KR20230145083A - 항체 생성물의 비푸코실화를 조절하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 생물반응기에서 생산되는 항체 생성물의 비푸코실화를 조절하는 방법에 관한 것이다. 방법은 비처리된 생물반응기 생성물에 비해, 비푸코실화를 1% 이상 증가시키는 것을 포함하여, 항체 생성물의 비푸코실화를 제어하기 위해 생물반응기에 만노스를 첨가하는 것을 포함한다.
Description
본 출원은 생물반응기에서 생산되는 항체 생성물의 비푸코실화(afucosylation)를 조절하는 방법에 관한 것이다. 방법은 비처리된 생물반응기 생성물에 비해, 비푸코실화를 1% 이상 증가시키는 것을 포함하여, 항체 생성물의 비푸코실화를 제어하기 위해 생물반응기에 만노스를 첨가하는 것을 포함한다.
항체와 같은 단백질 생성물은 당 모이어티의 부착을 포함하여 세포로부터의 발현 동안 번역 후 변형을 겪는다. 이러한 변형 중 하나는 포유동물 IgG 중쇄의 CH2 도메인의 위치 Asn 297에서 발생하는 면역글로불린 G(IgG)의 N-연결 글리코실화이다. 이러한 특정 N-연결 글리코실화는 사전 형성된 올리고당의 초기 첨가에 의해 달성되며, 이는 이후에 글루코스 및 만노스 잔기를 제거하고 푸코스, 갈락토스, 시알산 및 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)과 같은 다른 당을 첨가하기 위해 후속 변형을 거친다. 이러한 글리코실화는 단백질의 생물학적 활성에 강한 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 많은 치료용 항체 작용의 중요한 메커니즘인 항체-의존성 세포 독성(ADCC)은 항체의 푸코실화 수준에 따라 다르다. 푸코실화의 양이 감소된(즉, 더 많은 비푸코실화)단클론성 항체가 푸코실화 대응물과 비교하여 더 높은 ADCC를 나타내는 것으로 다양한 보고가 밝혔다. 따라서, 비푸코실화가 증가될 수 있는 항체 생성물의 생산은 일부 치료적 접근, 특히 종양학에서 유리하다.
또한, 글리코실화의 유형 및 정도가 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있으므로, 치료용 항체의 글리칸 프로파일은 규제 당국에 보고되고 지속적으로 재생산되어야 하는 중요한 결정적인 품질 속성이다. 그러나 치료용 항체의 제조가 한 공정에서 다른 공정으로(또는 심지어 제조 장소 사이에) 이전될 때, 해당 제품에 대해 이전에 얻은 범위에서 푸코실화 수준을 달성한 이전된 공정을 조정할 필요를 초래할 수 있는 푸코실화와 같은 CQA에 변동이 발생할 수 있다.
따라서, 생물학적 활성을 향상시키고/시키거나 푸코실화 수준을 이전 제조 공정과 일치시키기 위해 재조합적으로 발현된 항체 조성물의 푸코실화 수준을 조절할 수 있는 것이 필요하다.
항체 생산 공정에 약 1 g/L 초과의 양으로 만노스를 첨가하면 (만노스의 첨가가 없는 동일한 생산 공정과 비교할 때) 항체 생성물의 비푸코실화의 통계적으로 유의한 증가를 초래한다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 또한, 본 방법에서 이러한 양으로 만노스를 첨가하는 것은 높은 만노스 종의 증가를 초래하지 않는 것으로 보인다. 이러한 결과는 놀랍고 예상치 못한 것이며, 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 방법은 (i) 항체 생성물의 비푸코실화를 조절하여 ADCC를 향상시키고, 이에 따라 향상된 치료 효과를 제공할 수 있는 치료용 항체를 생산하고; (ii) 중요한 품질 속성이라는 점을 고려하여 일관된 수준을 보장하기 위해 비푸코실화 수준을 조정하기 위한 수단을 제공한다. 본 방법은 비푸코실화를 향상시키기 위해 유전 공학 세포주(이러한 세포주를 생산하고 유지하는 것이 어려움)를 필요로 하는 다른 방법뿐만 아니라, 상류 생물처리(bioprocessing) 매개변수에 대한 상당한 조작을 필요로 하는 다른 방법에 비해 상당한 이점을 갖는다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 방법은 생물반응기에서 재조합적으로 발현된 항체의 비푸코실화를 증가시키는 방법을 제공하며, 방법은 생물반응기에서 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 만노스를 첨가하지 않고 항체 생산 공정에 의해 생산된 동일한 항체와 비교하여 항체의 비푸코실화가 증가되도록 항체 생산 공정 동안 세포 배양물에 만노스를 첨가하는 단계를 포함한다.
또한 동일한 항체에 대해 이전에 얻은 목표 비푸코실화 백분율과 재조합적으로 생산된 항체의 비푸코실화를 일치시키는 방법이 본 명세서에서 제공되며, 방법은 생물반응기에서 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 항체 생산 공정 동안 생물반응기에 만노스를 첨가하는 것을 제어하여 목표 비푸코실화 백분율로 발현된 항체를 수득하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 다른 특징 및 양태는 하기 더 상세히 논의된다.
본 개시내용의 완전하고 가능하게 하는 개시내용은 첨부된 도면에 대한 참조를 포함하여 본 명세서의 나머지 부분에서 보다 구체적으로 제시된다:
도 1은 ManNAc과 갈락토스의 조합과 비교하여 첨가된 만노스의 함수로서 mAb 생성물의 비푸코실화 백분율을 나타낸다.
본 명세서 및 도면에서 참조 문자의 반복 사용은 본 발명의 동일하거나 유사한 특징 또는 요소를 나타내는 것으로 의도된다.
도 1은 ManNAc과 갈락토스의 조합과 비교하여 첨가된 만노스의 함수로서 mAb 생성물의 비푸코실화 백분율을 나타낸다.
본 명세서 및 도면에서 참조 문자의 반복 사용은 본 발명의 동일하거나 유사한 특징 또는 요소를 나타내는 것으로 의도된다.
당업자는 본 논의가 단지 예시적인 실시형태의 설명일 뿐이며, 본 개시내용의 더 넓은 양태를 제한하는 것으로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
실시형태에서, 항체 생성물의 비푸코실화를 조절하는 방법이 본 명세서에서 제공되며, 이는 전형적으로 (i) 항체의 생물학적 활성을 변형시키고, 예를 들어 항체-의존적 세포 독성(ADCC)를 증가시키거나 (ii) 이전에 얻은 수준을 일치시키도록 하는 공정으로 비푸코실화를 미세 조정하는 것으로 의도된다.
글리코실화의 한 유형인 "푸코실화"는 항체와 같은 단백질(또한 본 명세서에서 "항체 생성물"이라고도 함)을 포함하여, 분자에 푸코스 당 단위를 첨가하는 과정이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비푸코실화"는 특정 분자, 예컨대, 특정 항체 생성물 상에의 푸코스 당 단위의 부재를 지칭한다. 항체 생성물의 제조에서, 비푸코실화의 수준은 푸코스 당 단위가 결여된 항체 분자의 백분율이다. 이는 질량 분석법 및 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함한 다수의 방법으로 결정될 수 있다. 사용된 방법 사이에 약간의 변동이 있을 수 있으므로, 일 실시형태에서 백분율은 비행 시간, 액체 크로마토그래피 질량 분석기(Time of Flight, Liquid Chromatograph Mass Spectrometer: TOF LC/MS) 시스템을 사용하여 측정된다. 항체는 환원된 다음 액체 크로마토그래프 질량 분석기(LC/MS), 예컨대, Agilent 6230B TOF LC/MS 시스템(PNGase F 분해에 대한 필요 없음)에 직접 로딩되며, 환원된 항체는 액체 크로마토그래프 상의 역상 탈염 컬럼을 통과시킨 후 비행 시간 질량 분석기에 주입된다.
다른 적합한 방법은, 예를 들어 문헌[Tay and Butler, 2015, J. Biol. Methods 2:19 Mishra et al., 2020, J. Biotechnology X 5: 100015]에 기재된 것을 포함한다. 이러한 기재된 방법 중 하나에서, 글리칸은 PNGase F를 사용하여 제거되고 건조될 수 있다. 그 다음 글리칸은 2-AB 표지화를 사용하여 표지화되고 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 - HPLC(HILIC-HPLC)를 사용하여 분석된다.
그 다음 검출된 종을 분석하여 비푸코실화 항체의 백분율을 결정한다. 보통 측정 정밀도를 개선시키기 위해 측정을 반복한다.
일 실시형태에서, 푸코실화 백분율은 N-연결 글리콘 종, 예컨대, 항체의 Fc 도메인에 연결된 N-연결 글리콘 종에 대해서만 계산된다. N-연결 글리칸 종은 G0, G0F, G1F, G2F, G1F + NeuAc, G2F + NeuAc, G2F + 2NeuAc를 포함한다. 일 실시형태에서, 비푸코실화는 G0/(G0+G0F)에 기반하여 백분율로 측정된다. 다른 아이소형(isoform)이 많은 만노스 형태와 함께 분해되거나 공동 용리되기 어려울 수 있기 때문에 G0 및 G0F에 기반한 측정이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 생성물" 및 "항체"는 호환 가능하게 사용되며, 항체 생성물은 항체 생산 공정의 결과이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 호환 가능하게 사용될 수 있으며 항원의 항원 결정기의 특징에 상보적인 내부 표면 형태 및 전하 분포를 갖는 3차원 결합 공간을 갖는 폴리펩타이드 사슬의 접힘으로부터 형성되는 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 그룹을 지칭한다. 항체는 전형적으로 2쌍의 폴리펩타이드 사슬을 갖는 사량체 형태를 가지며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" 및 "중쇄"를 갖는다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소형의 중쇄 사이에서 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 이황화 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH)과 이어서 다수의 불변 도메인(CH)을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VL) 및 다른 쪽 끝에 불변 도메인(CL)을 가지며, 여기서 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 경쇄는 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기반하여 람다 사슬 또는 카파 사슬로 분류된다.
면역글로불린 분자는 임의의 아이소형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 하위아이소형(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 알로타입(예를 들어, Gm, 예를 들어, G1m(f, z, a 또는 x), G2m(n), G3m(g, b, 또는 c), Am, Em, 및 Km(1, 2 또는 3))의 것일 수 있다. 면역글로불린은 단클론성 항체(mAb)(전장 단클론성 항체를 포함함), 다클론성 항체, 적어도 2개의 상이한 에피토프 결합 단편으로 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), CDR-그래프트, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화(camelised) 항체, 키메라 항체, 항-이디오타입(anti-idiotypic)(항-Id) 항체, 인트라바디, 및 이의 바람직한 항원 결합 단편(재조합적으로 생산된 항체 단편을 포함함)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 재조합적으로 생산될 수 있는 항체 단편의 예는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인, 예컨대, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편을 포함하는 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체 단편은 또한 상기 열거된 항체 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다. 적합한 실시형태에서, 항체 생성물은 단클론성 항체(mAb)이고 더 적합하게는 치료용 항체 생성물이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체 생산 공정은 적합하게는 생물반응기, 즉, 관심이 있는 항체를 발현하는 생산자(producer) 세포의 배양에 적합한 용기에서 수행된다. 생물반응기는 전형적으로 생산 규모, 또는 생산을 위해 규모를 확장하기 전 파일럿 규모에서 사용되므로, 생산 공정에 사용되는 생물반응기는 전형적으로 부피가 적어도 10 L이지만, 더 작은 생물반응기, 예를 들어 부피가 100 내지 250 mL인 AMBR®250 시스템이 공정을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 예시적인 실시형태에서, 생물반응기는 부피가 약 100 mL 내지 약 50,000L일 수 있다. 비제한적인 예는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터 및/또는 50,000 리터의 부피를 포함한다. 적합한 반응기는 다용도, 단일용도, 일회용, 또는 다회용일 수 있고 금속 합금, 예컨대, 스테인리스강(예를 들어, 316L 또는 임의의 다른 적합한 스테인리스강) 및 인코넬(Inconel), 플라스틱 및/또는 유리를 포함한 임의의 적합한 물질로 형성될 수 있다.
항체 생산 공정은 세포 증식 및 원하는 항체의 생산을 지원하기 위해, 필요한 시약 및 보충제(적합한 영양 배지를 포함함)를 적합하게 포함하는, 생산 배지 또는 완충제와 함께 항체 생성물을 생산하는 세포 배양물 또는 세포 집단을 포함한다.
본 명세서에서 "생산 공정 부피"라고도 지칭되는 생물반응기의 총 충전 부피는 생산 공정 동안 생물반응기에서 세포 배양물의 실제 부피를 지칭한다. 이는 전체 생물반응기 부피보다 작지만, 또한 전형적으로 약 10 L 내지 약 50000 L 정도이다. 따라서 생물반응기 부피에 대해 상기 기재된 예시적인 부피는 또한 충전 생산 공정 부피에도 적용 가능하다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 비푸코실화를 조절하는 방법은 항체 생산 공정 동안 생물반응기에 일정 양의 만노스를 첨가하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "만노스"는 탄수화물의 알도헥소스 계열의 당 단량체를 지칭하고, 글루코스의 C-2 에피머이다. 만노스는 D 및 L 이성질체 형태 둘 다로 존재하지만, 전형적으로 본 발명의 방법에서 사용되는 것은 D 이성질체이다:
본 명세서에 기재된 방법은 적합하게는 항체 생산 공정이 일어나는 생물반응기에 만노스를 첨가하는 것을 포함하며, 따라서 만노스 자체가 항체 생산 공정에 첨가된다. 첨가된 만노스의 양(즉, 만노스의 중량)은 생물반응기의 충전 부피, 따라서 생산 공정의 부피에 대해 계산된다. 따라서, 세포 배양액의 농도를 원하는 값으로 만들기 위해 만노스-함유 용액이 첨가된다. 예를 들어, 1 L의 10 g/L 만노스 공급원료를 9 L의 세포 배양액(배지 및 세포 바이오매스)을 포함하는 생물반응기에 첨가하여 1 g/L 최종 농도를 달성할 수 있다. 만노스의 첨가는 생물반응기에서 하나 이상의 밸브 또는 포트를 통한 첨가, 생물반응기의 개구부 또는 상부를 통해 생물반응기에 직접적인 만노스의 첨가를 포함하여 임의의 적합한 공정을 사용하여 수행될 수 있거나, 만노스는 생물반응기에 첨가될 용액에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 만노스는 항체 생산 공정 동안 도입될 영양 배지 용액에 포함될 수 있으며, 이에 의해 또한 만노스를 공정에 첨가할 수 있다. 독립형 용액으로 또는 다중 성분 배지 공급물의 성분으로 첨가될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 단순히 세포 증식 등을 촉진시키기 위해 영양 배지에 적은 양으로 만노스를 포함시키기보다는 비푸코실화 증가/비푸코실화 수준 제어를 목적으로, 만노스를 항체 생산 공정에 첨가하는 것을 필요로 한다는 점에 유의하여야 한다.
첨가되는 만노스의 양은 필요한 비푸코실화의 정도뿐만 아니라 만노스의 첨가를 견디는 세포의 능력에 따라 다를 것이다. 전형적으로, 첨가될 만노스의 양은 적어도 1 g/L, 예컨대, 약 2 g/L 초과, 약 3 g/L 초과, 약 4 g/L 초과, 약 5 g/L 초과, 약 6 g/L 초과, 약 7 g/L 초과, 약 8 g/L 초과, 약 9 g/L 초과이다. 첨가되는 만노스의 양은 전형적으로 약 20 g/L 미만, 예컨대, 약 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 g/L 미만, 또는 약 9 또는 8 g/L 미만 또는 약 7 g/L 미만이다. 너무 많은 만노스를 첨가하는 것은 고삼투질농도를 야기할 수 있어서, 결국 세포 성장을 감소시킬 수 있다. 따라서 첨가되는 만노스의 양은 약 1 g/L 내지 약 20 g/L, 약 1 g/L 내지 약 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L 또는 7 g/L; 약 2 g/L 내지 약 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L 또는 7 g/L; 약 3 g/L 내지 약 15 g/L, 14 g/L, 13 g/L, 12g/L, 11 g/L, 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L 또는 7 g/L일 수 있다. 세포 생산 성능을 고려하여 원하는 수준의 비푸코실화를 달성하기 위해 더 많은 양 또는 더 적은 양의 만노스가 또한 첨가될 수 있다. 1 g/L 만노스는 5.6mM 만노스와 동등하다.
일 실시형태에서, 최대 푸코실화가 요구되는 경우, 첨가되는 만노스의 양은 전형적으로 상기 개괄된 더 높은 수준에 대한 것이 될 것이다. 목표가 이전 생산 공정을 참조하여 항체에 대한 목표 수준과 비푸코실화를 일치시키는 것인 또 다른 실시형태에서, 만노스의 첨가는 상기 언급된 범위 내의 임의의 수준일 수 있고 또한 원하는 일치 수준을 달성하기 위해 생산 공정 동안 변할 수 있다.
항체 생산 공정에 만노스를 첨가하는 시기는 생산되는 항체의 유형, 수행되는 공정의 유형, 생물반응기, 공정이 수행되는 생산 플랜트의 요건 등에 기반하여 달라질 수 있다. 항체 생산 공정은 전형적으로 원하는 세포 밀도/바이오매스를 신속하게 달성하기 위한 성장 단계 및 그 후 관심이 있는 항체의 높은 비생산성을 조장하기 위한 생산 단계를 갖는다. 일부 공정에서 성장 단계에서 생산 단계로의 전환에는 온도 변화가 수반된다.
최종 생성물의 비푸코실화의 조절을 달성하기 위해, 만노스 수준은 생산 단계의 전부 또는 일부 동안 상승될 것이다. 이는 세포 배양 공정 동안 다양한 단계에서 만노스-포함 배지를 공급함으로써 달성될 수 있다. 전형적으로, 만노스는 모든 생산 단계 동안 첨가될 것이지만, 만노스는 또한 성장 단계 동안 공급될 수 있고 그 다음 세포가 추가 만노스를 첨가하지 않고 생산 단계 동안 상승된 만노스 수준 하에 관심이 있는 항체를 생산할 수 있게 할 수 있다.
생산은 전형적으로 당업계에 알려진 2가지 주요 생산 공정 방법, 즉, 유가식(fed batch) 및 관류 공정 중 하나, 또는 2가지 방법의 혼합이다.
일부 실시형태에서, 만노스는 세포 배양 공정의 처음 12 내지 48시간 이내에(즉, 동안에), 더 적합하게는 처음 12 내지 36시간 이내에(처음 12시간, 처음 24시간, 또는 처음 36시간 이내를 포함함) 첨가된다, 다른 실시형태에서, 만노스는 성장 단계의 종료 시, 예컨대, 생산 단계 12 내지 24시간 전에 첨가된다. 만노스의 첨가는 또한 세포 배양 공정(성장 단계 및/또는 생산 단계) 전체에 걸처 다수 회(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 등) 일어날 수 있으며, 각각의 첨가는 첨가되는 만노스의 최종 원하는 양을 달성하기 위한 원하는 양(즉, g/L 양)이다.
일 실시형태에서, 만노스는 처방과 같은 미리 한정된 전략에 따라 고정된 양으로 첨가된다. 예를 들어, 만노스는 표준 공급물 중 하나와 함께 포함될 수 있고 동일한 타이밍 요법(timing regimen)을 채택하거나 별개의 공급물로 채택할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 예를 들어 측정값이 비푸코실화가 미리 결정된 목표 값에서 멀어짐을 나타내는 경우, 첨가될 만노스의 양은 발현되는 항체의 주기적인 측정 결과로서 조정된다. 그 다음 첨가되는 만노스의 양은 목표 값에 비해 비푸코실화가 감소하는 경우 증가될 것이고 비푸코실화가 증가하는 경우 감소될 것이다. 비푸코실화의 측정은 오프라인 또는 인라인에서 수행될 수 있다.
미리 결정된 값은 공정이 이전 경우에, 예를 들어 상이한 크기의 용기, 상이한 장소 등에서 실시되었을 경우 얻어지는 비푸코실화의 수준에 기반할 수 있다. 또한, 예를 들어 해당 제품의 바이오시밀러를 생산할 때 CQA가 규제 목적에 최대한 가깝게 준수될 수 있도록, 상업적으로 입수 가능한 제품의 분석을 기반으로 할 수 있다. 미리 결정된 수준은, 예를 들어 범위(예컨대, 4.0 내지 4.5%)로서 또는 허용 오차가 있는 중간점(4.25% +/ 0.25%)으로서 표현될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 공정의 목적이 만노스를 항체 생산 공정에 첨가한 결과로서 비푸코실화를 증가시키는 것인 경우, 항체 생산 공정에 의해 생산되는 항체 생성물의 비푸코실화는 전형적으로, 만노스 첨가 없이 항체 생산 공정에 의해 생산되는 경우, 동일한 항체 생성물과 비교하여 적어도 0.5%만큼 증가된다. 즉, (만노스의 첨가를 포함하는) 본 명세서에 기재된 생산 방법으로부터의 항체 생성물이 동일한 항체 생산 공정에서, 그러나 추가적인 만노스의 포함 없이 생산된 동일한 항체 생성물과 비교되는 경우, 본 명세서에 기재된 방법에서 생산된 항체는 적어도 0.5%만큼 증가되는 비푸코실화를 나타낸다.
만노스를 첨가하여 생산된 동일한 항체 생성물과 비교하여 만노스 첨가를 포함하는 본 방법에 따라 제조된 항체 생성물의 비푸코실화의 증가량의 측정은, 당업계에 알려진 방법, 예컨대, 질량 분광 분석법(액체 크로마토그래피-질량 분석법을 포함함)뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여 이루어진다. 또한 상기 기재된 바와 같이, 사용된 방법 사이에 약간의 변동이 있을 수 있으므로, 일 실시형태에서 TOF LC/MS 시스템을 사용하여 백분율이 측정되며: 항체는 환원된 다음 액체 크로마토그래프 질량 분석기(LC-MS), 예컨대, Agilent 6230B TOF LC/MS 시스템(PNGase F 분해에 대한 필요 없음)에 직접 로딩되며, 환원된 항체는 액체 크로마토그래프 상의 역상 탈염 컬럼을 통과시킨 후 비행 시간 질량 분석기에 주입된다.
다른 적합한 방법은, 예를 들어 문헌[Tay and Butler, 2015, J. Biol. Methods 2:19 Mishra et al., 2020, J. Biotechnology X 5: 100015]에 기재된 것을 포함한다. 이러한 기재된 방법 중 하나에서, 글리칸은 PNGase F를 사용하여 제거되고 건조될 수 있다. 그 다음 글리칸은 2-AB 표지화를 사용하여 표지화되고 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 - HPLC(HILIC-HPLC)를 사용하여 분석된다.
하나의 단백질 집단에서 또 다른 단백질 집단으로의 비푸코실화(또는 푸코실화) 양의 비교는 비푸코실화의 백분율 증가(또는 푸코실화의 백분율 감소)를 제공하고 일반적으로 항체의 집단에 비해 상대적으로 제공된다. 즉, 또 다른 항체 집단과 비교하여 하나의 항체 집단으로부터의 비푸코실화의 백분율 증가의 측정은 일반적으로 개별 항체 기준이 아니라 약 0.5 g/L 이상 정도로 생산되는 항체의 양을 기준으로 계산된다. 적합하게, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 생산된 항체의 양은 약 1 g/L 이상, 적합하게는 5 g/L 이상, 또는 약 10 g/L 이상이다. 따라서, 본 명세서에서 적어도 0.5%의 비푸코실화 증가가 있는 실시형태에서, 증가는 약 0.5 g/L 이상인 항체의 총량에 대해 측정된다.
예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 초래된 비푸코실화의 증가량은 적어도 0.5% 증가, 또는 다른 실시형태에서 적어도 0.6% 증가, 적어도 0.7% 증가, 적어도 0.8% 증가, 적어도 0.9% 증가, 적어도 1% 증가, 적어도 1.1% 증가, 적어도 1.2% 증가, 적어도 1.3% 증가, 적어도 1.4% 증가, 적어도 1.5% 증가, 적어도 1.6% 증가, 적어도 1.7% 증가, 적어도 1.8% 증가, 적어도 1.9% 증가, 적어도 2.0% 증가, 적어도 2.1% 증가, 적어도 2.2% 증가, 적어도 2.3% 증가, 적어도 2.4% 증가, 적어도 2.5% 증가, 적어도 2.6% 증가, 적어도 2.7% 증가, 적어도 2.8% 증가, 적어도 2.9% 증가, 적어도 3.0% 증가, 또는 0.5% 내지 약 2.0%의 증가, 약 0.5% 내지 약 1.5%의 증가, 또는 약 0.5% 내지 약 1.0%의 증가이다.
또 다른 실시형태에서, 공정은 미리 결정된 수준(목표 값)을 일치하도록 푸코실화의 수준을 제어하는 데 사용된다. 따라서 일 실시형태에서 동일한 항체에 대해 이전에 얻은 목표 비푸코실화 백분율과 재조합적으로 생산된 항체의 비푸코실화를 일치시키는 방법이 제공되며, 방법은 생물반응기에서 항체를 발현시키는 세포를 배양하는 단계; 항체 생산 공정 동안 생물반응기에 만노스를 첨가하는 것을 제어하여 목표 비푸코실화 백분율로 발현된 항체를 수득하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 비푸코실화의 수준은 원하는 목표 값의 +/- 0.25% 이내로 제어된다(여기서 목표 값은 범위이고, 변동은 범위의 중간점에 대한 것임). 예를 들어, 비푸코실화의 수준은 +/- 0.5% 이내로 제어된다.
본 명세서에 기재된 방법에서 사용된 항체 생산 공정은 적합하게 포유동물 세포에서 수행되지만, 다른 실시형태에서 박테리아 또는 곤충 세포는 또한 항체 생성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 항체 생산 공정에서 사용될 수 있는 예시적인 포유동물 세포는 인간, 마우스, 래트, 중국 햄스터, 시리아 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 말, 페럿, 및 고양이 세포를 포함한다. 실시형태에서, 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 예시적인 실시형태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHOK1SV® 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHO-S, CHO GS 녹아웃(knock-out) 세포(글루타티온 합성효소(GS)의 모든 내인성 카피가 불활성화된 CHO 세포), CHOK1SV® FUT8 녹아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. 예시적인 CHO GS 녹아웃 세포(예를 들어, GS-KO 세포)는 CHOK1SV® GS 녹아웃 세포(예컨대, GS Xceed® 세포 - CHOK1SV GS-KO®, Lonza Biologics, Inc.)이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어 Potelligent® CHOK1SV® FUT8 녹아웃(Lonza Biologics, Inc.)이다. 다른 실시형태에서, 세포는 마우스 골수종(NSO)-세포주, HT1080, H9, HEK293 세포주, HeLa 세포주, T-세포 또는 HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK(아기 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, YB2/0, Y0, C127, L 세포, COS 등과 같은 세포주 유래일 수 있다.
실시형태에서, 항체 생산 공정은 유가식 생물반응기에서 수행되며, 여기서 영양 배지가 항체 생산 공정에 제공되고 생산 실행이 종료될 때까지 생성물이 생물반응기에 남아 있는 유가식 생산 공정이 사용된다. 이러한 실시형태에서, 만노스의 첨가는 또한 생산 실행이 종료될 때까지 항체가 제거되지 않도록 일어난다.
추가적인 실시형태에서, 항체 생산 공정은 관류 생물반응기에서 수행되는 관류 공정이다. 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 위한 예시적인 관류 생물반응기는 발효기, 교반-탱크 반응기, 또는 웨이브형(wave-type) 생물반응기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 관류 생물반응기는 유체 성장 배지 내에 세포 배양물을 수용하기 위한 생물반응기 부피를 포함하는 중공 용기 또는 컨테이너를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 관류 생물반응기는 세포 배양물을 교반하기 위한 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트와 함께 배치될 수 있다. 관류 생물반응기는 다양한 물질, 예컨대, 스테인리스강 또는 다른 금속, 중합체(예를 들어, 강성 중합체 또는 가요성 중합체), 또는 이들의 임의의 조합으로 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 관류 생물반응기는 세포 배양물 내에서 세포의 배양 및 증식을 가능하게 하는 다양한 구성요소 및 장비, 예컨대, 배플, 살포기, 기체 공급장치, 열 교환기 등을 포함할 수 있다. 관류 반응(및 관류 생물반응기)이 이용되는 실시형태에서, 만노스는 첨가된 만노스의 원하는 수준을 유지하기 위해 공정 전체에 걸쳐 일관되게 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 관류 공정은 정상 상태 관류 생산 공정일 수 있다. 이러한 경우에, 관류 생물반응기는 적어도 유입 포트를 통해 유입 배지 또는 배지들, 예컨대, 영양 배지뿐만 아니라 필요에 따라 만노스를 연속적으로 수용할 수 있는 반면, 배출 배지 또는 배지들은 적어도 배출 포트를 통해 관류 생물반응기로부터 연속적으로 제거될 수 있다. 유입 배지 또는 배지들을 통한 하나 이상의 유입 성분의 연속 도입 및 배출 배지 또는 배지들을 통한 유출 물질 또는 다른 물질의 연속적인 제거는 생물반응기 내에 포함된 세포 배양물 내에서 정상 상태 또는 유사-정상-상태(pseudo-steady-state) 조건을 유지할 수 있다. 예를 들어, 정상 상태 조건은 세포 배양물 및 세포 배양물이 배치되는 배지 또는 배지들의 상대적으로 일정한 부피를 유지하는 것을 포함할 수 있다. 예로서, 세포 배양물의 부피는, 예를 들어 10%, 8%, 5%, 또는 3% 초과만큼 변화하지 않도록 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 정상 상태 관류 생산 공정은 관류 생물반응기 내에서 원하는 세포 밀도를 유지할 수 있다.
실시형태에서, 관류 생물반응기는 하나 이상의 포트, 예컨대, 유입 포트 및 배출 포트를 포함할 수 있다. 유입 포트는 하나 이상의 유입 성분이 관류 생물반응기 내로 공급될 수 있도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 유입 성분(또한 하나 이상의 유입 물질로도 지칭됨)은 하나 이상의 영양소, 예컨대, 글루코스, 비타민, 지질, 만노스 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 유입 성분은 관류 생물반응기로 유동하는 액체 또는 다른 배지를 통해 관류 생물반응기 내로 전달될 수 있으며, 이 경우 배지 또는 배지들은 유입 배지 또는 유입 배지들로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 유입 배지 또는 배지들은 관류 생물반응기 내에서 성장 또는 확장하기 위해 세포에 의해 사용되는 영양 배지 또는 배지들일 수 있다. 일 실시형태에서, 배출 포트는 물질이 관류 생물반응기로부터 제거될 수 있도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 제거되는 물질은 폐기물, 부산물, 또는 기타 사용된 물질(또는 유출 물질로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 물질은 관류 생물반응기 밖으로 유동하는 액체 또는 다른 배지 또는 배지들을 통해 제거될 수 있다. 이러한 배지 또는 배지들은 배출 배지 또는 배지들로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 원하는 바이오산물은 동일한 배출 포트를 통해 생물반응기로부터 수확될 수 있거나, 생물반응기는 바이오산물의 수확을 위한 또 다른 포트를 가질 수 있다.
추가 실시형태에서, mAb 항체 생성물의 비푸코실화를 증가시키는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 방법은 적합하게는, 생물반응기에서 포유동물 세포에서 수행되는 mAb 항체 생산 공정을 제공하되, 생산 공정은 부피가 적어도 50 L인 단계; mAb 항체 생산 공정 동안 약 5 g/L 초과로 만노스 양을 생물반응기에 첨가하는 단계; 및 항체 생산 공정을 통해 mAb 항체 생성물을 생산하는 단계를 포함하며, mAb 항체 생성물의 비푸코실화는 만노스의 첨가 없이 mAb 항체 생산 공정에 의해 생산된 mAb 항체 생성물과 비교하여 적어도 2%만큼 증가된다.
예시적인 실시형태에서, mAb 항체 생산 공정은 유가식 생물반응기에서 수행된다. 다른 실시형태에서, 항체 생산 공정은 관류 생물반응기에서 수행된다. 적합하게는, 항체 생산 공정은 관류 공정이다.
생산 세포에 의한 생성물의 생합성이 만족스러운 지점까지 진행되면, 예를 들어 세포 배지를 회수하고 세포 및 세포 파편으로부터 상청액을 분리하여 생성물을 수확할 수 있다. 생성물을 하나 이상의 정제/처리 단계, 예컨대, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과 및/또는 바이러스 불활성화를 거쳐서 정제된 생성물을 수득할 수 있다. 생성물은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합되어, 예를 들어 완충제, 계면활성제, 안정화제(예컨대, 트레할로스, 수크로스, 글리세롤), 아미노산(예컨대, 글리신, 히스티딘, 아르기닌), 금속 이온/킬레이터, 염 및/또는 방부제 중 하나 이상을 포함하는 조성물, 예컨대, 제형화된 약제학적 조성물을 생성할 수 있다.
실시예 - 만노스의 첨가에 의한 비푸코실화의 조절
CHO GS-KO 세포를 상이한 농도의 상이한 화학물질로 보충한 화학적으로 규정된 배양 배지에서 배양하여 배양물에 의해 생산된 생성물의 N-연결 글리칸 프로파일에 대한 이들 화학물질의 영향을 테스트하였다. 이 세포주에 의해 생산된 생성물은 모델 IgG 항체이었다.
실험 흐름:
1.
화학물질이 보충된 배양 배지를 준비한다
2.
(1)로부터의 배지에서 세포를 배양한다
3.
배양물에서 생산된 mAb를 수확하고 정제, 환원, 및 탈염된 mAb 생성물의 글리칸 프로파일을 측정한다
4.
글리칸 생성물 품질에 대한 화학 보충제의 통계적 영향을 결정한다
화학물질이 보충된 배지의 준비:
포함된 배지에 보충된 화학물질:
-
없음(대조군)
-
만노스
-
N-아세틸만노스아민(ManNAc) + 갈락토스
만노스, ManNAc, 및 갈락토스의 농축된 스톡 용액을 제조하고 배양 배지에 첨가하였다. 특정 부피의 스톡 용액을 배양 배지에 보충하여 표 1의 조건을 생성하였다:
세포 배양:
GS-KO 세포를 표 1의 배지를 포함하는 통기 진탕 플라스크에 2 x 105개 세포/mL의 밀도로 접종하였다. 배양물을 온도, CO2, 및 습도-제어 인큐베이터에서 5일 동안 성장시켰다. 매일 샘플을 취하여 배양 상태를 모니터링하였다.
생성물 수확 및 글리칸 측정:
5일 진탕 플라스크 배양물로부터 mAb 생성물을 수확하고 단백질 A 포획을 통해 정제하였다. mAb를 환원시킴으로써 글리칸 분석을 위해 정제된 mAb를 준비하여 중쇄 및 경쇄를 분리하였다. 환원된 mAb를 LC-MS에 주입하였으며, 여기서 환원된 mAb를 LC의 역상 탈염 컬럼을 통과시킴으로써 탈염시킨 후 비행 시간 질량 분석기(TOF MS)(Agilent 6230B)에 주입하였다. 기술적 복제를 위해 샘플당 3회 주입을 수행하였다.
글리칸 데이터 분석 및 통계 분석:
Protein Metrics Software를 사용하여 생성된 LC-MS 데이터를 처리하고 각각의 글리칸 종의 상대적 존재비를 기록하였다. 처리에서 측정된 글리칸 종은 다음을 포함하였다: G0, G0F, G1F, G2F, G1F + NeuAc, G2F + NeuAc, G2F + 2NeuAc. 비푸코실화된 종의 총량을 비푸코실화 및 푸코실화 종의 합으로 나눔으로써(G0/G0F+G0) 비푸코실화된 mAb 백분율을 계산하였다. GraphPad Prism, Dunnett 사후(post-hoc) 분석을 수행하여 만노스-보충 배지 또는 갈락토스/ManNAc-보충 배지를 공급한 배양물에서 생산된 mAb가 보충하지 않은 배지를 공급한 배양물에서 생산된 mAb(대조군)와 유의하게 차이가 있는지 여부를 결정하였다.
결과/논의
만노스를 포함하지만 갈락토스 및 ManNAc를 포함하지 않는 배양 배지의 보충은 비푸코실화된 mAb%를 유의하게 증가시켰다(도 1 참조). 증가하는 농도의 만노스는 선형 관계로 비푸코실화된 종의 부수적인 증가를 유발하였다. 더 높은 농도의 ManNAc(10 uM) 보충으로 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 결과를 나타낸 한편, ManNAc는 푸코실화를 약간 감소시켰다.
예시적인 실시형태
실시형태 1은, 생물반응기에서 재조합적으로 발현되는 항체의 비푸코실화(afucosylation)를 증가시키는 방법으로서, 생물반응기에서 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 만노스를 첨가하지 않고 항체 생산 공정에 의해 생산된 동일한 항체와 비교하여 항체의 비푸코실화가 증가되도록 상기 항체 생산 공정 동안 세포 배양물에 만노스를 첨가하는 단계를 포함하는 방법이다.
실시형태 2는, 실시형태 1에 있어서, 첨가되는 만노스의 양이 약 1g/L 내지 약 10 g/L인, 방법을 포함한다.
실시형태 3은, 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 상기 생물반응기가 부피가 적어도 10 L인, 방법을 포함한다.
실시형태 4는, 실시형태 1 내지 3 중 어느 것인가에 있어서, 상기 항체가 단클론성 IgG인, 방법을 포함한다.
실시형태 5는, 실시형태 1 내지 4 중 어느 것인가에 있어서, 상기 세포가 포유동물인, 방법을 포함한다.
실시형태 6은, 실시형태 1 내지 5 중 어느 것인가에 있어서, 상기 항체의 비푸코실화가 만노스를 첨가하지 않고 상기 항체 생산 공정에 의해 생산된 항체와 비교하여 적어도 0.5%만큼 증가되는, 방법을 포함한다.
실시형태 7은, 실시형태 6에 있어서, 상기 항체 생성물의 비푸코실화가 만노스를 첨가하지 않고 상기 항체 생산 공정에 의해 생산된 항체와 비교하여 적어도 1%, 예컨대, 적어도 2%만큼 증가되는, 방법을 포함한다.
실시형태 8은, 실시형태 1 내지 7 중 어느 것인가에 있어서, 상기 항체 생산 공정이 유가식 공정인, 방법을 포함한다.
실시형태 9는, 실시형태 1 내지 7 중 어느 것인가에 있어서, 상기 항체 생산 공정이 관류 공정인, 방법을 포함한다.
실시형태 10은, 실시형태 1 내지 9 중 어느 것인가에 있어서, 발현된 항체를 단리시키는 단계 및 선택적으로 항체에 하나 이상의 정제 단계를 적용하는 단계를 더 포함하는, 방법을 포함한다.
실시형태 11은, 동일한 항체에 대해 이전에 얻은 목표 비푸코실화 백분율과 재조합적으로 생산된 항체의 비푸코실화를 일치시키는 방법으로서, 생물반응기에서 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계; 항체 생산 공정 동안 생물반응기에 만노스를 첨가하는 것을 제어하여 목표 비푸코실화 백분율로 발현된 항체를 수득하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시형태 12는, 실시형태 11에 있어서, 상기 발현된 항체의 비푸코실화 백분율이 목표 백분율 비푸코실화의 +/- 0.25% 이내인, 방법을 포함한다.
실시형태 13은, 실시형태 11 또는 실시형태 12에 있어서, 상기 항체 생산 공정이 관류 공정인, 방법을 포함한다.
본 발명에 대한 이들 및 다른 수정 및 변형은, 더 구체적으로 첨부된 청구범위에 제시된 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 실시될 수 있다. 추가적으로, 다양한 실시형태의 양태는 전체적으로 또는 부분적으로 호환될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 당업자는 전술한 설명이 단지 예일 뿐이며, 이러한 첨부된 청구범위에 추가로 기재되는 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해할 것이다.
Claims (13)
- 생물반응기에서 재조합적으로 발현되는 항체의 비푸코실화(afucosylation)를 증가시키는 방법으로서,
생물반응기에서 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계;
만노스를 첨가하지 않고 항체 생산 공정에 의해 생산된 동일한 항체와 비교하여 항체의 비푸코실화가 증가되도록 상기 항체 생산 공정 동안 세포 배양물에 만노스를 첨가하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 첨가되는 만노스의 양은 약 1g/L 내지 약 10 g/L인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생물반응기는 부피가 적어도 10 L인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 IgG인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 비푸코실화는 만노스를 첨가하지 않고 상기 항체 생산 공정에 의해 생산된 항체와 비교하여 적어도 0.5%만큼 증가되는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 항체 생성물의 비푸코실화는 만노스를 첨가하지 않고 상기 항체 생산 공정에 의해 생산된 항체와 비교하여 적어도 1%, 예컨대, 적어도 2%만큼 증가되는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 생산 공정은 유가식 공정인, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 생산 공정은 관류 공정인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 발현된 항체를 단리시키는 단계 및 선택적으로 항체에 하나 이상의 정제 단계를 적용하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 동일한 항체에 대해 이전에 얻은 목표 비푸코실화 백분율과 재조합적으로 생산된 항체의 비푸코실화를 일치시키는 방법으로서,
생물반응기에서 항체를 발현하는 세포를 배양하는 단계;
항체 생산 공정 동안 생물반응기에 만노스를 첨가하는 것을 제어하여 목표 비푸코실화 백분율로 발현된 항체를 수득하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제11항에 있어서, 상기 발현된 항체의 비푸코실화 백분율은 목표 백분율 비푸코실화의 +/- 0.25% 이내인, 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체 생산 공정은 관류 공정인, 방법.
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