KR20230160101A - Novel peptide for specific detection of Interleukin 1 beta - Google Patents
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Abstract
본 발명은 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 펩타이드는 인터루킨 1 베타와 특이적으로 결합할 수 있어 인터루킨 1 베타를 정확하게 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 인터루킨 1 베타에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인한 바, 이를 인터루킨 1 베타 검출, 또는 감염 및 염증에 대한 숙주 방어 반응에 중요한 인터루킨 1 베타 관련 질환 진단을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.The present invention relates to a novel peptide discovered using bacteriophage display screening. According to the present invention, the peptide can specifically bind to interleukin 1 beta, thereby accurately detecting interleukin 1 beta, and according to the present invention, the peptide can specifically bind to interleukin 1 beta. As it was confirmed that the peptide exhibits high sensitivity and specificity for interleukin 1 beta, it can be usefully used for detecting interleukin 1 beta or diagnosing diseases related to interleukin 1 beta, which are important in host defense responses to infection and inflammation.
Description
본 발명은 인터루킨 1 베타 검출용 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.The present invention relates to a novel peptide for detecting interleukin 1 beta and its use.
인터루킨 1 베타(Interleukin 1beta)는 IL 1B 유전자에 의해 암호화되는 사이토카인(cytokine)의 일종으로 감염 및 손상에 대한 급성기 반응을 개시함으로써 선천적 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 염증 유발 단백질이다. 인터루킨 1 베타는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포에 의해 발현되며 주변 분비 방식으로 수용체를 활성화시켜 염증 유발 유전자 산물의 발현을 유도한다. 인터루킨 1 베타는 활성 형태로 가장 자주 분비되지만, 일부 조건에서는 절단되지 않은 비활성 단백질로 분비될 수 있다. 병원체, 스트레스 조건 및 위험 신호에 반응하는 다중 단백질 복합체인 인플라마좀(Inflammasome)의 활성화로 인해 비활성 상태인 프로인터루킨 1 베타(proInterleukin 1beta)가 인터루킨 1 베타로 전환되며 활성화되어 염증 반응에 관여하게 된다. 염증 반응의 핵심 매개체로서 숙주 반응과 병원체에 대한 내성에 필수적이며, 만성 질환 및 급성 조직 손상 시 손상을 악화시킴과 동시에 위산 분비 억제제로서의 이중 역할을 하기 때문에 복잡한 사이토카인 네트워크로도 알려져 있다. 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염과 같은 염증성 대장질환, 알츠하이머병(Alzheimer's disease)을 포함한 다양한 염증성 이상반응과 관계가 있다고 밝혀져 인터루킨 1 베타의 신속하고 정확한 검출은 임상 진료에 있어 중요한 요소로 인식되고 있다.Interleukin 1beta, a type of cytokine encoded by the IL 1B gene, is a pro-inflammatory protein that plays an important role in innate host defense by initiating the acute phase response to infection and damage. Interleukin 1 beta is expressed by monocytes, macrophages, and dendritic cells and activates receptors in a paracrine manner, leading to the expression of proinflammatory gene products. Interleukin 1 beta is most often secreted in its active form, but under some conditions it may be secreted as an uncleaved, inactive protein. Activation of the inflammasome, a multi-protein complex that responds to pathogens, stress conditions, and danger signals, converts the inactive proInterleukin 1beta to interleukin 1beta, which becomes activated and participates in the inflammatory response. . As a key mediator of the inflammatory response, it is essential for host response and resistance to pathogens. It is also known as a complex cytokine network because it plays a dual role as an inhibitor of gastric acid secretion while aggravating damage in chronic diseases and acute tissue damage. It has been found to be related to various inflammatory side effects, including Crohn's disease, inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis, and Alzheimer's disease, and rapid and accurate detection of interleukin 1 beta is recognized as an important factor in clinical care. It is becoming.
현재까지 인터루킨 1 베타를 검출하기 위한 다양한 연구들이 개발되어 왔다. 대표적으로, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 항체(antibody) 등을 이용한 전기화학적(Electrochemical anaylsis) 분석기술, 전기화학발광 (Electrochemiluminescence method) 분석기술, SPR (surface plasmon resonance) 방법, LFA (Lateral Flow Assay) 기술, fluorescent assay, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 기술과 크로마토그래픽 (chromatographic methods) 방법 등을 사용하여 인터루킨 1 베타를 검출하려는 다양한 연구들이 보고되었다. To date, various studies have been developed to detect interleukin 1 beta. Representative examples include electrochemical anaylsis analysis technology using aptamers and antibodies that specifically bind to target molecules, electrochemiluminescence method analysis technology, and SPR (surface plasmon resonance) method. , various studies have been reported to detect interleukin 1 beta using LFA (Lateral Flow Assay) technology, fluorescent assay, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) technology, and chromatographic methods.
그러나 상기 방법들은 인터루킨 1 베타에 대한 민감도와 선택성이 다소 낮은 바, 인터루킨 1 베타를 특이적으로 정확하게 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.However, the above methods have somewhat low sensitivity and selectivity for interleukin 1 beta, so there is a need to develop a technology that can specifically and accurately detect interleukin 1 beta.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 인터루킨 1 베타를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술에 대해 연구하던 중, 인터루킨 1 베타에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드를 발굴하고 상기 펩타이드가 인터루킨 1 베타만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.In order to solve the problems of the prior art, the present inventors were researching a technology that can quickly and accurately detect interleukin 1 beta, and discovered a new peptide that specifically binds to interleukin 1 beta, and discovered that the peptide was linked to interleukin 1 beta. The present invention was completed by confirming that only beta can be specifically detected.
따라서 본 발명의 목적은 인터루킨 1 베타(Interleukin 1 beta) 검출용 펩타이드를 제공하는 것이다.Therefore, the purpose of the present invention is to provide a peptide for detecting interleukin 1 beta.
본 발명의 다른 목적은 인터루킨 1 베타 검출용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for detecting interleukin 1 beta.
본 발명의 또 다른 목적은 인터루킨 1 베타 검출용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a kit for detecting interleukin 1 beta.
본 발명의 또 다른 목적은 인터루킨 1 베타 검출용 바이오칩을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a biochip for detecting interleukin 1 beta.
본 발명의 또 다른 목적은 인터루킨 1 베타 검출 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for detecting interleukin 1 beta.
본 발명의 또 다른 목적은 인터루킨 1 베타 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing interleukin 1 beta-related diseases.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 인터루킨 1 베타(Interleukin 1 beta) 검출용 펩타이드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a peptide for detecting Interleukin 1 beta comprising part or the entire amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 검출용 조성물을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other objects, the present invention provides a composition for detecting interleukin 1 beta containing the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 검출용 키트를 제공한다.In addition, in order to achieve the above-mentioned other object, the present invention provides a kit for detecting interleukin 1 beta containing the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 검출용 바이오칩을 제공한다.Additionally, in order to achieve the above-mentioned other object, the present invention provides a biochip for detecting interleukin 1 beta containing the peptide according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 인터루킨 1 베타 검출 방법을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention includes the steps of treating a sample with a peptide according to the present invention; and detecting a reaction between the peptide and the sample. It provides a method for detecting interleukin 1 beta, including a step.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above other object, the present invention provides a composition for diagnosing interleukin 1 beta-related diseases comprising the peptide according to the present invention.
본 발명에 따른 신규한 인터루킨 1 베타 검출용 펩타이드는 비특이적 결합이 없으면서도 인터루킨 1 베타에 대해 높은 정확도 및 민감도를 보이며, 이를 포함하는 바이오칩 또한 인터루킨 1 베타를 정확하게 검출할 수 있는 바, 이를 이용하여 인터루킨 1 베타 검출 또는 인터루킨 1 베타 발현과 관련 질환의 진단 또는 경과 관찰 등에 유용하게 활용할 수 있으므로 인터루킨 1 베타와 관련된 질환을 해결하는데 크게 기여할 수 있다.The novel interleukin 1 beta detection peptide according to the present invention shows high accuracy and sensitivity for interleukin 1 beta without non-specific binding, and a biochip containing it can also accurately detect interleukin 1 beta, which can be used to detect interleukin 1 beta. It can be useful for detecting 1 beta or diagnosing or monitoring diseases related to interleukin 1 beta expression, so it can greatly contribute to solving diseases related to interleukin 1 beta.
도 1은 본 발명에 따라 선별된 박테리오파지의 인터루킨 1 베타에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지 입자 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지의 인터루킨 1 베타 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지의 골드칩(gold chip) 고정화 가능 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 박테리오파지 입자 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 인터루킨 1 베타 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 인터루킨 1 베타에 대한 결합 상수를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 박테리오파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 인터루킨 1 베타에 대한 특이성을 확인한 결과이다.Figure 1 shows the results of confirming the binding ability of bacteriophages selected according to the present invention to interleukin 1 beta.
Figure 2 shows the results of confirming the binding force according to the concentration of bacteriophage particles containing the peptide according to the present invention.
Figure 3 shows the results of confirming the binding force of bacteriophage containing the peptide according to the present invention according to interleukin 1 beta concentration.
Figure 4 shows the results of confirming whether bacteriophage containing the peptide according to the present invention can be immobilized on a gold chip.
Figure 5 shows the results of confirming the binding force according to the concentration of bacteriophage particles after fixing the bacteriophage containing the peptide according to the present invention to the gold chip.
Figure 6 shows the results of confirming the binding force according to the concentration of interleukin 1 beta after fixing the bacteriophage containing the peptide according to the present invention to a gold chip.
Figure 7 shows the results of confirming the binding constant for interleukin 1 beta after fixing the bacteriophage containing the peptide according to the present invention to a gold chip.
Figure 8 shows the results of confirming the specificity for interleukin 1 beta after fixing the bacteriophage containing the peptide according to the present invention to a gold chip.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 인터루킨 1 베타를 특이적으로 검출할 수 있는 펩타이드에 대한 것으로, 하기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 인터루킨 1 베타(Interleukin 1 beta) 검출용 펩타이드를 제공한다.The present invention relates to a peptide capable of specifically detecting interleukin 1 beta, and provides a peptide for detecting interleukin 1 beta comprising part or the entire amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 below. .
YVHHYSTGQMFN(서열번호 1).YVHHYSTGQMFN (SEQ ID NO: 1).
상기 서열번호 1로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 M13 박테리오파지(bacteriophage)의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 12개의 무작위 아미노산을 갖는 선형 모형의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현하도록 제작된 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library) Ph.D.-12(New England BioLab)를 이용하여 인터루킨 1 베타에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다. The amino acid sequence of the peptide according to the present invention, represented by SEQ ID NO: 1, is a linear model with 12 random amino acids at the end of the gene that produces pIII, a type of coat protein, in the genome of M13 bacteriophage. Ph.D.-12 (Ph.D.-12), a bacteriophage random peptide library designed to express hundreds of millions of different peptides obtained by artificially inserting gene sequences to express peptides and then infecting E.coli. The sequence that binds to interleukin 1 beta was discovered using New England BioLab.
상기 M13 박테리오파지는 특정 형질(strain)의 대장균만 감염되는 성질을 지니는 나노크기의 물질이며 돌연변이를 일으켜 인체에 감염될 가능성에 대해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 특히 2006년 FDA의 승인을 얻어 인스턴트식품의 세균 오염 방지용 첨가물로 활용되고 있으며, 항생제의 내성 문제는 해결할 수 있는 대체제 뿐만 아니라 인체에 무해한 생체 친화형 나노물질로 각광을 받고 있다. 더불어 상기 박테리아박테리오파지를 이용하는 경우, 견고하고 열에 안정한 박테리오파지의 특성을 이용하여 화학적 링커를 통해 쉽고 빠르게 변환기 표면에 고정될 수 있어 생체분자와 결합하기 쉬워 센서개발에 큰 장점이 된다. 또한 제조 공정이 간단하여 생산성과 안정성의 향상에 기여하며 다양한 유전공학적, 화학적 변형을 활용할 수 있는 장점이 있다.The M13 bacteriophage is a nano-sized material that infects only E. coli of a specific strain, and there has been no report to date on the possibility of it mutating and infecting the human body. In particular, it was approved by the FDA in 2006 and is being used as an additive to prevent bacterial contamination in instant foods. It is attracting attention not only as an alternative that can solve the problem of antibiotic resistance, but also as a biocompatible nanomaterial that is harmless to the human body. In addition, when using the bacterial bacteriophage, it can be easily and quickly fixed to the surface of the transducer through a chemical linker using the robust and heat-stable characteristics of the bacteriophage, making it easy to bind to biomolecules, which is a great advantage in sensor development. In addition, the manufacturing process is simple, contributing to improved productivity and stability, and has the advantage of being able to utilize various genetic engineering and chemical modifications.
본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리 시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.The peptide according to the present invention is a low-molecular-weight peptide and has the advantage of being three-dimensionally stable due to its small size, easily passing through mucous membranes, and being able to recognize molecular targets even deep in the tissue. In addition, the small molecule peptide according to the present invention is relatively simple to mass produce compared to antibodies and has little toxicity. In addition, the low-molecular-weight peptide according to the present invention has the advantage of high binding affinity to the target substance and does not undergo denaturation even during heat/chemical treatment. Additionally, because the molecule size is small, it can be used as a fusion protein by attaching it to another protein.
본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.Peptides according to the present invention can be prepared by chemical synthesis known in the art. Representative methods include, but are not necessarily limited to, liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, and 9-fluorenylmethoxycarbonyl (F-MOC) or tert-butyloxycarbonyl (T-BOC) chemistry. Additionally, the peptide of the present invention can be produced by genetic engineering methods. First, a DNA sequence encoding the peptide is constructed according to a conventional method. DNA sequences can be constructed by PCR amplification using appropriate primers. Alternatively, DNA sequences may be synthesized by standard methods known in the art, such as using automated DNA synthesizers (e.g., those sold by Biosearch or Applied Biosystems). The constructed DNA sequence is a vector containing one or more expression control sequences (e.g., promoter, enhancer, etc.) that are operably linked to the DNA sequence to control the expression of the DNA sequence. and transform the host cell with the recombinant expression vector formed therefrom. The resulting transformant is cultured under appropriate media and conditions to express the DNA sequence, and a substantially pure peptide encoded by the DNA sequence is recovered from the culture. The recovery can be performed using methods known in the art (eg, chromatography). In the above, 'substantially pure peptide' means that the peptide according to the present invention does not substantially contain any other proteins derived from the host. In addition, the peptide according to the present invention may have its N-terminus or C-terminus modified or protected with various organic groups in order to protect it from protein-cleaving enzymes in vivo and increase its stability. That is, there is no particular limitation as long as the C terminus of the peptide can be modified to increase stability, but it may preferably be modified into a hydroxy group (-OH) or an amino group (-NH 2 ). In addition, the N-terminus of the peptide is not particularly limited as long as it can be modified to increase stability, but is preferably an acetyl group, a fluorenyl methoxycarbonyl (Fmoc) group, or a formyl group. , it may be modified with a group selected from the group consisting of Palmitoyl group, Myristyl group, Stearyl group, and polyethylene glycol (PEG).
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.In addition, the peptide according to the present invention is characterized by having any one amino acid among D-type, L-type, peptide mimetics including peptoid monomers, or non-natural amino acids.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.In addition, the peptide according to the present invention is characterized as a dimer, trimer, or multimer, and may contain various functional groups at the N-terminus or C-terminus.
상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As an example of the various functional groups, the N-terminal functional group may be any one selected from the group consisting of free amine, acetylation, biotin, and fluorophore, and the C-terminal functional group may be any one selected from the group consisting of free amine, acetylation, biotin, and fluorophore. The functional group may be any one selected from the group consisting of free acid, amidation, biotin, and fluorophore, but is not limited thereto. In addition, the peptide according to the present invention may be labeled for detection or identification, and may be labeled with any one selected from the group consisting of chromogenic enzymes, radioisotopes, chromophores, luminescent substances, and fluorescent substances, but is limited thereto. It doesn't work.
상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등일 수 있다.The chromogenic enzyme may be, for example, peroxidase or alkaline phosphatase, and the radioactive isotope may be, for example, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S, The luminescent substance or fluorescent substance may be, for example, FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, fluorescein, phycoerythrin, quantum dots, etc.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.Similarly, the detectable label may be an antibody epitope, substrate, cofactor, inhibitor, or affinity ligand. This labeling may be performed during the process of synthesizing the peptide of the present invention, or may be additionally performed on the already synthesized peptide.
만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography, FMT)으로 인터루킨 1 베타에 결합한 펩타이드의 형광 패턴을 관찰할 수 있고, 형광이 관찰되는 패턴에 따라, 인터루킨 1 베타를 검출할 수 있다.If a fluorescent substance is used as a detectable label, the fluorescence pattern of the peptide bound to interleukin 1 beta can be observed using fluorescence mediated tomography (FMT), and interleukin 1 beta can be detected according to the pattern in which fluorescence is observed. can do.
본 발명의 인터루킨 1 베타 검출용 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는 데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.It is clear to those skilled in the art that biological functional equivalents that can be included in the range of the peptide for detecting interleukin 1 beta of the present invention will be limited to those that include mutations in the amino acid sequence that exhibit biological activity equivalent to the peptide of the present invention.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.These amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).In introducing mutations, the hydrophobic index of the amino acid may be considered. Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); Cysteine/Cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.The hydrophobic amino acid index is very important in imparting the interactive biological function of peptides. It is a known fact that similar biological activity can be maintained only when substituted with an amino acid having a similar hydrophobic index. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophobicity index, preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). Meanwhile, it is also well known that substitution between amino acids with similar hydrophilicity values results in peptides with equal biological activity. As disclosed in U.S. Patent No. 4,554,101, the following hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+3.0±1); glutamate (+3.0±1); serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); threonine (-0.4); Proline (-0.5±1); Alanine (-0.5); histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.When introducing a mutation with reference to the hydrophilicity value, substitution is made between amino acids that show a difference in hydrophilicity value, preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchanges in peptides that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 인터루킨 1 베타 검출용 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한 없이 사용할 수 있다. Considering the mutations having the above-mentioned biological equivalent activity, the peptide for detecting interleukin 1 beta of the present invention is interpreted to also include a sequence showing substantial identity with the sequence described in the sequence listing. The above substantial identity is achieved by aligning the peptide sequence of the present invention and any other sequence to correspond as much as possible, and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art, resulting in at least 80% identity. It means a sequence showing homology, more preferably more than 90% homology. As an alignment method for sequence comparison, any method known in the art can be used without limitation.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 검출용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting interleukin 1 beta containing the peptide according to the present invention.
상기 인터루킨 1 베타 검출용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 하기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.In the composition for detecting interleukin 1 beta, the composition includes a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. It may further include any one or more selected from the group consisting of peptides.
HFVKTPARWAWG(서열번호 2).HFVKTPARWAWG (SEQ ID NO: 2).
FRYSHSMDGAWY(서열번호 3).FRYSHSMDGAWY (SEQ ID NO: 3).
GHQGHWYQMFRA(서열번호 4).GHQGHWYQMFRA (SEQ ID NO: 4).
상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또한 앞서 기술한 바와 같이 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다. The peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, as well as the sequences listed in the sequence listing as previously described. It can be interpreted that it also includes sequences showing substantial identity. The above substantial identity is achieved by aligning the peptide sequence of the present invention and any other sequence to correspond as much as possible, and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art, resulting in at least 80% identity. It means a sequence showing homology, more preferably more than 90% homology. As an alignment method for sequence comparison, any method known in the art can be used without limitation.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 검출용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for detecting interleukin 1 beta containing the peptide according to the present invention.
상기 키트는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.The kit includes at least one selected from the group consisting of a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. More may be included.
본 발명의 인터루킨 1 베타 검출용 키트에는 인터루킨 1 베타 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃로 유지된 상태로 제공될 수 있다. The kit for detecting interleukin 1 beta of the present invention may include one or more other component compositions or devices suitable for the analysis method of the peptide for detecting interleukin 1 beta, and a buffer solution or a buffer that stably maintains the structure or physiological activity of the peptide. A reaction solution may be additionally included. Additionally, to maintain stability, it may be provided maintained at 4°C.
인터루킨 1 베타에 결합한 본 발명에 따른 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 인터루킨 1 베타와의 결합 정도 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 일 구체예로서 본 발명의 키트는 인터루킨 1 베타와 관련된 질환의 진단을 위하여 사용될 수 있고, 상기 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 진단을 실시할 수 있다.In order to facilitate the identification, detection, and quantification of the peptide according to the present invention bound to interleukin 1 beta, the peptide included in the kit of the present invention may be provided in a labeled state as described above. On the other hand, when the peptide of the present invention is provided unlabeled, the kit of the present invention additionally contains components for detecting the degree or location of the peptide of the present invention binding to interleukin 1 beta in vitro or in vivo. It can be included. The component is a known compound for labeling the peptide of the present invention, or an antibody against a specific receptor that binds to the peptide of the present invention or the peptide of the present invention, or a secondary antibody against these for detection through antigen-antibody reaction, and It may be a reagent for its detection. As one specific example, the kit of the present invention can be used to diagnose diseases related to interleukin 1 beta, and the diagnosis can be performed by modifying a conventional immunoassay method or protocol. For example, diagnosis can be performed by using the peptide of the present invention instead of the antibody in the conventional immunoassay and using the same process.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 검출용 바이오칩을 제공한다.In addition, the present invention provides a biochip for detecting interleukin 1 beta containing the peptide according to the present invention.
상기 바이오칩은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.The biochip contains at least one selected from the group consisting of a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. More may be included.
본 발명에 따른 펩타이드는 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩 (금(gold), 은(silver), 자성 비드(magnetic bead), 실리카(silica), 그래핀(graphene), 탄소 나노튜브(carbon nanotube 등의 표면상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 펩타이드의 특징과 관련되며 이와 같이 펩타이드를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다. The peptide according to the present invention can be used as a biochip on the surface of various chips (gold, silver, magnetic bead, silica, graphene, carbon nanotube, etc.) However, the features of the present invention are related to the features of the above-mentioned peptide, and manufacturing the peptide into a biochip can be done according to known techniques.
본 발명에 따른 인터루킨 1 베타 검출용 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드간의 반응을 검출할 수 있다.Using the biochip for detecting interleukin 1 beta according to the present invention, it is possible to detect the reaction between proteins, the reaction between proteins and reactive ligands, the reaction between target ligands and reactive proteins, or the reaction between target ligands and reactive ligands.
상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩타이드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.The reactive ligand may be a low molecular weight biomaterial, peptide, carbohydrate, aptamer, fatty acid, or lipid that reacts with a protein or peptide, but is not limited thereto. Additionally, the reactive protein may be an enzyme or an antibody, but is not limited thereto. Additionally, the target ligand may be a low molecular weight compound, nucleic acid, peptide, carbohydrate, aptamer, fatty acid, or lipid that reacts with a protein or peptide, but is not limited thereto. In addition, detection of the reaction can be performed using labeled or non-labeled substances.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 인터루킨 1 베타 검출 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of treating a sample with a peptide according to the present invention; and detecting a reaction between the peptide and the sample. It provides a method for detecting interleukin 1 beta, including a step.
본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the “sample” is used in the broadest sense. On the one hand, it is meant to include specimens or cultures (e.g. microbial cultures). On the other hand, it is meant to include both biological and environmental samples. Additionally, samples may include specimens of synthetic origin. The biological samples include whole blood, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, Breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid ), leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple Nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extract and cerebrospinal fluid ( It may be one or more selected from the group consisting of cerebrospinal fluid, but is not limited thereto.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파 전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the method of the present invention, detection of the reaction can be performed using cyclic voltammetry, square wave voltammetry, electrochemical impedance spectroscopy, and quartz crystal microbalance. ), Surface plasmon resonance, LFA (Lateral flow assay)/VFA (variable flip angle), Enzyme linked immunoassay, Fluorescence resonance energy transfer, and surface-enhanced Raman It may be performed by one or more methods selected from the group consisting of surface-enhanced Raman spectroscopy, but is not limited thereto.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 인터루킨 1 베타 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.Additionally, the present invention provides a composition for diagnosing interleukin 1 beta-related diseases comprising the peptide according to the present invention.
본 발명에 있어서, 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환, 또는 이의 원인에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.In the present invention, the "diagnosis" refers to determining an individual's susceptibility to a specific disease or condition, or its cause, determining whether an individual currently has a specific disease or condition, Includes determining the prognosis of a subject with a particular disease or disorder, or therametrics (e.g., monitoring the condition of a subject to provide information about the efficacy of treatment).
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 이용하여 인터루킨 1 베타의 검출이 가능한바, 이를 이용하여 시료 내 인터루킨 1 베타의 존재 유무를 검출하거나, 인터루킨 1 베타의 양을 정량하기 위한 용도로 활용될 수 있고, 보다 구체적으로는 인터루킨 1 베타가 발현되는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 인터루킨 1 베타 관련 질환은 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 알츠하이머병(Alzheimer disease), 및 알레르기(allergy)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.As described above, detection of interleukin 1 beta is possible using the peptide of the present invention, and it can be used to detect the presence or absence of interleukin 1 beta in a sample or to quantify the amount of interleukin 1 beta. And, more specifically, it can be used to diagnose diseases in which interleukin 1 beta is expressed. The interleukin 1 beta-related disease may be one or more selected from the group consisting of Crohn's disease, ulcerative colitis, Alzheimer's disease, and allergy, but is not limited thereto.
더불어 상기 조성물은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.In addition, the composition includes at least one selected from the group consisting of a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. It may further include.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.The contents of the present invention described above are applied equally to each other unless they contradict each other, and implementation by a person skilled in the art with appropriate changes is also included in the scope of the present invention.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 인터루킨 1 베타에 특이적인 펩타이드의 발굴Example 1. Discovery of peptides specific for interleukin 1 beta
인터루킨 1 베타에 특이적인 펩타이드를 발굴하기 위하여 먼저 아크로(Acro)사에서 인터루킨 1 베타(Cat. No. ILB-H4110)를 구입하여 바이오틴화(biotinylation)를 진행했으며 사용 전까지 초 저온 냉장고에 보관했다.In order to discover a peptide specific to interleukin 1 beta, interleukin 1 beta (Cat. No. ILB-H4110) was purchased from Acro, biotinylated, and stored in an ultra-low temperature refrigerator until use.
더불어 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library)는 Ph.D.-12(New England BioLab)을 사용했다. 이는 M13 박테리오파지의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 12개의 무작위 아미노산을 갖는 선형 모형의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.In addition, Ph.D.-12 (New England BioLab) was used as a bacteriophage random peptide library (phage display peptide library). This is done by artificially inserting a gene sequence to express a linear peptide with 12 random amino acids at the end of the gene that produces pIII, a type of coat protein, in the genome of M13 bacteriophage, and then inserting the gene sequence into E. coli. It is composed of recombinant bacteriophages that express hundreds of millions of different peptides obtained by infecting .
Ph.D.-12를 이용하여 각각 총 4회의 패닝(panning)을 수행하였으며, 패닝에는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 코팅되어 있는 평판 (Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. no. 15501))을 사용했다. 패닝은 다음과 같이 진행하였다.A total of four pannings were performed using Ph.D.-12, and panning was performed using streptavidin-coated plates (Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. no. 15501)) was used. Panning was performed as follows.
먼저, 바이오틴화된 인터루킨 1 베타(Biotinylated Interleukin-1beta) 100 μL (인터루킨 1 베타 농도: 17.5 μg/mL(1 μM))에 M13 라이브러리 1 μL (농도 : 1.0 x 1011 PFU/mL)을 넣어준 후 실온에서 1시간 동안 100 rpm으로 교반하였다. 표적 단백질인 바이오틴화된 인터루킨 1 베타와 M13 라이브러리 혼합체(phage-protein complex)의 교반이 마무리되어 갈 때 스트렙트아비딘이 코팅된 평판을 0.1 M 농도의 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 3회 반복 세척하였다. 이후, 바이오틴화된 인터루킨 1 베타와 M13 라이브러리 혼합체 100 μL를 상기 평판 위에 첨가하고 10분 동안 110 rpm으로 반응시켰다. 그 후 바이오틴 1 μL(농도 : 0.1 mM)를 첨가해 5분 동안 블로킹(blocking)해준 뒤 200 μL의 PBST(0.1 M PBS에 0.1 % 트윈 20(Tween 20)을 첨가)를 사용하여 10회 반복 세척하였다. 최종적으로 인터루킨 1 베타에 특이적으로 결합하는 박테리오파지는 100 μL의 0.2 M 글리신-HCl(Glycine-HCl (pH 2.2)) 1 mg/mL BSA(Bovine Serum Albumin) 용액에 용출되었고, 중화(neutralization)를 위해 15 μL의 Tris-HCl (pH 9.0)을 첨가하였다.First, 1 μL of the M13 library (concentration: 1.0 Then, it was stirred at 100 rpm for 1 hour at room temperature. When the agitation of the target protein, biotinylated interleukin 1 beta and M13 library mixture (phage-protein complex), was completed, the streptavidin-coated plate was repeated three times using 0.1 M phosphate buffered saline (PBS). Washed. Afterwards, 100 μL of the biotinylated interleukin 1 beta and M13 library mixture was added to the plate and reacted at 110 rpm for 10 minutes. Afterwards, 1 μL of biotin (concentration: 0.1 mM) was added and blocked for 5 minutes, and then washed 10 times repeatedly using 200 μL of PBST (0.1% Tween 20 added to 0.1 M PBS). did. Finally, the bacteriophage that specifically binds to interleukin 1 beta was eluted in 100 μL of 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2) 1 mg/mL BSA (Bovine Serum Albumin) solution, and neutralization was performed. 15 μL of Tris-HCl (pH 9.0) was added.
이를 통해 인터루킨 1 베타에 특이적 결합을 하는 신규한 펩타이드를 선별하였고 이들의 발굴 수율을 하기 수학식 1을 이용하여 계산하여 하기 표 1에 나타내었다.Through this, novel peptides that specifically bind to interleukin 1 beta were selected, and their discovery yields were calculated using Equation 1 below and are shown in Table 1 below.
[수학식 1][Equation 1]
수율(Yield) (%) = 출력(Output)/입력(Input) x 100 (%) Yield (%) = Output/Input x 100 (%)
더불어 상기 펩타이드의 아미노산 서열을 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하여 하기 표 2에 나타내었다.In addition, the amino acid sequence of the peptide was confirmed through DNA sequencing and is shown in Table 2 below.
(12mer)(12mer)
(PFU/mL)(PFU/mL)
(PFU/mL)(PFU/mL)
(%)(%)
실시예 2. 선별된 박테리오파지 후보군의 인터루킨 1 베타에 대한 결합력 확인Example 2. Confirmation of binding ability of selected bacteriophage candidates to interleukin 1 beta
상기 실시예 1을 통해 선별된 4개의 박테리오파지 후보군을 ELISA(enzymed-linked immunosorbent assay) 실험에 이용하기 위해 증폭(Amplification) 반응을 진행하였다. 각각의 박테리오파지 스톡(stock)을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 LB 배지에 넣은 후 37℃에서 210 rpm으로 4-5시간 동안 배양하였다. 이를 원심분리하여 상층액을 회수하고 20% PEG(polyethylen glycol)/2.5M NaCl을 첨가하여 4℃ 냉장고에 15시간 방치한 후 다시 원심분리하였다. 그런 후 침전물을 수득하고 이를 PBS에 녹인 후 박테리오파지 적정(Titration)을 실시하여 각각의 박테리오파지의 농도 (PFU/mL : Plaque forming units/mL)를 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다:An amplification reaction was performed to use the four bacteriophage candidates selected through Example 1 in an ELISA (enzymed-linked immunosorbent assay) experiment. Each bacteriophage stock was placed in LB medium together with pre-cultured E. coli ER2738 and cultured at 37°C at 210 rpm for 4-5 hours. This was centrifuged to recover the supernatant, 20% PEG (polyethylene glycol)/2.5M NaCl was added, left in a 4°C refrigerator for 15 hours, and then centrifuged again. Then, the precipitate was obtained, dissolved in PBS, and then subjected to bacteriophage titration, and the concentration of each bacteriophage (PFU/mL: Plaque forming units/mL) was calculated using Equation 2 below:
[수학식 2][Equation 2]
박테리오파지 농도(PFU/mL) = Plaque수 x 희석배수 x mL로 환산한 접종량Bacteriophage concentration (PFU/mL) = Plaque number x dilution factor x inoculum converted to mL
각각의 후보군과 인터루킨 1 베타의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판을 200μL의 0.1M PBS를 이용하여 5분씩 3번 반복하여 사전 세척(Pre-washing)해준 뒤, 바이오틴화된 인터루킨 1 베타 100μL(인터루킨 1 베타 농도: 17.5μg/mL (1μM))를 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 1시간 동안 실온에서 교반하였다. To compare the binding affinity between each candidate group and interleukin 1 beta, ELISA was performed as follows. First, the plate coated with streptavidin was pre-washed three times for 5 minutes each using 200μL of 0.1M PBS, and then 100μL of biotinylated interleukin 1 beta (interleukin 1 beta concentration: 17.5μg/ mL (1 μM)) was added to a plate coated with streptavidin and stirred at room temperature for 1 hour.
대조군으로 사용된 바이오틴화된 BSA, 바이오틴은 인터루킨 1베타와 동일하게 17.5μg/mL 농도로 100μL 씩 스트렙트아비딘이 코팅된 플레이트에 처리하였다. 바이오틴화된 BSA는 Thermo Scientific에서 구입한 biotinylation kit를 사용하여 직접 바이오틴화를 수행했으며, 바이오틴 역시 Thermo Scientific에서 구입하여 사용하였다.Biotinylated BSA and biotin, used as a control, were treated on streptavidin-coated plates at a concentration of 17.5 μg/mL, 100 μL each, in the same manner as interleukin 1 beta. Biotinylated BSA was directly biotinylated using a biotinylation kit purchased from Thermo Scientific, and biotin was also purchased from Thermo Scientific.
이후 상층 용액을 제거하고, 블로킹 용액 (5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200μL을 첨가하여 4℃에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 그 후, PBST로 6회 반복 세척한 후, 선별된 각각의 박테리오파지를 1012 PFU/mL의 농도로 처리하고 상온에서 1시간동안 100 rpm의 속도로 교반하였다. 그 후 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 항-M13-HRP(Anti-M13-HRP) 항체와 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))를 이용하여 405nm에서 흡광도(OD)값을 측정하였다. Afterwards, the upper layer solution was removed, and 200 μL of blocking solution (5% BSA in NaHCO 3 , pH 8.6) was added and reacted at 4°C for 1 hour and 30 minutes. Afterwards, after repeated washing with PBST 6 times, each selected bacteriophage was treated at a concentration of 10 12 PFU/mL and stirred at a speed of 100 rpm for 1 hour at room temperature. After washing with PBST repeatedly 6 times, using anti-M13-HRP antibody and ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) The absorbance (OD) value was measured at 405 nm.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 4개의 후보군 중 IL-1beta 12mer 4-19로 명명된 후보군이 바이오틴화된 BSA, 바이오틴, PBS에 대한 비특이적 결합이 없으면서도 인터루킨 1 베타에 대해 가장 좋은 결합력을 보이는 것을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 1, among the four candidates, the candidate named IL-1beta 12mer 4-19 showed the best binding ability to interleukin 1 beta without non-specific binding to biotinylated BSA, biotin, and PBS. confirmed.
실시예 3. 박테리오파지 입자(Phage particle) 농도에 따른 결합력 확인Example 3. Confirmation of binding force according to bacteriophage particle (Phage particle) concentration
상기 실시예 2를 통해 선별된 IL-1beta 12mer 4-19의 박테리오파지 입자 농도에 따른 결합력을 ELISA를 수행하여 확인하였다. 먼저, 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판을 0.1M PBS 200 μL를 이용하여 5분씩 3번 반복하여 사전 세척한 뒤, 바이오틴화된 인터루킨 1 베타 100μL(인터루킨 1 베타 농도: 17.5μg/mL (1 μM))를 상기 평판에 넣고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 이후 상층 용액을 제거하고, 블로킹 용액(5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200μL을 첨가한 후 4℃에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 그 후, PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 106 PFU/mL, 108 PFU/mL, 1010 PFU/mL, 1012 PFU/mL의 농도의 IL-1beta 12mer 4-19의 박테리오파지를 처리하고 상온에서 1시간동안 100rpm의 속도로 교반하였다. 이때 야생형(wild-type) M13 박테리오파지를 대조군(control)으로 처리하였다. 그런 후 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 항-M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405nm에서 OD값을 측정하였다. The binding ability of IL-1beta 12mer 4-19 selected through Example 2 according to bacteriophage particle concentration was confirmed by performing ELISA. First, the streptavidin-coated plate was prewashed three times for 5 minutes each using 200 μL of 0.1M PBS, and then 100 μL of biotinylated interleukin 1 beta (interleukin 1 beta concentration: 17.5 μg/mL (1 μM) )) was added to the plate and stirred at room temperature for 1 hour. Afterwards, the upper layer solution was removed, 200 μL of blocking solution (5% BSA in NaHCO 3 , pH 8.6) was added, and reaction was performed at 4°C for 1 hour and 30 minutes. Afterwards, washing was repeated 6 times with PBST, and then treated with IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage at concentrations of 10 6 PFU/mL, 10 8 PFU/mL, 10 10 PFU/mL, and 10 12 PFU/mL. and stirred at a speed of 100 rpm for 1 hour at room temperature. At this time, wild-type M13 bacteriophage was treated as a control. After washing with PBST repeatedly 6 times, the OD value was measured at 405 nm using anti-M13-HRP antibody and ABTS.
그 결과 도 2와 같이, IL-1beta 12mer 4-19의 박테리오파지 입자가 1012 PFU/mL일 때 인터루킨 1 베타에 대한 결합능이 급격히 증가하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that the binding ability to interleukin 1 beta increased rapidly when the bacteriophage particles of IL-1beta 12mer 4-19 were 10 12 PFU/mL.
실시예 4. 인터루킨 1 베타 농도에 따른 결합력 확인Example 4. Confirmation of binding ability according to interleukin 1 beta concentration
상기 실시예 2를 통해 선별된, IL-1beta 12mer 4-19의 인터루킨 1 베타 농도에 따른 결합력을 ELISA를 수행하여 확인하였다. 먼저, 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판을 0.1M PBS 200μL를 이용하여 5분씩 3번 반복하여 사전 세척한 뒤, 바이오틴화된 인터루킨 1 베타 100μL(인터루킨 1 베타 농도: 1.09μg/mL(0.0625 μM), 4.38μg/mL(0.25 μM), 8.75μg/mL(0.5 μM), 17.5 μg/mL (1μM))를 상기 평판에 넣은 후 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 이후 상층 용액을 제거하고, 블로킹 용액(5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200 μL을 첨가하여 4℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 선별된 후보군을 1012 PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간동안 100 rpm의 속도로 교반하였다. 이를 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 항-M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405 nm에서 OD값을 측정하였다. The binding ability of IL-1beta 12mer 4-19, selected through Example 2, according to interleukin 1 beta concentration was confirmed by performing ELISA. First, the streptavidin-coated plate was pre-washed three times for 5 minutes each using 200 μL of 0.1M PBS, and then 100 μL of biotinylated interleukin 1 beta (interleukin 1 beta concentration: 1.09 μg/mL (0.0625 μM)). , 4.38 μg/mL (0.25 μM), 8.75 μg/mL (0.5 μM), and 17.5 μg/mL (1 μM)) were added to the plate and stirred at room temperature for 1 hour. Afterwards, the upper layer solution was removed, and 200 μL of blocking solution (5% BSA in NaHCO 3 , pH 8.6) was added and allowed to react at 4°C for 1 hour and 30 minutes. After washing with PBST repeatedly 6 times, the selected candidates were treated at a concentration of 10 12 PFU/mL and stirred at a speed of 100 rpm for 1 hour at room temperature. After washing this repeatedly 6 times with PBST, the OD value was measured at 405 nm using anti-M13-HRP antibody and ABTS.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 인터루킨 1 베타의 농도가 증가할수록 IL-1beta 12mer 4-19의 결합력도 증가하는 것을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 3, it was confirmed that as the concentration of interleukin 1 beta increased, the binding affinity of IL-1beta 12mer 4-19 also increased.
실시예 5. 골드칩(gold chip)에 대한 고정화 확인Example 5. Confirmation of immobilization on gold chip
선별된 IL-1beta 12mer 4-19가 골드 작업 전극(gold working electrode)에 고정화될 수 있는지 CHI 660E(Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국)장비를 사용하여 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. It was confirmed whether the selected IL-1beta 12mer 4-19 could be immobilized on a gold working electrode using CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, USA) equipment. The analysis was conducted at room temperature, and disposable gold chips were used.
이를 위해 전위차 전기 화학 측정의 한 유형인 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry, CV)을 수행하였다. 상기 CV는 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 화학정이 존재하는 상태에서 작업 전극에 빠른 속도로 전압을 주사하면 이에 따른 전류 값의 변화에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 확인할 수 있는 분석 방법이다. For this purpose, cyclic voltammetry (CV), a type of potentiometric electrochemical measurement, was performed. The CV refers to the thermodynamics and kinetics of the electrochemical reaction of materials that occur near the electrode surface due to the change in current value when a voltage is injected at a high speed to the working electrode in the presence of a chemical crystal capable of oxidation/reduction reaction in the electrolyte. This is an analysis method that allows you to check parameters.
먼저 골드칩을 연마(Polishing)하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소(H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 제조한 피라냐 용액(Piranha solution)을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 서 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다.First, to polish the gold chip, it was immersed in ethanol for 5 minutes and then washed with distilled water. Accordingly, 250 μL of Piranha solution prepared by mixing sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in a 7:3 ratio was applied, left at room temperature for 8 minutes, and then washed again for the third time. Washed with distilled water.
그 후 골드칩을 한쪽 말단에 싸이올기(thiol, -SH)가 있는 11-MUA(11-Mercaptoundecanoic acid) (농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하고 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그 후 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride))와 NHS(N-Hydroxysuccinimide) (농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반시켰다. 이때, MUA의 카복실기(carboxyl group)와 EDC가 먼저 반응하여 중간체(O acylisourea intermediate)를 만들고, NHS가 반응하여 NHS 에스터(ester)를 형성하게 된다. 상기와 같이 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지(농도: 1.0×1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반시켰다. 그 후 골드칩을 3차 증류수로 씻어주고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극(Counter Electrode) 및 기준전극(Reference Electrode)과 함께 CV를 통해 스캔 속도에 따른 전류 변화를 확인하여 본 발명에 따른 IL-1beta 12mer 4-19가 기능기로 활성화된 골드칩에 고정화되었는지 확인하였다.Afterwards, the gold chip was immersed in 11-MUA (11-Mercaptoundecanoic acid) (concentration: 1 mM), which has a thiol group (-SH) at one end, and stirred at room temperature for 14 hours to fix the MUA on the gold chip. After that, it was thoroughly washed with tertiary distilled water and fixed in a gold chip dedicated cell. Afterwards, 75 μL of EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and NHS (N-Hydroxysuccinimide) (concentration ratio: 800mM:200mM) were added to the gold chip on which MUA was immobilized and incubated for 1 hour. It was stirred at room temperature for a while. At this time, the carboxyl group of MUA and EDC react first to form an intermediate (O acylisourea intermediate), and then NHS reacts to form NHS ester. The gold chip with the desired functional group activated as described above was washed with distilled water and 75 μL of IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage (concentration: 1.0×10 12 PFU/mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour. Afterwards, the gold chip was washed with tertiary distilled water and an electrolyte solution (K 4 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM+K 3 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM in 1M KNO 3 ) was added. Afterwards, the change in current according to the scan speed was confirmed through CV with the counter electrode and reference electrode to determine whether IL-1beta 12mer 4-19 according to the present invention was immobilized on the gold chip activated with a functional group. Confirmed.
상기와 같이 MUA-EDC/NHS가 처리된 골드칩 표면에 본 발명에 따른 IL-1beta 12mer4-19가 잘 고정화되었는지를 확인하기 위하여 표면 흡착률을 확인하였다. 이는 스캔 속도를 50-40 mV/s로 다르게 함으로써, 속도에 따른 피크 전류의 변화를 측정하여 확인하였다(도 4 왼쪽 그래프 참고). 더불어 스캔 속도에 따른 양극(ipa) 및 음극(ipc) 피크 전류 밀도도 확인하였다(도 4 오른쪽 그래프 참고.) 스캔 속도에 따른 양극(ipa) 및 음극(ipc) 피크 전류 밀도는 전위 스위프 속도에 비례한 것으로 관찰되었다.The surface adsorption rate was checked to confirm whether IL-1beta 12mer4-19 according to the present invention was well immobilized on the surface of the gold chip treated with MUA-EDC/NHS as described above. This was confirmed by varying the scan speed from 50 to 40 mV/s and measuring the change in peak current according to speed (see left graph in Figure 4). In addition, the anode (ipa) and cathode (ipc) peak current densities according to the scan speed were also confirmed (see the graph on the right side of Figure 4.) The anode (ipa) and cathode (ipc) peak current densities according to the scan speed are proportional to the potential sweep speed. It was observed that
따라서 도 4에 나타낸 바와 같이, 전극의 산화, 환원 과정이 전하 이동 역학(charge transfer kinetic)에 의해 제어되어 본 발명에 따른 IL-1beta 12mer 4-19가 골드칩에 고정화되었음을 확인하였다.Therefore, as shown in Figure 4, it was confirmed that the oxidation and reduction process of the electrode was controlled by charge transfer kinetics and that IL-1beta 12mer 4-19 according to the present invention was immobilized on the gold chip.
실시예 6. 전기화학적 분석법을 이용한 박테리오파지 입자 농도에 따른 결합력 확인Example 6. Confirmation of binding force according to bacteriophage particle concentration using electrochemical analysis
더불어 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국) 장비를 사용하여 골드칩에 고정된 본 발명에 따른 IL-1beta 12mer 4-19의 박테리오파지 입자 농도에 따른 결합능을 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 이를 위해 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 상태에서 작업 전극에 빠른 속도로 전압을 주사하면 이에 따른 전류의 값에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 확인할 수 있는 분석 방법인 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry, SWV)을 수행하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지(농도: 109 - 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 인터루킨 1 베타(농도: 1 μM)을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 3차 증류수로 다시 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다.In addition, the binding ability of IL-1beta 12mer 4-19 according to the present invention immobilized on a gold chip was confirmed according to the bacteriophage particle concentration using CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, USA) equipment. The analysis was conducted at room temperature, and disposable gold chips were used. For this purpose, when voltage is injected at a high speed to the working electrode in a state where oxidation/reduction reaction is possible in the electrolyte, the resulting current value is used to determine the thermodynamic and kinetic parameters of the electrochemical reaction of the material that occurs near the electrode surface. The method, Square Wave Voltammetry (SWV), was performed. First, to polish the gold chip, it was immersed in ethanol for 5 minutes and then washed with distilled water. Accordingly, 250 μL of piranha solution prepared by mixing sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in a 7:3 ratio was applied, left at room temperature for 8 minutes, and then washed again with tertiary distilled water. Afterwards, the gold chip was immersed in 11-MUA (concentration: 1 mM) with -SH group at one end and stirred at room temperature for 14 hours to fix the MUA on the gold chip. After that, it was thoroughly washed with tertiary distilled water and used exclusively for the gold chip. fixed to the cell. Then, 75 μL each of EDC and NHS (concentration ratio: 800mM:200mM) were added to the gold chip on which MUA was immobilized and stirred at room temperature for 1 hour. The gold chip with the desired functional group activated was washed with distilled water and 75 μL of IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage (concentration: 10 9 - 10 12 PFU/mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour. Next, the gold chip was washed with tertiary distilled water, interleukin 1 beta (concentration: 1 μM) was added and stirred at room temperature for 1 hour, then washed again with tertiary distilled water and electrolyte solution (K 4 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM+K 3 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM in 1M KNO 3 ) was added. Afterwards, SWV was measured together with the counter electrode and reference electrode.
그 결과 도 5와 같이, IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지 입자 농도가 증가함에 따라 인터루킨 1 베타와의 특이적인 결합이 더 많이 발생하게 되어 전류가 순차적으로 감소하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 5, it was confirmed that as the concentration of IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage particles increased, more specific binding to interleukin 1 beta occurred and the current sequentially decreased.
실시예 7. 전기화학적 분석법을 이용한 인터루킨 1 베타 농도에 따른 결합력 확인Example 7. Confirmation of binding force according to interleukin 1 beta concentration using electrochemical analysis
또한 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국) 장비를 사용하여 골드칩에 고정된 본 발명에 따른 IL-1beta 12mer 4-19의 인터루킨 1 베타 농도에 따른 결합력을 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지(농도: 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 인터루킨 1 베타(농도: 0.55 μg/mL, 1.09 μg/mL, 2.19 μg/mL, 4.38μg/mL)을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 3차 증류수로 다시 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다.In addition, the binding affinity of IL-1beta 12mer 4-19 according to the present invention immobilized on a gold chip according to the interleukin 1 beta concentration was confirmed using CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, USA) equipment. The analysis was conducted at room temperature, and disposable gold chips were used. First, to polish the gold chip, it was immersed in ethanol for 5 minutes and then washed with distilled water. Accordingly, 250 μL of piranha solution prepared by mixing sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in a 7:3 ratio was applied, left at room temperature for 8 minutes, and then washed again with tertiary distilled water. Afterwards, the gold chip was immersed in 11-MUA (concentration: 1 mM) with -SH group at one end and stirred at room temperature for 14 hours to fix the MUA on the gold chip. After that, it was thoroughly washed with tertiary distilled water and used exclusively for the gold chip. fixed to the cell. Then, 75 μL each of EDC and NHS (concentration ratio: 800mM:200mM) were added to the gold chip on which MUA was immobilized and stirred at room temperature for 1 hour. The gold chip with the desired functional group activated was washed with distilled water and 75 μL of IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage (concentration: 10 12 PFU/mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour. Next, the gold chip was washed with distilled water for the third time, interleukin 1 beta (concentration: 0.55 μg/mL, 1.09 μg/mL, 2.19 μg/mL, 4.38 μg/mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour, and then washed for the third time. It was washed again with distilled water and an electrolyte solution (K 4 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM+K 3 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM in 1M KNO 3 ) was added. Afterwards, SWV was measured together with the counter electrode and reference electrode.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 인터루킨 1 베타 농도가 증가함에 따라 IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지와의 특이적인 결합이 더 많이 발생하게 되어 전류가 순차적으로 감소하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 6, it was confirmed that as the concentration of interleukin 1 beta increases, more specific binding to IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage occurs, and the current sequentially decreases.
실시예 8. 전기화학적 분석법을 이용한 인터루킨 1 베타에 대한 결합 상수 확인Example 8. Confirmation of binding constant for interleukin 1 beta using electrochemical analysis
더불어 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국)장비를 사용하여 IL-1beta 12mer 4-19의 인터루킨 1 베타에 대한 결합능을 측정하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지(농도: 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다. In addition, the binding ability of IL-1beta 12mer 4-19 to interleukin 1 beta was measured using CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, USA) equipment. The analysis was conducted at room temperature, and disposable gold chips were used. First, to polish the gold chip, it was immersed in ethanol for 5 minutes and then washed with distilled water. Accordingly, 250 μL of piranha solution prepared by mixing sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in a 7:3 ratio was applied, left at room temperature for 8 minutes, and then washed again with tertiary distilled water. Afterwards, the gold chip was immersed in 11-MUA (concentration: 1 mM) with -SH group at one end and stirred at room temperature for 14 hours to fix the MUA on the gold chip. After that, it was thoroughly washed with tertiary distilled water and used exclusively for the gold chip. fixed to the cell. Then, 75 μL each of EDC and NHS (concentration ratio: 800mM:200mM) were added to the gold chip on which MUA was immobilized and stirred at room temperature for 1 hour. The gold chip with the desired functional group activated was washed with distilled water and 75 μL of IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage (concentration: 10 12 PFU/mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour. Next, the gold chip was washed with tertiary distilled water and an electrolyte solution (K 4 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM+K 3 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM in 1M KNO 3 ) was added. Afterwards, SWV was measured together with the counter electrode and reference electrode.
그 후 골드칩을 3차 증류수로 씻어주고 인터루킨 1 베타(농도: 0 - 4.375 μg/mL)을 넣고 1시간동안 상온에서 교반한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 상기 전해용액을 넣은 후 본 발명에 따른 박테리오박테리오파지 후보군과 인터루킨 1 베타와의 결합력을 SWV로 측정하였다. Afterwards, the gold chip was washed with tertiary distilled water, interleukin 1 beta (concentration: 0 - 4.375 μg/mL) was added, stirred at room temperature for 1 hour, and then washed with tertiary distilled water. Accordingly, after adding the electrolyte solution, the binding force between the bacteriobacteriophage candidate group according to the present invention and interleukin 1 beta was measured by SWV.
즉, 인터루킨 1 베타 농도에 따른 결합력을 전기화학적 신호변화로 측정하였으며, 하기 수학식 3을 통해 SWV에서 얻은 전류값으로부터 결합력을 산출하였다.That is, the binding force according to the concentration of interleukin 1 beta was measured by electrochemical signal change, and the binding force was calculated from the current value obtained from SWV through Equation 3 below.
[수학식 3][Equation 3]
상대 전류 변화값(ΔI(%)) = (Ib-Ia)/Ib×100Relative current change value (ΔI(%)) = (I b -I a )/I b ×100
여기서, Ia는 인터루킨 1 베타가 고정화된 상태에서의 전류값을 의미하고 Ib는 IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지 입자가 고정화된 상태에서의 전류값을 의미한다.Here, Ia refers to the current value in the state in which interleukin 1 beta is immobilized, and Ib refers to the current value in the state in which IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage particles are immobilized.
상기를 통해 확인된 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7 중 왼쪽 그래프는 IL-1beta 12mer 4-19의 결합 상수를 확인한 그래프이며, 오른쪽은 결합 상수를 산출할 때 활용했던 선형 그래프로, 농도에 따라 선형적으로 증가하는 구간(0.034-0.274 μg/mL)을 확인할 수 있었다.The results confirmed above are shown in Figure 7. The left graph in Figure 7 is a graph confirming the binding constant of IL-1beta 12mer 4-19, and the right is a linear graph used to calculate the binding constant, showing the range that increases linearly with concentration (0.034-0.274 μg/ mL) could be confirmed.
그러므로 도 7과 같이, 본 발명에 따른 IL-1beta 12mer 4-19의 결합 상수 값은 0.025 ± 0.003 μg/mL인 것을 확인하였다.Therefore, as shown in Figure 7, the binding constant value of IL-1beta 12mer 4-19 according to the present invention was confirmed to be 0.025 ± 0.003 μg/mL.
실시예 9. 전기화학적 분석법을 이용한 인터루킨 1 베타에 대한 특이성 확인Example 9. Confirmation of specificity for interleukin 1 beta using electrochemical analysis
또한 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국) 장비를 사용하여 IL-1beta 12mer 4-19의 인터루킨 1 베타에 대한 특이성을 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 IL-1beta 12mer 4-19 박테리오파지(농도: 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 이후, 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 대조군으로 사용된 BSA(Bovine serum albumin, (Sigma- Aldrich에서 구입)), PCT(Procalcitonin, (Randox Life Sciences에서 구입)), CRP(C-Reactive protein, (Biorbyt에서 구입)), 카스파제-3(Caspase-3, (Enzo Life Sciences에서 구입)), IL-33(Acrobiosystem에서 구입)과 인터루킨 1 베타(Acrobiosystem에서 구입)를 모두 0.55 μg/mL의 동일한 농도로 각각 다른 전기화학 셀에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반시켰다. Additionally, the specificity of IL-1beta 12mer 4-19 for interleukin 1 beta was confirmed using CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, USA) equipment. The analysis was conducted at room temperature, and disposable gold chips were used. First, to polish the gold chip, it was immersed in ethanol for 5 minutes and then washed with distilled water. Accordingly, 250 μL of piranha solution prepared by mixing sulfuric acid (H 2 SO 4 ) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in a 7:3 ratio was applied, left at room temperature for 8 minutes, and then washed again with tertiary distilled water. Afterwards, the gold chip was immersed in 11-MUA (concentration: 1 mM) with -SH group at one end and stirred at room temperature for 14 hours to fix the MUA on the gold chip. After that, it was thoroughly washed with tertiary distilled water and used exclusively for the gold chip. fixed to the cell. Then, 75 μL each of EDC and NHS (concentration ratio: 800mM:200mM) were added to the gold chip on which MUA was immobilized and stirred at room temperature for 1 hour. The gold chip with the desired functional group activated was washed with distilled water and 75 μL of IL-1beta 12mer 4-19 bacteriophage (concentration: 10 12 PFU/mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour. Afterwards, the gold chip was washed with tertiary distilled water and an electrolyte solution (K 4 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM+K 3 [Fe(CN) 6 ] 4- 2.5mM in 1M KNO 3 ) was added. Afterwards, SWV was measured together with the counter electrode and reference electrode. Next, the gold chip was washed with distilled water and washed with BSA (Bovine serum albumin, purchased from Sigma-Aldrich), PCT (Procalcitonin, purchased from Randox Life Sciences), and CRP (C-Reactive protein, used as controls). (purchased from Biorbyt)), caspase-3 (purchased from Enzo Life Sciences), IL-33 (purchased from Acrobiosystem) and interleukin 1 beta (purchased from Acrobiosystem) were all administered at 0.55 μg/mL at the same concentration. Different concentrations were placed in electrochemical cells and stirred at room temperature for 1 hour.
이를 3차 증류수로 세척한 후, 상기 전해용액을 넣고 각 실험군의 결합력을 SWV로 측정하였다. 상기 실시예 8에 기재한 수학식을 통해 측정된 값으로부터 각 실험군의 결합력을 산출하였다.After washing it with tertiary distilled water, the electrolyte solution was added, and the binding force of each experimental group was measured by SWV. The binding force of each experimental group was calculated from the values measured using the equation described in Example 8.
그 결과 도 8과 같이, 본 발명에 따른 IL-1beta 12mer 4-19는 인터루킨 1 베타에 특이적으로 우수하게 결합하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 8, it was confirmed that IL-1beta 12mer 4-19 according to the present invention specifically and excellently binds to interleukin 1 beta.
종합적으로, 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 본 발명의 펩타이드는 인터루킨 1 베타와 특이적으로 결합할 수 있어 인터루킨 1 베타를 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩도 인터루킨 1 베타에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인하였다.Overall, it was confirmed that the peptide of the present invention discovered using bacteriophage display screening can specifically bind to interleukin 1 beta and thus accurately detect interleukin 1 beta, and the biochip on which the peptide according to the present invention is immobilized is also It was confirmed that it exhibits high sensitivity and specificity for interleukin 1 beta.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel peptide for specific detection of Interleukin 1 beta <130> DP-22041 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide1 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 1 Tyr Val His His Tyr Ser Thr Gly Gln Met Phe Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide2 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 2 His Phe Val Lys Thr Pro Ala Arg Trp Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide3 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 3 Phe Arg Tyr Ser His Ser Met Asp Gly Ala Trp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide4 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 4 Gly His Gln Gly His Trp Tyr Gln Met Phe Arg Ala 1 5 10 <110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel peptide for specific detection of Interleukin 1 beta <130> DP-22041 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide1 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 1 Tyr Val His His Tyr Ser Thr Gly Gln Met Phe Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide2 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 2 His Phe Val Lys Thr Pro Ala Arg Trp Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide3 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 3 Phe Arg Tyr Ser His Ser Met Asp Gly Ala Trp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide4 for specific detection of Interleukin 1beta <400> 4 Gly His Gln Gly His Trp Tyr Gln Met Phe Arg Ala 1 5 10
Claims (14)
A peptide for detecting Interleukin 1 beta comprising part or the entire sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
상기 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
According to clause 1,
A peptide characterized in that the peptide is a dimer, trimer, or multimer.
상기 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
According to clause 1,
The peptide is characterized in that it is labeled with one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a radioisotope, a chromophore, a luminescent substance, and a fluorescent substance.
A composition for detecting interleukin 1 beta comprising the peptide according to any one of claims 1 to 3.
상기 검출용 조성물은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
According to clause 4,
The detection composition is any one selected from the group consisting of a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. A composition for detection, characterized in that it further comprises the above.
A kit for detecting interleukin 1 beta comprising the peptide according to any one of claims 1 to 3.
상기 키트는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 검출용 키트.
According to clause 6,
The kit includes at least one selected from the group consisting of a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. A kit for detection, characterized in that it further comprises.
A biochip for detecting interleukin 1 beta comprising the peptide according to any one of claims 1 to 3.
상기 바이오칩은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오칩.
According to clause 8,
The biochip contains at least one selected from the group consisting of a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. A biochip, characterized in that it further comprises.
Treating a sample with the peptide according to any one of claims 1 to 3; And a method for detecting interleukin 1 beta, comprising the step of detecting a reaction between the peptide and the sample.
상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
According to clause 10,
Detection of the reaction can be performed using cyclic voltammetry, square wave voltammetry, electrochemical impedance spectroscopy, quartz crystal microbalance, and surface plasmon resonance ( Surface plasmon resonance, LFA (lateral flow assay)/VFA (variable flip angle), enzyme linked immunoassay, fluorescence resonance energy transfer, and surface-enhanced Raman spectroscopy. ), characterized in that it is performed by one or more methods selected from the group consisting of.
A composition for diagnosing interleukin 1 beta-related diseases comprising the peptide according to any one of claims 1 to 3.
상기 인터루킨 1 베타 관련 질환은 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 알츠하이머병(Alzheimer disease), 및 알레르기(allergy)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
According to clause 12,
A diagnostic composition, wherein the interleukin 1 beta-related disease is at least one selected from the group consisting of Crohn's disease, ulcerative colitis, Alzheimer's disease, and allergy.
상기 조성물은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.According to clause 12,
The composition includes at least one selected from the group consisting of a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. A diagnostic composition, characterized in that it further comprises.
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