KR20230127699A - Preparing method for platelet-derived exosome and exosome prepared by the method - Google Patents
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Abstract
종래에 엑소좀을 분리하기 어려웠던 혈소판으로부터 높은 수율로 엑소좀을 얻을 수 있으며, 목적하는 치료 효과에 부합하는 성분을 높은 함량으로 함유하는 엑소좀을 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로, 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계; 및 상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계;를 포함하는 혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법과 이를 통해 제조된 혈소판 유래 엑소좀을 제공한다. It relates to a method capable of obtaining exosomes in a high yield from platelets, for which it was difficult to isolate exosomes in the past, and producing exosomes containing a high content of components corresponding to a desired therapeutic effect. treating the gluconate solution; and centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution; and a platelet-derived exosome manufacturing method comprising the same and platelet-derived exosomes prepared through the method are provided.
Description
혈소판에서 유래된 엑소좀(Exosome) 제조방법과 이를 통해 제조된 엑소좀에 관한 것으로, 상세하게는 혈소판으로부터 엑소좀을 높은 수율로 분리 추출하는 효율적인 조건 및 방법과 이러한 방법을 통하여 혈소판으로부터 분리 추출된 엑소좀에 관한 것이다. It relates to a method for producing exosomes derived from platelets and exosomes prepared through the same, and in detail, efficient conditions and methods for separating and extracting exosomes from platelets in high yield, and separation and extraction from platelets through this method It's about exosomes.
생명체가 생명활동을 수행하는 가장 작은 단위는 세포다. 각 세포들은 각자의 기능이 있고, 그 기능을 수행하기 위해 여러 물질을 생성한다. 이런 물질들은 세포 내 작은 크기의 소체를 통해 저장 및 분비되는데 이 소체를 엑소좀이라 한다. 엑소좀(Exosome)은 약 30nm 내지 200nm 크기를 갖는 세포 내 소체를 일컫는 것으로, 유래 세포로부터 다양한 물질을 운반하는 중요한 나노매개체로 작용할 수 있다. 종래에는 엑소좀의 크기가 작기 때문에 유래 세포로부터 분리하는 것이 쉽지 않았는데, 최근 원심분리 기술의 발달로 다양한 유래 세포로부터 엑소좀을 분리하는 것이 가능해졌다. 일례로 대한민국 등록특허 제10-2125567호에는 원심분리 기술을 이용하여 식물 엑소좀을 대량으로 생산하는 방법이 개시되어 있다. 분리된 엑소좀을 분석한 결과, 엑소좀 내에는 각 세포들의 각종 세포전달물질, 사이토카인(Cytokine), miRNA 등이 포함되어 있다는 것이 밝혀졌다. 최근에는 이러한 엑소좀을 여러 질병의 치료에 적용하려는 연구가 활발히 진행 중이다. 일례로 대한민국 공개특허 제10-2020-0040943호에는 모발 재생 효과를 갖는 엑소좀이 개시되어 있다. 또한, 엑소좀은 세포 고유의 기능이나 세포 간 커뮤니케이션에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이와 같이, 최근 연구되고 있는 엑소좀은 다양한 의료 분야에서 그 효과가 입증되는 과정에 있으나, 엑소좀을 추출하는 방법에 있어서 아직 정형화된 방법이 없고, 수율이 높지 않은 점에서 연구가 더 필요한 실정이다. The smallest unit in which living organisms carry out life activities is the cell. Each cell has its own function and produces various substances to perform that function. These substances are stored and secreted through small sized vesicles in cells, which are called exosomes. Exosome refers to an intracellular body having a size of about 30 nm to 200 nm, and can act as an important nano-mediator that transports various substances from the cell of origin. In the past, it was not easy to separate exosomes from cells of origin because of their small size, but with the recent development of centrifugation technology, it has become possible to separate exosomes from various cells of origin. For example, Korean Patent Registration No. 10-2125567 discloses a method for mass-producing plant exosomes using centrifugal separation technology. As a result of analyzing the isolated exosomes, it was revealed that various cell transport substances, cytokines, miRNAs, and the like of each cell were included in the exosomes. Recently, studies to apply these exosomes to the treatment of various diseases are being actively conducted. For example, Korean Patent Publication No. 10-2020-0040943 discloses an exosome having a hair regeneration effect. In addition, exosomes are known to play a key role in cell-specific functions or cell-to-cell communication. As such, exosomes, which are being studied recently, are in the process of proving their effectiveness in various medical fields, but there is no standardized method for extracting exosomes yet, and the yield is not high, so further research is needed. .
본 발명의 일 구현예는 종래에 엑소좀을 분리하기 어려웠던 혈소판을 유래 세포로 하여, 이로부터 높은 수율로 엑소좀을 분리 및 추출하는 효과적이고 효율적인 방법을 제공한다.One embodiment of the present invention provides an effective and efficient method for isolating and extracting exosomes in a high yield from platelets, from which it was conventionally difficult to isolate exosomes.
본 발명의 다른 구현예는 상기 방법을 이용하여 혈소판으로부터 얻어진 엑소좀을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides exosomes obtained from platelets using the above method.
본 발명의 일 구현예에서, 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계; 및 상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계;를 포함하는 혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법을 제공한다. In one embodiment of the present invention, treating the platelet-containing solution with a gluconate solution; And centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution; provides a platelet-derived exosome manufacturing method comprising the.
상기 글루콘산염은 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), 글루콘산아연(Zinc gluconate), 글루콘산철(Iron(II) gluconate), 글루콘산나트륨(Sodium gluconate), 글루콘산마그네슘(Magnesium gluconate), 글루콘산칼륨(Potassium gluconate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함할 수 있다.The gluconate is calcium gluconate, zinc gluconate, iron (II) gluconate, sodium gluconate, magnesium gluconate, gluconate It may include one selected from the group consisting of potassium (Potassium gluconate) and combinations thereof.
상기 글루콘산염 용액 중의 글루콘산염의 농도가 5중량% 내지 30중량%일 수 있다. The concentration of gluconate in the gluconate solution may be 5% to 30% by weight.
상기 혈소판함유액은 혈장층, 버피코트(Buffy coat)층 및 적혈구층을 포함할 수 있다. The platelet-containing fluid may include a plasma layer, a buffy coat layer, and a red blood cell layer.
상기 혈소판함유액은 상기 혈장층 대 상기 버피코트층 대 상기 적혈구층을 10 : 0.5 : 0.5 내지 10 : 1.5 : 1.5의 부피비로 포함할 수 있다. The platelet-containing solution may include the plasma layer, the buffy coat layer, and the red blood cell layer in a volume ratio of 10:0.5:0.5 to 10:1.5:1.5.
상기 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계는, 상기 혈소판함유액 대 상기 글루콘산염 용액의 부피비가 5 : 1 내지 25 : 1이 되도록 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. The step of treating the platelet-containing solution with the gluconate solution may include mixing the platelet-containing solution to the gluconate solution at a volume ratio of 5:1 to 25:1.
상기 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계는, 상기 혈소판함유액을 상기 글루콘산염 용액과 혼합한 후 30분 내지 4시간 자극시키는 단계를 포함할 수 있다. The step of treating the platelet-containing solution with a gluconate solution may include mixing the platelet-containing solution with the gluconate solution and then stimulating the platelet-containing solution for 30 minutes to 4 hours.
상기 혈소판함유액은 혈소판농축혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP) 추출 방법을 이용하여 전혈로부터 얻어질 수 있다. The platelet-containing fluid may be obtained from whole blood using a platelet-rich plasma (PRP) extraction method.
상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계는, 5,000g 내지 15,000g의 속도로 10분 내지 1시간 동안 원심분리하는 제1 원심분리 단계; 및 100,000g 내지 400,000g의 속도로 30분 내지 3시간 동안 원심분리하는 제2 원심분리 단계;를 포함할 수 있다.The step of centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution may include a first centrifugation step of centrifuging at a speed of 5,000 g to 15,000 g for 10 minutes to 1 hour; and a second centrifugation step of centrifuging at a speed of 100,000g to 400,000g for 30 minutes to 3 hours.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 혈소판 유래 엑소좀 제조방법으로 제조된 소판 유래 엑소좀(Exosome)을 제공한다. In another embodiment of the present invention, platelet-derived exosomes prepared by the method for producing platelet-derived exosomes are provided.
상기 혈소판 유래 엑소좀 제조방법은 종래에 엑소좀을 분리하기 어려웠던 혈소판을 유래 세포로 하여, 이로부터 분리 및 추출된 엑소좀을 높은 수율로 얻는 최적의 수단이 될 수 있다.The platelet-derived exosome manufacturing method can be an optimal means of obtaining exosomes isolated and extracted from platelets, which have been difficult to isolate in the past, as cell-derived cells, in high yield.
상기 혈소판 유래 엑소좀은 상기 제조방법을 통하여 제조됨으로써 유래 세포로부터 최대의 수율로 추출되며, 목적하는 치료 효과에 부합하는 크기 및 특성을 나타낼 수 있다. The platelet-derived exosomes are extracted from the cell-derived cells with maximum yield by being prepared through the above manufacturing method, and may exhibit a size and characteristics suitable for a desired therapeutic effect.
도 1의 (a)는 실시예 1의 NTA 그래프이고, 도 1의 (b)는 비교예 1의 NTA 그래프이다.
도 2는 일 구현예에 따라 혈소판농축혈장 추출 방법으로 층이 분리된 전혈의 일 예시를 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1에서 추출된 엑소좀의 투과전자현미경(TEM) 사진을 게재한 것이다.
도 4는 실시예 1 내지 실시예 4의 방법으로 제조된 엑소좀의 엑소좀 마커(CD9, CD63, CD81) 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 1 내지 실시예 4의 방법으로 제조된 엑소좀의 혈소판 엑소좀 마커(CD41) 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 1 내지 실시예 4의 방법으로 제조된 엑소좀의 적혈구 엑소좀 마커(Hb β)의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.1(a) is an NTA graph of Example 1, and FIG. 1(b) is an NTA graph of Comparative Example 1.
2 illustrates an example of whole blood whose layers have been separated by a platelet-rich plasma extraction method according to an embodiment.
Figure 3 shows a transmission electron microscope (TEM) picture of the exosomes extracted in Example 1.
4 is a graph showing the expression levels of exosome markers (CD9, CD63, CD81) of exosomes prepared by the methods of Examples 1 to 4.
5 is a graph showing the expression level of the platelet exosome marker (CD41) of the exosomes prepared by the methods of Examples 1 to 4.
6 is a graph showing the expression level of the red blood cell exosome marker (Hb β) of the exosomes prepared by the methods of Examples 1 to 4.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 후술하는 구현예 또는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 구현예 또는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 하기 명시된 구현예 또는 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐이고, 본 발명의 권리 범위는 청구범위의 범주에 의해 정의된다. Advantages and features of the present invention, and methods of achieving them, will become apparent with reference to the following implementations or examples. However, the present invention is not limited to the embodiments or examples disclosed below and may be implemented in various different forms. The embodiments or examples specified below make the disclosure of the present invention complete, and are provided only to inform those skilled in the art of the scope of the invention to which the present invention belongs, and the scope of the present invention is claimed Defined by the scope of the scope.
이하, 본 발명에 따른 구현예에 관하여 상세히 설명하기로 한다. Hereinafter, embodiments according to the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 구현예에서, 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계; 및 상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계;를 포함하는 혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법을 제공한다. In one embodiment of the present invention, treating the platelet-containing solution with a gluconate solution; And centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution; provides a platelet-derived exosome manufacturing method comprising the.
엑소좀(Exosome)은 모든 세포에 존재하는 자연적인 물질이지만, 유래 세포에 따라 포함하고 있는 성분 및 기능이 다양한 특징을 갖는다. 수많은 유래 세포 중 특히 혈소판에 포함된 엑소좀은 상처 치유 및 인대 손상 회복에 효과를 나타낼 수 있다. 혈소판은 주위 환경에 따라 생성하는 엑소좀의 양이 현저히 달라지며, 혈소판 자체가 다루기 쉽지 않은 세포이기 때문에 종래에는 혈소판으로부터 높은 수율로 엑소좀을 분리 추출하는 것이 어려웠었다. 이와 관련하여, 상기 혈소판 유래 엑소좀 제조방법은 혈소판으로부터 최대의 수율로 엑소좀을 분리 추출할 수 있는 효과적인 수단이 될 수 있다. Although exosomes are natural substances present in all cells, they have various characteristics in components and functions that they contain depending on the cell of origin. Exosomes, especially included in platelets, among numerous derived cells, can be effective in wound healing and recovery from ligament damage. The amount of exosomes produced by platelets varies significantly depending on the surrounding environment, and since platelets themselves are cells that are not easy to handle, conventionally, it has been difficult to separate and extract exosomes from platelets in high yield. In this regard, the platelet-derived exosome preparation method can be an effective means for separating and extracting exosomes from platelets with maximum yield.
상기 혈소판 유래 엑소좀 제조방법은 상기 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계를 포함한다. 종래의 엑소좀 분리 방법과 달리, 상기 제조방법은 상기 혈소판함유액을 상기 글루콘산염 용액으로 처리함으로써 상기 혈소판으로부터 엑소좀의 추출 수율을 극대화하기에 보다 유리할 수 있다. 상기 글루콘산염 용액은 상기 혈소판함유액 중의 혈소판을 자극하여 이로부터 엑소좀이 최대의 효율로 분리 추출되도록 할 수 있다. The platelet-derived exosome preparation method includes treating the platelet-containing solution with a gluconate solution. Unlike the conventional exosome isolation method, the preparation method may be more advantageous in maximizing the extraction yield of exosomes from the platelets by treating the platelet-containing solution with the gluconate solution. The gluconate solution can stimulate platelets in the platelet-containing solution to separate and extract exosomes from them with maximum efficiency.
일 구현예에서, 상기 글루콘산염 용액 중의 글루콘산염은 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), 글루콘산아연(Zinc gluconate), 글루콘산철(Iron(II) gluconate), 글루콘산나트륨(Sodium gluconate), 글루콘산마그네슘(Magnesium gluconate), 글루콘산칼륨(Potassium gluconate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함할 수 있다. 이와 같은 종류의 글루콘산염 용액을 적용함으로써 혈소판 유래 엑소좀의 분리 추출 효율을 극대화시키기에 보다 유리할 수 있다. In one embodiment, the gluconate in the gluconate solution is calcium gluconate, zinc gluconate, iron (II) gluconate, sodium gluconate, It may include one selected from the group consisting of magnesium gluconate, potassium gluconate, and combinations thereof. By applying this type of gluconate solution, it may be more advantageous to maximize the separation and extraction efficiency of platelet-derived exosomes.
상기 글루콘산염 용액의 용매는 예를 들어, 물, 증류수, 식염수, 알코올 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함할 수 있다. The solvent of the gluconate solution may include, for example, one selected from the group consisting of water, distilled water, saline, alcohol, and combinations thereof.
상기 글루콘산염 용액 중의 글루콘산염의 농도는 약 5중량% 내지 약 30중량%, 예를 들어, 약 5중량% 내지 약 25중량%, 예를 들어, 약 5중량% 내지 약 20중량%, 예를 들어, 약 5중량% 내지 약 15중량%일 수 있다. 이와 같은 농도의 상기 글루콘산염 용액을 적용함으로써 혈소판으로부터 추출되는 엑소좀의 수율을 극대화시키기에 보다 유리할 수 있다. The concentration of gluconate in the gluconate solution is from about 5% to about 30% by weight, such as from about 5% to about 25% by weight, such as from about 5% to about 20% by weight, For example, it may be about 5% to about 15% by weight. By applying the gluconate solution at such a concentration, it may be more advantageous to maximize the yield of exosomes extracted from platelets.
상기 혈소판함유액은 예를 들어, 혈장층, 버피코트(Buffy coat)층 및 적혈구층을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 '버피코트(Buffy coat)층'이란 혈소판 및 백혈구를 포함하는 층으로서 소량의 적혈구가 섞여 있는 경우를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 혈소판으로부터 엑소좀을 분리 추출함에 있어서, 상기 혈소판과 혈액 내의 다른 성분들, 예를 들어, 혈장, 백혈구, 적혈구 등의 성분들과의 상호 작용이 추출 수율에 영향을 주게 된다. 따라서, 엑소좀을 분리 추출하기 위한 상기 혈소판함유액에 혈소판과 다른 혈액 성분들이 함께 포함됨으로써 상기 혈소판으로부터 엑소좀의 분리 추출 수율을 극대화하기에 보다 유리할 수 있다. The platelet-containing fluid may include, for example, a plasma layer, a buffy coat layer, and a red blood cell layer. In the present specification, the 'buffy coat layer' is a layer containing platelets and leukocytes and should be interpreted to include a case in which a small amount of red blood cells are mixed. In separating and extracting exosomes from platelets, the interaction between the platelets and other components in the blood, such as plasma, white blood cells, and red blood cells, affects the extraction yield. Therefore, by including platelets and other blood components in the platelet-containing solution for separation and extraction of exosomes, it may be more advantageous to maximize the yield of separation and extraction of exosomes from the platelets.
구체적으로, 상기 혈소판함유액은 상기 혈장층 대 상기 버피코트층 대 상기 적혈구층을 약 10 : 0.5 : 0.5 내지 약 10 : 1.5 : 1.5, 예를 들어, 약 10 : 0.6 : 0.6 내지 약 10 : 1.5 : 1.5, 예를 들어, 약 10 : 0.8 : 0.8 내지 약 10 : 1.2 : 1.2, 예를 들어, 약 10 : 1 : 1의 부피비로 포함할 수 있다. 상기 혈소판함유액이 상기 혈장층, 버피코트층 및 적혈구층을 전술한 범위의 부피비로 포함함으로써 상기 혈소판과 다른 혈액 성분의 상호 작용 측면에서 엑소좀의 분리 추출 수율 향상에 유리할 수 있다. Specifically, the platelet-containing fluid comprises the plasma layer to the buffy coat layer to the red blood cell layer in a ratio of about 10:0.5:0.5 to about 10:1.5:1.5, for example, about 10:0.6:0.6 to about 10:1.5 : 1.5, for example, about 10:0.8:0.8 to about 10:1.2:1.2, for example, about 10:1:1. Since the platelet-containing solution includes the plasma layer, the buffy coat layer, and the red blood cell layer at a volume ratio within the above-described range, it may be advantageous to improve the separation and extraction yield of exosomes in terms of the interaction between the platelets and other blood components.
일 구현예에서, 상기 혈소판 유래 엑소좀 제조방법은 상기 혈소판함유액이 상기 혈장층, 상기 버피코트층 및 상기 적혈구층을 전술한 부피비로 포함하고, 이와 동시에 상기 혈소판함유액에 상기 글루콘산염 용액을 처리하는 단계를 포함함으로써 혈소판으로부터 분리 추출되는 엑소좀의 수율을 극대화시키는 데 보다 유리할 수 있다. In one embodiment, the platelet-derived exosome production method is such that the platelet-containing solution contains the plasma layer, the buffy coat layer, and the red blood cell layer in the aforementioned volume ratio, and at the same time, the gluconate solution is added to the platelet-containing solution. It may be more advantageous to maximize the yield of exosomes separated and extracted from platelets by including the step of processing.
상기 혈소판함유액은 항응고제, 생리식염수, 인산완충식염수(Phosphate buffered saline, PBS) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 더 포함할 수 있다. The platelet-containing solution may further include one selected from the group consisting of an anticoagulant, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), and combinations thereof.
상기 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계에서, 상기 혈소판함유액 대 상기 글루콘산염 용액의 부피비는, 예를 들어, 약 5 : 1 내지 약 25 : 1, 예를 들어, 약 5 : 1 내지 약 20 : 1, 예를 들어, 약 10 : 1 내지 약 20 : 1일 수 있다. 상기 혈소판함유액과 상기 글루콘산염 용액을 이와 같은 부피비로 혼합 처리함으로써 상기 혈소판함유액 내의 혈소판이 상기 글루콘산염 용액 내의 글루콘산염에 의해 적절히 활성화될 수 있으며, 그 결과, 상기 혈소판으로부터 분리 추출되는 엑소좀의 수율을 향상시키기에 보다 유리할 수 있다. In the step of treating the platelet-containing solution with a gluconate solution, the volume ratio of the platelet-containing solution to the gluconate solution is, for example, about 5:1 to about 25:1, for example, about 5:1. 1 to about 20:1, such as about 10:1 to about 20:1. By mixing the platelet-containing solution and the gluconate solution at such a volume ratio, platelets in the platelet-containing solution can be properly activated by the gluconate in the gluconate solution, and as a result, separate and extract from the platelets It may be more advantageous to improve the yield of exosomes being formed.
상기 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계는, 상기 혈소판함유액과 상기 글루콘산염 용액을 혼합한 후 예를 들어, 약 30분 내지 약 4시간, 예를 들어, 약 1시간 내지 약 4시간, 예를 들어, 약 1.5시간 내지 약 4시간 자극시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 혈소판함유액을 상기 글루콘산염 용액으로 이와 같은 시간 동안 자극시킴으로써 상기 혈소판함유액 내의 혈소판이 상기 글루콘산염 용액 내의 글루콘산염에 의해 적절히 활성화될 수 있으며, 그 결과, 상기 혈소판으로부터 분리 추출되는 엑소좀의 수율을 향상시키기에 보다 유리할 수 있다.In the step of treating the platelet-containing solution with a gluconate solution, after mixing the platelet-containing solution and the gluconate solution, for example, about 30 minutes to about 4 hours, for example, about 1 hour to about stimulation for 4 hours, eg, from about 1.5 hours to about 4 hours. By stimulating the platelet-containing solution with the gluconate solution for such a period of time, the platelets in the platelet-containing solution can be properly activated by the gluconate in the gluconate solution, and as a result, the platelets are separated and extracted. It may be more advantageous to improve the yield of exosomes.
상기 혈소판함유액은 예를 들어, 혈소판농축혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP) 추출 방법을 이용하여 전혈로부터 얻어질 수 있다. 상기 혈소판농축혈장 추출 방법은 전혈을 채취한 후 원심분리를 통해 층을 분리하는 소정의 방법을 일컫는다. 도 2는 일 구현예에 따른 혈소판농축혈장 추출 방법으로 층이 분리된 전혈의 일 예시를 도시한 것이다. 도 2를 참조할 때, 층이 분리된 전혈은 적혈구층(10), 버피코트층(20) 및 혈장층(30)을 포함할 수 있다. 상기 버피코트층(20)에는 혈소판 및 백혈구가 포함되며, 소량의 적혈구가 포함될 수 있다. 상기 혈소판농축혈장 추출 방법으로 층분리된 전혈로부터 상기 혈소판으로부터 엑소좀을 분리해내기 위한 적정 성분들의 조합을 추출하여 상기 혈소판함유액을 얻을 수 있다. The platelet-containing fluid may be obtained from whole blood, for example, using a platelet-rich plasma (PRP) extraction method. The platelet-rich plasma extraction method refers to a predetermined method of separating layers through centrifugation after collecting whole blood. 2 illustrates an example of whole blood whose layers have been separated by a platelet-rich plasma extraction method according to an embodiment. Referring to FIG. 2 , the layered whole blood may include a red blood cell layer 10 , a buffy coat layer 20 and a plasma layer 30 . The buffy coat layer 20 includes platelets and leukocytes, and may include a small amount of red blood cells. The platelet-containing solution can be obtained by extracting a combination of suitable components for separating exosomes from the platelets from whole blood layer-separated by the platelet-enriched plasma extraction method.
상기 전혈로부터 층을 분리하기 위한 혈소판농축혈장 추출 방법은 예를 들어, 상기 전혈을 약 100g 내지 약 1,000g, 예를 들어, 약 100g 내지 약 800g, 예를 들어, 약 100g 내지 약 500g, 예를 들어, 약 150g 내지 약 450g, 예를 들어, 약 200g 내지 약 400g, 예를 들어, 약 250g 내지 약 400g의 속도로 약 1분 내지 약 20분, 예를 들어, 약 1분 내지 약 15분, 예를 들어, 약 1분 내지 약 10분, 예를 들어, 약 5분 내지 약 10분 동안 원심 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 속도 및 시간 조건 하에 원심분리함으로써 상기 혈소판함유액을 얻기 위한 최적의 층분리를 얻어내기에 보다 유리할 수 있다. The platelet-rich plasma extraction method for separating the layers from the whole blood may include, for example, about 100 g to about 1,000 g of the whole blood, for example, about 100 g to about 800 g, for example, about 100 g to about 500 g, for example For example, from about 150 g to about 450 g, such as from about 200 g to about 400 g, such as from about 250 g to about 400 g for about 1 minute to about 20 minutes, such as about 1 minute to about 15 minutes; For example, it may include centrifuging for about 1 minute to about 10 minutes, eg, about 5 minutes to about 10 minutes. By centrifuging under such speed and time conditions, it may be more advantageous to obtain the optimal layer separation for obtaining the platelet-containing solution.
일 구현예에서, 상기 혈소판농축혈장 추출 방법은 상기 전혈에 항응고제를 혼합한 후 전술한 속도 및 시간 범위로 원심 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항응고제를 혼합 사용하는 경우, 상기 전혈 대 상기 항응고제의 부피비가 약 5 : 1 내지 약 20 : 1, 예를 들어, 약 5 : 1 내지 약 15 : 1, 예를 들어, 약 10 : 1 내지 약 20 : 1, 예를 들어, 약 10 : 1 내지 약 15 : 1 일 수 있다. 상기 항응고제를 이와 같은 부피비로 적용함으로써 상기 전혈로부터 상기 혈소판함유액을 얻기 위한 최적의 층분리를 얻어내기에 보다 유리할 수 있다. In one embodiment, the platelet-rich plasma extraction method may include mixing the anticoagulant with the whole blood and then centrifuging the whole blood at the speed and time range described above. When the anticoagulants are mixed and used, the volume ratio of the whole blood to the anticoagulant is about 5: 1 to about 20: 1, for example, about 5: 1 to about 15: 1, for example, about 10: 1 to about 20:1, for example from about 10:1 to about 15:1. By applying the anticoagulant in such a volume ratio, it may be more advantageous to obtain an optimal layer separation for obtaining the platelet-containing solution from the whole blood.
상기 혈소판 유래 엑소좀 제조방법은 상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계를 포함한다. 상기 혈소판함유액에 상기 글루콘산염이 처리된 후 이를 적절한 조건으로 원심분리함으로써 상기 혈소판함유액 내의 혈소판으로부터 엑소좀을 효과적으로 분리 추출할 수 있다. The platelet-derived exosome preparation method includes the step of centrifuging the platelet-containing solution treated with the gluconate. Exosomes can be effectively separated and extracted from platelets in the platelet-containing solution by treating the platelet-containing solution with the gluconate and centrifuging the platelet-containing solution under appropriate conditions.
일 구현예에서, 상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계는 다단 원심 분리 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계는, 약 5,000g 내지 약 15,000g의 속도로 약 10분 내지 약 1시간 동안 원심분리하는 제1 원심분리 단계; 및 약 100,000g 내지 약 400,000g의 속도로 약 30분 내지 약 3시간 동안 원심분리하는 제2 원심분리 단계;를 포함할 수 있다. 이와 같이, 다단 원심 분리 단계를 적용함으로써 엑소좀 이외에 불필요한 성분들을 효과적으로 여과시킬 수 있다. In one embodiment, the step of centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution may include a multi-stage centrifugation step. Specifically, the step of centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution includes a first centrifugation step of centrifuging at a speed of about 5,000 g to about 15,000 g for about 10 minutes to about 1 hour; and a second centrifugation step of centrifuging at a speed of about 100,000g to about 400,000g for about 30 minutes to about 3 hours. In this way, unnecessary components other than exosomes can be effectively filtered by applying the multi-stage centrifugation step.
상기 제1 원심분리 단계에서 세포 잔해(Cell debris) 등 상대적으로 크기가 큰 불필요한 거대분자(Macromolecules)들이 효과적으로 여과될 수 있다. 상기 제1 원심분리 단계의 속도는 예를 들어, 약 5,000g 내지 약 15,000g, 예를 들어, 약 6,000g 내지 약 14,000g, 예를 들어, 약 7,000g 내지 약 13,000g, 예를 들어, 약 8,000g 내지 약 12,000g일 수 있다. 상기 제1 원심분리 단계의 수행 시간은 예를 들어, 약 10분 내지 약 1시간, 예를 들어, 약 10분 내지 약 50분, 예를 들어, 약 10분 내지 약 40분, 예를 들어, 약 15분 내지 약 40분, 예를 들어, 약 20분 내지 약 40분일 수 있다. 상기 속도 및 시간 조건 하에서 상기 제1 원심분리 단계가 수행됨으로써 목적 효과 구현에 보다 유리할 수 있다. In the first centrifugation step, unnecessary macromolecules having a relatively large size, such as cell debris, may be effectively filtered. The speed of the first centrifugation step is, for example, about 5,000 g to about 15,000 g, such as about 6,000 g to about 14,000 g, such as about 7,000 g to about 13,000 g, such as about 8,000 g to about 12,000 g. The duration of the first centrifugation step is, for example, about 10 minutes to about 1 hour, for example, about 10 minutes to about 50 minutes, for example, about 10 minutes to about 40 minutes, for example, It may be from about 15 minutes to about 40 minutes, for example from about 20 minutes to about 40 minutes. By performing the first centrifugation step under the speed and time conditions, it may be more advantageous to realize the desired effect.
상기 제2 원심분리 단계는 상기 제1 원심분리 단계의 결과 용액의 상청액을 분리한 후 이를 대상으로 수행될 수 있다. 상기 제2 원심분리 단계의 속도는 예를 들어, 약 100,000g 내지 약 400,000g, 예를 들어, 약 100,000g 내지 약 300,000g, 예를 들어, 약 100,000g 내지 약 250,000g, 예를 들어, 약 100,000g 내지 약 200,000g일 수 있다. 상기 제2 원심분리 단계의 수행 시간은 예를 들어, 약 30분 내지 약 3시간, 예를 들어, 약 30분 내지 약 2시간, 예를 들어, 약 40분 내지 약 3시간, 예를 들어, 약 40분 내지 약 2시간, 예를 들어, 약 40분 내지 약 100분, 예를 들어, 약 50분 내지 약 90분일 수 있다. 상기 제2 원심분리 단계는 초고속 원심분리 단계로서, 이와 같은 속도 및 시간 범위 하에서 원심분리 함으로써 엑소좀을 효과적으로 침전시킬 수 있고, 혈소판으로부터 엑소좀의 결과적인 수율을 향상시키기에 보다 유리할 수 있다. The second centrifugation step may be performed after separating the supernatant of the solution resulting from the first centrifugation step. The speed of the second centrifugation step is, for example, from about 100,000 g to about 400,000 g, such as from about 100,000 g to about 300,000 g, such as from about 100,000 g to about 250,000 g, such as about 100,000 g to about 200,000 g. The duration of the second centrifugation step is, for example, about 30 minutes to about 3 hours, for example, about 30 minutes to about 2 hours, for example, about 40 minutes to about 3 hours, for example, from about 40 minutes to about 2 hours, such as from about 40 minutes to about 100 minutes, such as from about 50 minutes to about 90 minutes. The second centrifugation step is an ultra-high-speed centrifugation step, and centrifugation under such a speed and time range can effectively precipitate exosomes and can be more advantageous in improving the resulting yield of exosomes from platelets.
본 발명의 다른 구현예에서, 전술한 제조방법으로 제조된 혈소판 유래 엑소좀을 제공한다. In another embodiment of the present invention, platelet-derived exosomes prepared by the above-described method are provided.
줄기세포치료 등의 기존의 세포 치료는 몇 가지 한계를 가지고 있다. 첫 번째, 아직까지 그 효과가 기대한 것 보다 크지 않다는 것이다. 그 이유는 여러가지가 있겠지만 그 중 하나는 하나의 세포라 해도 세포는 복합적인 기능이 있어서 이로부터 원하는 반응만을 유도하기가 쉽지 않다는 것이다. 또한 원하는 반응을 유도해냈다고 해도 정성 및 정량 관리 등에 제한이 많다. 두 번째, 세포 치료가 아직 많은 위험성을 내포하고 있다는 것이다. 세포 자체를 직접 인체 내에 주입할 경우 세포의 크기가 크기 때문에 색전증 등의 물리적 부작용이 발생할 가능성이 있으며, 안전하게 주입되었다 하더라도 주입된 세포가 다른 세포로 변할 위험성이 있다. 또한, 세포를 이용한 치료는 치료 효과 증대를 위하여 농축, 용량 증가 등의 방법을 적용하기 쉽지 않다. Existing cell therapies such as stem cell therapy have several limitations. First, the effect is still not as great as expected. There are many reasons for this, but one of them is that even a single cell has complex functions, so it is not easy to induce only the desired response from it. In addition, even if the desired reaction is induced, there are many limitations in qualitative and quantitative management. Second, cell therapy still poses many risks. When the cells themselves are directly injected into the human body, there is a possibility of physical side effects such as embolism due to the large size of the cells, and even if the cells are safely injected, there is a risk that the injected cells change into other cells. In addition, treatment using cells is not easy to apply methods such as concentration and dose increase in order to increase the therapeutic effect.
이와 관련하여, 상기 혈소판 유래 엑소좀은 전술한 종래의 세포 치료의 단점을 극복하는 데 보다 유리할 수 있다. 구체적으로, 상기 혈소판 유래 엑소좀은 세포 내 유효 물질이 높은 수율로 추출 및 농축된 것이므로 종래의 세포 치료에 활용되던 줄기세포 등 보다 그 효과가 더 크다. 또한, 세포 자체를 직접 인체 등에 주입하는 것보다 그 세포의 실질적인 효과를 매개하는 소체를 주입하는 것으로서 그 효과의 예측 가능성이 높고 부작용 가능성이 낮다는 장점이 있다. 더 나아가, 상기 혈소판 유래 엑소좀은 전술한 제조방법을 통해 제조됨으로써 세포로부터 최대의 활성이 유도된 엑소좀이라는 장점이 있고, 목적 효과를 갖는 엑소좀의 정성 및 정량적 관리가 가능한 엑소좀이라는 장점이 있다.In this regard, the platelet-derived exosomes may be more advantageous in overcoming the above-described disadvantages of conventional cell therapy. Specifically, since the platelet-derived exosomes are obtained by extracting and concentrating active substances within cells in high yield, the effect is greater than that of stem cells used in conventional cell therapy. In addition, compared to directly injecting the cells themselves into the human body, etc., there is an advantage in that the predictability of the effect is high and the possibility of side effects is low by injecting the body that mediates the actual effect of the cell. Furthermore, the platelet-derived exosomes have the advantage of being exosomes in which the maximum activity is induced from cells by being prepared through the above-described manufacturing method, and the exosomes that can qualitatively and quantitatively manage exosomes having the desired effect. there is.
일 구현예에서, 상기 혈소판 유래 엑소좀의 직경은 예를 들어, 약 30nm 내지 약 200nm일 수 있다. 상기 전술한 제조방법을 통해 제조됨으로써 이와 같은 크기 범위를 갖는 엑소좀이 혈소판으로부터 높은 수율로 분리 추출될 수 있다. In one embodiment, the diameter of the platelet-derived exosomes may be, for example, about 30 nm to about 200 nm. Exosomes having such a size range can be separated and extracted from platelets in a high yield by being produced through the above-described preparation method.
이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예를 제시한다. 다만, 하기에 기재된 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하고, 이로 인해 본 발명의 권리 범위가 제한 해석되지 않으며, 본 발명의 권리 범위는 청구 범위에 의해서 결정되는 것이다. Hereinafter, specific embodiments of the present invention are presented. However, the examples described below are only intended to specifically illustrate or explain the present invention, and thus the scope of the present invention is not limited and interpreted, and the scope of the present invention is determined by the claims.
<실시예 및 비교예><Examples and Comparative Examples>
실시예 1Example 1
전혈 55cc에 항응고제(대한뉴팜, 씨.티.지.액(C.T.G. Solution)) 5cc를 혼합한 후 혈소판농축혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP) 추출 키트(굿모닝바이오社 60ml용)를 이용하여 층 분리를 수행하였다. PRP 회수용 스크류(screw)를 이용하여 혈장층 대 버피코트층 대 적혈구층을 10:1:1의 부피비로 추출하여 혈소판함유액을 얻었다. 상기 혈소판함유액을 10중량% 농도의 글루콘산칼슘 수용액 4cc와 혼합하여 3시간 동안 상온에 배치하였다. 이어서, 상기 글루콘산칼슘 수용액이 처리된 혈소판함유액에 생리식염수(normal saline)를 혼합하여 총 40cc가 되도록 한 후 적정 용량의 튜브(Tube)로 옮긴 뒤 10,000g의 속도에서 30분간 제1 원심분리 하였다. 이어서, 상기 제1 원심분리된 결과액으로부터 상청액을 분리하여 튜브(45Ti, cat no. P30294, 10.4ml용)에 옮긴 뒤 150,000g 속도로 70분간 제2 원심분리 하였다. 이로써 침전된 엑소좀을 얻었다. After mixing 5cc of anticoagulant (Daehan New Pharm, C.T.G. Solution) with 55cc of whole blood, separate the layers using a platelet-rich plasma (PRP) extraction kit (for 60ml of Good Morning Bio) was performed. The plasma layer, the buffy coat layer, and the red blood cell layer were extracted at a volume ratio of 10:1:1 using a PRP recovery screw to obtain a platelet-containing solution. The platelet-containing solution was mixed with 4 cc of a 10% by weight calcium gluconate aqueous solution and placed at room temperature for 3 hours. Subsequently, normal saline was mixed with the platelet-containing solution treated with the calcium gluconate aqueous solution to make a total of 40 cc, then transferred to a tube with an appropriate capacity, followed by first centrifugation at a speed of 10,000 g for 30 minutes did Subsequently, the supernatant was separated from the resultant solution of the first centrifugation, transferred to a tube (45Ti, cat no. P30294, for 10.4ml), and subjected to second centrifugation at a speed of 150,000g for 70 minutes. This resulted in precipitated exosomes.
실시예 2Example 2
전혈 55cc에 항응고제(대한뉴팜, 씨.티.지.액(C.T.G. Solution)) 5cc를 혼합한 후 10중량% 농도의 글루콘산칼슘 수용액 4cc와 혼합하여 3시간 동안 상온에 배치하였다. 이어서, 상기 글루콘산칼슘 수용액이 처리된 전혈을 적정 용량의 튜브(Tube)로 옮긴 뒤 10,000g의 속도에서 30분간 제1 원심분리 하였다. 이어서, 상기 제1 원심분리된 결과액으로부터 상청액을 분리하여 튜브(45Ti, cat no. P30294, 10.4ml용)에 옮긴 뒤 150,000g 속도로 70분간 제2 원심분리 하였다. 이로써 침전된 엑소좀을 얻었다. After mixing 5 cc of an anticoagulant (C.T.G. Solution, Daehan New Pharm, C.T.G. Solution) with 55 cc of whole blood, it was mixed with 4 cc of a 10% by weight calcium gluconate aqueous solution and placed at room temperature for 3 hours. Subsequently, the whole blood treated with the calcium gluconate aqueous solution was transferred to a tube having an appropriate capacity and subjected to first centrifugation at a speed of 10,000 g for 30 minutes. Subsequently, the supernatant was separated from the resultant solution of the first centrifugation, transferred to a tube (45Ti, cat no. P30294, for 10.4ml), and subjected to second centrifugation at a speed of 150,000g for 70 minutes. This resulted in precipitated exosomes.
실시예 3Example 3
전혈 55cc에 항응고제(대한뉴팜, 씨.티.지.액(C.T.G. Solution)) 5cc를 혼합한 후 혈소판농축혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP) 추출 키트(굿모닝바이오社 60ml용)를 이용하여 층 분리를 수행하였다. PRP 회수용 스크류(screw)를 이용하여 버피코트층만 추출하여 혈소판함유액을 얻었다. 상시 혈소판함유액을 10중량% 농도의 글루콘산칼슘 수용액 4cc와 혼합하여 3시간 동안 상온에 배치하였다. 이어서, 상기 글루콘산칼슘 수용액이 처리된 혈소판함유액에 생리식염수(normal saline)를 혼합하여 총 40cc가 되도록 한 후 적정 용량의 튜브(Tube)로 옮긴 뒤 10,000g의 속도에서 30분간 제1 원심분리 하였다. 이어서, 상기 제1 원심분리된 결과액으로부터 상청액을 분리하여 튜브(45Ti, cat no. P30294, 10.4ml용)에 옮긴 뒤 150,000g 속도로 70분간 제2 원심분리 하였다. 이로써 침전된 엑소좀을 얻었다. After mixing 5cc of anticoagulant (Daehan New Pharm, C.T.G. Solution) with 55cc of whole blood, separate the layers using a platelet-rich plasma (PRP) extraction kit (for 60ml of Good Morning Bio) was performed. Only the buffy coat layer was extracted using a PRP recovery screw to obtain a platelet-containing solution. The regular platelet-containing solution was mixed with 4 cc of 10% by weight calcium gluconate aqueous solution and placed at room temperature for 3 hours. Subsequently, normal saline was mixed with the platelet-containing solution treated with the calcium gluconate aqueous solution to make a total of 40 cc, then transferred to a tube with an appropriate capacity, followed by first centrifugation at a speed of 10,000 g for 30 minutes did Subsequently, the supernatant was separated from the resultant solution of the first centrifugation, transferred to a tube (45Ti, cat no. P30294, for 10.4ml), and subjected to second centrifugation at a speed of 150,000g for 70 minutes. This resulted in precipitated exosomes.
실시예 4Example 4
전혈 55cc에 항응고제(대한뉴팜, 씨.티.지.액(C.T.G. Solution)) 5cc를 혼합한 후 혈소판농축혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP) 추출 키트(굿모닝바이오社 60ml용)를 이용하여 층 분리를 수행하였다. PRP 회수용 스크류(screw)를 이용하여 혈장층 및 버피코트층만 추출하여 혈소판함유액을 얻었다. 상시 혈소판함유액을 10중량% 농도의 글루콘산칼슘 수용액 4cc와 혼합하여 3시간 동안 상온에 배치하였다. 이어서, 상기 글루콘산칼슘 수용액이 처리된 혈소판함유액에 생리식염수(normal saline)를 혼합하여 총 40cc가 되도록 한 후 적정 용량의 튜브(Tube)로 옮긴 뒤 10,000g의 속도에서 30분간 제1 원심분리 하였다. 이어서, 상기 제1 원심분리된 결과액으로부터 상청액을 분리하여 튜브(45Ti, cat no. P30294, 10.4ml용)에 옮긴 뒤 150,000g 속도로 70분간 제2 원심분리 하였다. 이로써 침전된 엑소좀을 얻었다. After mixing 5cc of anticoagulant (Daehan New Pharm, C.T.G. Solution) with 55cc of whole blood, separate the layers using a platelet-rich plasma (PRP) extraction kit (for 60ml of Good Morning Bio) was performed. A platelet-containing solution was obtained by extracting only the plasma layer and the buffy coat layer using a PRP recovery screw. The regular platelet-containing solution was mixed with 4 cc of 10% by weight calcium gluconate aqueous solution and placed at room temperature for 3 hours. Subsequently, normal saline was mixed with the platelet-containing solution treated with the calcium gluconate aqueous solution to make a total of 40 cc, then transferred to a tube with an appropriate capacity, followed by first centrifugation at a speed of 10,000 g for 30 minutes did Subsequently, the supernatant was separated from the resultant solution of the first centrifugation, transferred to a tube (45Ti, cat no. P30294, for 10.4ml), and subjected to second centrifugation at a speed of 150,000g for 70 minutes. This resulted in precipitated exosomes.
비교예 1Comparative Example 1
상기 실시예 1에 있어서, 상기 혈소판함유액을 글루콘산칼슘 수용액으로 처리하는 단계를 수행하지 않은 것을 제외하고 동일한 방법으로 엑소좀을 얻었다. Exosomes were obtained in the same manner as in Example 1, except that the step of treating the platelet-containing solution with an aqueous solution of calcium gluconate was not performed.
<평가><evaluation>
평가예 1: 나노입자추적분석(NTA) 및 투과전자현미경(TEM)Evaluation Example 1: Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) and Transmission Electron Microscopy (TEM)
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 추출된 엑소좀을 인산완충식염수(Phosphate buffered saline, PBS) 약 0.5 내지 약 1.0ml와 함께 혼합한 후 -80℃의 온도 조건 하에서 보관해두었다가 나노입자추적분석기(Malvern panalytical, Nanosight NS300)를 이용하여 나노입자추적분석(Nano particle Tracking Analysis, NTA) 그래프를 얻었다. 도 1의 (a)는 상기 실시예 1의 NTA 그래프이고, 도 1의 (b)는 상기 비교예 1의 NTA 그래프이다. 도 1을 참조할 때, 상기 실시예 1의 경우가 상기 비교예 1의 경우보다 200nm 이하의 엑소좀에 해당하는 크기의 피크 값이 약 1.5배 내지 약 2.0배 정도 큰 것을 확인할 수 있다. 이로부터 상기 글루콘산염 용액이 처리된 혈소판함유액으로부터 엑소좀을 얻는 실시예 1의 경우가 동일한 혈소판함유액에 대하여 상기 글루콘산염 용액을 처리하지 않고 엑소좀을 얻는 것보다 높은 수율을 나타내는 것을 확인할 수 있다. After mixing the exosomes extracted in Example 1 and Comparative Example 1 with about 0.5 to about 1.0 ml of phosphate buffered saline (PBS), they were stored at -80 ° C. A nanoparticle tracking analysis (NTA) graph was obtained using Malvern panalytical, Nanosight NS300). 1(a) is an NTA graph of Example 1, and FIG. 1(b) is an NTA graph of Comparative Example 1. Referring to FIG. 1, it can be seen that the peak value corresponding to the size of the exosomes of 200 nm or less in Example 1 is about 1.5 to about 2.0 times greater than that in Comparative Example 1. From this, the case of Example 1 in which exosomes were obtained from the platelet-containing solution treated with the gluconate solution showed a higher yield than the case of obtaining exosomes without treatment with the gluconate solution for the same platelet-containing solution. You can check.
한편, 상기 실시예 1에서 추출된 엑소좀을 인산완충식염수(Phosphate buffered saline, PBS) 약 0.5 내지 약 1.0ml와 함께 혼합한 후 -80℃의 온도 조건 하에서 보관해두었다가 투과전자현미경(Transmission electron microscope, TEM)(FEI社, Tecnai G2)을 이용하여 가속 전압 200kV 조건 하에서 TEM 사진을 측정하였다. 도 3은 이를 게재한 것이다. 도 3을 참조할 때, 상기 실시예 1의 제조방법을 통하여 실질적으로 혈소판 유래 엑소좀이 얻어진 것을 확인할 수 있다. On the other hand, the exosomes extracted in Example 1 were mixed with about 0.5 to about 1.0 ml of phosphate buffered saline (PBS), stored at -80 ° C, and then examined under a transmission electron microscope. , TEM) (FEI, Tecnai G2) was used to measure the TEM picture under the condition of an accelerating voltage of 200 kV. Figure 3 shows this. Referring to FIG. 3 , it can be confirmed that platelet-derived exosomes were substantially obtained through the manufacturing method of Example 1.
하기 표 1은 상기 실시예 1 및 상기 비교예 1을 통해 추출된 혈소판 유래 엑소좀의 수치적 함량을 게재한 것이다. 하기 표 1의 평균크기는 추출된 혈소판 유래 엑소좀의 수평균 크기 값이고, 모드크기는 가장 자주 발생하는 크기 값이며, 농도는 단위 mL 당 엑소좀의 개수이다. 이를 참조할 때, 전술한 바와 같이, 상기 실시예 1의 제조방법의 경우가 상기 비교예 1에 비하여 높은 수율로 혈소판 유래 엑소좀을 얻을 수 있음을 확인할 수 있다. Table 1 below shows the numerical content of platelet-derived exosomes extracted through Example 1 and Comparative Example 1. The average size in Table 1 below is the average size value of the number of extracted platelet-derived exosomes, the mode size is the most frequently occurring size value, and the concentration is the number of exosomes per unit mL. Referring to this, as described above, it can be confirmed that the production method of Example 1 can obtain platelet-derived exosomes in a higher yield than Comparative Example 1.
평가예 2: 엑소좀 마커 발현 평가Evaluation Example 2: Evaluation of exosome marker expression
상기 실시예 1 내지 실시예 4의 제조방법으로 제조된 엑소좀에 대하여 엑소좀 마커(CD9, CD63, CD81), 혈소판 엑소좀 마커(CD41), 적혈구 엑소좀 마커(Hb β)의 발현 정도를 웨스턴 블롯(Western blot)으로 확인하고 정량 분석 하였다. 상기 실시예 1 내지 실시예 4의 제조방법으로 제조된 엑소좀에 대하여 도 4는 엑소좀 마커(CD9, CD63, CD81) 발현 정도를 나타낸 그래프이고, 도 5는 혈소판 엑소좀 마커(CD41) 발현 정도를 나타낸 그래프이고, 도 6은 적혈구 엑소좀 마커(Hb β)의 발현 정도를 나타낸 그래프이다. 또한, 도 7은 3차에 걸친 웨스턴 블롯 결과를 게재한 것이다. 도 4 내지 도 6을 참조할 때, 상기 실시예 1 내지 4의 제조방법의 경우 모두 엑소좀을 분리 추출하는 데에 유용하지만, 혈소판 유래 엑소좀이 혈액의 다른 성분과의 상호작용에 의해 추출 수율이 달라짐을 고려할 때, 상기 실시예 1의 경우가 상기 실시예 2 내지 4의 경우에 비하여 혈소판으로부터 유래된 엑소좀을 얻기에 보다 유리한 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 7을 참조할 때, 상기 실시예 1의 경우, 혈소판 엑소좀 마커(CD41)의 발현 정도가 가장 큰 반면 상대적으로 적혈구 엑소좀 마커(Hb β)의 발현 정도가 낮은 것으로 보아 상기 실시예 1에서 제조된 엑소좀은 대부분이 혈소판에서 유래된 엑소좀임을 확인할 수 있다. The expression levels of exosome markers (CD9, CD63, CD81), platelet exosome marker (CD41), and erythrocyte exosome marker (Hb β) for the exosomes prepared by the manufacturing methods of Examples 1 to 4 were measured by Western It was confirmed by Western blot and quantitatively analyzed. 4 is a graph showing the expression level of exosome markers (CD9, CD63, CD81) for the exosomes prepared by the manufacturing methods of Examples 1 to 4, and FIG. 5 is the expression level of the platelet exosome marker (CD41). , and FIG. 6 is a graph showing the expression level of the red blood cell exosome marker (Hb β). In addition, Figure 7 shows the Western blot results over three times. 4 to 6, the preparation methods of Examples 1 to 4 are useful for isolating and extracting exosomes, but the extraction yield due to the interaction of platelet-derived exosomes with other blood components Considering this difference, it can be confirmed that Example 1 is more advantageous in obtaining exosomes derived from platelets than Examples 2 to 4. In addition, referring to FIG. 7, in the case of Example 1, the expression level of the platelet exosome marker (CD41) was the highest, whereas the expression level of the red blood cell exosome marker (Hb β) was relatively low. It can be confirmed that most of the exosomes prepared in 1 are platelet-derived exosomes.
이상, 상술한 바와 같이, 상기 혈소판 유래 엑소좀 제조방법은 종래에 엑소좀을 분리하기 어려웠던 혈소판을 유래 세포로 하여, 이로부터 분리 및 추출된 엑소좀을 높은 수율로 얻는 최적의 수단이 될 수 있다. 또한, 상기 혈소판 유래 엑소좀은 상기 제조방법을 통하여 제조됨으로써 목적하는 치료 효과에 부합하는 성분을 높은 함량으로 함유하는 이점을 가질 수 있다. As described above, the platelet-derived exosome preparation method can be an optimal means of obtaining exosomes isolated and extracted from platelets as cells derived from platelets, from which it was difficult to isolate exosomes in the prior art, in high yield. . In addition, the platelet-derived exosomes may have the advantage of containing a high content of components corresponding to a desired therapeutic effect by being prepared through the above manufacturing method.
10: 적혈구층
20: 버피코트층
30: 혈장층10: red blood cell layer
20: buffy coat layer
30: plasma layer
Claims (10)
상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계;를 포함하는
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
treating the platelet-containing solution with a gluconate solution; and
Centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution; comprising
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 글루콘산염은 글루콘산칼슘(Calcium gluconate), 글루콘산아연(Zinc gluconate), 글루콘산철(Iron(II) gluconate), 글루콘산나트륨(Sodium gluconate), 글루콘산마그네슘(Magnesium gluconate), 글루콘산칼륨(Potassium gluconate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 1,
The gluconate is calcium gluconate, zinc gluconate, iron (II) gluconate, sodium gluconate, magnesium gluconate, gluconate Containing one selected from the group consisting of potassium (Potassium gluconate) and combinations thereof,
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 글루콘산염 용액 중의 글루콘산염의 농도가 5중량% 내지 30중량%인,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 1,
The concentration of gluconate in the gluconate solution is 5% to 30% by weight,
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 혈소판함유액은 혈장층, 버피코트(Buffy coat)층 및 적혈구층을 포함하는,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 1,
The platelet-containing fluid includes a plasma layer, a buffy coat layer and a red blood cell layer,
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 혈소판함유액은 상기 혈장층 대 상기 버피코트층 대 상기 적혈구층을 10 : 0.5 : 0.5 내지 10 : 1.5 : 1.5의 부피비로 포함하는,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 4,
The platelet-containing solution comprises the plasma layer to the buffy coat layer to the red blood cell layer in a volume ratio of 10: 0.5: 0.5 to 10: 1.5: 1.5,
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계는,
상기 혈소판함유액 대 상기 글루콘산염 용액의 부피비가 5 : 1 내지 25 : 1이 되도록 혼합하는 단계를 포함하는,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 1,
The step of treating the platelet-containing solution with a gluconate solution,
Mixing so that the volume ratio of the platelet-containing solution to the gluconate solution is 5: 1 to 25: 1,
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 혈소판함유액에 글루콘산염 용액을 처리하는 단계는,
상기 혈소판함유액을 상기 글루콘산염 용액과 혼합한 후 30분 내지 4시간 자극시키는 단계를 포함하는,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 6,
The step of treating the platelet-containing solution with a gluconate solution,
Mixing the platelet-containing solution with the gluconate solution and then stimulating it for 30 minutes to 4 hours,
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 혈소판함유액은 혈소판농축혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP) 추출 방법을 이용하여 전혈로부터 얻어지는,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 1,
The platelet-containing fluid is obtained from whole blood using a platelet-rich plasma (PRP) extraction method.
Platelet-derived exosome manufacturing method.
상기 글루콘산염이 처리된 혈소판함유액을 원심분리하는 단계는,
5,000g 내지 15,000g의 속도로 10분 내지 1시간 동안 원심분리하는 제1 원심분리 단계; 및
100,000g 내지 400,000g의 속도로 30분 내지 3시간 동안 원심분리하는 제2 원심분리 단계;를 포함하는,
혈소판 유래 엑소좀(Exosome) 제조방법.
According to claim 1,
The step of centrifuging the gluconate-treated platelet-containing solution,
A first centrifugation step of centrifuging at a speed of 5,000g to 15,000g for 10 minutes to 1 hour; and
A second centrifugation step of centrifuging for 30 minutes to 3 hours at a speed of 100,000g to 400,000g;
Platelet-derived exosome manufacturing method.
혈소판 유래 엑소좀(Exosome).
Manufactured by the manufacturing method according to any one of claims 1 to 9,
Platelet-derived exosomes.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220025298A KR20230127699A (en) | 2022-02-25 | 2022-02-25 | Preparing method for platelet-derived exosome and exosome prepared by the method |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20200040943A (en) | 2018-10-02 | 2020-04-21 | 주식회사 스템온 | Composition for hair restoration comprising induced exosomes |
| KR102125567B1 (en) | 2019-07-02 | 2020-06-22 | 한양대학교 에리카산학협력단 | Large-Scale Production of Plant Derived Exosomes |
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2022
- 2022-02-25 KR KR1020220025298A patent/KR20230127699A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200040943A (en) | 2018-10-02 | 2020-04-21 | 주식회사 스템온 | Composition for hair restoration comprising induced exosomes |
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