KR20230133248A - 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질주입된 형질주입 세포주, 및 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
Description
뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, IgG 항체 및 상기 IgG 항체 말단에 연결된 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질 및 이의 의약적 용도에 관한 것이다.
뇌혈관장벽(blood-brain barrier: BBB)은 뇌와 혈액을 격리시키는 혈관 장벽으로서, 뇌를 포함하는 중추신경계를 혈액 내 잠재적인 위험 물질로부터 격리시키는 역할을 한다. 뇌혈관장벽은 뇌혈관장벽 내피세포(brain endothelial cell), 성상세포(astrocyte), 및 혈관주위세포(pericyte) 등의 세포로 이루어진 뇌혈관 중심의 구조체이며, 뇌 조직 내 뇌 혈관에 전반적으로 분포해 있다. 뇌혈관장벽 내피세포는 밀착 연접(tight junction)으로 단단하게 결합되어 있고, 성상세포와 성상세포 종족(end feet)은 혈관 주변을 에워싸고 있어, 뇌혈관 내부 혈액을 따라 흐르는 물질이 혈관장벽을 투과하여 뇌 조직으로 흡수/전달되는 것을 선택적으로 저해하는 장벽을 형성한다. 이러한 장벽과 같은 구조는 물질의 종류와 크기에 따라 선택적으로 물질 투과를 허용하거나 또는 투과를 억제시키게 되는데, 생명 유지에 필수적인 물이나 산소의 경우는 확산에 의해 뇌혈관장벽을 통과할 수 있고, 에너지원으로 사용되는 아미노산이나 글루코스의 경우에는 능동 수송에 의해 혈액에서 뇌 조직으로 전달될 수 있다. 그러나, 뇌에 잠재적으로 영향을 줄 수 있는 독성 물질, 및 병원균 등은 뇌혈관장벽에 의해 물질 전달이 억제될 뿐만 아니라 설사 투과된다 할지라도 세포의 펌핑 작용에 의해 다시 혈액으로 되돌아오게 되어 뇌 조직으로의 흡수를 막아, 뇌 조직을 보호하는 역할을 한다.
그러나, 이러한 구조를 갖는 뇌혈관장벽은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 뇌암 등과 같은 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 약리학적 치료에 있어서 주요한 장애 요인으로 작용한다. 실제로, 400~500 Dalton 이하의 분자량을 갖는 극히 일부의 치료 약물만이 뇌혈관장벽을 투과할 수 있는 것으로 보고된 바 있으며, 대부분의 치료 약물은 뇌혈관장벽에 의해 뇌 조직에 전달되지 못하거나 극 소량만이 전달되어 표적 기관인 뇌 조직에서의 효능이 발휘되지 못하고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 약물의 지용성화를 통해 내피세포의 세포막을 직접 통과시키는 기술, 선천적 영양소 전달 체계를 통한 전달 기술, 및 수용체 매개 트랜스시토시스(transcytosis)를 이용한 항체 기반의 전달 기술이 제안되었다. 그러나 이러한 기술들은 뇌 뿐만 아니라 다른 장기에도 작용하기 때문에 체내 부작용의 우려가 존재하며, 환자 별 전달의 효능 차이로 인해 적정 농도 또는 함량을 정하기 어렵다는 문제로 인해 임상적 활용에는 한계가 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 뇌혈관장벽에 대한 투과성 증진 및 뇌 조직으로의 선택적인 전달을 향상시키기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으나(한국 공개 특허 제10-2021-0005647호), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명자들은 이러한 종래 기술의 한계점을 극복하기 위하여, IgG 항체 및 상기 IgG 항체 말단에 4가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질을 고안하였으며, 상기 융합 단백질은 뇌 혈관 영역에서의 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터 발현 패턴 및 이에 따른 상기 뇌 혈관 영역 내 클러스터와의 특이적인 상호 작용에 의해, 뇌혈관장벽에 대한 투과성이 증진되어 뇌 조직으로 전달 효율이 향상되었을 뿐만 아니라, 타 조직에 비해 뇌 조직에 선택적으로 IgG 항체가 높은 수준으로 분포함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 일 양상은 IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된, 4가의 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질주입된 형질주입 세포주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된, 4가의 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하는, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제공한다.
뇌혈관장벽(Blood-brain barrier: BBB
)
본 명세서에서 용어, "뇌혈관장벽(blood-brain barrier: BBB)"은 혈액 내 존재하는 이온, 분자, 병원체와 같은 물질에 대한 뇌 조직으로의 이동을 엄격하게 제어하면서, 아미노산, 글루코스 등 생명 유지에 필수적인 성분들에 대한 선택적인 흡수를 가능하게 하는 뇌혈관 중심의 구조체를 지칭한다. 상기 뇌혈관장벽은 뇌혈관장벽 내피세포, 성상세포, 및 혈관주위세포 등의 세포들로 이루어진다. 상기 세포들은 공통의 기저막을 공유하는 형태로 배열되고, 뇌혈관장벽의 일 측면에는 단단하게 연결된 뇌혈관장벽 내피세포, 다른 면에는 혈관 주변을 에워싸고 있는 성상세포가 분포한다. 뇌혈관장벽 내피세포는 모세혈관의 벽을 구성하며, 매우 단단하고 복잡한 밀착 연접(tight junction)으로 연결되어 있다. 이러한 구조는 물리적인 장벽을 형성하여 인슐린과 같은 평균 크기에서 큰 크기의 분자를 포함한 대부분의 물질의 단순 확산을 저해하는 역할을 한다. 또한, 성상세포는 중추신경계의 신경아교세포(glial cell)의 일종으로, 뇌 혈관과의 상호 작용을 통해 뇌의 내피 세포 기능, 혈액 흐름, 이온 균형에 영향을 미친다. 성상세포는 종족(end feet)이라는 돌기(process)를 이용해 한쪽 끝으로는 혈관을 감싸고 다른 쪽 끝은 시냅스(synapse)에서 뉴런과 밀접하게 접촉한다. 이러한 구조를 갖는 뇌혈관장벽은 혈액 내 잠재적인 위험 물질로부터 뇌 조직을 보호함과 동시에, 질병의 치료에 유효한 물질이 뇌 조직으로 전달되는 것 역시 방해하므로, 약리학적 치료에 있어서 주요한 장애 요인으로 작용한다. 따라서, 뇌혈관장벽에 대한 투과성을 향상시키는 기술은 뇌 조직을 타겟으로 하는 의약 분야에서 치료제의 응용 가능성 또는 효능을 향상시킬 수 있다.
IgG 항체 (IgG antibody)
본 명세서에서 용어, "IgG 항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 가지는 면역글로불린 분자로서, 항원을 특이적으로 인식하는 항원의 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 지칭한다. 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 상기 항체는 다클론항체, 단일클론항체, 전장(full-length) 항체, 및 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편 또는 항원 결합 단편을 모두 포함할 수 있다. 전장 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전장 항체는 바람직하게 IgG일 수 있으며, 이의 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체는 천연형 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 천연형 항체란 유전자 조작을 가하지 않은 항체를 뜻하며, 생체 내에서 유전자 조작된 항체가 지닐 수 있는 면역원성(immunogenicity)의 위험성이 현저히 낮을 수 있다. 재조합 항체란 유전자 조작된 항체를 의미하며, 유전자 조작을 통하여 항원 결합력이나 원하는 특징을 추가할 수 있는 특징이 있다.
본 명세서에서 용어, "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), 및 scFv-Fc 이가 분자와 같은 기능적 항체 단편 또는 이들의 조합 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항원 결합 단편은 예시적으로 다음을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 IgG-like bispecific 항체의 구조가 비제한적으로 채용될 수 있다: (1) Fab, 항체 분자의 단가 항원-결합 단편을 포함하고, 전체 항체를 효소 파파인으로 분해하여 미가공 경쇄 및 하나의 중쇄의 부분을 수득하도록 생산될 수 있는 단편; (2) Fab', 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 미가공 경쇄 및 중쇄의 부분을 수득하도록 얻을 수 있는 항체 분자의 단편; 항체 분자 당 획득된 두 개의 Fab' 단편; (3) (Fab')2, 전체 항체를 후속적 환원 없이 효소 펩신으로 처리하여 획득될 수 있는 항체의 단편 및 두 개의 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된 두 개의 Fab' 단편의 이량체; (4) Fv, 두 개의 사슬로서 발현되는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전적으로 조작된 단편; (5) 단일 사슬 항체 (SCA 또는 scFv), 유전적으로 융합된 단일 사슬 분자로서 적합한 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 유전적으로 조작된 분자; (6) scFv-Fc, 단일 사슬 Fv (scFv)를 IgG 및 Fc 영역과 같은 면역글로불린 (Ig)으로부터의 힌지 영역과 융합시켜 생성된 분자.
또한, 상기 항체 또는 항체 단편은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 면역글로불린 분자로서, 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 마우스 항체, 키메라 항체, scFV, 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2, 디설파이드-결합 Fvs(sdFV), scFv 단편, scFv-Fc 단편, Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있음), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
본 명세서에서, 상기 IgG 항체는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티와 융합체를 이루는 대상으로서, IgG 항체를 구성하는 경쇄 C-말단 및 중쇄 C-말단 각각은 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결 또는 접합되어 있을 수 있다. 이러한 IgG 항체는 뇌혈관장벽 선택적 투과성이 증진되고, 타 장기 및 세포에 비해 뇌 조직에 상대적으로 높은 수준으로 분포할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 IgG 항체는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료, 완화, 또는 검출하는데 적용 가능한, 당업계 공지의 표적 항원과 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있고, 예를 들어, 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 약제학적 활성 물질일 수 있다. 상기 IgG 항체는 알츠하이머 치매(Alzheimer`s disease); 루이체 치매(dementia with Lewy bodies); 전측두엽 치매(frontotemporal dementia); 신경원 섬유 매듭-우세 치매(tangle only dementia); 파킨슨병(Parkinson`s disease); 다발성 경화증(multiple sclerosis); 근 위축 측삭 경화증(amyotrophic Lateral sclerosis: ALS); 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury); 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy); 피질기저핵변성(corticobasal degeneration); 신경교 타우병증(globular glial tauopathy); 노화 관련 타우 성상교병증(aging-related tau astrogliopathy); 만성 외상성 뇌병증(chronic Traumatic Encephalopathy: CTE); 원발성 중추신경계 림프종(primary CNS lymphoma: PCNSL), 신경교종(glioma), 신경모세포종(neuroblastoma), 뇌 전이암, 뇌수막종(meningioma) 등과 같은 뇌암; 피크병(Pick's disease); 항-IgLON5 관련 타우병증(anti-IgLON5-related tauopathy); 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism); 나딩신드롬(nodding syndrome); 통증(pain); 뇌전증(epilepsy); 자폐증(autism); 뇌졸중(stroke); 길리안-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome: GBS); 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease: CJD); 헌팅톤병(Huntington`s disase); 진행성 다초점 백질뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy: PML); 우울증(depression); 외상후 스트레스 장애(post traumatic stress disorder: PTSD); 및 리소솜 축적 질환(lysosomal storage disease: LSD)과 같은 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료 또는 완화하기 위한 항체일 수 있고, 예를 들어, anti-PD-L1 IgG 항체, anti-PD1 IgG 항체, anti-Tau IgG 항체, anti-HER2 IgG 항체, anti-Aβ IgG 항체, anti-TDP-43 IgG 항체, anti-alpha-synuclein IgG 항체, anti-SIGLEC3 IgG 항체, 또는 anti-TREM2 IgG 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트랜스페린 수용체 (Transferrin receptor: TfR)
본 명세서에서 용어, "트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)"는 혈장 당단백질인 트랜스페린으로부터 철의 세포 내 흡수를 매개하는 세포의 표면상에 발현된 막 당단백질을 지칭하며, 다양한 조직의 정상 세포에 광범위하게 분포되어 있을 뿐만 아니라, 활성화된 면역 세포 및 종양 세포 등에도 다량으로 발현되어 있는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 트랜스페린 수용체를 매개로 하는 전달기술은 뇌 조직으로의 유효한 전달 뿐만 아니라, 뇌 조직 이외 다른 장기 또는 정상 세포에 대한 낮은 전달이 요구된다. 실제로, 트랜스페린 수용체를 매개로 하는 전달체 또는 치료제는 망상적혈구 수의 감소, 심한 혼수, 간헐적인 사지 경직, 전신 경직, 용혈 및 헤모글로빈뇨증을 포함한 적혈구 관련 독성을 야기할 수 있음이 보고된 바 있다. 또한, 상기 트랜스페린 수용체의 세포막외 도메인(ectodomain)은 apical 도메인, helical 도메인 및 protease-like 도메인으로 구분되며, 이들은 수용체 매개 트랜스시토시스(transcytosis) 과정에서 타겟 물질과 상이한 결합 친화력을 갖는 것으로 알려져 있다.
상기 트랜스페린 수용체의 유전 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스로부터 수득할 수 있으며, 예를 들어, 상기 트랜스페린 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
트랜스페린 수용체 클러스터(Transferrin receptor cluster)
본 명세서에서 용어,"트랜스페린 수용체 클러스터"는 복수 개의 트랜스페린 수용체가 국소 영역에서 밀집하게 존재하는 군집을 지칭하며, 상기 트랜스페린 수용체 클러스터는 복수 개의 트랜스페린 수용체들이 뭉쳐져 있는 형태로 혈관 등의 조직 또는 세포에 분포할 수 있다. 특히, 다른 장기 조직 또는 세포에 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터와 달리, 뇌 혈관 영역에 존재하는 트랜스페린 수용체 클러스터는 특이적인 발현 패턴을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 특이적인 발현 패턴은 다른 장기 조직 또는 세포에 비해, 클러스터가 형성된 국소 영역 내 트랜스페린 수용체가 현격한 수준으로 조밀하게 분포되어 있는 상태를 지칭하며, 이러한 뇌 조직 특이적인 클러스터 및 클러스터 내 트랜스페린 수용체의 발현 패턴은 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성, 및 뇌 조직으로의 선택적 전달과 밀접한 연관 관계를 나타낼 수 있다.
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티
본 명세서에서 용어, "트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티"는 뇌혈관장벽을 구성하는 세포의 표면에 존재하는 수용체와 상호 작용하는 기능적 단위를 지칭하며, 구체적으로, 트랜스페린 수용체를 구성하는 영역 중 helical 영역에 대하여 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티를 의미하는 것일 수 있다. 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 뇌 조직 혈관에 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터의 발현 패턴을 반영한 것으로서, 4가의 형태로 구성될 수 있다. 여기서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역은 뇌 조직 혈관의 클러스터 내 조밀하게 분포된 복수 개의 트랜스페린 수용체와 융합 단백질이 유효한 4가의 결합이 형성되도록 외부로 노출된 기능적/구조적 영역이며, 이는 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성 및 뇌 조직으로의 선택적인 전달에 기여할 수 있다. 따라서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 결합이 가능한, 결합 모이어티는 IgG 항체와 연결되어 상기 IgG 항체의 뇌혈관장벽 투과성을 현격하게 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 뇌 조직으로의 선택적인 전달/흡수를 가능하게 하는 기능성을 부여할 수 있다.
상기 결합 모이어티는 뇌 조직 혈관 영역에 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터와 상호 작용하여 복합체/융합체를 형성하기 위한 것으로서, 상기 클러스터가 형성된 국소 영역 내 복수의 트랜스페린 수용체와 결합 친화력을 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로, 트랜스페린 수용체의 helical 영역, 보다 구체적으로, 서열번호 1의 트랜스페린 수용체를 기준으로 606번째 아미노산부터 665번째 아미노산까지의 영역 중 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산과 결합 친화력을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단, 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결될 수 있으며, 이에, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 4가의 형태로 IgG 항체에 연결되어, 목적하는 기능성을 발휘할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 6 내지 250개의 아미노산 길이를 가지는 것일 수 있으며, 예를 들어, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 길이는 6 내지 240개, 6 내지 220개, 6 내지 200개, 6 내지 180개, 6 내지 160개, 6 내지 140개, 6 내지 120개, 6 내지 100개, 6 내지 80개, 6 내지 60개, 6 내지 40개, 6 내지 20개, 6 내지 10개, 10 내지 250개, 10 내지 240개, 10 내지 220개, 10 내지 200개, 10 내지 180개, 10 내지 160개, 10 내지 140개, 10 내지 120개, 10 내지 100개, 10 내지 80개, 10 내지 60개, 10 내지 40개, 10 내지 20개, 20 내지 250개, 20 내지 240개, 20 내지 220개, 20 내지 200개, 20 내지 180개, 20 내지 160개, 20 내지 140개, 20 내지 120개, 20 내지 100개, 20 내지 80개, 20 내지 60개, 20 내지 40개, 40 내지 250개, 40 내지 240개, 40 내지 220개, 40 내지 200개, 40 내지 180개, 40 내지 160개, 40 내지 140개, 40 내지 120개, 40 내지 100개, 40 내지 80개, 40 내지 60개, 60 내지 250개, 60 내지 240개, 60 내지 220개, 60 내지 200개, 60 내지 180개, 60 내지 160개, 60 내지 140개, 60 내지 120개, 60 내지 100개, 또는 60 내지 80개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 길이는 예를 들어, 10 내지 48개, 10 내지 44개, 10 내지 40개, 10 내지 36개, 10 내지 32개, 10 내지 28개, 10 내지 24개, 10 내지 20개, 10 내지 16개, 10 내지 12개, 12 내지 48개, 12 내지 44개, 12 내지 40개, 12 내지 36개, 12 내지 32개, 12 내지 28개, 12 내지 24개, 12 내지 20개, 12 내지 16개, 14 내지 48개, 14 내지 44개, 14 내지 40개, 14 내지 36개, 14 내지 32개, 14 내지 28개, 14 내지 24개, 14 내지 20개, 또는 14 내지 16개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 단위체 서열이 2회 내지 5회, 2회 내지 4회, 또는 2회 내지 3회 반복되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단위체 서열은 융합되어 연결되거나, 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 2 내지 50개의 아미노산 길이, 예를 들어, 2 내지 40개, 2 내지 30개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 2 내지 5개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 10개의 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 링커 펩타이드는 예를 들어, (GlSm)n(l은 2 내지 8, m은 1 내지 5, n은 1 내지 5), (GdSeAS)f(d는 2 내지 8, e는 1 내지 5, f는 1 내지 5), (G4S)a(EAAAK)b(G4S)a(a, b는 1 내지 4의 정수), [(G4S)p(EAAAK)q]r(p, q, r은 1 내지 4의 정수)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 구성하는 단위체 서열은 세포 투과성 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 단위체 서열은 예시적으로 서열번호 3 내지 서열번호 43 중 어느 하나일 수 있으나, 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 유효한 상호 작용(수소결합, 정전기적 인력, 반데르발스힘), 즉, 유효한 결합 친화력을 갖는 단위체 서열이라면, 비제한적으로 확장 적용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 복수 개의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티 각각은 동일하거나, 상이한 것일 수 있다.
뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질
본 명세서에서 용어, "융합 단백질"은 둘 이상의 본래 별개인 단백질, 또는 이의 일부의 결합을 통해 형성된 단백질을 지칭하며, 선택적으로, 둘 이상의 단백질 사이에 위치하는 링커 또는 스페이스를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어, "뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질"은 IgG 항체 및 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티간 결합을 통해 형성된 단백질로서, 뇌혈관장벽을 투과하여 유효한 양의 IgG 항체가 뇌 조직에 선택적으로 전달 또는 흡수될 수 있도록 하는 기능적 구조를 포함하는 단백질을 총칭하는 것일 수 있다. 상기 기능적 구조는 뇌혈관장벽에 특이적으로 분포하는 혈관내피세포의 트랜스페린 수용체 클러스터의 구조 및 이들의 발현 양상을 반영하여 유효한 결합 친화력을 갖도록 변형된 것으로서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역과 결합할 수 있는 결합 모이어티, 및 IgG 항체를 구성하는 중쇄 및 경쇄의 C-말단 영역과 상기 결합 모이어티간 4가의 결합(연결)을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단, 및 중쇄의 C-말단 영역에, 4가의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 형태의 기능적 구조를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단, 및 중쇄의 C-말단 영역과 helical 영역 결합 모이어티와의 연결은 상기 언급한 IgG 항체의 말단 영역에 융합되어 연결되거나, 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있으며, 링커 펩타이드에 대한 사항은 전술한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌혈관장벽의 혈관에 특이적으로 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터를 형성하는 트랜스페린 수용체와 결합하여 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 다른 장기 조직 또는 세포에 비해, 트랜스페린 수용체 클러스터 내 조밀하게 분포된, 복수의 트랜스페린 수용체와 결합하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 기능적 구조는 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 유효한 결합 친화력, 및 뇌 혈관 영역에 분포하는 트랜스페린 수용체 클러스터의 특이적인 분포/발현 양상을 반영하여 고안된 것으로서, IgG 항체 내 경쇄의 C-말단 및 중쇄의 C-말단 영역, 즉, 총 4개의 말단 영역에 복수 개의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합단백질을 제조하였다. 이후, 상기 융합 단백질을 포함하는 제제를 정맥 투여한 경우, 뇌 조직에서 IgG 항체를 포함하는 융합 단백질의 전달이 현격하게 증진되었을 뿐만 아니라, 다른 장기에 비해 뇌 조직에서 IgG 항체가 높은 수준으로 분포되고, 특히, 망상적혈구를 포함하는 정상 세포 및 다른 장기 조직에 미치는 영향은 미미함을 확인하였다. 또한, 상기 융합 단백질은 트랜스페린 수용체의 helical 영역에 대한 유효한 결합 친화력을 갖는 4가의 모이어티 및 이를 포함하는 기능적 구조로부터 비롯된 기능으로서, IgG 항체의 종류, 및 결합 모이어티의 구체적인 서열에 구애받지 않고, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성과 같은 효과가 발휘됨을 알 수 있었다. 따라서, 일 실시예에서는 상기 결합 모이어티와 연결된, IgG 항체의 뇌혈관장벽 투과성을 증진시킴과 동시에 뇌 조직으로의 선택적인 전달을 유도하고, 항체 기반 약물의 부작용을 경감시키는데 기여할 수 있는 기능적 구조를 새롭게 규명하였다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역에 연결된 제1 결합 모이어티; 및 상기 IgG 항체의 중쇄 C-말단 영역에 연결된 제2 결합 모이어티를 각각 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 제제화되어 투여되는 것일 수 있고, 상기 투여는 통상적인 융합 단백질, 또는 항체 기반 제제의 투여 방법이 비제한적으로 적용될 수 있고, 예를 들어, 정맥 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 복강 투여, 안구 투여, 척수강내(intrathecal) 투여, 뇌실 내(intracerebroventricular) 투여, 비강 내 투여 등일 수 있다. 이러한 투여 조건 하에서, 상기 융합 단백질은 뇌혈관장벽을 구성하는 세포의 표면에 존재하는 수용체의 일부 영역, 즉, 트랜스페린 수용체의 helical 영역과의 적절한 수준의 상호 작용, 또는 결합 친화력을 제공할 수 있는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티와의 연결을 통하여, 융합 파트너인 IgG 항체가 뇌 조직 내 높은 수준으로 전달/분포될 수 있도록 할 수 있다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터로 형질주입된 형질주입 세포주를 제공한다.
하기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 형질주입 세포주에 언급된 용어 또는 요소 중 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 대한 설명에서 언급된 것과 동일한 것은, 상기한 바와 같다.
융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있고, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩(암호화)되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기서열의 교대(alternate) 형태이다. 단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩타이드를 암호화하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터
본 명세서에서 용어, "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 DNA 운반체 (vehicle)로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 벡터는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalovirus) 프로모터, T7 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, MLV(murine Leukemia Virus) LTR(long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 설바이빈 (survivin) 프로모터, 및 Chinese Hamster Elongation Factor-1α (CHEF1-α) 프로모터를 포함할 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 용어, “작동 가능하게 연결된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
형질주입 세포주
본 명세서에서 용어, "형질주입"은, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 상기 형질주입은 전술한 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 벡터가 숙주 세포 내로 삽입되어 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 생산하는 것을 의미한다.
상기 형질주입 세포주 또는 숙주 세포는 바람직하게는 박테리아와 같은 원핵생물, 효모와 같은 진핵생물을 포함하는 미생물, Sf9 세포 등의 곤충 유래 세포, CHO 세포 등의 마우스 유래 세포, HEK293 등의 사람 유래 세포 및 항체 생산 하이브리도마로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물; 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 융합 단백질의 의약적 용도; 또는 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
하기 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 이의 의약적 용도, 또는 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 대한 설명에서 언급된 것과 동일한 것은, 상기한 바와 같다.
뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
본 명세서에서 용어, “예방”은 상기 약제학적 조성물의 투여에 의해 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, “치료”는 상기 약제학적 조성물의 투여에 의해 뇌 기능 장애와 연관된 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 약제학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 “뇌 기능 장애와 연관된 질환”은 알츠하이머 치매; 루이체 치매; 전측두엽 치매; 신경원 섬유 매듭-우세 치매; 파킨슨병; 다발성 경화증; 근 위축 측삭 경화증; 외상성 뇌 손상; 진행핵상마비; 피질기저핵변성; 신경교 타우병증; 노화 관련 타우 성상교병증; 만성 외상성 뇌병증; 원발성 중추신경계 림프종, 신경교종, 신경모세포종, 뇌 전이암, 뇌수막종 등과 같은 뇌암; 피크병; 항-IgLON5 관련 타우병증; 과들루프 파킨슨증; 나딩신드롬; 통증; 뇌전증; 자폐증; 뇌졸중; 길리안-바레 증후군; 크로이츠펠트-야곱병; 헌팅톤병; 진행성 다초점 백질뇌병증; 우울증; 외상후 스트레스 장애; 및 리소솜 축적 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물, 즉, 융합 단백질을 포함하는 제약 제제는, 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도는 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메치오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤;카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 포도당, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
상기 약제학적 조성물은 추가적인 활성 성분, 임의로 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완 활성을 갖는 성분을 함유할 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 종류 및 유효량은 예를 들어 제제에 존재하는 항체의 양, 및 대상체의 임상 파라미터에 따라 결정된다. 상기 활성 성분은 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 미세캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 의해 봉입된 형태로 전달될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 의료 실무에 일치하는 방식으로 제제화, 투약, 및 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려해야 할 인자로는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 질환의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화될 수 있다. 상기 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 종류, 및 기타 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 본원에 설명된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 설명된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 적절한 것으로 경험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법
상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환을 치료하는 방법은 상기 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제와 동시-투여될 수 있다. 상기 추가의 치료제는 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 치료에 효과적인 치료제로서, 다음을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 콜린에스테라제 억제제 (예컨대 도네페질, 갈란타민, 로바스티그민 및 타크린), NMDA 수용체 길항제 (예컨대 메만틴), 아밀로이드 베타 펩타이드 응집 억제제, 항산화제, γ-세크레타제 조절물질, 신경 성장 인자 (NGF) 모방체 (mimic) 또는 NGF 유전자 요법제, PPARγ 효능제, HMS-CoA 환원효소 억제제 (스타틴), 암파킨, 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항제, 글리코겐 합성효소 키나제 억제제, 정맥내 이뮤노글로불린, 무스카린성 (muscarinic) 수용체 효능제, 니코틴 수용체 조절물질, 능동 또는 수동 아밀로이드 베타 펩타이드 면역화, 포스포디에스테라제 억제제, 세로토닌 수용체 길항제 및 항-아밀로이드 베타 펩타이드 항체.
또한, 대상 질환의 예방 또는 치료를 위해, 상기 약제학적 조성물의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용될 때)은 치료되는 질환의 종류, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전에 시행된 요법, 환자의 임상력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 결정될 것이다. 상기 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 적합하게 투여되며, 본 발명의 목적 상, 상기 항체는 4가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티와 결합된 융합 단백질의 형태로 제공되는 것일 수 있다. 질환의 종류 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (예를 들어 0.1 mg/kg ~ 100 mg/kg)의 항체 또는 융합 단백질이 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여에 의한 것인지, 또는 연속 주입에 의한 것인지 상관없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 일반적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 또는 그보다 긴 기간 동안에 걸친 반복 투여를 위해, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 요구되는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체 또는 융합 단백질의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg, 20 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 (예를 들어 환자에게 약 2 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 또는 예를 들어 약 6 mg/kg 용량의 항체 또는 융합 단백질이 투여되도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 로딩 용량에 이어서 하나 이상의 보다 적은 용량이 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
일 양상에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 따르면, 상기 융합 단백질 포함하는 제제를 정맥 투여한 경우, 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체간 유효한 상호 작용에 의해, 뇌 조직에서 IgG 항체의 전달이 현격하게 증진됨을 확인하였다.
또한, 일 양상에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에 따르면, 상기 융합 단백질 포함하는 제제를 정맥 투여한 경우, 뇌 조직 혈관 영역에서의 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터 분포 및 상기 클러스터와의 유효한 상호 작용에 의해, 타 장기 및 세포에 비해 뇌 조직에서 선택적으로 IgG 항체가 높은 수준으로 전달될 수 있는 바, 우수한 생체 안전성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 융합 단백질은 뇌 조직에 대한 선택적인 약물 전달을 필요로 하는 의약 분야, 예를 들어, 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 트랜스페린 수용체를 초저온 전자 현미경법을 통해 이미지화한 것으로서, 트랜스페린 수용체 내 helical 영역을 확인한 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체의 helical 영역간 결합을 초저온 전자 현미경법을 통해 구조를 규명한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #01과 트랜스페린 수용체간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #01의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, ISF 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 두개골 창을 갖는 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌혈관 장벽에서 융합 단백질의 transcytosis 현상을 실시간으로 이미징한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 두개골 창을 갖는 동물 모델에 정맥 투여한 후, 혈관내(ROI 1), 혈관벽(ROI 2) 및 혈관밖(ROI 3) 영역에 존재하는 융합 단백질의 수준을 실시간으로 확인한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F1#01, F3#01, F5#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 대조군 대비 상대적인 값으로 수치화하여 비교한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F1#01, F3#01, F5#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합을 면역 염색을 통해 확인한 것으로서, 도 10의 (a)는 융합 단백질 F5#01의 결과, 도 10의 (b)는 융합 단백질 F1#01의 결과, 및 도 10의 (c)는 융합 단백질 F3#01의 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F1#01, F3#01, F5#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합의 수준을 수치화하여 비교한 결과이다.
도 12는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01과 트랜스페린 수용체간 상호 작용을 negative staining TEM 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 13은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합에 의해 형성된 복합체의 구조를 이미지화하여 나타낸 결과이다.
도 14는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 15는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 16은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여하고, 혈액을 수득한 뒤, 전체 적혈구 세포 중 망상적혈구 세포가 차지하는 비율(%)을 확인한 결과이다.
도 17은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 혈장 내 융합 단백질의 농도를 확인한 결과이다.
도 18은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 혈장 및 혈액 샘플에 처리한 후, blood-to-plasma ratio를 산출한 결과이다.
도 19는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 20은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 21은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 22는 뇌 조직, 혈관 세포, 간, 폐, 신장, 및 비장에 발현된 트랜스페린 수용체의 양을 웨스턴 블롯을 통하여 비교한 결과이다.
도 23은 뇌 조직, 간, 비장, 폐, 및 망상적혈구에서 트랜스페린 수용체의 발현 양상을 공초점 현미경 이미지 및 초고해상도 STED 공초점 현미경 형광 이미지를 통하여 확인한 결과이다.
도 24는 뇌 혈관, 망상적혈구, 폐, 간, 및 비장에 형성된 트랜스페린 수용체 클러스터의 양적 분포를 클러스터의 크기에 따라 비교한 결과이다.
도 25는 뇌 혈관과 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체 클러스터의 intensity 평균값을 비교한 결과이다.
도 26은 트랜스페린 수용체간 거리를 산출하기 위한 파라미터로서, 트랜스페린 수용체간 거리의 최소값(min) 및 최대값(max)을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 27은 뇌 혈관 및 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체의 밀도를 비교한 결과이다.
도 28은 뇌 혈관 및 망상적혈구간 트랜스페린 수용체 간 거리를 비교한 결과이다.
도 29는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #2, #3, #5, #6, #7, 또는 #8과 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 30은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #9, #10, #11, #12, #13, 또는 #14와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 31은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #15, #16, #17, #18, #19, 또는 #20과 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 32는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #21, #22, #23, 또는 #24와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 33은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #25, #27, #30, #32, #33, 또는 #34와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 34는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #36, #38, 또는 #39와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 35는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #04의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 36은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #16, #19, 또는 #20의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 37은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #25, #26, 또는 #27의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 38은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #28, #29, 또는 #31의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 39는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #34, #35, #36, 또는 #37의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 40은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #38, #40, 또는 #41의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 41은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#02, F3#03, F3#04, F3#05, 또는 F3#06을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 42는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#07, F3#08, F3#09, F3#10, 또는 F3#11을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 43은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#12, F3#13, F3#14, 또는 F3#15를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 44는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#16, F3#17, F3#18, F3#19, 또는 F3#20을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 45는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#21, F3#22, F3#23, 또는 F3#24를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 46은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25, F3#26, 또는 F3#27을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 47은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#28, F3#29, F3#30, F3#31, 또는 F3#32을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 48은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#33, F3#34, F3#35, F3#36, 또는 F3#37을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 49는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#38, F3#39, F3#40, 또는 F3#41을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 50은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#03, F5#03, 또는 F3#03을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 51은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#05, F5#05, 또는 F3#05를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 52는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#06, F5#06, 또는 F3#06을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 53은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#12, F5#12, 또는 F3#12를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 54는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#16, F5#16, 또는 F3#16을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 55는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#25, F5#25, 또는 F3#25를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 56은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#27, F5#27, 또는 F3#27을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 57은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#31, F5#31, 또는 F3#31을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 58은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#37, F5#37, 또는 F3#37을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 59는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#40, F5#40, 또는 F3#40을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 60은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01, F3'#01에서, 결합 모이어티 #01의 유무에 따른 IgG1 항체의 PD-L1에 대한 결합력 변화를 확인한 결과이다.
도 61은 일 실시예에 따른 Tau에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-Tau를 동물 모델에 정맥 투여한 후, ISF 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 62는 일 실시예에 따른 Tau에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#27-Tau 또는 F3#36-Tau를 동물 모델에 정맥 투여한 후, ISF 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 63은 일 실시예에 따른 PD1에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-PD1을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 64는 일 실시예에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-HER2를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 65는 일 실시예에 따른 Aβ에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-Aβ를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체의 helical 영역간 결합을 초저온 전자 현미경법을 통해 구조를 규명한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #01과 트랜스페린 수용체간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #01의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, ISF 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 두개골 창을 갖는 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌혈관 장벽에서 융합 단백질의 transcytosis 현상을 실시간으로 이미징한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 두개골 창을 갖는 동물 모델에 정맥 투여한 후, 혈관내(ROI 1), 혈관벽(ROI 2) 및 혈관밖(ROI 3) 영역에 존재하는 융합 단백질의 수준을 실시간으로 확인한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F1#01, F3#01, F5#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 대조군 대비 상대적인 값으로 수치화하여 비교한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F1#01, F3#01, F5#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합을 면역 염색을 통해 확인한 것으로서, 도 10의 (a)는 융합 단백질 F5#01의 결과, 도 10의 (b)는 융합 단백질 F1#01의 결과, 및 도 10의 (c)는 융합 단백질 F3#01의 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질(F1#01, F3#01, F5#01)을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합의 수준을 수치화하여 비교한 결과이다.
도 12는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01과 트랜스페린 수용체간 상호 작용을 negative staining TEM 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 13은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합에 의해 형성된 복합체의 구조를 이미지화하여 나타낸 결과이다.
도 14는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 15는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 16은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여하고, 혈액을 수득한 뒤, 전체 적혈구 세포 중 망상적혈구 세포가 차지하는 비율(%)을 확인한 결과이다.
도 17은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 혈장 내 융합 단백질의 농도를 확인한 결과이다.
도 18은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 혈장 및 혈액 샘플에 처리한 후, blood-to-plasma ratio를 산출한 결과이다.
도 19는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 20은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 21은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 동물 모델에 정맥 투여한 후, IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 22는 뇌 조직, 혈관 세포, 간, 폐, 신장, 및 비장에 발현된 트랜스페린 수용체의 양을 웨스턴 블롯을 통하여 비교한 결과이다.
도 23은 뇌 조직, 간, 비장, 폐, 및 망상적혈구에서 트랜스페린 수용체의 발현 양상을 공초점 현미경 이미지 및 초고해상도 STED 공초점 현미경 형광 이미지를 통하여 확인한 결과이다.
도 24는 뇌 혈관, 망상적혈구, 폐, 간, 및 비장에 형성된 트랜스페린 수용체 클러스터의 양적 분포를 클러스터의 크기에 따라 비교한 결과이다.
도 25는 뇌 혈관과 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체 클러스터의 intensity 평균값을 비교한 결과이다.
도 26은 트랜스페린 수용체간 거리를 산출하기 위한 파라미터로서, 트랜스페린 수용체간 거리의 최소값(min) 및 최대값(max)을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 27은 뇌 혈관 및 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체의 밀도를 비교한 결과이다.
도 28은 뇌 혈관 및 망상적혈구간 트랜스페린 수용체 간 거리를 비교한 결과이다.
도 29는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #2, #3, #5, #6, #7, 또는 #8과 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 30은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #9, #10, #11, #12, #13, 또는 #14와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 31은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #15, #16, #17, #18, #19, 또는 #20과 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 32는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #21, #22, #23, 또는 #24와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 33은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #25, #27, #30, #32, #33, 또는 #34와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 34는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #36, #38, 또는 #39와 트랜스페린 수용체 간 결합의 열역학적 구조 안정성을 확인한 결과이다.
도 35는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #04의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 36은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #16, #19, 또는 #20의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 37은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #25, #26, 또는 #27의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 38은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #28, #29, 또는 #31의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 39는 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #34, #35, #36, 또는 #37의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 40은 일 실시예에 따른 helical 영역 결합 모이어티 #38, #40, 또는 #41의 세포 내 전달 수준을 인간 뇌 내피 세포주를 이용하여 확인한 결과이다.
도 41은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#02, F3#03, F3#04, F3#05, 또는 F3#06을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 42는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#07, F3#08, F3#09, F3#10, 또는 F3#11을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 43은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#12, F3#13, F3#14, 또는 F3#15를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 44는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#16, F3#17, F3#18, F3#19, 또는 F3#20을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 45는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#21, F3#22, F3#23, 또는 F3#24를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 46은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25, F3#26, 또는 F3#27을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 47은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#28, F3#29, F3#30, F3#31, 또는 F3#32을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 48은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#33, F3#34, F3#35, F3#36, 또는 F3#37을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 49는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#38, F3#39, F3#40, 또는 F3#41을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 50은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#03, F5#03, 또는 F3#03을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 51은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#05, F5#05, 또는 F3#05를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 52는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#06, F5#06, 또는 F3#06을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 53은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#12, F5#12, 또는 F3#12를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 54는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#16, F5#16, 또는 F3#16을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 55는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#25, F5#25, 또는 F3#25를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 56은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#27, F5#27, 또는 F3#27을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 57은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#31, F5#31, 또는 F3#31을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 58은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#37, F5#37, 또는 F3#37을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 59는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F1#40, F5#40, 또는 F3#40을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인한 결과이다.
도 60은 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01, F3'#01에서, 결합 모이어티 #01의 유무에 따른 IgG1 항체의 PD-L1에 대한 결합력 변화를 확인한 결과이다.
도 61은 일 실시예에 따른 Tau에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-Tau를 동물 모델에 정맥 투여한 후, ISF 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 62는 일 실시예에 따른 Tau에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#27-Tau 또는 F3#36-Tau를 동물 모델에 정맥 투여한 후, ISF 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 63은 일 실시예에 따른 PD1에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-PD1을 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 64는 일 실시예에 따른 HER2에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-HER2를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
도 65는 일 실시예에 따른 Aβ에 특이적으로 결합하는 IgG1 항체가 포함된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#25-Aβ를 동물 모델에 정맥 투여한 후, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 human IgG1 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 그 결과를 대조군 대비 배수로 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1 내지 실시예 41. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 제조
본 실시예에서는 뇌혈관장벽 투과성이 증진된 융합 단백질을 제조하고자 하였다. 이를 위하여, IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역, 즉, 총 4개의 말단 영역에 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질을 제조하였다. 한편, 본 실시예에서는 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티로서, helical 영역에 대한 결합 특성을 보유하되, 아미노산 서열이 각기 상이한 총 24개의 결합 모이어티를 도출하였다 (제1 결합 모이어티 그룹). 또한, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티로서, 서열번호 3의 결합 모이어티와의 서열 동일성을 일정 수준 이상 유지하되, 아미노산 서열 중 일부가 치환, 삽입, 또는 결실된 총 17개의 결합 모이어티를 추가로 도출하였다(제2 결합 모이어티 그룹).
1. 4가의 제1 결합 모이어티 그룹을 포함하는 융합 단백질의 제조
IgG1 항체 내 전술한 총 4개의 말단 영역에 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 다음과 같이 제조하였다. 구체적으로, 세포가 포함된 플라스크로부터 1mL의 샘플을 피펫으로 채취하고, cell mass를 측정하였다. 이후, 세포 생존율이 95% 이상이고, cell mass가 4~6Х106 cells/mL 이상이면, 37℃의 incubator에서 보관된 배양 배지를 첨가하고 이를 배양하여, cell mass 수준이 9Х106 cells/mL이 되도록 준비하였다. 이후, 상기 준비된 세포를 대상으로, 하기의 실험 조건에 따라 형질주입을 수행하였다.
[표 1]
이후, 배양 1일째 feed media와 enhancer를 처리하고, 배양 5일째 feed media를 처리하여 배양하였다. 세포 생존율이 70%이하가 되거나, 형질주입을 수행한 날로부터 8일이 경과한 때, 형질주입된 세포를 수득하였다. 이후, 상기 형질주입된 세포가 포함된 샘플을 4500rpm, 25℃ 조건에서 15분간 원심분리하여, 이로부터 상층액을 회수하였다. 이후, 상기 상층액을 0.22μm 필터를 사용하여 여과하였다. 이후 상기 여과물에 대한 정제는 친화도 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토그래피 등의 정제 기술을 이용하여 각각의 융합 단백질을 수득하였다. 상기 정제된 항체는 SEC-HPLC (size exclusion high performance liquid chromatography), SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), 질량분석방법으로 분석하여 정제 결과를 확인하였다.
한편, 본 실시예에 따른 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티, 및 IgG1 항체 등에 대한 사항은 다음과 같다.
[실시예 1]
[실시예 2]
[실시예 3]
[실시예 4]
[실시예 5]
[실시예 6]
[실시예 7]
[실시예 8]
[실시예 9]
[실시예 10]
[실시예 11]
[실시예 12]
[실시예 13]
[실시예 14]
[실시예 15]
[실시예 16]
[실시예 17]
[실시예 18]
[실시예 19]
[실시예 20]
[실시예 21]
[실시예 22]
[실시예 23]
[실시예 24]
2. 4가의 제2 결합 모이어티 그룹을 포함하는 융합 단백질의 제조
상기와 동일한 방식으로 제2 결합 모이어티 그룹을 포함하는 융합 단백질을 제조하였다. 한편, 본 실시예에 따른 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티, 및 IgG1 항체 등에 대한 사항은 다음과 같다.
[실시예 25]
[실시예 26]
[실시예 27]
[실시예 28]
[실시예 29]
[실시예 30]
[실시예 31]
[실시예 32]
[실시예 33]
[실시예 34]
[실시예 35]
[실시예 36]
[실시예 37]
[실시예 38]
[실시예 39]
[실시예 40]
[실시예 41]
[비교예]
비교예 1 내지 비교예 22. 2가의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질의 제조
IgG1 항체 내 중쇄의 C-말단 영역 또는 경쇄의 C-말단 영역 중 어느 하나의 영역에 2개의 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질을 제조하였다(F1, F5). 구체적으로, 상기 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 상기 제1 결합 모이어티 그룹 중 대표적인 결합 모이어티 총 6개(#01, #03, #05, #06, #12, #16), 상기 제2 결합 모이어티 그룹 중 대표적인 결합 모이어티 총 5개(#25, #27, #31, #37, #40)을 사용하였다.
1. 2가의 제1 결합 모이어티 그룹을 포함하는 융합 단백질의 제조
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티로서 결합 모이어티 #01, #03, #05, #06, #12, 또는 #16; IgG1 항체로서 anti-PD-L1 IgG1 항체; 및 상기 IgG1 항체 내 중쇄의 C-말단 영역에 2개의 결합 모이어티가 연결된 구조를 갖는 융합 단백질을 상기 실시예와 동일한 방식으로 제조하였다(비교예 1 내지 비교예 6: F1#01, F1#03, F1#05, F1#06, F1#12, F1#16).
또한, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티로서 결합 모이어티 #01, #03, #05, #06, #12, 또는 #16; IgG1 항체로서 anti-PD-L1 IgG1 항체; 및 상기 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역에 2개의 결합 모이어티가 연결된 구조를 갖는 융합 단백질을 상기 실시예와 동일한 방식으로 제조하였다(비교예 7 내지 12: F5#01, F5#03, F5#05, F5#06, F5#12, F5#16).
2. 2가의 제2 결합 모이어티 그룹을 포함하는 융합 단백질의 제조
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티로서 결합 모이어티 #25, #27, #31, #37, 또는 #40; IgG1 항체로서 anti-PD-L1 IgG1 항체; 및 상기 IgG1 항체 내 중쇄의 C-말단 영역에 2개의 결합 모이어티가 연결된 구조를 갖는 융합 단백질을 상기 실시예와 동일한 방식으로 제조하였다(비교예 13 내지 17: F1#25, F1#27, F1#31, F1#37, F1#40).
또한, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티로서 결합 모이어티 #25, #27, #31, #37, 또는 #40, IgG1 항체로서 anti-PD-L1 IgG1 항체, 및 상기 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역에 2개의 결합 모이어티가 연결된 구조를 갖는 융합 단백질을 상기 실시예와 동일한 방식으로 제조하였다(비교예 18 내지 22: F5#25, F5#27, F5#31, F5#37, F5#40).
[실험예]
실험예 1. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01의 기능성 평가
1-1. 결합 모이어티의 기능성 평가
본 실험예에서는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01의 결합 모이어티 #01에 대한 기능성을 트랜스페린 수용체의 helical 영역에 대한 결합 및 이를 통한 인간 뇌 내피 세포 내 전달 수준 평가를 통해 확인하고자 하였다.
(1) 트랜스페린 수용체의 helical 영역과 결합 모이어티간 결합 확인
상기 제조된 융합 단백질 F3#01에서, helical 영역 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)간 결합을 초저온 전자 현미경법(Cryo-electron microscopy: Cryo-EM)으로 확인하였다. 구체적으로, 유리화 동결시편을 제작하기 위하여, 50mM Tris, 150mM NaCl, 및 pH 7.6 완충 용액을 사용하여 10uM의 L7 TfR 샘플 시료를 준비하였다. 이후, Quantifoil Cu 1.2/1.3 400mesh 그리드를 사용하여, 상기 L7 TfR 샘플 시료에 대한 유리화(Vitrification)를 진행하였다. 이때, 샘플 시료와 그리드간 상호 작용을 증진시키고자, Glow discharger를 사용하여 그리드 표면의 음전하 방전을 유도하였다. 이후, 상기 방전된 그리드 위에 3㎕의 L7 TfR 샘플 시료를 주입하고, blotting time(7초), blotting force(0), waiting time(0초), 4℃, 95% 습도 조건에서 유리화를 진행하였다. 또한, Cryo-EM 분석은 200kV Glycios, 300kV Krios G4, 및 Falcon 4, K3 Detector를 사용하여 수행하였다. 이때, 렌즈는 구면 수차율(2.7),0 50uM 조리개, 배율(120K), exposure time(6.55초)의 조건으로 설정되었다. 또한, 한 샘플 당 50개의 fraction, 225 frames, pixel value 0.894 Å/pix, Dose rate 6.1 e/px/s, Total dose 49.93 e/Å2 조건에서 분석이 진행되었으며, defocus range는 0.25의 간격을 통한 -1.25 ~ -2.75 범위 내에서 분석을 진행하여, 총 500만개 이상의 파티클을 picking한 후, 이를 사용하여 초기 2D classification을 진행하였다. 이후, 최종 약 200만개의 파티클을 선별하여 3D refinement시키고, C1, C2 symmetry를 각각 적용하여 ~3.4Å의 resolution의 3D electron density map을 도출하였다. 해당 맵에서, TfR, transferrin의 co-complex model(PDB:3s9n)을 겹치어, 기존의 결합 방식과 helical 영역 결합 모이어티의 결합 방식 비교를 통하여 결합 위치, 핵심 잔기를 예측하였다.
또한, 상기 helical 영역 결합 모이어티 #01과 트랜스페린 수용체 간 결합을 도킹 시뮬레이션을 통해 확인하였다. 구체적으로 결합 모이어티 #01이 트랜스페린 수용체 helical 영역에 결합능을 가지는지 확인하기 위해 도킹 시뮬레이션을 진행하였다. 결합 모이어티 #01의 구조를 RosettaRelax 프로그램을 사용하여 구조를 모델링하고 트랜스페린 수용체 helical 영역과 상호작용할 것으로 예상되는 위치를 구조정보 및 열역학적 계산을 통해 모델링하였다. 이후, 결합 모이어티의 위치를 임의로 변경하고 helical 영역과의 상호작용을 계산해 가장 안정한 위치를 찾아가는 도킹 시뮬레이션을 RosettaDocking 프로그램을 사용하여 진행하였다. 각 서열번호 당 20,000 번의 시뮬레이션을 진행하였고 나온 데이터를 초기 모델링 구조와의 상동성과 열역학적 구조 안정성을 기준으로 분석하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 트랜스페린 수용체와의 상호 작용에 적용될 수 있는 helical 영역이 외부로 노출되어 있음을 확인하였고, 3.4Å의 resolution의 3D electron density map에서 트랜스페린 수용체와 트랜스페린의 endogenous binding mode를 유지하는 모델을 맞추어 보았을 때, 예측한 이상적인 범위에서 기존의 트랜스페린 수용체에서 나타나지 않았던, glycosylation에 준하는 electron density가 존재함을 확인하였다. 또한, 상기 결합 모이어티와의 결합은 알파 나선 구조의 형상에 부합되도록 형성되었으며, 이를 통하여, 트랜스페린 수용체의 helical 영역과 결합 모이어티간 상호작용을 확인하였다. 아울러, 도 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3에 해당하는 결합 모이어티 #01이 트랜스페린 수용체 helical 영역에 안정적으로 결합하는 것을 확인하였다.
(2) 인간 뇌 내피 세포 내 전달 확인
상기 실험예 1-1의 (1)에서 트랜스페린 수용체와의 결합을 확인한 helical 영역 결합 모이어티 #01이 전술한 상호 작용에 의해, 인간 혈액뇌장벽을 구성하는 인간 뇌 내피 세포인, hCMEC/D3 세포 내로 전달될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 hCMEC/D3 세포는 성장인자가 포함된 endothelial Cell Basal Medium 2(EBM2) 합성 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 이후, 세포 포화도가 80%이 되었을 때, 세포를 분리시킨 후, 40μL의 배양액에 4Х103 세포를 첨가하여, 이를 384 웰 플레이트에 분주하고, 10초간 원심 분리한 후, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 18시간 이상 배양하여 세포를 플레이트 상에 부착시켰다. 한편, 1mg의 결합 모이어티 펩타이드에 1x PBS 500μL을 첨가하고, 이를 혼합하여 자외선-가시광선 분광기로 이의 농도를 측정한 뒤, 상기 펩타이드의 최종 농도가 200μM가 되도록 희석하여 4℃ 조건에서 보관하였다. 이후, 상기 200μM 농도의 펩타이드를 처리 농도의 5배 농도로 EBM2 배양액에 희석하였다. 각 웰에 5배 농도로 희석한 10μL의 펩타이드를 분주한 후, 1,000rpm에서 10초간 원심분리하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2시간 배양하였다. 이후, 상기 배양된 세포를 1x PBS로 세척하고, 각 웰에 75μL의 4% PFA를 분주하고, 실온에서 30분간 보관하여 이들을 고정화하였다. 이 때, 상기 4% PFA에 Hoechst용액을 첨가하여, 핵 염색을 동시에 진행하였으며, 이로부터 30분 후, Cytation5 (Biotek)를 통해 세포를 이미징하여 세포 내 전달 수준을 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 내피 세포주 (hCMEC/D3) 이용한 세포 내 전달 수준 평가를 진행한 결과, 서열번호 3에 해당하는 결합 모이어티 #01의 유효한 세포 내 전달을 확인할 수 있었다.
1-2. 뇌혈관장벽에 대한 투과 수준 평가
본 실험예에서는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 평가하였다.
(1) 시간대별 뇌 조직 내 IgG1 항체 수준 평가
C57BL/6 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질 F3#01을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다. 이로부터 1일, 4일, 7일, 또는 14일이 경과한 시점에서, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, 눈 안쪽의 혈관 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취하였다. 이후, 생리식염수를 관류(perfusion)시켜 혈액을 제거하였다. 뒤이어, 상기 마우스의 뇌를 적출하고, 상기 적출된 뇌 조직을 액체 질소로 급속 냉동시킨 뒤, 사용 전까지 deep freezer에 보관하였다. 한편, 적출된 뇌 조직을 단백질 추출 용액을 사용하여 균질화시킨 뒤, 상기 균질화된 뇌 조직 샘플을 회전 믹서를 사용하여, 4℃에서 용해시켰다. 이후, 상기 용해된 뇌 조직 샘플을 원심분리하고, 이로부터 상층액을 수득하여 뇌 조직 용해물(Brain lysate)을 준비하였다. 이후, 뇌 조직 용해물 내 IgG1 항체의 수준은 human IgG1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 단백질 추출 용액을 사용하여 각 농도에 맞게 희석하여 standard(STD)를 준비하였으며, 단백질 추출 용액을 사용하여 각각의 희석 배율에 맞춰 뇌 조직 용해물을 포함하는 샘플(SPL)을 준비한 뒤, 이를 각 well당 50uL씩 첨가하였다. 이후, ELISA kit에 들어 있는 Ab cocktail을 각 well당 50uL 추가로 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 반응시켰다. 이후, 플레이트를 세척한 뒤, 여기에 TMB substrate를 각 well당 100 uL씩 첨가하였다. 뒤이어, microplate reader기를 사용하여 파장값 600 nm에서 STD1의 O.D값이 1.0에 도달 했을 때 stop 용액을 넣고 파장값 450 nm에서의 값을 측정 후 4 parameter logistic regression을 사용하여 표준 곡선(standard curve)을 획득하고, 이로부터 샘플(SPL) 내 존재하는 IgG1 항체의 농도를 산출하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 F3#01 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 투여 후 14일째까지 대조군에 비해 현저히 높게 관찰되었다. 구체적으로, F3#01 투여군의 경우, 대조군 대비 약 25배에서 약 320배까지 높은 수준의 전달을 보여주었다.
(2) ISF 샘플을 이용한 뇌 조직 내 IgG 항체의 수준 평가
융합 단백질이 뇌혈관장벽을 투과한 후, brain parenchyma에 결합하지 않은 형태로 존재하는 융합 단백질(ISF 샘플에 존재하는 융합 단백질)의 양을 검출한 뒤, 상기 검출 값에 대한 recovery를 진행하여, 뇌 혈관으로부터 뇌 실질로 유입된 융합 단백질의 양, 즉, 뇌혈관장벽을 투과한 융합 단백질의 양을 평가하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스를 마취시킨 뒤, 상기 마우스 두부의 피부를 절개하고, drill을 사용하여 해마 영역과 인접한 두개골에 천공을 형성하였다. 이후, 상기 형성된 두개골 천공에 guide cannula를 삽입하고, 레진으로 사용하여 이를 고정시켰다. 상기 절개된 피부를 봉합하여 두개골 천공 영역이 외부로 노출되지 않도록 처치한 뒤, 상기 마우스를 2주간 회복시켰다. 이후, 상기 회복된 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질(F3#01)을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였다.
상기 마우스에 융합 단백질을 정맥 투여한 후 4시간, 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, IgG1 항체 검출을 위해 활성화시킨 프로브를 마우스의 probe guide cannula에 삽입하였다. 이후, 일정한 속도로 BSA가 포함된 뇌척수액(CSF: cerebrospinal fluid)을 흘려주면서, 상기 융합 단백질이 포함된 간질액(ISF: interstitial fluid) 샘플을 채취한 뒤, 이를 -20℃ 조건에서 보관하였다. 이후, 상기 ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준은 human IgG1 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, N.S sample buffer를 사용하여 각 농도에 맞게 희석한 standard(STD) 및 샘플(SPL)을 준비한 뒤, 이들을 각 well당 50uL씩 첨가하였다. 이후, ELISA kit에 들어 있는 Ab cocktail을 각 well당 50uL 추가로 첨가한 뒤, 이를 4℃에서 인큐베이팅하였다. 이후, 플레이트를 세척한 뒤, 여기에 TMB substrate를 각 well당 100 uL씩 첨가하였다. 뒤이어, microplate reader기를 사용하여 파장값 600 nm에서 STD1의 O.D값이 1.0에 도달 했을 때 stop 용액을 넣고 파장값 450nm에서의 값을 측정하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 F3#01 투여군은 대조군에 비해 ISF 샘플 내 IgG1 항체의 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다.
(3) 동물 모델의 뇌 혈관 이미징을 통한 IgG 항체 수준 평가
두개골 창(cranial window)이 설치된 동물 모델 및 이광자 현미경을 사용하여, 실시간으로 뇌혈관 영역의 영상을 획득하고 뇌혈관 장벽에서 융합 단백질의 transcytosis 현상을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 두개골 창이 설치된 Tie2-GFP Tg 마우스를 이용해 Pial 혈관이 시작되는 영역부터 cortical layer 2-3를 포함하는 ~300μm 정도의 깊이까지 이광자 현미경을 통해 구조 영상을 획득하였다. 이후, Alexa-568이 결합된 융합 단백질의 transcytosis를 관찰하기 위하여, Alexa-568와 결합된 융합 단백질 26 mg/kg을 미정맥을 통해 주입하였다. 상기 융합단백질의 주입 후 1일째 획득한 영상과 동일한 3차원 영역에서, 1채널로 GFP를, 제2채널로 융합 단백질에 결합된 Alexa-568의 형광 강도를 측정하였다. 상기 형광강도의 측정은 postcapillary venule로부터 최소 3분절 이상의 혈관이 포함되는 영역에서 100nm 이하의 공간 해상도와 1분 이내의 시해상도를 가지는 조건에서 20분 동안 이루어졌다. transcytosis 현상을 관찰하기 위하여 획득된 모든 시계열 영상을 최초의 시계열 영상에 정합 하여 최초의 시계열 영상의 좌표로 정합 한 뒤, 제1채널 GFP 신호로 혈관내, 혈관벽 및 혈관밖의 영역으로 구분하였다. 상기 제1채널 GFP 신호로 구분된 혈관내, 혈관벽 및 혈관밖의 영역을 기준으로 제2채널에서 관찰되는 융합 단백질에 결합된 Alexa-568 신호 중, 혈관벽 근처에서 군집화 되어 있는 영역을 혈관내(ROI 1; region of interest), 혈관벽(ROI 2) 및 혈관밖(ROI 3) 영역으로 재지정 하여 시간별로 3개 ROI 에서의 융합 단백질에 결합된 Alexa-568 농도 변화를 관찰하였다.
일 실시예에 따른 융합 단백질 주입 후 1일째의 실시간 transcytosis 변화를 3개 ROI에서 20분 동안 실시간으로 관찰한 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 혈관내(ROI 1) 융합 단백질의 농도 변화는 관찰할 수 없었으며, 군집이 존재하는 혈관벽(ROI 2)에서의 융합 단백질은 10분 동안 군집을 형성한 뒤, 혈관 바깥쪽으로 이동하며 융합 단백질의 농도가 낮아지다가 더 이상 군집이 관찰되지 않는 순간부터(>10분) 이의 농도가 평형 상태로 관찰되는 것을 확인하였다. 또한, 혈관밖(ROI 3)의 영역에서 융합 단백질의 농도 변화는 최초 혈관벽(ROI 2)에서 관찰된 융합 단백질 군집이 약 6분뒤 혈관밖의 영역에 도달함과 동시에 융합 단백질의 농도가 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이후 약 12분째 농도가 최대치에 도달하는 것이 관찰되었다. 상기 결과를 통해 융합 단백질의 transcytosis가 뇌 혈관 장벽 부근에서의 군집화를 통해 일어나며, 이후, 수 분 이내에 상기 융합 단백질은 혈관밖으로 빠져나감을 알 수 있었다.
1-3. 결합 모이어티의 가수 변화에 따른 기능성 평가
C57BL/6 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질 F3#01, F1#01, F5#01을 각각 제제화한 뒤, 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 상기 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로 측정하였다. 이후, 4 parameter logistic regression을 사용하여 표준 곡선(standard curve)을 획득하고, 이로부터 샘플(SPL) 내 존재하는 IgG1 항체의 농도를 산출하였다. 이와 더불어, 뇌 혈관 내부의 항체 전달 상태를 관찰하기 위하여 상기 융합 단백질을 정맥 투여한 후 1일이 경과한 시점에서 동물의 뇌를 적출하였다. 동물을 마취한 후 동물의 흉강을 개복하여 좌심실에 나비침을 삽입하여 생리식염수를 주입하고 우심방으로 배출하여 체내 혈액을 제거하였다. 그 후, 4% paraformaldehyde(PFA)를 주입하여 세포를 고정하고 두개골을 절개하여 뇌를 추출하였다. 추출한 뇌는 하루동안 4% PFA에 보관하여 추가적인 세포 고정을 하고, 그 후 30% sucrose 용액에 3일간 보관하여 뇌 절편 제작 시에 세포가 파괴되는 것을 방지하였다. 3일간 30% sucrose 용액에 저장된 마우스의 뇌를 뇌 절편 제작 틀에 넣고 optimal cutting temperature compound 용액을 주입하고, -60℃에 보관하여 뇌를 냉각하였다. 냉각된 뇌 샘플을 micro-cryostat을 이용하여 40μm 두께의 뇌 절편을 만들어 각 뇌 절편을 면역염색에 이용하였다. 이후, 트랜스페린 수용체 항체와 상기 융합 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 염색을 실시한 뒤, 이를 공초점 현미경으로 촬영하여 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정맥 투여 후 4일이 경과한 시점에서, 상기 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 대조군 대비 상대적인 값으로 수치화하여 비교한 결과, 대조군에 비해, 중쇄 C-말단 및 경쇄 C-말단 4개의 영역 각각에 결합 모이어티가 연결된 4가 융합단백질 투여 군, 즉, F3#01 투여군은 약 80배 가량 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다. 반면, 중쇄 C-말단 또는 경쇄 C-말단 2개의 영역에 결합 모이어티가 연결된 2가 융합 단백질 투여군, 즉, F1#01, 및 F5#01 투여군은 동일한 결합 모이어티를 사용하였음에도 불구하고, IgG1 항체의 수준은 대조군과 유의적인 차이를 보여주지 못하였다.
또한, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, F1#01, 및 F5#01 투여군은 뇌 혈관에서 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합이 관찰되지 않았던 반면, F3#01 투여군에서는 뇌 혈관에서 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 결합이 존재함을 확인하였고, 이러한 결과를 정량화한 결과, 트랜스페린 수용체가 위치하는 영역에 존재하는 융합 단백질의 수준은 유의미한 차이를 보여주었다.
1-4. 융합 단백질과 트랜스페린 수용체간 상호작용 평가
상기 실험예 1-2에서 확인한 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성은 결합 모이어티와 뇌 조직에 존재하는 트랜스페린 수용체간 상호 작용에 기인한다는 전제 하에서, 상기 융합 단백질, 즉, 4가의 결합 모이어티와 트랜스페린 수용체간 상호 작용을 확인하고자 negative staining transmission electron microscope(TEM) 분석을 진행하였다. 구체적으로, 상기 융합 단백질과 트랜스페린 수용체(TfR)가 함께 첨가된 샘플을 실험군으로 준비하였고, 대조군으로서 (1) native TfR만 첨가된 군, (2) 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체만 첨가된 군, (3) 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체와 TfR이 함께 첨가된 군을 설정하였다. 모든 샘플은 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4조건의 완충용액을 사용하여 15uM 기준으로 정량화하였고, 융합 단백질/IgG1 항체와 TfR가 함께 첨가된 군은 molar ratio (1:2) 조건으로 이들을 혼합한 후 4℃에서 1시간 동안 반응을 진행하였다. 이후, 모든 샘플을 적정 농도로 희석한 뒤, TEM 그리드 샘플링을 진행하였다. 전자현미경 시편을 위한 그리드는 400 mesh F/C Cu 그리드를 사용하였으며, 상기 준비된 10ul의 샘플을 그리드 위에 주입하고 1분간 반응시킨 후 필터페이터를 이용하여 이를 제거하였다. 이후, 10ul의 2% 우라닐아세테이트 용액을 상기 그리드 위에 주입한 후, 다시 필터페이터를 이용하여 남은 용액을 제거하였다. 또한, 상기 그리드를 상온 조건에서 12시간 정도 노출시켜 남아있는 수분을 전부 제거하였다. 상기와 같이 준비된 그리드 시편은 60kV Jeol Gatan TEM을 사용하여 관찰하였으며, 60K - 200K 배율상에서 negative staining 샘플 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체와 TfR이 함께 첨가된 군(도 12의 (c))은, native TfR 및 결합 모이어티를 포함하지 않은 IgG1 항체 중 어느 하나만 첨가한 군(도 12의 (a), 및 (b))과 마찬가지로, 각각의 성분들이 상대적으로 균질하게 분포하였는 바, 이들간 상호 작용이 없음을 확인하였다. 반면, 일 실시예에 따른 융합 단백질 및 native TfR이 첨가된 군(도 12의 (d))은 트랜스페린 수용체와의 상호 작용에 의해 복합체를 형성하였다. 또한, 이러한 실험 결과에 미루어 볼 때, 도 13에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 4가의 결합 모이어티 각각은 트랜스페린 수용체의 helical 영역과 상호 작용하여 복합체를 형성함을 알 수 있었다. 특히, 상기 실험예 1-3에서의 실험 결과(도 9 참조)를 고려해 볼 때, 본 실시예의 실험 결과는 상기 복합체 내에서의 상호 작용이 뇌혈관장벽에 대한 투과성을 향상시키는 주요한 요소가 될 수 있음을 나타내는 것이다.
1-5. 뇌 조직에 대한 선택적 전달 효능 평가
본 실험예에서는 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 평가하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스에 20mg/kg의 융합 단백질 F3#01을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였으며, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다. 이후, 이로부터 1일, 또는 4일이 경과한 시점에서, 총 6개의 장기 (뇌, 폐, 비장, 신장, 간, 근육) 내 IgG1 항체의 수준을 상기 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로 측정하여 비교하였다.
그 결과, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 정맥 투여한 후, 이로부터 1일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기 별 분포 수준은 도 14에 나타낸 바와 같고, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기별 분포 수준은 도 15에 나타낸 바와 같다. 즉, 대조군으로서 정맥 투여된 IgG1 항체는 장기 중 폐에서의 분포가 가장 높게 관찰되고 뇌 조직에서의 분포는 상대적으로 낮게 관찰되었던 반면, F3#01 투여군은 다른 장기에 비해 뇌 조직에서 매우 높은 수준의 IgG1 항체가 분포됨을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 일 실시예에 따른 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질은 정맥 투여 시 뇌 조직에 대한 선택적인 분포로 인해, 뇌 조직 외 다른 조직에서의 IgG 항체 분포를 감소시킴으로써, 항체 기반 약물의 부작용을 경감시키는데 기여할 수 있음을 알 수 있었다.
1-6. 뇌 조직에 대한 선택적 전달에 의한 부작용 경감 효과 평가
(1) 망상적혈구 수준 평가
일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 투여한 후, 트랜스페린 수용체가 다량 발현되어 있는 세포 중 하나인 망상적혈구(Reticulocyte)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스에 20mg/kg 또는 50mg/kg의 융합 단백질 F3#01을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였다. 상기 마우스에 융합 단백질을 정맥 투여한 후 0일, 1일, 4일, 또는 7일이 경과한 시점에서, 마우스의 눈 안쪽 혈관으로부터 50㎕의 혈액 샘플을 heparinized capillary tube를 사용하여 수득하였다. 이후, 30㎕의 혈액 샘플과 100ul의 New methylene blue 용액을 혼합한 뒤, 상기 혼합 용액을 실온에서 일정 기간 방치하였다. 이후, 염색된 혈액 샘플을 슬라이드 글라스에 도말한 뒤, 이를 현미경으로 관찰하여 전체 적혈구 세포 중 망상적혈구 세포가 차지하는 비율(%)을 산출하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체를 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01이 투여된 군에서, 전체 적혈구 세포 중 망상적혈구 세포가 차지하는 비율은 대조군과 유사한 수준을 나타내었다.
(2) 약동학적 평가
일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01을 마우스에 투여한 후, 혈장에서의 약동학적 평가를 수행하였다. 구체적으로, 마우스에 20mg/kg의 융합단백질 F3#01을 포함하는 제제를 미정맥을 통해 정맥 투여하였다. 상기 마우스에 융합 단백질을 정맥 투여한 후 30분, 120분, 360분, 1일, 2일, 4일, 7일, 또는 14일이 경과한 시점에서, 마우스로부터 혈액 샘플을 수득하였다. 이후, 원심분리하여 혈장 시료를 분리한 후, 액체크로마토그래프 질량분석 (LC-MS)을 위한 전처리를 수행하고, 이어서, 상기 시료를 대상으로 LC-MS 분석을 실시하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체를 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01이 투여된 군의 혈장 PK 프로필은 대조군과 유사하였는 바, 상기의 실험 결과는 트랜스페린 수용체를 포함하는 여러 장기에 대한 융합 단백질의 분포가 미미함을 나타낸다.
(3) Blood-to-plasma ratio 산출
상기의 실험 결과가 뇌 조직에 대한 선택적인 전달, 즉, 트랜스페린 수용체를 포함하는 망상적혈구 세포 및 다른 장기 조직과의 비-결합으로부터 비롯된 것임을 검증하고자, blood-to-plasma ratio (혈액 상층액의 peak area ratio / 혈장의 peak area ratio)를 산출하였다. 구체적으로, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01의 최종 농도 40 μg/mL가 되도록 혈장 및 혈액 샘플에 첨가한 후, 이를 30분 동안 실온에 방치하였다. 이후, 혈액 샘플에 대해서는 원심분리 후, 혈액 상층액을 별도로 수득하였다. 상기 혈장 및 혈액 상층액 샘플을 계면 활성제가 포함된 PBS 용액, 및 자성 비드와 혼합하고, 상기 혼합물을 배양한 뒤, 상기 배양물을 계면 활성제가 포함된 PBS로 2회 세척하였다. 여기에, RapiGest 계면활성제 및 dithiothreitol을 첨가한 뒤, 60 ℃조건에서 50분 동안 배양하고, 이를 10 분간 실온에 방치하였다. 이후, 여기에 1) iodoacetic acid를 첨가한 뒤, 실온의 암 조건에서 30분간 배양, 2) trypsin을 첨가한 뒤, 60℃ 조건에서 24시간 배양, 3) HCl을 첨가한 뒤, 37℃ 조건에서 30분간 배양을 순차적으로 실시하였다. 이후, 상기 배양물을 원심분리하여, 상층액을 수득한 뒤, trypsin을 첨가하고, LC-MS를 이용하여 blood-to-plasma ratio (혈액 상층액의 peak area ratio / 혈장의 peak area ratio)를 산출하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체 처리 군을 사용하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#01이 투여된 군의 blood-to-plasma ratio 역시 대조군과 유사한 수준을 보여주었는 바, 상기의 실험 결과는 트랜스페린 수용체를 포함하는 망상적혈구 세포와 융합 단백질간 결합이 형성되지 않았다는 점으로부터 기인한 것임을 알 수 있었다. 또한, 일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌 조직이외 다른 장기에서 트랜스페린 수용체 매개 전달의 수준이 높지 않으며, 이로부터 뇌 조직에 대한 선택적인 전달을 확인하였다.
1-7. 반복된 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질의 기능성 평가
본 실험예에서는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 반복되도록 변형한 경우에도, 전술한 융합 단백질의 기능성을 유지할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티로서 서열번호 3의 모이어티가 2회 반복된 결합 모이어티; IgG1 항체로서 Anti-PD-L1 IgG1 antibody; 및 상기 IgG1 항체 내 중쇄 및 경쇄 각각의 C-말단에 총 4개의 결합 모이어티가 연결된 구조를 갖는 융합 단백질을 상기 실시예와 동일한 방식으로 제조하였다 (F3'#01).
(1) 시간대별 뇌 조직 내 IgG1 항체 수준 평가
일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로 평가하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, F3'#01 투여군의 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준은 투여 후 7일째까지 대조군에 비해 높게 관찰되었다. 구체적으로, F3'#01 투여군의 경우, 대조군 대비 약 18배에서 약 160배까지 높은 수준의 전달을 보여주었다.
(2) 뇌 조직에 대한 선택적 전달 효능 평가
일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 장기별 분포 수준을 실험예 1-5와 동일한 방식으로 평가하였다.
그 결과, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 정맥 투여한 후, 이로부터 1일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기 별 분포 수준은 도 20에 나타낸 바와 같고, 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3'#01을 정맥 투여한 후, 이로부터 4일이 경과한 시점에서, IgG1 항체의 장기별 분포 수준은 도 21에 나타낸 바와 같다. 즉, F3'#01 투여군은 다른 장기에 비해 뇌 조직에서 매우 높은 수준의 IgG1 항체가 분포됨을 확인하였다.
상기의 결과로부터, 일 실시예에 따른 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 반복되도록 변형한 경우에도, 기존과 동일하게, 뇌 조직 내 흡수 수준 증진, 및 뇌 조직에 선택적 전달과 같은 고유의 기능성을 발휘할 수 있음을 알 수 있었다.
1-8. 트랜스페린 수용체의 뇌 조직에서의 특이적 발현 양상 확인
일 실시예에 따른 4가의 결합 모이어티가 항체의 경쇄 C-말단 및 중쇄 C-말단에 연결된 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질은 상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성으로 인해, IgG1 항체에 대한 뇌 조직으로의 전달이 현격하게 증진될 뿐만 아니라, 타 장기 대비 뇌 조직에 대한 선택적인 전달로 인해, 높은 생체 안전성을 나타냄을 실험적으로 확인하였다. 이러한 효능은 일 실시예에 따른 결합 모이어티와 뇌 조직에 존재하는 트랜스페린 수용체간 상호 작용에 기인한다는 전제 하에서, 본 실험예에서는 뇌 조직에 분포하는 트랜스페린 수용체의 발현 양상 및 이의 특성을 확인하고자 하였다.
(1) 트랜스페린 수용체의 장기별 분포 확인
C57BL/6 마우스의 안와정맥 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취한 뒤, 생리식염수를 관류(perfusion)시켜 혈액을 제거하였다. 관류가 완료된 마우스로부터 뇌 조직을 적출하고, 상기 뇌 조직으로부터 brain vessel, parenchyma와 choroid plexus를 별도로 분리한 뒤, RIPA buffer를 이용하여 total protein을 추출하였다. 간, 폐, 신장, 비장과 같은 다른 장기에 대해서는 소량의 조직을 채취하여 RIPA buffer를 이용하여 total protein을 추출하였다. 상기 추출한 단백질을 SDS-PAGE sample buffer 와 섞은 후 denaturation 하여 SDS-PAGE gel에 loading 한 후 PVDF membrane에 transfer 하였다. 이후, anti-TfR과 beta-actin antibody를 1차 항체로 사용하여 각각의 단백질 밴드를 membrane 상에서 확인한 뒤, Image J software를 이용하여 이들의 intensity를 측정하였다.
그 결과 도 22에 나타낸 바와 같이, 각 장기에서 발현된 트랜스페린 수용체를 정량화하여 확인한 결과, 트랜스페린 수용체는 뇌 혈관, 및 혈액 세포에서 다량 발현되며, 비장에서도 유의적인 수준의 트랜스페린 수용체가 발현되어 있음을 확인하였다. 상기의 실험 결과로부터, 일 실시예에 따른 융합 단백질의 뇌 조직에 대한 선택적인 전달은 단지 각 장기별 트랜스페린 수용체 발현의 양적 차이로부터 비롯된 것이 아니라, 뇌 혈관에서 특이적 발현 양상을 갖는 트랜스페린 수용체와 일 실시예에 따른 결합 모이어티간 상호 작용, 또는 이러한 상호 작용을 형성할 수 있는 기능적 구조가 주요한 요인으로 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.
(2) 트랜스페린 수용체 클러스터의 발현 양상 비교
C57BL/6 마우스의 안와정맥 또는 복대 정맥에서 혈액을 채취한 뒤, 생리식염수를 관류시켜 혈액을 제거하였다. 한편, 뇌 조직은 saline 및 4% paraformaldehyde로 순서대로 perfusion하여 면역조직학법을 이용한 뇌 절편 염색을 위한 뇌 조직 시료를 준비하였다. 이후, 뇌 절편의 제작을 위하여, 상기 뇌 조직을 틀에 첨가하고, 여기에 tissue freezing medium 을 뇌 조직이 충분이 잠길 수 있을 만큼 첨가한 후, 이를 -70℃의 deep freezer에 하루 동안 보관하였다. 빙결된 뇌 블록은 cryostat에 의해 40 μm 두께의 절편으로 절편화되었다. 상기 절편은 0.1% sodium azide이 포함된 PBS 용액에 사용 전까지 보관되었다.
이후, 24-웰 플레이트에 조직 절편을 첨가하고, 이를 0.5% Triton-X 100이 포함된 500μl의 PBS 용액과 상온에서 20분간 반응시켰다. 이후, 상기 용액을 PBS 용액으로 교체한 뒤, 플레이트 교반기를 사용하여 이를 혼합하였다. 이후, 조직 절편을 5% BSA 및 0.1% Triton-X 100이 포함된 PBS 용액에 첨가하고, 이를 2시간 동안 상온에서 반응시킨 뒤, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 여기에 transferrin receptor 항체, 및 CD31 항체를 첨가한 후, 4℃ 조건에서 밤새도록 반응을 유도한 후, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이후, 여기에 anti-Rat Alexa488 및 anti-Goat Alexa568을 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 다시 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어서, DAPI가 포함된 PBS 용액을 첨가하고, 이를 상온에서 10분간 반응시켰다. 상기와 같이 처리된 조직 절편을 slide glass 상에 올린 뒤, 100㎕의 mounting solution을 도포하였다. 이후, 상기와 같이 처리된 조직 절편을 cover glass로 덮은 뒤, 이를 sealing 하였다.
염색된 샘플에 대한 형광 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 수득하였다. LAS-X software로 촬영하며 UV intensity 4%, white laser power 70% (488 - 15%, 568 - 10%)로 광원 세기를 조절하였다. magnification은 40X objective lens를 사용하고, pixel resolution 284nm를 설정하여 촬영을 진행하였으며, 하나의 조직 절편 당 1μm 두께로 총 20μm 두께에 대한 이미지를 획득하였다. 또한, 염색된 샘플에 대한 초고해상도 형광 이미지는 STED 공초점 현미경을 사용하여 수득하였다. LAS-X software로 촬영하며 UV intensity 6%, white laser power 70% (488 - 15%, 568 - 10%)로 광원 세기를 조절하였다. magnification은 100X objective lens를 사용하고, software zoom 및 STED 기능을 이용하였다. 또한, 상기 magnification은 pixel resolution 50nm를 설정하여 촬영을 진행하였으며, 하나의 조직 절편 당 100nm 두께로 총 3μm 두께에 대한 이미지를 획득하였다.
이후, 획득된 이미지를 ImageJ와 MATLAB software를 사용하여 분석하였다. 공초점 형광 이미지 및 STED 공초점 형광 이미지 분석을 위한 전처리 과정으로서, sigma 값을 1.0으로 설정하여 gaussian blur를 진행하였으며, 각각의 이미지를 같은 크기로 자르고 색상 채널에 맞게 대표 이미지를 제작하였다. signal-to-noise ratio를 높이기 위하여 ImageJ software의 plugin을 활용하여 background subtraction을 rolling ball algorithm을 통해 진행하였다. 트랜스페린 수용체의 signal인 green signal을 intensity histogram에 맞게 정규화하고, local thresholding method를 이용하여 binary 이미지를 획득하였다. masking된 복수 개의 트랜스페린 수용체 클러스터는 analyze particle 기능을 이용하여 최소 pixel 단위인 2500nm2 이상의 넓이를 지닌 pixel만을 선택하여 클러스터 크기의 분포도를 확보하였다. 상기 분포도는 총 4마리의 C57BL/6 마우스에서 각 장기별 10개의 세포 및 조직에 대하여, 장기당 총 40개의 세포에서 관찰된 transferrin receptor의 분포도를 표본으로 하였다. 또한, MATLAB을 이용하여 ImageJ에서 얻은 분포도 결과를 histogram으로 전환하고, smooth function을 이용하여 histogram의 추세선을 획득하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 뇌 조직, 간, 비장, 폐, 및 망상적혈구에 발현된 트랜스페린 수용체는 트랜스페린 수용체 클러스터 형태로 분포하고 있음을 확인하였다. 또한, 도 24에 나타낸 바와 같이, 뇌 조직 혈관, 망상적혈구, 폐, 간, 및 비장에서 발현된 트랜스페린 수용체 클러스터의 크기에 대한 양적 분포를 비교한 결과, 뇌 조직의 혈관 영역에서는 타 조직과 다르게 상대적으로 작은 크기의 트랜스페린 수용체 클러스터가 밀집되어 있음을 확인하였다.
(3) 장기별 트랜스페린 수용체 클러스터의 특성 평가
A. 형광 강도 평가를 통한 상대적인 밀집도 평가
장기별 트랜스페린 수용체 클러스터의 특성을 평가하고자, 뇌 조직 혈관과 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체 클러스터의 intensity 평균값을 평가하였다. 구체적으로, 실험예 1-8의 (2)와 동일한 방식으로 트랜스페린 수용체 클러스터를 이미징한 뒤, masking된 트랜스페린 수용체 클러스터를 analyze particle 기능을 이용하여 최소 pixel 단위인 2500nm2 이상의 넓이를 지닌 pixel로 추출하였다. 이후, 추출된 이미지를 mask 이미지로 만든 뒤, MATLAB을 이용하여 ImageJ에서 얻은 mask 이미지와, background subtraction을 수행한 image를 곱하여 cluster mask에서 green signal의 intensity를 계산하였다.
그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 뇌 조직 혈관에서, 더 높은 강도의 green signal intensity가 관찰되었으며, 이는 뇌 조직 혈관의 트랜스페린 수용체 클러스터는 망상적혈구에 비해, 더욱 많은 수의 트랜스페린 수용체가 밀집해 있음을 나타낸다.
B. 면역블랏 및 영상 분석을 통한 정량적인 밀집도 평가
C57BL/6 마우스의 뇌 혈관 조직 및 망상적혈구에서 FACS를 통해 50,000개의 세포를 채취하여 RIPA buffer를 이용해 total protein을 추출하였다. 상기 추출한 단백질을 sample buffer와 섞은 후 denaturation 하여 SDS-PAGE gel에 loading 한 후 PVDF membrane에 transfer 하였다. 이후, anti-TfR antibody를 1차 항체로 사용하여 각각의 단백질 밴드를 membrane 상에서 확인한 뒤, Image lab software(Biorad)를 이용하여 이들의 intensity를 측정하였다. 두가지 세포에서 측정된 트랜스페린 수용체 단백질 밴드의 intensity는 재조합 트랜스페린 수용체 밴드의 standard curve를 이용해 단일 세포당 트랜스페린 수용체 개수로 정량되었다. 다음으로, 단일 세포당 트랜스페린 수용체 밀도를 산출하기 위하여, 상기 기술된 STED 공초점 현미경에서 측정한 트랜스페린 수용체 클러스터의 평균 직경 및 개수를 이용하여 단일세포내 트랜스페린 수용체 클러스터의 총 면적을 산출하였고 상기 정량된 수용체 개수를 산출한 총 면적으로 나누어 단일세포내 클러스터 면적당 트랜스페린 수용체의 개수를 계산하였다. 계산된 트랜스페린 수용체의 개수는 아보가드로수로 나누어 면적당 몰 농도로 변환하였다. 이때, 트랜스페린 수용체는 이량체로 존재하기 때문에, 산출한 몰 농도는 절반의 값으로 변환하였다. 클러스터 내부에 존재하는 트랜스페린 수용체 사이의 거리는 정사각형 격자형태로 수용체가 채워진다는 전제 하에서, 이량체의 트랜스페린 수용체 내 중심점으로부터 이웃하는 수용체의 중심점까지의 거리로 계산하였으며, 도 26에 나타낸 바와 같이, 트랜스페린 수용체 중심으로부터 표면까지의 거리는 장축과 단축의 경우로 결정된다. 즉, 복수 개의 트랜스페린 수용체를 격자 형태로 배열/정렬한 경우, 이량체의 장축을 중심으로 수용체와 이웃하는 수용체 표면 사이의 거리를 최소값(min), 이량체의 단축을 중심으로 수용체와 이웃하는 수용체 표면 사이의 거리를 최대값(max)으로 산출한 뒤, 이들의 평균값(average)으로 평가하였다.
뇌 혈관 및 망상적혈구간 전체 트랜스페린 수용체의 밀도 및 트랜스페린 수용체 간 거리를 평가한 결과는 도 27 및 도 28에 나타낸 바와 같다. 구체적으로, 도 27에 나타낸 바와 같이, 뇌 혈관의 단일 세포별로 발현된 트래스페린 수용체의 밀도에 대한 분포는 망상적혈구에 비해 통계적으로 유의미하게 높게 관찰되었다. 또한 단일세포의 클러스터 내부에 발현하고 있는 트랜스페린 수용체 사이의 표면간 거리에 대한 분포를 산출한 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, 뇌 혈관 세포의 트랜스페린 수용체 사이의 표면간 거리는 망상적혈구에 비해 통계적으로 유의미하게 짧게 관찰되었다. 즉, 뇌혈관 세포의 트랜스페린 수용체 클러스터 내부는 트랜스페린 수용체의 발현 패턴이 망상적혈구보다 밀집되어 있음을 확인하였다.
상기의 실험 결과를 종합하면, 뇌 조직의 혈관 영역에서의 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터의 분포 양상은 일 실시예에 따른 4가의 결합 모이어티가 항체의 경쇄 C-말단 및 중쇄 C-말단에 연결된 기능적 구조를 포함하는 융합 단백질과의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 이러한 뇌 조직에서의 특이적인 상호 작용을 유도하는 트랜스페린 수용체 클러스터의 특이적인 발현 패턴은-뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성 및 IgG1 항체에 대한 뇌 조직으로의 선택적인 흡수를 가능하게 하는 인자로 작용함을 알 수 있었다.
실험예 2. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#02 내지 F3#41의 기능성 평가
본 실험예에서는 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 4가로 연결된 융합 단백질에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티를 변형시킨 경우에도 전술한 융합 단백질의 기능성이 발휘될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
2-1. 결합 모이어티의 기능성 평가
일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질의 결합 모이어티에 대한 기능성을 트랜스페린 수용체의 helical 영역에 대한 결합 및 이를 통한 인간 뇌 내피 세포 내 전달 수준 평가를 통해 확인하고자 하였다.
(1) 트랜스페린 수용체의 helical 영역과 결합 모이어티간 결합 확인
상기 실시예에서 제조된 융합 단백질의 helical 영역 결합 모이어티 모이어티 #02, #03, #05 내지 #25, #27, #30, #32, #33, #34, #36, #38, #39와 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR) 간 결합을 도킹 시뮬레이션을 통해 확인하였다. 상기 결합 모이어티의 구조를 RosettaRelax 프로그램을 사용하여 구조를 모델링 하고 트랜스페린 수용체 helical 영역과 상호작용할 것으로 예상되는 위치를 구조정보 및 열역학적 계산을 통해 모델링 하였다. 이후 결합 모이어티의 위치를 임의로 변경하고 helical 영역과의 상호작용을 계산해 가장 안정한 위치를 찾아가는 도킹 시뮬레이션을 RosettaDocking 프로그램을 사용하여 진행하였다. 각 서열번호 당 20,000 번의 시뮬레이션을 진행하였고 나온 데이터를 초기 모델링 구조와의 상동성과 열역학적 구조 안정성을 기준으로 분석하였다.
그 결과, 도 29 내지 도 34에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 결합 모이어티가 트랜스페린 수용체 helical 영역에 안정적으로 결합하는 것을 확인하였다.
(2) 인간 뇌 내피 세포 내 전달 확인
상기 실시예에서 제조된 융합 단백질의 helical 영역 결합 모이어티 #04, #16, #19, #20, #25 내지 #29, #31, #34 내지 #38, #40, 및 #41과 트랜스페린 수용체간 상호 작용에 의해, 인간 혈액뇌장벽을 구성하는 인간 뇌 내피 세포인, hCMEC/D3 세포 내로 전달될 수 있는지 여부를 실험예 1-1의 (2)와 동일한 방식으로 평가하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 35 내지 도 40에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 내피 세포주 (hCMEC/D3) 이용한 세포 내 전달 수준 평가를 진행한 결과, 일 실시예에 따른 결합 모이어티의 유효한 세포 내 전달을 확인할 수 있었다.
2-2. 융합 단백질의 뇌혈관장벽에 대한 투과 수준 평가
일 실시예에 따른 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 F3#02 내지 F3#41의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로, 정맥 투여 후 2일 또는 4일이 경과한 시점에서 평가하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 정맥 투여한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 41 내지 도 45에 나타낸 바와 같이, helical 영역에 대한 결합 특성을 보유하되, 아미노산 서열이 각기 상이한 제1 결합 모이어티 그룹을 사용하여 제조된 실시예 2 내지 24의 융합 단백질 F3#02 내지 F3#24 투여군은 모두 대조군에 비해 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 46 내지 도 49에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3의 결합 모이어티와의 서열 동일성을 일정 수준 이상 유지하되, 아미노산 서열 중 일부가 치환, 삽입, 또는 결실된 제2 결합 모이어티 그룹을 사용하여 제조된 실시예 25 내지 41의 융합 단백질 F3#025 내지 F3#41 투여군 역시 모두 대조군에 비해 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준이 현저하게 증가됨을 확인하였다.
상기의 실험 결과를 종합하면, 일 실시예에 따른 융합 단백질은 트랜스페린 수용체의 helical 영역에 대한 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티로부터 비롯된 기능으로서, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성, 및 IgG1 항체의 뇌 조직으로의 높은 전달과 같은 효과가 발휘됨을 알 수 있었다.
실험예 3. 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질에서 결합 모이어티의 가수 변화에 따른 기능성 평가
본 실험예에서는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질에서, IgG1 항체에 연결된 결합 모이어티의 가수를 변형시킨 경우, 전술한 융합 단백질의 기능성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 1) 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 4가로 연결된 융합 단백질(F3); 2) 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 IgG1 항체 내 중쇄의 C-말단 영역에 2가로 연결된 융합 단백질(F1); 및 3) 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역에 2가로 연결된 융합 단백질(F5)을 대상으로, 상기 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로, 정맥 투여 후 2일 또는 4일이 경과한 시점에서 평가하였다.
그 결과, 도 50 내지 도 59에 나타낸 바와 같이, 상기 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준을 수치화하여 비교한 결과, 중쇄 C-말단 및 경쇄 C-말단 4개의 영역 각각에 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질 투여군(F3#03, F3#05, F3#06, F3#12, F3#16, F3#25, F3#27, F3#31, F3#37, 또는 F3#40)은, 중쇄 C-말단 2개의 영역에 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질 투여군(F1#03, F1#05, F1#06, F1#12, F1#16, F1#25, F1#27, F1#31, F1#37, 또는 F1#40), 또는 경쇄 C-말단 2개의 영역에 결합 모이어티가 연결된 융합 단백질 투여군(F5#03, F5#05, F5#06, F5#12, F5#16, F5#25, F5#27, F5#31, F5#37, 또는 F5#40)에 비해, 뇌 조직 내 IgG1 항체의 수준이 현격하게 증진됨을 확인하였다.
상기의 실험 결과를 종합하면, 일 실시예에 따른 융합 단백질은 전술한 뇌 조직의 혈관 영역에서의 특이적인 트랜스페린 수용체 클러스터의 분포 양상을 반영한 구조로서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역에 대한 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티가 IgG1 항체 말단에 4가로 연결된 경우, 고유의 기능성을 발휘할 수 있음을 재차 확인하였다.
실험예 4. 결합 모이어티 연결에 의한 IgG1 항체의 반응성 평가
본 실험예에서는 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 4가로 연결된 융합 단백질에서, 결합 모이어티와의 연결이 IgG1 항체의 반응성, 즉, 표적과의 결합능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 0.25ug/ml의 human PD-L1 단백질 100 ul를 96 웰 플레이트에 첨가하고, 16시간 4℃ 조건에서 상기 단백질을 플레이트에 코팅하였다. 이후, 상기 코팅된 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고, 여기에 blocking buffer 200ul를 동일한 웰에 첨가한 뒤, 이를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 항체의 비특이적 결합을 방지하였다. 이후, 상기 플레이트를 PBS-T로 4회 세척한 후, 4nM의 융합 단백질(F3#01, F3'#01)을 웰에 첨가하고, 이를 다시 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 검출 항체인 anti-human IgG FCγ HRP conjugated antibody 100ul를 각 샘플이 있는 웰에 첨가하고, 이를 실온에서 1시간 인큐베이션시켰다. 이후, 상기 인큐베이션된 플레이트를 PBS-T로 4회 세척한 후 TMB 100ul를 각각의 웰에 첨가하고, 이를 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, stop solution 100ul을 첨가하여 반응을 중지시킨 뒤, microplate reader를 이용하여 450nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 한편, 본 실험예에서 IgG1 항체는 anti-PD-L1 antibody, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티 #01, 대조군으로는 IgG1 항체만을 첨가한 군을 사용하였다.
그 결과, 하기 표 2 및 도 60에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 융합 단백질 F3#01, 및 F3'#01는 IgG1 항체의 반응성, 즉, PD-L1에 대한 결합력이 대조군과 모두 유사한 수준을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과로부터, 일 실시예에 따른 융합 단백질에 의한 뇌혈관장벽 투과 및 선택적인 뇌 조직으로의 전달 효과는, IgG 항체 고유의 생물학적 활성을 유지한 상태로 발휘되는 것임을 제시한다.
[표 2]
실험예 5. 다양한 IgG1 항체로의 적용 가능성 평가
본 실험예에서는 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 4가로 연결된 융합 단백질에서, IgG1 항체를 변형시킨 경우에도 전술한 융합 단백질의 기능성이 발휘될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
5-1. anti-tau IgG1 항체
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 4가로 연결된 융합 단백질(F3)에서, IgG1 항체는 Tau에 결합하는 IgG1 항체(anti-Tau), 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 결합 모이어티 #25, #27, 또는 #36을 적용하여 실시예 1과 동일한 방식으로 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제조하였다(F3#25-Tau, F3#27-Tau, F3#36-Tau). 이후, 상기 제조된 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 ISF 내 흡수의 수준을 실험예 1-2의 (2)와 동일한 방식으로 평가하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 첨가한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 61 및 도 62에 나타낸 바와 같이, 전술한 본원 기능적 구조가 유지된 상태에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 융합 파트너인 IgG1 항체의 종류를 anti-Tau IgG1 항체로 변경한 경우에도, 대조군에 비해 ISF 내 상기 anti-Tau IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다.
5-2. anti-PD1 IgG1 항체
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 4가로 연결된 융합 단백질(F3)에서, IgG1 항체는 PD1에 결합하는 IgG1 항체(anti-PD1), 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 결합 모이어티 #25를 적용하여 실시예 1과 동일한 방식으로 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제조하였다(F3#25-PD1). 이후, 상기 제조된 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로 평가하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 첨가한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 63에 나타낸 바와 같이, 전술한 본원 기능적 구조가 유지된 상태에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 융합 파트너인 IgG1 항체의 종류를 anti-PD1 IgG1 항체로 변경한 경우에도, 대조군에 비해 뇌 조직 내 상기 anti-PD1 IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다.
5-3. anti-HER2 IgG1 항체
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 4가로 연결된 융합 단백질(F3)에서, IgG1 항체는 HER2에 결합하는 IgG1 항체(anti-HER2), 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 결합 모이어티 #25를 적용하여 실시예 1과 동일한 방식으로 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제조하였다(F3#25-HER2). 이후, 상기 제조된 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로 평가하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 첨가한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 64에 나타낸 바와 같이, 전술한 본원 기능적 구조가 유지된 상태에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 융합 파트너인 IgG1 항체의 종류를 anti-HER2 IgG1 항체로 변경한 경우에도, 대조군에 비해 뇌 조직 내 상기 anti-HER2 IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다.
5-4. anti-Aβ IgG1 항체
트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티가 IgG1 항체 내 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 4가로 연결된 융합 단백질(F3)에서, IgG1 항체는 Aβ에 결합하는 IgG1 항체(anti-Aβ), 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티는 결합 모이어티 #25를 적용하여 실시예 1과 동일한 방식으로 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 제조하였다(F3#25-Aβ). 이후, 상기 제조된 융합 단백질의 정맥 투여에 의한 IgG1 항체의 뇌 조직 내 흡수의 수준을 실험예 1-2의 (1)과 동일한 방식으로 평가하였다. 한편, 대조군으로는 IgG1 항체만을 첨가한 군을 사용하였다.
그 결과, 도 65에 나타낸 바와 같이, 전술한 본원 기능적 구조가 유지된 상태에서, 트랜스페린 수용체의 helical 영역 결합 모이어티의 융합 파트너인 IgG1 항체의 종류를 anti-Aβ IgG1 항체로 변경한 경우에도, 대조군에 비해 뇌 조직 내 상기 anti-Aβ IgG1 항체의 수준이 증가됨을 확인하였다.
상기의 결과로부터, 일 실시예에 따른 융합 단백질은, 트랜스페린 수용체의 helical 영역에 대한 유효한 결합 친화력을 갖는 모이어티 및 이를 포함하는 기능적 구조로부터 비롯된 기능으로서, IgG1 항체의 종류에 구애 받지 않고, 뇌혈관장벽에 대한 높은 투과성, 및 IgG1 항체의 뇌 조직으로의 높은 전달과 같은 효과가 발휘됨을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (6)
- IgG 항체; 및 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된, 4가의 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR)의 helical 영역 결합 모이어티를 포함하며,
상기 결합 모이어티는 트랜스페린 수용체 내 서열번호 2의 helical 영역과 결합 친화력을 갖는 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 뇌 기능 장애와 연관된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
상기 뇌 기능 장애와 연관된 질환은 알츠하이머 치매(Alzheimer`s disease); 루이체 치매(dementia with Lewy bodies); 전측두엽 치매(frontotemporal dementia); 신경원 섬유 매듭-우세 치매(tangle only dementia); 파킨슨병(Parkinson`s disease); 다발성 경화증(multiple sclerosis); 근 위축 측삭 경화증(amyotrophic Lateral sclerosis: ALS); 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury); 진행핵상마비(progressive supranuclear palsy); 피질기저핵변성(corticobasal degeneration); 신경교 타우병증(globular glial tauopathy); 노화 관련 타우 성상교병증(aging-related tau astrogliopathy); 만성 외상성 뇌병증(chronic Traumatic Encephalopathy: CTE); 뇌암; 피크병(Pick's disease); 항-IgLON5 관련 타우병증(anti-IgLON5-related tauopathy); 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism); 나딩신드롬(nodding syndrome); 통증(pain); 뇌전증(epilepsy); 자폐증(autism); 뇌졸중(stroke); 길리안-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome: GBS); 크로이츠펠트-야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease: CJD); 헌팅톤병(Huntington`s disase); 진행성 다초점 백질뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy: PML); 우울증(depression); 외상후 스트레스 장애(post traumatic stress disorder: PTSD); 또는 리소솜 축적 질환(lysosomal storage disease: LSD)인 것인, 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌혈관장벽의 혈관에 특이적으로 분포된 트랜스페린 수용체 클러스터(transferrin receptor cluster)를 형성하는 트랜스페린 수용체와 결합하여 복합체를 형성하는 것인, 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질은 뇌 조직에 선택적으로 전달되는 것인, 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것인, 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 IgG 항체는 anti-PD-L1 IgG 항체, anti-PD1 IgG 항체, anti-Tau IgG 항체, anti-HER2 IgG 항체, anti-Aβ IgG 항체, anti-TDP-43 IgG 항체, anti-alpha-synuclein IgG 항체, anti-SIGLEC3 IgG 항체, 또는 anti-TREM2 IgG 항체인 것인, 약제학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 결합 모이어티는 링커 펩타이드에 의해 상기 IgG 항체의 경쇄의 C-말단 영역 및 중쇄의 C-말단 영역에 연결된 것인, 약제학적 조성물.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2024091079A1 (ko) * | 2022-10-28 | 2024-05-02 | 주식회사 아임뉴런 | 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150039798A (ko) * | 2012-08-29 | 2015-04-13 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 혈액 뇌 장벽 셔틀 |
| KR20160105799A (ko) * | 2014-01-06 | 2016-09-07 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 1가 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11202101436SA (en) * | 2018-08-22 | 2021-03-30 | Denali Therapeutics Inc | Anti-her2 polypeptides and methods of use thereof |
-
2022
- 2022-12-30 WO PCT/KR2022/021730 patent/WO2023128702A1/ko unknown
-
2023
- 2023-09-01 KR KR1020230116339A patent/KR102614764B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150039798A (ko) * | 2012-08-29 | 2015-04-13 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 혈액 뇌 장벽 셔틀 |
| KR20160105799A (ko) * | 2014-01-06 | 2016-09-07 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 1가 혈액 뇌 장벽 셔틀 모듈 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024091079A1 (ko) * | 2022-10-28 | 2024-05-02 | 주식회사 아임뉴런 | 뇌혈관장벽 투과성 융합 단백질 및 이의 용도 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023128702A1 (ko) | 2023-07-06 |
| KR102614764B1 (ko) | 2023-12-20 |
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