 이종이량체의 발현은 이황화 결합 형성을 지원하기 위해 E. coli Origami 2(DE3) 세포의 세포질에서 발현되었다. E. coli BL21(DE3)의 주변 세포질에서 LukA 단량체의 발현은, 37℃에서 4 mM 람노오스의 최종 농도를 4시간 동안 사용하여, Terrific Broth (30 μg/mL 카나마이신이 보충됨)에서 유도 하에, pD861-CH에서 lukA 작제물의 형질전환을 통해 수행하였다. 세포질 및 주변 세포질 발현 작제물 모두를 유도한 후, 4℃에서 4000 rpm으로 15분 동안 원심분리를 통해 세포를 수확한 다음, 용해 완충액(94% Bugbuster [EMD Millipore] + 6% 5 M NaCl + 0.4% 4 M 이미다졸 + 프로테아제 억제제 칵테일 [ProteaseArrest, G-Biosciences])에 재현탁시켰다. 실온에서 20분 동안 용해시킨 후, 용해물을 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 16100 x g, 4℃에서 35분 동안 원심분리하였다. AKTA Pure 25M FPLC 및 HisTrap 컬럼을 사용하여 LukA의 N-말단에서 6xHis-tag를 통해 단백질을 정제하고, 이미다졸 구배(50 mM 인산나트륨 완충액 중 50-500 mM 이미다졸, pH 7.4, 200 mM NaCl)를 사용해 용리하였다. SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이, 정제된 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤에서 투석하였다. 정제된 단백질을 비신코닌산(BCA) 단백질 검정(Pierce)을 통해 정량화하였다.

본원에 기술된 연구에서 사용된 예시적인 LukA, LukB, 및 LukAB 이종이량체 복합체

톡소이드/ 독소 명칭	LukA	LukA 치환	서열번호	LukB	LukB 치환	서열번호
RARPR-013	CC45 W94	E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile	11	CC45	없음	16
RARPR-015	CC45 W95	E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile	4	CC45	없음	16
RARPR-017	CC45 W96	E321A, Lys81Leu, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val	12	CC45	없음	16
RARPR-019	CC45 W97	E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val	8	CC45	없음	16
RARPR-30	CC45 W95	E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile	4	CC45	Val53Leu	18
RARPR-31	CC8 W95	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile	3	none
RARPR-32	CC8 W95	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile	3	CC8	없음	15
RARPR-33	CC8 W95	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile	3	CC45	Val53Leu	18
RARPR-34	CC8 W95	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile	3	CC8	Val53Leu	17
LukA 단량체	CC8 W97 W72	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys	9	없음
LukA 단량체	CC45 W97 W72	E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys	10	없음
	CC8 W95 W72	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys	5	CC45	없음	16
	CC8 W95 W72	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys	5	CC45	Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys	22
	CC8 W95 W72	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys	5	CC45	Val53Leu	18
	CC8 W95 W72	E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys	5	CC45	Val53Leu, Glu45Cys, Thr122Cys, Glu110Cys, Arg155Cys	20
CC8delta10	CC8	C-말단 잔기 312-321 결실	113	CC8	없음	15
CC45delta10	CC45	C-말단 잔기 313-322 결실	114	CC45	없음	16
CC8 독소	CC8	없음	1	CC8	없음	15
CC45 독소	CC45	없음	2	CC45	없음	16

예 2: 야생형, LukA, 및 LukAB 톡소이드의 세포독성

(표 5에 정의된) LukAB 톡소이드 단백질의 세포독성을, 전핵구 세포주 THP-1, 또는 신선하게 단리된 일차 인간 다형핵 백혈구(hPMN)를 사용하여 야생형 LukAB 독소와 비교하여 평가하였다.

세포독성을 시험하기 전에, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트의 존재 하에 THP-1 세포를 분화시켰다. THP-1 세포독성 분석을 위해, 50 μL RPMI 중 총 1 x 10⁵ 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. LukAB 독소 및 톡소이드 단백질을 표준 단백질 농도로 조정하고, 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에서 연속 희석하고, 각각의 50 μL 부피를 적절한 웰에 첨가하였다. RPMI-단독 음성 대조군 이외에, Triton X-100을 양성 대조군으로서 0.1%의 최종 농도로 첨가하였다. CytoTox-ONE 검정(Promega)을 사용하여, 막 무결성의 마커로서 역할한, 세포질 효소 젖산 탈수소효소의 방출을 평가하기 전에, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.

분화된 THP-1 세포에 대한 LukA 및 LukAB 톡소이드의 세포독성이 아래 표 6에 제공되어 있다. 분화된 THP-1 세포는 CC8 및 CC45 LukAB 야생형 독소 모두가 0.313 μg/mL의 낮은 독소 농도에서 세포 집단의 30% 이상을 사멸시켰으므로, 야생형 독소에 민감하였다. LukA(delta10)의 C-말단에서 최종 10개의 아미노산 잔기를 결실시키면 CC8delta10 독소의 세포독성이 40 μg/mL에서 5% 미만 세포 사멸로 감소하였지만, 분화된 THP-1 세포를 향해 CC45delta10 독소의 세포독성을 감소시키지 않았다. LukA 단량체 중 어느 것도 분화된 THP-1 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않았다. 이 결과는, LukA가 LukB가 없는 상태에서 활성 기공 복합체를 형성하지 않아야 하기 때문에, 예상되었다. RARPR-33, RARPR-34, 및 RARPR-15를 포함하는 각각의 LukAB 이량체 톡소이드는 분화된 THP-1 세포에 대해 현저하게 감소된 세포독성을 나타냈으며, 시험된 최고 농도인 40 μg/mL에서 시험된 각각의 톡소이드에 대해 세포 사멸은 1% 이하였다.

표준화된 양의 독소를 사용하여 인간 단핵구 세포주인 분화된 THP-1 세포에 대한 LukA 또는 LukAB 단백질의 세포독성. 데이터는 사멸된 세포의 백분율로서 제시된다.

	LukAB 농도 (μg/mL)
톡소이드/독소	40	20	10	5	2.5	1.25	0.625	0.313	0.156	0.078	0.04	0.02
RARPR-15	-12	-12	-12	-14	-14	-15	-10	-14	-12	-11	-9	-7
RARPR-30	0	-1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
RARPR-31	0	0	-1	0	0	0	-1	-1	0	0	-1	-1
RARPR-32	0	-1	-1	-1	0	0	0	0	0	0	0	0
RARPR-33	1	1	1	0	1	1	1	0	1	1	1	1
RARPR-34	1	0	1	1	1	1	0	1	1	0	0	1
CC8 LukA W97 (단량체)	1	1	0	0	1	0	0	0	0	0	1	1
CC45 LukA W97 (단량체)	1	1	0	0	0	0	0	0	0	1	1	2
CC8delta10	4	3	1	1	0	0	0	0	0	-1	0	0
CC45delta10	53	39	32	31	33	41	54	55	53	35	13	5
CC8 독소	41	44	43	39	39	38	37	30	15	6	2	1
CC45 독소	42	34	31	34	40	46	46	36	18	4	1	0

hPMN의 경우, 중독 전에, 모든 독소를 (서브유닛당) 2.5 μg/mL로 정규화한 다음, 20 μL의 독소를 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. PMN을 분리하고 90 μL RPMI당 200,000개 세포로 정규화하였다 (10 mM HEPES + 0.1% HSA). 그런 다음, 90 μL의 PMN을 각 웰에 피펫팅하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO₂ 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 PMN 생존력을 평가하였다.

인간 일차 PMN 세포에 대한 LukA 단량체 및 LukAB 이량체 톡소이드의 세포독성이 아래 표 7에 제공되어 있다. 야생형 CC8 및 CC45 독소는 각각 0.313 μg/mL 및 1.25 μg/mL의 독소 농도에서 일차 인간 PMN의 90%를 초과하여 사멸하는 것을 나타냈다. 대조적으로, 각각의 LukAB 톡소이드 및 LukA 단량체는 이들 세포에 대한 세포독성이 상당히 감소되었다. CC8 LukA에서 10개의 C-말단 잔기의 결실은 분화된 THP-1 세포를 향해 세포독성을 근본적으로 제거하였지만, 이 독소는 hPMN에 대한 세포독성을 유지하였으며, 5 μg/mL 이상의 농도에서 20%를 초과하는 사멸이 관찰되었다. 활성 기공 복합체의 형성에 중요한 LukB 성분이 결여된 톡소이드에 대해 예상되는 바와 같이, CC8 및 CC45 LukA 단량체는 hPMN에 대해 세포독성을 거의 나타내지 않았다. 각각의 LukAB 이량체 톡소이드는 CC8 및 CC45 야생형 LukAB 독소와 비교하여 hPMN 세포에 대한 현저한 세포독성 감소를 나타냈다. RARPR-33 LukAB 톡소이드뿐만 아니라 관련 톡소이드인 RARPR-32 및 -34는, CC8delta10보다 세포독성이 덜한 것으로 나타났으며, RARPR-33은 시험된 최고 농도인 20 μg/mL에서 세포 집단의 15%만을 사멸시켰다.

표준화된 양의 독소를 사용하여 인간 일차 다형핵 백혈구에 대한 LukA 또는 LukAB 단백질의 세포독성. 데이터는 사멸된 세포의 백분율로 표시된다.

	LukAB 농도 (μg/mL)
톡소이드/독소	20	10	5	2.5	1.25	0.625	0.313	0.156	0.078	0.04	0.02
RARPR-15	42	36	31	20	14	11	11	11	6	10	11
RARPR-30	27	17	14	10	5	0	0	0	0	0	0
RARPR-31	12	2	1	0	0	3	0	0	0	0	0
RARPR-32	17	6	4	4	2	1	0	0	0	0	0
RARPR-33	15	8	6	3	1	0	0	0	0	0	0
RARPR-34	16	9	5	3	0	0	0	0	0	0	0
CC8 LukA W97 (단량체)	5	3	2	1	2	1	1	2	0	2	1
CC45 LukA W97 (단량체)	7	6	2	3	4	1	0	1	2	0	0
CC8delta10	29	26	22	18	11	11	4	4	3	4	3
CC8 독소	93	96	97	96	97	93	90	87	75	52	29
CC45 독소	97	97	97	97	96	85	72	57	49	30	19

예 3: RARPR-33 LukAB 톡소이드 및 WT LukAB 독소의 다른 변이체의 세포독성

RARPR-33 및 WT LukAB 독소 및 LukA 단량체의 상이한 변이체의 세포독성 및 면역원성을 평가하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 마우스를 면역원성 연구에 사용하였다.

LukAB 독소, 톡소이드 및 단량체의 세포독성을 인간 PMN에 대해 평가하였다. 중독 전에, 모든 독소를 (서브유닛당) 100 μg/mL로 정규화한 다음, 20 μL의 독소를 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고, 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. 상이한 공여자로부터 PMN을 분리하고, 90 μL RPMI 당 200,000개의 세포로 정규화하였다 (10 mM HEPES + 0.1% HSA). 90 μL의 PMN을 각 웰에 피펫팅하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 PMN 생존력을 평가하였다. 사멸 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 사멸로 설정된 Triton X100-처리 세포에 대해 정규화함으로써 계산하였다.

인간 일차 PMN 세포에 대한 LukA 단량체 및 LukAB 독소의 세포독성이 도 3에 제공된다. 야생형 LukAB CC8 및 CC45 독소는 각각 2.5 μg/mL 및 5 μg/mL의 독소 농도에서 일차 인간 PMN의 90%를 초과하여 사멸하는 것을 나타냈다. 2.5 μg/mL에서 LukAB 혼성 독소 CC8/CC45 및 CC45/CC8에 대해서도 최대 사멸이 관찰되었다. 대조적으로, LukAB 톡소이드 및 LukA 단량체는 이들 세포에 대한 세포독성이 상당히 감소되었다. CC8 LukA에서 10개의 C-말단 잔기의 결실은 hPMN에 대한 세포독성을 유지하였으며, 5 μg/mL 이상의 농도에서 20%를 초과하는 사멸이 관찰되었다. CC8 및 CC45 LukA 단량체 및 이들 단량체의 조합은 hPMN에 대한 세포독성을 거의 나타내지 않았다. RARPR-33 LukAB 톡소이드는 CC8Δ10C보다 세포독성이 덜한 것으로 나타났으며, RARPR-33은 시험된 최고 농도인 20 μg/mL에서 세포 집단의 15%만을 사멸시켰다.

예 4: 마우스에서 LukAB 변이체의 면역원성

상이한 LukAB 변이체의 면역원성을 결정하기 위해, Envigo Hsd:ND4(4주령) 마우스(n=5/항원)에게 50 μl의 애쥬번트, TiterMax® Gold와 혼합된 50 μl의 10% 글리세롤 1X TBS 중 20 μg LukAB를 피하 투여하였다. 5마리 마우스의 코호트도 동일한 부피의 10% 글리세롤 1X TBS 및 TiterMax® Gold로 이루어진 모의 면역화를 받았다. 2주 간격으로 동일한 항원-애쥬번트 칵테일을 2회 추가 투여한 후, 마우스를 심장 천자를 통해 채혈하고 혈청을 얻었다.

항-LukAB 항체 역가를 결정하기 위해, ELISA를 수행하였다. WT LukAB CC8 또는 CC45를 1X PBS 중 2 μg/ml로 희석하고, 96 웰 Immulon 2HB 플레이트(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 3455) 중 100 μl에서 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 세척 완충액(1X PBS + 0.05% Tween)으로 3회 세척한 다음, 200 μl의 차단 완충액(1X PBS 중 2.5% 우유)으로 1시간 동안 차단하였다. 1:500의 혈청에서 시작하여 차단 완충액으로의 5배 연속 희석을 생성하고, 로커에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 다시 3회 세척하고, 차단 완충액 중에서 1:5,000으로 희석된 마우스 IgG-HRP(Biorad) 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미결합 이차 항체를 세척 완충액으로 3회 연속 세척하여 씻어냈다. 실온으로 된 TMB(100 μl)를 각 웰에 첨가하고 25분 동안 인큐베이션하였다. 반응이 완료된 후, 이어서 동일한 양의 2N 황산을 각각의 반응에 웰에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그런 다음, 플레이트를 Envision 플레이트 판독기 상에서 450 nm 흡광도에 대해 판독하였다. 도 4a 및 4b에 도시된 히트맵은 이중 측정으로부터의 평균 흡광도 값을 보여주며, 검은색은 높은 흡광도 및 코팅 항원에 대한 항체 결합을 나타내고, 흰색은 낮은 흡광도 및 항체 결합이 없음을 나타낸다.

RARPR-33은 강력한 항-CC8 및 항-CC45 LukAB IgG 항체 역가를 유도하였다(도4a 및 도 4b). RARPR-33 면역화는 CC8 WT 독소, CC8/CC45 하이브리드 독소 및 CC8Δ10C 톡소이드로 면역화하는 것과 유사한 항-CC8 IgG 반응을 유도하였다. 개별 CC8 LukA 단량체에 의해 유도된 항-CC8 LukAB IgG 역가는 CC8 LukAB 독소 또는 CC8/CC45 하이브리드 독소, CC45/CC8 하이브리드 독소 및 RARPR 33 하이브리드 항원에 의해 유도된 역가만큼 높지 않았다(도 4a).

RARPR-33 면역화된 마우스에서 항-CC45 LukAB 역가는 CC8/CC45 WT 하이브리드 항원에 의해 유도된 것보다 높았으며, CC45 WT 항원에 의해 유도된 것과 동등하였다. CC8 및 CC45 LukA 단량체를 조합하면 CC8 및 CC45 LukAB 둘 다에 대한 항체 역가가 유도되었다(도 4b). 그러나, 조합된 CC8 및 CC45 LukA 단량체에 의해 유도된 이러한 항-CC8 및 항-CC45 LukAB 역가는 RARPR 33에 의해 유도된 것만큼 높지 않았다. 개별 CC45 LukA 단량체는 CC45/CC8 하이브리드에 의해 유도된 수준과 유사하게 매우 높은 항-CC45 LukAB 역가를 유도하며, RARPR-33 또는 CC45 WT 독소에 의해 유도된 것보다 약간만 더 낮다. 이들 결과는, RARPR-33 면역화 시 LukAB CC8 및 CC45 둘 다에 대한 항체 반응이 높은 크기로 유도된다는 것을 보여준다.

예 5: 독소 세포독성의 항체 매개 중화

독소 세포독성의 항체 매개 중화를 상기 예 4에서 전술한 바와 같이 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청으로 평가하였다. 열-불활성화 풀링된 혈청을 PBS에서 40% 혈청으로 정규화한 다음, 20 μL의 혈청을 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고, 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. LukAB 독소 클론 복합체 서열 변이체 각각의 LD₉₀을 실온에서 15분 동안 플레이트(10 μL/웰)에 첨가하였다. 그런 다음, 80 μL RPMI 당 200,000 세포로 정규화된 (10 mM HEPES + 0.1% HSA) 신선하게 분리된 인간 일차 다형핵 백혈구(hPMN)를 혈청-독소 혼합물에 첨가하고 37℃ + 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 PMN 생존력을 평가하였다. 항체 중화 데이터가 도 5에 제시되어 있다.

RARPR-33으로 면역화된 마우스 유래의 혈청은 모든 항원 중 가장 강력하고 광범위하게 LukAB 중화 능력을 나타냈다(도 5). RARPR 33-면역화된 마우스로부터의 혈청은 0.25%의 낮은 혈청에서 시험된 모든 11개의 LukAB 변이체의 세포독성 효과를 강력하게 중화시켰으며, 대부분의 LukAB 변이체에 대해서도 0.063-0.125%의 낮은 혈청에서 보호를 제공하였다(도 5). 개별 CC8 및 CC45 LukA 단량체로의 면역화는 항원 백본에 대해 고도로 편향된 LukAB 중화 능력을 갖는 혈청을 생성하였다(도 5). 각각의 면역화에 대해 20 μg의 각각의 단량체로 투여된 CC45 LukA와 CC8 LukA 단량체의 조합(40 μg의 총 단백질)은 광범위하고 강력한 LukAB 중화 능력 둘 다를 갖는 혈청을 생성하였는데, 이는 0.5% 혈청만큼 낮게 시험된 모든 11개의 LukAB 변이체를 중화시키지만(도 5), 이는 RARPR-33 면역화 마우스의 혈청에서 관찰된 것보다 낮다.

종합하면, 예 3 내지 5에 제시된 데이터는, RARPR-33의 CC8/CC45 LukAB 백본에 통합된 약독화 및 안정화 돌연변이가 CC8/CC45 WT LukAB 하이브리드의 광범위한 면역원성 효과를 개선시키는 한편(도 4 및 도 5), RARPR-33은 CC8/CC45 WT LukAB 독소에 비해 고도로 약독화되었다(도 3).

예 6: 항혈청 독소 중화

독소 세포독성의 항체 매개 중화를 야생형 LukAB, 야생형 LukAB 하이브리드(즉, CC8 LukA/CC45 LukB 및 CC45 LukA/CC8 LukB), LukA 단량체, 또는 LukAB 톡소이드로 면역화된 마우스로부터 수득한 혈청으로 평가하였다. 열-불활성화 풀링된 혈청을 PBS에서 40% 혈청으로 정규화한 다음, 20 μL의 혈청을 96-웰 플레이트의 상단 웰 내로 피펫팅하고, 10 μL의 1X PBS에서 2배 연속 희석하였다. 그런 다음, LukAB 독소 클론 복합체 서열 변이체 각각의 LD₉₀을 실온에서 15분 동안 2%, 1% 또는 0.5% 혈청이 담긴 플레이트의 웰(10 μL/웰)에 첨가하였다. 그런 다음, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 인간 일차 다형핵 백혈구(hPMN)를 80 μL RPMI(10 mM HEPES + 0.1% HSA) 당 200,000개의 세포로 정규화하고, 혈청-독소 혼합물에 첨가하고, 37℃ + 5% CO₂에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μL의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO₂에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 PMN 생존력을 평가하였다. 항체 중화 데이터가 도 6a(2% 항체 혈청), 도 6b(1% 항체 혈청, 및 도 6c(0.5% 항체 혈청)의 표에 제시되어 있다.

야생형 CC8 및 CC45 LukAB로의 면역화는 면역화된 항원의 서열 조성을 반영하는 패턴으로 LukAB 독소의 자연 발생 서열 변이체를 중화시킨 항체를 유도하였다. CC8 LukAB 독소에 의해 유도된 항체는 CC8, CC1, CC5, 및 기타 S. 아우레우스(S. aureus) 계통으로부터 유래된 독소를 강력하게 중화하였지만, CC30, CC45, 또는 ST22A S. 아우레우스(S. aureus)로부터 유래된 독소의 완전한 중화를 제공하지 않았다. 마찬가지로, CC45 LukAB 독소를 사용한 면역화는 CC30, CC45, 또는 ST22A S. 아우레우스(S. aureus) 계통으로부터 유래된 독소를 강력하게 중화시키지만, 다른 계통으로부터 유래된 독소는 중화시키지 않는 항체를 유도하였다.

CC45 LukB와 조합된 CC8 LukA 또는 CC8 LukB와 조합된 CC45 LukA 중 하나인, 비-천연 하이브리드 LukAB로 마우스를 면역화하면, 자연 발생 이량체 조합과 비교하여 LukAB 서열 변이체의 더 넓은 중화를 나타내는 항체를 유도하였다. 비-천연 하이브리드 이량체 중에서, CC8 LukA 및 CC45 LukB는 LukA의 (E323A) 끝에서 두 번째 잔기에서 Glu에서 Ala로의 치환을 운반하는 단백질에 보유된 패턴인, 반대 조합보다 약간 더 양호한 중화 프로파일을 나타냈다. 야생형 독소에 대해 유도된 항체에 대해 관찰된 바와 같이, LukA 단량체는 이들의 서열 조성을 나타내는 중화 패턴을 나타내는 항체를 유도하였다. CC8 LukA 및 CC45 LukA 단량체(RARPR-31 + CC45 LukA W97)의 조합은 광범위한 중화 패턴을 나타낸 항체를 유도하였지만, 중화의 효능은 이량체 항원과 비교하여 감소하였는데, 이는 1% 또는 0.5% 혈청에서의 중화 수준의 감소에 의해 명백해진다.

이량체 톡소이드 중에서, RARPR-15, RARPR-33, 및 RARPR-34는 시험된 모든 LukAB 서열 변이체에 대해 광범위한 중화 항체 반응을 나타냈다. 중화 반응의 효능은 여러 톡소이드에 대해 관찰된 것보다 열등하였지만, 비천연 야생형 이량체 조합은 또한 광범위한 중화 프로파일을 나타냈다. 하이브리드 야생형 및 톡소이드 항원 둘 다는 2%(도 6a) 및 1%(도 6b) 혈청에서 시험될 때 광범위하게 중화 프로파일을 나타냈지만, 0.5% 혈청(도 6c)에서 시험했을 때 톡소이드에 대한 반응의 개선된 효능이 명백하였다. 이러한 최저 시험 농도에서, RARPR-15, RARPR-32 RARPR-33, 및 RARPR-34는 각각 광범위한 중화 반응을 나타냈다. 특히, RARPR-33은 광범위한 중화 반응을 유지한 혈청을 유도한 반면, 하이브리드 야생형 항원 및 E323A 톡소이드는 0.5% 혈청에서 광범위한 보호 반응을 유도하지 못하였고, CC30, CC45, 및 ST22A LukAB 독소에 대해서만 높은 중화 수준이 관찰됨에 따라, 가장 낮은 시험 농도에서 CC45 톡소이드 RARPR-15에 의해 유도된 중화 패턴은 그의 서열 조성을 반영하였다. 하이브리드 이량체 톡소이드 RARPR-33은 강력하고 광범위하게 중화 면역 반응을 유도하였다.

예 7: 고농도에서 RARPR-33의 세포독성.

방법:

세포독성 분석: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체의 세포독성을 평가하기 위해, 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. 아우레우스(S. aureus) 독소로 중독시켰다. 상이한 공여자로부터 PMN을 분리하고, 50 μl RPMI당 200,000개의 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). PBS 중 50 μl의 독소를 세포에 첨가하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μl의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO2에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 PMN 생존력을 평가하였다. 사멸 세포 %는 배경(건강한 세포 + PBS)을 차감하고 100% 사멸로 설정된 TritonX-처리 세포로 정규화함으로써 계산된다.

LDH 검정: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체가 세포 용해를 야기할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 독소로 중독시키고 LDH 방출을 측정하였다. 야생형 독소를 PBS에서 2배 연속 희석하고, 5-0.0024 μg/ml 범위의 농도로 시험하였다. LukAB 톡소이드를 PBS에 희석하고 2.5, 2, 1, 1.5 및 0.5 mg/ml로 시험하였다. PMN을 분리하고 50 μl RPMI당 200,000개의 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). 그런 다음, 50 μl의 PMN을 각 웰에 피펫팅하고, 50 μl의 희석된 독소를 웰당 첨가하였다. 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. LDH 방출을 평가하기 위해, 플레이트를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리한 다음, 25 μl의 상청액을 각 웰로부터 제거하고 96-웰 흑색 투명-바닥 플레이트로 옮겼다. 25 μl의 CytoTox-ONE 균질 막 완전성 시약(Promega)을 흑색 투명-바닥 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해는 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 갖는 형광을 기록함으로써 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 평가하였다. 배경(건강한 세포 + PBS)을 차감하고 100% 사멸 상태로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 사멸 세포 %를 계산하였다.

결과:

이전 예들에서, hPMN에 대한 LukAB 톡소이드 RARPR-33의 세포독성을 20 μg/ml의 농도까지 측정하였다. 다음으로, 더 높은 농도(최대 2.5 mg/ml)의 RARPR-33의 존재 시에 인간 PMN의 세포독성을 모니터링하였다. CellTiter 측정에 기반한 인간 PMN(4-6명의 공여자)의 최대 세포독성을 ~0.156 μg/ml 독소로 1시간 중독 시 WT LukAB CC8, CC45 및 CC8/CC45 독소에 대해 관찰하였다(도 7a). RARPR-33 및 CC8 LukA 단량체의 경우, CellTiter로 측정한 사멸 세포 백분율은 0.5 mg/ml의 농도에서 ~10%였다(도 7b). 최대 2.5 mg/ml의 RARPR-33 또는 CC8 LukA 단량체의 농도로 PMN을 인큐베이션하더라도 CellTiter 측정에 의해 결정된 사멸 세포 백분율을 더 이상 증가시키지 않았다.

LD₁₅ 값은 15% 세포 사멸을 유도하는 항원의 농도를 나타낸다. 선형 회귀를 사용하여 LD₁₅를 결정하였다. CC8 WT LukAB의 경우, LD₁₅는 0.013 μg/ml였고, CC45 WT LukAB의 경우, LD₁₅는 0.004 μg/ml였으며, CC8/CC45 LukAB 하이브리드의 경우, LD₁₅는 0.002 μg/ml였다. LukAB RARPR-33의 LD₁₅는 2.5 mg/ml이었다. LD₁₅ 값은 RARPR-33의 LD₁₅ 농도를 WT 항원의 LD₁₅ 농도로 나눔으로써 비교하였다. 이러한 관찰에 기초하여, LukAB RARPR-33 독성은 LukAB CC8 WT보다 >192,308배, LukAB CC45 WT보다 >625,000배, 및 LukAB CC8/CC45 하이브리드보다 >1,250,000배 적다.

또한, 상이한 WT 독소, CC8 LukA 단량체 또는 RARPR-33과 함께 2시간 인큐베이션한 후, 원형질 막 손상을 평가하기 위해 LDH 분석을 수행하였다. 인간 PMN의 세포독성은 WT 독소, CC8 WT, CC45 WT, 또는 CC8/CC45 독소 하이브리드에 2시간 노출 후 유도하였다(도 7c). 0.625 μg/ml 독소의 농도에서, LDH에 의해 결정된 최대 세포 사멸이 관찰되었다. 대조적으로, 최대 2.5 mg/ml의 농도에서 RARPR-33 또는 CC8 LukA 단량체에 2시간 노출 후 인간 PMN의 원형질 막 손상은 관찰되지 않았다(도 7d). 이들 데이터는, RARPR-33이 해독되어 최대 2.5 mg/ml의 농도에서 인간 PMN의 세포 사멸을 유도할 수 없음을 보여준다. RARPR-33의 CC8/CC45 LukAB 백본에 통합된 돌연변이는 CC8/CC45 WT LukAB 독소와 비교하여 세포독성을 고도로 약화시켰다.

예 8: RARPR-33 대 D39A /R23E 톡소이드의 비교

LukA에는 D39A 돌연변이가 있고 LukB에는 R23E 점 돌연변이가 있는 CC8 백본을 기반으로 하는 LukAB 변성독소가 생성되었다. 이러한 “D39A/R23E 톡소이드”는 Kailasan, S. 등의 “Rational Design of Toxoid Vaccine Candidates for Staphylococcus aureus Leukocidin AB (LukAB),” Toxins 11(6): (2019)에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 이 톡소이드는 LukAB CC8 백본에서 생성되었고, WT CC8 LukAB 독소와 비교하여 독성이 > 36,000배 약화된 것으로 기술되었다. 세포독성은 PMN-유사로 분화된 HL-60 세포주를 사용하여 결정하였다. 본 실험에서, D39A/R23E 톡소이드와 RARPR-33 간의 비교를 수행하였다. 인간 다형핵 백혈구(PMN)에 대한 세포독성을 결정하고, 면역화 시 광범위하게 독소 중화 항체를 유도하는 능력을 평가하였다.

방법:

세포독성 분석: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체의 세포독성을 평가하기 위해, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. 아우레우스(S. aureus) 독소로 중독시켰다. PMN을 분리하고, 50 μl RPMI당 200,000개의 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). 세포에 PBS 중 50 μl의 독소를 첨가하고, 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 독성을 평가하기 위해, 10 μl의 CellTiter 96 Aqueous One Solution (CellTiter; Promega)을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 5% CO₂에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 492 nm의 흡광도에서 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 PMN 생존력을 평가하였다. 사멸된 세포의 백분율은 배경(건강한 세포 + PBS)을 빼고 100% 죽은 상태로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 계산된다.

LDH 검정: 각각의 해당하는 LukAB 단백질 복합체가 세포 용해를 유발하는지 여부를 평가하기 위해, 상이한 공여자로부터 새로 분리된 일차 인간 다형핵 백혈구(PMN)를 S. 아우레우스(S. aureus) LukAB 독소로 중독시키고 LDH 방출을 측정하였다. 야생형 독소를 PBS에서 2배 연속 희석하고 0.5 μg/ml 내지 0.00024 μg/ml 범위의 농도로 시험하였다. LukAB 톡소이드를 PBS에서 1 mg/ml 내지 0.03125 mg/ml 범위의 농도로 희석하고 시험하였다. PMN을 분리하고 50 μl RPMI당 200,000 세포로 정규화하였다(10 mM HEPES + 0.1% HSA). 그런 다음, PMN(50 μl)을 각 웰에 피펫팅하고, 웰 당 50 μl의 희석된 독소를 첨가하였다. 독소-PMN 혼합물을 37℃ + 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. LDH 방출을 평가하기 위해, 플레이트를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리한 다음, 25 μl의 상청액을 각 웰로부터 제거하고 96-웰 흑색 투명-바닥 플레이트로 옮겼다. 25 μl의 CytoTox-ONE 균질 막 완전성 시약(Promega)을 흑색 투명-바닥 96-웰 플레이트에 첨가하고, 혼합물을 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해는 560 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장을 갖는 형광을 기록함으로써 PerkinElmer EnVision 2103 다중 표지 판독기로 평가하였다. 배경(건강한 세포 + PBS)을 차감하고 100% 사멸로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 사멸된 세포의 백분율을 계산하였다.

마우스 면역화. Envigo Hsd:ND4(4주령) 마우스(n=5/항원)에게 50 μl의 애쥬번트, TiterMax® Gold와 혼합된 50 μl의 10% 글리세롤 1X TBS 중 20 μg의 LukAB를 피하 투여하였다. 동일한 항원/애쥬번트 칵테일을 2회 추가 투여한 후, 독소 중화 연구를 위해 마우스를 심장 천자를 통해 채혈하고 혈청을 얻었다.

독소 중화 검정. 각 군으로부터 면역화된 마우스로부터의 혈청을 풀링하고, 55℃의 수조에서 30분 동안 열 불활성화시켰다. 그런 다음, 풀링된 열-불활성화 혈청을 PBS로 40%로 희석하였다. 그런 다음, 96 웰 플레이트에서 10 μl의 PBS에 40% 스톡을 2배 연속 희석하여 혈청의 추가 희석을 달성하였다. 독소(10 μl)를 0.156 μg/ml 독소(LD90)의 최종 농도로 혈청 웰에 첨가하였다. RPMI + 0.1% HSA + 10 mM HEPES 중 200,000개의 세포 농도로 80 μl의 hPMN을 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 37℃ + 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 역가를 중독물에 첨가하고 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트 판독기 상에서 492 nm 흡광도로 플레이트를 판독하였다. 배경(건강한 세포 +PBS)을 빼고, 100% 사멸로 설정된 TritonX-처리 세포에 대해 정규화함으로써 사멸된 세포 백분율을 계산하였다.

결과:

D39A/R23E 톡소이드의 세포독성은 최대 약 12 μg/ml까지 시험되는 것으로 보고되었다. 여기서, RARPR-33 및 D39A /R23E 톡소이드의 세포독성을 인간 PMN 상에서 1 mg/ml의 농도까지 결정하였다. 또한, 비교를 위해 WT LukAB CC8, CC45 및 CC8/CC45를 시험하였다. CellTiter 측정에 기반한 인간 PMN의 최대 세포독성은 ~0.02 μg/ml WT LukAB CC8/CC45, ~0.03 μg/ml LukAB CC8 및 0.125 μg/ml LukAB CC45로 1시간 동안 중독될 때 관찰되었다(도 8a). 5명의 공여자의 평균이 도시되어 있다. D39A/R23E 톡소이드의 경우, 1 mg/ml로 인큐베이션 시 약 22%의 세포독성이 관찰되었다. RARPR-33의 경우, CellTiter로 측정한 사멸 세포 백분율은 1 mg/ml의 농도에서 약 3%였다(도 8b).

또한, 상이한 WT 독소, D39A/R23E 톡소이드 및 RARPR-33과 함께 2시간 인큐베이션한 후 원형질 막 손상을 평가하기 위해 LDH 분석을 수행하였다. WT 독소, CC8 WT, CC45 WT 및 CC8/CC45 독소 혼성체의 조합에 노출된 후 2시간 후에 인간 PMN의 세포독성을 유도하였다(도 8c). LDH에 의해 결정된 최대 세포 사멸은 0.25 μg/ml 독소의 농도에서 관찰되었다. 최대 1 mg/ml의 D39A/R23E 톡소이드 농도로 2시간 동안 인간 PMN에 노출시켰을 때, 약 8%의 세포 사멸이 관찰되었다. 유사한 농도의 RARPR-33을 사용해 인간 PMN을 배양할 때, 원형질 막 손상이 관찰되지 않았으며, 세포 사멸이 없음을 나타낸다(도 8d). 이들 결과는 RARPR-33이 검정에서 검출 한계 미만으로 약독화되고 D39A /R23E 톡소이드보다 더 약독화됨을 나타낸다.

RARPR-33 또는 D39A/R23E 톡소이드로 면역화된 마우스의 혈청을 독소 중화 검정으로 시험하여 인간 PMN의 독소 유도 세포 사멸을 방지하는 혈청의 능력을 평가하였다. 4명의 공여자로부터 분리된 PMN에 대해 16개의 상이한 LukAB 독소를 대상으로 중화를 시험하였다.

RARPR 33-면역화된 마우스로부터의 0.125% 혈청의 존재 시에, 시험된 모든 16개의 LukAB 변이체의 세포독성 효과를 중화시켰다(도 9). 유사한 혈청 농도에서, D39A /R23E 톡소이드 면역화된 마우스의 혈청은 RARPR-33 면역화된 마우스의 혈청과 동일하게 LukAB CC8의 세포독성 효과에 대해서만 보호되었다. 다른 모든 독소에 대해, D39A/R23E 톡소이드 면역화된 마우스의 혈청에 대한 보호가 관찰되지 않거나 훨씬 더 낮은 보호가 관찰되었다. 이들 결과는 RARPR-33 면역화가 D39A /R23E 톡소이드로 면역화하는 것보다 훨씬 더 넓은 독소 중화 반응을 유도하였음을 보여준다.

예 9: LukAB 톡소이드의 열 안정화

야생형 단백질과 비교하여 LukAB 톡소이드의 안정성을, 접힌 상태로부터 풀린 상태로의 단백질의 전환의 중간 지점에 대응하는 용융 온도(Tm)를 추정하기 위해 고유한 트립토판 또는 티로신 형광을 사용하여 열 풀림 실험을 통해 평가하였다. NanoTemper의 PromethiusNT.Plex 기기(NanoTemper Inc., 독일 소재)를 사용하여 열 안정성을 평가하였다. 0.3 내지 1 mg/mL(20 μL, 완충액: 50 mM 인산나트륨 완충액, 200 mM NaCl, pH 7.4, 10% 글리세롤)의 단백질 샘플에 대해 각각의 샘플에 대한 2회 실시로 열 풀림 측정을 수행하였다. Prometheus NanoDSF 사용자 인터페이스(Melting Scan 탭)를 사용하여 실행을 위한 실험 파라미터를 설정하였다. 전형적인 샘플에 대한 열 스캔은 1.0℃/분의 속도로 20℃ 내지 95℃에 걸쳐 있다. 샘플에 사용된 동일한 완충액 중의 표준 mAb(CNTO5825 또는 NIST)를 대조군으로서 포함시키고, 실행을 2회 수행하였다. 열 용융 프로파일을 벤더 소프트웨어 PR.ThermControl로 분석해서 단백질의 50%가 풀리는 온도(Tm)를 결정하였다.

표 8 및 표 9는 nanoDSF에 의해 평가했을 때, LukA 및 LukAB 톡소이드 단백질의 열 안정성을 보여준다. 단백질 풀림의 시작 온도(Tonset) 및 단백질 풀림의 전환의 중간 지점(Tm1)이 안정화 치환을 갖는 또는 갖지 않는 유사한 작제물 간의 Tm 차이(ΔTm)와 함께 제시된다.

CC45 유전적 배경에서의 단일 치환 및 하이브리드 CC8 / CC45 유전적 배경에서의 조합 치환

독소 명칭	LukA	LukB	Tonset	Tm1	ΔTm ^a
CC45 독소	CC45 LukA^E321A	CC45 LukB^wt	40.3	47.3	--
CC8 / CC45 독소	CC8 LukA^E320A	CC45 LukB^wt	37.7	43.9	--
	CC45 LukA^{E321A, Lys81Met}	CC45 LukB^wt	40.5	47.4	0.1
	CC45 LukA^{E321A, Ser139Ala}	CC45 LukB^wt	40.5	47.4	0.1
	CC45 LukA^{E321A, Val111Ile}	CC45 LukB^wt	40.0	47.7	0.4
	CC45 LukA^{E321A, Val190Ile}	CC45 LukB^wt	40.5	47.5	0.2
	CC45 LukA^{E321A, Thr247Val}	CC45 LukB^wt	41.3	47.3	0
	CC45 LukA^E321A	CC45 LukB^Val53Leu	40.7	47.8	0.5
RARPR-15	CC45 LukA ^{E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile}	CC45 LukB^wt	41.2	48.9	1.6
RARPR-33	CC8 LukA ^{E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile}	CC45 LukB^Val53Leu	40.0	47.9	4.0
LukA 단량체	CC8 LukA ^{E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val, Tyr71Cys, Asp137Cys, Gly146Cys, Gly153Cys}	LukB 없음	45.2	61.8	--
LukA 단량체	CC45 LukA ^{E321A, Lys81Met, Ser139Ala, Val111Ile, Val191Ile, Thr247Val, Tyr72Cys, Asp138Cys, Gly147Cys, Gly154Cys}	LukB 없음	51.9	58.1	--

^aΔTm은 하나 이상의 치환을 운반하는 대응하는 LukAB 단백질과 비교하여, 안정화 치환 및 이황화 결합 없는 CC45 또는 CC8/CC45 독소에 대한 Tm 값 사이의 차이를 나타낸다.

LukA 단량체는 이황화 결합 형성을 지원하기 위해 E. coli의 주변 세포질에 발현을 지시하기 위한 N-말단 PelB 신호 서열을 포함하였다.

이황화 결합 형성을 지원하기 위해 시스테인 치환 쌍을 운반하는 LukAB 이량체는 E. coli Origami 2(DE3) 세포의 세포질에서 발현되었다.

CC8 유전적 배경에서의 단일 치환 및 하이브리드 CC8 / CC45 유전적 배경에서의 조합 치환.

독소 명칭	LukA	LukB	Tonset	Tm1	ΔTm ^a
CC45 독소	CC45 LukA^E321A	CC45 LukB^wt	37.8	45.3	--
CC8 / CC45 독소	CC8 LukA^E320A	CC45 LukB^wt	35.3	42.2	--
	CC8 LukA^{E320A, Lys80Met}	CC45 LukB^wt	38.8	44.9	2.7
	CC8 LukA^{E320A, Ser138Ala}	CC45 LukB^wt	38.9	44.7	2.5
	CC8 LukA^{E320A, Val110Ile}	CC45 LukB^wt	38.0	44.0	1.8
	CC8 LukA^{E320A, Val190Ile}	CC45 LukB^wt	37.2	43.5	1.3
	CC8 LukA^{E320A, Thr246Ile}	CC45 LukB^wt	36.4	43.1	0.9
	CC8 LukA ^{E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile, Thr246Val}	CC45 LukB^wt	40.5	46.8	4.6
RARPR-33	CC8 LukA ^{E320A, Lys80Met, Ser138Ala, Val110Ile, Val190Ile}	CC45 LukB^Val53Leu	38.8	46.3	4.1

결과: 열 안정성 분석(표 8)은 CC45 LukA^E321A / CC45 LukB 단백질이 CC8 LukA^E321A / CC45 LukB 하이브리드 단백질에 대한 Tm 보다 3℃ 더 높은 Tm 값을 나타냄을 밝혔다. CC45 LukA에서의 개별 치환은, CC45 LukB^wt와 조합하여, Tm을 0 내지 0.4℃로 약간 증가시켰다. LukB에서의 Val53Leu 치환은 Tm을 0.5℃ 증가시켰다. 하이브리드 LukAB 톡소이드가 CC8 LukA 배경을 포함하였으므로, 야생형 CC45 LukB와 조합된 CC8 LukA에서 개별 아미노산 치환을 시험하였다(표 9). CC45 LukA로 확인한 바와 같이, CC8 LukA에서의 개별 치환 또한 야생형 LukAB보다 높은 Tm 값을 증가시켰다. LukA(RARPR-15)에서의 치환의 조합은 CC45 LukA^E321A / CC45 LukB 단백질보다 1.6℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였고, LukB^Val53Leu (RARPR-33)와의 CC8 LukA 치환의 조합은 CC8 LukA^E321A / CC45 LukB 하이브리드보다 4℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였다. RARPR-33의 증가된 열 안정성은 두 데이터세트 모두에서 관찰되었다(표 8 및 9). nanoDSF가 50℃ 미만에서 풀리는 단백질에 대해 약간의 변동성을 생성할 수 있지만, 각각의 세트 내에서 실행되는 대조군을 사용하여 결정된 ΔTm은 4.0 및 4.1℃에서 각각 데이터세트에 걸쳐 일관성이 있었다. LukA 단량체는 치환의 조합 및 시스테인 치환 쌍을 모두 포함하였고, ≥58℃의 상승된 Tm 값을 나타내어, 증가된 열 안정성을 위한 이황화 결합의 추가 기여를 나타냈다.

예 1-9 논의:

본원에 기술된 안정한 LukAB 변이체 이종이량체 톡소이드는 S. 아우레우스(S. 아우레우스) 백신 항원 후보로서 매우 적합한 것으로 여겨지는 여러 가지 특징을 갖는다.

첫째, RARPR-30, RARPR-31, RARPR-32, RARPR-33, RARPR-34, 및 RARPR-15를 포함하여, LukA 단량체 및 LukAB 이량체 톡소이드는 야생형 독소 및 다른 공지된 톡소이드(즉, CC8delta10 및 CC45delta10 톡소이드)와 비교하여 분화된 인간 THP-1 및 인간 PMN에 대해 현저하게 감소된 세포독성을 나타냈다. 최대 2.5 mg/ml의 농도에서도, RARPR-33은 세포독성이 없는 것으로 유지되어, 완전한 약독화를 입증하였다.

둘째, LukA 및 LukB 변이체 단백질에 도입된 치환의 조합은 단일 치환만을 함유하는 대응하는 톡소이드에 비해 이종이량체 RARPR 복합체의 열 안정성을 상당히 향상시켰다. 특히, LukA(RARPR-15)에서의 치환의 조합은 CC45 LukA^E321A / CC45 LukB 단백질보다 1.6℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였고, CC8 LukA 치환과 LukB^Val53Leu (RARPR-33)의 조합은 CC8 LukA^E321A / CC45 LukB 하이브리드보다 4℃ 더 높은 Tm 값을 생성하였다.

약독화된 세포독성 및 향상된 열 안정성에 더하여, 본원에 기술된 LukAB RARPR 톡소이드, 특히 RARPR-15, RARPR-33, 및 RARPR-34는 야생형 CC45 및 CC8 독소, 야생형 하이브리드 독소, 및 E323A 톡소이드 및 D39A/R23E 톡소이드를 포함하는, 톡소이드보다 유사하거나 더 넓은 독소 중화 반응 및 중화 항체의 더 높은 역가를 유도했다.

요약하면, 약독화된 세포독성, 개선된 열 안정성, 강력한 면역원성, 및 광범위한 중화 항체 프로파일은 본원에 기술된 LukAB RARPR 톡소이드를 이상적인 백신 항원 후보물질로 만든다.

예 10: 수술 상처가 있는 미니피그 감염 모델에서 LukAB RARPR-33, SpA*, 및 GLA-SE의 효능

실험의 목적은 톨 유사 수용체 4(TLR) 작용제인 글루코피라노실 지질 애쥬번트(GLA)가 있거나 없이 Spa 변이체 항원과 RARPR LukAB 이량체의 조합이 괴팅겐 미니피그의 S. 아우레우스(S. aureus) 수술 상처가 있는 감염 모델에서 보호를 제공할 수 있는지 여부를 평가하는 것이었다. 시험한 Spa 변이체 항원(Spa*)은 서열번호 60의 아미노산 서열을 가졌다. 시험된 돌연변이 LukAB 이량체 RARPR-33은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. GLA 애쥬번트를 안정한 유화액(SE)에 제형화하고, 10 μg의 GLA 및 2%의 SE를 함유하였다.

생체 내 실험. 수컷 괴팅겐 미니피그(군 당 3마리 돼지)를 도 10에 도시된 일정에 따라 3주 간격으로 3번의 별개로 근육내 면역화하였고, 다음의 조성물 또는 조성물의 조합을 사용하였다:

1. 완충액 대조군(애쥬번트 없음, LukAb RARPR-33 없음, Spa 없음*)

2. LukAB RARPR-33 (100 μg) + Spa* (100 μg) + 애쥬번트 GLA-SE (10 μg)

3. LukAB RARPR-33 (100 μg) + Spa* (100 μg), 애쥬번트 없음

4. 애쥬번트 단독 GLA-SE (10 μg)

백신접종 후, 돼지에게 임상적으로 관련된 S. 아우레우스(S. aureus) 균주, 즉 클론 복합체(CC, Clonal Complex) 398을 접종하였다. 감염 후 +8일차에, 돼지를 안락사시키고 수술 부위에서의 박테리아 부담을 결정하였다.

연구의 일차 평가변수는 애쥬번트가 있거나 없는 LukAB + Spa 변이체로 백신접종된 동물에서 수술 부위에서 박테리아 부담(cfu)의 감소였다. 애쥬번트 단독 또는 정형화 완충액 단독 백신접종을 대조군으로서 사용하였다.

재료 및 방법:

미니피그 수술 상처 감염 방법: 5 내지 8개월령 수컷 괴팅겐 미니피그(Marshall Biosciences, 뉴욕주 노스 로즈 소재)를 군으로 사육하고, 물을 자유롭게 섭취하게 하면서 12시간 명암 주기로 유지하였다. 수술 아침에, 공복 미니피그를 진정시키고, 삽관하고, 수술 기간 동안 이소플루란 마취 하에 두었다. 수술은 좌측 대퇴부에서 수행하였고, 이에 의해 근육층을 노출시키고 5- mm 날 없는 투관침(Endopath® Xcel, Ethicon Endo-Surgery, 푸에르토리코 과이나보 소재)을 대퇴골의 깊이까지 전진시켰다. 20 μl 접종물(약 6 log10 CFU/ml S. 아우레우스)로 이루어진 박테리아 접종물을 투관침을 통해 6 인치 MILA 척수 바늘(Mila International, Inc., 켄터키주 플로렌스 소재)을 통해 상처(대퇴골의 상단)에 주입한 다음 제거하였다. 박테리아 접종의 투여 후, 근육을 단일 실크 봉합사로 봉합하고, 피부를 흡수성 PDS 봉합사로 봉합하였다. 8일 후, 진정 하에 미니피그를 바르비투르산염으로 안락사시켰다. 일단 사망이 확인되면, 미생물학을 위해 기관을 별도로 처리하였다. 샘플을 Bead Ruptorlite(Omni International, 미국 조지아주 케네소 소재)를 사용하여 식염수에서 균질화시킨 다음, Autoplate 5000 Spiral Plater(Spiral Biotech, 미국 매사추세츠주 노우드 소재)를 사용하여 희석하고 TSA 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 37°에서 18-24시간 동안 인큐베이션한 다음, QCount 콜로니 계수기(Spiral Biotech, 미국 매사추세츠주 노우드 소재)에서 판독하였다.

Dunnett의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA를 수행하여 다수의 군 간의 통계적 유의성을 검정하였다. ANOVA 모델은 군 및 수술 날짜를 설명 인자로서 포함하였다. 모든 동물 연구는 얀센 스프링 하우스 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Janssen Spring House Institutional Animal Care and Use Committee)의 검토 및 승인을 받았고 AAALAC 인증 시설에 수용하였다.

결과:

미니피그 수술 상처 감염 모델에서의 효능. 애쥬번트 유무와 상관없이 백신의 효능을 시험하기 위해, 3회의 면역화 및 클론 복합체 CC398에 속하는 S. 아우레우스(S. aureus) 균주를 이용한 접종 후 중간 근육 및 심부 근육에서 콜로니 형성 단위(cfu)의 수를 결정하였다.

중간 근육에서, LukAB, Spa* + 애쥬번트(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 1.61)의 조합으로 면역화한 결과, 애쥬번트 없이 LukAB 및 Spa*로 면역화한 군(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 6.03, P= 0.0018)에 비해 또는 애쥬번트만을 투여한 군(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 6.08, P= 0.0017)에 비해 cfu가 유의하게 감소하였다(도 11a). 완충액 대조군(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 5.77)을 애쥬번트 단독군(P= 0.8711) 또는 LukAB RARPR-33 + Spa*군(P= 0.9392)과 비교했을 때 cfu의 유의한 차이는 발견되지 않았다. 그러나, 완충액 대조군과 LukAB RARPR-33, Spa* + 애쥬번트(P= 0.0006)를 투여한 동물 사이에서 cfu의 유의한 감소가 발견되었다(P= 0.0006). 이들 결과는 애쥬번트 자체가 보호 효과를 제공하지 않음을 나타낸다.

심부 근육에서, 애쥬번트 없이 LukAB와 Spa*의 조합으로 면역화한 결과 cfu가 감소하였다(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 4.18, P= 0.1389). LukAB RARPR-33, Spa* + 애쥬번트의 조합으로 면역화한 결과, 애쥬번트 없이 LukAB 및 Spa*로 면역화된 군에 비해 cfu가 훨씬 더 크게 감소하였고(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 1.58), 애쥬번트만을 투여한 군에 비해 유의한 감소가 나타났다(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 6.37, P= 0.0360) (도 11b). 완충액 대조군(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 6.14)을 애쥬번트 단독군(P= 0.9931) 또는 LukAB RARPR-33 + Spa* 군(P= 0.3953)과 비교했을 때 cfu에서 유의한 차이는 발견되지 않았다. 그러나, 완충액 대조군과 LukAB RARPR-33, Spa* + 애쥬번트를 투여한 동물 사이에서 cfu의 유의한 감소가 발견되었다(P= 0.0137).

이들 결과는 LukAB RARPR-33 및 Spa* 조합이 미니피그 수술 부위 감염 모델에서 박테리아 부담을 감소시키는 데 효과적이었고 GLA-SE 애쥬번트의 첨가가 수술 부위에서 박테리아 부하의 감소를 더욱 향상시켰음을 보여준다.

결론: 백신 조성물의 효능을 시험하기 위해, 미니피그 수술 상처 감염 모델에서 박테리아 부담을 감소시키는 백신의 능력을 관련 S. 아우레우스(S. aureus) 균주를 사용하여 결정하였다. 백신 조성물의 LukAB RARPR-33 + Spa* 조합으로 미니피그를 면역화한 결과, 관련 S. 아우레우스(S. aureus) 균주를 접종한 후 근육 내 콜로니 형성 단위의 수가 감소하였다. 백신 조합에 대한 GLA-SE 애쥬번트의 첨가는 박테리아 부담을 더욱 감소시켰다. 따라서, GLA-SE 애쥬번트와 함께, LukAB 톡소이드 및 Spa* 돌연변이를 함유하는 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 후보는 미니피그 수술 부위 감염 모델에서 깊게 착상된 S. 아우레우스(S. aureus) 감염으로부터 효과적으로 보호되었다.

예 11: 수술 상처가 있는 미니피그 감염 모델에서 면역원성 조성물에 의해 유도된 면역 반응

실험의 목적은 Spa 변이체 항원과 LukAB RARPR-33 이량체의 조합이 괴팅겐 미니피그의 아우레우스(S. aureus) 수술 상처가 있는 감염 모델에서 2개의 상이한 애쥬번트와 추가로 조합된 보호 기능을 제공하는지 여부를 평가하는 것이었다. 시험한 Spa 변이체 항원(SpA*)은 서열번호 60의 아미노산 서열을 가졌다. 시험된 LukAB RARPR 이량체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 본 실험의 일 아암에서, 면허된 Shingrix 백신의 일부이고(Leroux 등, 2016) TLR4 작용제 MPL 및 QS-21을 함유하는 AS01b 애쥬번트를 시험하였다. 실험의 다른 아암에서, 안정한 유화액으로 제형화된 TLR4 작용제 GLA를 함유하는 GLA-SE 애쥬번트를 시험하였다. 안정한 유화액은 수중유 유화액이었으며, 여기서 오일은 스쿠알렌이었다.

미니피그 모델을 사용하여 백신 후보물질의 면역원성(항원-특이적 IgG의 생성과 관련하여) 및 효능 둘 다를 평가하였다. 미니피그는 그들의 면역 체계 및 기관 및 피부 구조가 인간의 것과 대부분 유사하기 때문에 감염성 질환 연구에 널리 사용되어 왔다. 이 모델에서, S. 아우레우스(S. aureus) 박테리아에 의한 상처의 감염 후, 국소 감염은 수술 부위의 근육 및 피부의 층 전체에 걸쳐 발생한다. 다른 내부 기관에 대한 감염 전파도 관찰되며, 질환의 진행은 인간에서의 진행과 매우 유사하다.

미니피그 다형핵 호중구(PMN)에 대한 LukAB 독성은 인간 PMN에서 관찰된 것과 유사하다. 이는 독소 표적의 종-특이성으로 인해 마우스 및 토끼 PMN에서 관찰된 매우 감소된 LukAB 독성과 대조적이다. 또한, 돼지에 의한 스태필로코쿠스 종의 빈번한 운반으로 인해, 성인 인간(실험실 설치류는 아님)과 유사한 미니피그는 종종 스태필로코쿠스 항원(LutkAB 및 다른 S. 아우레우스(S. aureus) 단백질 포함)에 대한 높은 수준의 기존 항체를 갖는다. 따라서, 이 모델은 인간에서, 특히 LukAB 및 Spa 변이체를 함유하는 백신의 경우, 이전에 이용 가능한 설치류 모델보다 잠재적 백신 보호의 보다 신뢰성 있는 지표일 가능성이 있다.

생체 내 실험. 수컷 괴팅겐 미니피그(군 당 3마리 돼지)를 도 12에 도시된 일정에 따라 3주 간격으로 3번의 별개로 근육내 면역화하였고, 다음의 조성물 또는 조성물의 조합을 사용하였다:

1. 완충액 대조군(애쥬번트 없음, LukAB RARPR 없음, Spa 변이체 없음)

2. LukAB RARPR-33 (100 μg) + SpA* (100 μg) + 애쥬번트 AS01b (25 μg MPL + 25 μg QS-21)

3. LukAB RARPR-33 (100 μg) + SpA* (100 μg) + 애쥬번트 GLA-SE (10 μg GLA)

백신접종 후, 돼지에게 임상적으로 관련된 S. 아우레우스(S. aureus) 균주인 클론 복합체(CC, Clonal Complex) 398을 접종하였다. 감염 후 +8일차에, 돼지를 안락사시키고 수술 부위 및 내부 기관에서의 박테리아 부담을 결정하였다.

도 12에 도시된 바와 같이, 연구 시적 전과 백신접종 기간 동안 정기적인 간격으로 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈청 면역글로불린 양 및 기능을 평가하기 위해 혈청 분석을 수행하였다.

연구의 일차 평가변수는 LukAB + SpA* 및 상이한 애쥬번트로 백신접종된 동물의 수술 부위/기관에서의 박테리아 부담(CFU)의 감소였다. 완충액 단독을 사용한 백신접종을 대조군으로서 사용하였다.

재료 및 방법:

효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정된 LukAB 및 SpA에 대한 항체 반응: LukAB CC8 및 LukAB CC45에 대한 IgG 항체 수준을 측정하기 위해, 384-웰 Nunc 플레이트(Thermo Fisher Scientific)를 PBS 중 1.0 μg/ml LukAB CC8 또는 LukAB CC45로 코팅하고 2-8℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS + 0.05% Tween-20으로 세척한 후, 플레이트를 2.5% 탈지 우유로 차단하고, 세척하고, 희석 완충액(1xPBS 중 2.5%(w/v) 탈지 우유 분말)에서 1:10으로 시작하여 제조된 혈청의 연속 3배 희석물을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 1:10,000으로 희석된 항-Pig IgG-HRP 이차 항체(Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, TMB 기질(Leinco Technologies)로 플레이트를 발현시켰다. 1M 황산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 반수 최대 유효 농도로 정의된 EC₅₀ 역가는 4-파라미터 로지스틱(PL) 비선형 회귀 모델로 분석한 중복 12단계 적정 곡선에 기초하여 계산하였다. EC50 역가가 30 미만인 샘플을 30으로 검열하였다. 잠재적으로 검열된 값에 대한 Tobit 모델을 사용하여 3회의 면역화 후 백신 + 애쥬번트군 대 완충액 단독군 간의 통계적 유의성을 검정하였다. Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 보정하였다. SpA*에 대한 항체를 측정하기 위해, 96-웰 maxisorp 플레이트를 PBS 중 0.25 μg/ml SpA*로 코팅하고, 2-8℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이차 항체는 차단 완충액 중 항-피그 IgG-HRP의 1:10,000 희석물이었다. 다른 단계는 항-LukAB 항체 반응의 측정을 위해 전술한 바와 유사하였다. 잠재적으로 검열된 값에 대한 Tobit 모델을 사용하여 3회의 면역화 후 백신 + 애쥬번트군 대 완충액 단독군 간의 통계적 유의성을 검정하였다. Bonferroni 보정을 사용하여 다중 비교를 보정하였다.

LukAB 독소 중화 분석. Cyto-Tox-One 키트(Promega)를 사용하여 손상된 막을 갖는 세포로부터 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출을 측정하였다. THP-1 세포를 원심분리하고 RPMI로 2 × 10⁶ 세포/mL의 밀도로 재현탁하였다. 혈청의 연속 3배 희석물 또는 기준 LukAB 단클론 항체의 3배 연속 희석물을 2,500 ng/mL의 시작 농도로 함유하는 96 웰 배양 플레이트에 세포(50 μL)를 첨가하였다. LukAB 독소 CC8, CC45, CC22a, 또는 CC398을 40 ng/mL(CC8, CC22a, CC398) 또는 20 ng/mL(CC45)의 최종 농도로 시험 웰에 첨가하였다. 용해 용액(Promega)을 용해 대조군 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 원심분리하고, 25 μL의 상청액을 새로운 플레이트에 옮기고, 25 μL의 CytoTox-ONE 시약(Promega)을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고 정지 용액(Promega)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 560의 여기 파장 및 5 nm의 대역폭 및 590의 방출 파장 및 10 nm의 대역폭을 갖는 단색으로 Biotek Synergy Neo 2 판독기로 판독하였다. 획득은 120-130으로 설정된다. 모든 혈청 샘플 및 LukAB 단클론 기준 항체에 대해 50% 세포독성이 관찰된 농도를 나타내는 IC₅₀ 역가를 결정하였다. 혈청 샘플과 기준 단클론 항체 간의 IC₅₀ 역가의 차이를 나타내는 상대 역가를 출력 값으로 사용하였다. 3회 면역화 후 백신군의 상대 역가를 완충액군과 비교하였다. Dunnett의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA를 수행하여 백신군 대 완충액군 간의 통계적 유의성을 검정하였다.

미니피그 수술 상처 감염 방법: 5 내지 8개월령 수컷 괴팅겐 미니피그(Marshall Biosciences, 뉴욕주 노스 로즈 소재)를 군으로 사육하고, 물을 자유롭게 섭취하게 하면서 12시간 명암 주기로 유지하였다. 수술 아침에, 공복 미니피그를 진정시키고, 삽관하고, 수술 기간 동안 이소플루란 마취 하에 두었다. 수술은 좌측 대퇴부에서 수행하였고, 이에 의해 근육층을 노출시키고 5- mm 날 없는 투관침(Endopath® Xcel, Ethicon Endo-Surgery, 푸에르토리코 과이나보 소재)을 대퇴골의 깊이까지 전진시켰다. 20 μl 접종물(약 6 log₁₀CFU/ml S. 아우레우스(S. aureus))로 이루어진 박테리아 접종물을 투관침을 통해 6 인치 MILA 척수 바늘(Mila International, Inc., 켄터키주 플로렌스 소재)을 통해 상처(대퇴골의 상단)에 주입한 다음 제거하였다. 박테리아 접종의 투여 후, 근육을 단일 실크 봉합사로 봉합하고, 피부를 흡수성 PDS 봉합사로 봉합하였다. 8일 후, 진정 하에 미니피그를 바르비투르산염으로 안락사시켰다. 일단 사망이 확인되면, 미생물학을 위해 기관을 별도로 처리하였다. 샘플을 Bead Ruptorlite(Omni International, 미국 조지아주 케네소 소재)를 사용하여 식염수에서 균질화시킨 다음, Autoplate 5000 Spiral Plater(Spiral Biotech, 미국 매사추세츠주 노우드 소재)를 사용하여 희석하고 TSA 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 18-24시간 동안 인큐베이션한 다음, QCount 콜로니 계수기(Spiral Biotech, 미국 매사추세츠주 노우드 소재)에서 판독하였다.

Dunnett의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA를 수행하여 완충액군과 LukAB RARPR-33 + SpA* + 상이한 애쥬번트로 면역화된 군 간의 통계적 유의성을 검정하였다. ANOVA 모델은 군 및 수술 날짜를 설명 인자로서 포함하였다. 모든 동물 연구는 얀센 스프링 하우스 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Janssen Spring House Institutional Animal Care and Use Committee)의 검토 및 승인을 받았고 AAALAC 인증 시설에 수용하였다.

결과:

LukAB 및 SpA*에 대해 유도된 항체 반응. 전술한 미니피그군을 LukAB RARPR-33(100 μg) 및 SpA*(100 μg) + 애쥬번트 AS01b(25 μg MPL 및 25 μg QS-21) 또는 GLA-SE(10 μg GLA, 안정한 유화액)의 조합으로 3주 간격으로 3회 면역화하였다. 완충액만을 투여한 동물 대조군을 포함시켰다. 세 번째 면역화 후 3주차에 동물에게 S. 아우레우스(S. aureus)를 접종하였다. 혈액 샘플을 각각의 면역화 전에 및 접종 전에 채취하고(도 12), ELISA에 의해 LukAB 및 SpA*에 대한 항체 반응에 대해 분석하였다. 완충액으로만 면역화된 동물에서, 낮은 수준의 항-LukAB CC8 및 CC45 IgG 항체를 측정하였는데, 이는 LukAB에 대한 기존 항체의 존재를 나타낸다(도 13a 및 13b). 혈청 내 항체 수준은 실험 과정 내내 시간이 증가하지 않았다. 3회 면역화 후, AS01b 또는 GLA-SE로 보강된 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화한 결과 대조군에 비해 더 높은 기하 평균(Geomean) 항 LukAB CC8 및 LukAB CC45 IgG 역가를 초래하였다(도 13a 및 13b, 3회 면역화 후 Geomean IgG 역가 LukAB CC8: LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 64637; P=0.0034 LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 116357, P = 0.0003; 완충액 대조군: 2931. 3회 면역화 후 Geomean IgG 역가 LukAB CC45: LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 19764, P< 0.0001; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 11620, P< 0.0001; 완충액 대조군: 129).

완충액으로 면역화된 미니피그는 임의의 시점에서 SpA*에 대한 측정 가능한 항체가 없었다(도 13c 참조). AS01b 또는 GLA-SE로 보강된 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화한 결과, 3회 면역화 후 대조군에 비해 더 높은 기하 평균(Geomean) 항 SpA* IgG 역가를 초래하였다. (도 13c, 3회 면역화 후 Geomean IgG SpA*: LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 7013, P< 0.0001; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 1770, P< 0.0001; 완충액 대조군: 30). 이들 결과는 LukAB + SpA* + 애쥬번트 백신에 의한 SpA* 특이적 항체의 유도를 나타낸다.

LukAB 독소의 세포독성 활성의 중화. LukAB는 호중구 상의 수용체에 결합하는 독소로서, 막에 기공을 형성하여 세포의 용해를 초래한다. 시험 백신에 의해 유도된 항체의 기능을 평가하기 위해, 백신접종된 미니피그로부터의 혈청이 THP-1 세포의 LukAB 독소 유도 용해를 억제하는 능력을 측정하였다. 검정에서의 야생형 LukAB 독소는 클론 복합체 CC8 또는 CC45로부터 유래하였다. LukAB RARPR-33의 LukA는 클론 복합체 CC8로부터 유래되고, LukAB RARPR-33의 LukB는 클론 복합체 CC45로부터 유래된다. 기준 단클론 LukAB 특이적 항체도 분석에 사용하였다. 혈청 샘플과 기준 항체 간의 세포독성의 50%가 측정되는 희석을 나타내는 IC50 역가의 차이를 결정하고 상대 역가 역가(RP-역가)로서 도표화하였다. 실험 시작 시 미니피그의 혈청에서 LukAB CC8 및 LukAB CC45에 대한 중화 항체를 검출하였다(면역화 전 완충액 대조군에서 LukAB CC8 Geomean RP 역가: 1126; LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 1483; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 896. 면역화 전 완충액 대조군에서 LukAB CC45 Geomean RP 역가: 616; LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 954; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 637). 완충액으로 백신접종된 동물에서만 RP-역가는 실험 과정에 걸쳐 변하지 않았다(3회 면역화 후 Geomean RP 역가 LukAB CC8: 1497; LukAB CC45: 884). LukAB + SpA* + 애쥬번트로 백신접종된 동물에서, 3회 면역화 후 혈청에서 유의하게 더 높은 GeoMean RP 역가를 측정하였다(LukAB CC8 Geomean RP 역가 LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 17095, P = 0.0007; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 10285, P = 0.0116. LukAB CC45 Geomean RP 역가 LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 20019, P = 0.0022; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 16612, P = 0.0047). 도 14a 및 도 14b에 도시된 바와 같이, 결과는 백신(RARPR-33) 중의 LukAB가 LukAB 독소의 세포독성 활성을 차단하는 기능적 항체를 유도함을 나타낸다.

LukAB 독소의 세포독성 활성의 교차 중화. 다음으로, LukAB RARPR-33 + SpA* 및 상이한 애쥬번트로 면역화 시 미니피그에서 유도된 항체가 RARPR-33의 골격에 존재하지 않은 LukAB 서열 변이체의 세포독성을 교차 중화시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. 이를 위해, LukAB 서열 변이체 CC22a 및 CC398을 사용하였다. 교차 중화는 THP-1 세포의 LukAB 독소 유도 용해를 억제하는 혈청의 능력을 평가함으로써 측정하였다. 기준 단클론 LukAB 특이적 항체를 분석에도 사용하였고, 상대 효능 역가를 전술한 바와 같이 결정하였다. LukAB CC22a 및 LukAB CC398에 대한 교차 중화 항체는 실험 시작 시 미니피그 혈청에서 검출 가능하였다(면역화 전 완충액 대조군의 CC22a Geomean RP 역가: 541; LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 846; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 436. 면역화 전 완충액 대조군에서 LukAB CC398 Geomean RP 역가: 1061; LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 1090; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 608). 완충액 단독으로 백신접종된 동물에서 RP-역가는 실험 과정에 걸쳐 변하지 않았다(3회 면역화 후 Geomean RP 역가 LukAB CC22a: 761; LukAB CC398: 1270). LukAB + SpA* + 애쥬번트(AS01b 또는 GLA-SE)로 백신접종된 동물에서, 3회 면역화 후 혈청에서 유의하게 더 높은 GeoMean RP 역가를 측정되었다(LukAB CC22a Geomean RP 역가 LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 7524, P = 0.0040; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 5025, P = 0.0312. LukAB CC398 Geomean RP 역가 LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b: 14396, P = 0.0005; LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE: 8051, P = 0.0146). 도 14c 및 도 14d에 도시돤 바와 같이, 결과는 백신(RARPR-33) 중의 LukAB가 다양한 LukAB 독소 서열 변이체의 세포독성 활성을 차단하는 교차 중화 항체를 유도함을 나타낸다.

미니피그 수술 상처 감염 모델에서의 효능: 백신 효능을 시험하기 위해, 클론 복합체 CC398로부터의 S. 아우레우스(S. aureus)로의 3회 면역화 및 접종 후 근육(중간 및 심부) 및 비장의 2개의 부위에서 콜로니 형성 단위(cfu)의 수를 결정하였다. LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b 애쥬번트(GeoMean log₁₀ cfu/g 근육(중간) = 0.98, P=0.0057) 또는 LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE (GeoMean log₁₀ cfu/g 근육(중간) = 0.83, P=0.0046)로 면역화한 결과 애쥬번트 단독군(GeoMean log₁₀ cfu/g 근육(중간) = 5.99)과 비교하여 중간 근육에서 cfu가 유의하게 감소하였다(도 15a). LukAB RARPR-33 + SpA* + AS01b 애쥬번트(GeoMean log₁₀ cfu/g 근육(심부) = 0.58, P=0.0024) 또는 LukAB RARPR-33 + SpA* + GLA-SE(GeoMean log₁₀ cfu/g 근육(심부) = 0.76, P=0.0031)로 면역화한 결과 애쥬번트 단독군(GeoMean log₁₀ cfu/g 근육(심부) = 6.10)과 비교하여 심부 근육에서 cfu의 유의한 감소를 초래하였다(도 15b). 비장에서, LukAB + SpA* + AS01b 또는 LukAB + SpA* + GLA-SE (GeoMean log₁₀ cfu/g 비장 =0.51, 각각 P=0.0138 및 0.45, P=0.0120)로 면역화한 것에 비해, 애쥬번트 단독(GeoMean log₁₀ cfu/g 비장 = 2.20)으로 면역화된 대조군에서 더 높은 수준의 cfu가 관찰되었다(도 15c). 도 15a 내지 도 15c에 도시된 바와 같이, 결과는 시험된 백신 조합이 미니피그 수술 부위 감염 모델에서 효과적임을 나타낸다. 백신은 또한 비장과 같은 기관으로 박테리아의 확산을 감소시킨다.

결론: 애쥬번트를 갖는 항원 LukAB RARPR-33 및 SpA*를 함유하는 백신 조성물은 LukAB CC8, LukAB CC45 및 SpA*에 대한 IgG 항체가 유도되었기 때문에 미니피그에서 면역원성인 것으로 나타났다. 항-LukAB IgG 항체의 증가는 LukAB 독소의 세포독성 활성의 교차 중화 증가와 관련이 있었으며, 이는 유도된 IgG 항체가 기능적임을 나타낸다. 백신 조성물의 효능을 시험하기 위해, 미니피그 수술 상처 감염 모델에서 박테리아 부담을 감소시키는 백신의 능력을 관련 S. 아우레우스(S. aureus) 균주를 사용하여 결정하였다. LukAB RARPR-33 + SpA* + 애쥬번트 백신 조성물로 미니피그를 면역화한 결과, 시험 균주로 접종한 후 근육 내 콜로니 형성 단위의 수가 유의하게 감소하였다. 백신 조성물은 또한 비장에서 cfu의 유의한 감소를 초래하였다. 따라서, LukAB 및 SpA 톡소이드 돌연변이체를 함유하는 시험된 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 후보물질은 미니피그 수술 부위 감염 모델에서 깊게 착상된 S. 아우레우스(S. aureus) 감염으로부터 효과적으로 보호되었다.

예 12: S. 아우레우스( S. aureus ) USA300 균주에 대한 수술 상처가 있는 미니피그 감염 모델에서 LukAB RARPR-33 및 Spa*의 효능

실시예 10에서, 애쥬번트 없이 LukAB RARPR-33과 Spa*의 조합은 미니피그의 수술 부위 감염 모델에서 CC398 균주를 사용한 S. 아우레우스(S. aureus) 접종에 대한 약간의 보호를 제공하는 것으로 나타났다. 이 실험의 목적은 LukAB RARPR-33과 조합된 Spa*가 애쥬번트가 없는 상태에서, 상이한 접종 균주에 대해 괴팅겐 미니피그의 S. 아우레우스(S. aureus) 수술 상처가 있는 감염 모델에서 보호를 제공할 수 있는지 여부를 평가하는 것이었다. 임상적으로 관련된 USA300 S. 아우레우스(S. aureus) 균주를 사용하였다.

시험한 Spa 변이체 항원(Spa*)은 서열번호 60의 아미노산 서열을 가졌다. 시험된 돌연변이 LukAB 이량체 RARPR-33은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다.

생체 내 실험. 수컷 괴팅겐 미니피그(군 당 3마리 돼지)를 도 16a에 도시된 일정에 따라 3주 간격으로 3번의 별개로 근육내 면역화하였고, 다음의 조성물 또는 조성물의 조합(도 16b)을 사용하였다:

1. 완충액 대조군

2. LukAB RARPR-33 (100 μg) + Spa* (100 μg)

백신접종 후, 돼지에게 임상적으로 관련된 S. 아우레우스(S. aureus) USA300 균주를 접종하였다. 감염 후 +8일차에, 돼지를 안락사시키고 수술 부위에서의 박테리아 부담을 결정하였다. 연구의 일차 평가변수는 LukAB 및 Spa 변이체로 백신접종된 동물의 수술 부위에서 박테리아 부담(cfu)의 감소였다. 제형화 완충액으로의 백신접종을 대조군으로서 사용하였다.

재료 및 방법:

미니피그 수술 상처 감염 방법: 괴팅겐 미니피그에게 미니피그 수술 상처 감염 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus) USA300 균주를 접종하였다. 수술 부위에서의 박테리아 부담의 접종 및 결정은 실시예 10 및 11의 설명에 따라 수행하였다.

결과:

미니피그 수술 상처 감염 모델에서의 효능. 백신 항원의 조합의 효능을 시험하기 위해, S. 아우레우스(S. aureus) USA300 균주로 3회의 면역화 및 접종 후 중간 근육 및 심부 근육에서 콜로니 형성 단위(cfu)의 수를 결정하였다.

중간 근육에서, LukAB RARPR-33과 Spa*의 조합(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 2.15)으로 면역화한 결과, 완충액만을 투여한 군에 비해 cfu가 감소하였다(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 5.73, P=0.2790) (도 16c).

심부 근육에서, LukAB RARPR-33, Spa*의 조합(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 3.65)으로 면역화한 결과, 완충액 대조군에 비해 cfu가 유의하게 감소하였다(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 6.21, P=0.0245) (도 16d). 이들 결과는, 애쥬번트가 없는 경우, 시험된 백신 조합이 미니피그 수술 부위 감염 모델에서 USA300 균주에 대해 효과적임을 보여준다.

결론: 백신 항원의 조합의 효능을 시험하기 위해, 미니피그 수술 상처 감염 모델에서 박테리아 부담을 감소시키는 백신 조합의 능력을 S. 아우레우스(S. aureus) USA300 균주를 사용하여 결정하였다. 본 연구에서는 애쥬번트를 사용하지 않았다. LukAB RARPR-33 + Spa*로 미니피그를 면역화한 결과, 완충액 대조군과 비교하여 시험 균주를 접종한 후 근육 내 콜로니 형성 단위의 수가 감소하였다. 이들 결과는 애쥬번트가 없는 경우, LukAB RARPR-33과 Spa*의 조합이 미니피그의 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus) USA300 균주에 대한 어느 정도의 보호를 제공한다는 것을 보여준다.

예 13: USA100 S. 아우레우스( S. aureus ) 균주에 대한 수술 상처가 있는 미니피그 감염 모델에서 LukAB RARPR-33, SpA*, 및 GLA-SE의 효능

실험의 목적은 Spa 변이체 항원과 RARPR LukAB 이량체의 조합과 톨 유사 수용체 4(TLR) 작용제인 글루코피라노실 지질 애쥬번트(GLA)가 메티실린 내성 S. 아우레우스(S. aureus)(MRSA) USA100 균주가 접종된 괴팅겐 미니피그의 수술 상처가 있는 감염 모델에서 보호를 제공할 수 있는지 여부를 평가하는 것이었다. USA100 분리주는 의료 관련 MRSA 감염의 많은 부분을 담당한다. 시험한 Spa 변이체 항원(Spa*)은 서열번호 60의 아미노산 서열을 가졌다. 시험된 돌연변이 LukAB 이량체 RARPR-33은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. GLA 애쥬번트를 안정한 유화액(SE)에 제형화하고, 10 μg의 GLA 및 2%의 SE를 함유하였다.

생체 내 실험. 수컷 괴팅겐 미니피그(군 당 3마리 돼지)를 도 17a에 도시된 일정에 따라 3주 간격으로 3번의 별개로 근육내 면역화하였고, 다음의 조성물 또는 조성물의 조합(도 17b)을 사용하였다:

1. 애쥬번트 GLA-SE(10 μg, 2% SE)(LukAb RARPR-33 없음, Spa* 없음)

2. LukAB RARPR-33 (100 μg) + Spa* (100 μg) + 애쥬번트 GLA-SE (10 μg, 2% SE)

백신접종 후, 돼지에게 임상적으로 관련된 S. 아우레우스(S. aureus) USA100 균주(ST5)를 접종하였다. 감염 후 +8일차에, 돼지를 안락사시키고 수술 부위에서의 박테리아 부담을 결정하였다. 연구의 일차 평가변수는 GLA-SE 단독 백신접종된 동물과 비교했을 때, GLA-SE와 함께 LukAB + Spa 변이체 조합으로 백신접종된 동물에서 수술 부위에서 박테리아 부담(cfu)의 감소였다.

재료 및 방법:

미니피그 수술 상처 감염 방법: 괴팅겐 미니피그에게 미니피그 수술 상처 감염 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus) USA100 균주를 접종하였다. 수술 부위에서의 박테리아 부담의 시험접종 및 결정은 실시예 10 및 11의 설명에 따라 수행하였다. 두 군 간의 통계적 유의성을 검정하기 위해, ANOVA 모델을 사용하였다.

결과:

미니피그 수술 상처 감염 모델에서의 효능. 백신 조합의 효능을 시험하기 위해, S. 아우레우스(S. aureus) USA100 균주로 3회의 면역화 및 접종 후 중간 근육 및 심부 근육에서 콜로니 형성 단위(cfu)의 수를 결정하였다.

중간 근육에서, LukAB RARPR-33, Spa* + GLA-SE의 조합(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 0.88)으로 면역화한 결과, GLA-SE 단독으로 면역화한 군에 비해 cfu가 유의하게 감소하였다(GeoMean log10 cfu/g 중간 근육 = 5.27, P=0.0013)(도 17c). 또한, 심부 근육에서, LukAB RARPR-33, Spa* + GLA-SE의 조합(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 0.30)의 조합으로 면역화한 결과, GLA-SE 단독으로 면역화한 군에 비해 cfu가 유의하게 감소하였다(GeoMean log10 cfu/g 심부 근육 = 5.37, P<0.0001)(도 17d). 이들 결과는 LukAB RARPR-33, Spa* 및 GLA-SE의 조합이 SSI 모델에서 S. 아우레우스(S. aureus) USA100 균주로부터 보호를 제공하고 시험 백신이 미니피그에서 효과적임을 보여준다.

결론: LukAB RARPR-33, Spa* 및 GLA-SE의 조합의 효능을 시험하기 위해, 미니피그 수술 상처 감염 모델에서 박테리아 부담을 감소시키는 백신의 능력을 관련 S. 아우레우스(S. aureus) USA100 균주를 사용하여 결정하였다. LukAB RARPR-33 + Spa* + GLA-SE 애쥬번트 백신 조성물로 미니피그를 면역화한 결과, 시험 균주로 접종한 후 근육 내 콜로니 형성 단위의 수가 감소하였다. 이전 예의 결과와 조합하여, LukAB 톡소이드 및 Spa 돌연변이를 함유하는 S. 아우레우스(S. aureus) 백신 조합이 미니피그 수술 부위 감염 모델에서 다양한 임상적으로 관련된 S. 아우레우스(S. aureus) 균주에 의해 야기되는 깊게 착상된 감염으로부터 효과적으로 보호됨을 보여준다.

예 14: 상이한 애쥬번트와 조합된 LukAB RARPR-33 및 Spa*의 면역원성

실험의 목적은 상이한 애쥬번트가 Spa 변이체 항원과 RARPR LukAB 이량체의 조합의 면역원성을 개선하는지 여부를 평가하는 것이었다. 시험한 Spa 변이체 항원(Spa*)은 서열번호 60의 아미노산 서열을 가졌다. 시험된 돌연변이 LukAB 이량체 RARPR-33은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 LukB 변이체 폴리펩티드를 포함한다. TLR4 작용제를 함유하는 2개의 애쥬번트, 즉 AS01b(5 μg MPL 및 5 μg QS-21 함유) 및 안정한 유화액(GLA-SE, 1 μg GLA 함유, 2% SE)으로 제형화된 GLA를 시험하였다. 또한, 2개의 명반-기반 애쥬번트를 포함시켰다: 알하이드로겔 애쥬번트 2%(수산화알루미늄 겔) 및 Adju-Phos 애쥬번트(인산알루미늄 겔).

생체 내 실험. 암컷 Swiss Webster 마우스(군 당 5-10마리의 마우스)를 도 도 18a 도시된 일정에 따라 2주 간격으로 3회 피하로 면역화하였으며, 다음의 조성물 또는 조성물의 조합을 사용하였다(도 18b):

1. LukAB RARPR-33 (5 μg) + SpA* (5 μg) + AS01b (5 μg MPL + 5 μg QS-21)

2. LukAB RARPR-33 (5 μg) + SpA* (5 μg) + GLA-SE (1 μg GLA, 2% SE)

3. LukAB RARPR-33 (5 μg) + SpA* (5 μg) + 알하이드로겔 애쥬번트 (50 μl)

4. LukAB RARPR-33 (5 μg) + SpA* (5 μg) + Adju-Phos 애쥬번트 (50 μl)

5. LukAB RARPR-33 (5 μg) + SpA* (5 μg)

6. 완충액 + AS01b (5 μg MPL 및 5 μg QS-21)

7. 완충액 + GLA-SE (1 μg GLA, 2% SE)

8. 완충액 + 알하이드로겔 애쥬번트 (50 μl)

9. 완충액 + Adju-Phos 애쥬번트 (50 μl)

10. 완충액

도 18a에 도시된 바와 같이, 연구 시작 전과 3차 면역화 후 2주에 혈액 샘플을 채혈하였다. 혈청 면역글로불린 양 및 기능을 평가하기 위해 혈청 분석을 수행하였다. 백신 항원이 없는 애쥬번트 또는 제형화 완충액으로의 백신접종을 대조군으로서 사용하였다.

재료 및 방법:

효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정된 LukAB 및 SpA에 대한 항체 반응: LukAB CC8 및 LukAB CC45에 대한 IgG 항체 수준을 측정하기 위해, 384-웰 Nunc 플레이트(Thermo Fisher Scientific)를 PBS 중 1.0 μg/ml LukAB CC8 또는 LukAB CC45로 코팅하고 2-8℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS + 0.05% Tween-20으로 세척한 후, 플레이트를 2.5% 탈지 우유로 차단하고, 세척하고, 희석 완충액(1xPBS 중 2.5%(w/v) 탈지 우유 분말)에서 1:90 희석으로 시작하여 제조된 혈청의 연속 3배 희석물을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 1:2,000으로 희석된 항-마우스 IgG-HRP 이차 항체(Sigma Aldrich)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, TMB 기질(Leinco Technologies)로 플레이트를 발현시켰다. 1M 황산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 반수 최대 유효 농도로 정의된 EC₅₀ 역가는 4-파라미터 로지스틱(PL) 비선형 회귀 모델로 분석한 중복 12단계 적정 곡선에 기초하여 계산하였다. EC50 역가가 30 미만인 샘플을 30으로 검열하였다.

SpA*에 대한 항체를 측정하기 위해, 384-웰 maxisorp 플레이트를 PBS 중 0.25 μg/ml SpA*로 코팅하고 2-8℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이차 항체는 차단 완충액 중 항-마우스 IgG-HRP의 1:2,000 희석물이었다. 다른 단계는 항-LukAB 항체 반응의 측정을 위해 전술한 바와 유사하였다.

LukAB 독소 중화 분석. Cyto-Tox-One 키트(Promega)를 사용하여 손상된 막을 갖는 세포로부터 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출을 측정하였다. THP-1 세포를 원심분리하고 RPMI로 2 × 10⁶ 세포/mL의 밀도로 재현탁하였다. 혈청의 연속 3배 희석물 또는 기준 LukAB 단클론 항체의 3배 연속 희석물을 2,500 ng/mL의 시작 농도로 함유하는 96 웰 배양 플레이트에 세포(50 μL)를 첨가하였다. LukAB 독소 CC8 및 CC45를 각각 40 ng/mL 또는 20 ng/ml의 최종 농도로 시험 웰에 첨가하였다. 용해 용액(Promega)을 용해 대조군 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 원심분리하고, 25 μL의 상청액을 새로운 플레이트에 옮기고, 25 μL의 CytoTox-ONE 시약(Promega)을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고 정지 용액(Promega)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 560의 여기 파장 및 5 nm의 대역폭 및 590의 방출 파장 및 10 nm의 대역폭을 갖는 단색으로 Biotek Synergy Neo 2 판독기로 판독하였다. 획득은 120-130으로 설정된다. 모든 혈청 샘플 및 LukAB 단클론 기준 항체에 대해 50% 세포독성이 관찰된 농도를 나타내는 IC₅₀ 역가를 결정하였다. 혈청 샘플과 기준 단클론 항체 간의 IC₅₀ 역가의 차이를 나타내는 상대 역가를 출력 값으로 사용하였다.

결과:

LukAB 및 SpA*에 대해 유도된 항체 반응. 전술한 마우스 군을 애쥬번트와 함께 또는 애쥬번트 없이 LukAB RARPR-33(5 μg) 및 SpA*(5 μg)의 조합으로 2주 간격으로 3회 면역화하였다. 대조군으로서, 동물을 항원이 없는 두 경우 모두에서 애쥬번트 및 제형화 완충액으로 또는 제형화 완충액으로만 면역화시켰다. 도 18b를 참조한다.

도 18a에 따라 혈액 샘플을 채취하고 혈청을 ELISA에 의해 LukAB 서열 변이체 CC8 및 CC45 및 SpA*에 대한 항체 반응에 대해 분석하였다. 면역화 전에 모든 군에서 LukAB 또는 SpA*-특이적 기존 항체는 검출되지 않았다(도 18c-e ). 애쥬번트 및/또는 제형화 완충액 단독으로 면역화된 동물에서, 혈청 내 항체 수준은 실험 과정 전반에 걸쳐 시간적으로 증가하지 않았으며(도 18c-e) 이는 애쥬번트 자체가 특이적 항체 반응을 유도하지 않으며, 항원이 요구됨을 나타낸다.

애쥬번트가 LukAB RARPR-33 및 SpA*의 면역원성을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 이들 항원에 대한 항체 IgG 역가를 애쥬번트가 있거나 없는 LukAB RARPR-33 + Spa*로 면역화된 동물 간에 비교하였다.

AS01b와 조합된 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화한 결과, 애쥬번트 없이 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화된 동물(Geomean IgG LukAB CC8: 315; Geomean IgG LukAB CC45: 141; Geomean IgG Spa*: 282)과 비교했을 때 LukAB CC8 및 CC45 및 Spa*( Geomean IgG LukAB CC8: 8079; Geomean IgG LukAB CC45: 5012; Geomean IgG Spa*: 31496)에 대해 더 높은 기하학적 평균 IgG 역가를 초래하였다.

또한 GLA-SE와 조합된 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화한 결과, 애쥬번트 없이 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화된 동물(Geomean IgG LukAB CC8: 315; Geomean IgG LukAB CC45: 141; Geomean IgG Spa*: 282)에 비해 LukAB CC8 및 CC45 및 Spa*( Geomean IgG LukAB CC8: 1401; Geomean IgG LukAB CC45: 3757; Geomean IgG Spa*: 9012)에 대한 더 높은 기하학적 평균 IgG 역가를 초래하였다. 이들 결과는 TLR4 작용제를 함유하는 애쥬번트가 LukAB RARPR-33 및 SpA*의 면역원성을 개선함을 나타낸다.

알하이드로겔과 조합된 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화한 결과 애쥬번트 없이 LukAB RARPR-33, SpA*로 면역화된 동물(Geomean IgG LukAB CC8: 315; Geomean IgG LukAB CC45: 141)에 비해 LukAB CC8 및 CC45(Geomean IgG LukAB CC8: 595; Geomean IgG LukAB CC45: 263)에 대한 더 높은 기하 평균 IgG 역가를 초래하였다. SpA*-특이적 항체 반응의 경우, 가장 높은 기하 평균 IgG 역가가 알하이드로겔과 조합된 LukAB RARPR-33, SpA*(Geomean IgG Spa*: 93318)로 면역화된 동물군에서 관찰되었다.

Adju-phos와 조합된 LukAB RARPR-33, Spa*로 면역화한 결과 애쥬번트 없이 LukAB RARPR-33, Spa* 로 면역화된 동물(Geomean IgG LukAB CC8: 315; Geomean IgG LukAB CC45: 141)에 비해 LukAB CC8 및 CC45(Geomean IgG LukAB CC8: 645; Geomean IgG LukAB CC45: 593)에 대한 더 높은 기하 평균 IgG 역가를 초래하였다. Spa*의 경우, 기하 평균 IgG 역가는 애쥬번트 없이 LukAB RARPR-33, Spa* 로 면역화된 군(Geomean IgG Spa*: 282)에 비해 Adju-phos와 조합된 LukAB RARPR-33, Spa*( Geomean IgG Spa*: 11614)로 면역화된 동물 군에서 더 높았다.

이들 결과는 명반-기반 애쥬번트가 LukAB-특이적 항체 반응에 비해 스파-특이적 항체 반응에 더 큰 영향을 미친다는 것을 나타낸다. TLR4 작용제 또는 명반-기반 애쥬번트를 함유하는, 본원에서 시험된 모든 애쥬번트의 조합이 LukAB RARPR-33 및 Spa*의 병용 백신의 면역원성을 개선하였다.

LukAB 독소의 세포독성 활성 중화. 면역화된 마우스의 혈청이 LukAB CC8 및 CC45의 세포독성 투여량에 의해 유발된 세포 사멸로부터 THP-1 세포를 보호하는 능력을 독소 중화에서 평가하였다. 이들 군에서 LukAB CC8- 및 CC45- 특이적 항체를 ELISA에 의해 검출하였으므로, 42일차에 단리된 애쥬번트가 있거나 없는 LukAB RARPR-33 + SpA*로 면역화된 동물(군 당 5마리의 마우스)로부터의 혈청 샘플만을 포함시켰다(도 18c-d).

기준 단클론 LukAB 특이적 항체를 분석에 포함시켰다. 혈청 샘플과 기준 항체 간의 세포독성의 50%가 측정되는 희석을 나타내는 IC50 역가의 차이를 결정하고 상대 역가 역가(RP-역가)로서 도표화하였다.

LukAB CC8의 경우, 애쥬번트가 포함된 LukAB RARPR-33 + SpA*로 면역화된 군(AS01b: 1281; GLA-SE: 1502; 알하이드로겔: 476; Adju-Phos: 425)에서, 애쥬번트가 없는 LukAB RARPR-33 + SpA*로 면역화된 군(Geomean RP 역가: 122)과 비교하여 3회 면역화 후 혈청에서 더 높은 GeoMean RP 역가를 측정하였다(도 19a).

LukAB CC45의 경우, 애쥬번트가 포함된 LukAB RARPR-33 + SpA*로 면역화된 군(AS01b: 3392; GLA-SE: 3470; 알하이드로겔: 365; Adju-Phos: 298)에서, 애쥬번트가 없는 LukAB RARPR-33 + SpA*로 면역화된 군(Geomean RP 역가: 131)과 비교하여 3회 면역화 후 혈청에서 더 높은 GeoMean RP 역가를 측정하였다(도 19b).

도 19a-b에 나타난 바와 같이 이러한 결과는 백신 (RARPR-33) 중의 LukAB가 LukAB 독소의 세포독성 활성을 차단하는 기능적 항체를 유도하고, 애쥬번트의 첨가가 LukAB 독성을 중화시키는 항체의 기능을 개선함을 나타낸다.

결론: 상이한 유형의 애쥬번트가 LukAB RARPR-33 및 SpA*로 이루어진, 시험된 백신 조합의 면역원성을 개선할 수 있는지 여부, 항체 역가 및 기능성을 명반-기반 애쥬번트(수산화알루미늄 또는 인산염알루미늄) 또는 TLR4 작용제(AS01b 또는 GLA-SE)를 함유하는 애쥬번트와 함께 백신 조합으로 면역화된 마우스의 혈청에서 결정하였다. 조합 백신에 두 가지 유형 모두의 애쥬번트를 첨가하면 애쥬번트가 없는 면역화에 비해 백신-특이적 항체 역가가 개선되었다. 또한, 애쥬번트의 존재 하에, LukAB-특이적 항체는 더 양호한 LukAB 독소 중화 능력을 가졌다. 이들 결과는 조합 백신의 면역원성이 상이한 애쥬번트를 사용하여 개선될 수 있음을 보여준다.

참고문헌

다음의 참조 문헌은, 이들이 본원에 제시된 것들에 보충되는 예시적인 절차 또는 다른 세부 사항을 제공하는 정도까지, 구체적으로 본원에 참조로서 통합된다.

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바람직한 실시예가 본원에서 상세히 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 첨가, 치환 등이 이루어질 수 있고, 따라서 이들은 이어지는 청구범위에서 정의된 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것이 당 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN PHARMACEUTICALS, INC. NEW YORK UNIVERSITY <120> STAPHYLOCOCCUS AUREUS VACCINE COMPOSITIONS <130> 142772.000113 <150> 63/170,089 <151> 2021-04-02 <150> 63/249,452 <151> 2021-09-28 <160> 116 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 321 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus CC8 <400> 1 His Lys Asp Ser Gln Asp Gln Asn Lys Lys Glu His Val Asp Lys Ser 1 5 10 15 Gln Gln Lys Asp Lys Arg Asn Val Thr Asn Lys Asp Lys Asn Ser Thr 20 25 30 Ala Pro Asp Asp Ile Gly Lys Asn Gly Lys Ile Thr Lys Arg Thr Glu 35 40 45 Thr Val Tyr Asp Glu Lys Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Gln Phe Asp 50 55 60 Phe Ile Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asn Val Leu Leu Val Lys Lys 65 70 75 80 Gln Gly Ser Ile His Ser Asn Leu Lys Phe Glu Ser His Lys Glu Glu 85 90 95 Lys Asn Ser Asn Trp Leu Lys Tyr Pro Ser Glu Tyr His Val Asp Phe 100 105 110 Gln Val Lys Arg Asn Arg Lys Thr Glu Ile Leu Asp Gln Leu Pro Lys 115 120 125 Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys Val Asp Ser Thr Phe Ser Tyr Ser Ser 130 135 140 Gly Gly Lys Phe Asp Ser Thr Lys Gly Ile Gly Arg Thr Ser Ser Asn 145 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Pro Gly Lys 370 375 380 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys 385 390 395 400 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 405 410 415 Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn 420 425 430 Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp 435 440 445 Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val 450 455 460 Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln 465 470 475 480 Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val 485 490 495 Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg 500 505 510 Arg Arg Glu Leu 515 <210> 73 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAXX <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> Xaa at 7-8 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(35) <223> Xaa at 34-35 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(61) <223> Xaa at 60-61 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(69) <223> Xaa at 68-69 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(96) <223> Xaa at 95-96 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (126)..(127) <223> Xaa at 126-127 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (153)..(154) <223> Xaa at 153-154 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (184)..(185) <223> Xaa 184-185 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (211)..(212) <223> Xaa at 211-212 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (242)..(243) <223> Xaa at 242-243 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (269)..(270) <223> Xaa at 269-270 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <400> 73 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Xaa Xaa Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 74 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkkAA <400> 74 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 75 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(61) <223> Xaa at 60-61 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <400> 75 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 76 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkR <400> 76 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 77 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkR <400> 77 Met Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu 1 5 10 15 Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn 50 55 60 Phe Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro 65 70 75 80 Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala 85 90 95 Ala Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn 100 105 110 Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys 115 120 125 Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln 130 135 140 Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala 145 150 155 160 Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 165 170 175 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 180 185 190 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 195 200 205 Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 210 215 220 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 225 230 235 240 Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 245 250 255 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro 260 265 270 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 275 280 285 Gln Ala Pro Lys 290 <210> 78 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> Xaa at 7-8 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(35) <223> Xaa at 34-35 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(61) <223> Xaa at 60-61 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(69) <223> Xaa at 68-69 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(96) <223> Xaa at 95-96 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (126)..(127) <223> Xaa at 126-127 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (153)..(154) <223> Xaa at 153-154 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (184)..(185) <223> Xaa at 184-185 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (211)..(212) <223> Xaa at 211-212 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (242)..(243) <223> Xaa at 242-243 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (269)..(270) <223> Xaa at 269-270 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <400> 78 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Xaa Xaa Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 79 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkR E domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> Xaa at 7-8 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(35) <223> Xaa at 34-35 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(61) <223> Xaa at 60-61 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <400> 79 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65 <210> 80 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkR E domain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(8) <223> Xaa at 7-8 is QQ, KK, RR, RK, KR, AA, SS, ST, or TT dipeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(35) <223> Xaa at 34-35 is DD, AA, KK, RR, KR, HH, or VV dipeptide <400> 80 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65 <210> 81 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpAkR E domain <400> 81 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65 <210> 82 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA E domain <400> 82 Met Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu 1 5 10 15 Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn 50 55 60 Phe Asn Lys Asp 65 <210> 83 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA E domain <400> 83 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65 <210> 84 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpA 252 <400> 84 Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro 20 25 30 Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 35 40 45 Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe 50 55 60 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly 65 70 75 80 Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 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Leu Lys 290 295 300 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 305 310 315 320 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys 325 330 335 Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 340 345 350 Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 355 360 365 Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 370 375 380 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 385 390 395 400 Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys 405 410 415 Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn 420 425 430 Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp 435 440 445 Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val 450 455 460 Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln 465 470 475 480 Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val 485 490 495 Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala 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ctgaaaaaca agcctggaat tcattacggg 840 caaccaattt tagagcagaa taaggatgga cagcgcttta ttgtggtata tgaggtggac 900 tggaagaata agacagtaaa agttgtggaa aagtactctg accagaataa gccctataaa 960 gaagga 966 <210> 103 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC8 LukA W95 <400> 103 cataaagatt cgcaggatca aaataagaag gagcatgttg acaagagcca gcagaaagac 60 aagcgcaatg ttacaaacaa agataagaac tctacagcgc ccgatgacat tggtaagaac 120 ggcaagataa ctaagcggac ggaaaccgtg tatgacgaga aaactaacat tctgcaaaat 180 ttgcaatttg actttatcga cgatccaacc tatgacaaga atgtcttgct tgtcaaaatg 240 caaggttcga ttcattcaaa ccttaaattt gaatcccaca aagaggagaa aaactctaat 300 tggttaaagt atccttcaga atatcacata gatttccagg taaagagaaa ccgtaaaacg 360 gagatactgg atcaactgcc taaaaacaag atctcgacag ctaaggtgga cgctacgttc 420 tcgtactcgt ctggtgggaa gttcgactcg accaaaggca ttgggcgtac atcatcaaat 480 agctattcaa agactattag ctataatcag cagaactatg atacgatagc ttcgggtaag 540 aataacaact ggcacgttca ttggtcgatc attgcaaatg acttgaagta tggcggagag 600 gtaaagaatc gcaacgatga gctgttattc tatcgcaata cgagaattgc gactgtagag 660 aacccggaat tgtcttttgc ctccaaatat cggtacccgg cattggtacg ctctggtttc 720 aatcctgagt ttttaactta cctttccaac gaaaagagta atgagaagac ccaatttgag 780 gttacctaca cccgtaacca ggatattttg aagaatcggc cgggcatcca ttatgcccca 840 ccaatcctgg agaaaaataa agacggtcag cggcttattg tgacttacga ggtcgattgg 900 aaaaataaga cggtcaaggt agtggacaaa tattctgatg acaataaacc gtacaaagct 960 ggc 963 <210> 104 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC45 LukA W95 <400> 104 gctaataagg actcccagga ccagacaaag aaggaacacg tcgacaaagc ccagcaaaaa 60 gaaaaacgca acgtaaacga taaggacaag aacaccccag gacccgatga tattgggaag 120 aacggtaaag tcacaaaacg cacagtgagc gagtacgata aagaaacaaa tatcctgcaa 180 aatctgcaat ttgacttcat cgatgaccct acctatgata agaatgtgtt gttggttaag 240 atgcagggaa gtattcattc caacttgaaa ttcgagagcc accgtaacga aacgaatgcg 300 agttggttaa agtacccttc agaataccac attgattttc aggtgcagcg taacccgaaa 360 accgaaatct tagaccagct gcctaaaaac aagatttcta cggccaaggt ggacgcaact 420 ttcagttata gtcttggagg aaagttcgac agtaccaaag gtatcggccg cacatcctca 480 aacagctatt cgaaatccat ttcttacaac cagcaaaatt atgacacgat cgcctcaggt 540 aagaacaaca atcgtcatgt gcattggagc atcgtggcta acgatttgaa atatggtaac 600 gaaatcaaaa atcgcaatga cgagttcttg ttttaccgca atactcgcct ttctacggta 660 gagaatcctg agcttagctt tgcgagcaag tatcgttacc ctgctcttgt acgttcgggt 720 ttcaacccag agttccttac ttatatctcc aatgagaaga cgaacgataa aacccgtttt 780 gaagttacat acacgcgtaa tcaggacatc ttaaagaata aaccggggat tcattatggg 840 cagccgatct tagagcaaaa taaggatgga cagcgtttca ttgtagtgta tgaggttgac 900 tggaagaaca agacggtaaa agtagttgaa aagtattccg accaaaacaa gccttataag 960 gcgggt 966 <210> 105 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC8 LukA W97 W72 <400> 105 cacaaagaca gccaggatca aaacaagaaa gagcacgtgg acaagagcca gcaaaaggat 60 aaacgtaacg ttaccaacaa ggacaaaaac agcaccgcgc cggacgatat cggcaagaac 120 ggcaaaatta ccaagcgtac cgagaccgtg tacgatgaaa aaaccaacat cctgcagaac 180 ctgcaattcg actttattga cgatccgacc tgcgataaaa acgtgctgct ggttaagatg 240 cagggcagca tccacagcaa cctgaaattc gaaagccaca aagaggaaaa gaacagcaac 300 tggctgaagt acccgagcga gtatcacatt gactttcagg tgaaacgtaa ccgtaagacc 360 gaaatcctgg atcaactgcc gaagaacaaa attagcaccg cgaaggtttg cgcgaccttc 420 agctacagca gcggttgcaa atttgacagc accaagtgca tcggccgtac cagcagcaac 480 agctatagca aaaccatcag ctacaaccag caaaactatg ataccattgc gagcggcaag 540 aacaacaact ggcacgtgca ctggagcatc attgcgaacg acctgaaata cggtggcgag 600 gttaagaacc gtaacgatga actgctgttc tatcgtaaca cccgtatcgc gaccgtggag 660 aacccggaac tgagctttgc gagcaaatac cgttatccgg cgctggtgcg tagcggtttc 720 aacccggagt ttctggttta cctgagcaac gagaaaagca acgaaaagac ccagttcgaa 780 gttacctaca cccgtaacca agacatcctg aagaaccgtc cgggtatcca ctatgctccg 840 ccgattctgg agaagaacaa agatggccaa cgtctgattg tgacctatga agttgactgg 900 aagaacaaaa ccgttaaagt ggttgataag tacagcgacg ataacaaacc gtataaggcg 960 ggt 963 <210> 106 <211> 966 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC45 LukA W97 W72 <400> 106 gcaaacaaag actcacaaga tcagacaaag aaagagcatg tagacaaagc tcaacagaag 60 gaaaagcgca atgtgaacga caaggataaa aatactcctg gtccagatga cattggtaag 120 aatggtaaag ttactaagcg gaccgtctct gaatatgata aggagacaaa tattctccag 180 aatttgcaat tcgatttcat tgatgatccg acgtgcgata agaacgtatt gctcgttaaa 240 atgcagggct ccatccattc gaatctcaag ttcgaatccc atcgcaacga gacaaacgct 300 tcctggctca aatatcctag cgagtatcat atcgacttcc aagttcaacg gaaccctaaa 360 actgaaatcc ttgatcaact ccctaagaac aaaatctcaa ctgccaaggt ctgtgccaca 420 ttttcttatt ctcttggctg caaattcgat tcaacaaagt gtattggtcg tacatcaagt 480 aatagctata gtaaaagcat cagttataac cagcaaaact atgatacaat cgcgtcaggc 540 aaaaacaata atcgtcatgt ccattggtcc attgtcgcga acgaccttaa gtacggtaac 600 gaaattaaga atcggaacga tgagtttttg ttctatcgca acacccgtct gtctactgtc 660 gaaaacccgg agttgtcctt cgcaagtaaa tatcgctatc ctgctttggt acgttctggg 720 tttaacccgg aatttctcgt ctacatcagc aacgagaaaa caaatgacaa aacgcgcttt 780 gaagtcacgt acacacgtaa tcaggacatc ttaaaaaata aaccagggat tcactatggt 840 cagccaatct tggagcagaa taaagacggc cagcgtttca ttgtcgttta tgaagtggac 900 tggaaaaaca aaactgttaa ggtggttgag aaatattccg accaaaacaa accgtataag 960 gccggt 966 <210> 107 <211> 927 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 107 aaaatcaatt ctgaaattaa gcaagtgtcc gaaaaaaatt tggatggaga cacgaagatg 60 tatacgcgta ctgctacgac gtcagactcc cagaagaaca ttacacagag tctgcaattt 120 aattttctga cagaaccaaa ctatgacaag gaaactgtct ttattaaggc taaagggact 180 atcggaagcg gcttacgcat tttagacccc aacggttatt ggaatagcac gctgcgctgg 240 ccgggcagtt actcagtatc aatccaaaat gtcgatgata acaataacac caatgttacc 300 gatttcgccc ccaagaacca ggatgaatcg cgcgaggtta aatacacata cggctacaag 360 acaggcggtg actttagcat caaccgtggg ggcttgacag ggaatattac taaggaatca 420 aattatagtg agactatctc ttatcaacaa ccgtcctatc gtaccttatt agaccagagt 480 acctcccaca aaggtgtagg gtggaaagtt gaagcgcacc tgattaataa tatgggtcac 540 gatcacacac gccaactgac caacgacagt gacaaccgca caaaaagtga aatttttagt 600 cttacccgta acggaaatct gtgggccaaa gacaatttta caccgaaaga taagatgccg 660 gtcactgtat ctgaggggtt caatcccgag tttttagcag taatgtcgca tgacaaaaag 720 gacaaaggga aatcccagtt tgttgtccac tataagcgta gcatggatga attcaaaatc 780 gactggaacc gtcacggttt ctggggttac tggtcaggtg agaaccacgt agacaagaaa 840 gaggagaaac tgagcgcatt atatgaggtt gattggaaaa cgcacaatgt gaaatttgtt 900 aaagtcctga atgacaacga gaaaaag 927 <210> 108 <211> 930 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 108 gaaattaagt ctaagatcac aacagtatcg gagaaaaacc tggatggcga tactaagatg 60 tatacacgca ccgccactac ttcggacacg gagaagaaga tctcacaatc gttacagttt 120 aattttctta cagaaccgaa ctacgacaaa gagaccgtct tcattaaagc taaaggtacg 180 attggttcgg gattaaaaat tctgaatccg aatggctatt ggaacagtac cttacgttgg 240 ccggggtcat attctgtatc cattcaaaac gtggacgaca ataacaacag caccaatgtg 300 acagatttcg ctccaaagaa tcaggatgag tcccgcgagg tgaaatatac ctatgggtac 360 aaaacaggag gtgactttag cattaaccgt ggtggcttga ctggtaatat cacgaaggaa 420 aaaaattact ctgagactat ttcctaccaa cagccgtcgt atcgcacctt gatcgaccaa 480 ccaacgacta acaaaggggt cgcgtggaaa gttgaggccc acagtattaa caatatgggc 540 cacgatcaca ctcgtcagct tactaacgat tcggatgacc gcgtcaagtc ggaaattttc 600 agcctgacgc gtaacggaaa tttgtgggct aaagacaatt tcactcctaa gaacaagatg 660 cccgtgactg tttccgaagg ctttaatccc gaattcttag cggtgatgtc tcatgataaa 720 aatgataaag gaaaatcgcg cttcattgtg cattataagc gttctatgga cgacttcaaa 780 ttggattgga ataagcacgg attctggggg tactggtccg gggaaaatca cgtagatcaa 840 aaggaagaga agttgtccgc tttgtatgaa gtggactgga agactcacga cgttaagttg 900 atcaagacct tcaatgacaa agagaagaaa 930 <210> 109 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC8 LukB Val53Leu <400> 109 aagatcaatt cggaaattaa acaggtaagt gagaaaaatt tggatggcga taccaaaatg 60 tacacccgca ccgctaccac gtcagattca caaaaaaata ttacacagtc cttgcagttc 120 aatttcctga cagaaccgaa ttacgacaag gagactttgt tcattaaagc caagggaacc 180 atcgggtccg gattgcgtat cttggacccg aacggatatt ggaactcgac cttacgttgg 240 ccggggtctt acagtgttag tatccaaaac gtagatgata acaataacac aaacgtgaca 300 gattttgcac ctaaaaacca ggacgaaagc cgcgaggtaa agtacacata tgggtataaa 360 acaggggggg acttttccat caaccgtggt ggtttgaccg ggaacatcac caaagagtca 420 aattacagtg agaccatcag ttatcagcag ccgtcctatc gtacattatt ggatcagtcg 480 acttcacata aaggggtcgg atggaaagta gaggctcatt tgatcaacaa catgggtcac 540 gatcatacac gtcagttaac gaacgatagc gataatcgca cgaagtcaga aatctttagt 600 ctgactcgta acggtaactt gtgggccaag gacaatttca cgcccaaaga taagatgcct 660 gtgacggtat cggaggggtt caatccagaa ttccttgctg taatgtccca tgacaaaaaa 720 gacaagggca aatcgcaatt tgtagtccac tataagcgtt ctatggacga gttcaagatt 780 gactggaacc gccacggctt ctgggggtac tggagtggtg agaatcatgt ggataaaaag 840 gaggagaaac ttagcgccct gtatgaggta gattggaaaa cacacaatgt caagttcgtg 900 aaagttctta atgacaacga aaaaaaa 927 <210> 110 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC45 LukB Val53Leu <400> 110 gagatcaaga gcaaaattac caccgtgagc gaaaagaacc tggacggtga taccaaaatg 60 tatacccgta ccgcgaccac cagcgacacc gagaagaaaa ttagccagag cctgcaattc 120 aactttctga ccgagccgaa ctacgataag gaaaccctgt tcatcaaggc gaaaggcacc 180 attggtagcg gcctgaaaat cctgaacccg aacggttatt ggaacagcac cctgcgttgg 240 ccgggtagct acagcgtgag catccagaac gttgacgata acaacaacag caccaacgtg 300 accgacttcg cgccgaagaa ccaagatgag agccgtgaag ttaaatacac ctatggttac 360 aaaaccggtg gcgactttag cattaaccgt ggtggcctga ccggcaacat caccaaggag 420 aaaaactata gcgaaaccat tagctatcag caaccgagct accgtaccct gatcgatcag 480 ccgaccacca acaagggtgt ggcgtggaaa gttgaggcgc acagcattaa caacatgggc 540 cacgaccaca cccgtcaact gaccaacgat agcgacgatc gtgtgaagag cgaaatcttc 600 agcctgaccc gtaacggtaa cctgtgggcg aaagacaact ttaccccgaa gaacaaaatg 660 ccggtgaccg ttagcgaggg tttcaacccg gaatttctgg cggtgatgag ccacgacaag 720 aacgataagg gcaaaagccg tttcattgtt cactacaaac gtagcatgga cgatttcaag 780 ctggactgga acaaacacgg tttttggggc tattggagcg gcgagaacca cgttgatcag 840 aaagaggaga aactgagcgc gctgtacgaa gtggactgga agacccacga tgttaagctg 900 atcaaaacct ttaacgataa agaaaagaaa 930 <210> 111 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC8 LukA.delta.10C <400> 111 gctcacaaag attctcagga tcaaaataag aaggagcacg tcgacaagtc tcagcagaaa 60 gacaagcgta atgttacaaa caaggacaaa aacagcactg ctccagacga cattggaaaa 120 aacggtaaga ttactaaacg caccgaaacg gtatatgacg aaaaaacgaa cattttgcaa 180 aacttgcagt tcgatttcat tgacgacccc acttatgaca agaatgtcct tctggtgaag 240 aagcagggca gcattcactc aaacttgaaa tttgagtctc acaaggagga gaagaactcc 300 aattggctga aatacccatc agagtaccac gttgattttc aagtgaaacg taaccgcaaa 360 acggaaattt tggaccaatt gccgaaaaac aagatctcca ccgcgaaagt agactcaaca 420 ttcagttact cttccggcgg aaagttcgac agcactaagg ggatcgggcg cacttcttcc 480 aattcgtact cgaaaacgat ttcttacaat cagcagaatt atgacactat cgcatctggt 540 aaaaataata actggcacgt gcattggtcg gtgattgcta atgatttaaa gtatggaggt 600 gaggtaaaaa atcgtaatga cgagctgctg ttttaccgta acactcgcat cgcaaccgtt 660 gaaaacccgg aattgtcctt tgcctcgaaa taccgctacc ctgcattagt tcgttcaggc 720 tttaatcccg agtttttgac ttatctttcc aatgaaaaat cgaacgagaa gactcagttc 780 gaggttacgt acacccgcaa tcaggacatt ttgaagaacc gtccgggaat tcactatgcg 840 cctcccatct tagagaagaa taaggatgga caacgtttga tcgttacata tgaagttgac 900 tggaaaaata agaccgtaaa ggttgtggat aagtat 936 <210> 112 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC45 LukA.delta.10C <400> 112 gcaaataaag actctcaaga tcagactaaa aaggaacatg ttgataaggc gcaacaaaaa 60 gaaaagcgta atgtcaatga taaggacaag aatactccgg gacccgacga cattggcaag 120 aacggaaagg tgacaaagcg taccgttagt gagtacgaca aggaaacaaa tatcctgcag 180 aacttacagt tcgattttat tgacgatcct acctatgaca agaatgtcct gttggtgaag 240 aaacagggca gcattcattc caatttaaaa tttgaaagcc atcgtaacga aacaaatgca 300 tcttggctta aatacccttc tgagtaccac gtagattttc aggtacaacg caacccaaaa 360 accgaaattc tggatcaact gcccaagaat aaaatttcta cggctaaagt tgacagtaca 420 tttagctaca gtttaggggg aaagtttgat agtacaaaag gaattggtcg tacttccagt 480 aactcctatt cgaaatctat ttcctataat caacagaatt acgacaccat cgcatccggt 540 aaaaacaata atcgccacgt acattggagt gttgtcgcga atgacttaaa gtacggtaac 600 gaaatcaaga accgcaacga cgaattctta ttctatcgta acacgcgttt aagcaccgtc 660 gagaaccccg agttatcctt tgctagcaaa tatcgctatc ctgcgttagt acgctcaggg 720 ttcaatcctg agttcttaac ctacatctcc aacgagaaaa ctaatgataa gacacgcttc 780 gaggtgacct acacccgtaa tcaggatatc cttaaaaata aaccgggtat tcattacggg 840 caacccattt tagaacagaa taaggacggc caacgtttta tcgtggtcta tgaggttgat 900 tggaagaaca agacagtgaa agtggttgaa aagtat 936 <210> 113 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LukA CC8 delta 10 <400> 113 His Lys Asp Ser Gln Asp Gln Asn Lys Lys Glu His Val Asp Lys Ser 1 5 10 15 Gln Gln Lys Asp Lys Arg Asn Val Thr Asn Lys Asp Lys Asn Ser Thr 20 25 30 Ala Pro Asp Asp Ile Gly Lys Asn Gly Lys Ile Thr Lys Arg Thr Glu 35 40 45 Thr Val Tyr Asp Glu Lys Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Gln Phe Asp 50 55 60 Phe Ile Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asn Val Leu Leu Val Lys Lys 65 70 75 80 Gln Gly Ser Ile His Ser Asn Leu Lys Phe Glu Ser His Lys Glu Glu 85 90 95 Lys Asn Ser Asn Trp Leu Lys Tyr Pro Ser Glu Tyr His Val Asp Phe 100 105 110 Gln Val Lys Arg Asn Arg Lys Thr Glu Ile Leu Asp Gln Leu Pro Lys 115 120 125 Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys Val Asp Ser Thr Phe Ser Tyr Ser Ser 130 135 140 Gly Gly Lys Phe Asp Ser Thr Lys Gly Ile Gly Arg Thr Ser Ser Asn 145 150 155 160 Ser Tyr Ser Lys Thr Ile Ser Tyr Asn Gln Gln Asn Tyr Asp Thr Ile 165 170 175 Ala Ser Gly Lys Asn Asn Asn Trp His Val His Trp Ser Val Ile Ala 180 185 190 Asn Asp Leu Lys Tyr Gly Gly Glu Val Lys Asn Arg Asn Asp Glu Leu 195 200 205 Leu Phe Tyr Arg Asn Thr Arg Ile Ala Thr Val Glu Asn Pro Glu Leu 210 215 220 Ser Phe Ala Ser Lys Tyr Arg Tyr Pro Ala Leu Val Arg Ser Gly Phe 225 230 235 240 Asn Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Leu Ser Asn Glu Lys Ser Asn Glu Lys 245 250 255 Thr Gln Phe Glu Val Thr Tyr Thr Arg Asn Gln Asp Ile Leu Lys Asn 260 265 270 Arg Pro Gly Ile His Tyr Ala Pro Pro Ile Leu Glu Lys Asn Lys Asp 275 280 285 Gly Gln Arg Leu Ile Val Thr Tyr Glu Val Asp Trp Lys Asn Lys Thr 290 295 300 Val Lys Val Val Asp Lys Tyr 305 310 <210> 114 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LukA CC45 delta 10 <400> 114 Ala Asn Lys Asp Ser Gln Asp Gln Thr Lys Lys Glu His Val Asp Lys 1 5 10 15 Ala Gln Gln Lys Glu Lys Arg Asn Val Asn Asp Lys Asp Lys Asn Thr 20 25 30 Pro Gly Pro Asp Asp Ile Gly Lys Asn Gly Lys Val Thr Lys Arg Thr 35 40 45 Val Ser Glu Tyr Asp Lys Glu Thr Asn Ile Leu Gln Asn Leu Gln Phe 50 55 60 Asp Phe Ile Asp Asp Pro Thr Tyr Asp Lys Asn Val Leu Leu Val Lys 65 70 75 80 Lys Gln Gly Ser Ile His Ser Asn Leu Lys Phe Glu Ser His Arg Asn 85 90 95 Glu Thr Asn Ala Ser Trp Leu Lys Tyr Pro Ser Glu Tyr His Val Asp 100 105 110 Phe Gln Val Gln Arg Asn Pro Lys Thr Glu Ile Leu Asp Gln Leu Pro 115 120 125 Lys Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys Val Asp Ser Thr Phe Ser Tyr Ser 130 135 140 Leu Gly Gly Lys Phe Asp Ser Thr Lys Gly Ile Gly Arg Thr Ser Ser 145 150 155 160 Asn Ser Tyr Ser Lys Ser Ile Ser Tyr Asn Gln Gln Asn Tyr Asp Thr 165 170 175 Ile Ala Ser Gly Lys Asn Asn Asn Arg His Val His Trp Ser Val Val 180 185 190 Ala Asn Asp Leu Lys Tyr Gly Asn Glu Ile Lys Asn Arg Asn Asp Glu 195 200 205 Phe Leu Phe Tyr Arg Asn Thr Arg Leu Ser Thr Val Glu Asn Pro Glu 210 215 220 Leu Ser Phe Ala Ser Lys Tyr Arg Tyr Pro Ala Leu Val Arg Ser Gly 225 230 235 240 Phe Asn Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Ile Ser Asn Glu Lys Thr Asn Asp 245 250 255 Lys Thr Arg Phe Glu Val Thr Tyr Thr Arg Asn Gln Asp Ile Leu Lys 260 265 270 Asn Lys Pro Gly Ile His Tyr Gly Gln Pro Ile Leu Glu Gln Asn Lys 275 280 285 Asp Gly Gln Arg Phe Ile Val Val Tyr Glu Val Asp Trp Lys Asn Lys 290 295 300 Thr Val Lys Val Val Glu Lys Tyr 305 310 <210> 115 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus FPR3757 of CC8 <400> 115 Lys Ile Asn Ser Glu Ile Lys Gln Val Ser Glu Lys Asn Leu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Ser Gln Lys 20 25 30 Asn Ile Thr Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Glu Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Val Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Arg Ile Leu Asp Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asp Asn Asn Asn 85 90 95 Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Glu Ser Arg Glu 100 105 110 Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Thr Gly Gly Asp Phe Ser Ile Asn 115 120 125 Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Glu 130 135 140 Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Arg Thr Leu Leu Asp Gln Ser 145 150 155 160 Thr Ser His Lys Gly Val Gly Trp Lys Val Glu Ala His Leu Ile Asn 165 170 175 Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp Asn 180 185 190 Arg Thr Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu Trp 195 200 205 Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Val Ser 210 215 220 Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val Met Ser His Asp Lys Lys 225 230 235 240 Asp Lys Gly Lys Ser Gln Phe Val Val His Tyr Lys Arg Ser Met Asp 245 250 255 Glu Phe Lys Ile Asp Trp Asn Arg His Gly Phe Trp Gly Tyr Trp Ser 260 265 270 Gly Glu Asn His Val Asp Lys Lys Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu Tyr 275 280 285 Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asn Val Lys Phe Val Lys Val Leu Asn 290 295 300 Asp Asn Glu Lys Lys 305 <210> 116 <211> 309 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus NEWMAN of CC8 <400> 116 Lys Ile Asn Ser Glu Ile Lys Gln Val Ser Glu Lys Asn Leu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Thr Lys Met Tyr Thr Arg Thr Ala Thr Thr Ser Asp Ser Gln Lys 20 25 30 Asn Ile Thr Gln Ser Leu Gln Phe Asn Phe Leu Thr Glu Pro Asn Tyr 35 40 45 Asp Lys Glu Thr Val Phe Ile Lys Ala Lys Gly Thr Ile Gly Ser Gly 50 55 60 Leu Arg Ile Leu Asp Pro Asn Gly Tyr Trp Asn Ser Thr Leu Arg Trp 65 70 75 80 Pro Gly Ser Tyr Ser Val Ser Ile Gln Asn Val Asp Asp Asn Asn Asn 85 90 95 Thr Asn Val Thr Asp Phe Ala Pro Lys Asn Gln Asp Glu Ser Arg Glu 100 105 110 Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Tyr Lys Thr Gly Gly Asp Phe Ser Ile Asn 115 120 125 Arg Gly Gly Leu Thr Gly Asn Ile Thr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Glu 130 135 140 Thr Ile Ser Tyr Gln Gln Pro Ser Tyr Arg Thr Leu Leu Asp Gln Ser 145 150 155 160 Thr Ser His Lys Gly Val Gly Trp Lys Val Glu Ala His Leu Ile Asn 165 170 175 Asn Met Gly His Asp His Thr Arg Gln Leu Thr Asn Asp Ser Asp Asn 180 185 190 Arg Thr Lys Ser Glu Ile Phe Ser Leu Thr Arg Asn Gly Asn Leu Trp 195 200 205 Ala Lys Asp Asn Phe Thr Pro Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Val Ser 210 215 220 Glu Gly Phe Asn Pro Glu Phe Leu Ala Val Met Ser His Asp Lys Lys 225 230 235 240 Asp Lys Gly Lys Ser Gln Phe Val Val His Tyr Lys Arg Ser Met Asp 245 250 255 Glu Phe Lys Ile Asp Trp Asn Arg His Gly Phe Trp Gly Tyr Trp Ser 260 265 270 Gly Glu Asn His Val Asp Lys Lys Glu Glu Lys Leu Ser Ala Leu Tyr 275 280 285 Glu Val Asp Trp Lys Thr His Asn Val Lys Phe Val Lys Val Leu Asn 290 295 300 Asp Asn Glu Lys Lys 305

Claims

면역원성 조성물로서,
(i) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드, 및
(ii) S. 아우레우스(S. aureus) LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하며, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물.
2개 이상의 면역원성 조성물의 조합으로서,
(i) 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드, 및
(ii) S. 아우레우스(S. aureus) LukA 변이체 폴리펩티드를 함께 포함하며, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, 및 Val193에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물의 조합.
제1항 또는 제2항에 있어서, LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 Glu323에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 잔기 Lys83, Ser141, Val113, Val193, 및 Glu323에 대응하는 각각의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제4항에 있어서, 아미노산 치환은 Lys83Met, Ser141Ala, Val113Ile, Val193Ile, 및 Glu323Ala를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는
서열번호 25의 아미노산 잔기 Tyr74, Asp140, Gly149, 및 Gly156에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는,
면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제7항에 있어서, 아미노산 치환은 Tyr74Cys, Asp140Cys, Gly149Cys, 및 Gly156Cys를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 LukA 단백질 또는 폴리펩티드는:
서열번호 25의 아미노산 잔기 Thr249에 대응하는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제10항에 있어서, 상기 LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 폴리펩티드는 SpA 변이체 폴리펩티드인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제12항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 Fc 결합을 파괴하는 적어도 하나의 아미노산 치환 및 VH3 결합을 파괴하는 적어도 제2 아미노산 치환을 갖는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제12항 또는 제13항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA D 도메인을 포함하고, 상기 SpA D 도메인은 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제14항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서 아미노산 치환을 갖는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제14항 또는 제15항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E, A, B, 또는 C 도메인을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제16항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 SpA E, A, B, 및 C 도메인을 포함하고 서열번호 54의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제16항 또는 제17항에 있어서, 각각의 SpA E, A, B, 및 C 도메인은 서열번호 58의 아미노산 위치 9 및 10에 대응하는 하나 또는 둘 모두의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 하나 또는 둘 모두의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 글루타민 잔기에 대한 리신 잔기인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 적어도 하나의 도메인은 (i) 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 글루타민 잔기에서의 리신 치환 및 (ii) 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 S. 아우레우스(S. aureus) 류코시딘 B(LukB) 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제21항에 있어서, LukB 폴리펩티드는 서열번호 15의 LukB 폴리펩티드 또는 서열번호 16의 LukB 폴리펩티드인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제21항에 있어서, LukB 폴리펩티드는 LukB 변이체 폴리펩티드인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제23항에 있어서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제24항에 있어서, LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15 및 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제25항에 있어서, 아미노산 치환은 발린의 류신으로의 치환인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 잔기 Glu45, Glu109, Thr121, 및 Arg154에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 잔기 Glu45, Glu110, Thr122, 및 Arg155에 대응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LukB 변이체 폴리펩티드는 서열번호 17 내지 22로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 서열번호 16의 아미노산 서열 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukA 변이체 폴리펩티드, 및 서열번호 18의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LukB 폴리펩티드를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, SpA 폴리펩티드는 SpA 변이체 폴리펩티드인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제33항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 적어도 하나의 도메인은 (i) 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 글루타민 잔기에서의 리신 치환 및 (ii) 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제21항에 있어서, (i) SpA 변이체 폴리펩티드는 적어도 하나의 SpA A, B, C, D, 또는 E 도메인을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖고; (ii) LukA 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 위치 80에 대응하는 아미노산 위치에서의 메티오닌 치환, 서열번호 1의 위치 138에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환, 서열번호 1의 위치 110 및 190에 대응하는 아미노산 위치에서의 이소류신 치환, 및 서열번호 1의 위치 320에 대응하는 아미노산 위치에서의 알라닌 치환을 포함하는 CC8 LukA 변이체 폴리펩티드를 포함하고, (iii) LukB 폴리펩티드는 서열번호 16의 위치 53에 대응하는 아미노산 위치에서의 류신 치환을 포함하는 CC45 LukB 변이체 폴리펩티드인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제35항에 있어서, SpA 변이체 폴리펩티드는 연속적으로 SpA E, D, A, B, 및 C 도메인을 포함하며, 각각의 도메인은 서열번호 58의 위치 9 및 10에 대응하는 아미노산 위치에서의 리신 치환 및 서열번호 58의 위치 33에 대응하는 아미노산 위치에서의 글루타메이트 치환을 갖는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제37항에 있어서, 애쥬번트는 안정한 수중유 유화액인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제37항에 있어서, 애쥬번트는 사포닌을 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제39항에 있어서, 사포닌은 QS21인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제37항에 있어서, 애쥬번트는 TLR4 작용제를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제41항에 있어서, TLR4 작용제는 지질 A 또는 이의 유사체 또는 유도체인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제41항에 있어서, TLR4 작용제는 글리코피라노실 지질 애쥬번트(GLA, glycopyranosyl lipid adjuvant)인, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제41항에 있어서, 애쥬번트는 안정한 수중유 유화액과 조합된 TLR-4 작용제를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제43항에 있어서, 애쥬번트는 GLA-SE를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제41항에 있어서, 상기 애쥬번트는 사포닌과 조합된 TLR-4 작용제를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제43항에 있어서, 애쥬번트는 GLA-LSQ를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합으로서, 상기 조성물은 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 또는 이의 변이체, LukA 변이체 폴리펩티드, 및 LukB 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제48항에 있어서, 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 벡터에 함유된, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 조성물은 숙주 세포를 포함하고, 상기 숙주 세포는 상기 하나 이상의 핵산 분자 또는 상기 하나 이상의 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
스태필로코쿠스 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
스태필로코쿠스 박테리아에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체에서 유도하는 방법으로서, 상기 방법은:
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
스태필로코쿠스 박테리아의 탈집락화 또는 집락화 또는 재집락화의 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 탈집락화하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법은:
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
대상체에서 S. 아우레우스(S. aureus)에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.
의약으로서 사용하기 위한 실시예 1 내지 50 중 어느 하나의 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 조합.