KR20230140401A - 항바이러스용 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 이를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
지구상에는 수많은 바이러스가 존재하고, 신종 또는 재출현 바이러스가 지속적으로 나타나고 있다. 인간은 바이러스에 쉽게 감염될 수 있고, 바이러스 감염으로 인해 경증에서 중증까지 다양한 증상을 유발할 수 있으며, 수많은 사망자를 초래할 수 있어, 바이러스는 인류의 보건·건강뿐만 아니라 경제·사회·문화적으로 큰 위협이 되고 있다. 이에 따라 중동호흡기증후군 바이러스 (MERS-CoV), 조류독감 (Avian influenza), 에볼라 바이러스 (Ebola virus), 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV) 등 유행하는 인수공통 바이러스 감염병에 대한 관심도 높아지고 있으며, 우리 사회의 주요한 이슈로 자리 잡게 되었다. 또한, 지카 바이러스 (Zika virus)의 예와 같이 자연계에 존재하는 알려지지 않았던 바이러스나 해외 유입으로 인한 새로운 바이러스의 출현은 국민들과 보건당국에게 예기치 못하는 큰 사고를 일으킬 수 있다.
가장 최근에는, 2019년 후반 중국 우한시에서 처음 보고된 급성 호흡기 질환인 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)이 유행하였으며, 전 세계적으로 확진자가 속출함에 따라 세계보건기구 (WHO)는 '세계적 대유행 (Pandemic)'으로 선포하였다.
COVID-19는 자연 숙주로서 박쥐에서 기원한 것으로 알려져 있으며, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 변이로 발생하였고, 보편적인 증상으로는 발열, 기침, 피로, 호흡곤란, 후각 및 미각 손실 등이 있으며, 확산 속도가 빨라 수많은 감염자와 사망자를 야기하였다.
바이러스 감염을 방지하기 위한 백신은 대개 개발하기 어렵고, 제조 및 테스트에 상당한 시간이 소요된다. 또한, 항바이러스제는 감염된 환자의 신체 내 바이러스의 복제를 억제하고 신체의 면역 체계에 의존하여 효과를 나타내는데, 대부분의 항바이러스제는 효과가 일정하지 않고, 다수의 경우에는 바이러스 감염은 약물이 효과를 발휘하기 전에 소산될 수 있다.
따라서, 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위해 새롭고 효율적인 치료제의 개발에 대한 필요성이 증가하고 있다.
본 발명은 다양한 종류의 바이러스 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 물질을 제공하고자 한다.
이에, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 성분을 이용한 바이러스 감염증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 항바이러스 효과를 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 식에서,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
A는 페닐을 나타내고,
R1은 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R2는 수소, 할로겐 또는 C1-C6-알콕시를 나타내거나, -C1-C6-알킬렌-OH, -(CH2)pCO2R7, -NHR8, -N(H)S(O)2R7 또는 -NHC(O)R7을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, R7 은 수소 또는 C1-C3-알킬을 나타내고, R8은 C1-C3-알킬피페리딘일, 또는 C1-C3-알킬설포닐을 나타내며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C6-알킬 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
R4는 할로겐, C1-C6-알킬, -C1-C6-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2R7, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이고, R7 은 상기 정의된 바와 같으며,
R5는 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R6은 C1-C6-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C6-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 8원 환이고, R6은 C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다.
본 발명은 또한, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 의하면, 화학식 1의 화합물을 처리하는 경우, 다양한 세포에 있어, 항바이러스 효능을 나타낼 수 있다. 또한 바이러스 감염된 세포에 화학식 1의 화합물을 처리하는 경우, 감염 세포 내 항산화 및 항염증 효능, 및 미토콘드리아 항상성 유지 및 세포 사멸을 억제할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 바이러스 감염증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 실험예 1에 따른 Vero E6 세포에 대한 RT-qPCR 분석 결과 그래프를, 도 1b는 실험예 1에 따른 Vero E6 세포에 대한 플라크 분석법 결과를, 도 1c는 실험예 1에 따른 Vero E6 세포에 대한 웨스턴 블롯 결과 이미지를 나타낸 것이다.
도 1d는 실험예 1에 따른 Vero E6 세포에 대한 실시예 화합물 1의 EC50 값을 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 2b는 실험예 2에 따른 hACE2-A549 세포에 대한 MOI = 0.01 조건 및 MOI = 0.1 조건에서 실시예 화합물 1의 농도별 RT-qPCR 그래프(좌) 및 실시예 화합물 1의 EC50 값(우)을 나타낸 것이다.
도 2c는 실험예 2에 따른 hACE2-A549 세포에 대한 웨스턴 블롯 결과 이미지를, 도 2d는 플라크 분석법 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 실험예 3에 따라 차세대 시퀀싱 (NGS)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 실험예 3에 따라 각 유전자별 RT-qPCR 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 4a는 실험예 4에 따라 차세대 시퀀싱 (NGS)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 실험예 4에 따라 Heme Oxygenase 1 (HMOX1) 및 Nqo1의 RT-qPCR 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 4c는 실험예 4에 따라 차세대 시퀀싱 (NGS)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 5b는 실험예 5에 따라 JC-1 염색을 이용한 미토콘드리아 막전위 이미지 및 강도 그래프를 나타낸 것이고, 도 5c는 실험예 5에 따라 MitoTracker 염색을 이용한 막전위 이미지를 나타낸 것이며, 도 5d는 실험예 5에 따라 미토콘드리아 역학 인자의 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는 실험예 6에 따라 감염 후 24 시간 (hour post infection, hpi) 및 48 시간에서 미토콘드리아 세포 사멸 인자에 대한 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸 것이다.
도 7a, 7b, 7c, 7d 및 7e는 실험예 7에 따라 바이러스 종류별 RT-qPCR 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 1d는 실험예 1에 따른 Vero E6 세포에 대한 실시예 화합물 1의 EC50 값을 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 2b는 실험예 2에 따른 hACE2-A549 세포에 대한 MOI = 0.01 조건 및 MOI = 0.1 조건에서 실시예 화합물 1의 농도별 RT-qPCR 그래프(좌) 및 실시예 화합물 1의 EC50 값(우)을 나타낸 것이다.
도 2c는 실험예 2에 따른 hACE2-A549 세포에 대한 웨스턴 블롯 결과 이미지를, 도 2d는 플라크 분석법 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 실험예 3에 따라 차세대 시퀀싱 (NGS)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 실험예 3에 따라 각 유전자별 RT-qPCR 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 4a는 실험예 4에 따라 차세대 시퀀싱 (NGS)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 실험예 4에 따라 Heme Oxygenase 1 (HMOX1) 및 Nqo1의 RT-qPCR 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 4c는 실험예 4에 따라 차세대 시퀀싱 (NGS)를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 5b는 실험예 5에 따라 JC-1 염색을 이용한 미토콘드리아 막전위 이미지 및 강도 그래프를 나타낸 것이고, 도 5c는 실험예 5에 따라 MitoTracker 염색을 이용한 막전위 이미지를 나타낸 것이며, 도 5d는 실험예 5에 따라 미토콘드리아 역학 인자의 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸 것이다.
도 6a 및 6b는 실험예 6에 따라 감염 후 24 시간 (hour post infection, hpi) 및 48 시간에서 미토콘드리아 세포 사멸 인자에 대한 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸 것이다.
도 7a, 7b, 7c, 7d 및 7e는 실험예 7에 따라 바이러스 종류별 RT-qPCR 분석 결과 그래프를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 식에서,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
A는 페닐을 나타내고,
R1은 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R2는 수소, 할로겐 또는 C1-C6-알콕시를 나타내거나, -C1-C6-알킬렌-OH, -(CH2)pCO2R7, -NHR8, -N(H)S(O)2R7 또는 -NHC(O)R7을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, R7 은 수소 또는 C1-C3-알킬을 나타내고, R8은 C1-C3-알킬피페리딘일, 또는 C1-C3-알킬설포닐을 나타내며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C6-알킬 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
R4는 할로겐, C1-C6-알킬, -C1-C6-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2R7, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이고, R7 은 상기 정의된 바와 같으며,
R5는 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R6은 C1-C6-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C6-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 8원 환이고, R6은 C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 종류의 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 나타낼 수 있으며, 바이러스 양 또는 바이러스 복제양을 억제시키는 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 바이러스 감염으로 인해 비정상적이 된 세포가 항산화 및 항염증 효능, 미토콘드리아 항상성 유지 및 세포 사멸을 억제할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 본 발명은 이러한 화학식 1의 화합물의 신규한 용도를 규명한 것이다.
본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 특히, 약학적으로 허용가능한 염은, 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있다. 여기서, 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 아이오딘화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 다이카복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸다이오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트라이플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및/또는 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
*본 명세서에서, "이성질체 (isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체 (tautomer) 등의 구조이성질체와, 비대칭 탄소 중심을 가지는 R 또는 S 이성질체, 기하이성질체 (트랜스, 시스) 등의 이성질체, 광학 이성질체 (enantiomer)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서, "수화물 (hydrate)"은 비공유적 분자간력 (non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적 (stoichiometric) 또는 비화학양론적 (non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 수화물은 비공유적 분자간 힘으로 결합되는 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 물을 포함할 수 있다. 상기 수화물은 1 당량 이상, 바람직하게는, 1 당량 내지 5 당량의 물을 함유할 수 있다. 이러한 수화물은 물 또는 물을 함유하는 용매로부터 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염을 결정화시켜 제조될 수 있다.
본 명세서에서, "용매화물 (solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있다.
본 명세서에서, 용어 '알킬'은 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬은 알케닐이나 알키닐 부위를 포함하지 않는 “포화 알킬 (saturated alkyl)”이거나, 적어도 하나의 알케닐 또는 알키닐 부위를 포함하는 “불포화 알킬 (unsaturated alkyl)”일 수 있으며, 달리 정의하지 않는 한 1 내지 20 개의 탄소원자를 가질 수 있다.
용어 '알킬렌(alkylene)'은 상기 알킬에서 라디칼이 추가로 형성된 탄화수소 2가 기를 의미하고, 그 예로는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 이소부틸렌 등을 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 '알콕시'는 달리 정의하지 않는 한 1 내지 10 개의 탄소원자를 가지는 알킬-옥시를 의미한다.
용어 '사이클로알킬'은 달리 정의하지 않는 한 포화 지방족 3~10원 환을 의미한다. 전형적인 사이클로알킬 그룹에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등이 포함되지만, 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
용어 '헤테로사이클' 은 달리 정의하지 않는 한 N, O 및 S로 이루어진 그룹에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 포함하며, 벤조 또는 C3-C8사이클로알킬과 융합될 수 있고, 포화되거나 1 또는 2 개의 이중결합을 포함하는 3~10원 환, 바람직하게는 4~8원 환, 더욱 바람직하게는 5~6원 환을 의미한다. 또한, 용어 '헤테로사이클릴'과 혼용되어 사용될 수 있다. 헤테로사이클의 예로는 피롤린, 피롤리딘, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 피라졸린, 피라졸리딘, 피란, 피페리딘, 몰포린, 티오몰포린, 피페라진, 하이드로퓨란 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물에 있어서,
R3는 수소, 할로겐, 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 몰포리노, 피페라지논일인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐일 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물에 있어서,
R4는 할로겐, C1-C3-알킬, -C1-C3-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2-에틸, 헤테로사이클이 티오몰포리노, 몰포리노, 피페라지논일, 또는 피롤리딘일인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수일 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물에 있어서,
R5는 수소, 또는 C1-C3-알킬이고,
R6은 C1-C3-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 테트라하이드로-2H-피란, 또는 피페리딘일이고, R6이 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클인 경우, C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다.
본 발명에서, 화학식 1의 화합물의 예로는 하기 표 1에 나열된 화합물 1 내지 32 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 들 수 있다.
| No. | 구조 | 화합물 명 |
| 1 | 5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민 | |
| 2 | 에틸 7-(사이클로펜틸아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-카복실레이트 | |
| 3 | (7-(사이클로펜틸아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메탄올 | |
| 4 | 5-클로로-N,1-디메틸-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민 | |
| 5 | 4-((7-(사이클로펜틸아미노)-2-(3-플루오로페닐)-1H-인돌-5-일)메틸)피페라진-2-온 | |
| 6 | 4-((2-페닐-7-(((테트라하이드로-2H-피란-4-일)메틸)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드 | |
| 7 | 5-클로로-N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-페닐-1H-인돌-7-아민 | |
| 8 | 5-페녹시-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민 | |
| 9 | 5-클로로-3-(몰포리노메틸)-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민 | |
| 10 | 2-(4-((5-플루오로-2-페닐-1H-인돌-7-일)아미노)피페리딘-1-일)에탄-1-올 | |
| 11 | N-(4-(5-클로로-7-(사이클로펜틸아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)메탄설폰아미드 | |
| 12 | 5-클로로-3-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민 | |
| 13 | 4-((2-(3-플루오로페닐)-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드 | |
| 14 | 5-클로로-N-사이클로펜틸-2-(4-((1-메틸피페리딘-4-일)아미노)페닐)-1H-인돌-7-아민 | |
| 15 | 4-((7-(이소펜틸아미노)-2-(4-메톡시페닐)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드 | |
| 16 | N-(4-(7-(사이클로펜틸아미노)-5-((1,1-디옥시도티오몰포리노)메틸)-1H-인돌-2-일)페닐)아세타미드 | |
| 17 | 4-((3-브로모-2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드 | |
| 18 | 4-((5-클로로-2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-3-일)메틸)피페라진-2-온 | |
| 19 | 4-((7-(메틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드 | |
| 20 | 5-메틸-N-(1-(메틸설포닐)피페리딘-4-일)-2-페닐-1H-인돌-7-아민 | |
| 21 | N-(4-(5-(1,1-디옥시도티오몰포리노)-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세타미드 | |
| 22 | 4-((7-((1-(메틸설포닐)피페리딘-4-일)아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드 | |
| 23 | N1-(5-클로로-2-페닐-1H-인돌-7-일)-N4-메틸사이클로헥산-1,4-디아민 | |
| 24 | 메틸 2-(3-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세테이트 | |
| 25 | (2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-카보닐)-D-프롤린 | |
| 26 | (3-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)메탄올 | |
| 27 | N-사이클로펜틸-2-페닐-5-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)-1H-인돌-7-아민 | |
| 28 | 메틸 2-(4-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세테이트 | |
| 29 | 메틸 4-(5-클로로-7-(사이클로펜틸아미노)-1H-인돌-2-일)벤조에이트 | |
| 30 | 2-(4-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)에탄-1-올 | |
| 31 | 3-브로모-5-(몰포리노메틸)-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민 | |
| 32 | 4-((3-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드 |
본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 항바이러스 효능을 가지고, 바이러스 감염으로 나타나는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 여기서 바이러스의 종류는 크게 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체 양태에서, 상기 약학적 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV-2), 제1형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV-1), 지카 바이러스 (Zika virus, ZIKV), 감악 바이러스 (Gamak virus, GAKV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus, RSV), 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus, VACV), 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus), 플라비 바이러스 (Flavivirus), 아데노 바이러스 (Adenovirus, AdV), 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV), 헤르페스 바이러스 (Herpes virus), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus, JEV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV), 에볼라 바이러스 (Ebola virus, EBOV), 리노 바이러스 (Rhinovirus), 치쿤구니아 바이러스 (Chikungunya virus, CHIKV), A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus, HAV), B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus, HBV), C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus, HCV), 로타 바이러스 (Rotavirus), 아스트로 바이러스 (Astrovirus), 서울 바이러스 (Seoul virus, SEOV)를 포함한 한타 바이러스 (Hantavirus), 뎅기 바이러스 (Dengue virus), 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 (SFTSV), 인간면역결핍 바이러스 (HIV), 웨스트나일 바이러스 (West Nile Virus, WNV), 및 황열 바이러스 (Yellow fever virus) 및 이들의 변이형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체 양태에서, 상기 약학적 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV-2), SARS-CoV-2 B.1 (우한), SARS-CoV-2 B.1.617.2 (델타), SARS-CoV-2 BA.1 (오미크론), 서울 바이러스 (Seoul virus, SEOV), 지카 바이러스 (Zika virus, ZIKV), 및 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus, VACV)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체 양태에서, 상기 약학적 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 감염으로 인한 질병, 구체적으로는 코로나바이러스감염증-19 (coronavirus disease 2019, COVID-19)의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 SARS-CoV-2 B.1 (우한), SARS-CoV-2 B.1.617.2 (델타), SARS-CoV-2 BA.1 (오미크론) 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 “제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV-2)”는 SARS-CoV-2 변이체를 모두 포괄하며, 예를 들어, 변이체 B.1, B.1.617.2, BA.1 로 지칭되는 변이체를 모두 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 스파이크 단백질 중 돌연변이 (예를 들면 아미노산의 부가, 치환 및/또는 결실)로 인한 것일 수 있다.
본 발명에서 “항바이러스” 또는 “바이러스 억제”는 바이러스 입자가 숙주 세포에 감염되는 것을 억제하거나, 숙주 세포에서 바이러스 입자가 복제 또는 증식하는 것을 억제하는 능력을 의미한다.
본 명세서에서, “감염”은 병원성 미생물이 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하여, 체내에서 증식한 상태를 의미한다.
본 명세서에서, “바이러스 감염증”은 바이러스 감염으로 인한 질환을 의미하며, 질환의 원인이 바이러스 감염인 것이라면 그 증상이나 징후는 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체 양태에서, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 바이러스에 대한 EC50 이 0.01 ~ 10 μM일 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 바이러스 감염된 세포의 바이러스 복제를 억제할 수 있다. 또한 바이러스 감염된 세포에서 염증 발생, 산화 스트레스 발생, 세포 사멸을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체 양태에서, 상기 약학적 조성물은 바이러스 감염으로 인해 증가된 Ifnb, Tnfα, Il-6, Ifit1, 및 Ifit2로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 바이러스 감염으로 인해 억제된 HMOX1, 및 Nqo1로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체 양태에서, 상기 약학적 조성물은 미토콘드리아 항상성 관련 유전자인 MLKL, p-MLKL, caspase-3, cleaved caspase-3, MFN1, 및 MFN2로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
본 명세서에서, “치료”란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, “예방”이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “약학적 조성물 (pharmaceutical composition)”은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환이 호전, 예방 또는 치료될 수 있는 인간 및 가축을 포함하는 포유류, 조류 등의 척추 동물을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 감염 증상 또는 감염 징후를 나타내는 환자뿐만 아니라 감염될 가능성이 있는 환자에게도 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이미 통용되고 있는 항바이러스제와 병용하여 사용될 수 있다.
이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 본 발명을 하기 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다. 또한, 이들 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 목적일 뿐이므로, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
실험 방법
(1) 실시예 화합물 1의 준비 및 세포의 배양
본 실시예에서 화학식 1의 화합물의 대표 예로 (5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민)(이하, '실시예 화합물 1' 또는 'Compound 1'이라고 함)을 사용하였다.
Vero E6 세포, 및 Calu-3 세포는 1% 10 mM HEPES in 0.85% NaCl, 1% Antibiotic-Antimycotic (Gibco™, cat# 15240062; 10 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0.25 μg/mL Fungizone™), 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; Gibco, cat# 10082147) 을 포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, cat# 2003610) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃ 5% CO2 조건하에서 배양하고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위해 계대 배양하였다.
Human ACE2 수용체가 발현된 A549 세포 (이하, 'hACE2-A549 세포'라고 한다)는 10% FBS, 1% 10 mM HEPES in 0.85% NaCl, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 100 μg/mL Normocin™을 첨가한 DMEM 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃ 5% CO2 조건하에서 배양하고, 두 계대마다 0.5 μg/mL의 Puromycin이 첨가된 성장 배지에서 계대 배양하였다.
(2) In vitro 바이러스 감염
Vero E6 세포, Calu-3 세포 (웰당 1×106 세포) 및 hACE2-A549 세포 (웰당 0.5×106 세포)를 6 웰 플레이트에 시딩 (seeding) 하고, 밤새 37℃ 5% CO2 조건의 인큐베이터에 두었다. 세포가 대략 80%의 밀도에 도달했을 때, 예열된 인산염 완충 식염수 (PBS; Gibco™, cat# 70011069)로 2회 세척하고, 1mL 2% FBS 배지를 첨가하였으며, 다중 감염성 [MOI, multiplicities of infectivity] 값으로 37°C에서 2시간 동안 감염시켰다 (Vero E6 세포는 MOI = 0.01, hACE2-A549 세포는 MOI = 0.1, Calu-3 세포는 MOI = 1). 감염된 플레이트를 15분마다 흔들어 감염물질을 효율적으로 분배시켰다. 바이러스 흡착 2시간 후, 실시예 화합물 1을 투여하였다. 다음으로, 24 hpi (감염 후 24시간)에 상층액 및 세포를 수확하였다.
(3) 플라크 분석법 (Plaque assay)
Vero E6 세포를 6 웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 37℃ 5% CO2 조건의 인큐베이터에 두었다. 예열된 PBS로 세포를 세척하고, 무혈청 배지를 사용하여 바이러스 상층액의 10배 희석액으로 감염시켰다. 감염 후 90분 동안 플레이트를 15분마다 흔들어 바이러스를 흡착시키고 세포를 0.6% 정제된 한천을 함유하는 오버레이 배지 (DMEM/F12 배지) 3 mL로 덮었다. 이 후, 4일동안 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였고, 3.7% 포름알데히드로 24시간 고정시켰다. 오버레이 한천 배지를 제거한 다음 플레이트를 20% 메탄올을 함유하는 0.1% crystal violet으로 30분동안 염색하였다. 여기서, 바이러스의 종류마다 감염 후 배양 시간 등과 같은 조건을 달리할 수 있으며, 구체적으로 SARS-CoV-2 플라크 분석법의 경우에는 37℃5% CO2 조건에서 반고체 한천 혼합된 배지에서 4일간 배양하였고, 지카 바이러스 (ZIKV)는 5일간, 백시니아 바이러스 (VACV)는 3일간 반고체 한천 첨가 없이 배양하였다. 이후 형성된 플라크의 개수를 세어 바이러스 수량을 측정하였다.
(4) 실시간 정량 PCR (Real-time quantitative PCR (RT-qPCR))
RT-qPCR을 통해 바이러스의 RNA 유전자 측정을 통한 바이러스 복제의 양을 관찰함으로써 항바이러스 효능을 유전자 단계에서 확인하였다.
RNA 추출은 Trizol (Ambion, cat# 15596026)을 이용하였다. 먼저, 세포를 1 mL의 Trizol 녹인 후 1.5 mL tube에 옮겨 담았다. 그 후, 200 μL의 클로로포름 (EMSURE, cat# 1.02445.1000)을 넣고 고르게 섞어준 후 4℃ 13,000rpm에서 15분 간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 600 μL의 이소프로판올 (EMSURE, cat# 1.09634.1011)과 5 μL의 선형 아크릴아미드 (linear acrylamide; Ambion, cat# AM9520))을 넣고 혼합하였다. 4℃ 13,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 1 mL의 75% 에탄올 (EMSURE, cat# 1.00983.1011)을 넣어주고 다시 4℃13,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 모두 제거한 후 공기중에서 건조시키고 DEPC 처리수 (Ambion, cat# AM9906) 20 μL에 RNA 펠렛 (pellet)을 녹여 희석시켰다. 이후, 분광 광도계인 Nanodrop 2000 (Thermo scientific)을 이용해 RNA 농도를 측정하였다.
cDNA 합성에는 High-Capacity RNA-to-cDNA 키트 (Applied biosystem, cat# 4387949)을 사용하였다. Buffer 2X 5 μL, RT enzyme 0.5 μL, DEPC 처리수와 template RNA가 4.5 μL 되도록 넣어주었고 (total 10 μL) Thermal cycler (Thermo scientific)을 이용해 단계 1 (37.0℃ 60min, 1 cycle), 단계 2 (95.0℃ 5min, 1 cycle) PCR 사이클을 통해 합성하였다.
Real-time qPCR은 power SYBR Green PCR Master Mix (Applied biosystem, cat# 4367659)을 이용하였다. 준비된 cDNA 템플레이트를 DEPC 처리수로 1:40 희석하였다. SYBR green PCR Master Mix 5 μL, qPCR용 프라이머 1 μL, cDNA 템플레이트 4 μL을 넣고 섞어준 후 Quantstudio3 (Thermo scientific) 기계를 이용해 RT-qPCR을 진행하였다. 여기서, 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2 내지 4에 나타내었다. 표 2는 SARS-CoV-2 검출에 필요한 프라이머 서열이고, 표 3은 SARS-CoV-2 포함한 다양한 바이러스 검출에 필요한 프라이머 서열이며, 표 4는 인간 유전자의 프라이머 서열을 나타낸 것이고, 표 5는 RT-qPCR의 수행 조건을 나타낸 것이다.
RT-qPCR 결과를 나타내는 도면에서 “+”는 해당 물질을 처리한 것을 의미하고, “-“는 해당 물질을 처리하지 않음을 의미한다.
| 타겟 | 서열 | 방향 | SEQ ID NO. |
| N gene | 5'-CACATTGGCACCCGCAATC-3' | 정방향 | 1 |
| 5'-GAGGAACGAGAAGAGGCTTG-3' | 역방향 | 2 | |
| E gene | 5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3' | 정방향 | 3 |
| 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3' | 역방향 | 4 | |
| RdRp gene | 5'-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG-3' | 정방향 | 5 |
| 5'-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA-3' | 역방향 | 6 |
| 바이러스 | 타겟 유전자 | 서열 | 방향 | SEQ ID NO. |
| SARS-CoV-2 | N | 5'-CAC ATT GGC ACC CGC AAT C-3' | 정방향 | 7 |
| 5'- GAG GAA CGA GAA GAG GCT TG-3' | 역방향 | 8 | ||
| ZIKV | NS1 | 5'-CRA CTA CTG CAA GYG GAA GG-3' | 정방향 | 9 |
| 5'-GCC TTA TCT CCA TTC CAT ACC-3' | 역방향 | 10 | ||
| SEOV | NP | 5'-TGG CAC TAG CAA AAG ACT GG-3' | 정방향 | 11 |
| 5'-CAG ATA AAC TCC CAG CAA TAG GA -3' | 역방향 | 12 | ||
| VACV | E9 | 5'-CGC CTA AGA GTT GCA CAT CCA-3' | 정방향 | 13 |
| 5'-CTC TGC TCC ATT TAG TAC CGA TTC T-3' | 역방향 | 14 |
여기서, N 은 Nucleocapsid protein를, NS1 은 Non-structure protein 1를, NP 은 Nucleoprotein을, E9 은 DNA polymerase를 의미한다.
| Human related gene | 유전자 | 서열 | 방향 | SEQ ID NO. |
| HMOX1 | 5'-CGG ATG GAG CGT CCG CAA CC-3' | 정방향 | 15 | |
| 5'-TCA CCA GCT TGA AGC CGT CTC G-3' | 역방향 | 16 | ||
| Nqo1 | 5'-CCC CGG ACT GCA CCA GAG C-3' | 정방향 | 17 | |
| 5'-CTG CAG CAG CCT CCT TCA TGG C-3' | 역방향 | 18 | ||
| Ifnb | 5'-GTC AGA GTG GAA ATC CTA AG-3' | 정방향 | 19 | |
| 5'-ACA GCA TCT GCT GGT TGA AG-3' | 역방향 | 20 | ||
| Tnfα | 5'-CCA ACT GTC ACT CAT TGC TGA-3' | 정방향 | 21 | |
| 5'-TTC CAA GAA GGA GAC CAT GTT T-3' | 역방향 | 22 | ||
| Il-6 | 5'-GCC CAG CTA TGA ACT CCT TCT-3' | 정방향 | 23 | |
| 5'-GCG GCT ACA TCT TTG GAA TCT-3' | 역방향 | 24 | ||
| Ifit1 | 5'- GGA TTC TGT ACA ATA CAC TAG AAA CCA-3' | 정방향 | 25 | |
| 5'- CTT TTG GTT ACT TTT CCC CTA TCC-3' | 역방향 | 26 | ||
| Ifit2 | 5'- ATC CCC CAT CGC TTA TCT CT-3' | 정방향 | 27 | |
| 5'- CCACCTCAATTAATCAGGCACT-3' | 역방향 | 28 | ||
| GAPDH | 5'-GCA AAT TCC ATG GCA CCG T-3' | 정방향 | 29 | |
| 5'-TCG CCC CAC TTG ATT TTG G-3' | 역방향 | 30 | ||
| β-actin | 5'-AGA GCT ACG AGC TGC CTG AC-3' | 정방향 | 31 | |
| 5'-CGT GGA TGC CAC AGG ACT-3' | 역방향 | 32 |
| 단계 | 온도 | 시간 | cycle |
| 단계 1 |
50.0℃ | 2 min | 1X |
| 95.0℃ | 10 min | ||
| 단계 2 |
95.0℃ | 15 sec | 40X |
| 65.0℃ | 1 min | ||
| 단계 3 |
95.0℃ | 15 sec | 1X |
| 65.0℃ | 1 min | ||
| 95.0℃ | 1 sec |
(5) 웨스턴 블롯
RIPA (Radioimmunoprecipitation assay) 완충액 (Cell Signaling Technology®cat# 9806), 프로테아제/포스포테아제 억제제 혼합물 (Cell Signaling Technology®, cat# 5872)을 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해된 세포는 12% 및 15% 아크릴아마이드 젤에서 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여, 80-120 V에서 90분동안 전기영동 시켰다.
겔을 PVDF 멤브레인 (Millipore Ltd, cat# 617203)을 사용하여 30V에서 90분 동안 트랜스블로팅하였다. 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고 TBS-T (Tris-buffered saline (TBS) 및 0.1% Tween-20 (Bio-Rad Laboratories, Inc., cat# 1706531)) 와 5% 탈지유 (Skim milk)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹 (Blocking) 처리하였다. 다음으로 막을 TBS-T로 세척하였고, TBS-T, 4°C에서 1차 항체 (SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 (Invitrogen™cat# PA1-41098), caspase-3 (Cell Signaling Technology®, cat# 9662), cleaved caspase-3 (Cell Signaling Technology®, cat# 9664), MLKL (Cell Signaling Technology®, cat# 14993), p-MLKL (Cell Signaling Technology®, cat# 91689), MFN1 (Cell Signaling Technology®, cat# 14739), MFN2 (Cell Signaling Technology®, cat# 83667), TOM20 (Cell Signaling Technology®, cat# 72610) 및 GAPDH (Sigma, cat# G9545))에서 밤새 배양하였다. 그 후, TBS-T로 3번 세척하고 실온에서 1시간 동안 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch Inc, cat# 111-035-003)로 처리하였다. 항체 처리된 PVDF 멤브레인은 VILBER (FUSION Solo S instrument)을 사용하여 HRP substrate (EMD Millipore corporation)로 검출하였다.
웨스턴 블롯 결과를 나타내는 도면에서 “+”는 해당 물질을 처리한 것을 의미하고, “-“는 해당 물질을 처리하지 않음을 의미한다.
(6) RNA 시퀀싱 분석 및 차등 발현 유전자 분석 (DEG)
추출된 RNA의 시퀀싱 라이브러리를 위하여 Bowtie2 [참고문헌 2] 및 HISAT2 프로그램[참고문헌 1]을 이용하여 인간 참조 게놈 버전 (GRCh38)에 spliced read를 맵핑한 다음 통계 처리를 하였다. 각 샘플에 대한 처리 및 매핑된 판독 수를 확인하고 StringTie 프로그램의 참조 유전자 모델을 사용하여 전사체 어셈블리를 수행하였다 [참고문헌 3]. 이후, 전사체의 양은 판독 수 (read count)로 계산하였고 FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) 및 TPM (transcripts per kilobase million) 값으로 계산하였다.
차등 발현 유전자 분석 (DEG)은 원시 데이터에 대해 알려진 유전자 (StringTie-e 옵션을 사용하여 수득)에 대한 판독 수 (read count) 값을 타겟하여 저품질 유전자를 필터링하고, edgeR R library-calcNormFactors를 사용하여 TMM (M-값의 Trimmed mean) 정규화 조건 (조정된 p-값 <0.05; 초기하 테스트 및 다중 테스트 보정 (FDR) 및 fold change |Foldchange (fc)|>=2)을 계산하였다.
DEG 분석으로 2개 이상의 샘플에서 transcriptome 시퀀싱 후 샘플 그룹 간의 유전자 발현 및 조절 패턴의 차이를 비교하였고 이를 heatmap으로 모식화 하였다.
DEG 분석 결과를 나타내는 도면에서 “+”는 해당 물질을 처리한 것을 의미하고, “-“는 해당 물질을 처리하지 않음을 의미한다.
(7) 미토콘드리아 막전위 측정
미토콘드리아 막 전위 프로브인 MitoTracker™Orange CMTMRos (Invitrogen™cat# M7510) 및 JC-1 (Thermo Fisher Scientific, cat# T3168)을 사용하여 미토콘드리아 막 전위의 회복을 측정하였다. Mitotracker™Orange CMTMRos는 살아있는 세포의 미토콘드리아를 염색하는 형광 염료로, 554-576 nm의 파장에서 공초점 현미경으로 관찰할 수 있다.
Calu-3 세포를 4-챔버 슬라이드에 시딩한 후, 바이러스 감염 및 실시예 화합물 1을 처리한 다음, 무혈청 DMEM에서 최종 농도 500 nM로 한 Mitotracker™Orange CMTMRos를 37°C, 5% CO2에서 20분 동안 처리하였다. 대조군 세포를 카르보닐 시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존 (FCCP)으로 20분간 처리하였다. 모든 단계는 빛을 차단하고 4-챔버 슬라이드를 예열된 PBS로 3회 세척하고 면역형광 분석 (IFA)을 수행하였다.
JC-1는 미토콘드리아 막 전위에 대한 마커로, 탈분극 및 비정상적인 미토콘드리아 막 전위에서 녹색 형광 단량체 (~529 nm)로 나타난다. JC-1을 10 mM로 희석하였고, 무혈청 DMEM에서 2 μM의 최종 농도로 JC-1 용액을 37°C, 5% CO2에서 20분 동안 처리하였다. 대조군 세포는 H2O2로 20분 동안 처리하였다. JC-1 염색 후 Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific, cat# 62249)를 사용하여 실온에서 5분 동안 핵을 염색하였다. 각 염색 단계 후 세포를 예열된 PBS를 사용하여 3회 세척하고 슬라이드 글라스에 장착하였다. 모든 단계는 빛을 차단한 상태에서 수행되었다.
실험 결과
실험예 1. SARS-CoV-2 B.1 감염 모델 기반 실시예 화합물 1의 농도별 In vitro 항바이러스 효능 확인
SARS-CoV-2 B.1에 대한 실시예 화합물 1의 항바이러스 활성을 조사하기 위해 Vero E6 세포를 SARS-CoV-2 B.1 (MOI = 0.01)를 감염시켰다. 2시간 후 감염된 Vero E6 세포에 실시예 화합물 1을 각각 30, 20, 10, 1 μM의 농도로 투여하였다. 24 hpi (감염 후 24시간)에서 감염된 세포로부터 총 RNA, 단백질 추출물 및 상등액을 수집하였으며, 상기 실험 방법에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 도 1a, 1b, 1c 및 1d에 나타내었다.
도 1a, 1b 및 1c는 항바이러스 활성을 각각 RT-qPCR, 플라크 분석법, 및 웨스턴 블롯을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 실시예 화합물 1을 처리하지 않은 경우에 비해 30 μM의 실시예 화합물 1을 처리한 경우, SARS-CoV-2 B.1 바이러스 복제를 1,000배까지 억제할 수 있었다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 30 μM의 실시예 화합물 1을 처리한 경우, 실시예 화합물 1을 처리하지 않은 경우에 비해 SARS-CoV-2 B.1의 감염성 입자가 1,000배 감소되었다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 B.1 뉴클레오캡시드 단백질의 발현도 실시예 화합물 1의 용량 의존적으로 감소하였으며, 도 1d로부터 실시예 화합물 1은 SARS-CoV-2 B.1에 대한 항바이러스 활성의 EC50 값이 1.1 μM임을 알 수 있다.
본 실험예 1로부터, 실시예 화합물 1이 SARS-CoV-2 B.1에 감염된 Vero E6 세포에 대하여 RNA, 단백질, 바이러스 분자 형성 단계에서 모두 항바이러스 효능을 나타내고, SARS-CoV-2 B.1의 복제는 실시예 화합물 1의 용량 의존적인 방식으로 점진적으로 감소됨을 알 수 있다.
실험예 2. hACE2-A549 세포에서 SARS-CoV-2 B.1에 대한 실시예 화합물 1의 농도별 In vitro 항바이러스 효능 확인
실시예 화합물 1이 인간 유래 세포에서 항바이러스 활성을 나타내는지 조사하기 위해, hACE2-A549 세포를 SARS-CoV-2 B.1 (MOI = 0.01 및 0.1)로 감염시켰다. 2시간 후 실시예 화합물 1을 각각 30, 20, 10, 1 μM의 농도로 감염된 hACE2-A549 세포에 처리하였다. 24 hpi (감염 후 24시간)에서 감염된 세포로부터 총 RNA, 단백질 추출물 및 상등액을 수집하였으며, 상기 실험 방법에 따라 실험을 수행하였고, 그 결과를 도 2a, 2b, 2c 및 2d에 나타내었다.
도 2a 및 2b는 MOI = 0.01 조건 및 MOI = 0.1 조건에서 실시예 화합물 1의 농도별 바이러스 발현량 (좌) 및 실시예 화합물 1의 SARS-CoV-2 B.1 바이러스에 대한 EC50 값 (우)을 나타낸 것이다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, MOI = 0.01 조건에서 실시예 화합물 1의 항바이러스 활성은 30 μM 농도에서 SARS-CoV-2 B.1의 복제를 약 100배 억제하였고, SARS-CoV-2 B.1 바이러스에 대하여 1.4 μM의 EC50 값을 가짐을 알 수 있다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, MOI = 0.1 조건에서 실시예 화합물 1의 항바이러스 활성은 30 μM 농도에서 SARS-CoV-2 B.1의 복제를 약 100배 억제하였고, SARS-CoV-2 B.1 바이러스에 대하여 7 μM의 EC50 값을 가짐을 알 수 있다. MOI = 0.01 및 0.1 감염의 경우 실시예 화합물 1의 30 μM 농도에서 억제 비율이 유사하였으나 EC50은 약 5배 차이가 났다. 그 이유는 MOI = 0.1 조건을 사용하면 저농도에서 바이러스의 회복 속도가 빨라지기 때문이다.
도 2c에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 B.1 뉴클레오캡시드 단백질의 발현은 MOI = 0.1에서 실시예 화합물 1의 용량 의존적으로 감소하였고, 도 2d에 나타낸 바와 같이, MOI = 0.1 조건에서 30 μM의 실시예 화합물 1 처리에서 SARS-CoV-2 B.1의 감염성 입자가 100배 감소하였다.
본 실험예 2로부터 실시예 화합물 1이 SARS-CoV-2 B.1에 감염된 인간유래 세포인 hACE2-A549 세포에 대하여 RNA, 단백질, 바이러스 분자 형성 단계에서 모두 항바이러스 효능을 나타내고, SARS-CoV-2 B.1의 복제는 실시예 화합물 1의 용량 의존적인 방식으로 점진적으로 감소함을 알 수 있다.
실험예 3. SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2-A549 세포에서 실시예 화합물 1을 처리 후 염증성 사이토카인 분석
SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2-A549 세포에서 실시예 화합물 1을 처리 후 염증성 사이토카인의 발현여부를 평가하였다.
먼저, mRNA 시퀀싱을 차세대 염기서열분석 (NGS) 및 차등 발현 유전자 (DEG) 분석 (비교 조합은 |Foldchange (fc)|>=2 & p-value<0.05 조건을 만족)을 통해 수행하였으며, 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a로부터 염증성 사이토카인 관련 유전자에 대한 mRNAseq 분석 결과, 인터페론 (Interferon, IFN) 신호 경로와 전염증성 사이토카인 (Pro-inflammatory cytokines) 유전자는 SARS-CoV-2 B.1 감염에 의해 고도로 유도되었음을 알 수 있다. 또한, 실시예 화합물 1의 처리로 인해 인터페론 신호 및 전염증성 사이토카인의 발현이 억제됨을 알 수 있다.
도 3b로부터, RT-qPCR 로 염증성 사이토카인 관련 유전자의 발현량을 확인할 수 있으며, 30 μM 및 1 μM 의 실시예 화합물 1의 처리에 의해 인터페론 관련 유전자인 Ifnβ, Ifit1 및 Ifit2의 발현이 유의하게 하향 조절되었음을 알 수 있다. 또한, 30 μM 및 1 μM 의 실시예 화합물 1의 처리로 인해 전염증성 사이토카인 유전자인 Il-6와 Tnfα의 유도가 감소하였다. 이로부터 SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2- A549 세포에서 실시예 화합물 1 처리에 의해 전염증성 사이토카인의 발현이 억제됨을 알 수 있다.
본 실험예 3으로부터 실시예 화합물 1이 SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2-A549 세포에 대하여 인터페론 및 전염증성 사이토카인의 발현을 억제함을 알 수 있다.
실험예 4. 실시예 화합물 1 처리 후 Nrf2 및 oxidative phosphorylation (OXPHOS) 경로 분석
실시예 화합물 1 처리에 의해 유도된 Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (Nrf2) 관련 유전자 및 OXPHOS 경로의 발현을 조사하였다.
먼저, hACE2-A549 세포를 MOI 0.1의 SARS-CoV-2 B.1로 감염시켰다. 2시간 후 30 μM의 실시예 화합물 1을 처리하였고, 24 hpi (감염 후 24시간)에서 감염된 세포로부터 총 RNA를 수집하였다.
mRNAseq 데이터에서 차등 발현 유전자 (DEG) 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2-A549 세포에서 Nrf2 신호 경로가 하향 조절되었고, 실시예 화합물 1 처리로 인해 Nrf2 신호전달 경로에서 상향 조절되었음을 관찰할 수 있다.
Nrf2 유도 유전자인 Heme Oxygenase 1 (HMOX1) 및 Nqo1의 발현은 세포에서 강력한 항산화 활성 및 염증성 사이토카인의 발현 억제를 가능하게 한다. 실시예 화합물 1을 처리 후 RT-qPCR을 이용하여 HMOX1과 Nqo1의 유전자 발현을 분석한 결과를 도 4b에 나타내었으며, 실시예 화합물 1을 처리하지 않은 감염 세포와 비교하여 실시예 화합물 1을 처리한 감염 세포가 상기 두 유전자 발현의 유의한 증가를 나타내었으며, 바이러스 비감염 세포와 비슷한 수준의 발현량을 나타낸다.
세포 내 ATP는 대부분 미토콘드리아 OXPHOS 과정에 의해 생성되는데, 실시예 화합물 1을 처리 후 미토콘드리아 OXPHOS 복합체의 발현 수준 변화를 mRNAseq 데이터의 차등 발현 유전자 (DEG) 분석을 통해 평가하였으며, 그 결과를 도 4c에 나타내었다. SARS-CoV-2 B.1 감염으로 인해 미토콘드리아 OXPHOS 복합체 I, II, III, IV 및 V의 발현 수준이 감소하였고, 5개의 OXPHOS 복합체 모두에서 실시예 화합물 1을 처리한 세포가 SARS-CoV-2 B.1 감염된 세포와 비교하여 상향 조절되었다. SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2-A549 세포에서 실시예 화합물 1의 처리는 Nrf2 신호 경로 및 OXPHOS 관련 유전자에서 HMOX1과 Nqo1의 발현을 상향 조절하여 실시예 화합물 1이 SARS-CoV-2 B.1 감염 후 미토콘드리아 기능의 회복을 촉진함을 시사하였다.
본 실험예 4로부터, 실시예 화합물 1이 hACE2-A549 세포에 대하여 SARS-CoV-2 B.1 감염으로 인해 억제된 세포 내 항산화 전사인자인 Nrf2의 발현 및 미토콘드리아 OXPHOS 발현을 상향 조절하였음을 알 수 있다.
실험예 5. 실시예 화합물 1 처리 후 SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2-A549 세포 및 Calu-3 세포에서 미토콘드리아 항상성 유지 평가
실시예 화합물 1 처리에 의한 미토콘드리아의 항상성을 평가하기 위해 hACE2-A549 세포와 Calu-3 세포를 MOI = 0.1 및 1의 SARS-CoV-2 B.1 바이러스로 감염시켰다. 2시간 후 실시예 화합물 1을 30 μM 로 처리하였으며, 24 hpi에서 hACE2A-549 세포 및 Calu-3 세포의 JC-1 및 MitoTracker 염색을 수행하였다.
hACE2-A549 세포가 SARS-CoV-2 B.1 균주에 감염되었을 때 미토콘드리아 막 전위(ΔΨ의 동적 변화를 감지하기 위해 JC-1 염색을 수행하고 실시예 화합물 1이 24 hpi에서 막 전위 회복에 영향을 미치는지 관찰하였으며 그 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었다.
hACE2-A549 세포의 미토콘드리아 막 전위 (JC-1 Aggregate, RED)는 SARS-CoV-2 B.1 감염 후 감소하였으며, 감염된 세포에 실시예 화합물 1 처리는 24 hpi에서 감염되지 않은 세포와 비슷한 수준의 강도를 보였다.
또한 Calu-3 세포를 SARS-CoV-2로 감염시킨 후 MitoTrackerTM Orange CMTMRos와 IFA를 사용하여 감염된 세포의 막 전위를 측정하였으며, 그 결과를 도 5c에 나타내었다. MitoTracker의 축적은 24 hpi에서 SARS-CoV-2 B.1 감염 세포에서 유의하게 감소하였다. 실시예 화합물 1의 처리로 인해 MitoTracker가 축적되어 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질이 유의하게 감소하였다.
JC-1과 MitoTracker 염색 결과로부터, 산화적 인산화 과정에서 에너지 저장 과정 중 양성자 펌프 (complex I, III, IV)에 의해 유지되는 세포 내 미토콘드리아의 막 전위가 SARS-CoV-2 감염에 반응하여 감소하고 실시예 화합물 1 처리 후 회복되는 것을 관찰할 수 있다.
SARS-CoV-2 B.1 균주에 감염된 Calu-3 세포의 단백질을 포스포테아제와 프로테아제 억제제가 있는 RIPA buffer을 사용하여 24 hpi에서 수집하였다. 단백질 수준에서 미토콘드리아 역학, 특히 융합 관련 인자인 Mitofusin 1 (MFN1)과 Mitofusin 2 (MFN2)를 관찰하였으며, 그 결과를 도 5d에 나타내었다. SARS-CoV-2 B.1에 감염된 Calu-3 세포에서는 MFN1과 MFN2가 모두 과발현되었으며, 실시예 화합물 1 처리 후 과발현이 억제되었다.
본 실험예 5의 결과는 미토콘드리아가 SARS-CoV-2 감염으로 인해 지속적인 스트레스를 받고 있으며 실시예 화합물 1 처리에 의해 미토콘드리아 스트레스가 억제됨을 시사한다.
실험예 6. 실시예 화합물 1 처리 후 SARS-CoV-2 B.1에 감염된 hACE2-A549의 세포사멸 패턴분석
실시예 화합물 1 처리에 의한 미토콘드리아의 세포사멸 패턴을 평가하기 위해 hACE2-A549 세포를 SARS-CoV-2 B.1 MOI 0.1로 감염시켰다. 2시간 후 실시예 화합물 1을 각각 30, 20, 10, 1 μM씩 처리하였다. 웨스턴 블롯을 사용하여 미토콘드리아 기능 장애로 인한 세포사멸 패턴을 평가하였으며, 그 결과를 도 6a와 6b에 나타내었다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 24 hpi에서 cleaved-Caspase-3 (cCaspase3)과 Phospho-MLKL (p-MLKL)을 절단한 세포사 관련 인자를 검출할 수 없었다. 하지만, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 30 μM 농도에서 괴사 관련 p-MLKL 단백질과 세포 사멸 관련 cCaspase 3 단백질은 48 hpi에서 억제되었다.
이에 따라 본 실험예 6으로부터 실시예 화합물 1이 SARS-CoV-2 B.1에 의한 세포사 관련 단백질의 발현을 억제함을 알 수 있다.
실험예 7. 실시예 화합물 1의 범용 (Universal) 항바이러스 효능 확인
실시예 화합물 1의 항바이러스 활성은 SARS-CoV-2 B.1에만 국한되지 않고 다른 인간 병원성 바이러스에도 확장될 수 있는지, SARS-CoV-2 변이체 및 다른 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 평가하였다. hACE2-A549 세포, Vero E6 세포를 각각 SARS-CoV-2 B.1.617.2 (Delta), BA.1 (Omicron), 서울 바이러스 (SEOV), 지카 바이러스 (ZIKV) 및 백시니아 바이러스 (VACV)로 감염시켰다. 2시간 후 실시예 화합물 1을 각각 30, 20, 10, 1 μM의 농도로 감염된 세포에 투여하였다. 총 RNA는 ZIKV를 제외하고 24 hpi에서 감염된 세포로부터 수집하였다. 수집한 RNA는 RT-qPCR을 수행하였으며, 그 결과를 바이러스 별로 도 7a, 7b, 7c, 7d 및 7e에 나타내었다.
도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 실시예 화합물 1은 SARS-CoV-2 B.1.617.2 (델타) 및 BA.1 (오미크론) 로 감염된 hACE2-A549 세포에서 각각 약 1000배, 30배의 항바이러스 효과를 보였다. 도 7c에 나타낸 바와 같이, Vero E6 세포에서 실시예 화합물 1 처리로 SEOV 바이러스 발현량이 약 3배 감소하였다. 도 7d 및 7e에 나타낸 바와 같이, Vero E6 세포에서 실시예 화합물 1 처리로 ZIKV 발현량이 약 16배 감소하였으며, VACV는 약 15배 감소하였다.
또한, 모든 바이러스가 용량 의존적인 방식으로 감소하였으며, 각 바이러스에 따른 실시예 화합물 1의 EC50 값은 표 6에 나타내었다. 이 결과는 실시예 화합물 1이 SARS-CoV-2 변종과 여러 바이러스에 대한 광범위한 항바이러스제임을 시사한다.
| 종류 | 분류 | 바이러스 | EC50[μM] |
| RNA | Coronaviridae | SARS-CoV-2 B.1.617.2 | 1.2 |
| SARS-CoV-2 BA.1 | 1.1 | ||
| Bunyaviridae | SEOV | 1.9 | |
| Flaviviridae | ZIKV | 7.8(48 hpi) | |
| DNA | Poxviridae | VACV | 6.6 |
[참고문헌][1] Kim, Daehwan, et al. "Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype." Nature biotechnology 37.8 (2019): 907-915.
[2] Langmead, Ben, and Steven L. Salzberg. "Fast gapped-read alignment with Bowtie 2." Nature methods 9.4 (2012): 357-359.
[3] Pertea, Mihaela, et al. "StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads." Nature biotechnology 33.3 (2015): 290-295.
Claims (7)
- 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
상기 식에서,
n은 1 내지 3의 정수이며,
m은 0 또는 1이고,
A는 페닐을 나타내고,
R1은 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R2는 수소, 할로겐 또는 C1-C6-알콕시를 나타내거나, -C1-C6-알킬렌-OH, -(CH2)pCO2R7, -NHR8, -N(H)S(O)2R7 또는 -NHC(O)R7을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, R7 은 수소 또는 C1-C3-알킬을 나타내고, R8은 C1-C3-알킬피페리딘일, 또는 C1-C3-알킬설포닐을 나타내며,
R3는 수소, 할로겐, C1-C6-알킬 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
R4는 할로겐, C1-C6-알킬, -C1-C6-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2R7, 헤테로사이클이 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며 5 내지 6원 환인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 3의 정수이고, R7 은 상기 정의된 바와 같으며,
R5는 수소, 또는 C1-C6-알킬이고,
R6은 C1-C6-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C6-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 S, N 및 O 원자 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 8원 환이고, R6은 C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환될 수 있다. - 제1항에 있어서,
R3는 수소, 할로겐, 또는 페닐을 나타내거나, 헤테로사이클이 몰포리노, 피페라지논일인 -(CH2)p-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수이며, 단, m이 0인 경우, R3은 페닐이고,
R4는 할로겐, C1-C3-알킬, C1-C3-알킬렌-OH, -O-페닐, -(CH2)pCO2-에틸, 헤테로사이클이 티오몰포리노, 몰포리노, 피페라지논일, 또는 피롤리딘일인 -(CH2)p-헤테로사이클, 또는 프롤린-N-카보닐이고, 여기에서 p는 0 내지 1의 정수이며,
R5는 수소, 또는 C1-C3-알킬이고,
R6은 C1-C3-알킬, C3-C6-사이클로알킬, 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클을 나타내고, 여기에서 헤테로사이클은 테트라하이드로-2H-피란, 또는 피페리딘일이고, R6이 헤테로사이클 또는 -C1-C3-알킬렌-헤테로사이클인 경우, C1-C6-알킬아민, -C1-C6-알킬렌-OH, 또는 C1-C6-알킬설포닐로 치환되는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
<1>5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <2>에틸 7-(사이클로펜틸아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-카복실레이트; <3>(7-(사이클로펜틸아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메탄올; <4>5-클로로-N,1-디메틸-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <5>4-((7-(사이클로펜틸아미노)-2-(3-플루오로페닐)-1H-인돌-5-일)메틸)피페라진-2-온; <6>4-((2-페닐-7-(((테트라하이드로-2H-피란-4-일)메틸)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <7>5-클로로-N-(1-메틸피페리딘-4-일)-2-페닐-1H-인돌-7-아민; <8>5-페녹시-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <9>5-클로로-3-(몰포리노메틸)-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <10>2-(4-((5-플루오로-2-페닐-1H-인돌-7-일)아미노)피페리딘-1-일)에탄-*?*1-올; <11>N-(4-(5-클로로-7-(사이클로펜틸아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)메탄설폰아미드; <12>5-클로로-3-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; <13>4-((2-(3-플루오로페닐)-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <14>5-클로로-N-사이클로펜틸-2-(4-((1-메틸피페리딘-4-일)아미노)페닐)-1H-인돌-7-아민; <15>4-((7-(이소펜틸아미노)-2-(4-메톡시페닐)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <16>N-(4-(7-(사이클로펜틸아미노)-5-((1,1-디옥시도티오몰포리노)메틸)-1H-인돌-2-일)페닐)아세타미드; <17>4-((3-브로모-2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <18>4-((5-클로로-2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-3-일)메틸)피페라진-2-온; <19>4-((7-(메틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <20>5-메틸-N-(1-(메틸설포닐)피페리딘-4-일)-2-페닐-1H-인돌-7-아민; <21>N-(4-(5-(1,1-디옥시도티오몰포리노)-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세타미드; <22>4-((7-((1-(메틸설포닐)피페리딘-4-일)아미노)-2-페닐-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드; <23>N1-(5-클로로-2-페닐-1H-인돌-7-일)-N4-메틸사이클로헥산-1,4-디아민; <24>메틸 2-(3-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세테이트; <25>(2-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-카보닐)-D-프롤린; <26>(3-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)메탄올; <27>N-사이클로펜틸-2-페닐-5-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)-1H-인돌-7-아민; <28>메틸 2-(4-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)아세테이트; <29>메틸 4-(5-클로로-7-(사이클로펜틸아미노)-1H-인돌-2-일)벤조에이트; <30>2-(4-(5-클로로-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-2-일)페닐)에탄-1-올; <31>3-브로모-5-(몰포리노메틸)-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민; 및 <32>4-((3-페닐-7-((테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-1H-인돌-5-일)메틸)티오몰포린 1,1-디옥시드. - 제1항에 있어서,
화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물인, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 2]
- 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, SARS-CoV-2), 제 1형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV-1), 지카 바이러스 (Zika virus, ZIKV), 감악 바이러스 (Gamak virus, GAKV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus, RSV), 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus, VACV), 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus), 플라비 바이러스 (Flavivirus), 아데노 바이러스 (Adenovirus, AdV), 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV), 헤르페스 바이러스 (Herpes virus), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus, JEV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV), 에볼라 바이러스 (Ebola virus, EBOV), 리노 바이러스 (Rhinovirus), 치쿤구니야 바이러스 (Chikungunya virus, CHIKV), A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus, HAV), B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus, HBV), C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus, HCV), 로타 바이러스 (Rotavirus), 아스트로바이러스 (Astrovirus), 서울 바이러스 (Seoul Virus, SEOV)를 포함한 한타 바이러스 (Hantavirus), 뎅기 바이러스 (Dengue virus), 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV), 인간면역결핍 바이러스 (Human immunodeficiency virus, HIV), 웨스트나일 바이러스 (West Nile Virus, WNV), 황열 바이러스 (Yellow fever virus) 및 이들의 변이형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 코로나바이러스 감염증-19 (Coronavirus disease 2019, Covid-19)의 예방 또는 치료를 위한 것인 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 바이러스 감염으로 인해 억제된 HMOX1, 및 Nqo1로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시키거나,
바이러스 감염으로 인해 증가된 Ifnb, Tnfα, Il-6, Ifit1, 및 Ifit2 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 억제시키는 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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