KR20230125842A - FimH 돌연변이체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

FimH 돌연변이체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

FimH 렉틴 도메인이 만노스에 대해 저친화도 입체형태로 존재하도록 하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 기재된다. 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 폴리펩타이드를 투여함으로써 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 추가로 기재되어 있다.

Description

FimH 돌연변이체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
본 발명은 의료 미생물학 및 백신 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 FimH 렉틴 도메인이 만노스에 대해 낮은 친화도를 갖는 입체형태로 존재하게 하고, 대상체에게 투여 시 방광 상피 세포에 대한 E. coli의 부착의 항체 매개 저해를 높은 수준으로 유도하게 하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 면역원성 폴리펩타이드의 투여에 의해 면역 반응 자극을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법에 관한 것이다.
외부 장 감염(extra-intestinal infection)에 대한 책임이 있는 E. coli의 균주는 외부 장 병원성 E. coli(extra-intestinal pathogenic E. coli: ExPEC)로 지칭되었다. ExPEC는 가장 일반적인 장내 그람-음성 유기체로서, 외래, 장기 요양 및 입원 시에 외부 장 감염을 야기한다. E. coli로 인한 전형적인 외부 장 감염은 요로 감염(UTI), 세균증, 및 패혈증을 포함한다. E. coli는 심각한 패혈증의 주요 원인이고, 이는 높은 이환율 및 사망률에 대한 책임이 있다.
ExPEC는, 엔테로박테리아세아 패밀리의 다른 구성원으로서, 타입 I 핌브리아(Fimbriae)를 생성하는데, 이것은 점막 상피 표면에 대한 부착을 돕는다. 이러한 타입 I 핌브리아는 엔테로박테리아세아 패밀리의 표면 구성원으로부터 나오는 모발-유사 구조이다. 타입 I 핌브리아의 주요 성분은 오른손 나선으로 배열된 FimA의 반복 소단위여서 중심 축방향 구멍을 갖는 길이가 대략 1 μm이고 직경이 7 nm인 필라멘트를 형성한다. 주요 소단위로서 FimA와 함께, 핌브리아 필라멘트는 또한 부(minor) 단백질 소단위로서 FimF, FimG 및 FimH를 함유한다. 부 단백질 소단위 FimH는 진핵 세포 표면 상의 만노스-함유 당단백질에 대한 타입 I-핌브리아 박테리아의 부착을 촉진하는 만난-결합 어드헤신이고, 만난 및 피브로넥틴을 포함하는 다양한 표적에 결합하는 단백질의 패밀리를 나타낸다. 면역 전자 현미경 연구는 FimH가 타입 I 핌브리아의 원위 팁에 전략적으로 배치되는데, 여기서 이것은 FimG와 복합체를 형성하여 가요성 피브릴 구조를 형성하는 것으로 보이며, 또한 필라멘트를 따라 다양한 간격으로 종방향으로 배치된다.
FimH 어드헤신 단백질은 UTI에 대한 다양한 전임상 모델에서 백신으로서 사용될 때 보호를 유도하는 것으로 나타났다(문헌[Langermann S, et al., 1997, Science, 276: 607-611]; 문헌[Langermann S, et al., 2000, J Infect Dis, 181: 774-778]; 문헌[O'Brien VP et al., 2016, Nat Microbiol, 2:16196]).
E. coli 감염 중에, 만노실화된 수용체에 결합하는 어드헤신 FimH의 렉틴 도메인은 만노스(긴장성(tense))에 대한 저친화도 및 만노스(연장/이완)에 대한 고친화도의 2개의 구별되는 입체형태를 채택할 수 있다(문헌[Kalas et al, 2017, Sci Adv 10;3(2)]). 저친화도 입체형태는 박테리아 운동성 및 신규 조직의 콜로니화를 촉진한다. 고친화도 입체형태는 소변 배출의 기계적 힘 하에서 긴밀한 박테리아 부착을 보장한다. 또한, 저친화도 변이체에 대한 항체는 비뇨상피 세포에 대한 박테리아 결합을 차단하고 방광에서 CFU 수치를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Tchesnokoca, 2011 Infect Immun. 79(10):3895-904]; 문헌[Kisiela, 2013 Proc Natl Acad Sci, 19;110(47):19089-94]).
WO02102974는 분자의 캐년(canyon) 영역에서 아미노산 변형을 모두 포함하는 다수의 FimH 돌연변이체를 기술한다. 구체적으로, WO02102974는 결합 포켓 내의 만노스 상호작용 잔기가 돌연변이된 변이체를 기술한다. 이러한 돌연변이의 위치가 선택되는데, 그 이유는 이것이 FimH 돌연변이체를 더 개방된 입체형태로 유지하고 이에 의해 야생형 단백질에서 불량하게 접근 가능한 에피토프를 노출시킬 것이기 때문이다. 그러나, 현재까지, 이러한 돌연변이체 중 어느 것도 백신 후보로서 추가로 추구되지 않았다. 임상 시험에서, 야생형 FimH만이 사용되었다.
따라서, 당업계에는 E. coli에 의해서 야기되는 박테리아 감염에 대해서 고도로 저해성인 항체를 유도할 수 있는 백신에 대한 필요성이 존재한다.
제1 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열의 위치 71에 상응하는 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 아미노산을 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 위치 144에 상응하는 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 아미노산을 추가로 포함한다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제7 양태에서, 본 발명은 엔테로박테리아세아 패밀리의 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 벡터, 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 엔테로바실러스 관련 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 엔테로바실러스 관련 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 벡터, 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
제8 양태에서, 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 본 발명의 벡터를 함유하는 재조합 세포로부터 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공하며, 선택적으로 이 방법은 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로 폴리펩타이드는 그 후에 폴리펩타이드의 약제학적 조성물로 제형화된다.
도 1 : 상이한 FimH 변이체에 의해 유도된 항체의 기능. Wistar 래트에게 제0일, 제7일, 제10일 및 제18일에 비-프로인트 아주반트 (Speedy-래트 모델, Eurogentec)와 조합된 상이한 FimH 변이체 60 ug/용량을 사용하여 4회 근육내 면역화를 제공하였다. 혈청 샘플을 제0일(면역화 전) 및 제28일(면역화 후)에 얻었다.
A) 다양한 FimH 변이체(그래프 아래에 표시됨)를 사용한 초기 실험. 저해성 항체 역가(IC50)를 12-단계 희석 곡선에 피팅된 4-매개변수 로지스틱 회귀 모델에 기초하여 계산하였다. 데이터는 2마리 동물/군으로부터의 중복 혈청 샘플의 평균을 나타낸다.
B) FimH 돌연변이체 F144V, f71Y 및 F144V/F71Y 이중 돌연변이체를 사용한 별도의 실험. 저해성 항체 역가(IC50)를 6-단계 희석 곡선에 피팅된 4-매개변수 로지스틱 회귀 모델에 기초하여 계산하였다. 그래프는 GMT(기하학적 평균 역가) ±95% CI(신뢰 구간)로 중복으로 측정된 혈청 샘플의 면역화 전 및 면역화 후 개별 IC50 역가를 나타낸다. LOD: 검출 한계.
도 2 : NMR 분광법에 의해 결정된 바와 같은 만노사이드 리간드의 존재 및 부재에서의 상이한 FimH 렉틴 도메인 변이체의 입체형태 상태. 좌측 패널은 만노사이드 리간드가 결합되지 않은 경우(예를 들어, apo 상태) 저친화도 상태(L)에서 균일하게 15N-표지된 FimHLD 변이체의 15N HSQC NMR 스펙트럼을 나타내고, 우측 패널은 만노사이드 리간드가 결합된 경우(예를 들어, 리간드 상태) 고친화도 상태(H)에서의 스펙트럼을 나타낸다. 만노사이드 리간드의 결합 시 화학적 이동을 겪는 주요 아미노산 잔기를 박스에 나타낸다. E. coli 23-10에 대해서 특이적인 잔기 번호 1 및 2를 제외하고는, 잔기가 E. coli K12로부터의 공개적으로 입수 가능한 NMR 스펙트럼으로부터 식별되었는데(문헌[Rabbani S et al, j Biol. Chem., 2018, 293(5):1835-1849]), 이는 야생형 FimHLD 23-10 단백질이 E.coli K12의 FimHLD와 비교할 때 apo 상태에서 약간 상이한 입체형태를 갖는다는 것을 나타낸다.
본 발명은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 신규한 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 FimH 렉틴 도메인은 본 명세서에서 '저친화도 입체형태'라고도 지칭되는 만노스에 대해 저친화도를 갖는 입체형태로 "잠금"된다. 본 발명은 만노스 입체형태에 대해 저친화도의 FimH 항원이 만노사이드 매개 부착을 저해할 수 있는 항체를 유도할 수 있다는 관찰에 부분적으로 기초한다. 이들 항체는 매우 저해성이며 박테리아 감염을 예방 또는 치료하는 데 향상된 효과를 갖는다. F71Y 돌연변이를 갖는 FimH 렉틴 도메인이 예를 들어, 재발성 UTI를 예방 또는 감소시키기 위해 UTI에 대한 백신에 사용하기에 매우 적합하게 만드는 놀랍게도 바람직한 특성의 양호한 조합을 갖는 것을 발견하였다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 참조 아미노산 서열의 위치 71에 상응하는 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 아미노산을 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 면역원성 폴리펩타이드를 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 참조 아미노산 서열에서 각각 위치 71 및 144에 상응하는 두 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 아미노산을 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 면역원성 폴리펩타이드를 추가로 제공한다. 이러한 "이중 돌연변이"는 저친화도 입체형태로 잠긴 상태로 유지되며 따라서 만노사이드 매개 부착을 저해할 수 있는 항체를 동등하게 유도할 수 있다. 이러한 저해성 항체를 유도하는 것에 더하여, 본 명세서에서 FimH 렉틴 도메인의 F71Y 및 F144V 이중 돌연변이체는 이중 돌연변이체에 놀랍게 높은 안정성을 제공하는 고친화도 입체형태로 다시 전환될 수 없다는 것을 발견하였다. 고친화도 입체형태로 다시 전환될 수 없다는 것은, 이중-돌연변이체를 예를 들어, 재발성 UTI를 예방하거나 감소시키기 위해서, 예를 들어, UTI에 대한 백신에 사용하기에 매우 적합하게 만드는 매우 바람직한 특성인데, 그 이유는 특히 그러한 입체형태가 저장 동안 또는 다른 저장 또는 사용 조건 하에서 안정한지의 여부를 시험하기 위한 추가적인 품질 또는 안정성 제어가 필요하지 않다는 것을 보장하기 때문이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 아미노산 위치 71 및 144는 서열번호 1의 FimH 렉틴 도메인의 참조 아미노산 서열에서 각각 위치 71 및 144를 지칭한다. 서열번호 1 이외의 본 발명의 아미노산 서열에서, 바람직하게는 아미노산 위치 71 및 144는 서열 정렬에서, 바람직하게는 디폴트 설정을 사용한 ClustalW(1.83) 서열 정렬에서, 서열번호 1에서, 각각 위치 71 및 144에 상응하는 다른 아미노산 서열의 위치에 존재한다. 당업자는 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 서열 정렬 알고리즘을 사용하여 서열번호 1 이외의 FimH 렉틴 도메인 아미노산 서열에서 상응하는 아미노산 위치를 식별하는 방법을 알고 있을 것이다.
본 출원 전체에 걸쳐, 서열번호 1의 아미노산 서열의 위치 71에 상응하는 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 아미노산을 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 본 명세서에서 "FimH(F71mut)"로 지칭될 것이다. 마찬가지로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 각각 위치 71 및 144에 상응하는 두 위치에서 페닐알라닌(F) 이외의 아미노산을 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 본 명세서에서 "FimH(F71mut/F144mut)"로 지칭될 것이다.
특정 실시형태에서, FimH(F71mut)는 서열번호 1의 위치 71에 상응하는 위치에서 티로신(Y) 및 트립토판(W)의 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다.
특정 실시형태에서, FimH(F71mut)는 서열번호 1의 위치 71에 상응하는 위치에서 티로신(Y)을 포함한다.
특정 실시형태에서, FimH(F71mut/F144mut)는 서열번호 1의 위치 144에 상응하는 위치에서 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다.
특정 실시형태에서, FimH(F71mut/F144mut)는 서열번호 1의 위치 144에 상응하는 위치에서 발린(V)을 포함한다.
특정 실시형태에서, FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut) 렉틴 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시형태에서, FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut)는 FimH 렉틴 도메인이 만노스 입체형태에 대해 저친화도로 존재하게 하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, FimH(F71mut)는 서열번호 1에서 위치 71에 상응하는 위치에서 돌연변이되었다. 일 실시형태에서, FimH(F71mut/F144mut)는 서열번호 1에서 위치 71 및 144에 상응하는 위치에서 돌연변이되었다.
이러한 문맥에서 만노스에 대해 저친화도를 갖는 FimH 렉틴 도메인은 예를 들어, 실시예 2에 명시된 조건 하에서, 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정할 때 적어도 1000 nM 이상의 해리 상수(KD)로 만노사이드 리간드에 결합하는 FimH 렉틴 도메인으로서 본 명세서에서 정의된다. 만노스에 대해 높은 친화도를 갖는 FimH 렉틴 도메인은 동일한 조건 하에서, 100 nM 이하인 KD로 만노사이드 리간드에 결합하는 FimH 렉틴 도메인으로서 본 명세서에서 정의되고; 전형적으로 야생형 FimH는 이 카테고리에 속한다. 이러한 조건 하에서 100 nM 내지 1000 nM의 KD를 갖는 FimH 렉틴 도메인은 본 명세서에서 만노스에 대한 중간 친화도를 갖는 것으로 지칭된다.
이러한 문맥에서 용어 '돌연변이체', '돌연변이', '돌연변이된' 또는 '치환', 치환된'은 본 명세서에서 위치 71 및 144에서 F를 갖는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드인 상응하는 모 분자에서 표시된 위치에 또 다른 아미노산이 존재함을 의미한다. 이러한 모 분자는 폴리펩타이드로서 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 형태로 물리적으로 존재할 수 있지만, 또한 아미노산 서열 또는 아미노산 서열을 암호화하는 상응하는 핵산 서열로서 인 실리코 또는 온 페이퍼로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 문맥에서 돌연변이 또는 치환은, 예를 들어, 핵산 분자가 전체적으로 화학적 합성에 의해 제조된 경우, 상응하는 모 분자를 암호화하는 핵산이 그 공정 동안 초기에 실제로 제조되지 않았더라도, 단백질이 돌연변이 또는 치환을 암호화하도록 합성된 핵산으로부터 발현된 경우에는, 존재하는 것으로 간주된다.
바람직하게는, 돌연변이는 단일 아미노산 잔기의 치환이다. 돌연변이는 바람직하게는 각각 서열번호 1의 위치 71 및 144 중 적어도 하나에 상응하는 아미노산 잔기의 치환이다. 바람직하게는, 돌연변이는 서열번호 1의 위치 71에 상응하는 위치에서 또 다른 아미노산에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1의 위치 144에 상응하는 위치에서 또 다른 아미노산에 의한 페닐알라닌(F)의 치환을 추가로 포함한다. FimH(F71mut)에서, 서열번호 1에서 위치 71에 상응하는 위치는 바람직하게는 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 대해 치환된다. 바람직한 일 실시형태에서, FimH(F71mut)는 위치 71에서 페닐알라닌(F)의 티로신(Y)으로의 치환을 포함한다. 특정 실시형태에서, FimH(F71mut)는 위치 71에서 티로신을 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, FimH(F71mut)는 자연 발생 페닐알라닌 대신에 위치 71에서 티로신을 갖는다("FimH(F71Y)"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, FimH(F71mut)는 페닐알라닌 이외에 자연 발생 아미노산 대신에 위치 71에서 티로신을 갖는다('FimH(x71Y)', 여기서 x는 모 분자에서 페닐알라닌 또는 티로신 이외의 아미노산일 것이다).
일 실시형태에서, FimH(F71mut/F144mut)는 서열번호 1에서 위치 71 및 144에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함한다. 위치 71에서의 돌연변이는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 치환이다. 위치 144에서의 돌연변이는 바람직하게는 서열번호 1에서 위치 144에 상응하는 아미노산 잔기의 치환이다. 바람직하게는, 돌연변이는 서열번호 1에서 위치 144에 상응하는 위치에서 페닐알라닌(F) 아미노산 잔기의 치환이다. 바람직하게는, 위치 144에서의 아미노산은 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M) 및 알라닌(A)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환된다. 바람직한 일 실시형태에서, FimH(F71mut/F144mut)는 위치 144에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환을 포함한다.
특정 실시형태에서 FimH(F71mut/F144mut)는 위치 71에서 티로신 및 위치 144에서 발린을 포함하는 비-자연 발생 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, FimH(F71mut/F144mut)는 자연 발생 페닐알라닌 대신에 위치 71에서 티로신을 갖고, 자연 발생 페닐알라닌 대신에 위치 144에서 발린을 갖는다. 특정 실시형태에서, FimH(F71mut/F144mut)는 페닐알라닌 이외의 자연 발생 아미노산 대신에 위치 71에서 티로신을 갖고, 페닐알라닌 이외의 자연 발생 아미노산 대신에 위치 144에서 발린을 갖는다.
전장 FimH(FimHFL)는 2개의 도메인으로 구성된다: 짧은 테트라-펩타이드 루프 링커에 의해서 C-말단 선모 도메인(FimHPD)에 연결된 N-말단 렉틴 도메인(FimHLD). 본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 FimH 선모 도메인을 포함하지 않는다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 FimH 선모 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut)는 전장 FimH 폴리펩타이드이며, 여기서 FimH 렉틴 도메인은 FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut)에 대해 각각 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 또 다른 폴리펩타이드에 융합된 FimH 렉틴 도메인의 융합 폴리펩타이드이며, 다른 폴리펩타이드는 임의의 관심 폴리펩타이드일 수 있고, 이는 자연에서 FimH와 관련되지 않고 FimH와 회합되지 않아야 한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 FimH 선모 도메인을 추가로 포함하고 또한 또 다른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드이며, 다른 폴리펩타이드는 임의의 관심 폴리펩타이드일 수 있고, 자연에서 FimH와 관련되지 않고 FimH와 회합되지 않아야 한다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 또한 백신접종 목적을 위한 면역원으로서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, FimHFL 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 위치 71 또는 71 및 144는 각각 FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut)에 대해 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, FimHFL 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 F71Y 및 선택적으로 F144V 치환을 제외하고는 서열번호 2를 갖는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 4와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 바람직하게는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300을 갖는 FimHFL이며, 여기서 위치 71 또는 71 및 144는 각각 FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut)에 대해 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, FimHFL 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 F71Y 및/또는 F144V 치환을 제외하고는, 서열번호 4를 갖는 서열 또는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, FimHFL 폴리펩타이드는 전문이 본 명세서에 포함된 US6,737,063에 기재된 바와 같은 서열번호 23 내지 45 및 55와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 위치 71 또는 71 및 144는 각각 FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut)에 대해 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 잔기를 포함한다.
FimH 폴리펩타이드는 E. coli의 다양한 균주들 사이에 고도로 보존되어 있고, 이들은 또한 광범위한 그람-음성 박테리아 사이에서 고도로 보존된다. 또한, 균주들 사이에서 일어나는 아미노산 변화는 일반적으로 유사한 아미노산 위치에서 발생한다. E. coli 균주들 사이에서 FimH의 높은 보존의 결과로서, 하나의 균주로부터의 FimH 폴리펩타이드는 FimH 렉틴에 의해서 다른 E. coli 균주가 세포에 결합하는 것을 저해하거나 예방하고/하거나 다른 E. coli 균주에 의해서 야기되는 감염에 대한 보호 및/또는 치료를 제공하는 항체 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, FimHFL 폴리펩타이드는 서열번호 5와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성, 또는 바람직하게는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 위치 71 또는 71 및 144는 각각 FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut)에 대해 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, FimHFL 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 F71Y 치환 및 선택적으로 F144V 치환을 제외하고는, 서열번호 5를 갖는 서열 또는 적어도 이의 아미노산 22 내지 300을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, FimH FL 폴리펩타이드는 서열번호 6과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 위치 71 또는 71 및 144는 각각 FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut)에 대해 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, FimHFL 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 F71Y 치환, 및 선택적으로 F144V 치환을 제외하고는 서열번호 6을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, FimH는 바람직하게는 E. coli FimH이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "주변세포질 샤페론"은 공통 결합 에피토프(또는 에피토프들)의 인식을 통해 다양한 샤페론-결합 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 박테리아의 주변세포질에 국소화된 단백질로서 정의된다. 샤페론은 박테리아 세포로부터 주변세포질로 외수송된 단백질이 그의 천연 입체형태로 접힐 때 주형으로서 작용한다. 샤페론 결합 단백질과 샤페론의 회합은 또한 주변세포질 내에 국지화된 프로테아제에 의한 분해로부터 결합 단백질을 보호하는 역할을 하며, 수성 용액에서 이의 용해도를 증가시키고, 조립 선모(assembling pilus)에 순차적으로 정확한 혼입을 야기한다. 샤페론 단백질은 이러한 조립을 매개함으로써 선모의 조립에 관여하지만 구조에 혼입되지 않는 그람-음성 박테리아의 단백질의 부류이다. FimC는 FimH의 주변세포질 샤페론 단백질이다. 본 발명에 사용하기 위한 FimC 폴리펩타이드는 서열번호 3과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, FimC 폴리펩타이드는 전문이 본 명세서에 포함된 US6,737,063에 기재된 바와 같은 서열번호 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. FimC와 FimH의 비공유 복합체는 FimCH로 명명된다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut)를 포함하고 본 명세서에 정의된 바와 같은 FimH 선모 도메인 또는 전장 FimH를 추가로 포함하는 폴리펩타이드 및 본 명세서에 정의된 바와 같은 FimC 폴리펩타이드를 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시형태에서, FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 렉틴 도메인은 FimH 선모 도메인을 추가로 포함하는 폴리펩타이드의 일부이며, 이는 FimC와 복합체화되어 FimCH 복합체를 형성한다.
본 출원의 발명자는 상이한 아미노산 변화를 갖는 몇몇 FimH 렉틴 도메인 변이체를 생성하였고, 이들을 다양한 검정에서 효율에 대해 시험하였다 (실시예 참조).
본 명세서에 기재된 FimH(F71mut) 및 FimH(F71mut/F144mut) 둘 다는 FimCH 복합체를 형성할 수 있었다.
일 실시형태에서, FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 렉틴 도메인은 서열번호 2와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 FimHFL 폴리펩타이드의 일부이고, 이것은 선택적으로 FimC 폴리펩타이드와 복합체화되어 FimCH 복합체를 형성한다. 최종 형태의 FimHFL 폴리펩타이드, 즉, 성숙 FimHFL 폴리펩타이드는 전형적으로 예를 들어 서열번호 4 및 5의 아미노산 1 내지 21로서 제시된 신호 펩타이드를 포함하지 않고, 즉, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 성숙 FimHFL 폴리펩타이드는 이들 서열의 아미노산 22 내지 300을 포함하지만 전형적으로 아미노산 1 내지 21이 결여되어 있는 것으로 이해된다. FimHFL 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해서, 재조합 숙주 세포에서 신호 펩타이드를 포함하는 성숙 FimHFL 폴리펩타이드를 암호화하여, 폴리펩타이드의 세포질주위 위치로 이어지는 일반적인 분비 경로를 통해서 내부(세포질)막을 가로지르는 수송(때때로 "세포질주위 발현"이라고 지칭됨)을 얻는 것이 유용하지만, 단리된 그대로 그리고 예를 들어, 약제학적 조성물에서 사용되는 최종 성숙 FimHFL 폴리펩타이드에서, 신호 펩타이드는 전형적으로 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포에 의한 프로세싱의 결과로서 더이상 존재하지 않는다.
일 실시형태에서, FimCH 복합체는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 FimC 단백질 및 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 렉틴 도메인을 포함하는 FimH 단백질을 포함하거나 이들로 이루어진다. 특정 실시형태에서, FimCH 복합체는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 FimC 단백질 및 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 렉틴 도메인을 포함하는 FimH 단백질 또는 FimHFL 단백질을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 FimHFL 단백질은 바람직하게는 (예를 들어, 여전히 신호 펩타이드를 포함하는 서열번호 4 또는 5에서) F92 치환을 포함한다. 선택적으로, FimCH 복합체는 서열번호 3과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 FimC 단백질 및 렉틴 도메인 내에 F71(Y) 및 F144(V) 치환을 포함하는 FimH 또는 (예를 들어, 여전히 신호 펩타이드를 포함하는 서열번호 4 또는 5에서) F92(Y) 및 F165(V) 치환을 포함하는 전장 FimH 단백질을 포함하거나 이들로 이루어진다.
여전히 신호 펩타이드를 포함하는 전장 FimH에서, 아미노산 위치 92는 FimH 렉틴 도메인에서 아미노산 위치 71에 상응하고, 위치 165는 아미노산 위치 144에 상응한다. 당업자는 상기에 정의된 바와 같은 아미노산 서열 정렬 알고리즘을 사용하여 전장 FimH 아미노산 서열 및 FimH 렉틴 도메인 아미노산 서열에서 상응하는 아미노산 위치를 식별하는 방법을 알 것이다.
일 실시형태에서, E. coli 샤페론 FimC 및 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 복합체는 FimH(F71mut)- 또는 FimH(F71mut/F144mut)-포함 폴리펩타이드를 FimC와 함께 공동-발현시킴으로써 재조합 세포로부터 형성될 수 있다.
일 실시형태에서, FimCH 복합체는 하나의 박테리아 균주로부터 유래된 FimC를 포함하는 반면, FimH는 상이한 박테리아 균주로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, FimCH 복합체는 FimC 및 FimH를 포함하며, 이들 둘 다는 동일한 박테리아 균주로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, FimH 또는 FimC, 또는 FimH 및 FimC 둘 다는 자연에 존재하는 실제 박테리아 단리물로부터 유래하지 않은 인공 서열일 수 있으며, 예를 들어, 이들은 또한 공통 서열 또는 자연 단리물의 조합에 기초할 수 있다.
일 실시형태에서, FimCH 복합체는 His-태그를 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전장 FimH는 His-태그를 포함하거나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 FimC는 His-태그를 포함한다. 바람직하게는, FimCH 복합체에서, FimC는 His-태그를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 His-태그는 히스티딘(His) 잔기, 예를 들어, 6개의 His 잔기의 스트레치이며, 이는 내부에 또는 바람직하게는 단백질의 N- 또는 C-말단에 부가될 수 있다. 그러한 태그는 정제의 용이성을 위해 잘 알려진 용도를 갖는다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 이에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 선행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 FimH 암호 서열에 대해 내인성이다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 엔테로박테리아세아 패밀리의 박테리아에서 FimH의 발현을 구동하는 내인성 프로모터이다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 FimH 암호 서열에 이종성이며, 예를 들어 재조합 발현 시스템에 사용하기 위해 당업자에게 알려진 강력한 프로모터가 사용된다. 예를 들어, 유도성 Lac 프로모터를 포함하는 pET-DUET 벡터가 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드 및/또는 FimC 폴리펩타이드의 발현을 위해 사용될 수 있다. Lac 프로모터 또는 Tac 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 경우, IPTG를 사용하여 발현을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 그의 자연 환경으로부터 단리된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리펩타이드는 재조합, 합성 또는 인공 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 형태의 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 FimH 암호화 폴리뉴클레오타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 5'-단부 및/또는 3'-단부에서 자연 발생 FimH-암호화 폴리뉴클레오타이드에 존재하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖는다. 암호화된 성숙 FimC 및/또는 FimH의 서열은 바람직하게는 각각의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 바와 같은 폴리펩타이드에서 신호 펩타이드가 선행될 수 있고, 신호 펩타이드는 각각 FimC 및/또는 FimH 폴리펩타이드에 대한 내인성 신호 펩타이드(즉, 이들 단백질에 대해 자연에서 발생하는 신호 펩타이드)일 수 있거나, 이들은 이종 신호 펩타이드, 즉, 다른 단백질 또는 합성 신호 펩타이드로부터의 신호 펩타이드일 수 있다. 신호 펩타이드는 주변세포질 발현에 유용하지만, 전형적으로 각각 절단되어 최종적으로 생성되고 정제된 FimC 및/또는 FimH에 존재하지 않는다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 바람직하게는 플라스미드이다. 벡터는 바람직하게는 DNA, 예를 들어 DNA 플라스미드의 형태이다. 특정 실시형태에서, 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 이는 폴리뉴클레오타이드가 프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 프로모터는, 예를 들어, 플라스미드의 발현 카세트에서 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 상류에 위치할 수 있다.
더 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 일반적인 분자 생물학 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. 이러한 핵산은 염색체외에, 예를 들어, 플라스미드 또는 다른 벡터 상에 존재할 수 있거나, 또는 이것은 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 바람직하게는, 단백질을 암호화하는 핵산은 프로모터와 같은 숙주 세포에서 핵산의 발현을 유도하는 서열에 작동 가능하게 커플링된다. 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있거나, 이것은 특정 조건, 예를 들어, 당업계에 널리 알려진 것과 같은 온도 변화 또는 세포 내의 특정 화학물질 또는 단백질의 존재에 대해 활성이 조절, 예를 들어, 억제되거나 유도될 수 있는 촉진제일 수 있다.
숙주 세포는 단리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 예를 들어, 생물반응기와 같은 배양 용기에서 배양 배지에서 배양될 수 있다. 세포는 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 적합한 임의의 미생물, 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포이다. 바람직하게는, 박테리아 숙주 세포는 그람-음성 박테리아 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 E. coli 및 클레브시엘라(Klebsiella)로부터 선택된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 E. coli이다.
필요한 경우 그리고/또는 원하는 경우, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드 또는 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 첨가함으로써 약학적으로 활성인 혼합물 내에 혼입될 수 있다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드 또는 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물을 또한 제공한다.
본 발명의 (약제학적) 조성물은 담체, 충전제, 보존제, 가용화제 및/또는 희석제를 포함하는 임의의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 특히 주사용 용액의 경우에, 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 예는 공지되어 있으며, 예를 들어, 교과서 및 매뉴얼에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 완충제, 예를 들어, Tris-완충 식염수, 포스페이트 완충제, HEPES 또는 수크로스 포스페이트 글루타메이트 완충제를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 염, 예를 들어, Tris-하이드로클로라이드, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 인산나트륨, 모노소듐 글루타메이트, 및 알루미늄 염 (예를 들어, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산칼륨알루미늄, 또는 이러한 알루미늄염의 혼합물)을 추가로 포함한다.
본 발명의 조성물은 조성물이 투여되는 숙주에서 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있으며, 즉, 면역원성이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 엔테로박테리아세아의 패밀리의 박테리아에 의해 야기되는, 바람직하게는 클레브시엘라 또는 E. coli, 더욱 바람직하게는, E. coli에 의해 야기되는 감염에 대한 백신으로서 사용될 수 있고, 따라서, 선택적으로 백신에 사용하기에 적합한 임의의 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물의 추가적인 선택적인 성분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 아주반트이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 보존제, 예컨대, 페놀, 벤즈에토늄 클로라이드, 2-페녹시에탄올, 또는 티메로살을 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 (약제학적) 조성물은 0.001% 내지 0.01%의 보존제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 (약제학적) 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 대상체로의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 피하, 비경구, 경구, 피부내, 경피, 결장직장, 복강내, 질내 또는 직장 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내, 경구, 협측, 복강내, 비강내, 기관내, 피하, 근육내, 국소, 피부내, 경피 또는 폐 투여, 바람직하게는 근육내 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 사용 전에 저장될 수 있으며, 예를 들어 조성물은 냉동(예를 들어, 약 -20℃ 또는 약 -70℃)에서 저장될 수 있거나; 냉장 조건(예를 들어, 약 2 내지 8℃, 예를 들어 약 4℃에서) 저장될 수 있거나; 또는 실온에서 저장될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 아주반트를 추가로 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아주반트"는 본 발명의 조성물과 함께 또는 그의 일부로서 투여될 때 FimH에 대한 면역 반응을 증강시키고/시키거나, 향상시키고/시키거나 부스팅하지만, 아주반트 화합물이 단독으로 투여되는 경우 접합체 및/또는 FimH에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 지칭한다. 아주반트는 예를 들어, 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 항원 제시 세포의 자극을 포함하는 몇몇 기전에 의해 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 아주반트를 포함하거나, 아주반트와 조합하여 투여된다. 본 발명의 조성물과 조합하여 투여하기 위한 아주반트는 면역원성 조성물의 투여 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 및 아주반트는 단일 조성물의 형태로 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 아주반트를 포함하지 않고, 아주반트와 조합하여 투여되지 않는다.
아주반트의 구체적인 예는 알루미늄 염(알룸)(예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 및 산화알루미늄, 알룸 또는 나노알룸 제형을 포함하는 나노입자를 포함함), 인산칼슘(예를 들어, 문헌[Masson JD et al, 2017, Expert Rev Vaccines 16: 289-299]), 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(예를 들어, 영국 특허 GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919), AS01, AS02, AS03 및 AS04(모두 GlaxoSmithKline; 예를 들어, AS04에 대해서는 EP1126876, US7357936, AS02에 대해서는 EP0671948, EP0761231, US5750110 참조), 이미다조피리딘 화합물(WO2007/109812 참조), 이미다조퀴녹살린 화합물(WO2007/109813 참조), 델타이눌린(예를 들어, 문헌[Petrovsky N and PD Cooper, 2015, Vaccine 33: 5920-5926] 참조), STING-활성화 합성 사이클릭-다이-뉴클레오타이드(예를 들어, US20150056224), 레시틴과 카르보머 단독중합체의 조합물(예를 들어, US6676958) 및 사포닌, 예컨대, Quil A 및 QS21(예를 들어, 문헌[Zhu D and W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113] 참조)(선택적으로 QS7과 조합됨)(문헌[Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)]); US 5,057,540 참조)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 프로인트 아주반트(완전 또는 불완전)이다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 예를 들어, Brenntag(현재 Croda) 또는 Invivogen으로부터 상업적으로 입수 가능한 Quil-A를 포함한다. QuilA는 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무(Quillaja saponaria Molina tree)로부터의 사포닌의 수-추출 가능한 분획을 함유한다. 이들 사포닌은 일반적인 트라이테르페노이드 골격 구조를 갖는 트라이테르페노이드 사포닌의 군에 속한다. 사포닌은 T-의존성 항원뿐만 아니라 T-비의존성 항원에 대한 강한 아주반트 반응뿐만 아니라 강력한 세포독성 CD8+ 림프구 반응을 유도하고, 점막 항원에 대한 반응을 강화하는 것으로 알려져 있다. 이들은 또한 콜레스테롤 및 인지질과 조합되어 면역자극 복합체 (immunostimulatory complex: ISCOM)를 형성할 수 있으며, 여기서 QuilA 아주반트는 상이한 기원으로부터의 광범위한 항원에 대한 항체 매개 및 세포 매개 면역 반응 둘 다를 활성화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 AS01, 바람직하게는 AS01B이다. S01은 MPL(3-O-데아실-4'-모노포스포릴 지질 A), qS21(퀼라자 사포나리아 모닐라 분획 21) 및 리포좀을 함유하는 아주반트 시스템이다. 특정 실시형태에서, AS01은 상업적으로 입수 가능하거나(GSK), 본 명세서에 참조로 포함된 WO 96/33739에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 아주반트는 2개의 비혼화성 유체, 예를 들어, 오일과 물의 혼합물인 에멀젼을 포함하며, 이들 중 하나는 다른 것의 내부에 작은 액적으로서 현탁되고 표면 활성제에 의해 안정화된다. 수중유 에멀젼은 오일의 작은 액적을 둘러싸는 연속상을 형성하는 물을 갖는 반면, 유중수 에멀젼은 연속상을 형성하는 오일을 갖는다. 특정 에멀젼은 스쿠알렌(대사 가능한 오일)을 포함한다. 특정 아주반트는 2개의 단량체가 함께 클러스터링되고 반복 단위의 블록을 형성할 때 형성된 공중합체인 블록 공중합체를 포함한다. 블록 공중합체, 스쿠알렌 및 미립자 안정화제를 포함하는 유중수 에멀젼의 예는 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 입수 가능한 TiterMax®이다. 선택적으로, 에멀젼은 면역자극 성분, 예컨대, TLR4 효능제와 조합될 수 있거나 이를 추가로 포함할 수 있다. 특정 아주반트는 선택적으로 면역 자극제, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A와 조합하여 MF59(예를 들어, EP0399843, US 6299884, US6451325 참조) 및 AS03 및/또는 Q21, 예컨대, AS02에서 또한 사용되는 수중유 에멀젼(예컨대, 스쿠알렌 또는 땅콩유)이다(문헌[Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91] 참조). 아주반트의 추가 예는 면역자극제 함유 리포좀, 예컨대, AS01E 및 AS01B에서와 같은 MPL 및 QS21(예를 들어, US 2011/0206758)이다. 아주반트의 다른 예는 CpG, 및 이미다조퀴놀린(예컨대, 이미퀴모드 및 R848)이다. 예를 들어, 문헌[Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 아주반트는 사포닌을 포함하며, 바람직하게는 퀼라자 사포나리아로부터 얻은 사포닌의 수-추출 가능한 분획을 포함한다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 QS-21을 포함한다.
특정 실시형태에서, 아주반트는 톨-유사 수용체 4(toll-like receptor 4: TLR4) 효능제를 함유한다. TLR4 효능제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807]을 참조한다. 특정 실시형태에서, 아주반트는 지질 A를 포함하는 TLR4 효능제, 또는 이의 유사체 또는 유도체이다.
예를 들어, TLR4 효능제를 포함하는 아주반트는 다양한 방식으로, 예를 들어, 에멀젼, 예컨대, 유중수(w/o) 에멀젼 또는 수중유(o/w) 에멀젼(예는 MF59, AS03), 안정적인 (나노-)에멀젼(SE), 지질 현탁액, 리포좀(중합체) 나노입자, 비로좀, 알룸 흡착된, 수성 제형(AF) 등으로 제형화될 수 있는데, 이들은 아주반트에서의 면역조절 분자 및/또는 면역원을 위한 다양한 전달 시스템을 나타낸다(예를 들어, 상기 문헌[Reed et al, 2013]; 문헌[Alving CR et al, 2012, curr Opin Immunol 24: 310-315] 참조).
면역자극 TLR4 효능제는 선택적으로 다른 면역조절 성분, 예컨대, 사포닌(예를 들어, QuilA, QS7, QS21, Matrix M, Iscoms, Iscomatrix 등), 알루미늄 염, 다른 TLR에 대한 활성화제(예를 들어, 이미다조퀴놀린, 플라젤린, CpG, dsRNA 유사체 등 참조) 등과 조합될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Reed et al, 2013] 참조).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지질 A"는 글루코사민을 포함하고 케토사이드 결합을 통해 LPS 분자의 내부 코어에서 케토-데옥시옥툴로소네이트에 연결된 LPS 분자의 소수성 지질 모이어티를 지칭하며, 이는 그람-음성 박테리아의 외부 막의 외부 리플렛에 LPS 분자를 고정한다. LPS 및 지질 A 구조의 합성의 개요에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Raetz, 1993, J. Bacteriology 175:5745-5753], 문헌[Raetz CR and C Whitfield, 2002, Annu Rev Biochem 71: 635-700]; US 5,593,969 및 US 5,191,072를 참조한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 지질 A는 자연 발생 지질 A, 혼합물, 유사체, 유도체 및 이의 전구체를 포함한다. 이 용어는 단당류, 예를 들어, 지질 X로 지칭되는 지질 A의 전구체; 이당류 지질 A; 헵타-아실 지질 A; 헥사-아실 지질 A; 펜타-아실 지질 A; 테트라-아실 지질 A, 예를 들어, 지질 IVA로 지칭되는 지질 A의 테트라-아실 전구체; 탈인산화된 지질 A; 모노포스포릴 지질 A; 다이포스포릴 지질 A, 예컨대, 에쉐리키아 콜라이 및 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 지질 A를 포함한다. 몇몇 면역 활성화 지질 A 구조는 6개의 아실 사슬을 함유한다. 글루코사민 당에 직접 부착된 4개의 1차 아실 사슬은 일반적으로 길이가 10 내지 16개의 탄소인 3-하이드록시 아실 사슬이다. 2개의 추가적인 아실 사슬이 종종 1차 아실 사슬의 3-하이드록시기에 부착된다. 예로서 E. coli 지질 A는 전형적으로 당에 부착된 4개의 C14 3-하이드록시 아실 사슬 및 각각 2' 및 3' 위치에서 1차 아실 사슬의 3-하이드록시기에 부착된 하나의 C12 및 하나의 C14를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지질 A 유사체 또는 유도체"는 지질 A의 구조 및 면역학적 활성과 유사하지만 본질적으로 자연적으로 발생하지는 않는 분자를 지칭한다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 위치 4'에서 포스페이트 대신에 갈락투론산 모이어티를 보유하기 위해서, 환원 단부에서 글루코사민-1-포스페이트 대신에 2-데옥시-2-아미노글루코네이트를 함유하기 위해서, 또 다른 아민 당 잔기, 예를 들어, 갈락토사민 잔기로 치환된 이의 글루코사민 잔기를 갖도록 변형, 예를 들어, 단축 또는 축합될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는, 예를 들어, 화학적 유도체화에 의해서 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조될 수 있거나, 예를 들어, 바람직한 지질 A 및 이의 합성 유사체 또는 유도체의 구조를 먼저 결정하고 이의 유사체 또는 유도체를 화학적으로 합성함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 또한 TLR4 효능제 아주반트로서 유용하다(예를 들어, 문헌[Gregg KA et al, 2017, MBio 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17] 참조). 예를 들어, 지질 A 유사체 또는 유도체는 예를 들어, 알칼리 처리에 의해 야생형 지질 A 분자의 탈아실화에 의해 얻어질 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체는 예를 들어, 박테리아로부터 단리된 지질 A로부터 제조될 수 있다. 이러한 분자는 또한 화학적으로 합성될 수 있다. 지질 A 유사체 또는 유도체의 또 다른 예는 지질 A 생합성 및/또는 지질 A 변형에 관여하는 효소의 돌연변이, 결실 또는 삽입을 보유하는 박테리아 세포로부터 단리된 지질 A 분자이다. MPL 및 3D-MPL은 지질 A 독성을 감쇠시키도록 변형된 지질 A 유사체 또는 유도체이다. 지질 A, MPL 및 3D-MPL은 긴 지방산 사슬이 부착되어 있는 당 골격을 갖고, 여기서 골격은 글리코사이드 연결부에 2개의 육탄당 및 4 위치에 포스포릴 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 5 내지 8개의 장쇄 지방산(일반적으로 12 내지 14개 탄소 원자)이 당 골격에 부착된다. 자연 공급원의 유도체화로 인해서, MPL 또는 3D-MPL은 다수의 지방산 치환 패턴, 예를 들어, 헵타-아실, 헥사-아실, 펜타-아실 등의 복합체 또는 혼합물로서 존재할 수 있으며, 지방산 길이가 다양하다. 이것은 또한 본 명세서에 기재된 다른 지질 A 유사체 또는 유도체의 일부에 대해서도 마찬가지이지만, 합성 지질 A 변이체는 또한 정의되어 있고, 균질할 수 있다. MPL 및 이의 제조는 예를 들어, US 4,436,727에 기재되어 있다. 3D-MPL은 예를 들어, US 4,912,094B1에 기재되어 있고, 위치 3에서 환원-단부 글루코사민에 연결된 에스테르인 3-하이드록시미리스트산 아실 잔기의 선택적 제거에 의해 MPL과 상이하다(예를 들어, US 4,912,094B1호의 컬럼 1의 MPL 대 컬럼 6에서 3D-MPL의 구조를 비교함). 당업계에서 종종 3D-MPL이 사용되지만, 때때로 MPL로서 지칭된다(예를 들어, 상기 문헌[Ireton GC 및 SG Reed, 2013]의 표 1의 첫 번째 구조는 이러한 구조를 MPL®로서 지칭하지만 실제로 3D-MPL의 구조를 실제로 도시한다). 본 발명에 따른 지질 A(유사체, 유도체)의 예는 MPL, 3D-MPL, RC529(예를 들어, EP1385541), PET-지질 A, GLA(글리코피라노실 지질 아주반트, 합성 이당류 당지질; 예를 들어, US20100310602, US8722064), SLA(예를 들어, 문헌[Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: e108 (doi: 10.1038/cti.2016.63)]), PHAD(인산화된 헥사아실 이당류; 이의 구조는 GLA의 구조와 동일함), 3D-PHAD, 3D-(6-아실)-PHAD(3D(6A)-PHAD)(PHAD, 3D-PHAD 및 3D(6A)PHAD는 합성 지질 A 변이체이며, 예를 들어, avantilipids.com/divisions/adjuvants 참조하고, 이것은 이들 분자의 구조를 또한 제공함), E6020(CAS 번호 287180-63-6), ONO4007, OM-174 등을 포함한다. 3D-MPL, RC529, PET-lipid A, GLA/PHAD, E6020, ONO4007 및 OM-174의 예시적인 화학 구조에 대해서는, 예를 들어, 상기 문헌[Ireton GC and SG Reed, 2013]의 표 1을 참조한다. SLA의 구조에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Reed SG et al, 2016, Curr Opin Immunol 41: 85-90]의 도 1을 참조한다. 특정 바람직한 실시형태에서, TLR4 효능제 아주반트는 3D-MPL, gLA, 또는 SLA로부터 선택된 지질 A 유사체 또는 유도체를 포함한다.
지질 A 유사체 또는 유도체를 포함하는 예시적인 아주반트는 GLA-LSQ(합성 MPL[GLA], QS21, 리포좀으로서 제형화된 지질), SLA-LSQ(합성 MPL[SLA], qS21, 지질, 리포좀으로서 제형화됨), GLA-SE(합성 MPL[GLA], 스쿠알렌 오일/물 에멀젼), SLA-SE(합성 MPL[SLA], 스쿠알렌 오일/물 에멀젼), SLA-나노알룸(합성 MPL[SLA], 알루미늄 염), GLA-나노알룸(합성 MPL[GLA], 알루미늄 염), SLA-AF(합성 MPL[SLA], 수성 현탁액), GLA-AF(합성 MPL[GLA], 수성 현탁액), SLA-알룸(합성 MPL[SLA], 알루미늄 염), GLA-알룸(합성 MPL[GLA], 알루미늄 염) 및 AS01 (MPL, QS21, 리포좀), AS02(MPL, QS21, 오일/물 에멀젼), AS25(MPL, 오일/물 에멀젼), AS04(MPL, 알루미늄 염) 및 AS15(MPL, QS21, CpG, 리포좀)을 비롯한 몇몇 GSK ASxx 시리즈의 아주반트를 포함한다. 예를 들어, WO 2013/119856, WO 2006/116423, US 4,987,237, U.S. 4,436,727, US 4,877,611, US 4,866,034, US 4,912,094, US 4,987,237, US5191072, US5593969, US 6,759,241, US 9,017,698, US 9,149,521, US 9,149,522, US 9,415,097, US 9,415,101, US 9,504,743, 상기 문헌[Reed G, et al., 2013], 문헌[Johnson et al., 1999, J Med Chem, 42:4640-4649] 및 문헌[Ulrich and Myers, 1995, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell and Newman, Eds.; Plenum: New York, 495-524] 참조.
비-당지질 분자가 또한 TLR4 효능제 아주반트, 예를 들어, 합성 분자, 예컨대, 네오셉틴-3 또는 자연 분자, 예컨대, LeIF로서 사용될 수 있고, 예를 들어, 상기 문헌[Reed SG et al, 2016]을 참조한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드, FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 엔테로박테리아세아 패밀리의 그람 음성 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 의약으로서의, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원" 또는 "면역원성" 또는 "항원"은 수용자에게 단독으로, 아주반트와 함께 또는 디스플레이 비히클에 제시되어 투여 시에 그 자체에 대한 면역학적 반응을 유도할 수 있는 분자를 기술하기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항원 또는 조성물에 대한 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 대상체에서 항원 또는 조성물에 존재하는 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발달을 지칭한다.
추가 양태에서, 본 발명은 엔테로박테리아세아 패밀리의 그람 음성 박테리아에 의해서 야기되는 박테리아 감염에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 박테리아 감염은 클레브시엘라 종, 또는 E. coli에 의해서 야기된다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아 감염은 E. coli에 의해서 야기된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 E. coli 또는 클레브시엘라, 바람직하게는, E. coli에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 의약으로서의, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
바람직한 실시형태에서, 엔테로박테리아세아 패밀리의 그람-음성 박테리아에 의해서 야기되는 박테리아 감염은 E. coli, ExPEC에 의한 감염이고, 예를 들어, 감염은 요로 감염(UTI)일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 UTI와 관련된 증상 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 억제하는 데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 UTI는 rUTI이다. E. coli는 젊은 여성 및 늙은 성인에서 중요한 건강 관리 문제인 UTI 및 rUTI의 주요 원인적 작용제 중 하나이다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 박테리아 감염은 E. coli에 의해서 야기되는 UTI 또는 rUTI이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 엔테로바실러스-관련 병태와 관련된 증상 및/또는 후유증의 치료, 예방 또는 억제를 필요로 하는 대상체에서 엔테로바실러스-관련 병태와 관련된 증상 및/또는 후유증을 치료, 예방 또는 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 투여는 엔테로바실러스-관련 병태를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 면역 반응을 유도한다. 바람직하게는, 엔테로바실러스-관련 병태는 비뇨생식기 감염, 더 구체적으로는 UTI 또는 rUTI이다.
본 발명은 또한 엔테로박테리아세아 패밀리의 그람 음성 박테리아, 바람직하게는 E. coli에 의해서 야기되는 박테리아 감염에 의해서 야기되는 박테리아 감염을 치료, 예방 또는 억제하기 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드, 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FmiH (F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 박테리아 감염은 E. coli에 의해서 야기되는 UTI 또는 재발성 UTI(rUTI)이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩타이드의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 함유하는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 배양은 폴리펩타이드의 생산에 도움이 되는 조건 하에서 일어난다.
특정 실시형태에서, 본 방법은 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 추가로 포함하며, 그 다음에 선택적으로 약제학적 조성물로의 제형화가 이어진다.
바람직하게는, E. coli 세포, 예를 들어, E. coli BL21 유도체, 세포는 본 발명의 FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut) 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 사용된다.
폴리펩타이드의 회수는 바람직하게는 당업계에 널리 알려진 통상적인 단백질 정제 방법을 사용하여 수행될 수 있는 정제 및/또는 단리 단계를 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및/또는 렉틴 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
이러한 정제 및/또는 단리를 위한 전형적인 예는 단백질에 대한 항체 또는 단백질 구조의 일부로서 발현하는 His 태그 또는 절단 가능한 리더 또는 테일로 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 His-태그가 포함되고, IMAC 친화도 정제와 같은 방법에 의해 정제된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 His-태그를 포함하지 않으며, 이러한 경우에, 정제는 크로마토그래피, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HiC) 및/또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
정의
다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는, 그 내용들 중 임의의 것 또는 모든 것이, 개시되거나 청구된 그 어떠한 본 발명과 관련해서 종래 기술의 일부를 형성하는 것이라고, 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 언급된 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태(부정 관사 및 정관사)는, 문맥이 명확하게 달리 나타내지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
본 설명 및 후술되는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지는 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "구비하는"으로 치환될 수 있거나, 경우에 따라서는 본 명세서에 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "~로 이루어진"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 구성성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용될 때, "~로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 양태 또는 실시형태와 관련하여 본 명세서에 사용되는 모든 경우에, 임의의 전술한 용어 "포함하는", "함유하는", "구비하는" 및 "갖는"은 본 발명의 범주를 변동시키기 위해 용어 "~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 선택지 및 조합된 선택지 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 제1 선택지는 제2 요소 없이 제1 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 제2 선택지는 제1 요소 없이 제2 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 제3 선택지는 함께 제1 요소와 제2 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 이들 선택지 중 어느 것이든 하나는 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 선택지 중 하나 초과한 것의 동시 적용 가능성 또한 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 본 발명에 따른 조성물의 유효성 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비독성 물질을 지칭한다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 소포, 미소구체, 리포좀 캡슐화, 또는 약제학적 제형에 사용하기 위한 당업계에 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 특성은 특정 응용을 위한 투여 경로에 좌우될 것임이 이해될 것이다. 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용을 고려하여, 백신에 사용하기에 적합한 임의의 약제학적으로 허용 가능한 담체가 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 멸균수, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합뿐만 아니라 안정화제, 예를 들어, Human Serum Albumin(HSA) 또는 다른 적합한 단백질 및 환원당을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 대상체에서 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하는 활성 성분 또는 성분의 양을 지칭한다. 유효량은 언급된 목적에 관하여 경험적으로 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 최적의 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 시험관내 검정이 임의로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 실시형태에 따른 방법 또는 조성물에 의해 백신접종될 것이거나 백신접종된 적이 있는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포괄한다. 포유동물의 예는 암소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간, 등, 가장 바람직하게는 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간 성인이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 성인"은 18세 이상인 인간을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 18세 미만, 예를 들어, 0 내지 18세, 예를 들어, 9세 내지 18세, 또는 12세 내지 18세이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 약 18 내지 약 50세의 인간 대상체이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 약 50 내지 약 100세, 예를 들어, 50 내지 85세, 60 내지 80세, 50세 이상, 55세 이상, 60세 이상, 65세 이상, 70세 이상, 75세 이상, 80세 이상, 85세 이상의 인간이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 대상체는 85세 이하, 80세 이하, 75세 이하이다. 특정 실시형태에서, 인간 대상체는 남성이다. 특정 실시형태에서, 인간 대상체는 여성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "UTI"는 신장, 방광, 요관 또는 요도의 감염을 의미한다. UTI의 증상은 배뇨 시 급박한 느낌, 배뇨에 대한 빈번하거나 상당한 긴급성, 불완전한 방광 비움, 비정상적인 외관 및/또는 냄새를 갖는 소변, 소변 중의 상승된 백혈구, 피곤하거나 불안한 감정, 방향 감각 상실, 발열 또는 오한, 불쾌감, 등, 하복부, 골반 또는 방광의 통증 또는 압박감 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 그러나, 일부 환자에서, 증상은 존재하지 않거나 비특이적일 수 있다. UTI의 후유증은 침습적 질환 및 패혈증과 같은 전신 합병증을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, UTI는 임상적으로 그리고/또는 미세생물학적으로 문헌화되어 있으며, 예를 들어, 소변 및/또는 분자 또는 다른 방법의 박테리아 배양으로 확인된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 이전에 UTI를 가졌거나 현재 갖는 인간 대상체이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 마지막 2년, 마지막 1년, 또는 마지막 6개월 내에 UTI를 가졌다. 특정 실시형태에서, 대상체는 재발성 UTI(rUTI)를 가진 적이 있거나 현재 갖고 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "rUTI" 는 6개월 동안 적어도 2회의 감염 또는 1년 동안 적어도 3회의 UTI를 의미한다. 특정 실시형태에서, FimH(F71mut) 또는 FimH(F71mut/F144mut), 본 발명의 FimCH 복합체, 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 본 발명의 조성물이 투여되는 대상체는 마지막 2년 내에, 마지막 해, 또는 마지막 6개월 내에 적어도 2회의 UTI를 앓은 적이 있다. 특정 실시형태에서, 대상체는 복합 UTI를 앓은 적이 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "복합 UTI"는 병태와 연관된 UTI, 예컨대, 비뇨생식관의 구조적 또는 기능적 이상 또는 근본적인 질환의 존재를 의미한다. 특정 실시형태에서, UTI는 소변 또는 다른 소변 이상에서 백혈구 세포의 증가된 수로 이어진다. 특정 실시형태에서, UTI를 갖는 대상체는 소변 중에 다수의 박테리아를 가지며, 즉, 소변은 멸균성이 아니며, 예를 들어, 적어도 약 10개 세포/mL, 적어도 약 100개의 세포/mL, 적어도 약 103개 세포/mL, 예를 들어 적어도 약 104개 세포/mL, 예를 들어, 적어도 약 105개 세포/mL의 박테리아 세포 수치를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항원 또는 조성물에 대한 "면역학적 반응" 또는 "면역 반응"은 체액성 대상체 및/또는 조성물에 존재하는 항원 또는 항원에 대한 세포 면역 반응의 발생을 지칭한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 그 일련의 것들에 안의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
수치 값(예컨대, 약 10)과 관련하여 사용되는 경우 용어 "약" 또는 "대략"은 바람직하게는 그 값이 (10의) 그 값의 ± 10%, 바람직하게는 ± 5%의 주어진 값일 수 있음을 의미한다.
용어 "상동성", "서열 동일성" 등은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 서열 동일성은 본 명세서에서 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이 2개 이상의 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열 사이의 관계로서 정의된다. 당업계에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서, 이러한 서열의 스트링들 사이의 매치에 의해 결정되는 바와 같은, 아미노산 또는 핵산 서열들 사이의 서열 관계성을 의미한다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 이의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 두 서열의 길이에 따라, 전체 또는 국부적 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 펩타이드 또는 2개의 뉴클레오타이드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 서열을 전체 길이에 걸쳐 최적으로 정렬시키는 글로벌 정렬 알고리즘(예컨대, Needleman Wunsch)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국부적 정렬 알고리즘(예컨대, Smith Waterman)을 사용하여 정렬된다. 이어서, (예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되는 경우) 이들이 (하기에 정의된 바와 같은) 적어도 특정 최소 백분율의 서열 동일성을 공유할 때 서열들은 "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한"으로 지칭될 수 있다. GAP는 Needleman 및 Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 서열을 그의 전체 길이(전장)에 걸쳐 정렬시키고, 매치의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화한다. 두 서열이 유사한 길이를 갖는 경우 서열 동일성을 결정하기 위해 글로벌 정렬이 적합하게 사용된다. 일반적으로, 갭 생성 페널티 = 50(뉴클레오타이드)/8 (단백질) 및 갭 연장 페널티 = 3(뉴클레오타이드)/2(단백질)과 함께, 갭 디폴트 파라미터가 사용된다. 뉴클레오타이드의 경우 사용된 디폴트 스코어링 매트릭스는, nwsgapdna이고, 단백질의 경우 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919)이다. 서열 정렬 및 백분율 서열 동일성에 대한 점수는, 상기 GAP에 대한 것과 동일한 파라미터를 사용하거나 또는 디폴트 설정을 사용하는 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 미국 캘리포니아주 92121-3752 샌디에이고주 9685 스크레인톤 로드 소재의 Accelrys Inc.로부터 입수 가능한 GCG Wisconsin Package, Version 10.3을 사용하여 또는 오픈 소스 소프트웨어, 예컨대, EmbossWIN version 2.10.0의 프로그램 "needle"(글로벌 Needleman Wunsch 알고리즘 사용) 또는 "water"(로컬 Smith Waterman 알고리즘)를 사용하여 결정될 수 있다('needle' 및 'water'의 경우 둘 다 및 단백질 및 DNA 정렬의 경우 둘 다, 디폴트 Gap 오프닝 패널티는 10.0이고, 디폴트 갭 연장 패널티는 0.5이고; 디폴트 스코어링 매트릭스는 단백질의 경우 Blosum62이고, DNA의 경우 DNAFull이다). 서열이 실질적으로 상이한 전체 길이를 갖는 경우, Smith Waterman 알고리즘을 사용하는 것과 같은 로컬 정렬이 바람직하다.
대안적으로, FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여 공개 데이터베이스를 검색함으로써 백분율 유사성 또는 동일성이 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어, 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색을 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행하여 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색을 BLASTx 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]에 기재된 바와 같은 Gapped BLAST를 활용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTx 및 BLASTn)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 미국 국립생물공학정보센터 홈페이지http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/를 참조한다.
서열의 설명
[표 1]
FimH 폴리펩타이드에 대한 서열의 다른 예는 US6,737,063, 예를 들어, 상기 특허의 서열번호 23 내지 45 또는 서열번호 55 중 어느 하나에 기재되어 있고, 이들 모두는 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
실시예
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 결정됨이 이해되어야 한다.
백신 효능의 FimH 입체형태 변화의 영향을 이해하기 위해서, 저친화도 상태로 단백질을 잠재적으로 잠금할 수 있는 상이한 돌연변이를 함유하는 FimH의 몇몇 변이체를 설계하여, 방광의 박테리아 부착 및 콜로니화를 감소시킬 수 있는 기능적 항체를 유도하는 개선된 FimH 변이체를 확인하는 것을 목표로 하였다. 적합한 FimH 렉틴 도메인 변이체를 찾는 기회를 최적화하기 위해서, 상이한 예측된 작용 모드를 갖는 변이체를 선택하였다. 이전에 기재된 돌연변이체 FimH_Q133K 및 FimH_R60P뿐만 아니라 야생형(WT) FimH를 대조군으로서 취하였다.
실시예 1: 저해 항체를 유도하는 능력
저친화도 입체형태의 FimH에 대해 생성된 항체는 방광에서 박테리아 세포를 차단하고 콜로니 형성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 제1 단계로서, 본 발명자들은 부착 저해 검정(adhesion inhibition assay: AIA)을 사용함으로써 저친화도 입체형태로 잠긴 FimH의 상이한 변이체에 의해 유도된 항체의 기능성을 평가하였다.
물질 및 방법
FimH 설계 및 발현
FimC 및 FimH를 주변세포질에서의 발현을 위해 이종 신호 서열을 사용하여 그리고 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)를 사용한 친화도 정제를 위해 FimC 상의 C-말단 His-태그를 사용하여 pET-DUET 또는 pET-22b 벡터에서 발현시켰다. IPTG를 사용하여 발현을 유도하고, 단백질을 추출하고 IMAC 정제(Talon)를 사용하여 정제하였다.
면역화
Wistar 래트에게 비-프로인트 아주반트(Speedy 래트 28일 모델, Eurogentec)와 조합된 상이한 FimH 변이체(60 μg의 각각의 변이체/용량)를 제0일, 제7일, 제10일 및 제18일에 4회 근육내 (i. m.) 면역화를 제공하였다. 하기에 기재된 바와 같은 부착 저해 검정(AIA)에 의해 제0일(면역화 전) 및 제28일(면역화 후)에 혈청 항체의 기능성을 조사하였다.
부착 저해 검정(AIA)
박테리아(E. coli 균주 J96)를 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지하였다. 표지된 박테리아를 37℃에서 1시간 동안 방광 요로상피 세포(5637 세포주)와 함께 인큐베이션하였다. 부착 박테리아의 %를 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 혈청 저해의 평가를 위해, 박테리아를 혈청 샘플과 함께 37℃에서 30분 동안 미리 인큐베이션하고, 이어서 5637 세포와 혼합하였다.
ELISA
96-웰 플레이트를 1 ug/mL의 FimH로 밤새 코팅하였다. 세척 후, 코팅된 웰을 차단 완충액[포스페이트 완충 식염수(PBS) + 2% 소 혈청 알부민(BSA)]과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS + 0.05% Tween 20으로 세척한 후, 혈청을 플레이트에 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 2% BSA를 함유한 PBS에서 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-래트 항체를 실온에서 1시간 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 최종 세척 후, 반응물을 테트라메틸벤지딘 기질로 현상시켰다. 반응을 1 M 인산으로 중단하고, 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
결과
혈청 항체 저해 역가를 4-매개변수 로지스틱(4PL) 회귀 모델에 기초하여 절반 최대 저해 농도(IC50)로서 계산하였다. 또한, 상이한 FimH 변이체에 의해 유도된 혈청 항체의 수준(총 IgG)을 ELISA에 의해 평가하였다. 절반 최대 유효 농도로 정의된 IC50 역가를 4PL 비선형 회귀 모델로 분석된 중복 6-단계 적정 곡선에 기초하여 계산하였다.
예비 실험에서, 몇몇 상이한 FimH 변이체를 저해 항체를 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 변이체 FimH(F71Y), FimH(F144V)는 가장 높은 수준의 기능성 항체를 유도하였다. FimH(F144V) 변이체는 본 명세서에 참조로 포함된, 2020년 1월 16일에 Janssen Pharmaceuticals, Inc의 명의로 출원된 유럽 특허 출원 제20152217호에 이전에 기재되었다. 그러나, 본 발명에 앞서, FimH(F71Y) 가 유사하게 높은 수준의 저해성 항체를 유도할 것이라는 것은 놀라운 것이고 완전히 예측 불가능하였다.
예비 결과를 확인하기 위해, AIA 검정을 더 많은 수의 동물로 반복하였고, 본 실험에서 FimH(F71Y) 및 FimH(F144V) 둘 모두가 신뢰성 있게 높은 수준의 저해 항체를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다(도 1b).
FimH(F71Y) 및 FimH(F144V) 변이체는 결합 포켓의 입체형태적 변화를 유도하는 상이한 기전에 의해 저친화도 입체형태로 잠금되는 것으로 보인다. FimH(F71Y) 변이체에서의 치환은 잔기가 소수성 포켓(이완 상태)으로 접히는 것을 방지하여, 긴장성 상태를 더 유리하게 만드는 반면, FimH(F144V) 변이체에서, 치환은 저친화도 입체형태를 안정화시키는 만노스 결합 포켓에 비교적 가깝게 위치된다. 저친화도 상태에 대한 입체형태 변화가 이러한 2개의 별개의 기전에 의해 야기되기 때문에, 본 발명자들은 F71Y 및 F144V 치환 둘 모두를 포함하는 렉틴 도메인이 그 부류의 FimH 변이체에 추가의 이점을 제공하는 저친화도 입체형태로 훨씬 더 안정적으로 잠금될 수 있다고 가정하였다. 이 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 F71Y 및 F144V 치환 둘 모두를 포함하는 FimH 이중 돌연변이체(FimH(F71Y/F144V)를 생성하였다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, FimH(F71Y/F144V)는 높은 수준의 저해성 항체를 유도할 수 있었다.
이들 결과에 기초하여, FimH(F71Y) 및 FimH(F71Y/F144V)를 리드 후보로서 선택하였다. 이들의 특성을 하기에 기재된 바와 같이 추가로 분석하였다.
실시예 2 : 신규한 변이체 설계-SPR 데이터
SPR
FimH 렉틴 도메인 변이체와 n-헵틸-α-D-만노피라노사이드 리간드의 상호작용의 결합 친화도 및 동역학적 특성에 대한 상세한 통찰력을 얻기 위해, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 측정을 수행하였다. 간략하면, FimH 변이체를 HBS-N(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20) 중의 3 또는 10 μM의 최고 농도를 사용하여 만노사이드 리간드 5 표면내로 적정하였다(문헌[Rabbani S et al, j Biol. Chem., 2018, 293(5):1835-1849]). 단백질을 단일 사이클 동역학 주사를 사용하여 0.12 내지 10 μM 또는 0.036 내지 3.0 μM로 주사하였다.
결과
상기에 기재된 돌연변이체 FimH_Q133K 및 FimH_R60P는 결합 포켓 내의 만노스 상호작용 잔기에 돌연변이를 갖는다. 이들 돌연변이는 만노스와의 결합 상호작용에 직접 영향을 미치는 것으로 예측된다. 이들 돌연변이체를 양성 대조군으로서 취하였다. 이중 돌연변이 R60P_Q133K를 취하여 잠재적으로 향상된 효과를 확인하였다. 추가로, 야생형(WT) FimH 렉틴 도메인을 음성 대조군으로서 취하였다.
만노스에 대한 결합에 대한 변이체 친화도를 SPR을 사용하여 평가하였다. 상세한 결과를 표 2에 제시한다. 예상된 바와 같이, FimH의 만노사이드 결합 포켓에 돌연변이(Q133K 및 R60P_Q133K)를 갖는 렉틴 도메인 변이체는 결국 만노사이드에 결합하지 않았다. R60P 돌연변이체는 예상된 바와 같이 만노사이드에 대해 낮은 친화도를 나타냈다.
높은 수준의 저해성 항체를 유도할 수 있음에도 불구하고, F71Y 치환을 포함하는 변이체는 만노사이드에 대해 약간의 친화도를 여전히 나타내었는데, 이는 이러한 돌연변이체가 만노사이드에 대한 결합을 완전히 제거하지 않았음을 나타낸다. F144V 치환을 포함하는 FimH 렉틴 도메인 변이체에서, 만노사이드에 대한 결합은 (본 명세서에 참조에 의해 포함된, janssen Pharmaceuticals, Inc.의 명의로 2020년 1월 16일에 출원된, 유럽 특허 출원 제20152217호에서 단일 F144V 돌연변이체에 대해 이전에 개시된 바와 같이) 완전히 제거되었다. F71Y 및 F144V 둘 모두를 포함하는 돌연변이체에서, 만노사이드에 대한 결합이 또한 완전히 제거되었다.
[표 2]
실시예 3 : 특징규명된 저해성 mAb 475 및 926에 결합하는 능력
FimH의 렉틴 도메인에서의 돌연변이는 FimH의 결합 포켓에 존재하는 에피토프와 같은 강력하고 기능적인 면역 반응을 유도하는 데 중요한 에피토프의 손실을 야기할 수 있다. 결합 포켓의 온전성이 본 명세서에 기재된 돌연변이에 의해 손상되지 않았음을 보장하기 위해, 돌연변이체 FimH 렉틴 도메인에 대한 단클론성 항체(mAb) mAb475 및 mAb926의 결합을 평가하였다. mAb475 및 mAb926은 FimH의 만노스-결합 포켓 내의 FimH 렉틴 도메인상의 중첩하지만 별개의 에피토프를 인식한다(문헌[Kisiela et al. 2013 & 2015]).
결과
돌연변이된 FimH 렉틴 도메인은 WO02102974호 이미 기재되어 있다. WO02102974는 대부분 명시되지 않은 돌연변이의 가능한 돌연변이의 광범위한 목록을 기재한다(65개의 가능한 돌연변이 부위가 대략 159개 아미노산 길이인 FimH의 렉틴 도메인에서 제안됨). 그러나, WO02102974는 위치 54, 133 또는 135에서 아미노산 치환을 갖는 FimH 렉틴 도메인이 가장 유망한 후보이고, FimH_Q133K가 매우 바람직한 옵션으로서 명시적으로 언급됨을 나타낸다. 따라서, FimH-23-10_Q133K가 기능성 mAb475에 의해 인식되지 않았다는 것이 매우 놀라웠으며, 이는 결합 포켓의 온전성 문제를 나타낸다(표 3). 대조적으로, FimH(F71Y) 및 FimH(F144V) 둘 모두는 mAb475 및 mAb926 둘 모두에 의해 인식되었는데, 이는 결합 포켓이 완전히 온전하게 유지됨을 나타낸다(표 3). 또한 FimH(F71Y/F144V) 이중 돌연변이체는 두 항체 모두에 의해 여전히 인식되었는데, 이는 결합 포켓이 또한 이러한 이중 돌연변이체에서 온전하게 유지됨을 나타낸다(표 3).
[표 3]
실시예 4 : NMR에 의한 FimH 렉틴 도메인 변이체의 입체형태 상태 분석
성장 배지에 15N을 첨가하여 본 방법 섹션에 기재된 바와 같이 생성된 균일하게15N-표지된 FimHLD 변이체의 1H,15N 이종핵 단일 양자 간섭성 핵 자기 공명(heteronuclear single quantum coherence nuclear magnetic resonance: HSQC NMR) 스펙트럼을 n-헵틸-α-D-만노피라노사이드 리간드의 부재 및 존재 하에서 측정하여 잔기-기반 수준에 대한 구조적 차이를 평가하였다. 단백질을 150 μM로 농축하고, 7% 내지10% D2O를 포함하는 20 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4에서 측정하였다. n-헵틸-α-D-만노피라노사이드 리간드를 D2O에 용해시키고, 10배 몰 과량까지 단백질에 단계적으로 첨가하였다. 각각의 샘플의 스펙트럼을 공개적으로 입수 가능한 참조 스펙트럼과 비교하였다(문헌[Rabbani S et al, j Biol. Chem., 2018, 293(5):1835-1849]).
결과
FimH 변이체 FimH(F71Y), FimH(F144V) 및 FimH(F71Y/F144V)를 만노사이드 리간드의 존재 하에서 저친화도 입체형태로 유지되는 능력에 대해 분석하였다. 리간드의 부재 하에서, 모든 3개의 변이체는 고친화도 상태를 나타내는 것으로 알려진 잔기의 화학적 이동과 비교할 때 저친화도 입체형태로 존재한다(문헌[Rabbani S et al, j Biol. Chem., 2018, 293(5):1835-1849]). 대조적으로, FimHLD 23-10 야생형은 만노사이드 리간드의 부재 하에서 고친화도 입체형태로 잠금된다. 그러나, 리간드의 존재 하에서, FimH(F71Y) 및 FimH(F144V)는 고친화도 입체형태로 전환되지만, FimH(F71Y/F144V)는 저친화도 입체형태로 유지되며, 예를 들어, FimH(F71Y/F144V)에 리간드를 첨가한 후에 화학적 이동이 관찰되지 않는다(도 2 및 표 4).
[표 4]
K12 야생형과 상이한 2개의 알려지지 않은 잔기를 제외하고는, FimHLD 23-10 야생형은 리간드의 부재 하에서 고친화도(H) 입체형태로 이미 존재하는 것으로 간주된다. 단일 돌연변이체 변이체 F71Y 및 F144V는 리간드의 부재 하에서 저친화도 (L) 입체형태로 존재하고, 리간드의 존재 하에 H 입체형태로 전환되는 반면, 이중 돌연변이체 변이체 F71Y/F144V는 리간드의 존재 하에서도 L 입체형태로 유지되었다. 이러한 고친화도 입체형태로 재전환될 수 없다는 것은 FimH(F71Y/F144V)를 백신의 약제학적 조성물에 사용하기에 특히 매력적이게 하는데, 그 이유는 예를 들어, 입체형태가 저장 동안 또는 다른 저장 조건 하에서 안정한지의 여부를 시험하기 위한 추가적인 품질 또는 안정성 제어가 필요하지 않다는 것을 보장하기 때문이다. 추가로, 고친화도 입체형태로 재전환될 수 없다는 것은 작용 기전을 연구하거나 입체형태 지식을 얻기 위해 연구 도구로서 FimH(F71Y/F144V)를 사용할 수 있게 하고, 이는 FimH(F71Y/F144V)가 유용한 연구, 진단 및 가능하게는 약제학적 응용을 갖는 특정 항체를 생성하는 데 사용될 수 있게 한다.
따라서, 결론적으로, 모든 시험된 FimH 변이체 중, FimH(F71Y), FimH(F144V), 및 FimH(F71Y/F144V)는 FimH의 결합 포켓을 유지하면서 가장 높은 수준의 기능성 저해성 항체를 유도할 수 있다. FimH(F71Y/F144V)는 만노사이드에 대한 결합을 완전히 제거하고 리간드의 존재 하에서도 저친화도 입체형태로 잠긴 상태로 유지되는 추가 이점을 갖는다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceuticals, Inc. <120> FimH mutant, compositions therewith and use thereof. <130> CRU6050 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimHLD 23-10 <400> 1 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimHt <400> 2 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160 Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 165 170 175 Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 180 185 190 Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 195 200 205 Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 210 215 220 Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 225 230 235 240 Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 245 250 255 Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 260 265 270 Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 275 <210> 3 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimC <400> 3 Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro Ala Gly Gln Lys 1 5 10 15 Gln Val Gln Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn Ser Thr Tyr Leu 20 25 30 Ile Gln Ser Trp Val Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys Asp Gly Arg Phe 35 40 45 Ile Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Met Lys Gly Lys Lys Glu Asn Thr 50 55 60 Leu Arg Ile Leu Asp Ala Thr Asn Asn Gln Leu Pro Gln Asp Arg Glu 65 70 75 80 Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala Ile Pro Ser Met Asp Lys Ser 85 90 95 Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gln Leu Ala Ile Ile Ser Arg Ile Lys 100 105 110 Leu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro Asp Gln Ala Ala 115 120 125 Glu Lys Leu Arg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu Thr Leu Ile Asn 130 135 140 Pro Thr Pro Tyr Tyr Leu Thr Val Thr Glu Leu Asn Ala Gly Ala Arg 145 150 155 160 Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro Pro Met Gly Glu Ser Thr Val Lys 165 170 175 Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn Ile Thr Tyr Arg Thr Ile Asn Asp 180 185 190 Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met Glu 195 200 205 <210> 4 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Example of FimH 23-10 <400> 4 Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 1 5 10 15 Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile 20 25 30 Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala 35 40 45 Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe 50 55 60 Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80 Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val 85 90 95 Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro 100 105 110 Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu 115 120 125 Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly 130 135 140 Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser 145 150 155 160 Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val 165 170 175 Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr 180 185 190 Leu Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys 195 200 205 Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp 210 215 220 Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln 225 230 235 240 Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn 245 250 255 Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly 260 265 270 Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn 275 280 285 Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 290 295 300 <210> 5 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 2 of US 6,500,434 - FimH <400> 5 Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 1 5 10 15 Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile 20 25 30 Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val 35 40 45 Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe 50 55 60 Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80 Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val 85 90 95 Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro 100 105 110 Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu 115 120 125 Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly 130 135 140 Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser 145 150 155 160 Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val 165 170 175 Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr 180 185 190 Leu Pro Asp Tyr Arg Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys 195 200 205 Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp 210 215 220 Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln 225 230 235 240 Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn 245 250 255 Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly 260 265 270 Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn 275 280 285 Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Thr Gln 290 295 300 <210> 6 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimH sequence with truncation at N-terminus <400> 6 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Leu Val Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160 Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Arg 165 170 175 Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 180 185 190 Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 195 200 205 Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 210 215 220 Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Thr Asn Asn Thr Val Ser Leu 225 230 235 240 Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 245 250 255 Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 260 265 270 Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln 275 <210> 7 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FimHLD <400> 7 Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 20 25 30 Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45 Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60 Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95 Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110 Ser Ser Ala Gly Gly Leu Val Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125 Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140 Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 위치 71에 상응하는 위치에 티로신(Y) 또는 트립토판(W)을 포함하는 FimH 렉틴 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FimH 렉틴 도메인은 서열번호 1의 위치 71에 상응하는 위치에 티로신(Y)을 포함하는, 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 위치 144에 상응하는 위치에 페닐알라닌(F) 이외의 아미노산을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 위치 144에 상응하는 위치에서 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 글리신(G), 메티오닌(M), 및 알라닌(A)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는, 폴리펩타이드.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 FimH 렉틴 도메인은 서열번호 1의 위치 144에 상응하는 위치에 발린(V)을 포함하는, 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FimH 렉틴 도메인은 서열번호 1과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 바람직하게는 상기 FimH 렉틴 도메인은 서열번호 1을 포함하고, 상기 위치 71의 페닐알라닌 잔기는 티로신에 의해 치환된, 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 FimH 렉틴 도메인은 서열번호 1을 포함하고, 상기 위치 71의 페닐알라닌 잔기는 티로신에 의해 치환되고, 상기 위치 144의 페닐알라닌 잔기는 발린에 의해 치환된, 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 FimH 선모(pilin) 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 전장 FimH이고, 바람직하게는 상기 FimH 렉틴 도메인은 서열번호 2를 포함하고, 상기 위치 71의 페닐알라닌 잔기는 티로신에 의해 치환되고, 더 바람직하게는 상기 FimH 렉틴 도메인은 서열번호 2를 포함하고, 상기 위치 71의 페닐알라닌 잔기는 티로신에 의해 치환되고, 상기 위치 144의 페닐알라닌 잔기는 발린에 의해 치환된, 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 벡터.
  12. 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제11항에 따른 벡터를 포함하는, 재조합 숙주 세포.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제11항에 따른 벡터를 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae) 패밀리의 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제11항에 따른 벡터 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물로서, 바람직하게는 상기 박테리아는 E. coli 또는 클레브시엘라(Klebsiella), 바람직하게는 E. coli인, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 약제학적 조성물.
  15. 대상체에서 E. coli에 의해서 야기되는 요관 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제10항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제11항에 따른 벡터 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물.
  16. FimH 렉틴 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 제10항의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제11항의 벡터를 함유하는 재조합 세포로부터 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하며, 선택적으로 폴리펩타이드를 회수 및 정제하는 단계 및 그 다음 선택적으로 상기 폴리펩타이드를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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