KR20230150262A - Disposable electrochemical biosensor based on NAD(P)-dependent dehydrogenase and diaphorase - Google Patents
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Abstract
적어도 작업 전극 부분 및 기준 전극 부분을 갖는 감지 표면, 작업 전극 부분 상에 배치되고, NAD(P)-의존성 탈수소효소, NAD(P)+, 디아포라제 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함하여, 작업 전극을 형성하는 제1 시약, 및 기준 전극 부분 상에 배치되어, 기준 전극을 형성하는 기준 전극 재료를 포함하는 일회용 바이오센서.A sensing surface having at least a working electrode portion and a reference electrode portion, disposed on the working electrode portion, comprising NAD(P)-dependent dehydrogenase, NAD(P)+, diaphorase and an oxidized form of a redox mediator. , a first reagent forming a working electrode, and a reference electrode material disposed on the reference electrode portion, forming the reference electrode.
Description
본 발명은 일반적으로 전기화학적 바이오센서들(electrochemical biosensors)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다양한 분석물들의 결정을 위한 촉매로서 탈수소효소(dehydrogenase)를 사용하는 전기화학적 바이오센서들에 관한 것이다. The present invention relates generally to electrochemical biosensors. In particular, the present invention relates to electrochemical biosensors that use dehydrogenase as a catalyst for the determination of various analytes.
글루코스(glucose), 글루타메이트(glutamate), 락테이트(lactate), 콜레스테롤(cholesterol), d-하이드록시부티레이트(hydroxybutyrate), 글리세롤(glycerol), 말레이트(malate), 류신(leucine), 알코올(alcohol) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 분석물들을 측정하는 많은 전기화학적 센서들이 있다. 전기화학적 센서들 중 일부는 액체 측정을 위해 설계되고 일부는 기체 측정을 위해 설계된다.Glucose, glutamate, lactate, cholesterol, d-hydroxybutyrate, glycerol, malate, leucine, alcohol There are many electrochemical sensors that measure a variety of analytes including, but not limited to, etc. Some of the electrochemical sensors are designed for measuring liquids and some are designed for measuring gases.
액체 측정을 위해 설계된 것들은 일반적으로 작업 전극, 기준 전극 및 선택적인 상대 전극을 포함하고, 분석을 수행하기 위한 촉매로서 각각의 옥시다아제(oxidase)의 사용을 더 포함한다. 예를 들어, 글루코스 옥시다아제는 글루코스를 측정할 때 사용되고, 글루타메이트 옥시다아제는 글루타메이트를 측정할 때 사용된다. 또한, 환원된 상태의 산화환원 매개체(redox mediator)는 측정되는 분석물의 양에 비례하는 전류를 생성하기 위해 산화환원 매개체를 산화된 상태로 변환시키는 화학 반응에 관여한다. Those designed for liquid measurements typically include a working electrode, a reference electrode and an optional counter electrode, and further include the use of the respective oxidase as a catalyst to perform the analysis. For example, glucose oxidase is used to measure glucose, and glutamate oxidase is used to measure glutamate. Additionally, the redox mediator in the reduced state is involved in a chemical reaction that converts the redox mediator to the oxidized state to generate a current proportional to the amount of analyte being measured.
기체 측정을 위해 설계된 것들은 작업(또는 감지) 전극, 상대 전극, 및 일반적으로 기준 전극을 포함한다. 이러한 전극들은 액체 전해질과 접촉하는 센서 하우징에 들어 있다. 작업 전극은 기체에 대해 투과성이지만 전해질에 대해서는 불투과성인 테프론®(Teflon®) 멤브레인의 내부 면에 있다. 전기화학적 센서로 검출될 수 있는 임의의 기체의 경우, 기체가 전기적 활성이어야 한다. 기체는 센서로 확산되고 멤브레인을 통해 작업 전극으로 확산된다. 기체가 작업 전극에 도달하면, 전기화학적 반응이 발생한다; 기체의 유형에 따라 산화 또는 환원. 예를 들어, 일산화탄소가 이산화탄소로 산화되거나, 산소가 물로 환원될 수 있다. 산화 반응은 작업 전극에서 회부 회로를 통해 상대 전극으로 전자들의 흐름을 야기한다. Those designed for gas measurements include a working (or sensing) electrode, a counter electrode, and usually a reference electrode. These electrodes are housed in a sensor housing that is in contact with a liquid electrolyte. The working electrode is on the inner side of a Teflon® membrane that is permeable to gases but impermeable to electrolytes. For any gas that can be detected with an electrochemical sensor, the gas must be electrically active. The gas diffuses into the sensor and through the membrane to the working electrode. When the gas reaches the working electrode, an electrochemical reaction occurs; Oxidation or reduction depending on the type of gas. For example, carbon monoxide can be oxidized to carbon dioxide, or oxygen can be reduced to water. The oxidation reaction causes the flow of electrons from the working electrode to the counter electrode through the secondary circuit.
반대로, 환원 반응은 상대 전극에서 작업 전극으로 전자들의 흐름을 야기한다. 이 전자들의 흐름은 기체 농도에 비례하는 전류를 구성한다. 관련 기기의 전자 장치는 전류를 검출 및 증폭하고 교정(calibration)에 따라 출력을 조정한다. 그런 다음, 기기는, 예를 들어, 독성 기체 센서들의 경우 백만분율(parts per million)(ppm)로 그리고 산소 센서들의 경우 퍼센트 부피(percent volume)로, 기체 농도를 표시한다. 대부분의 알코올들도 전기적 활성이다. 즉, 그것들은, 전하 이동 단계에서, 산화 상태의 변화, 또는 화학적 결합들의 파괴나 형성을 겪는다. 알코올 연료 전지들의 개발에 상당한 노력을 기울여 졌으며, 경찰 기관들에서 사용되는 여러 알코올 호흡 측정기들(즉, 음주 측정기들)은 전기화학적 센서들을 기반으로 한다. Conversely, a reduction reaction causes a flow of electrons from the counter electrode to the working electrode. This flow of electrons constitutes an electric current that is proportional to the gas concentration. The electronics of the relevant device detect and amplify the current and adjust the output according to calibration. The instrument then displays the gas concentration, for example, in parts per million (ppm) for toxic gas sensors and in percent volume for oxygen sensors. Most alcohols are also electrically active. That is, they undergo a change in oxidation state, or the breaking or formation of chemical bonds, during the charge transfer step. Considerable effort has been put into the development of alcohol fuel cells, and several alcohol breathalyzers (i.e. breathalyzers) used in police agencies are based on electrochemical sensors.
대부분의 음주 측정기들은 사람의 혈액에서 혈중 알코올 함량(blood alcohol content; BAC)을 측정하기 위해 연료 전지 센서 기술 또는 반도체 산화물 센서 기술을 사용한다. 연료 전지 센서들은 호흡 샘플 내의 알코올을 산화시키는 전기화학적 프로세스에 의존한다. 산화는 음주 측정기가 BAC를 결정하기 위해 측정하는 전류를 생성한다. 전류의 강도는 샘플 내에 존재하는 알코올의 양에 해당한다. 반도체 산화 센서들은 산화주석 물질을 사용하여 BAC를 측정한다. 이산화주석 센서가 히터 코일로 강철 메쉬 필름을 가열하고, 내뿜은 알코올이 가열된 필름에 닿으면 저항이 변한다. 센서 저항의 변화는 고정 또는 가변 저항기에 걸친 출력 전압의 변화로 측정된다. 센서 저항과 알코올 농도의 사이에는 직접적인 관계가 있다. 반도체 센서 기술을 사용한 음주 측정기들은 연료 전지 센서들을 사용한 것들보다 정확도가 낮고 가격도 저렴하다. Most breathalyzers use fuel cell sensor technology or semiconductor oxide sensor technology to measure blood alcohol content (BAC) in a person's blood. Fuel cell sensors rely on an electrochemical process that oxidizes alcohol in breath samples. Oxidation creates an electrical current that a breathalyzer measures to determine BAC. The intensity of the current corresponds to the amount of alcohol present in the sample. Semiconductor oxidation sensors use tin oxide materials to measure BAC. The tin dioxide sensor heats the steel mesh film with a heater coil, and when the emitted alcohol touches the heated film, its resistance changes. Changes in sensor resistance are measured as changes in output voltage across a fixed or variable resistor. There is a direct relationship between sensor resistance and alcohol concentration. Breathalyzers using semiconductor sensor technology are less accurate and less expensive than those using fuel cell sensors.
과거에는 전체 혈액의 알코올 농도를 측정하기 위한 작업이 거의 이루어지지 않았다. 전술된 바와 같이, 가장 일반적인 알코올 측정 기술은 음주 측정기 산업이었다. 기존 기술에서 혈중 알코올 농도를 측정하기 위해 알코올 탈수소효소를 사용하는 것이 언급되었지만, 알코올 센서들은 그러한 센서들의 다양한 단점들로 인해 일회용 센서들에 사용하기에 실용적이지 않다. 이러한 단점들은 센서 저장 수명 안정성, 반응 감도, 농도의 범위, 및 이용 가능한 환원된 형태의 산화환원 매개체들의 수를 포함한다. 센서 저장 수명 안정성은 더 복잡한 보관 요건들을 사용하지 않고 상용 제품에 대해 충분히 길지 않다. 반응 감도는 낮아서 정확도가 떨어진다. 농도 범위의 하한도 손상된다. In the past, little work was done to measure whole blood alcohol content. As mentioned above, the most common alcohol measurement technology was the breathalyzer industry. Although the use of alcohol dehydrogenase to measure blood alcohol concentration has been mentioned in existing techniques, alcohol sensors are not practical for use in disposable sensors due to various disadvantages of such sensors. These drawbacks include sensor shelf life stability, response sensitivity, concentration range, and number of available reduced forms of redox mediators. Sensor shelf life stability is not long enough for commercial products without more complex storage requirements. Reaction sensitivity is low, so accuracy is low. The lower limit of the concentration range is also compromised.
본 발명은 NAD(P)-의존성 탈수소효소 및 디아포라제(diaphorase) 기반의 일회용 전기화학적 바이오센서이다. 디아포라제는 디(di)- 및 트리(tri)- 포스포피리딘 뉴클레오티드(phosphopyridine nucleotides)와 같은 환원된 형태들의 NAD 및 NADP를 산화시킬 수 있는 플라빈단백질 효소(flavoprotein enzyme)이다. 디아포라제 효소가 포함되어 있기 때문에, 산화된 형태의 산화환원 매개체가 사용될 수 있다. 산화환원 매개체를 산화된 형태로 사용함으로써 다양한 이점들이 제공된다. 산화환원 매개체를 산화된 형태로 사용하는 것은 주변 환경에서 대응하는 환원된 형태보다 더 안정적이므로, 일회용 바이오센서들의 저장 수명 안정성에 도움이 된다. 다른 이점은 일회용 바이오센서가 더 민감한 반응을 생성할 것이라는 점이다. 추가 이점은 일회용 바이오센서가 측정되는 분석물의 매우 낮은 농도를 측정할 수 있다는 점이다. 또 다른 이점은 환원된 형태의 산화환원 매개체들에 대한 것들보다 산화된 형태의 산화환원 매개체들의 더 많은 선택들이 있다는 점이다. 추가 이점은 주변 환경에서의 산화된 형태의 산화환원 매개체가 동일한 환경에서의 환원된 형태의 산화환원 매개체보다 더 안정적이라는 점이다. 이 이점은 유사한 저장 수명 안정성을 나타내기 위해 환원된 형태의 산화환원 매개체를 사용하는 일회용 바이오센서들과 같은 특별한 보관 요건들을 필요로 하지 않는 일회용 바이오센서들로 해석된다. The present invention is a disposable electrochemical biosensor based on NAD(P)-dependent dehydrogenase and diaphorase. Diaphorase is a flavoprotein enzyme that can oxidize reduced forms of NAD and NADP, such as di- and tri-phosphopyridine nucleotides. Because the diaphorase enzyme is included, the oxidized form of the redox mediator can be used. Various advantages are provided by using the redox mediator in its oxidized form. Using a redox mediator in its oxidized form is more stable than the corresponding reduced form in the ambient environment, thus aiding the shelf life stability of disposable biosensors. Another advantage is that disposable biosensors will produce more sensitive responses. An additional advantage is that disposable biosensors can measure very low concentrations of the analyte being measured. Another advantage is that there are more choices for oxidized forms of redox mediators than for reduced forms of redox mediators. An additional advantage is that the oxidized form of the redox mediator in the surrounding environment is more stable than the reduced form of the redox mediator in the same environment. This advantage translates to disposable biosensors that do not require special storage requirements like disposable biosensors that use the reduced form of the redox mediator to exhibit similar shelf life stability.
본 발명의 목적은 특별한 보관 조건들 없이 우수한 저장 수명 안정성을 갖는 전체 혈액에의 사용을 위한 일회용 바이오센서를 제공하는 것이다. The object of the present invention is to provide a disposable biosensor for use in whole blood with excellent shelf-life stability without special storage conditions.
본 발명의 다른 목적은 기존의 일회용 바이오센서들보다 더 민감한 반응을 갖는 전체 혈액에의 사용을 위한 일회용 바이오센서를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a disposable biosensor for use in whole blood that has a more sensitive response than existing disposable biosensors.
본 발명의 추가 목적은 관심 있는 종(species)/분석물들의 매우 낮은 농도를 측정할 수 있는 전체 혈액에의 사용을 위한 일회용 바이오센서를 제공하는 것이다. A further object of the present invention is to provide a disposable biosensor for use in whole blood that is capable of measuring very low concentrations of species/analytes of interest.
본 발명은 더 긴 저장 수명 안정성, 더 민감한 반응, 및 관심 있는 종/분석물의 매우 낮은 농도를 측정하는 능력을 갖는 일회용 바이오센서를 제공함으로써 이들 및 기타 목적들을 달성한다. The present invention achieves these and other objectives by providing a disposable biosensor with longer shelf life stability, more sensitive response, and the ability to measure very low concentrations of the species/analyte of interest.
본 발명의 일 실시예에서, 일회용 바이오센서는 적어도 작업 전극(working electrode) 및 기준 전극(reference electrode)을 갖는 감지 표면, 작업 전극 부분 상에 배치되고, NAD(P)-의존성 탈수소효소, NAD(P)+, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함하여, 작업 전극을 형성하는 제1 시약, 및 기준 전극 부분 상에 배치되어, 기준 전극을 형성하는 기준 전극 재료를 포함한다. In one embodiment of the invention, the disposable biosensor is disposed on a sensing surface having at least a working electrode and a reference electrode, the working electrode portion, and comprising NAD(P)-dependent dehydrogenase, NAD ( A first reagent comprising P)+, diaphorase, and an oxidized form of a redox mediator, forming a working electrode, and a reference electrode material disposed on the reference electrode portion, forming the reference electrode.
본 발명의 다른 실시예에서, 일회용 바이오센서는 블랭크 전극(blank electrode), 및 블랭크 전극 부분 상에 배치되고, NAD(P)+, 디아포라제, 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함하고 탈수소효소를 포함하지 않고, 블랭크 전극을 형성하는 제2 시약을 더 포함한다. In another embodiment of the invention, a disposable biosensor is disposed on a blank electrode and a portion of the blank electrode, and includes NAD(P)+, diaphorase, an oxidized form of a redox mediator, and a dehydrogenase. and further includes a second reagent for forming a blank electrode.
본 발명의 일 실시예에서, 기준 전극을 형성하기 위한 기준 재료는 Ag-AgCl, 또는 In one embodiment of the present invention, the reference material for forming the reference electrode is Ag-AgCl, or
환원된 형태의 산화환원 매개체, 산화된 형태의 산화환원 매개체, 및 환원된 형태와 산화된 형태의 산화환원 매개체의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 화학적 산화 시약을 포함하는 기준 매트릭스 중 하나이다. One of the reference matrices comprising at least a chemical oxidation reagent selected from the group consisting of a redox mediator in reduced form, a redox mediator in oxidized form, and a mixture of redox mediators in reduced and oxidized forms.
일 실시예에서, NAD(P)-의존성 탈수소효소는 알코올 탈수소효소, 글루타메이트 탈수소효소, 글루코스 탈수소효소, 락테이트 탈수소효소, 콜레스테롤 탈수소효소, D-3-하이드록시부티레이트 탈수소효소, 글리세롤 탈수소효소, 말레이트 탈수소효소, 및 류신 탈수소효소 중 하나이다. In one embodiment, the NAD(P)-dependent dehydrogenase is alcohol dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase, D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, malhydrogenase. It is one of late dehydrogenase, and leucine dehydrogenase.
일 실시예에서, 산화된 형태의 산화환원 매개체는 금속 화합물 또는 유기 산화환원 화합물을 포함한다. In one embodiment, the redox mediator in oxidized form includes a metal compound or an organic redox compound.
일 실시예에서, 산화된 형태의 산화환원 매개체는 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide), 페리시안화 나트륨(sodium ferricyanide), 페로센(ferrocene) 및 그 유도체들(derivatives), 염화 헥사아민루테늄(III)(hexaamineruthenium(III) chloride) 및 그 유도체들과 같은 루테늄 화합물, 오스뮴 착물(osmium complexes), 1,10-페난트롤린-5,6-디온(1,10- phenanthroline-5,6-dione), 멜돌라 블루(meldola's blue), 테트라티아풀발렌 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄(Tetrathiafulvalene 7,7,8,8- tetracyanoquinodimethane), 하이드로퀴논(hydroquinone), 디클로로페놀이온도페놀(dichlorophenoliondophenol), p-벤조퀴논(p-benzoquinone), o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine), 및 3,4-디히드록시벤즈알데히드(3,4-dihydroxybenzaldehyde) 중 적어도 하나를 포함한다. In one embodiment, the redox mediator in oxidized form is potassium ferricyanide, sodium ferricyanide, ferrocene and its derivatives, and hexaamineruthenium(III) chloride. (III) ruthenium compounds such as chloride and its derivatives, osmium complexes, 1,10-phenanthroline-5,6-dione, meldola Blue (meldola's blue), Tetrathiafulvalene 7,7,8,8- tetracyanoquinodimethane, hydroquinone, dichlorophenoliondophenol ), p-benzoquinone, o-phenylenediamine, and 3,4-dihydroxybenzaldehyde.
일 실시예에서, 제1 시약은 중합체(polymer), 계면활성제(surfactant), 및 완충제(buffer)를 더 포함한다. 추가 실시예에서, 제1 시약은 선택적인 증량 시약(bulking reagent)을 더 포함한다. In one embodiment, the first reagent further includes a polymer, a surfactant, and a buffer. In a further embodiment, the first reagent further comprises an optional bulking reagent.
일 실시예에서, 제2 시약은 중합체, 계면활성제, 및 완충제를 더 포함한다. 추가 실시예에서, 제2 시약은 선택적인 증량 시약을 더 포함한다. In one embodiment, the second reagent further includes a polymer, a surfactant, and a buffering agent. In a further embodiment, the second reagent further comprises an optional extender.
본 발명의 다른 실시예에서, 일회용 바이오센서는 적어도 두 개의 전기 회로들이 상부에 형성되는(delineated) 전기-절연성 재료로 이루어지는 베이스 층, 베이스 층 상에 배치되는 전기-절연성 재료로 이루어지는 채널 형성 층, 및 채널 형성 층의 위에 배치되는 전기-절연성 재료로 이루어지는 커버 층을 더 포함한다. 적어도 두 개의 전기 회로들의 각각은 베이스 층을 따라 길이 방향으로(longitudinally) 연장되고, 적어도 두 개의 회로들의 각각은 베이스 층 근위(proximal) 단부 부분 및 베이스 층 원위(distal) 단부 부분의 각각에 형성되는 전기-전도성 접촉 패드를 갖고, 전기-전도성 트레이스가 베이스 층 근위 단부 부분에 있는 전기-전도성 접촉 패드를 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 대응하는 전기-전도성 패드와 전기적으로 결합한다. 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 하나의 전기-전도성 패드는 작업 전극을 형성하고, 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 다른 전기-전도성 패드는 기준 전극을 형성한다. 채널 형성 층은 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 각 전기-전도성 패드를 노출시키기에 충분한 미리 정해진 거리만큼 채널 층 원위 단부로부터 연장되는 슬롯(slot)을 갖는다. 채널 형성 층은 베이스 근위 단부 부분에 있는 각 전기-전도성 패드가 노출되도록 베이스 층의 길이보다 더 짧은 길이를 갖는다. 채널 형성 층의 위에 배치되는 커버 층은 채널 형성 층의 슬롯에 의해 형성되는 샘플 챔버를 생성한다. 커버 층은 커버 층 원위 단부로부터 이격되는 벤트 오프닝(vent opening)을 갖고, 벤트 오프닝은 샘플 챔버와 적어도 부분적으로 연통된다. In another embodiment of the invention, a disposable biosensor comprises a base layer made of an electrically insulating material on which at least two electrical circuits are delineated, a channel forming layer made of an electrically insulating material disposed on the base layer, and a cover layer made of an electrically insulating material disposed on top of the channel forming layer. Each of the at least two electrical circuits extends longitudinally along the base layer, and each of the at least two circuits is formed in each of a base layer proximal end portion and a base layer distal end portion. It has an electrically-conductive contact pad, wherein the electrically-conductive trace electrically couples the electrically-conductive contact pad in the base layer proximal end portion with a corresponding electrically-conductive pad in the base layer distal end portion. One electrically-conductive pad in the distal end portion of the base layer forms the working electrode and the other electrically-conductive pad in the distal end portion of the base layer forms the reference electrode. The channel forming layer has slots extending from the channel layer distal end a predetermined distance sufficient to expose each electrically-conductive pad at the base layer distal end portion. The channel forming layer has a length shorter than that of the base layer such that each electrically-conductive pad at the proximal end portion of the base is exposed. A cover layer disposed on top of the channel forming layer creates a sample chamber defined by the slots in the channel forming layer. The cover layer has a vent opening spaced apart from the distal end of the cover layer, the vent opening at least partially communicating with the sample chamber.
일 실시예에서, 일회용 바이오센서는 베이스 층과 채널 형성 층 사이의 시약 보유 층을 더 포함한다. 시약 보유 층은 시약 보유 층 원위 단부에 있는 적어도 두 개의 관통 오프닝들(through openings)을 갖고, 적어도 두 개의 관통 오프닝들 중 하나는 작업 전극과 일치하고, 적어도 두 개의 관통 오프닝들 중 다른 하나는 기준 전극과 일치한다. In one embodiment, the disposable biosensor further includes a reagent retention layer between the base layer and the channel forming layer. The reagent retention layer has at least two through openings at the distal end of the reagent retention layer, one of the at least two through openings coincident with the working electrode, and the other of the at least two through openings is a reference. Matches the electrode.
일 실시예에서, 베이스 층은 베이스 층을 따라 길이 방향으로 연장되는 제3 전기 회로를 갖는다. 제3 전기 회로는 베이스 층 근위 단부 부분 및 베이스 층 원위 단부 부분의 각각에 형성되는 전기-전도성 접촉 패드를 갖고, 전기-전도성 트레이스가 베이스 층 근위 단부 부분에 있는 전기-전도성 접촉 패드를 블랭크 전극을 형성하는 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 대응하는 전기-전도성 패드와 전기적으로 결합한다. 블랭크 전극은 채널 형성 층의 슬롯 내에 있다. In one embodiment, the base layer has a third electrical circuit extending longitudinally along the base layer. The third electrical circuit has an electrically-conductive contact pad formed on each of the base layer proximal end portion and the base layer distal end portion, wherein an electrically-conductive trace connects the electrically-conductive contact pad on the base layer proximal end portion to a blank electrode. It electrically couples with a corresponding electrically-conductive pad on the distal end portion of the forming base layer. The blank electrode is within the slot of the channel forming layer.
일 실시예에서, 시약 보유 층은 제3 관통 오프닝을 갖고, 제3 관통 오프닝은 블랭크 전극과 일치한다. In one embodiment, the reagent retention layer has a third through opening, and the third through opening coincides with the blank electrode.
일 실시예에서, NADP-의존성 탈수소효소 및 디아포라제 기반의 일회용 바이오센서를 제조하는 방법이 개시된다. 방법은 적어도 작업 전극 부분 및 기준 전극 부분을 갖는 감지 표면을 제공하는 단계, 작업 전극 부분 상에 제1 시약을 배치하고, 제1 시약을 건조시켜, 작업 전극을 생성하는 제1 전극 매트릭스를 형성하는 단계, 및 기준 전극을 형성하는 기준 전극 부분 상에 기준 전극 재료를 배치하고, 기준 전극 시약을 건조시켜, 기준 전극 매트릭스를 형성하는 단계를 포함한다. 제1 시약은 NAD(P)-의존성 탈수소효소, NAD(P)+, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함한다. 기준 전극 재료는 Ag-AgCl, 또는 환원된 형태의 산화환원 매개체, 산화된 형태의 산화환원 매개체, 및 환원된 형태와 산화된 형태의 산화환원 매개체의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 화학적 산화 시약을 포함하는 기준 전극 시약 중 하나이다.In one embodiment, a method of manufacturing a disposable biosensor based on NADP-dependent dehydrogenase and diaphorase is disclosed. The method includes providing a sensing surface having at least a working electrode portion and a reference electrode portion, disposing a first reagent on the working electrode portion, and drying the first reagent to form a first electrode matrix that creates a working electrode. and placing a reference electrode material on the reference electrode portion forming the reference electrode and drying the reference electrode reagent to form a reference electrode matrix. The first reagent includes NAD(P)-dependent dehydrogenase, NAD(P)+, diaphorase, and oxidized forms of redox mediators. The reference electrode material contains at least a chemical oxidation reagent selected from the group consisting of Ag-AgCl, or redox mediators in reduced form, redox mediators in oxidized form, and mixtures of redox mediators in reduced and oxidized forms. It is one of the reference electrode reagents included.
다른 실시예에서, 제1 시약을 형성하는 단계는 미리 정해진 양의 물에 미리 정해진 양의 NAD(P)-의존성 탈수소효소, 미리 정해진 양의 NAD(P)+, 미리 정해진 양의 디아포라제, 및 미리 정해진 양의 산화된 형태의 산화환원 매개체를 함께 첨가하는 단계를 포함한다. In another embodiment, forming the first reagent comprises a predetermined amount of NAD(P)-dependent dehydrogenase, a predetermined amount of NAD(P)+, a predetermined amount of diaphorase, and a predetermined amount of water. and adding together a predetermined amount of the redox mediator in oxidized form.
다른 실시예에서, 방법은 0. 1 그램 내지 0.5 그램의 NAD(P)-의존성 탈수소효소를 측정하는 단계, 0.02 그램 내지 0.1 그램의 NAD(P)+를 측정하는 단계, 0.02 그램 내지 0.5 그램의 디아포라제를 측정하는 단계, 0.1 그램 내지 0.5 그램의 산화된 형태의 산화환원 매개체를 측정하는 단계, 및 10 밀리리터의 물에 NAD(P)-의존성 탈수소효소, NAD(P)+, 디아포라제, 및 산화환원 매개체를 첨가하는 단계를 포함한다. In another embodiment, the method comprises measuring between 0.1 gram and 0.5 gram of NAD(P)-dependent dehydrogenase, measuring between 0.02 gram and 0.1 gram of NAD(P)+, and measuring between 0.02 gram and 0.5 gram of NAD(P)+. Measuring diaphorase, measuring 0.1 gram to 0.5 gram of the redox mediator in oxidized form, and NAD(P)-dependent dehydrogenase, NAD(P)+, diaphorase in 10 milliliters of water. , and adding a redox mediator.
일 실시예에서, 방법은 0.2 그램 내지 0.4 그램의 NAD(P)-의존성 탈수소효소를 측정하는 단계, 0.05 그램의 NAD(P)+를 측정하는 단계, 0.05 그램 내지 0.2 그램의 디아포라제를 측정하는 단계, 0.3 그램의 산화된 형태의 산화환원 매개체를 측정하는 단계, 및 10 밀리리터의 물에 NAD(P)-의존성 탈수소효소, NAD(P)+, 디아포라제, 및 산화환원 매개체를 첨가하는 단계를 포함한다.In one embodiment, the method comprises measuring 0.2 gram to 0.4 gram NAD(P)-dependent dehydrogenase, measuring 0.05 gram NAD(P)+, measuring 0.05 gram to 0.2 gram diaphorase. measuring 0.3 grams of the oxidized form of the redox mediator, and adding NAD(P)-dependent dehydrogenase, NAD(P)+, diaphorase, and redox mediator to 10 milliliters of water. Includes steps.
도 1은 본 발명의 일 실시예의 일회용 바이오센서의 확대된, 정면 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 일회용 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예의 일회용 바이오센서의 확대된, 정면 사시도이다.
도 4는 도 3에 도시된 일회용 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예의 일회용 바이오센서의 확대된, 정면 사시도이다.
도 6은 도 5에 도시된 일회용 바이오센서의 확대된, 평면도이다.
도 7은 수소화효소, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체 페리시안화 칼륨을 포함하는 알코올 바이오센서를 사용한 알코올 바이오센서 전류 대 알코올 농도에 대한 결과들을 보여주는 표 1의 데이터의 그래픽 표현이다.
도 8은 수소화효소, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체 염화 헥사아민-루테늄(III)을 포함하는 알코올 바이오센서를 사용한 알코올 바이오센서 전류 대 알코올 농도에 대한 결과들을 보여주는 표 2의 데이터의 그래픽 표현이다.
도 9는 수소화효소, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체 페리시안화 칼륨을 포함하는 알코올 바이오센서에 대한 정밀 테스트 결과들을 보여주는 표 3의 데이터의 그래픽 표현이다.
도 10은 수소화효소, 디아포라제, 및 산화된 산화환원 매개체 페리시안화 칼륨을 포함하는 알코올 바이오센서들 대 디아포라제는 포함하지 않고 수소화효소 및 환원된 형태의 산화환원 매개체 1,10-페난트롤린-5,6-디온을 포함하는 알코올 바이오센서들에 대한 결과들의 비교를 보여주는 표 4의 데이터의 그래픽 표현이다.
도 11은 수소화효소, 디아포라제, 및 산화된 산화환원 매개체 페리시안화 칼륨을 포함하는 알코올 바이오센서들 대 디아포라제는 포함하지 않고 수소화효소 및 환원된 형태의 산화환원 매개체 1,10-페난트롤린-5,6-디온을 포함하는 알코올 바이오센서들에 대한 장기 보관 안정성을 보여주는 표 5의 데이터의 그래픽 표현이다. 1 is an enlarged, front perspective view of a disposable biosensor of one embodiment of the present invention.
Figure 2 is an exploded perspective view of the disposable biosensor shown in Figure 1.
Figure 3 is an enlarged, front perspective view of a disposable biosensor of another embodiment of the present invention.
Figure 4 is an exploded perspective view of the disposable biosensor shown in Figure 3.
Figure 5 is an enlarged, front perspective view of a disposable biosensor of another embodiment of the present invention.
Figure 6 is an enlarged, top view of the disposable biosensor shown in Figure 5.
Figure 7 is a graphical representation of the data in Table 1 showing results for alcohol biosensor current versus alcohol concentration using an alcohol biosensor containing hydrogenase, diaphorase, and the oxidized form of the redox mediator potassium ferricyanide.
Figure 8 shows the data in Table 2 showing results for alcohol biosensor current versus alcohol concentration using an alcohol biosensor containing hydrogenase, diaphorase, and the oxidized form of the redox mediator hexamine-ruthenium(III) chloride. It is a graphical representation of .
Figure 9 is a graphical representation of the data in Table 3 showing precision test results for an alcohol biosensor containing hydrogenase, diaphorase, and the redox mediator potassium ferricyanide in oxidized form.
Figure 10 shows alcohol biosensors containing hydrogenase, diaphorase, and the oxidized redox mediator potassium ferricyanide versus no diaphorase and hydrogenase and the reduced form of the redox mediator 1,10-phenanthrol. Graphical representation of the data in Table 4 showing comparison of results for alcohol biosensors containing lin-5,6-dione.
Figure 11 shows alcohol biosensors containing hydrogenase, diaphorase, and the oxidized redox mediator potassium ferricyanide versus no diaphorase and hydrogenase and the reduced form of the redox mediator 1,10-phenanthrol. Graphical representation of the data in Table 5 showing the long-term storage stability for alcohol biosensors containing lin-5,6-dione.
본 발명의 바람직한 실시예들이 도 1 내지 도 11에 도시되어 있다. 도 1은 본 발명의 일 실시예를 도시하고 있다. 일회용 바이오센서(10)는 적층체(12), 전극 단부 부분(14), 전극 단부(14a), 전기 접촉 단부 부분(16), 전기 접촉 단부(16a), 및 벤트 오프닝(52)을 갖는 다층으로 된, 일체형 바이오센서이다. 전극 단부 부분(14)은 전극 단부(14a)에 있는 샘플 입구(18)와 벤트 오프닝(52) 사이의 샘플 챔버(17)를 포함한다. 전기 접촉 단부 부분(16)은 샘플 테스트 챔버(17) 내에 위치되는 각각의 전극들과 전기 접촉하는 적어도 세 개의 전기 커플링 패드들(16b, 16c 및 16d)를 갖는다. 이 실시예에서, 일회용 바이오센서(10)는 30 mm(1.2 인치)의 길이와 5.5 mm(0.22 인치)의 폭을 갖지만, 그러한 치수들은 비제한적이다. Preferred embodiments of the present invention are shown in Figures 1 to 11. Figure 1 shows one embodiment of the present invention. Disposable biosensor 10 includes a multilayer laminate 12, an electrode end portion 14, an electrode end 14a, an electrical contact end portion 16, an electrical contact end 16a, and a vent opening 52. It is an integrated biosensor. The electrode end portion 14 includes a sample chamber 17 between a sample inlet 18 and a vent opening 52 at the electrode end 14a. The electrical contact end portion 16 has at least three electrical coupling pads 16b, 16c and 16d in electrical contact with respective electrodes located within the sample test chamber 17. In this embodiment, disposable biosensor 10 has a length of 30 mm (1.2 inches) and a width of 5.5 mm (0.22 inches), but such dimensions are non-limiting.
이제 도 2를 참조하면, 적층체(120)는 베이스 층(20), 시약 보유 층(30), 채널 형성 층(40), 및 커버(50)를 포함한다. 적층체(12)의 모든 층들은 유전체 재료, 바람직하게는 플라스틱으로 이루어진다. 바람직한 유전체 재료의 예들은 폴리염화비닐(polyvinyl chloride), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리술폰(polysulfone), 나일론(nylon), 폴리우레탄(polyurethane), 셀룰로오스 니트레이트(cellulose nitrate), 셀룰로오스 프로피오네이트(cellulose propionate), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트(cellulose acetate butyrate), 폴리에스테르(polyester), 폴리이미드(polyimide), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 및 폴리스티렌(polystyrene)이다.Referring now to FIG. 2 , laminate 120 includes a base layer 20 , a reagent retention layer 30 , a channel forming layer 40 , and a cover 50 . All layers of the laminate 12 are made of dielectric material, preferably plastic. Examples of preferred dielectric materials include polyvinyl chloride, polycarbonate, polysulfone, nylon, polyurethane, cellulose nitrate, cellulose propionate ( cellulose propionate, cellulose acetate, cellulose acetate butyrate, polyester, polyimide, polypropylene, polyethylene, and polystyrene.
베이스 층(20)은 세개의 전도성 경로들(22, 24 및 26)이 형성된 전도성 층(21)을 갖는다. 전도성 경로들(22, 24, 26)은 전도성 층(21)의 스크라이빙 또는 스코어링에 의해 형성될 수 있다. 대안으로, 베이스 층(20)은 전도성 경로들(22, 24, 26)이 실크 스크린된(silk screened) 유전체 재료일 수 있다. 금 폴리에스테르 필름 조각이 사용되고, 도 2에 도시된 바와 같은 형상으로 절단되어, 일회용 바이오센서(10)의 베이스 층(20)을 형성할 수 있다. The base layer 20 has a conductive layer 21 in which three conductive paths 22, 24 and 26 are formed. Conductive paths 22 , 24 , 26 may be formed by scribing or scoring the conductive layer 21 . Alternatively, base layer 20 may be a dielectric material in which conductive paths 22, 24, and 26 are silk screened. A piece of gold polyester film can be used and cut into a shape as shown in Figure 2 to form the base layer 20 of the disposable biosensor 10.
전도성 층(21)의 스크라이빙 또는 스코어링은 세 개의 독립적인 전도성 경로들(22, 24, 26)을 생성하기에 충분하게 전도성 층(21)을 기계적으로 스크라이브함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 스크라이빙 또는 스코어링 방법은 이산화탄소 레이저, YAG 레이저 또는 엑시머 레이저를 사용하여 수행된다. 스코어링 라인은 매우 얇지만 세 개의 개별 전기 경로들을 생성하기에 충분하다. 전도성 층(21)은, 예를 들어, 금, 주석 산화물/금, 팔라듐, 다른 귀금속들 또는 이들의 산화물들, 또는 탄소 필름 조성물들과 같은 임의의 전기 전도성 재료로 이루어질 수 있다. 바람직한 전기 전도성 재료는 금 또는 주석 산화물/금이다. 노이즈 신호를 일으킬 수 있는 가능한 정적 문제들을 피하기 위해 전도성 층이 제거된 베이스 층(20)의 외부 에지를 따라 추가적인 스코어링 라인(28)(확대되고 축척되지는 않음; 단지 예시를 위한 것임)이 만들어질 수 있다. 그러나, 스코어링 라인(28)은 일회용 바이오센서(10)의 기능에 필요하지 않음이 이해되어야 한다. 베이스 층(20)을 위한 바람직한 전기 전도성 재료는 금 또는 주석 산화물/금 코팅된 폴리에스테르 필름이다. Scribing or scoring of the conductive layer 21 may be performed by mechanically scribing the conductive layer 21 sufficient to create three independent conductive paths 22, 24, and 26. The preferred scribing or scoring method of the present invention is performed using a carbon dioxide laser, YAG laser or excimer laser. The scoring line is very thin but long enough to create three separate electrical paths. Conductive layer 21 may be made of any electrically conductive material, such as, for example, gold, tin oxide/gold, palladium, other noble metals or oxides thereof, or carbon film compositions. Preferred electrically conductive materials are gold or tin oxide/gold. An additional scoring line 28 (enlarged and not to scale; for illustration purposes only) will be made along the outer edge of the base layer 20 from which the conductive layer has been removed to avoid possible static problems that could cause a noisy signal. You can. However, it should be understood that scoring line 28 is not necessary for the functioning of disposable biosensor 10. A preferred electrically conductive material for base layer 20 is gold or tin oxide/gold coated polyester film.
시약 보유 층(30)은 제1 전도성 경로(22)의 일 부분을 노출시키는 제1 전극 오프닝(32), 제2 전도성 경로(24)의 일 부분을 노출시키는 제2 전극 오프닝(34), 및 제3 전도성 경로(26)를 노출시키는 제3 전극 오프닝(36)을 갖는다. 시약 보유 층(30)은 플라스틱 재료, 바람직하게는 펜실베니아주 글렌 록 소재의 어드히시브 리서치 사(Adhesive Research, Inc.) 또는 글로벌 인스트루먼트 코포레이션(Global Instrument Corporation; GIC)(대만)에서 입수 가능한 의료용 단면 접착 테이프로 만들어진다. 본 발명에 사용하기 위한 테이프의 허용 가능한 두께들은 약 0.001 인치(0.025 mm) 내지 약 0.005 인치(0.13 mm)의 범위에 있다. 바람직한 두께는 약 0.003 인치(0.075 mm)이다. 테이프를 사용할 필요가 없음이 이해되어야 한다. 시약 보유 층(30)은 플라스틱 시트로 만들어질 수 있으며, 언급된 폴리에스테르 테이프를 사용하는 것과 동일한 결과들을 달성하기 위해 감압 접착제, 광중합체로 코팅되거나, 베이스 층(20)에 초음파 결합되거나, 베이스 층(20) 상에 실크-스크린되거나, 또는 베이스 층(20) 상에 3D 프린트될 수 있다. The reagent retention layer 30 includes a first electrode opening 32 exposing a portion of the first conductive path 22, a second electrode opening 34 exposing a portion of the second conductive path 24, and It has a third electrode opening (36) exposing a third conductive path (26). The reagent retention layer 30 is made of a plastic material, preferably a medical section available from Adhesive Research, Inc., Glen Rock, Pa., or Global Instrument Corporation (GIC) (Taiwan). It is made of adhesive tape. Acceptable thicknesses of tape for use in the present invention range from about 0.001 inch (0.025 mm) to about 0.005 inch (0.13 mm). A preferred thickness is about 0.003 inches (0.075 mm). It should be understood that there is no need to use tape. The reagent retention layer 30 may be made of plastic sheet, coated with a pressure sensitive adhesive, a photopolymer, ultrasonically bonded to the base layer 20, or bonded to the base layer 20 to achieve the same results as using the polyester tape mentioned. It can be silk-screened on (20) or 3D printed on the base layer (20).
세 개의 전극 오프닝들(32, 34 및 36)은 각 전도성 경로(22, 24, 26)의 일 부분을 개별적으로 노출시켜, 작업 전극 부분(20W), 기준 전극 부분(20R) 및 블랭크 전극 부분(20B)을 정의하고, 차례로, 전극 웰들(W, R 및 B)을 개별적으로 정의하며, 화학적 시약들을 보유하여, 작업 전극(W), 기준 전극(R), 및 블랭크 전극(B)을 형성한다. 바람직하게는, 전극 웰(W)에는 효소에 대한 기질 또는 효소와 촉매적으로 반응하는 기질을 포함하는 반응을 촉매할 수 있는 NAD(P)-의존성 탈수소효소, 디아포라제, 및 효소-촉매 반응과 작업 전극 사이에 전달되는 전자들을 전달할 수 있는 산화된 형태의 매개체가 로드되어, 효소 또는 기질(측정하고자 하는, 개시되는 예들에서의 알코올을 나타냄)의 활성을 나타내는 전류, 및 적어도 중합체 결합제(binder)를 생성한다. 블랭크 전극 웰(B)에는 전극 웰(W)과 유사한 화학 물질이 로드되지만, 탈수소효소는 없다. 추가 중합체들, 안정제들(stabilizers), 및 증량제들(bulking agents)과 같은 하나 이상의 화학 성분들이 시약 매트릭스에 선택적으로 포함될 수 있다. 기준 시약 매트릭스는 전극 웰(R)에 로드된다. The three electrode openings 32, 34, and 36 individually expose a portion of each conductive path 22, 24, 26, forming a working electrode portion 20W, a reference electrode portion 20R, and a blank electrode portion ( 20B) and, in turn, separately define electrode wells (W, R and B) and hold chemical reagents to form the working electrode (W), reference electrode (R), and blank electrode (B). . Preferably, the electrode well (W) contains a NAD(P)-dependent dehydrogenase, a diaphorase, and an enzyme-catalyzed reaction capable of catalyzing a reaction comprising a substrate for the enzyme or a substrate that catalytically reacts with the enzyme. loaded with an oxidized form of the mediator capable of transferring electrons to be transferred between the electrode and the working electrode, producing a current indicative of the activity of the enzyme or substrate (representing an alcohol in the disclosed examples to be measured), and at least a polymer binder. ) is created. Blank electrode wells (B) are loaded with similar chemicals as electrode wells (W), but without dehydrogenase. One or more chemical components, such as additional polymers, stabilizers, and bulking agents, may optionally be included in the reagent matrix. A reference reagent matrix is loaded into electrode wells (R).
바람직하게는, 기준 매트릭스는 환원된 형태의 산화환원 매개체, 산화된 형태의 산화환원 매개체, 또는 환원된 형태와 산화된 형태의 산화환원 매개체의 혼합물과 같은 적어도 화학적 산화 시약을 포함한다. 예를 들어, 페리시안화 칼륨, 또는 페로시안화 칼륨(potassium ferrocyanide), 또는 페리시안화 칼륨과 페로시안화 칼륨의 혼합물이 로드되어, 바람직한 전도성 코팅 재료를 사용할 때 기준 전극 기능을 만들 수 있다. 페리시안화 칼륨과 페로시안화 칼륨의 혼합물은, 페리시안화 칼륨 농도가 약 10 %까지의 범위에 있는 한편, 페로시안화 칼륨 농도가 약 5 %까지의 범위에 있도록, 준비될 수 있다. 대안으로, 기준 전극(전극 웰(R))에는 Ag/AgCl 층(예: Ag/AgCl 잉크를 적용하거나, (a) Ag 층을 스퍼터-코팅한 후 Ag를 클로라이드화하거나 (b) Ag 층의 위에 AgCl 층을 스퍼터-코팅함) 또는 제대로 기능하게 위해 산화환원 매개체가 필요하지 않은 다른 기준 전극 재료들이 로드될 수 있다. 채널에서 작업, 기준 및 블랭크 전극들의 위치 배열은 센서에서 유용한 결과들을 얻는 데 중요하지 않음에 유의해야 한다. Preferably, the reference matrix comprises at least a chemical oxidation reagent, such as a redox mediator in reduced form, a redox mediator in oxidized form, or a mixture of redox mediators in reduced and oxidized forms. For example, potassium ferrocyanide, or potassium ferrocyanide, or a mixture of potassium ferrocyanide and potassium ferrocyanide can be loaded to create a reference electrode function when using the preferred conductive coating material. A mixture of potassium ferricyanide and potassium ferrocyanide can be prepared such that the potassium ferricyanide concentration is in the range of up to about 10%, while the potassium ferrocyanide concentration is in the range of up to about 5%. Alternatively, the reference electrode (electrode well (R)) may be coated with an Ag/AgCl layer (e.g., by applying Ag/AgCl ink, (a) sputter-coating the Ag layer and then chloridizing the Ag, or (b) forming a layer of Ag on the Ag layer. sputter-coating a layer of AgCl on top) or other reference electrode materials that do not require a redox mediator to function properly can be loaded. It should be noted that the positional arrangement of the working, reference and blank electrodes in the channel is not critical to obtaining useful results from the sensor.
각 테스트 측정에 필요한 샘플의 부피를 최소화하기 위해 일회용 바이오센서의 샘플 챔버를 가능한 한 짧게 만들기 위해 시약 보유 오프닝들의 크기는 가능한 한 작게 만드는 것이 바람직하다. 세 개의 시약 보유/전극 오프닝들(32, 34 및 36)은 서로 정렬되고, 서로로부터 약 0.02 인치(0.508 mm) 내지 약 0.05 인치(1.27 mm) 이격되어 있다. 원형의 시약 보유 오프닝들은 단지 예시를 위한 것이다. 시약 보유 오프닝들의 형상 및 전극들의 각각의 사이의 거리는 중요하지 않음이 이해되어야 한다. 사실 상, 시약 보유 오프닝들은 표면적들의 비율이 하나의 센서에서 다른 센서로 실질적으로 일정하게 유지되는 한 표면적에서 서로 다를 수 있다. It is desirable to make the size of the reagent holding openings as small as possible to make the sample chamber of the disposable biosensor as short as possible to minimize the sample volume required for each test measurement. The three reagent retention/electrode openings 32, 34 and 36 are aligned with each other and spaced about 0.02 inches (0.508 mm) to about 0.05 inches (1.27 mm) apart from each other. The circular reagent holding openings are for illustrative purposes only. It should be understood that the shape of the reagent holding openings and the distance between each of the electrodes are not critical. In fact, the reagent retaining openings may differ in surface area as long as the ratio of surface areas remains substantially constant from one sensor to the other.
채널에서 작업, 기판, 및 기준 전극들의 위치 배열은 일회용 바이오센서로부터 유용한 결과들을 얻는 데 중요하지 않다. 샘플 유체 채널 내의 가능한 전극 배열들은 W-B-R, W-R-B, R-W-B, B-W-R, B-R-W, 또는 R-B-W일 수 있으며, 배열은 전극들이 적층체(12)의 샘플 입구(18)에서 벤트 오프닝(52)까지 나타남에 따라 나열된다. 바람직한 위치는 W-R-B인 것으로 확인되었다; 즉, 유체 샘플이 적층체(12)의 샘플링 단부(14)에 들어감에 따라, 유체 샘플은 먼저 작업 전극, 그 다음 기준 전극, 그 다음 블랭크 전극을 덮을 것이다. The positional arrangement of the working, substrate, and reference electrodes in the channel is not critical to obtaining useful results from a disposable biosensor. Possible electrode arrangements within the sample fluid channel may be W-B-R, W-R-B, R-W-B, B-W-R, B-R-W, or R-B-W, with the arrangement listed as the electrodes appear from the sample inlet 18 of the stack 12 to the vent opening 52. do. The preferred location was found to be W-R-B; That is, as the fluid sample enters the sampling end 14 of the stack 12, it will first cover the working electrode, then the reference electrode, and then the blank electrode.
세 개의 전극들은 각각 별도의 대응하는 전기 커플링 패드들과 접촉한다. 별도의 대응하는 전기 커플링 패드들은 판독 디바이스에 대한 전기적 연결을 위해 노출된다. Each of the three electrodes contacts separate corresponding electrical coupling pads. Separate corresponding electrical coupling pads are exposed for electrical connection to the reading device.
채널 형성 층(40)은 전극 단부 부분(14)에 위치되는 채널 노치(42)를 갖는다. 채널 노치(42)의 길이는, 채널 형성 층(40)이 시약 보유 층(30)에 적층될 때, 전극 영역들(W, R 및 B)이 채널 노치(42)에 의해 정의되는 공간 내에 있도록 하는 길이이다. 채널 노치(42)의 길이, 폭, 및 두께는 캐필러리 챔버 부피(capillary chamber volume)를 정의한다. 채널 형성 층(40)은 시약 보유 층(30)에 적층된다. 시약 보유 층(30)과 마찬가지로, 채널 형성 층(40)은 플라스틱 시트로 만들어질 수 있고, 감압 접착제, 광중합체로 코팅되거나, 시약 보유 층(30)에 초음파 결합되거나, 시약 보유 층(30) 상에 실크-스크린되거나, 또는 시약 보유 층(30) 상에 3D 프린트될 수 있다. The channel forming layer 40 has a channel notch 42 located in the electrode end portion 14. The length of the channel notch 42 is such that when the channel forming layer 40 is laminated to the reagent retention layer 30, the electrode regions W, R and B are within the space defined by the channel notch 42. This is the way to do it. The length, width, and thickness of channel notch 42 define the capillary chamber volume. Channel forming layer 40 is laminated to reagent retention layer 30. Like reagent retention layer 30, channel forming layer 40 may be made of plastic sheet, coated with a pressure sensitive adhesive, photopolymer, ultrasonically bonded to reagent retention layer 30, or attached to reagent retention layer 30. It can be silk-screened on, or 3D printed on the reagent retention layer 30.
채널 형성 층(40)은 플라스틱 재료, 바람직하게는 펜실베니아주 글렌 록 소재의 어드히시브 리서치 사 또는 글로벌 인스트루먼트 코포레이션(대만)에서 입수 가능한 의료용 양면 감압 접착 테이프로 만들어진다. 테이프의 두께는 바람직하게는 약 0.001 인치(0.025 mm) 내지 0.010 인치(0.25 mm)의 범위에 있다. 채널 노치(42)는 레이저로 또는 다이-커팅(die-cutting)(바람직한 방법)에 의해 만들어질 수 있다. 채널 노치(42)의 길이는 약 0.22 인치(5.7 mm) 내지 약 0.250 인치(6.4 mm)이고, 폭은 약 0.05 인치(1.3 mm) 내지 약 0.07 인치(1.8 mm)이며, 두께는 약 0.0039 인치(0.1 mm) 내지 약 0.009 인치(0.225 mm)이다. 채널 노치(42)의 두께 및 크기는 중요하지 않음이 이해되어야 한다. The channel forming layer 40 is made of a plastic material, preferably a medical grade double-sided pressure sensitive adhesive tape available from Adhesive Research, Glen Rock, PA or Global Instruments Corporation (Taiwan). The thickness of the tape preferably ranges from about 0.001 inch (0.025 mm) to 0.010 inch (0.25 mm). Channel notches 42 can be made with a laser or by die-cutting (the preferred method). The channel notch 42 is about 0.22 inches (5.7 mm) to about 0.250 inches (6.4 mm) long, about 0.05 inches (1.3 mm) to about 0.07 inches (1.8 mm) wide, and about 0.0039 inches (0.0039 inches) thick. 0.1 mm) to about 0.009 inches (0.225 mm). It should be understood that the thickness and size of the channel notch 42 is not critical.
채널 형성 층(40)에 적층되는 커버(50)는 샘플 챔버(17) 내의 샘플이 전극 영역들(W, R 및 B)을 완전히 덮도록 하기 위해 일회용 바이오센서(10)의 전극 단부(14a)로부터 이격되는 벤트 오프닝(52)을 갖는다. 벤트 오프닝(52)은 커버(50)에 위치되어, 채널 노치(42)의 폐쇄 단부 또는 그 부근에서 채널 노치(42)의 일 부분을 노출시키고 부분적으로 오버레이한다. 벤트 오프닝(52)은 임의의 형상일 수 있지만, 약 0.08 인치(2 mm) x 약 0.035 인치(0.9 mm)의 치수들을 갖는 직사각형으로 도시되어 있다. 커버(50)를 위한 바람직한 재료는 폴리에스테르 필름이다. 샘플 챔버(17) 내에서 샘플 유체의 캐필러리 작용을 용이하게 하기 위해, 폴리에스테르 필름이 캐필러리 챔버를 형성하는 폴리에스테르 필름의 해당 부분에 매우 친수성인 표면을 갖는 것이 바람직하다. 3M 또는 GIC의 투명 필름들이 사용될 수 있다. 커버(50)는 혈액 샘플을 샘플 챔버(17)에 적용할 때의 샘플 입구(18)의 부주의한 폐색(전극들로의 샘플 유체의 적절한 전달을 막을 수 있음)을 방지하기 위해 입구 노치(54)를 선택적으로 포함할 수 있다. The cover 50 laminated on the channel forming layer 40 covers the electrode end 14a of the disposable biosensor 10 so that the sample in the sample chamber 17 completely covers the electrode regions W, R and B. It has a vent opening 52 spaced apart from. Vent opening 52 is located in cover 50 to expose and partially overlay a portion of channel notch 42 at or near the closed end of channel notch 42. Vent opening 52 may be of any shape, but is shown as a rectangle with dimensions of approximately 0.08 inches (2 mm) by approximately 0.035 inches (0.9 mm). A preferred material for cover 50 is polyester film. To facilitate capillary action of the sample fluid within the sample chamber 17, it is desirable for the polyester film to have a highly hydrophilic surface on that portion of the polyester film forming the capillary chamber. Clear films from 3M or GIC may be used. Cover 50 has an inlet notch 54 to prevent inadvertent occlusion of sample inlet 18 when applying a blood sample to sample chamber 17 (which may prevent proper delivery of sample fluid to the electrodes). ) can be optionally included.
도 3은 3-층 일회용 바이오센서(10')를 도시하고 있다. 4-층 실시예와 마찬가지로, 일회용 바이오센서(10')는 적층체(12), 전극 단부 부분(14), 전기 접촉 단부 부분(16), 및 벤트 오프닝(52)을 갖는다. 전극 단부 부분(14)은 샘플 입구(18)와 벤트 오프닝(52) 사이의 샘플 챔버(17)를 포함한다. 전기 접촉 단부 부분(16)은 세 개의 분리된 전기 커플링 패드들(16b, 16c 및 16d)을 갖는다. Figure 3 shows a three-layer disposable biosensor 10'. Like the four-layer embodiment, the disposable biosensor 10' has a laminate 12, an electrode end portion 14, an electrical contact end portion 16, and a vent opening 52. The electrode end portion 14 includes a sample chamber 17 between the sample inlet 18 and the vent opening 52. The electrical contact end portion 16 has three separate electrical coupling pads 16b, 16c and 16d.
도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 적층체(12)는 베이스 층(20), 채널 형성 층(40), 및 커버(50)를 포함한다. 전술된 바와 같이, 적층체(12)의 모든 층들은 유전체 재료, 바람직하게는 플라스틱으로 이루어진다. 4-층 실시예와 달리, 3-층 실시예에서는 별도의 시약 보유 층이 없다. 채널 형성 층(40)은 또한, 미리 결정된 양의 시약 혼합물들이 작업 전극, 기준 전극, 및 선택적인 블랭크 전극 상의 세 개의 별개의 시약 매트릭스 코팅들로서 전도성 경로들 상에 개별적으로 배치되는 영역을 형성한다. As can be seen from Figure 4, laminate 12 includes a base layer 20, a channel forming layer 40, and a cover 50. As mentioned above, all layers of laminate 12 are made of dielectric material, preferably plastic. Unlike the 4-layer embodiment, there is no separate reagent retention layer in the 3-layer embodiment. Channel forming layer 40 also forms an area where predetermined amounts of reagent mixtures are individually disposed on the conductive paths as three separate reagent matrix coatings on the working electrode, reference electrode, and optional blank electrode.
이제 도 5를 참조하면, 일회용 바이오센서(430)를 보여주는 본 발명의 다른 실시예가 도시되어 있다. 일회용 바이오센서(430)는 적층체(432), 샘플 수용 웰(434), 및 전기 접촉 단부(436)를 갖는다. 적층체(432)는 베이스 층(450) 및 커버(460)를 갖는다. 커버(460)는, 베이스 층(450)과 결합될 때, 샘플 수용 웰(434)을 형성하는 샘플 오프닝(462)을 갖는다. 베이스 층(450)은 적어도 세 개의 전기적 경로들(452, 454 및 456)을 가지며, 이는 계측 디바이스(meter device)(도시되지 않음)에 대한 연결을 위해 전기 접촉 단부(436)에서 노출되는 제1 부분, 및 샘플 수용 웰(434)에 의해 노출되는 제2 부분을 갖는다. Referring now to Figure 5, another embodiment of the invention is shown showing a disposable biosensor 430. Disposable biosensor 430 has a stack 432, a sample receiving well 434, and an electrical contact end 436. Laminate 432 has a base layer 450 and a cover 460. Cover 460 has a sample opening 462 that, when combined with base layer 450, forms a sample receiving well 434. Base layer 450 has at least three electrical paths 452, 454, and 456, with a first exposed at electrical contact end 436 for connection to a meter device (not shown). a portion, and a second portion exposed by a sample receiving well 434.
샘플 수용 웰(434)에 의해 노출되는 전기적 경로들(452, 454 및 456)의 제2 부분은 적어도 작업 전극(W), 블랭크 전극(B), 및 적어도 기준/상대 전극(R)을 생성한다. 제1 시약 혼합물(470)은 작업 전극(W) 상에 배치되는 작업 전극에 대해 전술된 혼합물을 포함한다. 제2 시약 혼합물(472)은 블랭크 전극(B) 상에 배치되는 블랭크 전극에 대해 전술된 혼합물을 포함한다. 기준/상대 전극(R)은 전술된 임의의 기준 재료(474)를 포함한다. 본 발명의 이 실시예에서, 샘플 수용 웰(434)은 혈액 샘플에서 분석물의 결정을 위해 혈액과 같은 유체 샘플을 수용하기 위한 샘플 입구 및 샘플 챔버 모두의 역할을 한다. The second portion of electrical paths 452, 454, and 456 exposed by sample receiving well 434 generates at least a working electrode (W), a blank electrode (B), and at least a reference/counter electrode (R). . The first reagent mixture 470 includes the mixture described above for the working electrode disposed on the working electrode W. The second reagent mixture 472 includes the mixture described above for the blank electrode disposed on the blank electrode B. Reference/counter electrode R includes any of the reference materials 474 described above. In this embodiment of the invention, the sample receiving well 434 serves as both a sample inlet and a sample chamber for receiving a fluid sample, such as blood, for the determination of analytes in the blood sample.
여기에 개시되는 실시예들 중 임의의 것의 도관 경로들은 임의의 비부식성 금속으로 만들어질 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 탄소 페이스트 또는 탄소 잉크와 같은 탄소 증착물들이 도관 경로들로서 사용될 수 있으며, 모두 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람들에게 잘 알려져 있다. It should be understood that the conduit paths of any of the embodiments disclosed herein may be made of any non-corrosive metal. For example, carbon deposits such as carbon paste or carbon ink can be used as conduit paths, all of which are well known to those skilled in the art.
화학적 시약들chemical reagents
효소enzyme
본 발명의 일회용 바이오센서는 시약 매트릭스에 사용되는 탈수소효소에 따라 측정하고자 하는 분석물을 소비하는, 작업 전극(W)의 시약 매트릭스 내의 적어도 화학 작용제들(chemical agents)을 포함한다. 비제한적인 예를 들어, 측정하고자 하는 분석물이 에탄올인 경우, 알코올 탈수소효소가 사용된다. 다른 비제한적인 예는 측정하고자 하는 분석물이 글루타메이트인 경우 글루타메이트 탈수소효소일 것이다. 블랭크 전극은 혈액 샘플이 방해물들(interferants)을 포함하는 경우 혈액 유체 내의 알코올 농도를 정확하게 결정하기 위해 본 발명에서 필수적일 것이다. 전술된 바와 같이, 그러한 블랭크 전극의 사용은 에탄올에 의해 유발된 산화 전류를 샘플 유체 내의 다른 산화 가능한 종에 의해 유발되는 산화 전류와 구별하는 데 도움이 된다. 계속해서 알코올 예를 들면, 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma Chemical Company) 또는 뉴저지주 레이크우드 소재의 워싱턴 바이오케미컬 코포레이션(Worthington Biochemical Corporation)으로부터 상업적으로 입수 가능한 알코올 탈수소효소가 알코올 작업 전극의 준비에 사용된다. 예를 들어, 시약 혼합물에서 알코올 탈수소효소의 농도는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml의 범위, 바람직하게는 10 mg/ml 내지 50 mg/ml의 범위, 더 바람직하게는 20 mg/ml 내지 40 mg/ml의 범위에 있다. The disposable biosensor of the invention comprises at least chemical agents in the reagent matrix of the working electrode (W), which consume the analyte to be measured depending on the dehydrogenase used in the reagent matrix. As a non-limiting example, if the analyte to be measured is ethanol, alcohol dehydrogenase is used. Another non-limiting example would be glutamate dehydrogenase if the analyte to be measured is glutamate. A blank electrode will be essential in the present invention to accurately determine the alcohol concentration in the blood fluid if the blood sample contains interferants. As described above, the use of such blank electrodes helps distinguish oxidation currents induced by ethanol from oxidation currents caused by other oxidizable species in the sample fluid. Continuing with alcohol, for example, alcohol dehydrogenase, commercially available from Sigma Chemical Company, St. Louis, MO or Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, can be used to treat alcohol working electrodes. Used in preparation. For example, the concentration of alcohol dehydrogenase in the reagent mixture ranges from 5 mg/ml to 100 mg/ml, preferably from 10 mg/ml to 50 mg/ml, more preferably from 20 mg/ml to 40 mg/ml. It is in the range of mg/ml.
디아포라제diaphorase
디아포라제는 작업 전극을 위한 시약 매트릭스의 필수적인 부분이다. 디아포라제는 플라빈단백질 유형의 효소이고, 환원된 형태의 보조-효소(co-enzyme) NAD를 산화시킬 수 있다. 시약 매트릭스에서 디아포라제의 농도는 2 mg/ml 내지 50 mg/ml의 범위, 바람직하게는 5 mg/ml 내지 20 mg/ml의 범위에 있다. Diaphorase is an essential part of the reagent matrix for working electrodes. Diaphorase is a flavin protein type enzyme and can oxidize the reduced form of the co-enzyme NAD. The concentration of diaphorase in the reagent matrix is in the range of 2 mg/ml to 50 mg/ml, preferably in the range of 5 mg/ml to 20 mg/ml.
화학적 산화 시약들chemical oxidation reagents
산화환원 매개체들과 같은 화학적 산화 시약들이 일회용 바이오센서에 포함된다. 산화환원 매개체를 산화된 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 환원된 형태의 매개체가 인가되는 전위에서 전극 표면에서 전기화학적으로 산화될 수 있는 것이 또한 바람직하다. 매개체가 시약 매트릭스에서 안정한 것이 더 바람직하다. 기준 전극에 사용될 때, 매개체가 기준 전극이 적절하게 기능하게 할 수 있는 것이 더욱 바람직하다. 산화환원 매개체는 다양한 금속 화합물 및 유기 산화환원 화합물로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 허용 가능한 산화환원 매개체들의 예들은 페리시안화 칼륨(또는 나트륨), 페로센 및 그 유도체들, 구리 화합물, 아질산염 화합물, 염화 헥사아민루테늄(III) 및 그 유도체들과 같은 루테늄 화합물, 오스뮴 착물, 1,10-페난트롤린-5,6-디온, 멜돌라 블루, 테트라티아풀발렌 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄, 테트라티아풀발렌, TCNQ, 하이드로퀴논, 디클로로페놀이온도페놀, p-벤조퀴논, o-페닐렌디아민, 3,4-디히드록시벤즈알데히드 등을 포함한다. 바람직한 매개체는 페리시안화 칼륨 또는 염화 헥사아민루테늄(III)이다. 시약 매트릭스에서 페리시안화 칼륨의 농도는 0.5 % 내지 10 %의 범위, 바람직하게는 1 % 내지 5 %의 범위에 있고, 더 바람직하게는 시약 매트리트의 3 %(w/w)의 양이다. 시약 매트릭스에서 염화 헥사아민루테늄(III)의 농도는 바람직하게는 0.5 % 내지 5 %의 범위, 더 바람직하게는 1 % 내지 2 %의 범위에 있다. Chemical oxidation reagents, such as redox mediators, are included in disposable biosensors. It is preferred to use the redox mediator in its oxidized form. It is also preferred that the reduced form of the mediator can be electrochemically oxidized at the electrode surface at the applied potential. It is more desirable for the vehicle to be stable in the reagent matrix. When used in a reference electrode, it is more desirable for the mediator to be able to allow the reference electrode to function properly. The redox mediator may be selected from, but is not limited to, various metal compounds and organic redox compounds. Examples of acceptable redox mediators are potassium (or sodium) ferricyanide, ferrocene and its derivatives, copper compounds, nitrite compounds, ruthenium compounds such as hexaamineruthenium(III) chloride and its derivatives, osmium complexes, 1,10 -Phenanthroline-5,6-dione, Meldola blue, tetrathiafulvalene 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane, tetrathiafulvalene, TCNQ, hydroquinone, dichlorophenol ion phenol, Includes p-benzoquinone, o-phenylenediamine, 3,4-dihydroxybenzaldehyde, etc. Preferred vehicles are potassium ferricyanide or ruthenium(III) hexaamine chloride. The concentration of potassium ferricyanide in the reagent matrix is in the range of 0.5% to 10%, preferably in the range of 1% to 5%, more preferably in an amount of 3% (w/w) of the reagent matrix. The concentration of hexaamineruthenium(III) chloride in the reagent matrix is preferably in the range of 0.5% to 5%, more preferably in the range of 1% to 2%.
효소 보조-인자(co-factor)Enzyme co-factor
일회용 바이오센서(10, 10', 430)의 시약 매트릭스에 포함되는 효소 보조-인자는 유기 보조인자인 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)(NAD)이고, 이는 탈수소효소 및 디아포라제의 사용으로 인해 사용된다. 시약 매트릭스에서 보조-인자의 농도는 0.1 % 내지 2 %의 범위, 바람직하게는 0.2 % 내지 1 %의 범위에 있고, 더 바람직하게는 0.5 %(w/w)이다. The enzyme co-factor included in the reagent matrix of the disposable biosensor (10, 10', 430) is nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD), an organic cofactor, which acts as a catalyst for dehydrogenase and diaphorase. It is used because of use. The concentration of co-factors in the reagent matrix is in the range of 0.1% to 2%, preferably in the range of 0.2% to 1%, more preferably 0.5% (w/w).
중합체들polymers
시약 매트릭스에서 결합제로 사용되는 중합체는 충분히 수용성이어야 하고, 또한 시약의 모든 다른 화학 물질들을 전극 영역의 전도성 표면 층에 안정화 및 결합시킬 수 있어야 한다. 적합한 중합체들은 저분자량 및 고분자량 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide; PEO), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 스타치(starch), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 하이드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 카르복시 메틸 셀룰로오스(carboxy methyl cellulose; CMC), 및 폴리아미노산(polyamino acids)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 시약 결합제는 바람직하게는 약 0.02 %(w/w) 내지 약 7.0 %(w/w)의 농도 범위에 있는, 단일 중합체 또는 중합체들의 조합일 수 있다. 본 발명의 시약 매트릭스에서 바람직한 결합제는 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)와 메틸셀룰로오스의 조합이다. PEO의 분자량은 수천에서 수백만의 범위에 이르며, 미국 뉴욕주 소재의 사이언티픽 폴리머 프로덕트(Scientific Polymer Products)에서 입수 가능하다. 시약 매트릭스에서 PEO의 농도는 바람직하게는 약 0.04 %(w/w) 내지 약 2 %(w/w)이다. 메토셀(Methocel) 60 HG(미국 위스콘신주 밀워키 플루카 케미컬(Fluka Chemicals) Cat. No. 64655)라는 상표명으로 입수 가능한 메틸셀룰로오스는 시약 매트릭스에서 바람직하게는 약 0.02 %(w/w) 내지 약 5 %(w/w)의 범위에 있는 농도를 갖는다. The polymer used as a binder in the reagent matrix must be sufficiently water soluble and also be capable of stabilizing and binding all other chemicals of the reagent to the conductive surface layer of the electrode area. Suitable polymers include low and high molecular weight polyethylene oxide (PEO), polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, starch, methylcellulose, and hydroxypropylcellulose. (hydroxypropylcellulose), polyvinyl alcohol (PVA), carboxy methyl cellulose (CMC), and polyamino acids. The reagent binder may be a single polymer or a combination of polymers, preferably in a concentration range of about 0.02% (w/w) to about 7.0% (w/w). The preferred binder in the reagent matrix of the present invention is a combination of polyethylene oxide (PEO) and methylcellulose. PEO's molecular weight ranges from thousands to millions and is available from Scientific Polymer Products, New York, USA. The concentration of PEO in the reagent matrix is preferably about 0.04% (w/w) to about 2% (w/w). Methylcellulose, available under the trade name Methocel 60 HG (Cat. No. 64655, Fluka Chemicals, Milwaukee, WI), is preferably present in the reagent matrix at about 0.02% (w/w) to about 5%. It has a concentration in the range of % (w/w).
계면활성제들surfactants
계면활성제는 전극 영역들로 시약 혼합물을 분배하는 것을 용이하게 하기 위해 시약 혼합물에 선택적으로 포함될 수 있다. 계면활성제는 또한 샘플 유체가 일회용 바이오센서의 샘플 채널에 들어갈 때 건조 화학 시약들을 빠르게 용해시키는 데 도움이 된다. 계면활성제의 양과 유형은 전술된 기능들을 보장하고 효소들에 대한 변성 효과를 방지하도록 선택된다. 계면활성제들은 다양한 음이온성, 양이온성, 비이온성, 및 양쪽이온성 세제들(detergents)로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 허용 가능한 계면활성제들의 예들은 폴리옥시에틸렌 에테르(polyoxyethylene ether), 트윈20(Tween 20), 소듐 콜레이트 수화물(sodium cholate hydrate), 헥사데실피리디튬 콜라이드 일수화물(hexadecylpyridinium cholide monohydrate) 및 CHAPs이다. 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 에테르이다. 더 바람직하게는, t-옥시페녹시폴리에톡시에탄올(t-octylphenoxypolyethoxyethanol)이고, 트리톤(Triton) X-100이라는 상표명으로 입수 가능하다. 시약 매트릭스에서 트리톤 X-100의 농도는 바람직하게는 약 0.01 %(w/w) 내지 약 2 %이다. A surfactant may optionally be included in the reagent mixture to facilitate distribution of the reagent mixture to electrode regions. Surfactants also help quickly dissolve dry chemical reagents when the sample fluid enters the sample channel of a disposable biosensor. The amount and type of surfactant are selected to ensure the above-described functions and to prevent denaturing effects on the enzymes. Surfactants may be selected from, but are not limited to, a variety of anionic, cationic, nonionic, and zwitterionic detergents. Examples of acceptable surfactants are polyoxyethylene ether, Tween 20, sodium cholate hydrate, hexadecylpyridinium cholide monohydrate and CHAPs. A preferred surfactant is polyoxyethylene ether. More preferably, it is t-octylphenoxypolyethoxyethanol, available under the trade name Triton X-100. The concentration of Triton
완충제buffer
선택적으로, 완충제는 본 발명의 센서 스트립에서 건조된 형태로 산화환원 매개체와 함께 존재할 수 있다. 완충제는 시약 혼합물들의 pH를 실질적으로 유지하기에 충분한 양으로 존재한다. 적합한 완충제들의 예들은 시트르산(citric acid), 인산염(phosphates), 트리스(Tris) 등을 포함한다. 본 발명에서, 완충제의 pH는 바람직하게는 약 5.0 내지 약 8.5의 범위에 있다. Optionally, the buffering agent may be present together with the redox mediator in dried form in the sensor strip of the invention. The buffering agent is present in an amount sufficient to substantially maintain the pH of the reagent mixtures. Examples of suitable buffering agents include citric acid, phosphates, Tris, etc. In the present invention, the pH of the buffer preferably ranges from about 5.0 to about 8.5.
증량 시약extender reagent
수용성이며 비활성 성분인 선택적인 증량제는 바람직하게는 시약 혼합물/매트릭스에 첨가된다. 증량제의 사용은, 샘플 유체가 캐필러리 채널을 채울 때 전극 형성 층의 전극 오프닝들이 기포들을 가두지 않도록 전극 형성 층이 시약 매트릭스를 포함하는 데 사용될 때 증량제의 사용이 유리하다. 예를 들어, 트레할로스(trehalose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 만니톨(mannitol), 만노스(mannose), 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 락티톨(lactitol), 소르비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 니코틴아미드(nicotinamide), 말토스(maltose) 등과 같은 다양한 당들(sugars)이 다른 성분들과 반응하지 않고 전극 표면에서 비활성화되는 한 시약 혼합물에 첨가될 수 있다. 증량제는 하나의 화학 물질 또는 화학 물질들의 조합일 수 있다. 시약 매트릭스에서 증량제의 양은 약 1 % 내지 약 15 %(w/w)의 범위에 있다.An optional extender, which is a water-soluble, inert component, is preferably added to the reagent mixture/matrix. The use of an extender is advantageous when the electrode forming layer is used to include a reagent matrix so that the electrode openings of the electrode forming layer do not trap air bubbles when the sample fluid fills the capillary channel. For example, trehalose, galactose, glucose, sucrose, lactose, mannitol, mannose, fructose, sucrose. ), various sugars such as lactose, lactitol, sorbitol, xylitol, nicotinamide, maltose, etc. do not react with other ingredients and do not react with the electrode. It can be added to the reagent mixture as long as it is inactive on the surface. The extender may be a single chemical or a combination of chemicals. The amount of extender in the reagent matrix ranges from about 1% to about 15% (w/w).
바이오센서의 제조Manufacturing of biosensors
상기 설명으로부터 유추될 수 있는 바와 같이, NAD(P)-의존성 탈수소효소 및 디아포라제 기반의 일회용 전기화학적 바이오센서는 다음과 같이 만들어진다. As can be inferred from the above description, a disposable electrochemical biosensor based on NAD(P)-dependent dehydrogenase and diaphorase is made as follows.
전도성 층(21)을 갖는 베이스 층(20)이 전술된 바와 같이 형성되고 스크라이브된다. 채널 형성 층(40)이 전술된 바와 같이 형성되고 베이스 층(20)에 적층된다. 미리 정해진 양의 제1 시약이 작업 전극 부분(20W) 상에 배치되고 건조되어, 작업 전극(W)을 형성한다. 미리 정해진 기준 재료가 기준 전극 부분(20R) 상에 배치되어, 기준 전극(R)을 형성한다. 기준이 기준 전극 시약을 사용하는 경우, 미리 정해진 양의 기준 시약이 기준 전극 부분(20R) 상에 배치되고 건조된다. 작업 전극(W)과 기준 전극(R)이 형성된 후에, 커버 층(50)이 채널 형성 층(40)에 적층되어, 작업 전극(W)과 기준 전극(R)이 채널 노치(42) 및 벤트 오프닝(52) 내에 위치되어 채널 노치(42)의 일 부분을 적어도 부분적으로 오버레이하도록 채널 노치(42)가 위치되게 한다. Base layer 20 with conductive layer 21 is formed and scribed as described above. A channel forming layer 40 is formed as described above and laminated to the base layer 20. A predetermined amount of first reagent is placed on the working electrode portion 20W and dried, forming the working electrode W. A predetermined reference material is disposed on the reference electrode portion 20R, forming the reference electrode R. When the reference uses a reference electrode reagent, a predetermined amount of reference reagent is placed on the reference electrode portion 20R and dried. After the working electrode (W) and the reference electrode (R) are formed, the cover layer 50 is laminated to the channel forming layer 40, so that the working electrode (W) and the reference electrode (R) are formed through the channel notch 42 and the vent. Positioned within opening 52 allows channel notch 42 to be positioned to at least partially overlay a portion of channel notch 42 .
시약 보유 층(30)이 포함되는 실시예에서, 시약 보유 층(30)은, 관통 오프닝들(32, 34, 및 선택적으로 36)이 작업 전극 부분(20W), 기준 전극 부분(20R), 및 선택적으로 블랭크 전극 부분(20B)을 노출시키도록, 베이스 층(20)의 전도성 층(21) 상에 직접 배치된다. 미리 정해진 양의 제1 시약이 관통 오프닝(32) 내에 배치되고 건조되어, 작업 전극(W)을 형성한다. 미리 정해진 기준 재료가 관통 오프닝(34) 내에 배치되어, 기준 전극(R)을 형성한다. 기준이 기준 전극 시약을 사용하는 경우, 미리 정해진 양의 기준 시약이 관통 오프닝(34) 내에 배치되고 건조된다. 그 후, 채널 형성 층(40)이 시약 보유 층(30)에 적층되어, 관통 오프닝(32, 34, 및 선택적으로 36)이 채널 노치(42) 내에 존재하게 한다. 그런 다음, 커버 층(50)이 전술된 바와 같이 채널 형성 층(40)에 적층된다. In embodiments where a reagent retention layer 30 is included, the reagent retention layer 30 has through openings 32, 34, and optionally 36 connected to the working electrode portion 20W, the reference electrode portion 20R, and It is placed directly on the conductive layer 21 of the base layer 20, optionally exposing the blank electrode portion 20B. A predetermined amount of first reagent is placed within the through opening 32 and dried to form the working electrode W. A predetermined reference material is placed within the through opening 34, forming a reference electrode R. If the reference uses a reference electrode reagent, a predetermined amount of reference reagent is placed within the through opening 34 and dried. A channel forming layer 40 is then laminated to the reagent retention layer 30 such that through openings 32, 34, and optionally 36 exist within the channel notches 42. A cover layer 50 is then laminated to the channel forming layer 40 as described above.
혈액 샘플 내 알코올의 결정Determination of alcohol in blood samples
하기 예는 혈액 샘플에서 알코올을 결정하기 위한 데이터를 제공하지만, 이러한 일회용 바이오센서들이 전술된 이점들을 갖도록 하기 위해, 글루타메이트, 글루코스, 락테이트, 콜레스테롤, 하이드록시부티레이트, 글리세롤, 말레이트, 류신 등과 같은 혈액 내 다른 분석물들도 적절한 탈수소효소 및 디아포라제를 사용하여 결정될 수 있음이 전술된 바와 같이 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람들에 의해 이해되어야 한다. The example below provides data for determining alcohol in a blood sample, but to ensure that these disposable biosensors have the advantages described above, it is important to note that the following It should be understood by those skilled in the art that other analytes in blood can also be determined using appropriate dehydrogenases and diaphorases as described above.
알코올 바이오센서의 경우, 혈액 샘플이 알코올(예시적인 경우, 알코올은 에탄올임)을 포함할 때 발생하는 기본 화학 반응들은 다음과 같다.For an alcohol biosensor, the basic chemical reactions that occur when a blood sample contains alcohol (in the example case, the alcohol is ethanol) are:
여기서, Medox는 산화된 형태의 매개체이고, Medred는 환원된 형태의 매개체이고, e는 전극 표면에서 전류를 생성하는 전자를 나타낸다. Here, Med ox is the oxidized form of the mediator, Med red is the reduced form of the mediator, and e represents the electron that generates the current at the electrode surface.
알코올 바이오센서에 대한 작업 전극과 기준 전극에 걸친 바이어싱 전위는 100 mV 내지 500 mV의 범위, 바람직하게는 300 mV 내지 400 mV의 범위에 있다. 범위 내의 전압 값은 중요하지 않지만 일정해야 한다. 작업 전극과 기준 전극에 걸친 바이어싱 전위는 매개체가 전극 표면에서 환원된 상태로부터 산화된 상태로 변하게 하여(화학식 3 참조), 혈중 알코올의 농도에 기반하여 전류를 생성한다. The biasing potential across the working and reference electrodes for the alcohol biosensor is in the range of 100 mV to 500 mV, preferably in the range of 300 mV to 400 mV. The voltage value within the range is not critical but should be constant. The biasing potential across the working and reference electrodes causes the mediator to change from a reduced state to an oxidized state at the electrode surface (see Equation 3), generating a current based on the concentration of alcohol in the blood.
알코일에 대한 혈액 샘플들의 농도 값들은 뉴욕주 태리타운 소재의 지멘스 헬스케어 다이어그노스틱스 인코포레이티드(Siemens Healthcare Diagnostics, Inc.)에서 판매되는 디멘션 RxL 케미스트리 애널라이저(Dimension RxL Chemistry Analyzer)로 알려진 혈액 분석기를 사용하여 획득되었다. 분석물 테스트 스트립들의 테스트 데이터는 CH 인스트루먼트 퍼텐쇼스탯(CH Instruments Potentiostat) 모델 번호 CHI 812B 또는 모델 번호 CHI 660A를 사용하여 획득되었다. Concentration values of blood samples for alcohol were obtained using the Dimension RxL Chemistry Analyzer, available from Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Tarrytown, NY. Obtained using an analyzer. Test data for analyte test strips were acquired using a CH Instruments Potentiostat model number CHI 812B or model number CHI 660A.
시약 매트릭스에 디아포라제 및 매개체로서의 KK as a diaphorase and mediator in the reagent matrix 33 Fe(CN)Fe(CN) 66 를 갖는 알코올 바이오센서를 사용한 알코올 결정을 위한 테스트 데이터Test data for alcohol determination using an alcohol biosensor with
혈중 알코올 농도들과 알코올 바이오센서에 기반한 반응 사이의 선형성 반응을 결정하기 위해, 테스트들은 9 가지의 상이한 농도 레벨들의 에탄올을 사용했다. 레벨들은 0 %, 0.01 %, 0.02 %, 0.04 %, 0.08 %, 0.12 %, 0.16 %, 0.2 %, 및 0.25 %이다. 이러한 에탄올 레벨들에 대해 샘플들이 준비되었고, 각 에탄올 농도에 대해 전류 측정들이 수행되었다. 각 측정에는, 새로운 알코올 바이오센서 스트립이 사용되었다. 표 1은 알코올의 결정을 위해 획득된 테스트 데이터를 나타내며, 여기서, 에탄올 바이오센서는 에탄올 탈수소효소, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함하는 작업 전극 시약 매트릭스를 갖는다. 산화된 형태의 산화환원 매개체는 페리시안화 칼륨 매개체이다.To determine the linearity of the response between blood alcohol concentrations and the alcohol biosensor-based response, tests used nine different concentration levels of ethanol. The levels are 0%, 0.01%, 0.02%, 0.04%, 0.08%, 0.12%, 0.16%, 0.2%, and 0.25%. Samples were prepared for these ethanol levels and amperometric measurements were performed for each ethanol concentration. For each measurement, a new alcohol biosensor strip was used. Table 1 shows the test data obtained for the determination of alcohol, where the ethanol biosensor has a working electrode reagent matrix comprising ethanol dehydrogenase, diaphorase, and the oxidized form of the redox mediator. The redox mediator in its oxidized form is the potassium ferricyanide mediator.
도 7은 다양한 알코올 농도들에 대한 작업 전극(즉, 에탄올 탈수소효소 기반 전극)의 측정된 전류 반응을 나타낸다. 전류 반응은 테스트된 알코올 농도 범위 전체에서 에탄올 농도에 대해 선형이다. Figure 7 shows the measured current response of the working electrode (i.e., ethanol dehydrogenase-based electrode) for various alcohol concentrations. The current response is linear with ethanol concentration throughout the alcohol concentration range tested.
시약 매트릭스에 디아포라제 및 매개체로서의 염화 헥사아민-루테늄(III)을 갖는 알코올 바이오센서를 사용한 알코올 결정을 위한 테스트 데이터Test data for alcohol determination using an alcohol biosensor with diaphorase in the reagent matrix and hexamine-ruthenium(III) chloride as mediator.
하나의 더 높은 농도 레벨을 제외하고는 이전의 예와 동일한 레벨들과 수의 알코올 농도들이 이 예에서 사용되었다. 즉, 레벨들은 0 %, 0.01 %, 0.02 %, 0.04 %, 0.08 %, 0.12 %, 0.16 %, 0.2 %, 0.25 %, 및 0.35 %이다. 이러한 에탄올 레벨들에 대해 샘플들이 준비되었고, 각 에탄올 농도에 대해 전류 측정들이 수행되었다. 각 측정에는 새로운 알코올 바이오센서 스트립이 사용되었다. 표 1은 알코올의 결정을 위해 획득된 테스트 데이터를 나타내며, 여기서, 에탄올 바이오센서는 염화 헥사아민-루테늄(III) 매개체를 사용한다.The same levels and number of alcohol concentrations were used in this example as the previous example except for one higher concentration level. That is, the levels are 0%, 0.01%, 0.02%, 0.04%, 0.08%, 0.12%, 0.16%, 0.2%, 0.25%, and 0.35%. Samples were prepared for these ethanol levels and amperometric measurements were performed for each ethanol concentration. A new alcohol biosensor strip was used for each measurement. Table 1 shows the test data obtained for the determination of alcohol, where the ethanol biosensor uses a hexamine-ruthenium(III) chloride mediator.
도 8은 다양한 알코올 농도들에 대한 작업 전극(즉, 에탄올 탈수소효소 기반 전극)의 측정된 전류 반응을 나타낸다. 전류 반응은 테스트된 알코올 농도 범위 전체에서 에탄올 농도에 대해 선형이다.Figure 8 shows the measured current response of the working electrode (i.e., ethanol dehydrogenase based electrode) for various alcohol concentrations. The current response is linear with respect to ethanol concentration throughout the alcohol concentration range tested.
시약 매트릭스에 디아포라제 및 매개체로서 KK as a diaphorase and mediator in the reagent matrix 33 Fe(CN)Fe(CN) 66 를 갖는 에탄올 바이오센서에 대한 정밀 테스트 결과들Precise test results for ethanol biosensor with
에탄올 바이오센서의 정밀한 반응을 결정하기 위해, 이 테스트는 두 가지의 상이한 상이한 농도 레벨들의 에탄올을 사용했다. 레벨들은 0.05 % 및 0.18 %이다. 이러한 에탄올 레벨들에 대해 샘플들이 준비되었고, 각 에탄올 농도에 대해 전류 측정들이 수행되었다. 각 농도 레벨 측정에는, 20 개의 새로운 알코올 바이오센서들 스트립이 사용되었다. 표 3은 알코올의 결정을 위해 획득된 테스트 데이터를 나타내며, 여기서, 에탄올 바이오센서는 디아포라제 및 페리시안화 칼륨 매개체를 사용한다.To determine the precise response of the ethanol biosensor, this test used two different concentration levels of ethanol. The levels are 0.05% and 0.18%. Samples were prepared for these ethanol levels and amperometric measurements were performed for each ethanol concentration. For each concentration level measurement, 20 new strips of alcohol biosensors were used. Table 3 shows the test data obtained for the determination of alcohol, where the ethanol biosensor uses diaphorase and potassium ferricyanide mediator.
도 9는 두 가지의 알코올 농도들에 대한 작업 전극(즉, 에탄올 탈수소효소 기반 전극)의 측정된 전류 반응을 나타낸다. 각 알코올 농도에 대한 20 개의 에탄올 바이오센서들의 평균은 각각 0.543 및 1.721이다. 백분율의 변동 계수(coefficient of variation in percent)는 1.55 및 1.81이다. 테스트 데이터는 하나의 알코올 바이오센서에서 다른 알코올 바이오센서로의 반응이 상대적으로 정밀함을 나타낸다. Figure 9 shows the measured current response of the working electrode (i.e., ethanol dehydrogenase-based electrode) for two alcohol concentrations. The average of 20 ethanol biosensors for each alcohol concentration is 0.543 and 1.721, respectively. The coefficient of variation in percent is 1.55 and 1.81. Test data indicates that the response from one alcohol biosensor to another is relatively precise.
산화된 매개체와 환원된 매개체 사이의 알코올 바이오센서들의 반응 비교Comparison of responses of alcohol biosensors between oxidized and reduced media
(1) 디아포라제 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 사용하는 알코올 바이오센서와 (2) 디아포라제 없이 환원된 형태의 산화환원 매개체를 사용하는 알코올 바이오센서를 기반으로 혈중 알코올 농도들과 반응 사이의 민감도 반응을 결정하기 위해, 테스트들은 9 가지의 상이한 농도 레벨들의 에탄올을 사용했다. 레벨들은 0 %, 0.01 %, 0.02 %, 0.04 %, 0.08 %, 0.12 %, 0.16 %, 0.2 %, 및 0.25 %이다. 이전과 마찬가지로, 한 세트의 알코올 바이오센서들에 사용되는 산화된 매개체는 페리시안화 칼륨이었다. 비교 세트의 알코올 바이오센서의 환원된 매개체는 환원된 형태의 1,10-페난트롤린-5,6-디온이었다. Reaction with blood alcohol concentrations based on (1) an alcohol biosensor using diaphorase and a redox mediator in its oxidized form and (2) an alcohol biosensor using a redox mediator in its reduced form without diaphorase. To determine the sensitivity response between ethanol, tests used nine different concentration levels of ethanol. The levels are 0%, 0.01%, 0.02%, 0.04%, 0.08%, 0.12%, 0.16%, 0.2%, and 0.25%. As before, the oxidized medium used in one set of alcohol biosensors was potassium ferricyanide. The reduced mediator of the comparative set of alcohol biosensors was the reduced form of 1,10-phenanthroline-5,6-dione.
디아포라제 없이 환원된 형태의 산화환원 매개체 1,10-페난트롤린-5,6-디온을 갖는 알코올 바이오센서의 경우, 혈액 샘플이 알코올(예시적인 경우, 알코올은 에탄올임)을 포함할 때 발생하는 기본 화학 반응들은 다음과 같다.For alcohol biosensors with the redox mediator 1,10-phenanthroline-5,6-dione in reduced form without diaphorase, when the blood sample contains alcohol (in the exemplary case, the alcohol is ethanol) The basic chemical reactions that occur are as follows:
여기서, Medox는 산화된 형태의 매개체이고, Medred는 환원된 형태의 매개체이다. Here, Med ox is the oxidized form of the mediator, and Med red is the reduced form of the mediator.
디아포라제가 없는 이 환원된 형태의 산화환원 매개체 알코올 바이오센서들에 대한 작업 전극과 기준 전극에 걸친 바이어싱 전위는 -50 mV 내지 -300 mV의 범위, 바람직하게는 -100 mV 내지 -200 mV의 범위에 있다. 범위 내의 전압 값은 중요하지 않지만 일정해야 한다. 작업 전극과 기준 전극에 걸친 바이어싱 전위는 매개체가 전극 표면에서 산화된 상태로부터 환원된 상태로 변하게 하여(화학식 6 참조), 혈중 알코올의 농도에 기반하여 전류를 생성한다. The biasing potential across the working and reference electrodes for these reduced form redox mediator alcohol biosensors without diaphorase ranges from -50 mV to -300 mV, preferably from -100 mV to -200 mV. It's in range. The voltage value within the range is not critical but should be constant. The biasing potential across the working and reference electrodes causes the mediator to change from an oxidized state to a reduced state at the electrode surface (see Equation 6), generating a current based on the concentration of alcohol in the blood.
상기 참조된 에탄올 레벨들에 대해 샘플들이 준비되었고, 각 바이오센서 세트에 대한 각 에탄올 농도에 대해 전류 측정들이 수행되었다. 각 측정에는, 새로운 알코올 바이오센서가 사용되었다. 표 4는 전술된 상이한 세트들의 에탄올 바이오센서들을 사용하여 알코올의 결정을 위해 획득된 반응 비교 테스트 데이터를 나타낸다. Samples were prepared for the ethanol levels referenced above and amperometric measurements were performed for each ethanol concentration for each biosensor set. For each measurement, a new alcohol biosensor was used. Table 4 shows comparative response test data obtained for the determination of alcohol using the different sets of ethanol biosensors described above.
도 10은 각 알코올 바이오센서 세트에 대한 다양한 알코올 농도들에 대한 작업 전극(즉, 에탄올 탈수소효소 기반 전극)의 측정된 전류 반응을 나타낸다. 전류 반응은 각 알코올 바이오센서 세트에 대해 테스트되는 알코올 농도 범위 전체에서 에탄올 농도에 대해 선형이다. 그러나, 민감도는 산화된 형태의 매개체 및 환원된 형태의 매개체와 함께 탈수소효소를 사용할 때 심각한 차이를 나타낸다. 그래프에 나타난 바와 같이, 산화된 형태의 매개체 및 디아포라제를 갖는 알코올 바이오센서는 0 내지 2.6 마이크로암페어에서 디아포라제가 없는 환원된 형태의 매개체의 경우의 0 내지 0.8 마이크로암페어보다 훨씬 더 민감한 반응을 갖는다. 반응이 더 민감하기 때문에, 측정의 정확도도 향상된다. 상기 화학식들로부터, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람은 환원된 형태의 매개체를 사용하는 경우, 환원된 형태의 매개체가 NAD(P)H로 전자를 잃어 NAD(P) 및 산화된 형태의 매개체를 형성하므로, 디아포라제의 존재가 반응들에 영향을 미치지 않을 것임을 인식할 것이다. Figure 10 shows the measured current response of the working electrode (i.e., ethanol dehydrogenase-based electrode) to various alcohol concentrations for each alcohol biosensor set. The current response is linear with respect to ethanol concentration across the alcohol concentration range tested for each set of alcohol biosensors. However, the sensitivity shows significant differences when using dehydrogenase with the oxidized and reduced forms of the mediator. As shown in the graph, the alcohol biosensor with the oxidized form of the mediator and diaphorase produces a much more sensitive response at 0 to 2.6 microamps than the 0 to 0.8 microamps for the reduced form of the mediator without diaphorase. have Because the response is more sensitive, the accuracy of measurements is also improved. From the above chemical formulas, those skilled in the art will know that when a reduced form of the mediator is used, the reduced form of the mediator loses electrons to NAD(P)H, resulting in NAD(P) and the oxidized form. It will be appreciated that since it forms a mediator, the presence of diaphorase will not affect the reactions.
알코올 바이오센서 보관 안정성Alcohol biosensor storage stability
NAD(P)-의존성 탈수소효소, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함하는 알코올 바이오센서와 디아포라제 없이 환원된 형태의 산화환원 매개체를 사용하는 알코올 바이오센서의 안정성을 결정하기 위해, 12 개월의 기간에 걸쳐 알코올 바이오센서들에 대한 비교가 수행되었다. 0.15 %의 에탄올 농도를 갖는 샘플에 대해 새로운 알코올 센서로 각 판독값이 측정되었다. 이전과 마찬가지로, 한 세트의 알코올 바이오센서들에 사용되는 산화된 매개체는 페리시안화 칼륨이었다. 비교 세트의 알코올 바이오센서들의 환원된 형태의 매개체는 환원된 형태의 1,10-페난트롤린-5,6-디온이었다. Determining the stability of alcohol biosensors containing NAD(P)-dependent dehydrogenase, diaphorase, and oxidized forms of redox mediators and of alcohol biosensors using reduced forms of redox mediators without diaphorase For this purpose, a comparison of alcohol biosensors was performed over a period of 12 months. Each reading was taken with a new alcohol sensor for a sample with an ethanol concentration of 0.15%. As before, the oxidized medium used in one set of alcohol biosensors was potassium ferricyanide. The reduced form of the carrier for the comparative set of alcohol biosensors was the reduced form of 1,10-phenanthroline-5,6-dione.
디아포라제 및 전자 매개체로서의 페리시안화 칼륨을 갖는 알코올 바이오센서들에 대해 작업 전극과 기준 전극에 걸친 바이어싱 전위는 100 mV 내지 500 mV의 범위, 바람직하게는 300 mV 내지 400 mV의 범위에 있다. 디아포라제 없이 환원된 형태의 산화환원 매개체 1,10-페난트롤린-5,6-디온을 갖는 알코올 바이오센서들에 대한 작업 전극과 기준 전극에 걸친 바이어싱 전위는 -50 mV 내지 -300 mV의 범위, 바람직하게는 -100 mV 내지 -200 mV의 범위에 있다.For alcohol biosensors with diaphorase and potassium ferricyanide as electron mediator the biasing potential across the working and reference electrodes is in the range of 100 mV to 500 mV, preferably in the range of 300 mV to 400 mV. The biasing potential across the working and reference electrodes for alcohol biosensors with the redox mediator 1,10-phenanthroline-5,6-dione in reduced form without diaphorase is -50 mV to -300 mV. range, preferably in the range of -100 mV to -200 mV.
상기 참조된 에탄올 레벨들에 대해 샘플들이 준비되었고, 각 바이오센서 세트에 대한 0.15 %의 농도에 대해 전류 측정들이 수행되었다. 각 측정에는, 새로운 알코올 바이오센서가 사용되었다. 표 5는 전술된 상이한 세트들의 에탄올 바이오센서들을 사용하여 알코올의 결정을 위해 획득된 반응 비교 테스트 데이터를 나타낸다.Samples were prepared for the ethanol levels referenced above and amperometric measurements were performed for a concentration of 0.15% for each biosensor set. For each measurement, a new alcohol biosensor was used. Table 5 shows comparative response test data obtained for the determination of alcohol using the different sets of ethanol biosensors described above.
도 11은 각 알코올 바이오센서 세트에 대한 주변 보관 조건들 하에서 작업 전극(즉, 에탄올 탈수소효소 기반 전극)의 측정된 전류 반응을 나타낸다. NAD(P)-의존성 탈수소효소, 산화된 형태의 산화환원 매개체, 및 디아포라제를 갖는 알코올 바이오센서 세트의 경우, 전류 반응은 12 개월 기간 동안 에탄올 농도에 대해 안정적이다. 그래프 도면과 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 디아포라제 없이 환원된 형태의 산화환원 매개체를 갖는 알코올 바이오센서 세트의 경우, 12 개월 기간 동안 전류 반응은 감소한다. 사실 상, 디아포라제 없이 환원된 형태의 산화환원 매개체를 갖는 알코올 바이오센서들을 4 개월 보관한 후, 전류 반응이 감소하기 시작하고, 바이오센서가 오래될수록 더 빨리 떨어짐이 명백하다. 그래프에 나타난 바와 같이, 디아포라제 없이 환원된 형태의 매개체를 갖는 알코올 바이오센서들은 4 개월 보관 수명에서의 0.571 마이크로암페어(또는 평균 0.574 마이크로암페어)에서 12 개월 저장 수명에서의 0.398 마이크로암페어로 반응이 감소한다. 요약하면, 알코올 바이오센서들 반응은 시간이 가면서 감소한다. Figure 11 shows the measured current response of the working electrode (i.e., ethanol dehydrogenase-based electrode) under ambient storage conditions for each set of alcohol biosensors. For the alcohol biosensor set with NAD(P)-dependent dehydrogenase, the oxidized form of the redox mediator, and diaphorase, the current response is stable to ethanol concentration over a period of 12 months. As shown in the graphical figures and in Table 5 above, for the alcohol biosensor set with the redox mediator in reduced form without diaphorase, the current response decreases over a period of 12 months. In fact, it is clear that after 4 months of storage of alcohol biosensors with the reduced form of the redox mediator without diaphorase, the current response begins to decline, falling faster the older the biosensor. As shown in the graph, alcohol biosensors with the reduced form of the mediator without diaphorase responded from 0.571 microamps (or an average of 0.574 microamps) at a 4-month shelf life to 0.398 microamps at a 12-month shelf life. decreases. In summary, the response of alcohol biosensors decreases over time.
본 발명의 바람직한 실시예들이 여기에 설명되었지만, 상기 설명은 단지 예시적인 것이다. 여기에 개시된 본 발명의 추가 수정이 각각의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람들에 의해 발생될 수 있으며, 그러한 모든 수정들은 첨부된 청구범위 내에 있는 것을 간주된다.Although preferred embodiments of the invention have been described herein, the description is illustrative only. Further modifications of the invention disclosed herein may be made by those skilled in the art, and all such modifications are considered to be within the scope of the appended claims.
Claims (18)
적어도 작업 전극 부분 및 기준 전극 부분을 갖는 감지 표면;
상기 작업 전극 부분 상에 배치되고, NAD(P)-의존성 탈수소효소, NAD(P)+, 디아포라제(diaphorase), 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함하여, 작업 전극을 형성하는 제1 시약; 및
상기 기준 전극 부분 상에 배치되어, 기준 전극을 형성하는 기준 전극 재료
를 포함하는,
일회용 바이오센서.
In a disposable biosensor,
a sensing surface having at least a working electrode portion and a reference electrode portion;
A first electrode disposed on the working electrode portion and comprising NAD(P)-dependent dehydrogenase, NAD(P)+, diaphorase, and an oxidized form of a redox mediator, forming a working electrode. reagent; and
A reference electrode material disposed on the reference electrode portion to form a reference electrode.
Including,
Disposable biosensor.
상기 감지 표면은,
블랭크 전극 부분, 및
상기 블랭크 전극 부분 상에 배치되고, NAD(P)+, 디아포라제, 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함하고 탈수소효소를 포함하지 않고, 블랭크 전극을 형성하는 제2 시약
을 더 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to claim 1,
The sensing surface is,
a blank electrode portion, and
A second reagent disposed on the blank electrode portion, comprising NAD(P)+, diaphorase, an oxidized form of a redox mediator and no dehydrogenase, forming a blank electrode.
Containing more,
Disposable biosensor.
상기 기준 재료는,
Ag-AgCl, 또는
환원된 형태의 산화환원 매개체, 산화된 형태의 산화환원 매개체, 및 환원된 형태와 산화된 형태의 산화환원 매개체의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 화학적 산화 시약을 포함하는 기준 매트릭스
중 하나인,
일회용 바이오센서.
According to claim 1,
The reference material is,
Ag-AgCl, or
A reference matrix comprising at least a chemical oxidation reagent selected from the group consisting of redox mediators in reduced form, redox mediators in oxidized form, and mixtures of redox mediators in reduced and oxidized forms.
One of the
Disposable biosensor.
상기 NAD(P)-의존성 탈수소효소는,
알코올(alcohol) 탈수소효소, 글루타메이트(glutamate) 탈수소효소, 글루코스(glucose) 탈수소효소, 락테이트(lactate) 탈수소효소, 콜레스테롤(cholesterol) 탈수소효소, D-3-하이드록시부티레이트(D-3-hydroxybutyrate) 탈수소효소, 글리세롤(glycerol) 탈수소효소, 말레이트(malate) 탈수소효소, 및 류신(leucine) 탈수소효소 중 하나인,
일회용 바이오센서.
According to claim 1,
The NAD(P)-dependent dehydrogenase is,
Alcohol dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase, D-3-hydroxybutyrate Dehydrogenase, one of glycerol dehydrogenase, malate dehydrogenase, and leucine dehydrogenase,
Disposable biosensor.
상기 산화된 형태의 상기 산화환원 매개체는,
금속 화합물 또는 유기 산화환원 화합물을 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to claim 1,
The redox mediator in its oxidized form,
Containing a metal compound or an organic redox compound,
Disposable biosensor.
상기 산화된 형태의 상기 산화환원 매개체는,
페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide), 페리시안화 나트륨(sodium ferricyanide), 페로센(ferrocene) 및 그 유도체들(derivatives), 염화 헥사아민루테늄(III)(hexaamineruthenium(III) chloride) 및 그 유도체들과 같은 루테늄 화합물, 오스뮴 착물(osmium complexes), 1,10-페난트롤린-5,6-디온(1,10- phenanthroline-5,6-dione), 멜돌라 블루(meldola's blue), 테트라티아풀발렌 7,7,8,8-테트라시아노퀴노디메탄(Tetrathiafulvalene 7,7,8,8- tetracyanoquinodimethane), 하이드로퀴논(hydroquinone), 디클로로페놀이온도페놀(dichlorophenoliondophenol), p-벤조퀴논(p-benzoquinone), o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine), 및 3,4-디히드록시벤즈알데히드(3,4-dihydroxybenzaldehyde) 중 적어도 하나를 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to claim 1,
The redox mediator in its oxidized form,
Ruthenium compounds such as potassium ferricyanide, sodium ferricyanide, ferrocene and its derivatives, hexaamineruthenium(III) chloride and its derivatives , osmium complexes, 1,10-phenanthroline-5,6-dione, meldola's blue, tetrathiafulvalene 7,7 ,8,8-Tetrathiafulvalene 7,7,8,8- tetracyanoquinodimethane, hydroquinone, dichlorophenoliondophenol, p-benzoquinone, o -Containing at least one of o-phenylenediamine and 3,4-dihydroxybenzaldehyde,
Disposable biosensor.
제1 시약은,
중합체(polymer), 계면활성제(surfactant), 및 완충제(buffer)를 더 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to claim 1,
The first reagent is,
Further comprising a polymer, a surfactant, and a buffer,
Disposable biosensor.
상기 제1 시약은,
증량 시약(bulking reagent)을 더 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to clause 7,
The first reagent is,
Further comprising a bulking reagent,
Disposable biosensor.
상기 제2 시약은,
중합체, 계면활성제, 및 완충제를 더 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to clause 2,
The second reagent is,
further comprising polymers, surfactants, and buffering agents,
Disposable biosensor.
상기 제2 시약은,
증량 시약을 더 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to clause 9,
The second reagent is,
further comprising an extender,
Disposable biosensor.
적어도 두 개의 전기 회로들이 상부에 형성되는(delineated) 전기-절연성 재료로 이루어지는 베이스 층 - 상기 적어도 두 개의 전기 회로들의 각각은 상기 베이스 층을 따라 길이 방향으로(longitudinally) 연장되고, 상기 적어도 두 개의 회로들의 각각은 베이스 층 근위 단부 부분 및 베이스 층 원위 단부 부분의 각각에 형성되는 전기-전도성 접촉 패드를 갖고, 전기-전도성 트레이스가 상기 베이스 층 근위 단부 부분에 있는 전기-전도성 접촉 패드를 상기 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 대응하는 전기-전도성 패드와 전기적으로 결합하고, 상기 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 하나의 전기-전도성 패드는 상기 작업 전극을 형성하고, 상기 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 다른 전기-전도성 패드는 상기 기준 전극을 형성함 -;
상기 베이스 층 상에 배치되는 전기-절연성 재료로 이루어지는 채널 형성 층 - 상기 채널 형성 층은 상기 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 각 전기-전도성 패드를 노출시키기에 충분한 미리 정해진 거리만큼 채널 층 원위 단부로부터 연장되는 슬롯을 갖고, 상기 채널 형성 층은 상기 베이스 근위 단부 부분에 있는 각 전기-전도성 패드가 노출되도록 상기 베이스 층의 길이보다 더 짧은 길이를 가짐 -; 및
상기 채널 형성 층의 위에 배치되는 전기-절연성 재료로 이루어지고, 상기 채널 형성 층의 상기 슬롯으로 샘플 챔버를 생성하는 커버 층 - 상기 커버 층은 커버 층 원위 단부로부터 이격되는 벤트 오프닝을 갖고, 상기 벤트 오프닝은 상기 샘플 챔버와 적어도 부분적으로 연통됨 -
을 더 포함하는,
일회용 바이오센서.
According to claim 1,
A base layer made of an electrically insulating material on which at least two electrical circuits are delineated, each of the at least two electrical circuits extending longitudinally along the base layer, the at least two circuits each of which has an electrically-conductive contact pad formed on each of a base layer proximal end portion and a base layer distal end portion, wherein an electrically-conductive trace connects an electrically-conductive contact pad at the base layer proximal end portion and at a base layer distal end portion. electrically coupled to a corresponding electrically-conductive pad in an end portion, one electrically-conductive pad in the base layer distal end portion forming the working electrode, and the other electrically-conductive pad in the base layer distal end portion. A pad forms the reference electrode;
A channel forming layer comprised of an electrically insulating material disposed on the base layer, the channel forming layer extending from the channel layer distal end a predetermined distance sufficient to expose each electrically conductive pad at the distal end portion of the base layer. wherein the channel forming layer has a length shorter than the length of the base layer such that each electrically-conductive pad at a proximal end portion of the base is exposed; and
A cover layer made of an electrically insulating material disposed over the channel forming layer and creating a sample chamber with the slot in the channel forming layer, the cover layer having a vent opening spaced from a distal end of the cover layer, the vent opening The opening is at least partially in communication with the sample chamber -
Containing more,
Disposable biosensor.
상기 베이스 층과 상기 채널 형성 층 사이의 시약 보유 층
을 더 포함하고,
상기 시약 보유 층은 시약 보유 층 원위 단부에 있는 적어도 두 개의 관통 오프닝들을 갖고, 상기 적어도 두 개의 관통 오프닝들 중 하나는 상기 작업 전극과 일치하고, 상기 적어도 두 개의 관통 오프닝들 중 다른 하나는 상기 기준 전극과 일치하는,
일회용 바이오센서.
According to claim 11,
Reagent retention layer between the base layer and the channel forming layer
It further includes,
The reagent retaining layer has at least two through openings at a distal end of the reagent retaining layer, one of the at least two through openings coincides with the working electrode, and the other of the at least two through openings corresponds to the reference. Matched with electrodes,
Disposable biosensor.
상기 베이스 층은 상기 베이스 층을 따라 길이 방향으로 연장되는 제3 전기 회로를 갖고, 상기 제3 전기 회로는 상기 베이스 층 근위 단부 부분 및 상기 베이스 층 원위 단부 부분의 각각에 형성되는 전기-전도성 접촉 패드를 갖고, 전기-전도성 트레이스가 상기 베이스 층 근위 단부 부분에 있는 전기-전도성 접촉 패드를 상기 블랭크 전극을 형성하는 상기 베이스 층 원위 단부 부분에 있는 대응하는 전기-전도성 패드와 전기적으로 결합하고, 상기 블랭크 전극은 상기 채널 형성 층의 상기 슬롯 내에 있는,
일회용 바이오센서.
According to claim 11,
The base layer has a third electrical circuit extending longitudinally along the base layer, the third electrical circuit comprising an electrically-conductive contact pad formed on each of the base layer proximal end portion and the base layer distal end portion. wherein an electrically-conductive trace electrically couples an electrically-conductive contact pad in the proximal end portion of the base layer with a corresponding electrically-conductive pad in the distal end portion of the base layer forming the blank electrode, and an electrode is within the slot of the channel forming layer,
Disposable biosensor.
상기 시약 보유 층은 제3 관통 오프닝을 갖고, 상기 제3 관통 오프닝은 상기 블랭크 전극과 일치하는,
일회용 바이오센서.
According to claim 13,
the reagent retention layer has a third through opening, the third through opening coincident with the blank electrode,
Disposable biosensor.
상기 방법은,
적어도 작업 전극 부분 및 기준 전극 부분을 갖는 감지 표면을 제공하는 단계;
상기 작업 전극 부분 상에 제1 시약을 배치하고 - 상기 제1 시약은 NAD(P)-의존성 탈수소효소, NADP+, 디아포라제, 및 산화된 형태의 산화환원 매개체를 포함함 -, 상기 제1 시약을 건조시켜, 작업 전극을 생성하는 제1 전극 매트릭스를 형성하는 단계;
기준 전극을 형성하는 상기 기준 전극 부분 상에 기준 전극 재료를 배치하고 - 상기 기준 전극 재료는 Ag-AgCl, 또는 환원된 형태의 산화환원 매개체, 산화된 형태의 산화환원 매개체, 및 환원된 형태와 산화된 형태의 산화환원 매개체의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 화학적 산화 시약을 포함하는 기준 전극 시약 중 하나임 -, 상기 기준 전극 시약을 건조시켜, 기준 전극 매트릭스를 형성하는 단계
를 포함하는,
방법.
In the method of manufacturing a disposable biosensor based on NADP-dependent dehydrogenase and diaphorase,
The above method is,
providing a sensing surface having at least a working electrode portion and a reference electrode portion;
Disposing a first reagent on the working electrode portion, the first reagent comprising NAD(P)-dependent dehydrogenase, NADP+, diaphorase, and an oxidized form of a redox mediator, the first reagent drying to form a first electrode matrix that creates a working electrode;
Disposing a reference electrode material on the reference electrode portion forming a reference electrode, wherein the reference electrode material is Ag-AgCl, or a redox mediator in reduced form, a redox mediator in oxidized form, and a redox mediator in reduced form and oxidized One of the reference electrode reagents containing at least a chemical oxidation reagent selected from the group consisting of a mixture of redox mediators - drying the reference electrode reagent to form a reference electrode matrix.
Including,
method.
상기 제1 시약을 형성하는 단계
를 더 포함하고,
상기 제1 시약을 형성하는 단계는,
미리 정해진 양의 물에 미리 정해진 양의 NAD(P)-의존성 탈수소효소, 미리 정해진 양의 NADP+, 미리 정해진 양의 디아포라제, 및 미리 정해진 양의 산화된 형태의 산화환원 매개체를 함께 첨가하는 단계
를 포함하는,
방법.
According to claim 15,
Forming the first reagent
It further includes,
The step of forming the first reagent is:
Adding together a predetermined amount of NAD(P)-dependent dehydrogenase, a predetermined amount of NADP+, a predetermined amount of diaphorase, and a predetermined amount of an oxidized form of a redox mediator to a predetermined amount of water.
Including,
method.
0. 1 그램 내지 0.5 그램의 상기 NAD(P)-의존성 탈수소효소를 측정하는 단계;
0.02 그램 내지 0.1 그램의 상기 NAD(P)+를 측정하는 단계;
0.02 그램 내지 0.5 그램의 상기 디아포라제를 측정하는 단계;
0.1 그램 내지 0.5 그램의 상기 산화된 형태의 산화환원 매개체를 측정하는 단계; 및
10 밀리리터의 물에 상기 NAD(P)-의존성 탈수소효소, 상기 NAD(P)+, 상기 디아포라제, 및 상기 산화환원 매개체를 첨가하는 단계
를 더 포함하는,
방법.
According to claim 16,
Measuring 0.1 gram to 0.5 gram of the NAD(P)-dependent dehydrogenase;
measuring between 0.02 and 0.1 grams of the NAD(P)+;
measuring between 0.02 and 0.5 grams of the diaphorase;
measuring 0.1 gram to 0.5 gram of said redox mediator in its oxidized form; and
Adding the NAD(P)-dependent dehydrogenase, the NAD(P)+, the diaphorase, and the redox mediator to 10 milliliters of water.
Containing more,
method.
0.2 그램 내지 0.4 그램의 상기 NAD(P)-의존성 탈수소효소를 측정하는 단계;
0.05 그램의 상기 NAD(P)+를 측정하는 단계;
0.05 그램 내지 0.2 그램의 상기 디아포라제를 측정하는 단계;
0.3 그램의 상기 산화된 형태의 산화환원 매개체를 측정하는 단계; 및
10 밀리리터의 물에 상기 NAD(P)-의존성 탈수소효소, 상기 NAD(P)+, 상기 디아포라제, 및 상기 산화환원 매개체를 첨가하는 단계
를 더 포함하는,
방법.According to claim 16,
measuring 0.2 to 0.4 grams of the NAD(P)-dependent dehydrogenase;
measuring 0.05 grams of said NAD(P)+;
measuring between 0.05 and 0.2 grams of the diaphorase;
measuring 0.3 grams of the redox mediator in its oxidized form; and
Adding the NAD(P)-dependent dehydrogenase, the NAD(P)+, the diaphorase, and the redox mediator to 10 milliliters of water.
Containing more,
method.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US2021/019515 WO2022182344A1 (en) | 2021-02-25 | 2021-02-25 | Disposable electrochemical biosensor based on nad(p)-dependent dehydrogenase and diaphorase |
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