KR20230135305A - 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents

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KR20230135305A KR1020220032594A KR20220032594A KR20230135305A KR 20230135305 A KR20230135305 A KR 20230135305A KR 1020220032594 A KR1020220032594 A KR 1020220032594A KR 20220032594 A KR20220032594 A KR 20220032594A KR 20230135305 A KR20230135305 A KR 20230135305A
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칸다사미 사라바나쿠마
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 포함하는 용액에, 트리코델마 하지아눔 추출물을 가하여 얻어진 철나노입자를, 키토산으로 캡슐화함으로써, 박테리아의 생물막을 파괴하여 항균 효과를 갖도록 한 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자 및 그 제조방법 {Trichoderma harzianum-derived chitosan encapsulated iron nanoparticles and manufacturing method thereof}
본 발명은 트리코델마 하지아눔으로 유래되어 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 자세하게는, 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 포함하는 용액에, 트리코델마 하지아눔 추출물을 가하여 얻어진 철나노입자를, 키토산으로 캡슐화함으로써, 박테리아의 생물막을 파괴하여 항균 효과를 갖도록 한 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
약물 내성 세균 감염은 전 세계적으로 인간의 건강과 안전을 심각하게 위협하고[1] 높은 사망률과 이환율을 초래한다. 생물막 관련 감염(BAI)의 치료는 이러한 병원체에 의한 다당류 생성으로 인해 어려운데, 이는 다양한 환경 스트레스로부터 이들을 보호하고 항생제 작용을 방지할 수 있다. 특히 대장균(Escherichia coli)과 장내 살모넬라 균(Salmonella enterica)이 계속해서 BAI의 주요 원인이 되고 있다. 항생제, 폴리펩타이드, 나노물질, 금속 및 암모니아 이온은 BAI를 치료하는 데 사용할 수 있지만 높은 수준의 역효과, 높은 비용 및 환경적 위험으로 인해 사용 및 적응이 제한된다. 새로운 항생제와 백신의 발견과 사용으로 인해 최근 수십 년 동안 미생물 감염으로 인한 사망자 수가 감소했음에도 불구하고. 항생제의 빈번한 사용은 돌연변이 및 다제내성 세균성 병원체의 발달로 이어지며, 이는 다제내성 의료 및 지역사회 관련 세균 감염의 높은 위험을 초래한다. 따라서 약물 내성 균주 및 부작용을 기록하지 않고 약물 내성 BAI 치료를 위한 새로운 접근 방식을 개발하는 것이 필수적이다.
최근 나노과학의 발전으로 인해 자극 반응성(pH, 온도, 근적외선(IR) 등) 및 활성산소종(ROS), 과산화효소 모방 무기 및 유기 나노물질의 개발에 관심이 집중되었다. 박테리아 세포 사멸. 나노물질은 생체적합성, 안정성 및 감염 부위를 표적으로 하는 효율성과 같은 고유한 특성 때문에 박테리아 병원체를 죽이기 위한 대체 항생제 개발에서 주요 관심을 받았다. 생물막은 신호 전달 또는 세포 접착, 쌍극자-쌍극자, H-결합, 정전기, 소수성 상호 작용 및 반 데르 발스(van der Waals)를 통해 표면에 형성될 수 있다. 따라서, 박테리아 부착을 억제하는 능력을 갖는 나노입자의 선택은 유망한 것으로 여겨진다. 박테리아 세포의 광열 절제는 박테리아 감염을 근절하는 효과적인 전략이다. 이러한 맥락에서 연구자들은 광촉매 나노 입자가 세포 신호 및 접착을 억제하여 생물막을 잠재적으로 근절한다고 보고했다.
ZnO, Al2O 및 TiO2를 포함한 여러 나노입자가 잠재적인 항균 및 살생물 활성을 나타내지만 이러한 물질은 건강과 안전에 위험한 영향을 미친다. 이와 관련하여 자성(Fe3O4) 나노 입자는 유망한 항균 활성과 표적 약물 전달 능력을 가진 생물 의학 응용 분야에서 세포 독성이 덜한 것으로 간주된다. 또한 Fe 나노 입자의 독특한 특성은 온열 요법, 조직 복구, 상처 치유 및 병원체 탐지와 같은 잠재적인 분석 활동을 가능하게 한다. 자성 손실과 단분산성으로 인해 Fe 나노 입자의 효율성은 약물 내성 박테리아 병원체를 죽이기에 충분하지 않다. 더욱이, 항생제 또는 기타 유기 물질에 의한 세균성 병원체의 박멸은 치료제에서 도전적이다. 그러므로. 추가적인 특성을 가능하게 하는 Fe 나노입자의 표면 개질은 항균 효율을 향상시킬 것이다.
그러나, 종래에는 이러한 철 나노입자를 제조하는 기술부터 시작하여, 철 나노입자의 표면을 개질하는 기술에 대하여 구체적으로 나타나 있지 않았으며, 상이한 방법을 이용한다 하더라도, 그 효과가 미약하고, 비용대비 생산성이 높지 않다는 문제점이 있었다.
대한민국 등록특허공보 제10-2198915호(2021.01.06.공고), "구리-철 합금의 나노분말을 포함하는 항바이러스 및 항균용 조성물"
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더 자세하게는, 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 포함하는 용액에, 트리코델마 하지아눔 추출물을 가하여 얻어진 철나노입자를, 키토산으로 캡슐화함으로써, 박테리아의 생물막을 파괴하여 항균 효과를 갖도록 한 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 혼합하고 증류수에 녹인 철용액에, 트리코델마 하지아눔 균주를 배양하고 원심분리하고 여과하여 얻어진 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 추출하여 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 용해시키고 교반하여 얻어진 철 나노입자(FeNPs)를, 키토산-TPP용액에 투입하여 얻어진 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs)를 제공한다.
또한, 상기 철용액은 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 1 ~ 99 : 99 : 1의 부피비로 혼합하고 증류수에 녹여 제조되되, 0.1M 수산화나트륨을 이용해 pH가 9 ~ 10으로 조정된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 트리코델마 하지아눔 균주는 PDB 배지에 접종하고 26 ~ 30℃에서 3 ~ 5일간 배양된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 트리코델마 하지아눔 바이오매스는 배양된 트리코델마 하지아눔 균주를 3000 ~ 5000rpm에서 5 ~ 15분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 얻어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 트리코델마 하지아눔 추출물은 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 증류수를 가하고, 26 ~ 30℃에서 160 ~ 200rpm으로 6 ~ 12시간 교반하면서 초음파 처리하여 추출된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 키토산-TPP용액은 키토산을 아세트산에 녹여 제조한 키토산 용액을, 트리폴리인산염을 증류수에 녹여 제조한 TPP용액과, 3 : 1의 부피비로 혼합하여 제조된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 혼합하고 증류수에 녹여 철용액을 제조하는 철용액 제조단계(S10); 트리코델마 하지아눔 균주를 배지에 접종하고 배양하는 배양단계(S20); 상기 배양단계(S20)에서 배양중인 트리코델마 하지아눔 균주를 원심분리하고 여과하여 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하는 바이오매스수집단계(S30); 상기 바이오매스수집단계(S30)에서 수집된 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 추출용매를 가하고 교반하면서 추출하는 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 수득하는 추출단계(S40); 상기 철용액 제조단계(S40)에서 제조된 철용액에 상기 추출단계(S40)에서 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 용해시키고 교반해 철 나노입자(FeNPs)를 수득하여 건조시키는 철 나노입자 수득단계(S50); 키토산을 아세트산에 녹인 키토산 용액을, TPP용액과 혼합하여, 키토산-TPP용액을 제조하는 키토산-TPP 용액 제조단계(S60); 상기 키토산 용액 제조단계(S60)에서 제조된 키토산-TPP용액에 철 나노입자(FeNPs)를 투입하고, 철 나노입자(FeNPs)를 키토산으로 캡슐화하여 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자(CS-Fe NPs)를 제조하는 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 제조단계(S70)를 포함하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 철용액 제조단계(S10)에서는 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 1 ~ 99 : 99 : 1의 중량비로 혼합하고 증류수에 녹여 철용액을 제조하되, 0.1M 수산화나트륨을 이용해 pH를 9 ~ 10으로 조정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 배양단계(S20)에서는 트리코델마 하지아눔 균주를 PDB 배지에 접종하고 26 ~ 30℃에서 3 ~ 5일간 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 바이오매스수집단계(S30)에서는 트리코델마 하지아눔 균주를 3000 ~ 5000rpm에서 5 ~ 15분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 추출단계(S40)에서는 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 증류수를 가하고, 26 ~ 30℃에서 160 ~ 200rpm으로 6 ~ 12시간 교반하면서 초음파 처리하여 트리코델마 하지아눔 추출물을 추출하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 키토산-TPP 용액 제조단계(S60)에서는, 키토산을 아세트산에 녹여 제조한 키토산 용액을, 트리폴리인산염을 증류수에 녹여 제조한 TPP용액과, 3 : 1의 부피비로 혼합하여, 키토산-TPP용액을 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자는 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 포함하는 용액에, 트리코델마 하지아눔 추출물을 가하여 얻어진 철나노입자를, 키토산으로 캡슐화함으로써, 박테리아의 생물막을 파괴하는 등 항균 효과를 갖는다.
도 1은 TEM 분석에 의한 CS-FeNP의 형태학적 관찰 이미지(A)와, CS-FeNPs에 대한 EDS 매핑이미지(철(B), 산소(C), 탄소(D), 병합(E), CS-FeNPs의 EDS 크로마토그램 분석 그래프(F), 내생 트리코더마 추출물(En-TE)에 의해 합성된 Fe NP의 UV-vis 분광광도계 분석 그래프(G), 진동 샘플 자력계(VSM) 분석 그래프(Fe NPs(H), CS-Fe NPs(I)), X선 회절 분석(XRD) 분석 그래프(J); 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 분석 그래프(K) 및, 나노입자에 대한 열중량 분석(TGA) 분석 그래프(L)다.
도 2는 808nm NIR 조사 하에서 CS-Fe NP의 광열 가열 실험에 대한 그래프(5분 동안 2.0 W/cm2(A), 5분 동안 1.5 W/cm2(B))와, 상이한 시간 간격 하에 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저에 대한 CS-Fe NP의 IR 열화상 반응 이미지(C), 5분 동안 2.0 W/cm2에서 CS-Fe NPs(250 μg/mL)의 광열 가열 실험(단일 주기)에 대한 그래프(D), 5회 반복 주기에서 5분 동안 2.0 W/cm2에서 CS-Fe NPs(250 μg/mL)의 광열 안정성을 나타낸 그래프(E), 5분 동안 2.0 W/cm2에서 CS-Fe NPs(250 μg/mL)의 광열 변환 효율을 나타낸 그래프(F) 및, NIR 조사 전후의 CS-Fe NPs의 UV-vis-NIR 스펙트럼 분석 그래프(G)다.
도 3은 CS-FeNP의 안정성 평가에 대한 이미지로써, CS-FeNPs의 TEM 이미지(a)와, CS-FeNPs의 EDS 매핑 이미지(B-E). CS-FeNPs의 EDS 크로마토그램(F), 증류수(DW), PBS 및 10% FBS와 같은 다양한 생물학적 매질에 분산된 CS-FeNPs의 안정성 측정 그래프(14일 후(H), 5분 후(G)), 14일 후의 입자 크기 분석 그래프(Fe NPs(I) 및 CS-FeNPs(J)), 14일 후 Fe NP 및 CS-FeNPs의 제타 전위 분석 그래프(K), CS-FeNPs의 제타 전위에 대한 다양한 pH 버퍼의 영향에 대한 그래프(L)다.
도 4는 HEK 293 세포주에서 NIR 조사가 있거나 없는 나노입자(Fe NP 및 CS-FeNP)의 세포독성을 나타낸 그래프(A)와, AO/EB 및 Rh123 염색 분석 이미지(B), 혈액 적합성에 대한 용혈 분석에 대한 그래프 및 이미지(C, D), Egg CAM에서 NIR 조사가 있거나 없는 나노입자(Fe NPs 및 CS-FeNPs)의 세포독성 분석 이미지(E)다.
도 5는 박테리아 병원체 그람 양성균에 대한 상이한 농도의 나노입자의 항균 활성에 대한 이미지(B. cereus(C) 및 E. coli(D)). 그람 양성균에 대한 억제 영역을 나타낸 그래프(B. cereus(C) 및 E. coli(D)), Fe NPs 및 CS-FeNPs의 세포벽 축적에 대한 주사 전자 현미경 이미지(B. cereus(E), E. coli(F))다.
도 6은 상이한 pH에서 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 다양한 농도의 Fe NPs 및 CS-FeNPs를 처리한 후 박테리아 생존율의 광열 효과를 나타낸 그래프(pH 7.4(A), pH 5.2(B)). 상이한 pH에서 5분 동안 2.0 W/cm2 조사의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 다양한 농도의 Fe NP 및 CS-FeNP를 처리한 후 MHA 플레이트에서 성장한 E. coli 콜로니의 사진(C) 및, BHI 배지로 pH 7.4 및 pH 5.2에서 Fe NPs 및 CS-FeNPs로 처리한 후 E. coli의 CLSM 이미지(D)다.
도 7은 상이한 pH로 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저에서 Fe NPs와 CS-FeNPs를 서로 다른 노출 시간(0-5분)으로 처리한 후 박테리아 생존율에 대한 광열 효과를 나타낸 그래프(pH 7.4(A), pH 5.2). MHA 플레이트에서 성장한 E. coli 콜로니 사진(C), 2.0 W/cm2 조사의 808 nm NIR 레이저로 상이한 노출 시간에서 Fe NPs 및 CS-FeNPs를 처리한 후 E. coli의 CLSM 이미지(D)다
도 8은 두 가지 다른 pH 7.4 및 pH 5.2에서 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 Fe NPs 및 CS-FeNPs를 처리한 후 E. coli 생물막의 CLSM 이미지(A), 생물막 바이오매스 측정 그래프(B). 생물막 두께 측정 그래프(C)다.
도 9는 상이한 pH(pH7.4, pH5.2)에서 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 Fe NP 및 CS-FeNPs를 처리한 후 생물막 표면 적용 범위를 나타낸 그래프(A) 및 E. coli 생물막의 SEM 이미지(B)다.
도 10은 나노 입자 제조 당일 각 나노입자의 입자 크기 및 제타 전위의 DLS 분석을 나타낸 그래프다(Fe NPs(A, B), CS-Fe NPs(C, D).
도 11은 NIR 범위에서 분석된 Fe NPs 및 CS-Fe NPs의 UV-Vis 흡수 스펙트럼그래프다.
도 12는 상이한 pH 및 NIR 조사에 대한 Fe NP 및 CS-FeNPs의 생물막 억제 활성을 나타낸 그래프로써, pH 7.4 및 pH 5.2에서 Bacillus cereus 생물막 억제(A, B). pH 7.4 및 pH 5.2에서 대장균 생물막 억제(C, D)를 나타낸 것이다.
이하의 본 발명에 관한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예의 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당 업자가 본 발명의 실시에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.
따라서 후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명에 따른 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs)에 대하여 자세히 설명한다.
본 발명에 따른 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs)는, 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 혼합하고 증류수에 녹인 철용액에, 트리코델마 하지아눔 균주를 배양하고 원심분리하고 여과하여 얻어진 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 추출하여 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 용해시키고 교반하여 얻어진 철 나노입자(FeNPs)를, 키토산-TPP용액에 투입하여 얻어진 것을 특징으로 한다.
상기 철용액은 염화제1철4수화물(FeCl2·4H2O)과 염화제2철6수화물(FeCL3·6H2O)을 1 ~ 99 : 99 : 1의 중량비로 혼합하고 증류수에 녹여 제조되되, 0.1M의 수산화나트륨을 이용해 pH가 9 ~ 10으로 조정된 것일 수 있다. 이에, 상기 철용액은 염화제1철4수화물이 3mM이 되고, 염화제2철6수화물이 6mM이 되도록 증류수에 녹여 제조된 것일 수도 있다.
상기 트리코델마 하지아눔 균주는 PDB 배지에 접종하고 26 ~ 30℃에서 3 ~ 5일간 배양된 것일 수 있다. 상기 트리코델마 하지아눔(Trichoderma harzianum) 균주는 공시된 균주로서 시중에 유통중이며, 구입을 통해 얻을 수 있다. 한편, 상기 트리코델마 하지아눔 균주는 Trichoderma harzianum(SKCGW008)일 수도 있다(한국생명공학연구원 기탁번호: KCTC18900P)).
상기 트리코델마 하지아눔 바이오매스는 배양된 트리코델마 하지아눔 균주를 3000 ~ 5000rpm에서 5 ~ 15분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 트리코델마 하지아눔 바이오매스는 본 출원인이 임의로 선정한 용어로써, 트리코델마 하지아눔의 배양을 통해 얻어진 균주의 덩어리를 칭한다. 보다 구체적으로, 상기 트리코델마 하지아눔 바이오매스는 배양된 트리코델마 하지아눔 균주를 4000rpm에서 10분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 얻어진 것일 수 있다.
상기 트리코델마 하지아눔 추출물은 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 증류수를 가하고, 28℃에서 180rpm으로 9시간 교반하면서 초음파 처리하여 추출된 것일 수 있다.
상기 키토산-TPP용액은 키토산을 아세트산에 녹여 제조한 키토산 용액을, 트리폴리인산염을 증류수에 녹여 제조한 TPP용액과, 3 : 1의 부피비로 혼합하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 철 나노입자(FeNPs)는 염화제1철4수화물(FeCl2·4H2O)과 염화제2철6수화물(FeCL3·6H2O)을 이용하여 제조된 철 용액에 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 가하고 교반하여 형성된다. 상기 철 나노입자(FeNPs)에는 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)이 캡핑되며, 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)의 캡핑을 통해, 항균능력이 증대된다.
한편, 본 발명에 따른 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs)는 키토산-TPP용액에 철 나노입자(FeNPs)를 투입하고, 3 ~ 5시간 동안 교반하여, 철 나노입자(FeNPs)를 키토산으로 캡슐화한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs)는 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)이 캡핑된 철 나노입자(FeNPs)를 다시 키토산으로 캡슐화한 것을 칭한다.
이하, 본 발명의 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법에 대하여 자세히 설명한다.
본 발명에 따른 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법은 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 혼합하고 증류수에 녹여 철용액을 제조하는 철용액 제조단계(S10)와; 트리코델마 하지아눔 균주를 배지에 접종하고 배양하는 배양단계(S20); 상기 배양단계(S20)에서 배양중인 트리코델마 하지아눔 균주를 원심분리하고 여과하여 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하는 바이오매스수집단계(S30); 상기 바이오매스수집단계(S30)에서 수집된 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 추출용매를 가하고 교반하면서 추출하는 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 수득하는 추출단계(S40); 상기 철용액 제조단계(S40)에서 제조된 철용액에 상기 추출단계(S40)에서 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 용해시키고 교반해 철 나노입자(FeNPs)를 수득하여 건조시키는 철 나노입자 수득단계(S50); 키토산을 아세트산에 녹인 키토산 용액을, TPP용액과 혼합하여, 키토산-TPP용액을 제조하는 키토산-TPP 용액 제조단계(S60); 및 상기 키토산 용액 제조단계(S60)에서 제조된 키토산-TPP용액에 철 나노입자(FeNPs)를 투입하고, 철 나노입자(FeNPs)를 키토산으로 캡슐화하여 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자(CS-Fe NPs)를 제조하는 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 제조단계(S70)를 포함한다.
우선, 철용액을 제조하는 철용액 제조단계(S10)를 수행한다.
상기 철용액 제조단계(S10)에서는 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 혼합하고 증류수에 녹여 철용액을 제조한다.
보다 구체적으로, 상기 철용액 제조단계(S10)에서는 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 1 ~ 99 : 99 : 1의 중량비로 혼합하고 증류수에 녹여 철용액을 제조하되, 0.1M 수산화나트륨을 이용해 pH를 9 ~ 10으로 조정하는 것이 바람직하다.
다음으로, 트리코델마 하지아눔 균주를 배양하는 배양단계(S20)를 수행한다.
상기 배양단계(S20)에서는 트리코델마 하지아눔 균주를 배지에 접종하고 배양한다.
상기 배양단계(S20)에서는 트리코델마 하지아눔 균주를 PDB 배지에 접종하고 26 ~ 30℃에서 3 ~ 5일간 배양하는 것이 바람직하다.
다음으로, 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 제조하는 바이오매스수집단계(S30)를 수행한다.
상기 바이오매스수집단계(S30)에서는 상기 배양단계(S20)에서 배양중인 트리코델마 하지아눔 균주를 원심분리하고 여과하여 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집한다.
상기 바이오매스수집단계(S30)에서는 트리코델마 하지아눔 균주를 3000 ~ 5000rpm에서 5 ~ 15분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하는 것이 바람직하다.
다음으로, 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 제조하는 추출단계(S40)를 수행한다.
상기 추출단계(S40)에서는 상기 바이오매스수집단계(S30)에서 수집된 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 추출용매를 가하고 교반하면서 추출하는 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 수득한다.
상기 추출단계(S40)에서는 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 증류수를 가하고, 26 ~ 30℃에서 160 ~ 200rpm으로 6 ~ 12시간 교반하면서 초음파 처리하여 트리코델마 하지아눔 추출물을 추출하는 것이 바람직하다.
다음으로, 철 나노입자(FeNPs)를 제조하는 철 나노입자 수득단계(S50)를 수행한다.
상기 철용액 제조단계(S40)에서 제조된 철용액에 상기 추출단계(S40)에서 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 용해시키고 교반해 철 나노입자(FeNPs)를 수득하여 건조시킨다.
다음으로, 키토산-TPP용액을 제조하는 키토산-TPP 용액 제조단계(S60)를 수행한다.
상기 키토산-TPP 용액 제조단계(S60)에서는 키토산을 아세트산에 녹인 키토산 용액을, TPP용액과 혼합하여, 키토산-TPP용액을 제조한다.
키토산-TPP 용액 제조단계(S60)에서는, 키토산을 아세트산에 녹여 제조한 키토산 용액을, 트리폴리인산염을 증류수에 녹여 제조한 TPP용액과, 3 : 1의 부피비로 혼합하여, 키토산-TPP용액을 제조하는 것이 바람직하다.
다음으로, 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자(CS-Fe NPs)를 제조하는 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 제조단계(S70)를 수행한다.
상기 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 제조단계(S70)에서는 상기 키토산 용액 제조단계(S60)에서 제조된 키토산-TPP용액에 철 나노입자(FeNPs)를 투입하고, 철 나노입자(FeNPs)를 키토산으로 캡슐화하여 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자(CS-Fe NPs)를 제조한다.
이하, 하기 실시예, 비교예 및 제조예를 통해, 본 발명에 따른 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자가 갖는 효과에 대하여 설명한다.
1. 시료의 준비
1.1. 재료
인간 배아 신장 세포(HEK 293)는 대한민국 서울에 있는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 구입했다. 대장균(ATCC35150) 및 바실러스 세레우스(ATCC 14579)는 American Type of the Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 입수했다. Potato Dextrose Broth(PDB), Mueller-Hinton Agar(MHA), Mueller-Hinton 국물(MHB), Brain Heart Infusion(BHI) 국물은 대한민국 서울의 MB cell에서 입수했다. Tryptone Soya Broth(TSB)는 영국 Hampshire의 Oxoid Ltd에서 입수했다. 한천 분말은 대한민국 경기도에 있는 Daejung Chemical & Metals co.에서 구입했다. 트리폴리포스페이트, FeCl2.4H2O, FeCl3.6H2O, 수산화나트륨, 아크리딘 오렌지(AO), 브롬화에티듐(EB), 로다민 123(Rh123)은 대한민국에 있는 Sigma-Aldrich사에서 입수했다. 세포 생존력 분석 키트(CELLO MAXTM)는 대한민국 MediFab에서 구입했다. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), Penicillin and Streptomycin(P&S), Fetal Bovine Serum(FBS), Phosphate Buffer Saline(PBS), LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit는 대한민국의 ThermoFisher Scientific에서 구입했다. 섬유소가 제거된 양 혈액은 대한민국 서울에 있는 Byeongnra Co., Ltd.에서 입수했다.
1.2. 실시예 1. 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자( CS - Fe NPs)의 제조
하기의 공정에 따라 실시예 1에 따른 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(CS-Fe NPs)를 제조하였다.
철용액 제조단계(S10): 염화제1철4수화물이 3nM이 되고, 염화제2철6수화물이 6mM이 되도록 100mL의 증류수에 녹여 철용액을 제조하되, 0.1M의 수산화나트륨을 이용해 pH를 9.5로 조정하였다.
배양단계(S20): 트리코델마 하지아눔(Trichoderma harzianum(SKCGW008)) 균주를 삼각플라스크 내의 PDB 배지 100mL에 접종하고 28℃에서 4일간 배양하였다.
바이오매스수집단계(S30): 트리코델마 하지아눔 균주를 4000rpm에서 10분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 20g의 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하였다.
추출단계(S40): 트리코델마 하지아눔 바이오매스 20g에 증류수 100mL를 가하고, 28℃에서 180rpm으로 9시간 교반하면서 초음파 처리하여 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 추출하였다. 이때, 회전증발기를 이용하여 35℃에서 농축하였다.
철 나노입자 수득단계(S50): 상기 철용액 제조단계(S40)에서 제조된 철용액100mL에 상기 추출단계(S40)에서 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE) 10mg을 용해시키고 교반해 철 나노입자(FeNPs)를 수득하여 건조시켰다.
키토산-TPP 용액 제조단계(S60): 키토산 10mg을 아세트산(0.5%) 100mL에 50℃에서 4시간 동안 녹여 제조한 키토산 용액과, 트리폴리인산염(TPP)을 증류수에 1mg/mL가 되도록 녹여 제조한 TPP용액을, 각각 75mL, 25mL로 혼합하여, 100mL의 키토산-TPP용액을 제조하였다.
키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 제조단계(S70): 상기 키토산 용액 제조단계(S60)에서 제조된 키토산-TPP용액에 철 나노입자(FeNPs)를 투입하고, 4시간 동안 실온에서 교반하여, 철 나노입자(FeNPs)를 키토산으로 캡슐화하였으며, 수득된 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(CS-Fe NPs)는 증류수로 세척하고, 동결건조하여 밀폐용기에 보관하였다.
1.3. 비교예 1. 철 나노입자( Fe NPs )의 제조
하기의 공정에 따라 비교예 1에 따른 철 나노입자(FeNPs)를 제조하였다.
철용액 제조단계(S10): 염화제1철4수화물이 3nM이 되고, 염화제2철6수화물이 6mM이 되도록 100mL의 증류수에 녹여 철용액을 제조하되, 0.1M의 수산화나트륨을 이용해 pH를 9.5로 조정하였다.
배양단계(S20): 트리코델마 하지아눔(Trichoderma harzianum(SKCGW008)) 균주를 삼각플라스크 내의 PDB 배지 100mL에 접종하고 28℃에서 4일간 배양하였다.
바이오매스수집단계(S30): 트리코델마 하지아눔 균주를 4000rpm에서 10분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 20g의 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하였다.
추출단계(S40): 트리코델마 하지아눔 바이오매스 20g에 증류수 100mL를 가하고, 28℃에서 180rpm으로 9시간 교반하면서 초음파 처리하여 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 추출하였다. 이때, 회전증발기를 이용하여 35℃에서 농축하였다.
철 나노입자 수득단계(S50): 상기 철용액 제조단계(S40)에서 제조된 철용액100mL에 상기 추출단계(S40)에서 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE) 10mg을 용해시키고 교반해 철 나노입자(FeNPs)를 수득하여 건조시켰다.
1.4. 비교예 2. 트리코델마 하지아눔 추출물( En - TE )의 제조
하기의 공정에 따라 비교예 2에 따른 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 제조하였다.
철용액 제조단계(S10): 염화제1철4수화물이 3nM이 되고, 염화제2철6수화물이 6mM이 되도록 100mL의 증류수에 녹여 철용액을 제조하되, 0.1M의 수산화나트륨을 이용해 pH를 9.5로 조정하였다.
배양단계(S20): 트리코델마 하지아눔(Trichoderma harzianum(SKCGW008)) 균주를 삼각플라스크 내의 PDB 배지 100mL에 접종하고 28℃에서 4일간 배양하였다.
바이오매스수집단계(S30): 트리코델마 하지아눔 균주를 4000rpm에서 10분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 20g의 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하였다.
추출단계(S40): 트리코델마 하지아눔 바이오매스 20g에 증류수 100mL를 가하고, 28℃에서 180rpm으로 9시간 교반하면서 초음파 처리하여 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 추출하였다. 이때, 회전증발기를 이용하여 35℃에서 농축하였다.
2. 실험방법
2.1. 특성 분석
실시예 1(CS-Fe NPs) 및 비교예 1(FeNPs) 내지 비교예 2(En-TE)에서 제조된 시료에 대해여 물리적 및 화학적 특성이 측정하였다.
형태 및 원소 분석을 위해, 투과 전자 현미경-에너지-분산 X선 분광법(TEM-EDS; JEOL-JSM 1200EX, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 기능 그룹 변화에 대해 특정하기 위해, 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR; PerkinElmer Paragon 500, USA)이 이용되었다. 자기 특성 분석을 위해 진동 샘플 자력계(VSM; PPMS-14, Quantum Design, USA)를 이용하였다. 결정질 특성에 대해 측정하기 위하여 X선 회절 분석이 이용되었다. 열 안정성을 측정하기 위해 열중량(TGA; TA Instruments, SDT Q600) 분석이 이용되었다. 크기와 제타 전위를 측정하기 위해 동적 광산란(DLS, Zeta potential particle Size Analyzer Malvern, Netherland) 및 전기영동 광산란(ELS) 분석이 이용되었다. UV-vis 분광광도계, TEM-EDS, DLS 및 zeta potential을 이용하여 각 시료의, 다양한 pH, 제조일(0, 14일)에서의 나노입자 반응의 안정성을 확인하였다.
2.2. 광열 효과 측정
실시예 1(CS-Fe NPs) 및 비교예 1(FeNPs)의 NIR 흡수 특성을 테스트했다. 100μg/mL의 각 나노입자를 증류수에 녹이고 Genesys 30S UV-Vis 분광광도계를 사용하여 400-1100 nm 범위의 흡수 스펙트럼을 측정했다. 광열 효과를 측정하기 위해 상이한 농도(0-200μg/mL)의 CS-Fe NPs 1mL를 NIR 레이저(808nm)로 두 가지 다른 전력 밀도(2.0 및 1.5W/cm2) 하에 5분 동안 각각 조사했다. thermocouple을 사용하여 온도 변화를 감지하고, IR 카메라(FLIR Systems Inc., Portland, OR, USA)를 사용하여 thermal IR 이미지를 캡처했다. CS-FeNPs의 광열 안정성은 NIR 레이저 on/off의 5주기에 의해 관찰되었다. 5주기의 레이저 조사 후 CS-FeNP의 광열 안정성은 UV-Vis 분광 광도계와 FE-TEM을 사용하여 평가되었다.
2.3. 독성 분석
2.3.1. 세포독성 시험
실시예 1(CS-Fe NPs) 및 비교예 1(FeNPs)의 세포독성은 WST 세포독성 분석(WST cytotoxicity assay)을 사용하여 NIR 레이저로 노출되거나 노출되지 않은 HEK293 세포에서 테스트되었다. 간단히 말해서, HEK293 세포(1x104)는 37℃에서 24시간 동안 5% CO2 배양기에서, 10% FBS와 1% P&S가 포함된 DMEM 배지 5mL가 담긴 T25 플라스크에서 배양되었다. 세포가 80-90% confluence에 도달한 후 trypsinization을 사용하여 세포를 수확하고 세포 농도를 1x104로 조정했다. 100μL/well의 세포(1x104)를 96웰 플레이트에 파종하고 37℃에서 24시간 동안 5% CO2 인큐베이터에 두었다. 그 후, 상이한 농도(0-300 μg/mL)의 FeNPs와 Fe-CS NPs 10 μL를 각각의 웰에 첨가했다. 처리된 세포에 5분 동안 2.0 W/cm2의 전력 밀도에서 NIR 레이저(808 nm)를 조사하거나 조사하지 않았다. 그 후, 세포를 4시간 동안 CO2 인큐베이터에 두었다. 그런 다음, 10 μL의 WST 시약(WST reagent)을 첨가하고 세포 생존율 측정을 위해 인큐베이터에서 45분 동안 보관했다. 마지막으로 450 nm에서 흡광도를 관찰하여 세포 생존율을 계산하였다.
2.3.2. 용혈 테스트
실시예 1(CS-Fe NPs) 및 비교예 1(FeNPs)의 용혈 활성은 약간 변형된 다른 곳에서 보고된 방법에 따라 양 혈액(sheep blood, Carlina, Korea)을 통해 테스트되었다. 1mL의 혈액을 10mL의 PBS에 용해시켰다. 그런 다음 4℃에서 15분간 2000rpm으로 원심분리하여 적혈구를 분리하고 PBS(pH.7.4)로 3회 세척하였다. 분석을 위해, 200μL의 RBC(4% v/v)와, 다양한 농도(10-250μg/mL)의 Fe NPs 또는 CS-Fe NPs 400μL를 추가하고 37℃에서 45분 동안 배양했다. 처리 후, 샘플에 5분 동안 NIR 레이저(808 nm)를 조사하거나 조사하지 않았다. 그런 다음 4℃에서 15분 동안 2000rpm으로 원심분리했다. 상부층을 채취하고 UV 분광광도계를 이용하여 545 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 분석에서 Triton X-100 및 PBS 1%(v/v)가 각각 양성 및 블랭크 대조군으로 간주되었다. 용혈(%) = (시험/대조군) x 100.
2.3.3. Chick egg CAM 분석
병아리 배아에서의 실시예 1(CS-Fe NPs) 및 비교예 1(FeNPs)의 효과는 생체내 병아리 배아 융모막요막(CAM) 분석에 의해 측정되었다. 배의 발달을 위해 수정란을 적절한 습도(60%)와 온도(37℃)에서 9일 동안 부화시켰다. 그런 다음 70% 에탄올을 사용하여 계란 표면을 소독하고 CAM을 손상시키지 않고 계란 껍질을 조심스럽게 제거했다. 그런 다음 200μL의 각 CS-Fe NPs 및 FeNPs(200μg/mL)를 각 난자 배아에 첨가하고 실온에서 5분 동안 방치했다. 이 분석에서 PBS 및 1M NaOH는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용되었다. NPs를 통해 유도된 배아 변화(혈관 손상 및 출혈)가 기록되었다.
2.4. 체외 항균 활성 스크리닝
실시예 1(CS-Fe NPs) 및 비교예 1(FeNPs)의 체외 항균 활성은 E. coli와 B. cereus에서 well 확산 분석을 통해 테스트되었다. 박테리아 균주는 simple streaking method에 의해 20%의 글리세롤 스톡으로부터 회수되었다. 그 다음, 각 박테리아 균주의 단일 콜로니를 5mL의 MHB가 있는 15mL 튜브에 접종하고 37 ± 1℃의 인큐베이터에서 24시간 동안 유지했다. 한편, MHA 플레이트(9 mm), 항생제(테트라사이클린)용액(20 μg/mL) 및 상이한 농도(0-200 μg/mL)의 나노입자를 분석을 위해 준비하였다. 24시간 경과 후, MHA 플레이트에 각각의 박테리아 균주를 페인팅하고, metal corer를 사용하여 웰을 만들었다. 그런 다음, 50 μL의 항생제(테트라사이클린) 용액(20 μg/mL)과 다른 농도(50-200 μg/mL)의 나노입자를 각 웰에 첨가하고 37 ± 1 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 억제 영역이 측정되었다. 그 후, MIC, MBC는 NIR 조사 유무와 상관없이 배지의 두 가지 다른 pH(7.4 및 5.2)에서 미세희석법(microdilution method)에 의해 측정되었고, 나노입자의 세포 축적은 SEM 하에서 관찰되었다.
2.4.1. 생물막 억제를 위한 크리스탈 바이올렛 분석
나노입자의 항생물막 효과는 분광광도계를 사용하여 808 nm NIR을 조사하거나 조사하지 않은 상이한 pH(7.4 및 5.2)에서 평가되었다. 10 μL의 박테리아 현탁액(OD:0.5)을 190 μL의 TSB를 포함하는 96-웰 플레이트의 웰에 접종하고 37 ± 1 ℃에서 72시간 동안 유지했다. 그 후, residual media, planktonic, non-adhering, 및 biofilm을, 신선한 TSB(pH 5.2 및 7.4)에서 37 ± 1℃로 4시간 동안, 상이한 농도(0-300μg/mL)를 갖는 Fe NPs 또는 CS-Fe NPs와 함께 배양했다. 그 다음, 처리된 생물막은 15분 동안 NIR 조사(808 nm, 2.0 W/cm2)에 노출되거나 노출되지 않았다. 그 다음 다시 37 ± 1 ℃에서 4시간 동안 배양했다. 그런 다음, planktonic 및 non-adhering 세포를 차가운 PBS(1 x)로 3회 세척하여 60℃에서 20분 동안 건조시켰다. 96 웰 플레이트에서 생성된 생물막을 15분 동안 크리스탈 바이올렛(0.1% w/v)으로 염색했다. 잔류 얼룩은 증류수를 사용하여 반복적으로 세척하여 제거하고 200μL의 아세트산(30% v/v)에 용해시켰다. 마지막으로 생물막 억제(%) 계산을 위해 광학 밀도를 595 nm에서 기록하였다.
2.4.2. 세균 생존력 분석
박테리아 생존 측면에서 대장균 생물막에 대한 나노 입자 처리 및 NIR 조사의 효과가 측정되었다. 생물막은 4시간 동안 37 ± 1℃에서 상이한 농도(0-200 μg/mL)의 Fe NPs 또는 CS-Fe NPs와 함께 TSB 배지의 두 가지 다른 pH(5.2 및 7.4)에서 배양되었다. 그 후, 세포에 NIR 레이저(808 nm; 2.0 W/cm2)를 다른 시간 간격(0-5분)으로 조사하거나 조사하지 않았다. 조사 후, 박테리아 현탁액을 와류(vortexing) 및 초음파 처리(sonication) 중인 배지를 통해 PBS에서 희석(106 CFU/mL)하였다. 50 μL의 희석된 박테리아 용액을 TSA 플레이트에 뿌린 다음 밤새 37 ± 1 ℃에서 유지했다. 마지막으로, 박테리아 콜로니를 계수하였다. cell viability는 LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit에 의해 계산되었다.
2.4.3 생물막 제거의 CLSM 분석
50㎕/웰의 E. coli 현탁액을 5mL의 BHI를 함유하는 24웰 플레이트에 접종하였다. 그 다음 유리 커버슬립(1.5 x 1.5 cm)을 웰에 수직으로 놓고 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 생물막을 BHI(pH 5.2 및 7.4) 배지에서 200㎍/mL의 Fe NPs 또는 CS-FeNPs와 함께 37 ± 1℃에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 생물막에 NIR 레이저(808 nm; 2.0 W/cm2)를 5분 동안 조사하거나 조사하지 않은 채로 인큐베이터에서 4시간 동안 유지했다. 인큐베이션 후 유리 커버슬립을 무균적으로 수집하고 차가운 PBS(1 x)로 세척하여 planktonic 및 non-adhering 세포를 제거했다. 그 다음 커버슬립을 30분 동안 공기 건조하고 LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit로 염색하고 CLSM에서 관찰했다.
biofilm thickness와 biomass는 ZEN 2 및 image J 1.8.0_172 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/download.html)를 사용하여 계산되었다.
2.4.4. 생물막 제거의 SEM 관찰
생물막은 metal grid(2 x 2 cm)에서 확인되었다. 샘플 처리 및 NIR 조사는 섹션 2.4.3에 설명된 대로 수행되었다. 처리 후, 생물막을 포함하는 금속 토큰을 PBS(pH 7.2)에서 글루타르알데히드(2%) 및 파라포름알데히드(2%)로 4℃에서 4시간 동안 고정했다. 이후 상온에서 10분간 멸균수로 세척하였다. 그 다음, 생물막을 헥사메틸디실라잔에 40분 동안 넣고 공기 건조시켰다. 이어서 E-1010 이온 스퍼터(HITACHI, Japan)를 사용하여 30초간 금도금하고 3kV에서 SUPRA 55VP-SEM(ZEISS, Germany)을 사용하여 이미지를 획득했다. 생물막 표면적(%)은 Image J 1.8.0_172 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
2.5. 통계 분석
기술통계, 표본 간 차이는 ANOVA(p<0.01; p<0.05)로 분석하였고, 그래프는 OrginPro V. 8.5, SPSS v.16.0 및 Microsoft Excel 365를 이용하여 작성하였다. 각 실험은 최소 3회 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SE(표준 오차)로 표시된다.
3. 실험 결과
3.1. Fe NPs 및 CS - FeNPs의 특성
Fe NPs 및 CS-Fe NPs에 대한 특성을 확인하였다.
도 1은 TEM 분석에 의한 CS-Fe NPs의 형태학적 관찰 이미지(A)와, CS-Fe NPs에 대한 EDS 매핑이미지(철(B), 산소(C), 탄소(D), 병합(E), CS-FeNPs의 EDS 크로마토그램 분석 그래프(F), 내생 트리코더마 추출물(En-TE)에 의해 합성된 Fe NP의 UV-vis 분광광도계 분석 그래프(G), 진동 샘플 자력계(VSM) 분석 그래프(Fe NPs(H), CS-Fe NPs(I)), X선 회절 분석(XRD) 분석 그래프(J); 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 분석 그래프(K) 및, 나노입자에 대한 열중량 분석(TGA) 분석 그래프(L)다. 한편, 도 10은 나노 입자 제조 당일 각 나노입자의 입자 크기 및 제타 전위의 DLS 분석을 나타낸 그래프다(Fe NPs(A, B), CS-Fe NPs(C, D)).
투과 전자 현미경 이미지는 두 나노 입자가 응집된 구형 나노 입자로 Fe NPs의 경우 평균 크기가 18.35 ± 2.51nm이고 CS-FeNPs의 경우 29.62 ± 1.25nm인 것으로 나타났다(도 1A). 키토산의 캡슐화로 인해 CS-Fe NPs의 크기가 Fe NPs보다 약간 더 큰 것으로 나타났다. EDS 결과는 Fe NPs에서 Fe(100%)의 존재를 보여준 반면, CS-Fe NPs는 탄소(36.56%), Fe(38.23%) 및 산소(25.2%)를 나타냈다(도 1B). TEM 이미지에서는 키토산 캡슐화 산화철 나노입자가 구형으로 나타났다. 또한, Cs-Fe 나노입자의 키토산 농도는 261.52±2.05 μg/mg으로 측정되었다. Cs-Fe NPs의 키토산 수준은 이온 겔화 방법을 통해 기인한 철의 pH 반응 방출에 가장 적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 생합성을 통한 Fe NPs의 자기 조립으로 인해 나노 입자 사이의 응집이 관찰되었다. 나노입자의 크기는 합성 방법의 영향을 받지 않고 나노입자의 응집 상태에 영향을 미칠 수 있다는 점에 주목해야 한다. FE NPs의 UV 스펙트럼은 산화철 나노입자의 형성의 iron salt reduction으로 인해 350-400 범위의 흡수 피크를 나타내었다(도 1G).
진동 샘플 자력계(vibrating sample magnetometer, VSM)는 FeNPs의 경우 1.35 emu/mg, CS-Fe NPs의 경우 0.115/mg emu의 saturation magnetization(Ms) 값을 보여주었다. 이러한 결과는 키토산의 캡슐화가 CS-Fe NPs의 cationic 및 magnetic surface 혼란으로 인해 Fe NP에 비해 Ms를 감소시킨다는 것을 나타낸다. XRD 분석은 Fe NP의 경우 120, 220, 311, 111, 051, 422, 511, 132, 440, 533에서 평면을 나타냈지만 220, 311, 400, 511, 440 및 533의 평면을 보여주었다(도 1J). 나노입자의 결정 크기(τ)는 Scherrer 방정식을 사용하여 계산되었으며 결과는 Fe NPs 및 CS-Fe NPs에 대해 각각 2.31±0.26 nm 및 5.76±0.12 nm의 결정 크기를 나타냈다. Fe NPs와 Cs-Fe NPs의 크기는 XRD가 나노입자의 결정 크기를 측정하기 때문에 TEM 분석에서 측정한 크기보다 작은 것으로 밝혀졌는데, 이는 종래의 연구와 일치하는 것이다. 이어서 Fe NPs 및 CS-Fe NPs의 XRD 패턴을 회절 표준 JCPDS 00-039-1346(maghemite) 및 JCPDS 00-019-0629(magnetite)와 비교한 결과, 해당 나노입자들이 자철광 구조적 특성(magnetite structural properties)를 갖는 것으로 확인되었다. 그 다음, Fe NPs의 유체역학적 크기는, -22.8mV의 제타 전위를 갖는 116.5nm인 반면(도 10 A-B), CS-Fe NPs의 유체역학적 크기는, 10.8mV의 제타 전위를 갖는 135.1nm 였다(도 10 C-D).
도 1K는 En-TE, FE NPs 및 CS-Fe NPs의 FTIR 스펙트럼을 보여준다. En-TE의 IR 스펙트럼은 트리코더마 추출물에 수산기/카르복실(3278 and 1376 cm-1), 아미드/아민(2923, 2854, 1649, 1152, 1244, and 1023 cm-1), δ-락톤(1743 cm-1), C-H bending(895 cm-1) 및 니트로 화합물(1545 cm- 1)의 존재를 나타낸다.
한편, Fe NPs는 IR 피크가 3285, 2922, 2853, 1741, 1648, 1555, 1376, 1258, 1151, 1026, and 891 cm-1에서 약간 이동되어 En-TE와 유사했으며, 이는 En-TE에 포함되는 단백질, 카르복실/히드록실, 휘발성 화합물 및 니트로 화합물이 Fe NPs에 캡핑되었음을 나타낸다. 이러한 결과는 Fe NPs에 대한 En-TE의 캡핑을 입증한다. 한편, Fe NPs는 Fe의 특징적인 피크로 간주되는 558에서 피크를 가졌다.
한편, CS-Fe NPs는 3270, 2921, 2852, 1743, 1648, 1551, 1376, 1308, 1154, 1026, 874, 627, 569 cm-2에서 En-TE 및 Fe NPs와 유사한 특징적 피크를 보였으며, 이는 TPP 이온 겔화 방법을 통해 키토산이 성공적으로 코팅되었음을 나타낸다. 또한, FeO의 특성 피크는 Fe NPs와 비교하여 558 cm-1 에서 569 cm-1로 크게 이동하여, CS-Fe NPs의 키토산 코팅을 나타내었다. 키토산의 특징적인 피크(891 cm- 1)는 캡핑으로 인해 CS-Fe NPs에서 넓어졌다(870-891 cm-1).
TGA 분석을 통해 Fe NPs 및 Cs-FeNPs의 열 안정성을 측정할 수 있었다(도 1L). 온도 상승에 따른 중량 감소 반응은 Fe NPs에 비해 CS-Fe NPs에서 더 높게 나타났다. Cs-Fe NPs는 세 가지 다른 단계에서 중량 감소를 나타냈다.
3.2. Cs - Fe NPs의 광열 효과 및 안정성
Fe NPs 및 CS-Fe NPs에 대한 광열 효과 및 안정성을 확인하였다.
도 2는 808nm NIR 조사 하에서 CS-Fe NP의 광열 가열 실험에 대한 그래프(5분 동안 2.0 W/cm2(A), 5분 동안 1.5 W/cm2(B))와, 상이한 시간 간격 하에 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저에 대한 CS-Fe NP의 IR 열화상 반응 이미지(C), 5분 동안 2.0 W/cm2에서 CS-Fe NP(250 μg/mL)의 광열 가열 실험(단일 주기)에 대한 그래프(D), 5회 반복 주기에서 5분 동안 2.0 W/cm2에서 CS-Fe NP(250 μg/mL)의 광열 안정성을 나타낸 그래프(E), 5분 동안 2.0 W/cm2에서 CS-Fe NP(250 μg/mL)의 광열 변환 효율을 나타낸 그래프(F) 및, NIR 조사 전후의 CS-Fe NP의 UV-vis-NIR 스펙트럼 분석 그래프(G)다.
도 3은 CS-FeNP의 안정성 평가에 대한 이미지로써, CS-FeNP의 TEM 이미지(a)와, CS-FeNP의 EDS 매핑 이미지(B-E). CS-FeNPs의 EDS 크로마토그램(F), 증류수(DW), PBS 및 10% FBS와 같은 다양한 생물학적 매질에 분산된 CS-FeNPs의 안정성 측정 그래프(14일 후(H), 5분 후(G)), 14일 후의 입자 크기 분석 그래프(Fe NPs(I) 및 CS-FeNPs(J)), 14일 후 Fe NP 및 CS-FeNP의 제타 전위 분석 그래프(K), CS-FeNPs의 제타 전위에 대한 다양한 pH 버퍼의 영향에 대한 그래프(L)다.
NIR 범위에서 Fe NPs 및 CS-Fe NPs의 UV-Vis 흡수 스펙트럼 분석 결과, CS-Fe NPs가 750-850 nm에서 더 높은 흡광도를 나타냈으며 이는 NIR wavelength range에 대한 CS-Fe NPs의 positive response를 나타낸다(도 11). 더 나은 NIR response와 promising photothermal conversion efficiency은 PTA 개발에 중요한 요소다. 따라서 CS-Fe NPs의 광열변환 특성을 평가하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 광열 특성을 분석하기 위해, 농도가 상이한 CS-Fe NPs에 두 가지 전력 밀도(2.0 및 1.5 W/cm2)로 NIR 레이저(808 nm)를 조사했다(도 2A 및 B). Cs-Fe NPs의 광열 효과는 powder densities, time intervals 및 concentration-dependent manner에 따라 크게 증가했다. 이와 유사하게, 종래 연구에서는 온도의 증가가 나노입자의 전력 밀도 및 농도와 관련이 있다고 보고된 바 있다. CS-Fe NPs(200μg/mL)는 NIR(808nm, 1.5W/cm2)에 비해 NIR(808nm, 2.0W/cm2) 조사에서, 온도 증가 측면(>55℃)에 있어 더 높은 광열 효과를 나타냈다. 상이한 time intervals에서 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저에 반응한 CS-Fe NP의 IR 열화상을 얻었으며, CS-FeNP(200 μg/mL)는 NIR(808nm; 2.0 W/cm2)에서 5분 동안 조사할 때 더 높은 온도 상승(>55℃)을 나타냈다(도 2 C,D). 광열 변환 효율(η)은 CS-Fe NP의 경우 21.53%였다(도 2F). CS-Fe NPs의 계산된 η는 dopamine quantum dots, gold nanoshells, nanorods, FePt NPs와 같이 종래에 보고된 광열 작용제(PTA)들의 η와 비슷했다. 또한, 광열 안정성은 레이저 on/off 단계의 5주기로 측정되었으며, 그 결과 Cs-Fe NPs는 광열 특성이 일정하고 안정적인 것으로 나타났다(도 2E). 한편, Cs-Fe NPs는 color 또는 UV-vis absorption spectrum에서 유의미한 변화를 나타내지 않았으며, 이는 NIR 조사 전후의 안정성을 나타낸다(도 2G). 또한, TEM 이미지는 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저 조사 전후에 CS-Fe NPs의 형태에 유의미한 변화가 없음을 보여주었다. 근적외선 조사 후, Cs-Fe NPs의 크기는 27.18 ± 1.03nm로 나타났으며, 이는 근적외선 조사 전 TEM 이미지로 측정한 크기와 유사하다. 이러한 결과는 CS-Fe NPs가 광열 치료에 이상적인 PTA로 작용할 수 있음을 나타낸다.
또한, CS-Fe NPs의 안정성은 증류수, PBS(pH 7.2) 및 FBS(10%)를 포함한 다양한 생물학적 매질에서 UV vis 스펙트럼 분석을 통해 두 가지 상이한 간격(5분 및 14일)으로 테스트되었다. CS-Fe NPs는 상이한 생물학적 용액 및 저장 시간에 상응하는 UV 흡수에 있어서, 유의한 변화를 나타내지 않았다(도 3G 및 H). 또한, Fe NPs의 크기는 -25.16 mV의 제타 전위를 갖는 114.47 ± 0.20 nm인 반면, 14일 보관 후 CS-Fe NPs의 경우 제타 전위가 34.32 mV인 138.12 ± 0.29였다(도 I, J 및 K ). 이러한 결과는 CS-Fe NPs의 물리적, 화학적 특성이 증류수, PBS(pH 7.2) 및 FBS(10%)를 포함한 다양한 생물학적 매질에서도 14일 동안 안정적임을 보여주었다. 한편, 상이한 pH가 Cs-Fe NPs와 Fe NPs의 제타 전위에 미치는 영향을 측정한 결과 Fe NPs의 경우 등전점이 pH 7.1인 반면 CS-Fe NPs의 경우 pH 7.7인 것으로 나타났다(도 3L). Fe NPs와 CS-Fe NPs의 제타 전위는 아미노기의 양성자화로 인해 낮은 pH에서는 양(+)인 반면 알칼리성 pH에서는 음(-)인 것으로 밝혀졌다.
3.3. 독성 연구
Fe NPs 및 CS-Fe NPs에 대한 세포독성을 확인하였다.
도 4는 HEK 293 세포주에서 NIR 조사 또는 비조사 나노입자(Fe NPs 및 CS-Fe NPs)의 세포독성을 나타낸 그래프(A)와, AO/EB 및 Rh123 염색 분석 이미지(B), 혈액 적합성에 대한 용혈 분석에 대한 그래프 및 이미지(C, D) 및, Egg CAM에서 NIR 조사가 있거나 없는 나노입자(Fe NP 및 CS-FeNP)의 세포독성 분석 이미지(E)다. 오차 막대는 표준 오차(n=3), *p<0.05, **p<0.01 농도와 샘플 사이에 유의미함을 나타낸다.
3.3.1. Cytotoxicity
Fe NPs 및 CS-Fe NPs의 광열 효과 유도 세포독성은 HEK293 세포에서 standard WST assay를 사용하여 테스트되었다. 세포 생존율은 나노입자의 종류, NIR 조사, 나노입자의 농도에 따라 약간의 영향을 받았다(p<0.05; 도 4A). WST 분석은 808 레이저 조사 없는 Fe NPs 및 Cs-Fe NPs의 처리(150 μg/mL)가 HEK293 세포의 세포 생존율이 90%를 나타내는 반면, NIR 조사와 함께 5분 동안 각 나노입자를 처리한 결과, Fe NPs의 경우 62.12%, CS-Fe NPs의 경우 58.32%로 상당한 세포 독성이 발생함을 보여주었다(도 4A). AO/EB 및 Rh123 염색 분석은 CS-Fe NPs 및 Fe NPs의 광열 효과로 인한 세포 주의 분산을 관찰하면서 808 nm 레이저 조사 없이 기록된 유의한 세포독성이 없음을 확인하였다(도 4B). 이러한 결과는 Fe NPs와 C-Fe NPs의 광열 특성을 강력하게 나타냈다.
3.3.2. 용혈
용혈 활성은 근적외선 조사, 나노입자 농도에 따라 유의하게 증가하였다(p<0.05). 50-100 μg/mL 농도 범위의 Fe NPs 또는 CS-Fe NPs로 처리된 적혈구는 용혈 활성을 나타내지 않았으나, 150-250 μg/mL의 더 높은 농도에서는 증가된 용혈 활성을 나타냈다(도 4C 및 D). 또한, Fe NPs(250 μg/mL)는 근적외선 조사에서 CS-Fe NPs(250 μg/mL)보다 더 높은 용혈 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 NIR 조사 유도 광열 특성으로 인해 더 높은 농도에서 CS-Fe NPs의 혈액 세포에 대한 독성을 입증한다. 이와 유사하게, 종래의 연구에서는 NIR 조사 반응성 용혈 활성이 보고된 바 있다.
3.3.3. 계란 CAM 어셈블리.
CAM 분석은 다양한 생리 활성 분자 및 화학 요법 약물의 독성을 결정하는 데 자주 적용된다. 세균 박멸 또는 생물의학 적용을 위한 잠재적인 PTA는 비독성 물질이어야 한다. 따라서 Fe NPs와 Cs-Fe NPs의 독성 효과를 egg CAM assay로 조사하였다. 도 4E에 나타난 바와 같이, 두 나노입자는 NaOH(1M) 처리와 비교할 때 200㎍/mL의 농도에서도 egg CAM에 명백한 독성 효과(출혈, 충혈 및 응고)를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 Fe NPs 및 CS-Fe NPs의 비 세포독성 특성을 입증했다.
3.4. 체외 항균 활성
Fe NPs와 CS-Fe NPs의 체외 항균 활성을 확인하였다.
도 5는 박테리아 병원체 그람 양성균에 대한 상이한 농도의 나노입자의 항균 활성에 대한 이미지(B. cereus(C) 및 E. coli(D)). 그람 양성균에 대한 억제 영역을 나타낸 그래프(B. cereus(C) 및 E. coli(D)), Fe NP 및 CS-FeNP의 세포벽 축적에 대한 주사 전자 현미경 이미지(B. cereus(E), E. coli(F))다. 오차 막대는 표준 오차(n=3), *p<0.05, **p<0.01 저농도 및 샘플에 비해 유의함을 나타낸다. 노란색 화살표는 나노 입자의 축적을 나타낸다.
Fe NPs와 CS-Fe NPs의 체외 항균 활성은 well diffusion으로 평가되었고 두 가지 박테리아 병원체(B. cereus 및 E. coli)에 대한 최소 억제 농도(MIC)와 최소 살균 농도(MBC)를 측정하기 위해 microdilution assay가 수행되었다. 결과는 두 나노입자 모두 표적 병원체에 대해 용량 의존적 항균 활성을 나타내었지만, 양성자화된 형태의 키토산이 항균 활성을 향상시켰기 때문에 Fe NPs보다 CS-Fe NPs에서 비교적 더 높은 항균 활성이 관찰되었다. CS-Fe NPs는 electrostatic attraction으로 인해 박테리아(G+)보다 박테리아(G-)에서 비교적 높은 활성을 나타냈다. 종래의 연구에서 키토산으로 코팅된 산화철 나노 입자의 더 높은 박테리아 억제 효율은 키토산의 양이온성 표면 전하와 박테리아의 음이온성 세포막의 상호 작용에 기인한다는 것이 입증된 바 있다. 이러한 사항은 다른 처리에 비해 CS-Fe NPs로 처리된 대장균 세포에 더 높은 농도의 나노입자가 축적되었음을 SEM 분석에 의해 발견함으로써, 입증되었다(도 5E 및 F).
한편, 하기 표 1은 5분 동안 808 NIR 레이저 조사의 유무에 관계없이 B. cereus 및 E. coli의 항균 활성에 대한 FeNPS 및 CS-FeNPs의 MIC 및 MBC로써, 결과는 평균 ± SE로 표시된다(n=3).
Samples
(μg/mL)		 pH NIR Bacillus cereus E. coli
MIC MBC MIC MBC
FeNPs 7.4 - 125.12±0.74 - 132.95±0.14 -
+ 116.06±0.95 - 114.15±0.62 -
5.2 - 118.01±1.51 - 133.56±0.14 -
+ 93.21±0.12 - 105.54±1.52 -
CS-FeNPs 7.4 - 72.17±0.25 310.61±1.14 107.14±1.98 270.62±2.45
+ 68.12±0.75 300.45±0.62 54.10±2.03 242.14±1.85
5.2 - 54.02±1.05 285.89±0.14 48.53±0.52 231.12±3.25
+ 41.26±2.01 253.14±0.85 32.39±1.21 216.15±0.95
808 nm에서 레이저 조사 여부에 따른, Fe NPs와 CS-Fe NPs의 박테리아에 대한 MIC 및 MBC(G+/G-)가 측정되었다(표 1). MIC 및 MBC는 Fe NPs와 CS-Fe NPs의 처리에 따라서, 그리고, pH(5.2 및 7.4) 및 NIR 조사 유무(p<0.05)에 따라서 다양하게 나타났다. 낮은 MIC 값은 높은 박테리아 억제 활성을 나타낸다. pH 5.2 및 NIR (808 nm 2.0 W/cm2) 조사 하에서, CS-Fe NPs는 B cereus에 대해 41.26 ± 2.01 μg/mL의 MIC, E coli에 대해 32.39±1.21 μg/mL의 MIC를 나타내는 반면, Fe NPs는 B cereus에 대해 93.21±0.12 μg/mL의 MIC, E coli에 대해 105.54±1.52 μg/mL의 MIC를 나타냈다. 해당 MIC 값은 다른 모든 처리 및 NIR 조사에 비해 낮았습니다. photothermal bacterial cell distraction을 통해 CS-Fe NPs가 pH 5.2에서 Fe NPs보다 더 높은 항균 활성을 나타냄을 나타내었으며, 이는 표 1에 표시된 CS-Fe NP의 낮은 MIC 및 MBC 값으로 입증되었다. CS-Fe 나노입자의 NIR-mediated antibacterial activity는 박테리아 세포에서 Fe 나노입자의 electrostatic attraction 및 pH response release를 통해 나타났다. 또한, CS-Fe NPs의 높은 안정성은 상이한 pH에서 Fe NPs에 비해 더 높은 항균 활성을 갖는 결과를 가져왔다. 한편, 종래의 연구에서는 키토산의 항균 활성은 배지의 pH와 관련이 있으며 pH 6-7에서 키토산 처리로 기록된 활성이 더 적다는 것이 밝혀진 바 있다.
3.4.1. 생물막 억제
다양한 농도의 Fe NPs 및 CS-Fe NPs 처리에 따른 Biofilm inhibition 효과는, NIR 조사군 및 비조사군에 대해, 상이한 pH로, 박테리아 세포(G+ 및 G-)에 대한 plate colony counting method에 의해 평가되었다.
도 6은 상이한 pH에서 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 다양한 농도의 Fe NP 및 CS-FeNP를 처리한 후 박테리아 생존율의 광열 효과를 나타낸 그래프(pH 7.4(A), pH 5.2(B)), 상이한 pH에서 5분 동안 2.0 W/cm2 조사의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 다양한 농도의 Fe NPs 및 CS-Fe NPs를 처리한 후 MHA 플레이트에서 성장한 E. coli 콜로니의 사진(C) 및, BHI 배지로 pH 7.4 및 pH 5.2에서 Fe NPs 및 CS-Fe NPs로 처리한 후 E. coli의 CLSM 이미지(D)다. 오차 막대는 표준 오차(n=3)를 나타내며, 샘플 간에 유의한 **p<0.01다.
spectrophotometric assay 결과는 생물막 억제가 Fe NPs 또는 CS-Fe NPs의 처리, 상이한 pH(7.4 및 5.2), 세균의 종류(G+ 및 G-), 및 NIR 처리(조사군 또는 비조사군(NIR+ 또는 NIR-))에 따라 다양함을 보여주었다(p<0.05). CS-Fe NPs는 (G+) B. cereus에 대한 용량, pH 및 NIR 조사 의존적으로 생물막 억제 활성을 나타냈다(도 13 A 및 B). CS-Fe NPs(300μg/mL)의 처리는 NIR 조사군에서 pH 7.4(54.83 ± 0.84%)에 비해 pH 5.2(73.35 ± 1.26%)에서 더 높은 B. cereus 생물막 억제를 나타내는 것으로 관찰되었다. 유사하게, E. coli 생물막의 경우, CS-Fe NPs(300 μg/mL)는 NIR 조사군에서 pH 7.4(56.25 ± 2.32%)에 비해 pH 5.2(86.45 ± 0.85%)에서 더 높은 억제를 나타내었다(도 13 C 및 D). 그러나 NIR 비조사군에 있어, 두 나노 입자는 각각 pH 7.4 및 5.2에서 B. cereus에 대해 <25 및 < 40%의 생물막 억제 활성을 나타내지 않았다(도 13A 및 B). pH 7.4 및 5.2에서 각각 대장균에 대한 생물막 억제 활성은 약 <40% 및 <60%였다(도 13C 및 D). 그러나 pH 및 근적외선 조사를 포함한 다양한 조건 중에서 CS-Fe NPs(300 μg/mL)는 pH 5.2에서 근적외선 조사 하에 두 세균성 병원체(G+/G-)에 대해 더 높은 생물막 억제 활성을 나타냈다. 그러나 세균성 병원체의 경우 G-박테리아 생물막은 다른 처리에 비해 CS-FeNPs(NIR+)에 의해 크게 억제되었다. G+ 박테리아보다 G- 박테리아에 대한 높은 수준의 G- 박테리아 생물막 억제는 높은 수준의 CS-Fe NP 축적으로 인한 것일 수 있다. 또한, Fe의 pH 반응성 방출은 박테리아 세포를 죽이기 위해 빛 에너지를 열 에너지로 전환하는 데 도움이 된다.
3.4.2. 세균 생존력
Fe NPs 및 CS-Fe NPs의 Bacterial viability를 확인하였다.
도 7은 상이한 pH로 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저에서 Fe NP와 CS-FeNP를 서로 다른 노출 시간(0-5분)으로 처리한 후 박테리아 생존율에 대한 광열 효과를 나타낸 그래프(pH 7.4(A), pH 5.2). MHA 플레이트에서 성장한 E. coli 콜로니 사진(C), 2.0 W/cm2 조사의 808 nm NIR 레이저로 상이한 노출 시간에서 Fe NP 및 CS-FeNP를 처리한 후 E. coli의 CLSM 이미지(D)다. 오차 막대는 표준 오차(n=3)를 나타내며, 샘플 간에 유의한 **p<0.01다.
박테리아(G-) E. coli에 대한 상이한 농도의 Fe NPs 및 CS-Fe NPs 처리 효과는 plate colony counting method에 의해 근적외선 조사군 또는 비조사군에 대해 두 가지 상이한 pH로 평가되었다. 도 6A 및 B에 나타난 바와 같이, 세포 생존율은 나노입자, pH 및 농도에 따라 유의하게 변화하였다(p<0.05). NIR 조사(5분)와 함께 동반되는 CS-Fe NPs(200μg/mL)의 처리는 pH 7.4에서 39.15 ± 1.56 및 pH 5.2에서 1.44 ± 0.26으로 더 적은 세포 생존력을 나타냈다. 이러한 결과는 pH 5.2에서 808-레이저 조사와 함께 동반되는 CS-Fe NPs의 처리가 세포 생존율에 유의한 영향을 미친다는 것을 보여주었다. 박테리아 세포를 성장시키고, CS-Fe NPs 및 Fe NPs 처리와, NIR 조사처리 또는 비조사처리한 각각의 실험군에 대해, 콜로니 형성 및 세포 생존 능력에 미치는 영향을 테스트했다. 결과는 근적외선 조사와 Fe NPs 및 CS-Fe NPs의 처리로 인해 상당한 세포 수 감소가 있음을 보여 주었다. 특히, 세포가 NIR 조사와 함께 CS-Fe NPs(NIR+)로 처리되었을 때 더 적은 수의 콜로니가 관찰되었다(도 6C). 유사한 경향이 SYTO 9 및 PI 염색 분석을 사용하여 살아있는 세포과 죽은 세포 모두에서 관찰되었다(도 6D). 살아있는 세포는 녹색 형광(SYTO 9)을 나타내는 반면, 죽은 세포(propidium iodide)에서는 적색 형광이 관찰된다.
세포 생존율, 생존 및 사멸 분석은 CS-Fe NPs(200μg/mL)가 박테리아 생물막 박멸을 위한 최적의 농도임을 나타내었다. 이에, 더 나은 생물막 제거를 위한 최적의 NIR 조사 시간을 측정하기 위해 추가 실험이 촉진되었다(도 7). 세포 생존율은 Fe NPs와 Cs-Fe NPs, 노출 시간(0-5분) 및 pH(7.4 및 5.2)에 따라 다양했습니다. 다른 처리와 비교하여 pH 5.2에서 5분의 NIR 조사와 함께 CS-Fe NP 처리 후 더 높은 세포 사멸이 관찰되었다(도 7 A 및 B). cell counts assay에 따르면 NIR 노출 시간이 증가함에 따라 손실 콜로니가 증가하였으며, Fe NPs 처리에 비해 CS-Fe NPs에서 더 높은 박테리아 콜로니 감소가 발견되었다(그림 7C). live and dead assay는 Fe NPs(NIR+) 처리군이 808 nm 레이저 노출 5분 후에 CS-FeNPs(NIR+) 처리군과 비교하여, 죽은 세포를 명확히 나타내지 않음을 보여주었다. 완전한 박테리아 세포 사멸은 5분의 808 nm 레이저 노출로 CS-Fe NPs(NIR+) 처리일 때 관찰되었다(도 7D). CS-Fe NPs로 처리된 세포는 NIR 조사 매개 광열 활성으로 인한 국소 온도 증가로 인해 더 높은 세균 세포 사멸이 기록되었다.
3.4.3. CLSM 및 TEM 분석.
Fe NPs 및 CS-Fe NPsdp 대한 CLSM 및 TEM analysis가 수행되었다.
도 8은 두 가지 다른 pH 7.4 및 pH 5.2에서 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 Fe NP 및 CS-FeNP를 처리한 후 E. coli 생물막의 CLSM 이미지(A), 생물막 바이오매스 측정 그래프(B). 생물막 두께 측정 그래프(C)다. 오차 막대는 표준 오차(n=3), *p<0.05, **p<0.01 대조군과 샘플 사이에 유의미함을 나타낸다. 막대의 다른 알파벳은 pH와 NIR 방사선 사이에서 상당히 다양했다(p<0.05).
도 9는 상이한 pH(pH7.4, pH5.2)에서 5분 동안 2.0 W/cm2의 808 nm NIR 레이저를 사용하거나 사용하지 않고 Fe NP 및 CS-FeNP를 처리한 후 생물막 표면 적용 범위를 나타낸 그래프(A) 및 E. coli 생물막의 SEM 이미지(B)다. 오차 막대는 표준 오차(n=3)를 나타내며, **p<0.01 대조군과 샘플 사이에 유의미하다. 막대의 다른 알파벳은 pH와 NIR 방사선 사이에서 상당히 다양했다(p<0.05).
세균 세포는 세포 신호 전달과 세포외 다당류를 통한 생물막의 발달을 통해 다양한 생활 환경에 적응한다. 잘 확립된 생물막은 다양한 항생제 치료에 대한 박테리아 내성을 향상시키며 플랑크톤 세포에 비해 박테리아 생물막을 근절 및/또는 치료하기 어렵다. 다제내성으로 인해 세균성 바이오필름 관련 감염을 전통적인 방법으로 치료하는 것은 어려운 일이다. 따라서 생물막으로 보호되는 병원성 세균을 치료하는 것은 치료의 항균 가능성을 결정하는 중요한 방법이다. 이와 관련하여 NIR 처리 여부에 관계없이 CS-Fe NPs 및 Fe NPs의 항 생물막 활성을 두 상이한 pH(5.2 및 7.4)에서 평가했다. CLSM 분석은 pH 5.2와 7.4에서 처리되지 않은 대조군의 생물막 밀도가 다른 처리군에 비해 높게 나타났다(도 8A). 그러나 NIR 조사만으로도 pH 5.2 및 pH 7.4에서 E.coli 생물막은 eradicated 되었다. pH 5.2에서 NIR 조사(808 nm 2.0 W/cm2)와 함께 CS-Fe NPs로 처리한 그룹에서 더 높은 수준의 생물막 박멸이 관찰되었다. 또한, 바이오필름 바이오매스 및 바이오필름 두께는 나노입자, pH 및 NIR 조사에 따라 유의하였다(도 8B 및 C). CS-Fe NPs(NIR+)는 다른 처리군과 비교할 때 pH 5.2에서 더 높은 수준의 바이오매스 및 두께 손실을 나타냈다. 이 결과는 CS-FeNPs의 IR 및 pH 반응 항생물막 활성을 입증한다. 유사한 결과가 도 9A와 B에 도시된 bio-TEM 분석에서도 관찰되었다. 특히 NIR 조사의 유무에 따라 상당한 수준의 생물막 표면 커버리지가 관찰되었다. 그 결과는 CS-Fe NPs(NIR+)로 처리된 그룹에서 높은 수준의 생물막 박멸을 나타냈다.
4. 결론
요약하면, 본 발명에서는 키토산과 Fe NP로 구성된 IR/pH 반응성 항균 시스템을 성공적으로 개발했다. 시험관 내에서 본 발명의 나노입자는 세균(G+/G-)과 생물막을 박멸하는 데 탁월한 활성을 보였다.
한편, 나노입자의 특성 분석을 통해, 트리코델마 하지아눔 추출물에 포함되는 단백질, 카르복실/히드록실, 휘발성 화합물 및 니트로 화합물이 Fe NPs 및 CS-FeNPs에도 포함됨을 확인할 수 있었다.
본 발명의 가설인 Fe NPs에 코팅된 키토산이 두 가지 메커니즘(NIR/pH-반응성)을 통해 더 높은 항균 및 항균막 활성에 기인한다는 것이 입증되었다. 양이온성 키토산이 음이온성 세균과 정전기적 인력을 통해 결합한 후 산성 조건에서 Fe가 키토산에서 방출되어 세균에 축적됨을 추가로 확인하였다. 근적외선 조사는 광열 요법을 통해 항균 활성을 가속화했다.
또한, 세포독성 연구는 CS-FeNPs가 플랑크톤 및 생물막 박테리아(G-)에 대해 유망한 항균 효과를 나타내는 반면 정상 세포에 대해 유의한 세포독성을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다.
따라서 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs)는 박테리아 감염의 광열 매개 근절에 큰 잠재력을 보여줄 것으로 기대된다.
이에, 본 발명은 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 포함하는 용액에 트리코델마 하지아눔 추출물을 가하여 얻어진 철나노입자를, 키토산으로 캡슐화함으로써, 박테리아의 생물막을 파괴하는 항균 효과를 갖는 약학용 나노입자로써, 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs) 및 그 제조방법을 개발하였음을 명시한다.
본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시 예에 불과하며, 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공되는 것임을 명확히 한다.
(S10): 철용액 제조단계
(S20): 배양단계
(S30): 바이오매스수집단계
(S40): 추출단계
(S50): 철 나노입자 수득단계
(S60): 키토산-TPP 용액 제조단계
(S70): 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 제조단계

Claims (12)

  1. 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 혼합하고 증류수에 녹인 철용액에, 트리코델마 하지아눔 균주를 배양하고 원심분리하고 여과하여 얻어진 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 추출하여 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 용해시키고 교반하여 얻어진 철 나노입자(FeNPs)를, 키토산-TPP용액에 투입하여 얻어진 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 철용액은 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 1 ~ 99 : 99 : 1의 중량비로 혼합하고 증류수에 녹여 제조되되, 0.1M 수산화나트륨을 이용해 pH가 9 ~ 10으로 조정된 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 트리코델마 하지아눔 균주는 PDB 배지에 접종하고 26 ~ 30℃에서 3 ~ 5일간 배양된 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 트리코델마 하지아눔 바이오매스는 배양된 트리코델마 하지아눔 균주를 3000 ~ 5000rpm에서 5 ~ 15분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 얻어진 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs).
  5. 제1항에 있어서,
    상기 트리코델마 하지아눔 추출물은 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 증류수를 가하고, 26 ~ 30℃에서 160 ~ 200rpm으로 6 ~ 12시간 교반하면서 초음파 처리하여 추출된 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs).
  6. 제1항에 있어서,
    상기 키토산-TPP용액은 키토산을 아세트산에 녹여 제조한 키토산 용액을, 트리폴리인산염을 증류수에 녹여 제조한 TPP용액과, 3 : 1의 부피비로 혼합하여 제조된 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자(Cs-FeNPs).
  7. 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 혼합하고 증류수에 녹여 철용액을 제조하는 철용액 제조단계(S10);
    트리코델마 하지아눔 균주를 배지에 접종하고 배양하는 배양단계(S20);
    상기 배양단계(S20)에서 배양중인 트리코델마 하지아눔 균주를 원심분리하고 여과하여 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하는 바이오매스수집단계(S30);
    상기 바이오매스수집단계(S30)에서 수집된 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 추출용매를 가하고 교반하면서 추출하는 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 수득하는 추출단계(S40);
    상기 철용액 제조단계(S40)에서 제조된 철용액에 상기 추출단계(S40)에서 수득된 트리코델마 하지아눔 추출물(En-TE)을 용해시키고 교반해 철 나노입자(FeNPs)를 수득하여 건조시키는 철 나노입자 수득단계(S50);
    키토산을 아세트산에 녹인 키토산 용액을, TPP용액과 혼합하여, 키토산-TPP용액을 제조하는 키토산-TPP 용액 제조단계(S60);
    상기 키토산 용액 제조단계(S60)에서 제조된 키토산-TPP용액에 철 나노입자(FeNPs)를 투입하고, 철 나노입자(FeNPs)를 키토산으로 캡슐화하여 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자(CS-Fe NPs)를 제조하는 키토산으로 캡슐화된 철 나노입자 제조단계(S70)를 포함하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 철용액 제조단계(S10)에서는 염화제1철4수화물과 염화제2철6수화물을 1 ~ 99 : 99 : 1의 중량비로 혼합하고 증류수에 녹여 철용액을 제조하되, 0.1M 수산화나트륨을 이용해 pH를 9 ~ 10으로 조정하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 배양단계(S20)에서는 트리코델마 하지아눔 균주를 PDB 배지에 접종하고 26 ~ 30℃에서 3 ~ 5일간 배양하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 바이오매스수집단계(S30)에서는 트리코델마 하지아눔 균주를 3000 ~ 5000rpm에서 5 ~ 15분간 원심분리하고 여과지로 여과하여 트리코델마 하지아눔 바이오매스를 수집하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 추출단계(S40)에서는 트리코델마 하지아눔 바이오매스에 증류수를 가하고, 26 ~ 30℃에서 160 ~ 200rpm으로 6 ~ 12시간 교반하면서 초음파 처리하여 트리코델마 하지아눔 추출물을 추출하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 키토산-TPP 용액 제조단계(S60)에서는, 키토산을 아세트산에 녹여 제조한 키토산 용액을, 트리폴리인산염을 증류수에 녹여 제조한 TPP용액과, 3 : 1의 부피비로 혼합하여, 키토산-TPP용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 트리코델마 하지아눔 유래 키토산 캡슐화 철 나노입자의 제조방법.
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