KR20230125806A - 선천성 근이영양증의 치료를 위한 치료용 lama2 페이로드 - Google Patents

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마스미타 마리아 팔라레스
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우니베르시타트 폼페우 파브라
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Abstract

본 발명은, a) 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질산 서열; 또는 상기 제1 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; b) 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질; 또는 상기 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 및 c) 라미닌-α2 단백질, 또는 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 선천성 근이영양증의 치료를 위해, LAMA2 트랜스진을 세포의 게놈 내의 특이적 부위로 통합하기 위한 이러한 조성물의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

선천성 근이영양증의 치료를 위한 치료용 LAMA2 페이로드
본 발명은 LAMA2 트랜스진(transgene)을 세포의 게놈 내의 특이적 부위로 통합하기 위해 트랜스포사제(transposase) 및 LAMA2 트랜스진에 융합된 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 특히 선천성 근이영양증(congenital muscular dystrophy)의 치료를 위한 이의 치료적 용도에 관한 것이다.
선천성 근이영양증 (CMD)은 골격/심장 근육뿐만 아니라 중추 신경계에 영향을 미치는 중증 조기-발병 근이영양증(severe early-onset muscular dystrophy)의 부류이다.
CMD 중에서, 메로신-결핍 선천성 이영양증 1A형(merosin-deficient congenital dystrophy type 1A) (MDC1A)으로도 공지된 라미닌-α2 쇄-결핍 선천성 근이영양증(laminin-α2 chain-deficient co-genital muscular dystrophy) (LAMA2 MD)은 중증 저긴장증(severe hypotonia), 근육 쇠약(muscle weakness), 골격 기형(skeletal deformity), 보행 불가(non-ambulation), 호흡 부전(respiratory insufficiency)을 특징으로 한다. 유사한 증상을 나타내지만 더 야생형의 표현형 가변성을 가진, 나중에 발병하는 더 경증 형태의 질환이 있다.
현재 MDC1A에 이용가능한 어떤 치유법(cure)도 없다. 클리닉에서의 현재 전략은 관리 (급식 보충(feeding supplementation), 호흡 부전에 대한 비침습적 인공호흡 지원(non-invasive ventilation support), 및 관절 구축(joint contracture), 척추 결함(spinal defect), 및 기타 문제에 대한 물리 요법(therapy))에 초점을 맞추고 있다 (Nguyen et　al., 2019. Appl　Clin　Genet. 12:113-130).
MDC1A는 라미닌-211의 서브유닛(subunit) 중 하나인 라미닌-α2 쇄를 코딩하는 LAMA2 유전자의 카피(copy) 둘 다에서 기능 상실 열성 돌연변이(loss-of-function recessive mutation)에 의해 유발된다. 라미닌-211은 수축 동안 기저막과 근육 섬유를 안정화시키는 기능을 하는 세포외 기질 단백질이다. 라미닌-α2 쇄 단백질의 길이는 3 122개의 아미노산 잔기이므로, 이의 코딩 DNA 서열 (CDS)의 길이는 ~9.3 kb이다. 따라서 다른 많은 근이영양증과 같이, MDC1A는 AAV 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 카고(cargo) 용량을 능가하는, 매우 큰 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 더욱이, 전반적인 LAMA2 유전자에서 지금까지 단일 점 미스센스(single point missense), 스플라이스 부위(splice site) 또는 인프레임(in-frame) 돌연변이로부터, 다중-킬로베이스(multi-kilobase) 영역 결실(deletion)에 이르기까지 수십 가지의 상이한 돌연변이가 너무 많이 기재되어 있어 (Oliveira et　al., 2018. Hum　Mutat. 39(10):1314-1337), 치유적 유전자 요법 접근법이 도전과제이고 유전자 대체 전략은 지금까지 이용가능하지 않다.
다른 교정 유전자-기반 전략이 MDC1A에 대해 시험되었다. 통상적으로 스플라이스 인핸서(enhancer) 부위를 억제하고 특정한 엑손이 스플라이싱에 참여하지 못하도록 하기 위해 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용을 지칭하는 엑손-스키핑 접근법(Exon-skipping approach)이 사용되었다 (Aoki et　al., 2013. Biomed　Res　Int. 2013:402369). 그러나, 이 엑손-스키핑 접근법은 보편적이지 않으며 결실을 갖는 일부 환자에게만 사용할 수 있으며, 여기서 결실에 인접한 추가 엑손을 스키핑함으로써 판독 프레임을 복원할 수 있다 (Shieh, 2018. Neurotherapeutics. 15(4):840-848). 엑손-스키핑은 말단절단된(truncated) 그러나 부분적으로 기능적인 단백질의 번역을 복원하나 전체 길이 라미닌-α2 단백질의 이점을 요약하지는 않는다.
CRISPR/Cas9는 또한 LAMA2 돌연변이를 교정하는 데 사용되었으며, 특히 스플라이스-부위 돌연변이를 함유하는 LAMA2 인트론 2 영역을 절제하고 비-상동 말단-연결(non-homologous end-joining) (NHEJ)을 통해 기능적 공여체(donor) 스플라이스 부위를 생성하여, LAMA2 전사체의 엑손 2 포함 및 전장 라미닌-α2 사슬 단백질 복원을 유도하였다 (Kemaladewi et　al., 2017. Nat　Med. 23(8):984-989). 엑손-스키핑으로서, 이 전략은 일부 환자에서만 사용할 수 있으며 보편적이지 않는다.
그러나, NHEJ는 큰 트랜스진을 게놈에 통합하는 데 적합하지 않으며, 한편 상동성 지향 복구(homology directed repair) (HDR) 경로에 의존하는 유전자 변형이 이론적으로 대부분의 병원성 점 돌연변이를 교정할 수 있지만, 이는 문헌 [Kemaladewi　&　Cohn (2019. Emerg　Top　Life　Sci. 3(1):11-18)]에 의해 설명된 바와 같이 "극히 비효율적"인 것으로 밝혀졌다. 결론적으로, [Kemaladewi　&　Cohn]은 근이영양증을 유발하는 돌연변이를 교정하기 위한 대안적 전략의 개발을 촉구하였다.
마지막으로, CRISPR/Cas9는 LAMA1 유전자의 프로모터로 지향하는, VP64와 같은 전사 활성화 도메인에 융합된 촉매적으로 불활성인 Cas9 (SadCas9)를 사용함으로써, 유전자 발현을 유도하기 위해 또한 사용되어, 구조적으로 유사한 라미닌-α1 쇄 단백질의 발현 증가를 허용한다 (Kemaladewi et　al., 2019. Nature. 572(7767):125-130). 그러나, 이 접근법은 트랜스진의 지속적인 발현이 필요하다.
따라서 보편적이어서 특정 돌연변이에 영향을 받는 특정 환자에게만 국한되지 않는, MDC1A를 치료하기 위한 영구적이고 효율적인 전략을 개발할 필요성이 남아 있다.
LAMA2 유전자의 유전자 교체는 유망한 치료 가치를 가지고 있으나; 카고(cargo) 크기 제약으로 인해 지금까지는 도전과제였다. 본 발명자들은 LAMA2 유전자의 건강한 전장 카피를 세포의 게놈 내의 특정 부위로 통합하기 위해 트랜스포사제 (예를 들어, 과활성(hyperactive) PiggyBac 트랜스포사제)에 융합된 부위-특이적 DNA-결합 단백질 (예를 들어, Cas9)을 포함하는 융합 단백질을 사용하였다. 이에 따라 본 발명자들은 상이한 유전자 전달 기술과 호환되는, 생체외 및 생체내 전달을 위한 대형 LAMA2 발현 카세트 (9.3 kb의 CDS)를 가진 치료 페이로드(therapeutic payload)를 제공할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 a) 표적 핵산 서열(target nucleic acid sequence)에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적(site-specific) DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질; 또는 상기 제1 단백질을 코딩하는(encoding) 핵산 작제물(construct); b) 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질; 또는 상기 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 및 c)　바람직하게는 서열번호: 74의, 라미닌-α2 단백질, 또는 이의 기능적 변이체(functional variant) 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
한 실시양태에서, a) 및 b)의 제1 및 제2 단백질은 임의로 링커(linker)를 통해 함께 융합(fusing)된다.
한 실시양태에서, c)의 핵산 작제물은 서열번호: 76의 CMV 프로모터, 서열번호: 77의 CAG 프로모터, 서열번호: 78의 EF1-알파 프로모터, 서열번호: 79의 SV-40 프로모터 및 서열번호: 80의 EalbAAT 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, c)의 핵산 작제물은 서열번호: 81의 스플라이스 수용체 (83-85)를 포함한다. 한 실시양태에서, c)의 핵산 작제물은 바람직하게는 서열번호: 83-85로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리(A) 신호 서열(poly(A) signal sequence) 및/또는 바람직하게는 서열번호: 86-87로 이루어진 군으로부터 선택되는 절연체 요소(insulator element)를 포함한다. 한 실시양태에서, c)의 핵산 작제물은 역 말단 반복부(inverted terminal repeat) (ITR), 바람직하게는 서열번호: 88 및 89의 5'-ITR 및 3'-ITR에 의해 플랭킹(flanking)된다.
한 실시양태에서, c)의 핵산 작제물은 플라스미드 벡터, 미니써클 벡터(minicircle vector), 도기 본(doggy bone) DNA 공여체 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 렌트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터에 포함된다.
한 실시양태에서, 상기 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 Cas 단백질을 포함하는 RNA-가이드된(guided) 뉴클레아제이고, 여기서 상기 조성물은 세포 게놈의 특이적 부위에 상기 LAMA2 트랜스진을 통합하기 위한 표적 핵산 서열에 대한 상보적 서열을 포함하는 가이드 RNA를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 Cas 단백질은 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas 9 단백질이다.
한 실시양태에서, 가이드 RNA는 서열번호: 90 내지 97 중 어느 하나를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 트랜스포사제는 변형된 과활성 Piggybac 트랜스포사제 또는 슬리피 뷰티(Sleepy Beauty) 트랜스포사제, 바람직하게는 변형되지 않은 과활성 Piggybac과 비교하여 절제 활성(excision activity)을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 및 변형되지 않은 과활성 Piggybac과 비교하여 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이다.
한 실시양태에서, 상기 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 V34, T43, Y177, M194, R202, S230, R245, R275, R277, G325, S351, N347, R372, K375, R376, E377, E380, A411, D450, T560, S564, S573, M589, S592, 및 F594로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 바람직하게는 아미노산 Y177, R202, S230, R245, R275, R277, G325, N347, S351, E377, D450, R372 및 K375, E377, T560, S564, S573, M589, S592, F594의 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이며, 상기 위치 번호는 서열번호: 9의 변형되지 않은 과활성 Piggybac의 아미노산 번호에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 M194, R245, R275, R277, G325, R372, K375, R376, E377, E380, D450 및 S573으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 바람직하게는 아미노산 D450, R372 및 R375의 돌연변이를 포함하는, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이며, 상기 위치 번호는 서열번호: 9의 변형되지 않은 과활성 Piggybac의 아미노산 번호에 상응한다.
한 실시양태에서, 상기 트랜스포사제는 링커, 바람직하게는 GGS, XTEN 또는 FOKI를 포함하는 펩티드 링커, 보다 바람직하게는 서열번호: 53의 XTEN에 의해 상기 부위-특이적 DNA 결합 단백질에 N-말단으로 융합된다.
한 실시양태에서, 상기 조성물은 나노입자 내에 패키징(packaging)된다.
본 발명은 또한 세포 내로 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 포함하는 세포의 게놈 내의 표적 핵산 서열 내로 LAMA2 트랜스진을 통합하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 시험관내 방법에 의해 수득할 수 있는 조작된 세포(engineered cell)에 관한 것이며, 여기서 조작된 세포는 이의 게놈 내에 통합된 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 인테그라제 및/또는 트랜스포사제 매개 유전자 삽입에 대한 작동 서열(operational sequence)에 의해 플랭킹된 라미닌-α2 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함한다.
한 실시양태에서, 트랜스진을 플랭킹하는 작동 서열은 서열번호: 88 및 89를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, ITR-간 크기(inter-ITR size)는 적어도 300 bp이다.
한 실시양태에서, 트랜스진은 전장(full-length) 라미닌-α2 단백질을 코딩한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 조작된 세포를, 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한, 특히 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 메로신-결핍 선천성 근이영양증 1A형 (MDC1A)의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조성물, 본 발명의 조작된 세포 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 분명히 달리 나타내지 않는 한 단수형 및 복수형 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "제제(agent)"에 대한 언급은 단일 제제 및 복수의 이러한 제제를 포함한다.
용어 "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 단량체 뉴클레오티드로 이루어지거나 그를 포함하는 임의의 분자를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, 또는 이의 혼합일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 변형되거나 인공적일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산 (LNA), 뿐만 아니라 글리콜 핵산 (GNA) 및 트레오스 핵산 (TNA)을 포함한다. 이들 서열 각각은 분자의 백본에 대한 변화에 의해 자연적으로 발생하는 DNA 또는 RNA와 구별된다. 또한, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 다른 데옥시뉴클레오티드 유사체는, 제한 없이, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, N3'P5'-포스포르아미데이트 및 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트 및 이의 2'-O-알릴 유사체 및 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트를 포함하며, 이들은 본 개시내용의 뉴클레오티드에 사용될 수 있다.
용어 "트랜스진"은 외인성 핵산 서열, 특히 유전자 산물을 코딩하는 외인성 DNA 또는 cDNA를 지칭한다. 유전자 산물은 RNA, 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 유전자 산물 (CDS)에 대한 코딩 영역에 더하여, 트랜스진은 발현을 용이하게 하거나 향상시키기 위한 하나 이상의 작동 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서(들), 반응 요소(response element)(들), 리포터 요소(들), 절연체 요소(들), 폴리아데닐화 신호(들) 및/또는 기타 기능 요소를 포함하거나 이와 연관될 수 있다. 본 개시내용의 실시양태는 달리 특정되지 않는 한, 임의의 공지된 적합한 프로모터, 인핸서(들), 반응 요소(들), 리포터 요소(들), 절연체 요소(들), 폴리아데닐화 신호(들) 및/또는 다른 기능적 요소를 이용할 수 있다. 적합한 요소 및 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지될 것이다.
용어 "핵산 작제물"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 사람이 제조한 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 작제물은 핵산 서열의 세그먼트를 함유하도록 변형된, 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자이며, 이는 자연계에 달리 존재하지 않을 방식으로 조합되고 병치된다. 핵산 작제물은 대개 "벡터", 즉 외인성으로 생성된 DNA를 숙주 세포로 전달하는 데 사용되는 핵산 분자이다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉, 이의 복제가 염색체 복제와 무관한 여분의 염색체 실체로서 존재하는 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 여분의 염색체 요소, 미니-염색체, 또는 자기-복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 함유할 수 있는 인공 염색체; 또는 통합 벡터, 즉 숙주 세포에 도입될 때 이의 게놈에 통합되고 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 벡터를 지칭할 수 있다.
용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 정렬로부터의 위치에서 매치 (동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드)의 수(%)를 지칭한다. 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩을 최대화하도록 정렬될 때 서열을 비교함으로써 결정된다. 특히, 서열 동일성은 두 서열의 길이에 따라, 임의의 다수의 수학적 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 글로벌 정렬 알고리즘 (예를 들어, 니들만 앤드 분쉬(Needleman and Wunsch) 알고리즘 [Needleman　&　Wunsch, 1970. J　Mol　Biol. 48(3):443-53])을 사용하여 정렬되며, 한편 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 로컬 정렬 알고리즘 (예를 들어, 스미쓰 앤드 워터맨(Smith and Waterman) 알고리즘 [Smith　&　Waterman, 1981. J　Mol　Biol. 147(1):195-197] 또는 앨트셜(Altschul) 알고리즘 [Altschul et　al., 1997. Nucleic　Acids　Res. 25(17):3389-3402; Altschul et　al., 2005. FEBS　J. 272(20):5101-9])을 사용하여 정렬된다. 예컨대 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/에서 이용가능한 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 관련 기술분야의 기술 범위 내에서 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, % 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 동일성 값은 니들만-분쉬 알고리즘을 사용하여 두 서열의 최적 글로벌 정렬을 생성하는 쌍별(pair wise) 서열 정렬 프로그램 EMBOSS 니들(Needle)을 사용하여 생성된 값을 지칭하며, 여기서 모든 검색 파라미터는 디폴트 값, 즉, 스코어링 매트릭스(Scoring matrix) = BLOSUM62, 갭 오픈(Gap open) = 10, 갭 확장(Gap extend) = 0.5, 엔드 갭 페널티(End gap penalty) = 거짓, 엔드 갭 오픈(End gap open) = 10 및 엔드 갭 확장(End gap extend) = 0.5로 설정된다.
용어 "융합"은 2개 이상의 서브유닛 분자가 연결된 분자를 지칭한다. 일부 실시예에서, 둘 사이의 연결은 공유결합이며; 대안적으로, 둘 사이의 연결은 비공유결합일 수 있고, 예를 들어 분자간 상호작용에 의존할 수 있다. 서브유닛 분자는 동일한 화학적 유형의 분자이거나, 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다.
용어 "융합 단백질"은 적어도 2개의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 하나의 단백질 도메인은 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단) 부분 또는 카르복시 말단 (C-말단) 단백질에 위치하여, "아미노-말단 융합 단백질" 또는 "카르복시-말단 융합 단백질"을 각각 형성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 융합 단백질은 핵산 서열에 의해 완전히 코딩될 수 있는 단일 쇄 폴리펩티드이고, 펩티드에 의해 직접 공유결합되거나 펩티드 링커를 통해 임의로 공유결합된 적어도 2개의 단백질 도메인을 포함한다.
용어 "링커"는 2개의 인접한 분자 또는 모이어티를 연결하는 화학적 기 또는 또는 분자를 지칭한다.
용어 "결합 단백질"은 또 다른 분자에 비공유 결합할 수 있는 단백질을 지칭한다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 동일한 단백질의 하나 이상의 분자에 결합하여 동종이량체, 동종삼량체 등을 형성할 수 있고/거나; 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 초과의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 단백질, 또는 이의 단편 (예를 들어, Cas9의 활성 또는 불활성 DNA 절단 도메인, 및/또는 Cas9의 gRNA 결합 도메인을 포함하는 단백질)을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한 때때로 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR (클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeat))-연관 뉴클레아제라고도 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전 요소 (바이러스, 전이 요소(transposable element) 및 접합 플라스미드(conjugative plasmid))에 대한 보호를 제공하는 적응 면역 시스템이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 상보적인 서열, 및 표적 침습 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 전사되어 CRISPR RNA (crRNA)로 프로세스된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, pre-crRNA의 올바른 처리는 트랜스-코딩된 소형 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질을 필요로 한다. tracrRNA는 pre-crRNA의 리보뉴클레아제 3-보조 처리(aided processing)를 위한 가이드 역할을 한다. 후속적으로, Cas9/crRNA/tracrRNA는 스페이서에 상보적인 선형 또는 원형 dsDNA 표적을 내핵분해적으로(endonucleolytically) 절단한다. crRNA에 상보적이지 않은 표적 가닥은 먼저 내핵분해적으로 커팅된 다음에, 외핵분해적으로(exonucleolytically) 3'-5' 트리밍된다. 자연에서, DNA-결합 및 절단은 전형적으로 단백질 및 두 RNA 모두를 필요로 한다. 그러나, 단일 가이드 RNA ("sgRNA" 또는 간단히 "gNRA")는 crRNA 및 tracrRNA 둘 다의 측면을 단일 RNA 종으로 혼입되도록 조작될 수 있다.
Cas9는 CRISPR 반복 서열에서 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서(protospacer) 인접 모티프)를 인식하여 자기와 비-자기(non-self)를 구별하는 데 도움을 준다. Cas9 뉴클레아제 서열 및 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. Cas9 오르토로그(ortholog)는 에스. 피오게네스 및 에스. 써모필러스(S.　thermophilus)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종에서 기재되어 있다. 추가적인 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 본 개시내용을 기반으로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 문헌 [Chylinski et　al., 2013. (RNA　Biol. 10(5):726-37)]에 개시된 유기체 및 유전자좌로부터의 Cas9 서열을 포함하며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 불활성 (예를 들어, 불활성화된) DNA 절단 도메인을 갖는다. 뉴클레아제-불활성화된 Cas9 단백질은 "dCas9" 단백질 (뉴클레아제-"죽은" Cas9의 경우)로서 상호교환적으로 지칭될 수 있다. 불활성 DNA 절단 도메인을 갖는 Cas9 단백질 (또는 이의 단편)을 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek et　al., 2012. Science. 337(6096):816-821; Qi et　al., 2013. Cell. 152(5):1173-83]을 참조하며, 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨).
용어 "징크 핑거 단백질"은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 징크 핑거 단백질의 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인을 지칭한다. 용어 "징크 핑거 단백질"은 종종 "ZFP"로 약칭된다.
용어 "징크 핑거 뉴클레아제"는 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소를 지칭한다. 징크 핑거 도메인은 원하는 특정 DNA 서열을 표적으로 하도록 조작될 수 있으며, 이를 통해 징크 핑거 뉴클레아제가 복잡한 게놈 내 고유한 서열을 표적으로 삼을 수 있다. "징크 핑거 뉴클레아제"는 종종 "ZFN" 또는 "ZNP"로 약칭된다.
용어 "절단(cleavage)"은 DNA 분자의 공유 백본의 파손(breakage)을 지칭한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 다가 가능하고, 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 사건의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단은 무딘 말단(blunt end) 또는 엇갈린 말단(staggered end)을 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 표적화된 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
용어 "특이성"은 선택된 서열에 대해 어느 정도의 서열 동일성을 공유하는 서열에 선택적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
용어 "삽입" 및 "통합"은 핵산 서열을 제2 핵산 서열에 또는 게놈 또는 이의 일부에 첨가하는 것을 지칭한다. 삽입 또는 통합과 관련하여 용어 "특이적", "부위-특이적", "표적화된" 및 "온-타깃된(on-targeted)"은 본원에서 핵산의 삽입을 제2 핵산의 특이적 부위에 또는 게놈 또는 이의 일부의 특이적 부위에 삽입하는 것을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 반대로, 용어 "무작위", "비표적화된(non-targeted)" 및 "오프-타깃된(off-targeted)"은 원하지 않는 부위로의 핵산의 비특이적 및 의도하지 않은 삽입을 지칭한다. 용어 "총" 또는 "전반적인"은 총 삽입 수를 지칭한다.
용어 "돌연변이"는 서열, 예를 들어 핵산 또는 아미노산 서열 내의 잔기의, 또 다른 잔기로의 치환; 및/또는 핵산 또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잔기의 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는 전형적으로 원래의 잔기에 이어서 서열 내 잔기의 위치를 확인한 다음에, 새로 치환된 잔기의 정체를 확인함으로써 본원에 기재된다. 본원에서 제공되는 아미노산 치환 (돌연변이)을 만드는 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지 있으며, 예를 들어 문헌 [Green　&　Sambrook, 2012 (Molecular cloning: a laboratory manual (4th　Ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)]에 의해 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 용어 단백질에서의 돌연변이는 아미노산 치환을 지칭한다.
용어 "트랜스포사제"는 트랜스포존의 말단에 결합하고 잘라내기(cut)- 및 붙여넣기(paste) 메커니즘 또는 복제 전치 메커니즘(replicative transposition mechanism)에 의해 게놈의 또 다른 부분으로의 이의 이동을 촉매하는 효소를 지칭한다.
용어 "변형된"은 상응하는 변형되지 않은 단백질 또는 핵산 서열과 상이한 단백질 또는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "링커"는 2개의 인접한 분자 또는 모이어티를 연결하는 화학적 기 또는 분자를 지칭한다.
상세한 설명
본 발명자들은 LAMA2 트랜스진을 세포의 게놈 내의 특이적 부위에 통합시키기 위해 트랜스포사제에 융합된 부위-특이적 DNA-결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 사용하였다.
따라서 본 발명은
a) 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질; 또는 상기 제1 단백질을 코딩하는 핵산 작제물, 바람직하게는 cDNA 또는 mRNA;
b) 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질; 또는 상기 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물, 바람직하게는 cDNA 또는 mRNA; 및
c) 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물
을 포함하거나 이로 이루어진 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 조성물은
a) (i) 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질, 및 (ii) 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질; 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 작제물, 바람직하게는 cDNA 또는 mRNA; 및
b) 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물
을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에 따르면, 제1 단백질은 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다.
조작된 징크 핑거 단백질(zinc finger protein) (ZFP), 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator like effector nuclease) (TALEN), 그리고 보다 최근에는 Cas9와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 포함한 현재의 게놈 공학 도구(genome engineering tool)는 게놈에서 서열-특이적 DNA 절단에 영향을 미친다. 이 프로그래밍 가능한 절단은 비-상동 말단 연결 (NHEJ)을 통해 절단 부위에서 DNA의 돌연변이 또는 상동성-지향 복구(homology-directed repair) (HDR)를 통해 절단 부위 주변의 DNA의 대체를 발생시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제, 징크 핑거 단백질 및 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 및 징크 핑거 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 RNA-가이드된 뉴클레아제이다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 이의 변이체 및 기능적 단편을 포함하여, Cas9 단백질 (예를 들어, 제외 없이, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus　pyogenes) Cas9 (SpCas9), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus　aureus) Cas9 (SaCas9), 또는 캄필로박터 제주니(Campylobacter　jejuni) Cas9 (CjCas9); 일부 다른 적합한 예가 하기에 기재될 것임), 또는 이의 변이체 (예를 들어, 닉카제 Cas9 (nCas9) 또는 데드(dead) Cas9 (dCas9)), Cas12a 단백질, Cas12b 단백질, Cpf1 단백질, 또는 CasX 단백질이다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 이의 변이체 및 기능적 단편을 포함하여, Cas9 단백질이다.
CRISPR-Cas9 시스템은 서열-특이적 이중-가닥 파단(double-strand break) (DSB)을 통해 유전자를 불활성화하거나 수정하는 데 매우 효과적인 도구이다. 이들 DSB는 세포 DNA 손상 반응 기계에 의해 인식되며 내인성 DSB 복구 경로에 의해 복구될 수 있다. 우세한 복구 경로는 비-상동 말단 연결 (NHEJ)이며, 이는 종종 작은 삽입 및/또는 결실을 발생시켜 프레임이동(frameshift) 돌연변이를 생성하고 유전자의 기능을 방해할 수 있다. 이 경로를 이용하여 유전적 녹아웃(genetic knockout) 돌연변이를 생성할 수 있다. 대안적으로, 복구 주형(repair template) (예컨대, 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물)이 있는 경우, 손상은 상동성-지향 복구 (HDR)에 의해 원활하게(seamlessly) 복구될 수 있다. 그러나, 현저한 진전에도 불구하고, 정밀한 유전자 변형을 도입하기 위한 HDR-매개 게놈 편집은 NHEJ-매개 유전자 파괴(gene disruption)보다 훨씬 덜 효율적이다. 더욱이, HDR 경로에 의한 대규모 멀티-kb 대체는 도전과제이고 선택 및/또는 대규모 집단 세포 분류를 필요로 한다. 결과적으로, HDR 경로의 주요 적용은 현재 유전자 내 핵심 영역의 로컬 대체로 제한되나, 대규모 전장 유전자는 아니다. 상기에서 설명된 바와 같이, 본 발명은 이러한 결점을 해결한다.
한 실시양태에서, Cas9 단백질은 (i) 활성 DNA 절단 도메인 및 (ii) 가이드 RNA 결합 도메인을 포함한다.
공지된 Cas9 단백질 중에서, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질은 게놈 공학을 위한 도구로 널리 사용되어 왔다. 이 Cas9 단백질은 2개의 별개의 뉴클레아제 도메인을 함유하는 대형, 멀티-도메인(multi-domain) 단백질이다.
한 실시양태에서, Cas9 단백질은 서열번호:　19를 가진 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium　ulcerans) (NCBI 참조번호: NC_015683.1, NC_017317.1); 서열번호:　20을 가진 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium　diphtheria) (NCBI 참조번호: NC_016782.1, NC_016786.1); 서열번호:　21을 가진 스피로플라즈마 시르피디콜라(Spiroplasma　syrphidicola) (NCBI 참조번호: NC_021284.1); 서열번호:　22를 가진 프레보텔라 인터메디아(Prevotella　intermedia) (NCBI 참조번호: NC_017861.1); 서열번호:　23을 가진 스피로플라즈마 타이와넨스(Spiroplasma　taiwanense) (NCBI 참조번호: NC_021846.1); 서열번호:　24를 가진 스트렙토코커스 이니아에(Streptococcus　iniae) (NCBI 참조번호: NC_021314.1); 서열번호:　25를 가진 벨리엘라 발티카(Belliella　baltica) (NCBI Ref: NC_018010.1); 서열번호:　26을 가진 사이크로플렉서스 토르퀴시(Psychroflexus　torquisi) (NCBI Ref: NC_018721.1); 서열번호:　27을 가진 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus　thermophilus) (NCBI 참조번호: YP_820832.1); 서열번호:　28을 가진 리스테리아 이노쿠아(Listeria　innocua) (NCBI 참조번호: NP_472073.1); 서열번호:　29를 가진 캄필로박터 제주니 (CjCas9) (NCBI 참조번호: YP_002344900.1) (서열번호:　63에 의해 코딩됨); 서열번호:　30을 가진 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria　meningitidis) (NCBI 참조번호: YP_002342100.1); 서열번호:　68을 가진 스타필로코커스 아우레우스 (SaCas9) (서열번호:　60에 의해 코딩됨); 및 서열번호:　31을 가진 스트렙토코커스 피오게네스 (SpCas9) (NCBI 참조번호: NC_017053.1)로부터의 Cas 9 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본원에서 야생형 Cas9 단백질을 언급할 때, 상기 야생형 Cas9 단백질은 달리 특정되지 않는 한, 서열번호: 31을 가진 스트렙토코커스 피오게네스 (spCas9)로부터의 Cas9에 상응한다.
한 실시양태에서, Cas9 단백질은 "Cas9 변이체"일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "Cas9 변이체"는 본원에 기재된 바와 같은 Cas9 단백질에 대한 상동성을 공유하는 단백질이며, 이의 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, Cas9 변이체는 서열번호: 31을 가진 야생형 Cas9 단백질 또는 서열번호:　19-30 또는 68을 가진 임의의 다른 Cas9 단백질과 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 적어도 약 96% 동일, 적어도 약 97% 동일, 적어도 약 98% 동일, 적어도 약 99% 동일, 적어도 약 99.5% 동일할 수 있거나, 적어도 약 99.9%일 수 있다.
한 실시양태에서, Cas9 변이체는 하나 또는 수개의 아미노산 치환을 가진 Cas9 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, Cas9의 DNA 절단 도메인은 2개의 서브도메인, HNH 뉴클레아제 서브도메인 및 RuvC1 서브도메인을 포함하는 것으로 공지되어 있다. HNH 서브도메인은 gRNA에 상보적인 가닥을 절단하며, 한편 RuvC1 서브도메인은 비상보적인(non-complementary) 가닥을 절단한다.
이들 서브도메인 내의 돌연변이는 Cas9의 뉴클레아제 활성을 침묵시킬 수 있다. 예를 들어, D10A 및 H841A 치환은 서열번호: 31을 가진 에스. 피오게네스 Cas9 단백질의 뉴클레아제 활성을 완전히 불활성화하여, sgRNA-프로그래밍된 방식에서 DNA에 결합하는 이의 능력을 여전히 유지하는 데드 Cas9 (dCas9)를 발생시키는 것으로 공지되어 있다. 원칙적으로, 또 다른 단백질이나 도메인에 융합될 때, dCas9는 적절한 sgRNA와의 공동-발현(co-expression)에 의해 그 단백질을 거의 모든 DNA 서열로 표적화할 수 있다. 한 실시양태에서, dCas9 단백질은 서열번호:　59에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, dCas9 단백질은 서열번호: 67에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Cas9 닉카제 (nCas9)에 관해서, Cas9 닉카제 (nCas9)는 RuvC 뉴클레아제 도메인의 점 돌연변이 (D10A)가 상이한 Cas9 뉴클레아제의 변종으로, DNA를 닉킹할 수 있으나(nick), 절단할 수는 없다. 한 실시양태에서, nCas9 단백질은 서열번호:　57에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, nCas9 단백질은 서열번호:　65에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, SaCas9 닉카제 (SanCas9)는 서열번호:　58에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, SaCas9 닉카제 (SanCas9)는 서열번호: 66에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, Cas9 변이체는 Cas9의 단편을 포함하여, 단편이 서열번호: 31을 가진 야생형 Cas9 단백질 또는 서열번호:　19-30 또는 68을 가진 임의의 다른 Cas9 단백질의 상응하는 단편과 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 적어도 약 96% 동일, 적어도 약 97% 동일, 적어도 약 98% 동일, 적어도 약 99% 동일, 적어도 약 99.5% 동일할 수 있거나, 적어도 약 99.9%일 수 있도록 한다.
한 실시양태에서, Cas9 변이체는 DNA 절단 도메인 또는 가이드 RNA 결합 도메인 중 하나만을 포함한다.
한 실시양태에서, 예시적인 Cas9 변이체는 인간화 Cas9 (hCas9) 또는 이의 변이체 또는 기능적 단편이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 Cas9" 또는 "hCas9"는 인간 세포에 대해 서열-최적화된 Cas9 단백질을 지칭한다.
한 실시양태에서, hCas9 단백질은 서열번호:　56에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, hCas9 단백질은 서열번호:　64에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 cpf1 단백질이다. 한 실시양태에서, cpf1 단백질은 서열번호:　61에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, cpf1 단백질은 서열번호:　69에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 CasX 단백질이다. 한 실시양태에서, 상기 CasX는 서열번호:　62에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, 상기 CasX는 서열번호:　70에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 개시내용의 특정 측면은 또한 부위-특이적 DNA 결합 단백질, 특히 RNA-가이드된 뉴클레아제, 특히 본원에 기재된 Cas9 단백질 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터 또는 플라스미드 (예를 들어, 발현 벡터, 패키징 벡터 등)에 관한 것이며; 상기 벡터 또는 플라스미드는 바람직하게는 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 또는 조류 세포에서의 발현에 적합하다.
한 실시양태에서, 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP)이다.
징크 핑거 단백질은 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합할 수 있는 단백질이다. ZFP는 진핵생물에 고르지 않게 분포되어 있다. ZFP는 DNA 인식, RNA 결합, 및 단백질 결합에 관여하는 것으로 확인되었다. 징크 핑거 단백질에 대한 특정 분류는 폴딩된(folded) 도메인에서 단백질 백본(backbone)의 전반적인 형상의 관점에서 "폴드 그룹"을 기반으로 한다. 징크 핑거의 가장 통상적인 "폴드 그룹(fold group)"은 C2H2 또는 Cys2His2-유사 ("클래식(classic) 징크 핑거"), 트레블 클렙(treble clef), 및 징크 리본(zinc ribbon)이다. 이들 단백질을 특징짓는 대표적인 모티프는 문헌 [Li　&　Liu, 2020 (Int　J　Mol　Sci. 21(4):1361)]의 표 1에 개시되어 있으며, 이 표는 본원에 참조로 포함된다.
ZFP는 게놈에서 특이적 게놈 DNA 서열에 결합할 수 있는, 임의의 ZFP, 이의 변이체 또는 기능적 단편일 수 있다. ZFP의 비제한적 예는 C2H2, gag 넉클(knuckle), 트레블 클렙, 징크 리본, Zn2/Cys6-유사, 또는 TAZ2 도메인-유사, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 폴드 그룸 또는 징크 핑거 모티프를 포함하는 ZFP를 포함한다. 한 실시양태에서, ZFP는 C2H2 징크 핑거 단백질이다.
한 실시양태에서, ZFP는 조작된 ZFP이다. 조작된 징크 핑거 어레이는 DNA 절단 도메인 (대개 FokI의 절단 도메인)에 융합되어 징크 핑거 뉴클레아제를 생성할 수 있다. 이러한 징크 핑거-FokI 융합은 게놈 조작에 유용한 시약이 되었다.
ZFP는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 그 초과의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. ZFP는 2 내지 12개, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 3 내지 8개, 4 내지 8개, 또는 5 내지 8개의 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, ZFP는 6개의 징크 핑거 도메인을 포함한다.
통상적인 모듈 어셈블리(modular assembly) 공정은 9 염기쌍에서 18 염기쌍 길이 범위의 표적 부위를 인식하는 3-핑거, 4-, 5-, 또는 6-핑거 어레이를 생성하기 위해 각각 3-염기쌍 DNA 서열을 인식할 수 있는 별도의 징크 핑거를 조합하는 것을 포함한다. 또 다른 방법은 2-핑커 모듈을 사용하여 최대 6개의 개별 징크 핑거를 가진 징크 핑거 어레이를 생성한다.
한 실시양태에서, ZFP의 결합 도메인은 관심 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연-발생 ZFP와 비교하여, 개선된 결합 특이성을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, ZFP를 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호:　32, 서열번호:　34, 서열번호:　36, 또는 서열번호:　38을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 이들 서열에 의해 코팅되는 예시적인 아미노산 서열은 서열번호:　33, 서열번호:　35, 서열번호:　37, 또는 서열번호:　39를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, ZFP는 서열번호:　33, 35, 37 또는 39 중 어느 한 서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, ZFP는 Gal4 DNA 결합 도메인을 갖지 않는다. Gal4는 N이 임의의 염기일 수 있는 CGG-N11-CCG에 결합한다. 이 단백질은 갈락토스를 글루코스로 전환시키는 데 사용되는 효소를 코딩하는 갈락토스-유도 유전자 예컨대 GAL1, GAL2, GAL7, GAL10, 및 MEL1의 유전자 발현에 대한 양성 조절자이다. 이는 이들 유전자의 상류 활성화 서열 (UAS-G)에서 17-염기쌍 서열을 인식한다. 따라서, Gal4는 게놈에서 짧고 매우 빈번한 서열을 인식하므로, 부위-특이적이지 않는다. 한 실시양태에서, ZFP는 부위-특이적이도록 조작된 Gal4 DNA 결합 도메인을 갖는다.
하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 개시내용의 특정 측면은 부위-특이적 DNA 결합 단백질, 특히 본원에 기재된 ZFP를 코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터 또는 플라스미드 (예를 들어, 발현 벡터, 패키징 벡터 등)에 관한 것이며; 상기 벡터 또는 플라스미드는 바람직하게는 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 또는 조류 세포에서의 발현에 적합하다.
본 발명에 따르면, 제2 단백질은 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진다.
트랜스포존은 전위를 겪을 수 있는 염색체 세그먼트, 예를 들어, 숙주 DNA에 상보적인 서열의 부재 하에 전체적으로 전위될 수 있는 DNA이다. 트랜스포존은 인간 세포에서 장거리 DNA 조작을 수행하는 데 사용할 수 있다. 포유동물 세포에 사용되는 통상적인 트랜스포존 시스템은 불활성 트랜스포존으로부터 재구성된, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) (SB), 및 나방(moth) 트리코플루시아(Trichoplusia)로부터 단리된, PiggyBac (PB)을 제한 없이 포함한다. PiggyBac은 SB보다 전위 활성도가 높으며 흉터 없이 절제할 수 있다.
천연 DN트랜스포존은 전형적으로 트랜스포사제 결합 부위를 운반하는 역 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹되는 트랜스포사제 단백질을 코딩하는 단일 유전자를 함유한다. 이의 전위 동안, 트랜스포사제 단백질은 이들 ITR을 인식하여 임의의 방식으로 다른 곳에서 요소의 절단 및 후속 재통합을 촉매한다. 게다가, 이들 트랜스포존 중 일부는 이들을 이중-구성요소 시스템(bi-component system)으로서 이용하여, 유전자 요법 프로토콜에 사용하기 위해 적합화될 수 있으며, 여기서 플라스미드는 트랜스포존 ITR 사이에 배치된 관심 DNA 서열 (예를 들어, LAMA2 트랜스진)이 시험관 내에서 합성된 트랜스포사제 효소 또는 그 mRNA를 코딩하는 서열을 함유하는 공동-형질감염된 플라스미드에 의해 지향되는 숙주 게놈으로 도입될 수 있는 발현 카세트를 함유한다. 본 개시내용에 따르면, 트랜스포존-기반 시스템은 세포에서 LAMA2 트랜스진의 안정한 통합 및 지속적인 발현을 효율적으로 매개하는데 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 트랜스포사제 또는 변형된 트랜스포사제는 게놈의 특이적 부위에 LAMA2 트랜스진을 삽입할 수 있는 임의의 트랜스포사제일 수 있다.
트랜스포사제의 비제한적인 예는 프로그 프린스(Frog Prince), 슬리핑 뷰티, 과활성 과활성 슬리핑 뷰티, PiggyBac, 및 과활성 PiggyBac을 포함한다.
한 실시양태에서, 트랜스포사제는 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 (hyPB)이다.
야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 9를 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 갖는다. 이 단백질을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호: 71에 제시된 바와 같다.
한 실시양태에서, 트랜스포사제는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이다.
본원에 사용된 바와 같이, "변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제"는 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 비교하여, 하나 이상의 아미노산 치환, 전형적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 트랜스포사제를 지칭한다. 보다 구체적으로, 변형된 과활성 PiggyBac은 (i) 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 비교하여 절제 활성을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환, 및/또는 (ii) 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 비교하여 DNA 결합 활성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 9에 제시된 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 절제 활성을 증가시키기 위해, 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어 아미노산 위치 D198, D201, R202, M212, 및/또는 S213에서 아미노산 위치 번호 [194-200], [214-222], [434-442] 및/또는 [446-456]에 의해 정의된 영역 내에 절제 활성을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 갖는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 위치 450, 560, 564, 573, 589, 592, 및/또는 594로부터 선택된 아미노산 위치에서 절제 활성을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 갖는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 위치 M194 및 D450으로부터 선택된 아미노산 위치에서 절제 활성을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9의 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 M194V 및 D450N 중에서 선택되며, 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 DNA 결합 활성을 감소시키기 위해, 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 비교하여, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 비교하여 위치 254, 275, 277, 347, 372, 375, 및/또는 465로부터 선택된 아미노산 위치에서 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 위치 R275, N347, R372, K375, R376, E377, 및/또는 E380으로부터 선택된 아미노산 위치에서 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 위치 R372, K375, R376, E377 및/또는 E380으로부터 선택된 아미노산 위치에서 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9의 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 R372A, K375A, R376A, E377A, 및/또는 E380A 중에서 선택되고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 위치 N347, R372, 및 K375로부터 선택된 아미노산 위치에서 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N347S, N347A, R372A 및/또는 K375A 중에서 선택되고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N347S 또는 N347A 중에서 선택되고; 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는, 상기에 정의된 바와 같이, 절제 활성을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환; 및 상기에 정의된 바와 같은 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 위치 D450에서 절제 활성을 증가시키기 위한 적어도 하나의 치환 및 위치 N347, R372 및 K375에서 DNA 결합 활성을 감소시키는 위한 적어도 2개의 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 하며; 바람직하게는 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 이중 돌연변이 N347S 및 D450N 또는 삼중 치환 D450N, R372A 및 K375A를 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 과활성 PiggyBac의 변형된 트랜스포사제는 이중 돌연변이 N347S 및 D450N을 포함하며, 상기 위치 번호는 서열번호:　9의 변형되지 않은 과활성 Piggybac의 아미노산 번호에 상응한다.
일부 실시양태에서, 과활성 PiggyBac의 변형된 트랜스포사제는 삼중 돌연변이 D450N, R372A 및 K375A를 포함하지 않으며, 상기 위치 번호는 서열번호:　9의 변형되지 않은 과활성 Piggybac의 아미노산 번호에 상응한다.
한 실시양태에서, 이전 실시양태에서 개시된 바와 같은 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 위치 번호 [158-169]에 의해 정의된 영역에 적어도 하나의 치환, 예를 들어 A166S; 및/또는 위치 Y527, R518, K525 및/또는 N463에서 적어도 하나의 치환을 추가로 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
전형적으로, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 1의 변형되지 않은 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 34, 43, 117, 202, 230, 245, 268, 275, 277, 287, 290, 315, 325, 341, 346, 347, 350, 351, 356, 357, 388, 409, 412, 432, 447, 460, 461, 465, 517, 560, 564, 571, 573, 576, 586, 587, 589, 592, 및 594로부터 선택된 위치에서 하기 아미노산 치환 중 하나 이상을 추가로 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 하기 아미노산 치환 또는 치환의 조합 중 하나를 포함한다: V34M, T43I, Y177H, R202K, S230N, R245A, D268N, R275A, R277A, K287A, K290A, K287A/K290A, R315A, G325A, R341A, D346N, N347A, N347S, T350A, S351E, S351P, S351A, K356E, N357A, R388A, K409A, A411T, K412A, K432A, D447A, D447N, D450N, R460A, K461A, W465A, S517A, T560A, S564P, S571N, S573A, K576A, H586A, I587A, M589V, S592G, F594L, D450N/R372A/K375A, R275A/R277A, K409A/K412A, R460A/K461A, R275A/R277A/N347S/K375A/T560A/S573A/M589V/S592G 및R245A/R275A/R277A/R372A/W465A; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 하기 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합 중 하나를 포함한다:
- R372A/K375A/D450N,
- R372A/K375A/R376A/D450N,
- K375A/R376A/E377A/E380A/D450N,
- R372A/K375A/R376A/E377A/E380A/D450N,
- M194V,
- M194V/R372A/K375A,
- S351A/R372A/K375A/R388A/D450N/W465A/S573A/M589V/S592G/F594L,
- R245A/R275A/R277A/R372A/W465A/M589V,
- R275A/325A/R372A/T560A,
- N347A/D450N,
- N347S/D450N/T560A/S573A/F594L,
- R202K/R275A/N347S/R372A/D450N/T560A/F594L,
- R275A/N347S/K375A/D450N/S592G,
- R275A/N347S/R372A/D450N/T560A/F594L,
- R275A/R277A/N347S/R372A/D450N/T560A/S564P/F594L
- R245A/N347S/R372A/D450N/T560A/S564P/S573A/S592G,
- R277A/G325A/N347A/K375A/D450N/T560A/S564P/S573A/S592G/F594L,
- V34M/R275A/G325A/N347S/S351A/R372A/K375A/D450N/T560A/S564P,
- G325A/N347S/K375A/D450N/S573A/M589V/S592G,
- S230N/R277A/N347S/K375A/D450N,
- T43I/R372A/K375A/A411T/D450N,
- G325A/N347S/S351A/K375A/D450N/S573A/M589V/S592G, 또는
- Y177H/R275A/G325A/K375A/D450N/T560A/S564P/S592G;
넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 하기 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합 중 하나를 포함한다:
- K375A/R376A/E377A/E380A/D450N,
- R372A/K375A/R376A/E377A/E380A/D450N,
- M194V,
- M194V/R372A/K375A,
- R245A/R275A/R277A/R372A/W465A/M589V,
- R275A/325A/R372A/T560A,
- N347A/D450N,
- N347S/D450N/T560A/S573A/F594L,
- R202K/R275A/N347S/R372A/D450N/T560A/F594L,
- R275A/N347S/K375A/D450N/S592G,
- R275A/N347S/R372A/D450N/T560A/F594L,
- R275A/R277A/N347S/R372A/D450N/T560A/S564P/F594L
- R245A/N347S/R372A/D450N/T560A/S564P/S573A/S592G,
- R277A/G325A/N347A/K375A/D450N/T560A/S564P/S573A/S592G/F594L,
- G325A/N347S/K375A/D450N/S573A/M589V/S592G,
- S230N/R277A/N347S/K375A/D450N,
- G325A/N347S/S351A/K375A/D450N/S573A/M589V/S592G, 또는
- Y177H/R275A/G325A/K375A/D450N/T560A/S564P/S592G;
넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 하기 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합 중 하나를 포함한다:
- R372A/K375A/D450N,
- S351A/R372A/K375A/R388A/D450N/W465A/S573A/M589V/S592G/F594L,
- R245A/R275A/R277A/R372A/W465A/M589V,
- N347A/D450N,
- N347S/D450N/T560A/S573A/F594L,
- R202K/R275A/N347S/R372A/D450N/T560A/F594L,
- R275A/N347S/K375A/D450N/S592G,
- R275A/N347S/R372A/D450N/T560A/F594L,
- R275A/R277A/N347S/R372A/D450N/T560A/S564P/F594L,
- R275A/325A/R372A/T560A,
- R245A/N347S/R372A/D450N/T560A/S564P/S573A/S592G,
- R277A/G325A/N347A/K375A/D450N/T560A/S564P/S573A/S592G/F594L,
- G325A/N347S/K375A/D450N/S573A/M589V/S592G,
- S230N/R277A/N347S/K375A/D450N,
- G325A/N347S/S351A/K375A/D450N/S573A/M589V/S592G, 또는
- Y177H/R275A/G325A/K375A/D450N/T560A/S564P/S592G;
넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 서열번호:　1-8, 10-18, 108-113, 및 122-130 중 임의의 것 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 1-8 및 10-18 중 임의의 것 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 108-113 중 임의의 것 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 상기 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 122-130 중 임의의 것 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어 아미노산 268 및/또는 346 (예를 들어, D268N 및/또는 D346N)에서 보존된 촉매 트리아드(catalytic triad)에 관여하는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호:　11을 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어 아미노산 287, 287/290 및/또는 460/461 (예를 들어, K287A, K287A/K290A, 및/또는 R460A/K461A)에서, 절제에 중대한 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호:　12를 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어 아미노산 351, 356, 및/또는 379 (예를 들어, S351E, S351P, S351A, 및/또는 K356E)에서 표적 연결(target joining)에 관여하는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호:　13을 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어 아미노산 560, 564, 571, 573, 589, 592, 및/또는 594 (예를 들어, T560A, S564P, S571N, S573A, M589V, S592G, 및/또는 F594L)에서 통합에 중대한 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호:　14를 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어 아미노산 325, 347, 350, 357 및/또는 465 (예를 들어, G325A, N347A, N347S, T350A 및/또는 W465A)에서 정렬에 관여하는 hyPB에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호:　15를 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어 아미노산 576 및/또는 587 (예를 들어, K576A 및/또는 I587A)에서, 잘 보존된 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호:　16를 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 예를 들어, 586 (예를 들어, H586A)에서, Zn2+ 결합에 관여하는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호: 17를 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 프로그램가능한 트랜스포사제는 예를 들어 315, 341, 372, 및/또는 375 (예를 들어, R315A, R341A, R372A, 및/또는 K375A)에서 통합에 관여하는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 서열번호: 18을 가진 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제와 비교하여 게놈으로의 DNA 통합의 높은 특이성을 위해 선택된다. 한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호:　9-18 및 108-113 중 어느 하나에 비해 본원에 개시된 변형 중 하나 이상을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호:　1-18 및 108-113 각각에 제시된 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일하다.
실시예에 볼 수 있듯이, 새로 개발된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 치환 라이브러리를 사용하여 특이적 표적화된 전위를 수행하는 변형된 과활성 PiggyBac을 확인하였다. 이러한 라이브러리를 사용하여 양성 표적화된 전위를 가진 변형된 과활성 PiggyBac을 확인하였다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산: 245, 275, 275, 277, 325, 347, 351, 372, 375, 388, 450, 465, 560, 564, 573, 589, 592, 594로부터 선택된 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있고; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 R245A, R275A, R275A, R277A, R275A/R277A, G325A, N347A, N347S, S351E, S351P, S351A, R372A, K375A, R388A, D450N, W465A, T560A, S564P, S573A, M589V, S592G, 또는 F594L로부터 선택된 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 D450N을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 변형 N347A를 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 N347S를 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 이중 아미노산 치환 D450N 및 N347A를 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 D450N 및 N347S를 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 R372A, K375A 및 D450을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 R245A 및 D450을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 R245A, G325A, 및 S573P를 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 R245A, G325A, D450 및 S573P를 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 N347S 및 D450N을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9의 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 아미노산 치환 N347A 및 D450N을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9의 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 이 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 110의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 L25F, R36A, I42K, G59D, I212K, N245S, K252A 및/또는 Q271L 중에서 선택된 하나 또는 수개의 아미노산 치환을 포함하며; 넘버링은 서열번호: 9를 가진 야생형 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 기반으로 한다.
본원에 제공된 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 본원에 개시된 다른 요소, 예컨대 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질에 융합할 수 있거나; 단독으로, 또는 이러한 다른 요소와 조합하여 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서:
- 34번 위치의 아미노산이 V 또는 M이고,
- 43번 위치의 아미노산이 T 또는 I이고,
- 177번 위치의 아미노산이 Y 또는 H이고,
- 202번 위치의 아미노산이 R 또는 K이고,
- 230번 위치의 아미노산이 S 또는 N이고,
- 245번 위치의 아미노산이 A이고,
- 268번 위치의 아미노산이 D 또는 N이고,
- 275번 위치의 아미노산이 R 또는 A이고,
- 277번 위치의 아미노산이 R 또는 A이고,
- 325번 위치의 아미노산이 A 또는 G이고,
- 347번 위치의 아미노산이 N, S 또는 A이고,
- 351번 위치의 아미노산이 E, P 또는 A이고,
- 372번 위치의 아미노산이 R 또는 A이고,
- 375번 위치의 아미노산이 A 또는 K이고,
- 388번 위치의 아미노산이 R 또는 A이고,
- 409번 위치의 아미노산이 K 또는 A이고,
- 411번 위치의 아미노산이 A 또는 T이고,
- 412번 위치의 아미노산이 K 또는 A이고,
- 450번 위치의 아미노산이 D 또는 N이고,
- 460번 위치의 아미노산이 R 또는 A이고,
- 465번 위치의 아미노산이 W 또는 A이고,
- 517번 위치의 아미노산이 S 또는 A이고,
- 560번 위치의 아미노산이 T 또는 A이고,
- 564번 위치의 아미노산이 P 또는 S이고,
- 571번 위치의 아미노산이 S 또는 N이고,
- 573번 위치의 아미노산이 S 또는 A이고,
- 576번 위치의 아미노산이 K 또는 A이고,
- 586번 위치의 아미노산이 H 또는 A이고,
- 587번 위치의 아미노산이 I 또는 A이고,
- 589번 위치의 아미노산이 M 또는 V이고,
- 592번 위치의 아미노산이 G 또는 S이고/이거나,
- 594번 위치의 아미노산이 L 또는 F이다.
한 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제이다.
한 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 서열번호:　73에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이 단백질을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열번호:　72에 제시된 바와 같다.
한 실시양태에서, 트랜스포사제는 변형된 슬리핑 뷰티 트랜스포사제이다. 한 실시양태에서, 변형된 슬리핑 뷰티 트랜스포사제는 야생형 슬리핑 뷰티 트랜스포사제와 비교하여 하나 이상의 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제에서 하나 이상의 치환은 L25F, R36A, I42K, G59D, I212K, N245S, K252A 및/또는 Q271L 중에서 선택되고; 넘버링은 서열번호: 73을 가진 야생형 슬리핑 뷰티 트랜스포사제를 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 트랜스포사제는 Himar1C9 돌연변이가 아니다.
하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 개시내용의 특정 측면은 또한 특히 본원에 기재된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터 또는 플라스미드 (예를 들어, 발현 벡터, 패키징 벡터 등)에 관한 것이며; 상기 벡터 또는 플라스미드는 바람직하게는 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 또는 조류 세포에서의 발현에 적합하다.
한 실시양태에서, 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질 (상기에 기재된 바와 같음)을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질, 및 트랜스포사제 (상기에 기재된 바와 같음)를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질이, 함께 융합되어 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 융합 단백질을 형성한다.
한편으로는 부위-특이적 DNA 결합 단백질, 및 다른 한편으로는 트랜스포사제에 관련된 임의의 실시양태는 본원에 기재된 융합 단백질의 경우에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용한다.
따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은
(i) 상기에 기재된 바와 같은, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제, 징크 핑거 단백질 또는 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제를 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질, 및
(ii) 상기에 기재된 바와 같은, 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질
을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은
(i) 상기에 기재된 바와 같은, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 징크 핑거 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질, 및
(ii) 상기에 기재된 바와 같은, 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질
을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은
(i) 상기에 기재된 바와 같은, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질, 및
(ii) 상기에 기재된 바와 같은, 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질
을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은
(i) 상기에 기재된 바와 같은, Cas9 단백질 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질, 및
(ii) 상기에 기재된 바와 같은, 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제; 특히 상기에 기재된 바와 같은, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질
을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 어느 순서로든 융합 단백질에서 배향될 수 있다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 제2 단백질의 C-말단 말단부(terminal end)에 융합된 제1 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다. 환언하면, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지: (i) 제2 단백질 (즉, 트랜스포사제); (ii) 임의로, 링커; 및 (iii) 제1 단백질 (즉, 부위-특이적 DNA 결합 단백질, 바람직하게는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제; 보다 바람직하게는 Cas9 단백질 또는 이의 변이체)을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 제2 단백질의 N-말단 말단부에 융합된 제1 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다. 환언하면, 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단까지: (i)　제1 단백질 (즉, 부위-특이적 DNA 결합 단백질, 바람직하게는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제; 보다 바람직하게는 Cas9 단백질 또는 이의 변이체); (ii)　임의로, 링커; 및 (iii)　제2 단백질 (즉, 트랜스포사제)을 포함하거나 이로 이루어진다
한 실시양태에서, 융합 단백질은 링커를 포함한다.
링커의 적합한 예는 제1 단백질과 제2 단백질 사이 (임의의 순서로)에 펩티드 링커를 포함한다.
한 실시양태에서, 펩티드 링커는 (GGS)n, 서열번호:　114를 가진 (GGGGS)n, (G)n, 서열번호:　115를 가진 (EAAAK)n, XTEN 링커, 및 (XP)n 모티프, 및 이들 중 임의의 것의 임의의 것의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 n은 독립적으로 1 내지 50의 정수이다.
한 실시양태에서, 링커는 12- 내지 24-아미노산 길이이거나, 36- 내지 72- 뉴클레오티드 길이인 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 실시양태에서, 링커는 XTEN 링커 또는 (GGS)n링커이다.
한 실시양태에서, 링커는 표 1에 나타낸 링커 중에서 선택된다.
[표 1]
한 실시양태에서, 링커는 서열번호:　41, 서열번호:　43, 서열번호:　45, 서열번호:　47, 서열번호:　49, 서열번호:　51, 서열번호:　53, 서열번호:　55, 또는 이의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 아미노산 서열을 포함하며; 각각 서열번호:　40, 서열번호:　42, 서열번호:　44, 서열번호:　46, 서열번호:　48, 서열번호:　50, 서열번호:　52, 서열번호:　54의 예시적인 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 실시양태에서, 링커는 서열번호:　41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며; 서열번호:　40의 예시적인 핵산 서열에 의해 코딩된다.
또한, 본 개시내용에 제공된 핵산 작제물 중 임의의 것의 발현으로부터 수득된 융합 단백질이 본원에 제공된다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 삼중 융합 단백질이다.
이러한 삼중 융합 단백질은 다음을 포함하거나 이루어질 수 있다:
- 1개의 제1 단백질 (즉, 1개의 부위-특이적 DNA 결합 단백질) 및 2개의 제2 단백질 (즉, 2개의 트랜스포사제); 또는
- 2개의 제1 단백질 (즉, 2개의 부위-특이적 DNA 결합 단백질) 및 1개의 제2 단백질 (즉, 1개의 트랜스포사제).
한 실시양태에서, 삼중 융합은 1개의 제1 단백질 (즉, 1개의 부위-특이적 DNA 결합 단백질) 및 2개의 제2 단백질 (즉, 2개의 트랜스포사제)을 포함하거나 이로 이루어지고, 삼중 융합은 N-말단에서 C-말단까지 다음을 포함한다:
- (i)　부위-특이적 DNA 결합 단백질, (ii)　제1 트랜스포사제; (iii)　제2 트랜스포사제; 또는
- (i)　제1 트랜스포사제; (ii)　부위-특이적 DNA 결합 단백질, (iii)　제2 트랜스포사제; 또는
- (i)　제1 트랜스포사제; (ii)　제2 트랜스포사제, (iii)　부위-특이적 DNA 결합 단백질.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 트랜스포사제는 동일하다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 트랜스포사제는 상이하다. 예를 들어, 제1 트랜스포사제는 과활성 PiggyBac 트랜스포사제일 수 있고 제2 트랜스포사제는 본원에 기재된 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 중 임의의 것 중에서 선택된, 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제일 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 트랜스포사제는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제일 수 있으나, 각각은 본원에 기재된 바와 같이 상이한 치환 또는 치환의 상이한 조합을 갖는다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 트랜스포사제는 기능적 이량체를 형성할 수 있다.
한 실시양태에서, 삼중 융합은 2개의 제1 단백질 (즉, 2개의 부위-특이적 DNA 결합 단백질) 및 1개의 제2 단백질 (즉, 1개의 트랜스포사제)을 포함하거나 이로 이루어지고, 삼중 융합은 N-말단에서 C-말단까지를 포함한다:
- (i) 제1 부위-특이적 DNA 결합 단백질, (ii) 제2 부위-특이적 DNA 결합 단백질; (iii) 트랜스포사제; 또는
- (i) 제1 부위-특이적 DNA 결합 단백질; (ii) 트랜스포사제, (iii) 제2 부위-특이적 DNA 결합 단백질; 또는
- (i) 트랜스포사제; (ii) 제1 부위-특이적 DNA 결합 단백질, (iii) 제2 부위-특이적 DNA 결합 단백질.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 동일하다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 상이하다. 예를 들어, 제1 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 Cas9 단백질일 수 있고 제2 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 본원에 기재된 Cas9 단백질 변이체 중 임의의 것 중에서 선택된 Cas9 단백질의 변이체일 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 부위-특이적 DNA 결합 단백질은 둘 다 Cas9 단백질 변이체일 수 있으나, 각각은 상이한 변이체이다..
한 실시양태에서, 삼중 융합 단백질은 이의 단백질 중 2개 또는 3개의 단백질 사이에 링커를 임의로 포함한다.
또한, 다음을 포함하는 융합 단백질이 본원에 개시된다:
(i) 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질; 또는 상기에 기재된 바와 같은 상기 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물, 및
(ii) 적어도 하나의 특이적 RNA 서열에 결합할 수 있는 RNA-결합 단백질; 또는 상기 RNA-결합 단백질을 코딩하는 핵산 작제물.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 상기에 기재된 바와 같은 링커를 포함한다.
한 실시양태에서, 제2 단백질은 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 트랜스포사제는 서열번호: 9를 가진 과활성 PiggyBac이다. 한 실시양태에서, 제2 단백질은 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 트랜스포사제는 서열번호: 9를 갖는 과활성 PiggyBac과 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac이다. 특히, 변형된 과활성 PiggyBac은 본원에 개시된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
한 실시양태에서, 트랜스포사제/RNA 결합 단백질 융합은 상기에 기재된 바와 같이 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질에 추가로 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, RNA-결합 단백질은 MS2 박테리오파지 코트 단백질 (MCP) 또는 이의 단편이다.
일부 실시양태에서, MCP는 서열번호: 132 (예를 들어, 서열번호: 131을 가진 핵산 서열에 의해 코딩됨)와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.
일부 실시양태에서, RNA 결합 단백질은 적어도 하나의 특이적 RNA 서열에 결합할 수 있으며, 상기 RNA 서열은 테트라루프를 포함한다. 용어 "테트라루프"는 용어 "스템 루프(stem loop)" 및 "헤어핀 루프(hairpin loop"와 상호교환적으로 사용된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 테트라루프는 MS2 RNA 테트라루프-결합 서열이다.
일부 실시양태에서, 테트라루프는 가이드 RNA (gRNA) 내에 포함된다. 특정 실시양태에서, gRNA는 상기에 기재된 바와 같이, Cas9 단백질과 복합체를 이룬다.
일부 실시양태에서, gRNA는 적어도 하나의 MS2 RNA 테트라루프-결합 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 하나 초과의 MS2 RNA 테트라루프-결합 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 MS2 RNA 테트라루프-결합 서열을 포함하는 gRNA는 서열번호: 134과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성 (예를 들어, 서열번호: 133을 가진 DNA 서열에 의해 코딩됨)을 가진다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질의 MCP는 Cas9 단백질에 비공유결합으로 결합된 gRNA 자체에 포함된 적어도 하나의 MS2 RNA 테트라루프-결합 서열에 비공유결합으로 결합하고; 특히, Cas9/gRNA 복합체에 대한 융합 단백질의 결합은 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제의 절단 활성을 Cas9/gRNA 복합체에 의해 특이적으로 인식되는 부위로 지향한다.
하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 개시내용의 특정 측면은 또한 본원에 기재된 융합 단백질을 코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 벡터 또는 플라스미드 (예를 들어, 발현 벡터, 패키징 벡터 등)에 관한 것이며; 상기 벡터 또는 플라스미드는 바람직하게는 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 또는 조류 세포에서의 발현에 적합하다.
본 발명에 따르면, 조성물은 상기에 기재된 바와 같이 단백질로서; 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산 작제물로서, 제1 단백질 및/또는 제2 단백질 (또는 이 둘 다를 포함하는 융합 단백질)을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은
a) 상기에 기재된 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진, 상기에 기재된 제1 단백질을 코딩하는 핵산 작제물;
b) 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진, 상기에 기재된 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 및
c) 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물
을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은
a) (i) 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질, 및 (ii) 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질을 포함하거나 이로 이루어진, 상기에 기재된 융합 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 및
b) 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물
을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 작제물은 상기에 기재된 바와 같이 제1 단백질과 제2 단백질 사이의, 또는 삼중 융합 단백질의 경우에, 이의 단백질 둘 사이 또는 세 단백질 사이의 링커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 개시내용에 따르면, 제1 및 제2 단백질, 또는 상기 제1 및 제2 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질은 트랜스진의 게놈, 특히 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 이의 단편을 코딩하는 트랜스진의 부위-특이적 삽입을 가능하게 하고/하거나 촉진한다.
일부 실시양태는 다음 중 하나를 포함하는 플라스미드 또는 벡터 (예컨대, 발현 벡터)에 관한 것이다:
- 제1 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 또는
- 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 또는
- 제1 단백질을 코딩하는 핵산 작제물 및 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 또는
- 융합 단백질 또는 삼중 융합 단백질을 코딩하는 핵산 작제물.
일부 실시양태에서, 플라스미드는 패키징 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 캡시드 단백질, 예를 들어 gag 및 pol을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 바이러스 외피(envelope) (외피 플라스미드)에 대한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레티드를 포함하는 제2 플라스미드; 및 LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 제3 플라스미드와 조합되며, 여기서 조합이 생산 세포주 (예를 들어, 진핵 세포, 원핵 세포 및/또는 세포주)에 도입될 때, LAMA2 트랜스진을 코딩하는 핵산 작제물 및 제1 단백질, 제2 단백질, 제1 및 제2 단백질 둘 다 또는 융합 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 바이러스 입자가 생성된다.
일부 실시양태에서, 플라스미드는 캡시드 단백질, 예를 들어 gag 및 pol(패키징 플라스미드, 여기서 패키징 플라스미드는 기능성 인테그라제를 결여함)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 플라스미드, 바이러스 외피 (외피 플라스미드)에 대한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레티드를 포함하는 제3 플라스미드 및 LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 제4 플라스미드와 조합되며, 여기서 조합이 생산 세포주 (예를 들어, 진핵 세포, 원핵 세포 및/또는 세포주)에 도입될 때, LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물 및 제1 단백질, 제2 단백질, 제1 및 제2 단백질 둘 다 또는 융합 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 바이러스 입자가 생성된다.
한 실시양태에서, 제1 단백질, 제2 단백질, 제1 및 제2 단백질 둘 다 또는 융합 단백질, 및/또는 LAMA2 트랜스진은 렌티바이러스 입자를 사용하여 세포로 전달된다.
한 실시양태에서, 핵산 작제물은 표적 핵산 서열에 결합하도록 조작된 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, LAMA2 트랜스진을 게놈에 삽입할 수 있게 하는 트랜스포사제를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열, 및 임의로, 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 링커를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질은 상기에 기재된 바와 같은, 징크 핑거 단백질 또는 Cas9 단백질 또는 이의 변이체이고/거나; 제2 단백질은 상기에 기재된 바와 같은, 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이다.
융합 단백질을 생성하기 위한 적합한 링커의 예는 상기에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 제1 단백질이 제2 단백질과 별도의 플라스미드로부터 발현되기 때문에 링커가 필요하지 않다.
한 실시양태에서, 링커를 사용하는 대신에, 제1 및/또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 각각 제1 및 제2 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이의 적어도 하나의 말단에 링커의 기능을 만드는 추가 뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 핵산 작제물은 DNA 또는 RNA 형태이다.
또한, 본 개시내용에 제공된 핵산 작제물 중 임의의 것을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 특히, 벡터는 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균 세포, 또는 조류 세포에서의 발현에 적합하다. 또한, 본 개시내용에 제공된 핵산 작제물 또는 벡터 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
본 발명에 따르면, 조성물은 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진 (본원에서 " LAMA2 트랜스진"이라고도 함)를 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 라미닌-α2 단백질, 특히 야생형 포유동물, 바람직하게는 인간, 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 임의의 핵산 서열일 수 있다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 LAMA2 야생형 유전자 (또는 이의 기능적 변이체 또는 단편), LAMA2 cDNA (또는 이의 기능적 변이체 또는 단편) 또는 LAMA2 미니유전자(minigene) (또는 이의 기능적 변이체 또는 단편)를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 전장 LAMA2 유전자를 포함한다.
라미닌-α2 쇄 단백질은 LAMA2 유전자 (유전자 ID: 3908, 2020년 11월 24일에 업데이트됨)에 의해 코딩되며, 이는 390-kDa 단백질로 전사되고 번역된다. 라미닌-α2는 이황화 결합에 의해 서로 결합된 3개의 서브유닛 (알파, 베타 및 감마)으로 구성된 라미닌-211 (또는 메로신)으로 공지된 헤테로삼량체, 십자형 분자의 구성요소이다.
인간, 돼지, 침팬지, 개, 소, 마우스, 토끼 또는 래트의 라미닌-α2 단백질을 제한 없이 포함하는 다수의 상이한 포유동물 라미닌-α2 단백질의 코딩 서열(coding sequence)은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 서열 데이터베이스에서 쉽게 찾을 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열은 폴리펩티드 서열을 기반으로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
특히, LAMA2 트랜스진은 인간 라미닌 서브유닛 α2 이소형(isoform) 전구체 (NCBI 참조: NP_000417, 2020년 10월 22일에 제출) 또는 라미닌 서브유닛 α2 이소형 b 전구체 (NCBI 참조: NP_001073291.2, 2020년 10월 24일에 제출)을 코딩할 수 있다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 바람직하게는 서열번호:　74를 가진, 인간 라미닌 서브유닛 α2 이소형 전구체를 코딩한다.
번역 후, 라미닌-α2 쇄는 전형적으로 서로 비공유결합으로 연관된 N-말단 단편 및 C-말단 단편으로 절단된다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 바람직하게는 라미닌 서브유닛 α2 이소형　X1 (NCBI 참조번:　XP_005267038.1, 서열번호:　116을 가짐), 라미닌 서브유닛 α2 이소형　X2 (NCBI 참조번호:　XP_011534122.1, 서열번호:　117을 가짐), 라미닌 서브유닛 α2 이소형　X3 (NCBI 참조번호:　XP_005267039.1, 서열번호:　118을 가짐), 라미닌 서브유닛 α2 이소형　X4 (NCBI 참조번호:　XP_016866340.1, 서열번호:　119를 가짐), 라미닌 서브유닛 α2 이소형　X5 (NCBI 참조번호:　XP_01686634.1, 서열번호:　120을 가진) 및 라미닌 서브유닛 α2 이소형　X6 (NCBI 참조번호:　XP_005267038.1, 서열번호:　121을 가짐)을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된 라미닌-α2 단백질의 상이한 인간 성숙 이소형을 코딩할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편" 또는 "기능적 단편"은 라미닌-α2 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 언급할 때 상기에 기재된 바와 같은 라미닌-α2 단백질로부터 유래된 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭하며 이는 여전히 전장 라미닌-α2 단백질의 활성을 유지하나 그 서열이 전장의 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 100% 동일하지는 않다. 기능적 단편은 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나, 동일한 수의 잔기를 가질 수 있고/있거나, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 기능적 단편은 단백질의 N-말단 말단부에 신호 펩티드를 포함하지 않는 성숙한 형태의 라미닌-α2 단백질을 지칭한다. 통상의 기술자는 예를 들어 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스에서 공개적으로 이용가능한 정보를 기반으로 하여, 신호 펩티드가 라미닌-α2 단백질의 어느 부분에 상응하는지 쉽게 결정할 수 있다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 서열번호: 75를 가진 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 서열번호: 82를 가진 합성 인트론을 포함하는 인간 LAMA2 미니유전자을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 합성 인트론은 서열번호: 75를 가진 코딩 서열의 위치 3925 및 3926에 있는 핵염기(nucleobase) 사이에 포함된다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 전장 라미닌-α2 단백질의 활성을 유지하는 기능적 라미닌-α2 단백질 변이체를 코딩하는 핵산 서열일 수 있다. 특히, 라미닌-α2 단백질 변이체는 이황화 결합에 의해 라미닌-211 β 및 γ 서브유닛에 결합하여 기능적인 십자형 라미닌-211 또는 라미닌-221을 형성하는 능력을 유지한다. 라미닌은 독립적인 네트워크를 형성하고 엔탁틴, 피브로넥틴, 및 페르레칸을 통해 IV형 콜라겐 네트워크와 연관된다. 그들은 또한 디스트로글리칸 당단백질 복합체 및 루테란 혈액형(blood group) 당단백질과 같은 인테그린 수용체 및 기타 원형질막 분자를 통해 세포막에 결합한다. 이들 상호작용을 통해, 라미닌은 세포 부착 및 분화, 세포 형상 및 이동, 조직 표현형의 유지, 및 조직 생존의 촉진에 결정적으로 기여한다.
바람직하게는, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체" 또는 "기능적 변이체"는 라미닌-α2 단백질과 관련하여, 야생형 라미닌-α2 단백질 서열에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
보다 바람직하게는, 용어 "변이체" 또는 "기능적 변이체"는 야생형 라미닌-α2 단백질 서열과 30, 25, 20, 15, 10 또는 5개 미만의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 한 실시양태에서 변이체는 하나 이상의 보존적 치환, 바람직하게는 15, 10 또는 5개 미만의 보존적 치환에 의해 야생형 라미닌-α2 단백질 서열과 상이하다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (메티오닌, 류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 소형 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군 내에 있다.
따라서 한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 서열번호: 75에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 라미닌-α2 단백질, 이의 변이체 또는 단편을 코딩하는 최적화된 서열을 포함할 수 있다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "최적화된"은 코돈 최적화를 지칭하며 전형적으로 인간에 대한 편향을 나타내는 코돈이 인간에 대한 편향을 나타내지 않는 동의 코돈(synonymous codon) (즉, 동일한 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈)으로 변경됨을 의미한다. 따라서, 코돈의 변화는 코딩된 단백질의 어떤 아미노산 변화도 발생시키지 않는다.
본 발명에 따르면, LAMA2 트랜스진은 핵산 작제물에 포함된다.
한 실시양태에서, 핵산 작제물은 세포에서 상기 트랜스진의 발현을 지향하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 LAMA2 트랜스진을 포함한다.
프로모터는 숙주 세포에 도입시 LAMA2 트랜스진의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 돌연변이, 말단절단, 및 하이브리드 프로모터를 포함한 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터, 바람직하게는 구성적 프로모터, 보다 바람직하게는 강한 구성적 프로모터일 수 있다
적합한 프로모터의 예는 바람직하게는 서열번호: 76을 가진 CMV 프로모터, 바람직하게는 서열번호: 77을 가진 CAG 프로모터, 바람직하게는 서열번호: 78을 가진 EF1-α 프로모터, 바람직하게는 서열번호:　79를 가진 SV-40, 및 바람직하게는 서열번호: 80을 가진, 하이브리드 알부민 인핸서-α1-항트립신 (EalbAAT) 간 특이적 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
대안적 실시양태에서, LAMA2 트랜스진은 또한 이의 발현이 통합 부위에서 또는 그 근처에서 내인성 프로모터에 의해 구동되는 이러한 방식으로 세포의 게놈으로 삽입될 수 있다. 특히, LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물은 트랜스진이 내인성 발현 제어를 갖기 위해, 내인성 LAMA2 또는 알부민 유전자와 같은 능동적으로 발현된 유전자의 인트론으로 통합될 때 유전자 발현을 보장하기 위해 스플라이스 수용체를 함유할 수 있다.
스플라이스 수용체 부위는 문헌 (Padgett et　al., 1988. Annu　Rev　Biochem. 55:1119-1150)과 같이 발현될 스플라이스 수용체 부위를 따르는 서열을 표적으로 하는 신호를 제공한다. 스플라이스 수용체 부위는 일반적으로 인트론 RNA 서열을 제거하기 위한 RNA 스플라이싱에 관여하는 뉴클레오티드 서열이다. 스플라이스 수용자 부위는 통상 인트론의 절제에 관여하며, 그 동안 스플라이스오좀(spliceosome)이라고 하는 RNA-단백질 복합체에 의해 결합되고, 절단된 다음에, 이미 절단된 스플라이스 공여체 부위에 연결된다. 스플라이스 수용체 서열은 관련 기술분야에 널리 공지 있고 이들이 스플라이싱을 매개하는 엑손과 인트론 사이의 위치에 있는 유전자로부터 쉽게 수득될 수 있다. 대안적으로, 스플라이스 수용체 부위는 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 스플라이스 수용체 (SA) 부위는 전형적으로 고도로 보존된 AG 디뉴클레오티드로 종료된다. 서열의 나머지 뉴클레오티드는 주로 시티딘 및/또는 티미딘이다. 한 실시양태에서, 스플라이스 수용체는 서열번호: 81의 서열을 갖는다.
제어 서열은 또한 적절한 전사 개시, 종결, 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, 코작 공통 서열(Kozak consensus sequence)); 및/또는 단백질 안정성을 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 매우 다수의 발현 제어 서열, 예를 들어 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적이 관련 기술분야에 공지되어 있고 LAMA2 트랜스진의 발현을 유도하기 위해 활용될 수 있다. 전형적으로, LAMA2 트랜스진은 전사 프로모터 및 전사 종결자에 작동가능하게 연결된다.
폴리(A) 신호는 전형적으로 a) 프리메신저(premessenger) RNA (pre-mRNA)의 3'-말단 세척(leavage) 및 폴리아데닐화 둘 다에 필요하고 하류 전사 종결을 촉진하는 것으로 밝혀진 공통 서열 AAUAAA, 및 b) AAAAAA를 폴리(A) 신호로 활용하는 효율을 제어하는 AAUAAA 서열의 상류 및 하류 추가 요소로 이루어진다. 포유동물 유전자에서 이들 모티프에는 상당한 가변성이 있다.
한 실시양태에서, 핵산 작제물 내의 폴리아데닐화 신호 서열은 포유동물 유전자 또는 바이러스 유전자의 폴리아데닐화 신호 서열이다. 적합한 폴리아데닐화 신호는 SV40 초기 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, HSV 티미딘 키나제 폴리아데닐화 신호, 프로타민 유전자 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 EIb 폴리아데닐화 신호, 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, PBGD 폴리아데닐화 신호, 뿐만 아니라 인실리코 설계된 폴리아데닐화 신호 (합성) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 서열번호:　83, 84 및 85를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리(A)이다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물은 또한 트랜스진 발현 수준을 증가시키고, 침묵을 피하고, 발현 가변성을 감소시키기 위해 절연체 요소를 포함한다.
절연체는 헤테로크로마틴의 전개 및 유전자의 침묵 (장벽 활성)을 방지하고 인핸서-차단 활성을 갖는 시스-작용 조절 서열의 복잡한 부류이다. 절연체는 전형적으로 길이가 300 bp 내지 2000 bp이다. CTCF 절연체, 집시(gypsy) 절연체 및 β-글로빈 유전자좌를 포함하여, 절연체의 많은 예가 있다.
한 실시예에서, 절연체 요소 서열은 핵산 작제물의 양 말단에 플랭킹한다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물은 서열번호:　86 및 87을 가진 절연체 요소를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 트랜스포사제는 ITR 사이의 요소의 절제 및 후속 재통합을 촉매하기 위해 트랜스포사제-결합 부위를 운반하는 역 말단 반복부 (ITR) 요소를 인식한다.
따라서, 특정한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진을 포함하는 상기 핵산 작제물은 트랜스포사제 결합 부위, 바람직하게는 서열번호: 88 및 89의 5'-ITR 및 3'-ITR을 운반하는 역 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된다.
한 실시양태에서, ITR 사이의 크기 증가는 LAMA2 트랜스진의 게놈 DNA로의 전달을 긍정적으로 조절한다.
한 실시양태에서, ITR 사이의 크기는 적어도 105 bp이다. 한 실시양태에서, ITR 사이의 크기는 적어도 200 bp이다. 한 실시양태에서, ITR 사이의 크기는 적어도 300 bp이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "적어도 300 bp"는 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 kb, 2 kb 또는 그 초과를 의미한다.
한 실시양태에서, LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물은 발현 벡터에 함유된다.
적절한 벡터의 예는 재조합 통합 또는 비통합 바이러스 벡터 및 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로부터 유래된 벡터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 미니써클 벡터 또는 도기 본 DNA 공여체 벡터이다. 바람직하게는, 벡터는 재조합 통합 또는 비통합 바이러스 벡터이다. 재조합 바이러스 벡터의 예는 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서 본 개시내용은 또한 상기에 기재된 바와 같이 LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물, 또는 상기 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 특히, 핵산 작제물 또는 발현 벡터는 "바이러스 벡터 입자"라고도 명명되는 "바이러스 입자"를 생성하기 위해 바이러스 캡시드에 패키징될 수 있다.
한 실시양태에서, 핵산 작제물 또는 발현 벡터는 "렌티바이러스 입자" 또는 "AAV 입자"를 생성하기 위해 렌티바이러스 또는 AAV-유래 캡시드에 패키징된다.
본 발명에 따르면, 제1 단백질은 표적 핵산 서열에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 서열" 또는 "표적 핵산 서열" 또는 "표적 부위"는 예를 들어 게놈에서 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 정의하는 서열이되, 단, 결합에 대한 충분한 조건이 존재한다.
상기 제1 단백질은 "표적 핵산 서열"로 불리는, 세포의 게놈 내의 임의의 선택 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위이다.
한 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 세포 게놈의 세이프 하버 유전자좌(safe harbor locus) 내에 있다. 한 실시양태에서, 표적 핵산 서열은 세포 게놈의 내인성 LAMA2 유전자 내에 있다. 특히, 제1 및/또는 제2 단백질은 세이프 하버 유전자좌 내에서 라미닌-α2 단백질을 코딩하는 트랜스진에 결합 및/또는 통합되도록 조작될 수 있다.
"세이프 하버 유전자좌"는 통합된 물질이 내인성 유전자 구조 또는 기능을 방해하지 않고 적절하게 발현될 수 있는 세포 게놈의 영역을 지칭한다. 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 (PPP1R12C의 인트론 1), HPRT, H11, hRosa26, 알부민 및 F-A 영역을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 세이프 하버 유전자좌는 편재하여 발현되는 유전자 및/또는 조직 특이적 발현 (예를 들어, 근육)을 가진 유전자의 엑손 또는 인트론일 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 PPP1R12C의 엑손 1, 인트론 1 또는 엑손 2, HPRT의 엑손 1, 인트론 1 또는 엑손 2, 및 hRosa26의 엑손 1, 인트론 1 또는 엑손 2, 알부민 유전자의 인트론 1으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 또한 내인성 유전자가 없고 게놈 구조 또는 기능을 교란시키지 않고 삽입된 트랜스진의 발현을 가능하게 하는 개방 염색질을 가진 게놈의 영역을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 단백질은 LAMA2 트랜스진이 세포 게놈 내의 내인성 LAMA2 유전자, 특히 내인성 LAMA2 유전자의 인트론 1에 결합하고 통합되도록 조작된다.
한 실시양태에서, 임의로 가이드 RNA와 조합된 제1 단백질은 서열번호: 90-97 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 핵산 서열에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 가이드 RNA를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "가이드 RNA", "gRNA" 또는 "단일 가이드 RNA"는 표적 핵산에 대한 gRNA/Cas 복합체의 특이적 표적화 또는 귀소를 촉진하는 핵산을 지칭한다.
특히, gRNA는 전이활성화 crRNA (tracrRNA) 및 crRNA를 포함하는 RNA 분자를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 가이드 RNA는 별도로 사용되거나 함께 융합될 수 있는 crRNA 및 tracrRNA에 상응한다. 표적 서열과 쌍을 형성하는 상보적 서열은 Cas 단백질을 모집하여 표적 서열에서 DNA에 결합하고 이를 절단한다.
한 실시양태에서, 가이드 RNA는 바람직하게는 서열번호: 90-97 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 서열의 일부에 상보적인 서열을 포함하도록 조작된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적 서열"은 표준 낮은 엄격한 조건 하에 폴리뉴클레오티드의 또 다른 부분에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 서열 (예를 들어, crRNA 또는 tracRNA의 일부)을 지칭한다. 바람직하게는, 서열은 가닥 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성, 즉 아데닌과 티민 (A-T) 뉴클레오티드 및 구아닌과 시토신 (G-C) 뉴클레오티드 사이의 고유 염기쌍형성에 의존하는 두 핵산 가닥 사이의 상보성에 따라 서로 상보적이다.
본 개시내용은 또한 LAMA2 트랜스진을 세포의 게놈 내의 표적 핵산 서열로 통합하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)이 표적 핵산 서열을 절단하고 상기 표적 핵산 내에 LAMA2 트랜스진을 통합하도록 상기에 기재된 바와 같은 조성물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 세포에 다음을 도입하는 것을 포함한다: 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서) 또는 이를 코딩하는 하나 또는 여러 핵산 작제물; 가이드 RNA; 및 라미닌-α2 단백질, 이의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물.
이들 요소는 상기에 기재된 바와 같이 상기 요소를 코딩하는 핵산 작제물(들) 또는 발현 벡터(들)를 세포 내로 도입한 결과로서 세포내 계내(in situ)에서 합성될 수 있다. 대안적으로, 상기 요소는 세포 외부에서 생산된 다음에 내부에 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기에 기재된 바와 같은 LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물, 발현 벡터 또는 바이러스 입자가 세포 내로 도입된다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 단백질을 코딩하는 하나 또는 수개의 폴리뉴클레오티드 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)는 예를 들어 전기천공법 또는 지질 나노입자에 의해 세포에 직접 도입되는 mRNA 형태로 형질감염될 수 있다.
한 실시양태에서, 가이드 RNA는 또한 세포 외부에서 생산된 다음에, 예를 들어 전기천공법 또는 지질 나노입자에 의해 내부에 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)은 세포 내로 단독으로 도입되거나 가이드 RNA와 사전-복합체화될 수 있다.
한 실시양태에서, 가이드 RNA 및/또는 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)은 핵산 작제물 또는 발현 벡터에 의해 코딩된다.
본 발명에 따른 생성물 (단백질 및 핵산)은 비제한적 예로서 리포솜 전달 수단, 중합체 담체, 화학적 담체, 리포플렉스, 폴리플렉스, 덴드리머, 나노입자, 에멀젼, 천연 엔도사이토시스 또는 식균작용 경로에 의해, 뿐만 아니라 물리적 방법 예컨대 전기천공법에 의해 세포 또는 세포하 구획 내부로 전달될 수 있다.
상기 핵산 작제물 또는 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있으며, 비제한적 예로서, 핵산 작제물 또는 발현 벡터가 세포 게놈으로 통합되는 안정한 형질전환 방법, 핵산 작제물 또는 발현 벡터가 세포 및 바이러스-매개 방법의 게놈으로 통합되지 않는 일시적 형질전환 방법을 포함한다. 예를 들어, 일시적 형질전환 방법은 예를 들어 미세주입, 전기천공법 또는 유전자 총법(particle bombardment)을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 분자 또는 핵산 작제물 또는 발현 벡터는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 형질감염, 전기천공법, 미세주입, 바이오리스틱(biolistic), 바이러스 감염 또는 리포솜-매개 형질감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공지 기술을 사용하여 세포 내로 전달될 수 있다.
한 실시양태에서, RNA, 바람직하게는 제1 및 제2 단백질을 코딩하는 가이드 RNA 또는 mRNA (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)는 예를 들어 시험관내 전사에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다. 이어서 RNA는 전기천공에 의해 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Almsbak et　al., 2011. Cytotherapy. 13(5):629-640; Rabinovich et　al., 2009. Hum　Gene　Ther. 20(1):51-61]; 및 [Beatty et　al., 2013. Cancer　Immunol　Res. 2(2):112-20]에 기재된 바와 같이).
대안적으로, RNA는 리포솜 또는 양이온 분자 등과 같은 다른 수단에 의해 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포 내로 도입된 핵산 작제물(들) 또는 벡터(들)은 에피솜으로(episomally) 발현될 수 있거나 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)을 코딩하는 가이드 RNA 및 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 및/또는 LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물은 나노입자, 바람직하게는 지질 나노입자 (LNP)에 의해 세포 또는 환자에게 전달될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 지질 또는 지질의 조합을 사용하여 LNP를 생성할 수 있다. LNP를 생산하는 데 사용되는 지질의 예는, DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-콜레르테롤, DOTAP-콜레르테롤, GAP-DMORIE-DPyPE, 및 GL67A-DOPE-DMPE-폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. 양이온성 지질의 예는, 98N12-5, C12-200, DLin-KC2- DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1, 및 7C1이다. 중성 지질의 예는, DPSC, DPPC, POPC, DOPE, 및 SM이다. PEG-변형 지질의 예는, PEG-DMG, PEG- CerC14, 및 PEG-CerC20이다.
한 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 시험관내 방법은 세포 배양에서 수행된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기에 기재된 방법에 의해 수득가능하거나 수득된 분리된 조작된 세포에 관한 것이다. 상기 조작된 세포는 상기에 기재된 바와 같이 적어도 라미닌-α2 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 조작된 세포는 상기에 기재된 바와 같이 세포에서 상기 트랜스진의 발현을 지향하는 제어 서열 중 임의의 하나 또는 여러 개를 포함한, 라미닌-α2를 코딩하는 적어도 하나의 트랜스진을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 조작된 세포는 상기에 기재된 바와 같은 플랭킹 ITR을 포함한, 라미닌-α2를 코딩하는 적어도 하나의 트랜스진을 포함한다.
한 실시양태에서, ITR 간 크기는 적어도 105 bp, 적어도 200 bp, 적어도 300 bp 또는 초과이다.
본 개시내용의 조작된 세포는 생체외 유전자 요법 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상기에 기재된 바와 같은, 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서), 가이드 RNA 및 LAMA2 트랜스진, 또는 핵산 작제물(들), 발현 벡터(들) 또는 바이러스 입자(들)이, 세포에 도입된다. 상기 단리된 세포는 후속적으로 환자 또는 대상체에게 이식될 수 있다. 이 이식 단계는 관련 기술분야에 공지된 임의의 이식 방법을 사용하여 완수될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는 환자의 혈액에 직접 주입되거나 원하는 근육에 주입될 수 있으며, 그렇지 않으면 환자에게 투여될 수 있다. 이식된 세포는 자가, 동종 또는 이종 기원을 가질 수 있다. 특히, 상기 세포는 공여체 또는 환자의 골격근, 평활근 또는 심근으로부터 단리된 근세포이거나 골수 세포 또는 말초 혈액으로부터의 간엽 줄기 세포일 수 있다. 임상 사용을 위해, 세포 단리는 일반적으로 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준(Good Manufacturing Practices) (GMP) 조건 하에 수행될 것이다.
적합한 세포는 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 세포는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포이고, 이들은 인간, 비인간 영장류 예컨대 유인원; 침팬지; 원숭이, 및 오랑우탄, 개와 고양이를 포함한 길들인 동물(domesticated animal), 뿐만 아니라 말, 소, 돼지, 양, 및 염소와 같은 가축, 또는 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 햄스터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 기타 포유동물 종 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이식될 환자 또는 대상체에 따라 보다 적절한 세포를 선택할 것이다.
상기 조작된 세포는 또한 근육 세포일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근육"은 심근 (즉, 심장) 및 골격근을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근육 세포"는 근세포, 근관, 근모세포, 및/또는 위성 세포를 지칭한다.
상기 조작된 세포는 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포와 같은 자기-재생 및 다능성 특성을 갖는 세포일 수 있다. 적합한 줄기 세포는 또한 예를 들어 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 줄기 세포는 바람직하게는 중간엽 줄기 세포이다. 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 조골세포, 연골세포, 지방세포, 또는 근육세포 중 적어도 하나로 분화할 수 있으며 임의의 유형의 조직으로부터 단리될 수 있다. 일반적으로 MSC는 골수, 지방 조직, 제대, 또는 말초 혈액으로부터 단리될 것이다. 이를 수득하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 유도 만능 줄기 세포 (iPS 세포 또는 iPSC라고도 함)는 성체 세포로부터 직접 생성될 수 있는 일종의 만능 줄기 세포이다. 야마나카(Yamanaka) 등은 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자를 마우스 및 인간 섬유모세포로 전달하고 세포가 유전자를 발현하도록 강제하여 iPS 세포를 유도하였다 (WO 2007/069666). 톰슨(Thomson) 등은 후속적으로 Klf4 및 c-Myc 대신에 Nanog 및 Lin28을 사용하여 인간 iPS 세포를 생산하였다 (WO 2008/118820). 특정 실시양태에서, 세포는 근모세포이다. 근모세포는 줄기 세포, 예를 들어, 근이영양증과 같은 근육 장애를 가진 환자로부터 유래된 iPSC를 포함하는 iPSC로부터 유래될 수 있다.
본 개시내용에 따른 조성물은 바람직하게는 본 발명에 따른 생성물 예컨대 상기 LAMA2 트랜스진을 코딩하는 핵산 작제물, 제1 및 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서), 상기 생성물을 코딩하는 가이드 RNA, 발현 벡터 또는 바이러스 입자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 작제물의 치료학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 사용된다.
본 개시내용과 관련하여, 치료학적 유효량은 그러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태의 진행을 역전, 완화 또는 억제하거나 또는 그러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 진행을 역전, 완화 또는 억제하기에 충분한 용량을 지칭한다.
유효 용량은 의료 분야의 통상의 기술자가 인정할, 사용되는 조성물, 투여 경로, 성별, 연령 및 체중과 같은 고려되는 개체의 신체적 특성, 병용 약물, 및 기타 요인과 같은 요인에 따라 결정되고 조정된다.
본 개시내용의 다양한 실시양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 비히클을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 포유동물, 특히 인간에게 적절하게 투여될 때 부작용, 알레르기 또는 기타 바람직하지 않은 반응을 초래하지 않는 비히클을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 비독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 보조 제형(formulation auxiliary)을 지칭한다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약제학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균, 식염수 (인산일나트륨 또는 이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있으며, 이는 첨가 시 멸균수나 생리식염수의 경우에, 주사액의 구성이 가능하다.
주사 사용에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 현탁액을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 세포와 호환되는 첨가제를 포함할 수 있다. 용액 또는 현탁액은 비-바이러스 벡터, 바이러스-벡터 및 나노입자와 호환되고 성분이 표적 세포로 들어가는 것을 방해하지 않는 첨가제를 포함할 수 있다. 모든 경우에, 형태는 무균 상태여야 하며 쉽게 주사할 수 있는 정도의 유동성이 있어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 적절한 용액의 예는 완충제, 예컨대 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 링거 락테이트이다.
본 개시내용에 따른 조성물은 요법, 특히 LAMA2-관련 근이영양증의 치료를 위해 사용된다.
LAMA2-관련 근이영양증은 운동에 사용되는 근육 (골격근)의 쇠약(weakness) 및 소모(wasting) (위축)를 유발하는 장애이다. 이 병태는 중증의, 조기-발병 유형에서 보다 경미한 후기-발병 형태에 이르기까지 중증도가 다양하다.
조기-발병 LAMA2-관련 근이영양증은 출생시 또는 생후 처음 몇 개월 이내에 명백하다. 이는 선천성 근이영양증이라고 하는 근육 장애 부류의 일부로 간주되며 때때로 선천성 근이영양증 1A형라고 한다. 영향을 받은 영아는 중증 근육 쇠약, 근육 긴장도의 부족 (저긴장증), 자발적인 움직임이 거의 없고, 관절 기형 (구축(contracture))을 가질 수 있다. 얼굴과 목의 근육이 쇠약해지면 수유가 어려워지고 예상 속도로 성장 및 체중 증가가 불가능할 수 있다. 가슴의 근육이 쇠약해질 때 발생하는 호흡 부전은 약한 울음과 호흡 문제를 유발하며 이는 빈번하고, 잠재적으로 생명을 위협하는 폐 감염을 야기할 수 있다.
영향을 받은 소아가 성장함에 따라, 이들은 종종 척추의 좌우 만곡(side-to-side curvature) (척추측만증(scoliosis))과 등의 안쪽 만곡 (전만증(lordosis))이 비정상적으로 점차 악화된다. 조기-발병 LAMA2-관련 근이영양증을 가진 소아는 종종 걷는 능력이 발달하지 않는다. 언어 장애는 안면 근육의 쇠약과 혀가 커진 결과일 수 있다. 조기-발병 LAMA2-관련 근이영양증을 가진 개체의 약 1/3에서 발작(Seizure)이 발생하며; 드물게는, 이러한 형태의 장애에서 심장 합병증이 발생한다.
후기-발병 LAMA2-관련 근이영양증의 증상은 어린 시절이나 성인기에 분명해지며 사지-거들(limb-girdle) 근이영양증으로 분류되는 근육 장애의 그룹의 증상과 유사하다. 후기-발병 LAMA2-관련 근이영양증에서, 가장 영향을 받는 근육은 신체에 가장 가까운 근육 (근위 근육), 구체적으로 어깨, 상완, 골반 부위, 및 허벅지의 근육이다. 후기-발병 LAMA2-관련 근이영양증을 가진 소아는 때때로 걷기와 같은 운동 기술의 발달이 지연되나, 일반적으로 도움 없이 걸을 수 있는 능력을 달성한다. 시간이 지남에 따라, 이들은 등의 경직, 관절 구축, 척추측만증 및 호흡 문제가 발생할 수 있다. 그러나 영향을 받은 대부분의 개체는 걷고 계단을 오를 수 있는 능력을 유지한다.
본 개시내용은 또한 환자에게 치료학적 유효량의 상기에 기재된 바와 같은 조성물, 조작된 세포 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 본 개시내용에 따른LAMA2-관련 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다.
"치료학적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하고 쇠약 및 골격근의 위축과 같은 LAMA2-관련 근이영양증의 적어도 하나 이상의 징후 또는 증상을 예방, 지연 또는 역전시키는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료학적 유효량의 본 발명의 생성물 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 생성물 또는 약제학적 조성물이 개체에서 원하는 반응을 도출하는 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 전형적으로 생성물 또는 약제학적 조성물의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 더 중요한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "개체"는 포유동물을 나타낸다. 바람직하게는, 본 개시내용에 따른 환자 또는 개체는 인간이다.
본 개시내용과 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 용어가 적용되는 LAMA2-관련 근이영양증 또는 병태의 진행을 역전, 완화 또는 억제하는 것을 의미하거나, 그러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 진행을 역전, 완화 또는 억제하는 것, 특히 골격근의 쇠약 및 위축의 감소 및/또는 골격근 기능의 개선을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 환자에서 치료 효과를 유도하기에 효과적인 투여량 및 기간 동안 공지된 절차에 따라 투여된다.
투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 전신 투여는 바람직하게는 비경구 예컨대 피하 (SC), 근육내 (IM), 혈관내 예컨대 정맥내 (IV) 또는 동맥내; 복강내 (IP); 피내 (ID), 간질 등이다. 투여는 예를 들어 주사 또는 관류에 의한 것일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 투여는 비경구, 바람직하게는 혈관내 예컨대 정맥내 (IV) 또는 동맥내이다. 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있는 종래의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같이 개시된 방법을 실시하기 위한 키트가 본 개시내용에 의해 제공된다. 키트는 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서) 또는 이를 코딩하는 핵산 작제물, 및 본원에 기재된 바와 같은 LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 키트는 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)을 코딩하는 핵산 작제물 및 본원에 기재된 바와 같은 LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물을 함유하는 렌티바이러스 입자를 함유할 수 있다.
대상 키트는 대상 방법을 실시하기 위해 키트의 구성요소를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 대상 방법을 실행하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매질에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재 상에 인쇄될 수 있다. 이와 같이, 설명서는 패키지 삽입물로서 키트에, 키트 또는 이의 구성요소의 용기의 라벨링 등 (즉, 패키징 또는 서브패키징과 연관됨) 등에 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독가능 저장 매체에 존재하는 전자 저장 데이터 파일, 예를 들어, CD-ROM, 디스크 등으로서 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 예를 들어 인터넷을 통해 원격 공급원으로부터 설명서를 얻기 위한 수단이 제공된다. 이 실시양태의 예는 설명서를 볼 수 있고/거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 이 수단은 적합한 기판에 기록된다.
본 개시내용은 전형적으로 다음을 포함하는 조성물 또는 키트에 관한 것이다:
(i) 본원에 정의된 바와 같은 제1 단백질, 또는 상기 제1 단백질을 코딩하는 핵산,
(ii) 본원에 정의된 바와 같은 제2 단백질, 또는 상기 제2 단백질을 코딩하는 핵산, 및
(iii) LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물
본 개시내용은 또한 다음을 포함하는 조성물 또는 키트에 관한 것이다:
(i) 본원에 정의된 바와 같은 융합 단백질, 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산,
(ii) LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 작제물
을 포함하는 제1 조성물.
한 실시양태에서, 조성물 또는 키트는 미니써클, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 특히 비통합 바이러스 벡터, 예를 들어 비통합 렌티바이러스 벡터에 외인성 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 조성물 또는 키트는 나노입자에 포함된다.
한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서)은 RNA, DNA 또는 단백질의 형태이고, LAMA2 트랜스진을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 전달 방법에 따라 RNA 또는 DNA의 형태이다. 특히, 외인성 핵산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 형태이다.
한 실시양태에서, 조성물 또는 키트는 바이러스가 없고 패키징 벡터는 나노입자, 예를 들어 중합체 또는 지질 나노입자이다. 패키징 벡터는 또한 조성물의 요소에 결합되는 담체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 입자에 함유된다.
한 실시양태에서, 조성물 또는 키트는 (a) RNA 형태로 별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서 (예를 들어, Cas9 및 트랜스포사제를 포함함) 제1 및 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물, (b) 필요한 경우 가이드 RNA (예를 들어, 별도의 직계(lineal) 단일 가닥 RNA 분자), 및 (c) 패키징 벡터 내에 함유되거나 그에 결합된, DNA 형태 (예를 들어, 벡터)로 삽입을 위해 LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 (a) 단백질 형태로 본원에 기재된 (예를 들어, Cas9 및 트랜스포사제를 포함함) 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서), (b) 필요한 경우 가이드 RNA (예를 들어, 별도의 직계 단일 가닥 RNA 분자로서), 여기서 융합 단백질 및 가이드 RNA는 리보핵 단백질 복합체 (RNP)를 형성함, 및 (c) 패키징 벡터 내에 함유되거나 그에 결합된, DNA 형태 (예를 들어, 벡터)로 삽입을 위해 LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 (a) DNA 형태로 별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서 (예를 들어, Cas9 및 트랜스포사제를 포함함) 제1 및 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물, (b) 필요한 경우 가이드 RNA (예를 들어, 별도의 직계 RNA 분자로서 또는 벡터 내 DNA로서), 및 (c) 패키징 벡터 내에 함유되거나 그에 결합된, DNA 형태 (예를 들어, 벡터)로 삽입을 위해 LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 (a) 단백질 형태로 본원에 기재된 (예를 들어, Cas9 및 트랜스포사제를 포함함) 제1 및 제2 단백질 (별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서), (b) 필요한 경우 가이드 RNA (예를 들어, 융합 단백질과 복합체를 형성하는 별도의 RNA 분자로서), 및 (c) 패키징 벡터에 함유되거나 결합된 삽입용 LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 패키징 벡터는 렌티바이러스 입자이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 단백질은 별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서 gag-pol 또는 VPR (바이러스 단백질 R)에 의해 렌티바이러스 캡시드에 결합된다. 일부 실시양태에서, LAMA2 트랜스진을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 인테그라제의 페이로드로서 RNA 형태이다.
한 실시양태에서, 제1 단백질이 ZFP인 경우 가이드 RNA가 필요하지 않을 수 있다.
본 개시내용은 전형적으로 키트로서,
(i) 별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서의 제1 및 제2 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산, 그리고 여기서 상기 제1 및 제2 단백질은 제1 가이드된 RNA 닉카제 Cas9의 아미노산 서열, 전형적으로 서열번호: 65를 가진 SpCas9 닉카제 및 변형된 과활성 PiggyBac를 포함함, 및,
(ii) 제1 가이드된 RNA 핵산
을 포함하는 제1 조성물,
(iii) 별도로 또는 상기에 기재된 융합 단백질의 일부로서의 제1 및 제2 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산, 그리고 여기서 상기 제1 및 제2 단백질은 제2 가이드된 RNA 닉카제 Cas9의 아미노산 서열, 전형적으로 서열번호: 66을 가진 SpCas9 닉카제 및 변형된 과활성 Piggybac를 포함함,
(iv) 제2 가이드된 RNA 핵산
을 포함하는 제2 조성물,
및 LAMA2 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물
을 포함하며;
여기서 제1 및 제2 단백질 각각 (제1 및 제2 조성물 각각 내)은 이종이량체화할 수 있고, 게놈 DNA 영역의 인접 부위에서 제1 및 제2 가이드된 RNA에 의해 결정된 이중 커트를 만들 수 있고, 임의로 인접 부위 사이에 상기 핵산을 삽입할 수 있는, 키트에 관한 것이다.
일부 추가 실시양태가 이후에 개시된다.
E1: a) 바람직하게는 알부민의 인트론 1; Lama2 또는 Rosa 26 유전자좌의 인트론 1 내에 포함된, 표적 핵산 서열에 결합할 수 있는 부위-특이적 DNA 결합 단백질로 이루어진 제1 단백질 및 트랜스포사제로 이루어진 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질; 또는 핵산 작제물, 바람직하게는 상기 융합 단백질을 코딩하는 mRNA, b) 라미닌-α2 단백질, 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 조성물.
E2:　트랜스진은 서열번호:　74의 라미닌-α2 단백질을 코딩한다.
E3: b)의 핵산 작제물은 서열번호: 76의 CMV 프로모터, 서열번호: 77의 CAG 프로모터, 서열번호: 78의 EF1-알파 프로모터, 서열번호:　79의 SV-40 프로모터 및 서열번호: 80의 EalbAAT 프로모터 또는 서열번호: 81의 스플라이스 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함한다.
E4:　b)의 핵산 작제물은 바람직하게는 서열번호: 83-85로 이루어진 군으로부터 선택된, 폴리(A) 신호 서열을 포함한다.
E5: b)의 핵산 작제물은 바람직하게는 서열번호: 86-87로 이루어진 군으로부터 선택된, 절연체 요소를 또한 포함할 수 있다.
E6:　b)의 핵산 작제물은 역 말단 반복부 (ITR)에 의해, 바람직하게는 서열번호:　88 및 89의 5'-ITR 및 3'-ITR에 의해 플랭킹된다.
E7:　b)의 핵산 작제물은 플라스미드 벡터, 미니써클 벡터, 도기 본 DNA 공여체 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터에 포함될 수 있다.
E8:　부위-특이적 DNA 결합 단백질은 Cas 단백질을 포함하는 RNA-가이드된 뉴클레아제이고 조성물은 세포 게놈의 특이적 부위에 상기 LAMA2 트랜스진을 통합하기 위한 표적 핵산 서열에 대한 상보적 서열을 포함하는 가이드 RNA를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 Cas 단백질은 에스. 피오게네스 Cas 9 단백질이다.
E9:　가이드 RNA는 서열번호: 90-97로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 상보적인 서열을 포함한다.
E10: 트랜스포사제는 변형된 과활성 Piggybac 트랜스포사제 또는 슬리피 뷰티 트랜스포사제, 바람직하게는 변형되지 않은 과활성 Piggybac과 비교하여 절제 활성을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 및 변형되지 않은 과활성 Piggybac과 비교하여 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제.
E11:　과활성 PiggyBac 트랜스포사제는 M194, R245, G325, R372, K375, R376, E377, E380, D450 및 S573으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며 바람직하게는 아미노산 D450, R372 및 K375의 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이며, 상기 위치 번호는 서열번호:　9의 변형되지 않은 과활성 Piggybac의 아미노산 번호에 상응한다.
E12:　트랜스포사제는 바람직하게는 링커, 바람직하게는 GGS, XTEN 또는 FOKI를 포함하는 펩티드 링커, 보다 바람직하게는 서열번호:　53의 XTEN에 의해 상기 부위-특이적 DNA 결합 단백질에 N-말단으로 융합된다.
E13:　조성물이 나노입자 내에 패키징된다.
E14: 상기에 기재된 바와 같은 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, LAMA2 트랜스진을 세포의 게놈 내의 표적 핵산 서열로 통합하기 위한 시험관내 방법 및 이의 게놈 내에 통합된 LAMA2 트랜스진을 포함하는 상기 방법에 의해 수득가능한 조작된 세포.
E15: 상기에 기재된 바와 같은 조성물 또는 조작된 세포를, 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
E16: 이를 필요로 하는 대상체에서 요법에 사용하기 위한, 특히 메로신-결핍 선천성 근이영양증 1A형 (MDC1A)의 치료에 사용하기 위한 조성물, 조작된 세포 또는 약제학적 조성물.
본 발명은 이제 첨부된 도면을 참조하여, 제한적이지 않은 하기 실시예로 예시될 것이다.
도 1: MCD1A의 Lama2 동물 모델에서 치료 유전자 교체를 위해 생산된 상이한 Lama2 페이로드의 표시.
도 2: GFP 또는 Lama2 로드된 렌티바이러스로 감염된 Hek293T 세포 상의 바이러스 카피 수. 카피 수의 qPCR 추정치를 기반으로 하여 역가를 계산하였다. Lama2로 인한 증가된 카고 크기는 바이러스 생산 효율을 백배 감소시킨다.
도 3: 순환 백혈구(A) 및 침윤된 근육 세포 (B)의 FACS 분석; 이식 4주 후 마우스로부터 단리 후. 빈 렌티바이러스 형질도입과 GFP 로드된 바이러스의 비교가 표시된다.
도 4: MCD1A 모델을 치료하기 위해 생체외 렌티바이러스 매개 Lama2 유전자를 골수 유래 세포로 전달하기 위한 실험 설계 및 워크플로우.
도 5: Lama2 발현 골수 유래 세포로 이식한 후 6주 및 12주 후에 처리 및 비처리 MCD1A 모델 대 야생형 동물의 상대적 강도 (A). 동일한 동물에서 처리 후 근력 증가 (B). 두 경우 모두에서, 결과는 그립 강도(grip strength) 검정의 분석을 나타냈다.
도 6: 시간 경과에 따른 처리 및 비처리 MCD1A 모델 대 야생형 동물에 대한 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선.
도 7: MCD1A 모델을 치료하기 위해 간 세포로의 생체내, 무바이러스(viral free), 트랜스포사제 매개 Lama2 유전자 전달을 위한 실험 설계 및 워크플로우.
도 8: 트랜스진 카피 수 (A; C) 및 트랜스진 발현 (B; D); 간 세포에서 처리 4주 후 각각 qPCR 및 RT-qPCR에 의해 측정됨. 과활성 PiggyBac에 의해 안정적으로 통합된 RFP 유전자 리포터의 데이터 (A; B); 및 조작된 PiggyBac에 융합된 프로그래밍 가능한 트랜스포사제 Cas9에 의해 안정적으로 통합된 Lama2 유전자 (C; D)가 표시된다.
도 9: 안정적인 발현을 위한 삽입 기계의 유무에 관계없이 공동-형질감염된, MDC1A 모델을 Lama2로 처리한 후 1주 및 4주 후 순환 혈청에서 라미닌의 존재에 대한 Elisa 검정.
도 10: (A) RFP 트랜스포존 단독 (에피솜(episomal)) 또는 생체내 JetPEI 시약과 함께 전달된 hyPB 또는 FICAT R372A_K375A_D450N mRNA와 함께 마우스 게놈에서 Rosa26 세이프 하버를 표적화하는 데 사용되었다. 간에서 RFP 트랜스진의 상대 카피 수를 반정량적 qPCR에 의해 측정하고 Tfrc 유전자 (이배체 게놈)의 상대적 이중 카피로 정규화하였다. (B) 미니써클 루시퍼라제 트랜스포존의 간 통합. 미니써클 루시퍼라제 트랜스포존, Rosa26 유전자좌를 표적으로 하는 sgRNA 및 FiCAT (Cas9-hyPB R372A_K375A_D450N) mRNA를 유체역학적 주입에 의해 전달하고 루시퍼라제 신호를 모니터링하였다. (C) 간 게놈 DNA에서 트랜스포존 3' ITR과 Rosa26 유전자좌 사이의 접합 PCR(Junction PCR). 마우스에 FiCAT R372A_K375A_D450N 플라스미드 DNA 또는 mRNA, Rosa26 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA 및 미니써클 트랜스포존 GFP 페이로드를 유체역학적으로 주입하고 주입 후 5주 후에 희생시켰다. 게놈+ 가닥 통합을 증폭시키는 PCR을 수행하였다. n = 2-3 동물/조건, 숫자는 상이한 개체에 상응한다. FiCAT mRNA 또는 pDNA로 처리된 마우스의 66%가 표적화 삽입을 나타낸다. FICAT에서 검출된 밴드(band)의 크기는 증폭된 삽입의 예상 크기에 상응한다. 배경으로 간주되는 에피솜 샘플에서 더 높은 크기의 밴드가 검출된다.
도 11: (a) C2C12 세포를 RFP 트랜스포존 단독 (에피솜)으로 형질도입하거나, FiCAT R372A_K375A_D450N 및 Lama2 유전자를 표적으로 하는 gRNA (스페이서 271.1)와 조합하여, 형질도입 후 2주 동안 RFP 양성 세포를 모니터링하였다. n = 2 기술 복제의 평균 ± SD가 플롯되었다. n = 3의 대표 이미지. (b) c2c12 게놈에서 검출된 삽입을 나타내는 카리오플롯(Karyoplot). (c) 3' ITR과 Lama2 유전자좌 사이의 접합 PCR을 FiCAT (3, 4)와 에피솜(1, 2) 처리된 농축화된(enriched) 집단을 비교하여 + 가닥 (1, 3) 및 - 가닥 (2, 4) 페이로드 삽입에서 표시된다 (아래쪽 패널). n = 3의 대표 이미지. (d) 온-타깃(on-target) 접합부 (Lama2 부위)에서의 커버리지(Coverage).
도 12: 300 bp ITR 간 크기의 삽입과 관련하여, 리포터 세포주의 AAVS1 부위에 ½ GFP 트랜스포존의 표적 삽입. 105 bp, 200 bp 및 300 bp의 ITR 간 크기는 과활성 PiggyBac (hyPB) R372A_K375A_D450N (Cas9-PBx3) hyPB R372A_K375A_D450N (Cas9-PBx3-PBx3)의 이량체에 융합된 Cas9와 함께 ½ GFP의 삽입에 대해 시험되었다.
도 13. 프로그래밍 가능한 트랜스포사제를 상이한 Cas 변이체, 예컨대 CasX, CjCas9 Cpf1 또는 SaCas9로 조작할 수 있으며, 이들 중 일부는 SpCas9와 같이 표적 부위에서 프로그래밍 가능한 삽입의 면에서 유사한 결과를 달성하였다. 시험된 Cas 변이체 각각은 3개의 독립적인 gRNA를 가진 분할(split) GFP 리포터 세포주의 특이적 표적 영역을 표적으로 하였다.
도 14. 네 가지 상이한 뉴클레아제 단백질을 사용한 FiCAT R372A-K375A-D450N의 프로그래밍 가능한 삽입 활성. SpCas9는 gRNA-TRAC-1 단독으로 프로그래밍 가능한 삽입을 위한 대조군으로서 사용된다 (좌측). 각각의 뉴클레아제는 ½ GFP 리포터 세포주에 표적 삽입을 위해 3개의 독립적인 gRNA (1-3)와 함께 사용되었다.
도 15. (a) CasX (좌측) 및 Cpf1 (중간)에 의한 편집 활동. (b) SaCas9 (좌측), CjCas9 (중간)에 의한 편집 활동. indels +/- SD를 가진 판독의 평균 %는 2개의 기술적 반복, N=3 생물학적 복제의 대표 이미지에 대해 표시된다. TRAC-1 부위를 표적으로 하는 SpCas9는 참조용으로 사용되었다 (우측).
도 16. 프로그래밍 가능한 트랜스포사제는 2개의 hyPB 도메인과 Cas9 뉴클레아제의 이량체 폴리펩티드로 조작되어, Cas9-hyPB와 비교하여 더 양호한 프로그래밍 가능한 삽입을 발생시킬 수 있다. 분할 GFP 리포터 세포주는 분할 GFP 트랜스포존의 표적 부위로의 프로그래밍 가능한 삽입에 사용하였다. hyPB R372A-K375A-D450N의 돌연변이체는 Cas9에 대한 단량체 또는 이량체 융합에 사용되었다. 조건: 1-삽입 기구(insertion machinery)로서 hyPB만을 사용하는 음성 대조군; 2: pcDNA 발현 벡터에서 Cas9-hyPB R372A-K375A-D450N의 양성 대조군; 3: 렌티바이러스 발현 벡터에서 Cas9-hyPB R372A-K375A-D450N의 양성 대조군; 4: C-말단에서 hyPB R372A-K375A-D450N의 2개의 단위에 융합된 Cas9 뉴클레아제; 5: 하나는 C-말단에 있고 다른 하나는 N-말단에 있는 hyPB R372A-K375A-D450N의 2개의 단위에 융합된 Cas9 뉴클레아제.
도 17. 라이브러리로부터 최상의 돌연변이체 조합을 선택할 수 있도록 프로그래밍 가능한 전위가 발생한 세포 선택의 수개의 주기. 우리는 Cas9에 융합될 때 Cas9-hyPB R372A-K375A-D450N보다 더 양호한 농축화(enrichment) 및 프로그래밍 가능한 삽입 용량을 가진 수개의 돌연변이체를 확인하였다.
도 18. 선택 주기에 따라 온-타깃 효율이 증가한다. 각각의 주기로부터 선택된 벌크(Bulk) 변이체는 AAVS1 및 ½ GFP 트랜스포존을 표적으로 하는 gRNA로 리포터 세포주에 공동-형질감염되었다. 플라스미드의 수량은 클로닝 효율을 위해 정규화하기 위해 PB 카피 수에 의해 교정되었다.
도 19. (A) 상위로 선택된 후보의 온-타깃 효율. 마지막 주기로부터 선택된 96개의 무작위 클론 중 가장 높은 온-타깃 활성을 기준으로 하여 6개의 개별 후보가 선택되었다. 개별 온-타깃 활성을 Cas9-hyPB R372A-K375A-D450N과 비교하였다. (B) 상위 온-타깃 활성 변이체에서 우세한 PB 잔기를 나타내는 로고.
도 20. Cas9 및 단일 gRNA (gRNA-TCR1 또는 AAVS1-3)에 의해 또는 닉카제 Cas9 및 인접 위치 (gRNA-TCR1 및 AAVS1-3)에서 표적화하는 2개의 gRNA, 및 변형된 hyPB (돌연변이체 R372A-K375A-D405N)에 대한 융합으로 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인 (ZnF)에 의한 이중 가닥 파단(break)은 표적 삽입을 발생시킨다. 효율적인 온-타깃된 삽입을 위해 삽입 부위에서 이중 가닥 파단 및 PB의 공동-국부화(Co-localization)가 필요하다. 이것은 뉴클레아제 Cas9 또는 닉카제 Cas9에 의한 이중 커트에 의해 달성될 수 있다.
도 21. ½ GFP 리포터 세포주에서 표적 삽입을 위한 SpCas9 또는 SaCas9와 융합된 이량체 hyPB R372A-K375A-D450N의 프로그래밍 가능한 삽입 활성.
도 22. 선택 주기에 따른 온-타깃 효율의 증가. (A) 각각의 주기로부터 선택된 벌크 변이체는 AAVS1 및 ½ GFP 트랜스포존을 표적으로 하는 gRNA로 리포터 세포주에 공동-형질감염되었다. 플라스미드의 수량은 클로닝 효율을 위해 정규화하기 위해 PB 카피 수에 의해 교정되었다. (B) 각각의 주기의 벌크 변이체를 발현하는 렌티바이러스를 생산하여 리포터 세포주를 감염시키는 데 사용하였다.
도 23. gRNA tcr1 및 ½ GFP MC 트랜스포존으로 공동 형질감염된 cas9_PB 라이브러리 농축화의 4주기 및 5주기 후 벌크 변이체로부터 단리된 단일 돌연변이체의 FiCAT (hyPB R372A-K375A-D450N)에 대한 특이적 표적 통합.
도 24. ½ GFP 리포터 세포주에서 표적 삽입을 위한 프로그래밍 가능한 삽입 활성의 상대적 비교. (A) SpCas9 단백질과 융합된 hyPB R372A-K375A-D450N (좌측) 및 SpCas9가 별도로 첨가된 MCP 단백질과 융합된 hyPB R372A-K375A-D450N (우측) 사이의 비교. (B) SpCas9가 별도로 첨가된 MCP 단백질에 융합된 3개의 hyPB 돌연변이체 (R372A-K375A-D450N; R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; 및 R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L)간의 비교.
도 25. ½ GFP 리포터 세포주에서 표적 삽입을 위한 프로그래밍 가능한 삽입 활성의 비교. (A) hyPB R372A-K375A-D450N 및 SpCas9 단백질 (좌측)과 HyPB R372A-K375A-D450N과 SpCas9 단백질을 포함하는 융합 단백질 (우측)의 공동-발현 사이의 비교. (B) SpCas9와 공동-발현된 3개의 hyPB 돌연변이체 (R372A-K375A-D450N; R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; 및 R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L) 간의 상대적 비교.
도 26. SpCas 및 hyPB R372A-K375A-D450N을 포함하는 제1 융합 단백질, 및 MCP 단백질 및 hyPB 돌연변이체 (R372A-K375A-D450N; R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; 및 R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L)를 포함하는 제2 융합 단백질의 공동-발현을 가진 ½ GFP 리포터 세포주에서 표적 삽입을 위한 프로그래밍 가능한 삽입 활성의 상대적 비교 (R372A-K375A-D450N; R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; 및 R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L).
도 27. SpCas 및 hyPB R372A-K375A-D450N을 포함하는 융합 단백질, 및 3 hyPB 돌연변이체 R372A-K375A-D450N; R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; 및 R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L의 공동-발현을 가진 ½ GFP 리포터 세포주에서 표적 삽입을 위한 프로그래밍 가능한 삽입 활성의 상대적 비교.
도 28. hyPB R272A-K275A-D450N의 이량체에 융합된 SpCas9 (좌측)와 제1 hyPB R272A-K275A-D450N에 및 제2 hyPB 돌연변이체 (우측)에 융합된 SpCas9 간의 ½ GFP 리포터 세포주에서 표적 삽입을 위한 프로그래밍 가능한 삽입 활성의 비교.
실시예
1. LAMA2 페이로드 아키텍처(architecture)
머스 머스쿨러스(Mus　musculus) (서열번호:　94) 또는 호모 사피엔스(Homo　sapiens) (서열번호:　75)에 대한, 외수송 (exporation)을 위한 리더 서열을 포함한 LAMA2-코딩 서열이 사용될 수 있다. LAMA2-코딩 서열은 우리가 유전자 편집을 수행하는 유기체에 존재하는 내인성 유전자와 구별하기 위해, 유전자 전달 후 페이로드 특이적 검출 및 추적(tracking)을 위한 서열의 일부에 대한 서열 리코딩(recording)을 함유할 수 있다.
이 LAMA2 유전자는 구성적 프로모터 (서열번호: 76-79), 조직 특이적 프로모터 (서열번호: 80), 또는 스플라이스 수용체 (서열번호: 81)의 하류에 클로닝된다. 스플라이스 수용체를 가진 버전은 능동적으로 발현되는 유전자의 제1 인트론에 통합되어 내인성 발현 제어를 가질 수 있다.
이 코딩 서열은 또한 페이로드의 미니-유전자(mini-gene) 버전을 위한 합성 인트론 (서열번호: 82)을 가질 수 있다. 발현 카세트는 폴리-A 신호 (서열번호: 83-85), 및 절연체 요소 (서열번호: 86-87)를 함유할 수 있다.
페이로드는 다음과 같은 형식일 수 있다:
1. 플라스미드 벡터; 박테리아 복제 기원 및 항생제 내성 함유
2. 플라스미드 벡터 성분에 더하여 32개의 SceI 제한 효소 표적 부위 및 Lama2 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 AttB 및 AttP 재조합 부위를 또한 함유하는 미니써클 벡터.
3. 선형화 및 공여체 DNA의 카고 말단 보호를 위해, 플라스미드 벡터 성분에 더하여 Lama2 발현 카세트를 플랭킹하는 TelN 표적 부위를 또한 함유하는 도기 본 DNA 공여체 벡터,
4. 렌티바이러스 또는 감마 레트로바이러스 페이로드 벡터, 치료 카고를 위한 추가 공간을 허용하도록 크기를 줄이도록 조작될 수 있는 렌티바이러스/레트로바이러스 작동 요소에 더하여 Lama2 발현 카세트를 플랭킹하는 긴 말단 반복부를 가짐.
이들 모든 경우에 Lama2 발현 카세트는 트랜스포사제 인식을 위한 역 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹될 수 있다 (Piggybac 및 슬리핑 뷰티).
도 1은 Lama2 트랜스진을 함유하는 상이한 카고의 표시를 나타낸다.
본 발명자들은 페이로드의 ITR 사이의 크기가 융합 단백질의 결합 능력에 영향을 미치고, 따라서 게놈으로의 이의 결과적인 전달에 영향을 미치는지 추가로 시험하였다. 세 가지 ITR 간 크기를 페이로드 효율의 표적 삽입을 위해 시도하였다: FiCAT (잔기 R372A_K375A_D450N에서 돌연변이된 Cas9 + 과활성 PiggyBac 트랜스포사제) 및 FiCAT 이량체 (잔기 R372A_K375A_D450N에서 돌연변이된 Cas9 + 과활성 PiggyBac 트랜스포사제의 이량체) 및 리포터 세포주에서 AAVS1 부위를 표적화하는 gRNA (도 12)를 가진 ½ GFP 트랜스포존의 미니써클 (MC) 페이로드에서 대략 300 bp, 200 bp 및 105 bp. 최상의 ITR 간 크기는 300 bp 및 200 bp이었으며, 한편 105 bp의 표적 통합 효율은 더 낮았다.
렌티바이러스 및 레트로바이러스-기반 전달에 더하여, 상이한 Lama2 페이로드는 폴리플렉스 및 지질 나노입자를 사용하여 전달되거나 전기천공법 또는 미세주입에 의해 네이키드(naked) 핵산으로서 표적 세포에 전달될 수 있다.
2. Lama2 페이로드의 생체외 형질도입
머스 머스쿨러스의 Lama2 코딩 서열을 함유하는 렌티바이러스 입자는 CMV 프로모터의 제어 하에 2세대 렌티바이러스 생산을 위한 표준 프로토콜을 사용하여 생산되었다. 이 페이로드의 크기가 큰 것을 감안하여, 입자가 농축되었고, 바이러스 역가는 Hek293T 세포를 감염시킨 후 바이러스 카피 수 qPCR 추정에 의해 계산되었다 (도 2).
생산 효율은 리포터 유전자 GFP와 비교하여 두 배 낮았긴 하지만, 이 역가는 Lama2 마우스 모델에서 세포 요법에 이어서 사용할 수 있는 세포의 생체외 형질도입에 충분하였다. 두 가지 상이한 접근법을 취하였다. 단리된 근육 줄기 세포를 수령자(수령자) 모델의 근육에 형질도입하고 이식하였다. 대안적으로, 골수 세포로부터 유래된 조혈 전구체는 Lama2 발현 카세트를 함유하는 렌티바이러스로 형질도입되었고, 이어서 이들 전구체는 정맥 주사를 통해 컨디셔닝된 모델로 이식될 수 있다.
생체외 치료에 대한 개념의 증거로서, 본 발명자들은 골수 유래 조혈 전구체를 단리하고 이들을 컨디셔닝된 마우스에 이식하기 전에 먼저 GFP 발현 렌티바이러스로 형질도입하였다. 이어서 본 발명자들은 순환 혈액에서 백혈구의 GFP 발현을 조사하여, 치료 4주 후에 생착(engraftment)을 점검하였고, 양성 결과를 발견하였다 (도 3A). 또한, 염증이 생긴 근육으로의 순환 세포의 침윤이 또한 점검되었고 양성 결과가 발견되었다 (도 3B).
생체외 형질도입된 조혈 전구체의 양성 침윤 및 페이로드 발현을 감안하여, 본 발명자들은 이어서 렌티바이러스 입자를 발현하는 Lama2로 이 실험을 반복하였다 (도 4). 마우스는 그립 검정에 의해 측정한 치료 후 12주 후에 근력을 회복하였다 (도 5A 및 B). 또한, 처리된 Lama2 동물 모델의 생존이 또한 관찰되었으며 (도 6), 이는 MDC1A 환자를 치료하기 위한 생체외 세포 형질도입 및 이식의 치료적 가치를 나타낸다.
또 다른 라인의 실험에서, 본 발명자들은 ~20%의 효율로 C2C12 뮤린 근모세포 세포주에 RFP 리포터의 LAMA2-표적화 삽입을 수행하였다 (도 11). 접합 PCR 및 (STAT)-PCR을 사용하여 온-타깃 및 오프-타깃(off-target) 효율을 측정하였다. 이 개선된 효율은 FiCAT로 지칭되는 R372A_K375A_D450N 잔기에서 돌연변이된 Cas9 및 과활성 PiggyBac 트랜스포사제를 포함하는 융합 단백질을 사용한 결과였다.
3. Lama2 페이로드의 생체내 형질도입
간(liver)이 생체내에서 단백질 생산을 위한 생물반응기로서 기능하는 능력을 감안하여; 본 발명자들은 트랜스포사제를 기반으로 하는 무바이러스 유전자 전달 접근법을 사용하여 Lama2 발현 벡터로 동물 모델의 생체내 간 세포를 형질도입할 수 있는 가능성을 탐구하였다.
생체내 JetPei (폴리플러스(PolyPlus)) (도 7)를 사용하여 제형화된 플라스미드 벡터 또는 mRNA 분자 및 트랜스포존 Lama2 플라스미드 벡터로서 프로그래밍 가능한 뉴클레아제 단백질 (SpCas9)을 가진 과활성 PiggyBac 트랜스포사제 또는 조작된 과활성 Piggybac 융합 트랜스포사제를 동물 모델에 정맥내 주사하고, 조직은 간에서 페이로드 카피 수 (개념 증명으로서의 RFP 데이터) (도 8A,C), 및 간에서의 발현 분석 (RFP, 도 8C; Lama2, 도 8D) 및 Lama2의 경우 순환 혈액 (도 9)을 위해 3 내지 4주 후에 수확하였다. 주사 1주 후 100 μL의 혈액을 수집하여 종점(end-point)에서 전혈을 수집하였다.
처리 4주 후 간 세포의 트랜스진 카피 수는 긍정적인 결과를 나타냈으며 RFP 리포터 유전자와 추가로 비교하였으며, 이는 상이한 크기의 페이로드로 유사한 형질도입 효율을 확인해 주었다 (도 8A, B). 에피솜 전달에 대한 참조는 어떤 트랜스포사제도 공동-전달되지 않았을 때 수행되었다. RFP 리포터 및 Lama2 유전자에 대한 트랜스진의 발현이 간세포에서 또한 확인되었으며 (도 8B, D), Lama2 발현은 전달 후 1주 및 4주 후에 혈액에서 검출되었다 (도 9).
4. 생체내 유전자 전달을 위한 개선된 도구
생체내 유전자 전달에 사용되는 프로그램 가능한 트랜스포사제를 개선하기 위해, 본 발명자들은 FiCAT (Cas9-hyPB R372A_K375A_D450N)에 플라스미드 DNA (pDNA)와 mRNA를 둘 다 사용하여, 플라스미드 또는 MC 형태로 Rosa26 게놈 세이프 하버 (개념 증명을 위한 트랜스포존을 코딩하는 RFP 또는 루시퍼라제)를 표적으로 하는 마우스 간으로 이를 전달하였다. 내인성 유전자 TFRC (도 10A)와 비교하여 트랜스진의 높은 카피수가 관찰되었고 시간이 지남에 따라 트랜스진 발현이 유지되었다 (도 10B). 3' ITR과 게놈 유전자좌 사이의 접합부의 PCR을 사용하여 새로 형성된 온-타깃 삽입을 측정하였다 (도 10C).
4.1. hyPB에 융합된 Cas 변이체의 결과
프로그래밍 가능한 전위를 수행하기 위해 조작된 hyPB의 능력을 추가로 특성화하기 위해, 우리는 다른 Cas 단백질이 뉴클레아제 활성을 가진 상이한 유기체를 형성하는, 시험된 프로그래밍 가능한 트랜스포사제의 SpCas9 머딜(mudile) (즉, 서열번호: 72의 SaCas9, 서열번호: 74의 cpf1, 서열번호: 75의 CasX, 및 서열번호: 29의 CjCas9)을 치환하였다. 분할 GFP 리포터의 상류 영역을 표적으로 하는 특이적 gRNA를 설계하고 허쉬(Hershey) 세포주 형질감염을 위해 클로닝하였다. 표적 전위는 GFP 발현에 의해 측정되었다 (도 13).
이들 결과는 또 다른 실험 라인에서 확인되었다. 우리는 CjCas9 및 LbCpf1에 대해 우수한 프로그램 가능한 삽입 활성을 수득하였으며, 한편 CasX는 우리의 검정에서 프로그래밍 가능한 통합을 달성하지 못하였다. 특히, SaCas9는 변형된 hyPB에 융합된 SpCas9와 유사한 수준으로, 시험된 Cas 단백질 중에서 가장 높은 수준의 프로그래밍 가능한 삽입을 가졌다 (도 14). 사용된 상이한 Cas 단백질 및 일루미나(Ilumina) NGS (도 15)에 의해 각각의 단백질에 대해 설계된 세 가지 상이한 gRNA에 대해 Indels이 결정되었으며, 정규화 목적으로 표시되었다.
이들 긍정적인 결과는 임의의 서열 특이적 뉴클레아제 모듈에 유용하도록 프로그래밍 가능한 전위를 위해 조작된 hyPB를 검증한다.
4.2. PB 돌연변이체의 이량체에 융합된 Cas9의 추가 결과
전위를 수행할 때 이량체로서 작용하는 PB의 특성을 감안하여, Cas9와 hyPB R372A-K375A-D450N 돌연변이체의 융합 단백질 생성을 시도하였다. 우리는 이들 융합의 온-타깃 활성을 Cas9-PB 돌연변이체 단독과 비교하였다. 우리는 구성 Cas9-PB-PB의 더 양호한 성능을 관찰하였으며; 한편 PB-Cas9-PB 구성은 Cas9-PB 단량체 융합을 능가하지 못하였다 (도 16). Cas9에 대한 이량체 융합을 위해 우리는 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위해 기록된 버전의 hyPB R372A-K375A-D450N 돌연변이체를 사용하였다.
흥미롭게도, 이량체 hyPB R372A-K375A-D450N에 융합된 Cas9가 SpCas9 대신에 SaCas9인 경우, 활성이 추가로 증가된다 (도 21). 이량체 hyPB를 사용하여 SpCas9에 비해 SaCas9의 증가된 성능은 단량체 hyPB로 수득된 결과와 일치한다 (도 13 및 14).
4.3. ZNF-PB 돌연변이체 구제(rescue)의 결과
우리는 오프 타깃 부위에서 비유도 DSB에 의한 오프 타겟 활성을 저하시키면서, 표적 통합을 용이하게 하는데 SpCas9 닉카제 변이체 (D10A)에 의한 단일 가닥 커트를 촉진하는 2개의 gRNA의 가까운 (4개의 뉴클레오티드) 표적 부위에 의해 유도된 이중-가닥 파단 (DSB) 활성의 역할을 추가로 탐구하고 싶었다. 우리는 D450N 돌연변이체 및 R372A-K375A-D450N 돌연변이체와의 융합에 의해, 트랜스포존의 지향된 국부화를 위해 징크 핑거-PB 융합을 사용하고 독립적인 닉카제 Cas9에 의한 2개의 현장(on-site) 단일 가닥 브레이크(brake), 또는 Cas9 뉴클레아제에 의한 단일 DSB로 이를 보완하였다.
Znf-PB 융합은 단일 또는 이중 gRNA 가이드-cas9 뉴클레아제 또는 닉카제와 함께 Znf 결합 부위 근처에 DSB를 도입하는 것과 조합될 때 구제된 표적 삽입 활성을 전혀 나타내지 않거나 매우 낮게 나타냈다 (도 20).
4.4. Cas9-hyPB 돌연변이 변이체의 결과
더 양호한 효율으로 프로그래밍 가능한 전위를 수행할 수 있는 돌연변이체 조합을 추가로 탐구하기 위해, 분할 GFP 리포터 시스템의 프로그래밍 가능한 삽입에 의해 GFP가 재구성되는 세포 선택의 수개의 주기를 수행하였다. 흥미롭게도 우리는 Cas9-hyPB R372A-K375A-D450N을 능가하는 수개의 조합을 관찰하였다 (도 17). 특히 언급할 가치가 있는 것은 hyPB에서 AA: A351-A372-A375-A388-N450-A465-A573-V589-G592-L594 (서열번호:2로도 식별됨)에서 돌연변이된 Cas9에 융합된 hyPB의 변이체이다. R372A-K375A-D450N (서열번호: 1)과 비교하여 양성 세포 집단에서 수배(several fold)가 농축화되며; 또한 A245-A275-A277-A372-A465-V589 (서열번호: 3) 및 A275-A325-A372-A560 (서열번호: 4)은 더 적은 정도로 농축화된다.
또 다른 실험 라인에서, PiggyBac DNA 라이브러리는 트위스트 바이오사이언스(Twist Bioscience)에 의해 생산되었으며, cas9와 융합하여 렌티바이러스 벡터로 클로닝되고 stb4 유능한 세포로 형질전환되어, x100 변이체 복잡성(variant complexity)을 보장하였다. 플라스미드를 maxiprep에 의해 정제하고 렌티바이러스 패키징 플라스미드로 Hek293T 세포에 공동형질감염시켰다. 렌티바이러스는 ½ GFP 리포터 세포주를 감염시키는 데 사용되었다. 감염된 세포를 AAVS1 서열을 표적화하는 ½ GFP 트랜스포존 및 gRNA로 형질감염시켰다. GFP 양성 세포는 유세포 분석 분류(flow cytometry sorting)에 의해 선택되었고 게놈 DNA가 추출되었다. 추출된 gDNA로부터 PB를 증폭하고, 렌티바이러스 벡터에 재클로닝하여 새로운 주기를 다시 시작하였다. 최상 성능의 프로그래밍 가능한 트랜스포사제 변이체를 선택하여 AAVS1 gRNA 및 MC ½ GFP로 개별적으로 형질감염시켰다.
먼저, 96개의 변이체의 무작위 선택을 수행하고 최상의 성능의 변이체를 별도로 스크리닝하였다 (도 18). 높은 온-타깃 삽입을 위한 최상의 PB 아미노산 변이체의 요약은 돌연변이 D450N, R372A 및 K375A의 중요성을 확인해 주나; 증가된 표적 효율에 기여하는 다른 중요한 잔기를 강조한다 (도 19B). 최상의 온-타깃 효율을 가진 6개의 PB 변이체를 선택하였다 (도 19A). 개별 온-타깃 활성은 FiCAT (Cas9-hyPB R372A-K375A-D450N)와 비교하여 하기 변이체로 유의하게 개선되었다: N347A-D450N; N347S-D450N-T560A-S573A-F594L; R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; R275A-N347S-K375A-D450N-S592G; R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; 및 R275A-R277A-N347S-R372A-D450N-T560A-S564P-F594L (양측 t-검정(two-sided t-test)).
이 실험을 반복하여 확인하였다 (도 22A). 우리는 또한 각각의 주기의 벌크 변이체를 발현하는 렌티바이러스 및 PB 변이체 CN에 의해 이의 역가를 교정하는 감염된 리포터 세포주를 생산하여, 주기에 걸쳐 유사한 온-타깃 효율 증가를 입증하였다 (도 22B). 단일 돌연변이체는 cas9_PB 라이브러리 농축화의 4주기 및 5주기 후에 벌크 변이체로부터 단리되었다. 온-타깃 리포터 세포주를 FiCAT 돌연변이체, gRNA tcr1 및 ½ GFP MC 트랜스포존으로 형질감염하여 돌연변이를 개별적으로 시험하였다. 최상의 FiCAT 돌연변이는 FiCAT R372A_K375A_D450N과 비교하여 표시된다 (도 23). 개별 온-타깃 활성은 FiCAT (Cas9-hyPB R372A-K375A-D450N)과 비교하여 하기 변이체로 유의하게 개선되었다: R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; R245A-N347S-R372A-D450N-T560A-S564P-S573A-S592G; R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L; N347A-D450N; R277A-G325A-N347A-R375A-D450N-T560A-S564P-S573A-S592G-F594L; N347S-D450N-T560A-S573A-F594L; V34M-R275A-G325A-N347S-S351A-R372A-K375A-D450N-T560A-S564P; G325A-N347S-K375A-D450N-S573A-M589V-S592G; S230N-R277A-N347S-K375A-D450N; T43I-R372A-K375A-A411T-D450N; G325A-N347S-S351A-K375A-D450N-S573A-M589V-S592G; Y177H-R275A-G325A-K375A-D450N-T560A-S564P-S592G.
돌연변이체 R372A-K375A-D450N과 비교하여 돌연변이체 R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L, R275A-R277A-N347S-R372A-D450N-T560A-S564P-F594L 및 R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L의 우월성은 SpCas9 및 2개의 hyPB를 포함하는 삼중 융합 단백질에서 추가로 입증되었다 (도 28).
4.5. Cas9 및 hyPB 비공유 연결의 결과
링커를 통해 Cas9와 hyPB R372A-R375A-D450N의 공유 결합에 더하여, 우리는 MS2-MCP 시스템을 사용하여 MCP 단백질과 hyPB R372A-R375A-D450N으로 이루어진 융합 단백질과 Cas9를 MCP 단백질에 결합하는 MS2 서열의 테트라루프를 함유하는 변형된 gRNA를 통해 연결하였다.
MCP-hyPB R372A-R375A-D450N 융합 단백질과 Cas9의 조합은 Cas9-hyPB R372A-R375A-D450N 융합 단백질과 비교하여 프로그램 가능한 삽입 활성이 증가하였다 (도 24A). 또한, MCP 단백질을 hyPB의 다른 돌연변이체에 융합하여 SpCas9와 함께 프로그래밍 가능한 전위를 수행하였다. 사용된 두 변이체 (R202K-R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L, 및 R275A-N347S-R372A-D450N-T560A-F594L) 모두 R372A-R375A-D450N을 능가하였다 (도 24B).
4.6. 프로그래밍 가능한 전위를 위한 Cas9 및 디커플링(decoupling)의 결과
우리는 또한, 링커 없이, 또는 MS2-MCP 시스템도 없이 hyPB R372A-R375A-D450N으로 SpCas9의 성능을 시험하였다. 우리는 동일한 세포 SpCas9 및 hyPB R372A-R375A-D450N에서 공동-발현시켰고, Cas9-hyPB R372A-R375A-D450N 융합 단백질과 비교하여 증가된 프로그래밍 가능한 삽입 활성이 등록되었다 (도 25A). 우리는 Cas9에 융합되지 않았으나, 동시에 발현되고, 프로그래밍 가능한 전위의 활성을 달성하기 위해 함께 작용하는 시험된 hyPB 돌연변이체 변이체의 수를 확장하였다 (도 25B).
4.7. Cas9-hyPB 및 MCP-hyPB 융합 단백질의 공동-발현의 결과
우리는 비공유결합으로 연결된 단량체 중 하나와의 융합의 이량체 버전을 수득하기 위해, MCP 단백질에 융합된 hyPB R372A-R375A-D450N 돌연변이체 및 SpCas9에 융합된 hyPB 돌연변이체를 공동-형질감염시켰다. SpCas9에 융합된 수개의 hyPB 돌연변이체를 특이적 표적 통합에 대해 비교하였다 (도 26).
4.8. Cas9-hyPB 및 hyPB 변이체의 공동-발현 결과
유사한 방식으로, 우리는 SpCas9 hyPB R372A-R375A-D450N 융합 단백질 및 hyPB 돌연변이체를 독립적으로 공동-형질감염시켜, 연결되지 않은 단량체 중 하나와의 융합의 이량체 버전을 수득하였다 (도 27).
재료 및 방법
렌티바이러스 생산, 농도 및 역가
바이러스를 생산하기 위해, 세포는 pSICO(GFP) 또는 pLV-Lama2 (Lama2) 및 pmd2.g (VSVG = 외피) 및 pax2 (IN을 포함한, 패키징 단백질 함유)로 그리고 때때로 단지 wt-인테그라제를 함유하는 플라스미드로 공동-형질감염시켜 비감염성 인테그라제를 구제하였다. 먼저 6x105개 HEK392T 세포 (계대 8)를 6-웰 조직 판(tissue plat)의 웰에 시딩하고 밤새 인큐베이션하였다. 바이러스 생산을 시작하기 5시간 전에, 세포의 배지를 각각의 웰에서 1:1000 CD (클로로퀸 디포스페이트; 스톡 = 25 mM)를 함유하는 1,7 mL 배지로 교체하였다. 플라스미드를 몰비 1,6:1,32:0,72:3,32 (pSICO:pax2:VSVG:wtIN-구제)로 감염시켰다. PEI (폴리에틸렌이민; 스톡=1 mg/mL)을 형질감염 시약으로 사용하였으며, 한편 형질감염에 사용된 총 DNA 1 μg에는 3 μL PEI가 사용되었다. DNA를 83 μL Opti-MEM (써모 사이언티픽(Thermo Scientific); #31985062)에 희석하고 PEI를 또 다른 83 μL에 희석하였다. 두 용액을 혼합한 후, 이들을 실온에서 15-20분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 형질감염 혼합물을 CD-배지와 함께 세포에 적가하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하였다. 다음날까지 배지를 교체하고 2,5 mL의 신선한 배지를 첨가하였다. 다음날 세포의 상청액을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 45 μm 필터를 통과시켰다. 4℃에서 19.500 rpm으로 90분 동안 초원심분리하고 원래 배지 부피의 1:100에서 밤새 재현탁하였다. 상청액은 -80℃에 보관하였다.
바이러스 역가를 결정하기 위해 HEK293T 세포를 생산된 바이러스로 감염시키고 GFP가 바이러스 패키징 서열에 코딩되어 있기 때문에 GFP 양성 세포의 양을 계수하였다. 따라서, 6-웰 플레이트의 웰당 75000개의 HEK393T 세포를 시딩하였다. 세포는 1:1000 폴리브렌과 이전에 생성된 바이러스 상청액 500 μL (1:3)를 포함하는 1 mL 배지의 혼합물로 감염되었다. 다음날 배지를 교체하였다. 다음날 배지를 흡인하고, 200 μL 트립신을 사용하여 세포를 탈착하였다. 800 μL 일반 배지를 첨가하여 반응을 중단하고 세포 측정법에 의해 분석하였다. 비형광 Lama2 페이로드의 경우에, gDNA를 세포로부터 추출하고 qPCR을 수행하여 페이로드 대 게놈의 카피 수를 결정하였다.
생체내 Lama2 전달
동물 실험 절차는 바르셀로나 바이오메디컬 연구 단지(Barcelona Biomedical Research Park)의 동물 실험 윤리위원회(Animal Experimentation Ethic Committee)의 승인을 받았다. C57BL/6J 또는 Lama2 모델 dj2y/dj2y, 8-10주령이 이 연구에 사용되었다. 동물은 잭슨 레보러토리즈(Jackson Laboratories)로부터 구입하였으며, 수컷과 암컷을 구분하지 않고 사용하였다.
공여체 마우스를 8주령에 희생시키고 뒷다리 뼈로부터 골수 세포를 수집하였으며; 계통 음성 고갈을 마우스 계통 세포 고갈 키트(Mouse Lineage Cell Depletion Kit) (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용하여 제조업체 설명서 따라 수행하고 적절한 자극 인자 (스템셀 테크놀로지즈(StemCell Technologies))를 가진 줄기 세포 배양 배지에서 밤새 렌티바이러스로 세포를 형질도입하였다. 이어서 이들 세포를 수확하고 후안와 주사(retro-orbital injection)에 의해 (방사선에 의한 컨디셔닝 후) 수령자 마우스에 이식하였다.
이식 4주 후, 처리된 마우스로부터 혈액 및 경골근(tibialis muscle)을 수집하였다. 용해 완충제 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 FACS 분석 전에 제조업체 설명서에 따라 혈액 샘플을 처리하였다. FACS 분석 전에 침윤된 세포를 단리하기 위해 경골근을 다지고(minced) 리베라제(liberase)/디스파제(dispase) 소화로 추가 처리하였다.
처리 후 6주 및 12주 후에 제조업체 설명서 따라 바이오셉(Bioseb) 장치를 사용하여 그립 강도 검정을 수행하였다.
hyPB mRNA를 제조업체의 설명서에 따라 리보맥스(RiboMAX) 대규모 RNA 생산 시스템즈(Large Scale RNA Production Systems)-T7 (프로메가(Promega))로 생산하였다. Rosa26 gRNA (25)를 IDT로부터 구입하였다. Rosa26 및 PB512-B 또는 Lama2 트랜스포존을 표적으로 하는 hyPB mRNA, gRNA를 1:2,5:2,5 비율로 후안와를 통해 주입하였다. 총 55 ug의 핵산을 복합체화하여; NP 비율 7에서 생체내-JetPEI (폴리플러스 형질감염)시켰다. 주사 후 10일에 동물을 안락사시키고 간을 단리하고 균질화하였다. 게놈 DNA와 RNA를 간 샘플로부터 추출하였다. Tfrc 내인성 유전자에 대한 트랜스포존 상대 카피 수 및 트랜스진 상대 발현은 각각 qPCR, RT-qPCR 또는 Elisa 시험에 의해 수득하였다.
IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (칼리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences))을 사용하여 FiCAT-gRNA-트랜스포존 또는 트랜스포존 대조군 투여 후 상이한 시점에서 루시퍼라제 발현의 이미징을 수행하였다. 제조업체의 설명서에 따라 D-루시페린 포타슘 염 (골드 바이오테크롤로지(Gold Biotechnology))을 복강내 주사한 후 5분 후에 이미지를 촬영하였다.
간으로부터의 gDNA 및 RNA 수확
게놈 DNA 추출은 DNeasy® 혈액 및 조직 키트 프로토콜 (퀴아젠(QIAGEN)®)에 따라 수행하였다. 간 조직을 PBS (인산염-완충 식염수)에서 균질화하였다. 20 μL의 프로테이나제 K (키트에 의해 제공됨)를 200 μL의 완충제 AL과 함께 첨가하였다. 볼텍싱 후, 샘플을 56℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 에탄올 (96-100%)을 첨가하고 짧게 볼텍싱(vortexing)한 후, 혼합물을 3 mL 수집 튜브에 배치된 Dneasy Mini 스핀 컬럼으로 옮기고 8000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 mL 수집 튜브로 옮기고 500 μL의 완충제 AW1을 첨가하였다. 튜브를 8000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 완충제 AW2에 대해 이 세척 단계를 반복하였다 (3분의 원심분리). 이어서, 스핀을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브로 옮기고 스핀 컬럼 멤브레인 중앙에 200 μL의 완충제 AE를 첨가하여 튜브를 1분 동안 방치하여 DNA를 용리시킨 후 8000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 농도는 나노드롭 원(NanoDrop One)®(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))으로 측정하였다.
qPCR 및 RT-qPCR
게놈 DNA 샘플의 25 ng/μL 및 10 ng/μL 희석액을 qPCR에 의해 분석하였다. 5 μL의 각각의 희석액을 4,4 μL 파워(Power)UP SYBR 그린 매스터믹스(Green MasterMix) (피셔 사이언티픽) 및 0,3 μL 올리고(oligo)와 앞뒤로 혼합하였다. Lama2, RFP 및 TfrC 내인성 유전자를 표적으로 하는 올리고를 사용하였다 (서열번호: 100-105
고용량 RNA-cDNA 키트 (써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 mRNA에서 cDNA로의 역전사를 수행하였다. 1 μg mRNA 샘플을 20 μL 반응에서 10 μL 완충제 및 1 μL 효소 혼합물과 혼합하였다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고 80℃에서 10분 동안 불활성화하였다. RT 제품을 10배 희석하고 5 μL의 샘플을 4,4 μL 파워UP SYBR 그린 매스터믹스 (피셔 사이언티픽) 및 0,3 μL 올리고 fw 및 rv와 혼합하여 qPCR을 수행하였다. Lama2, RFP 및 GAPDH 내인성 유전자를 표적으로 하는 올리고를 사용하였다 (서열번호: 102-107)
효소 연결 면역흡착 검정(Enzyme linked immunosorbent assay) (ELISA)
전혈을 탁상용 원심분리기에서 4℃ 10분 1200xg로 원심분리하였다. 혈장을 분리하여 ELISA 검정을 수행할 때까지 80℃에서 보관하였다. 인간 라미닌 서브유닛 알파-2 (LAMA-2) ELISA 키트 (쿠사비오(Cusabio))를 사용하였다. 20 μL의 혈장을 80 μL의 샘플 완충제로 희석하였다. 희석된 샘플을 플레이트에 배치하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 흡인하였으나 세척하지는 않았고 100 μL의 비오틴(Biotin)-항체를 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고 세척 완충제로 3회 세척하였다. 100 μL의 HRP-아비딘을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 5회 세척의 세척 단계를 조심스럽게 수행하였다. 90 μL의 TMB 기질을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 용액을 첨가하고, 플레이트를 완만하게 두드린 다음에 플레이트 판독기에서 450 nm에서 5분 이내에 광학 밀도를 결정하였다.
형광 활성화 세포계측법(Fluorescent activated cytometry analysis) 분석 (FACS)
(BD LSR 포르테사(Fortessa); BD 바이오사이언시스(Biosciences). 530/30 필터를 가진 청색 488 nm 레이저 및 610/20 필터를 가진 황록색 561 nm 레이저)에서 emGFP 발현을 측정하기 전에 순환하는 백혈구 및 근육 내 침윤 세포를 단리하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Universitat Pompeu Fabra <120> THERAPEUTIC LAMA2 PAYLOAD FOR TREATMENT OF CONGENITAL MUSCULAR DYSTROPHY <130> IBIO-2200/PCT <150> EP21209721.6 <151> 2021-11-22 <150> EP20214691.6 <151> 2020-12-16 <160> 134 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac <400> 1 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Ala Ser Asn Ala Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asn Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 2 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac <400> 2 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ala Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Ala Ser Asn Ala Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Ala Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asn Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Ala Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ala Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Val Cys Gln Gly 580 585 590 Cys Leu <210> 3 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac <400> 3 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala 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<220> <221> SITE <222> 277..277 <223> Wherein amino acid can be Arg, Ala <220> <221> SITE <222> 287..287 <223> Wherein amino acid can be Ala, Lys <220> <221> SITE <222> 290..290 <223> Wherein amino acid can be Ala, Lys <220> <221> SITE <222> 315..315 <223> Wherein amino acid can be Arg, Ala <220> <221> SITE <222> 325..325 <223> Wherein amino acid can be Gly, Ala <220> <221> SITE <222> 341..341 <223> Wherein amino acid can be Arg, Ala <220> <221> SITE <222> 346..346 <223> Wherein amino acid can be Asp, Asn <220> <221> SITE <222> 347..347 <223> Wherein amino acid can be Asn, Ala, Ser <220> <221> SITE <222> 350..350 <223> Wherein amino acid can be Thr, Ala <220> <221> SITE <222> 351..351 <223> Xaa can be Ser, Glu, Pro, Ala <220> <221> SITE <222> 356..356 <223> Wherein amino acid can be Lys, Glu <220> <221> SITE <222> 357..357 <223> Wherein amino acid can be Asn, Ala <220> <221> SITE <222> 372..372 <223> Wherein amino acid can be Arg, Ala <220> <221> SITE <222> 375..375 <223> Wherein amino acid can be Lys, Ala <220> <221> SITE <222> 388..388 <223> Wherein amino acid can be Arg, Ala <220> <221> SITE <222> 409..409 <223> Wherein amino acid can be Lys, Ala <220> <221> SITE <222> 412..412 <223> Wherein amino acid can be Lys, Ala <220> <221> SITE <222> 432..432 <223> Wherein amino acid can be Lys, Ala <220> <221> SITE <222> 460..460 <223> Wherein amino acid can be Arg, Ala <220> <221> SITE <222> 461..461 <223> Wherein amino acid can be Ala, Lys <220> <221> SITE <222> 465..465 <223> Wherein amino acid can be Trp, Ala <220> <221> SITE <222> 560..560 <223> Wherein amino acid can be Thr, Ala <220> <221> SITE <222> 564..564 <223> Wherein amino acid can be Ser, Pro <220> <221> SITE <222> 571..571 <223> Wherein amino acid can be Asn, Ser <220> <221> SITE <222> 573..573 <223> Wherein amino acid can be Ser, Ala <220> <221> SITE <222> 576..576 <223> Wherein amino acid can be Lys, Ala <220> <221> SITE <222> 586..586 <223> Wherein amino acid can be His, any naturally occuring amino acid <220> <221> SITE <222> 587..587 <223> Wherein amino acid can be Ile, Ala <220> <221> SITE <222> 589..589 <223> Wherein amino acid can be Met, Val <220> <221> SITE <222> 592..592 <223> Wherein amino acid can be Ser, Gly <220> <221> SITE <222> 594..594 <223> Wherein amino acid can be Phe, Leu <400> 10 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr 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Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Xaa Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser 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Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Xaa Pro 275 280 285 Ser Xaa Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Xaa Xaa Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 13 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac with mutation that are involved in target joining <220> <221> SITE <222> 351..351 <223> Xaa can be Ser, Glu, Pro, Ala <220> <221> SITE <222> 356..356 <223> Xaa can be Lys, Glu <400> 13 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu 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Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 14 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac with mutations that are critical for integration <220> <221> SITE <222> 560..560 <223> Wherein amino acid can be Thr, Ala, <220> <221> SITE <222> 564..564 <223> Wherein amino acid can be Ser, Pro <220> <221> SITE <222> 571..571 <223> Wherein amino acid can be Asn, Ser <220> <221> SITE <222> 573..573 <223> Wherein amino acid can be Ser, Ala <220> <221> SITE <222> 589..589 <223> Wherein amino acid can be Met, Val <220> <221> SITE <222> 592..592 <223> Wherein amino acid can be Ser, Gly <220> <221> SITE <222> 594..594 <223> Wherein amino acid can be Phe, Leu <400> 14 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met 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catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980 cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040 gattttctta agtccgatgg atttgccaac aggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100 tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160 cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220 gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280 atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340 atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400 gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460 gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520 atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580 gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640 aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700 actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760 cttgttgaga cacgccagat 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Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Ala Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asn Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ala Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Val Cys Gln Gly 580 585 590 Cys Phe <210> 127 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac S230N/R277A/N347S/K375A/D450N <400> 127 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Asn Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Ala Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Ser Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr 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Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 128 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac T43I/R372A/K375A/A411T/D450N <400> 128 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Ile Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Ala Ser Asn Ala Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Thr Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asn Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser 580 585 590 Cys Phe <210> 129 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac G325A/N347S/S351A/K375A/D450N/S573A/M589V/S592G <400> 129 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Ser Trp Phe Thr Ala Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Ala Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asn Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ala Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Val Cys Gln Gly 580 585 590 Cys Phe <210> 130 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified hyperactive PiggyBac Y177H/R275A/G325A/K375A/D450N/T560A/S564P/S592G <400> 130 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 150 155 160 Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile 165 170 175 His Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn 180 185 190 His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr 195 200 205 Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu 210 215 220 Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val 225 230 235 240 Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile 245 250 255 Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu 260 265 270 Gly Phe Ala Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro 275 280 285 Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys 290 295 300 Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn 305 310 315 320 Gly Val Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val 325 330 335 His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Ala Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asn Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Ala 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Gly Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ser Cys Lys Lys 565 570 575 Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Gly 580 585 590 Cys Phe <210> 131 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP N55K <400> 131 atggcttcaa actttactca gttcgtgctc gtggacaatg gtgggacagg ggatgtgaca 60 gtggctcctt ctaatttcgc taatggggtg gcagagtgga tcagctccaa ctcacggagc 120 caggcctaca aggtgacatg cagcgtcagg cagtctagtg cccagaagag aaagtatacc 180 atcaaggtgg aggtccccaa agtggctacc cagacagtgg gcggagtcga actgcctgtc 240 gccgcttgga ggtcctacct gaacatggag ctcactatcc caattttcgc taccaattct 300 gactgtgaac tcatcgtgaa ggcaatgcag gggctcctca aagacggtaa tcctatccct 360 tccgccatcg ccgctaactc aggtatctac 390 <210> 132 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP N55K <400> 132 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130 <210> 133 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA-MS2(tetraloop)-AAVS1-3 spacer <400> 133 ggggccacta gggacaggat gttttagagc taggccaaca tgaggatcac ccatgtctgc 60 agggcctagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttggccaaca tgaggatcac 120 ccatgtctgc agggccaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 162 <210> 134 <211> 162 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA-MS2(tetraloop)-AAVS1-3 spacer <400> 134 ggggccacua gggacaggau guuuuagagc uaggccaaca ugaggaucac ccaugucugc 60 agggccuagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggccaaca ugaggaucac 120 ccaugucugc agggccaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 162

Claims (21)

  1. a) 표적 핵산 서열(target nucleic acid sequence)에 결합하고 이를 절단할 수 있는 부위-특이적(site-specific) DNA 결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어진 제1 단백질; 또는 상기 제1 단백질을 코딩하는(encoding) 핵산 작제물(nucleic acid construct);
    b) 트랜스포사제(transposase)를 포함하거나 이로 이루어진 제2 단백질; 또는 상기 제2 단백질을 코딩하는 핵산 작제물; 및
    c)　바람직하게는 서열번호: 74의, 라미닌-α2 단백질, 또는 이의 기능적 변이체(functional variant) 또는 단편을 코딩하는 트랜스진(transgene)을 포함하는 핵산 작제물
    을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, a) 및 b)의 제1 및 제2 단백질이 임의로 링커(linker)를 통해 함께 융합(fusing)되는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, c)의 상기 핵산 작제물이 서열번호: 76의 CMV 프로모터, 서열번호: 77의 CAG 프로모터, 서열번호: 78의 EF1-알파 프로모터, 서열번호: 79의 SV-40 프로모터 및 서열번호: 80의 EalbAAT 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, c)의 상기 핵산 작제물이 서열번호: 81의 스플라이스 수용체(splice acceptor)를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c)의 핵산 작제물이 바람직하게는 서열번호: 83-85로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리(A) 신호 서열(poly(A) signal sequence) 및/또는 바람직하게는 서열번호: 86-87로 이루어진 군으로부터 선택되는 절연체 요소(insulator element)를 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c)의 핵산 작제물이 역 말단 반복부 (inverted terminal repeat; ITR), 바람직하게는 서열번호: 88 및 89의 5'-ITR 및 3'-ITR에 의해 플랭킹(flanking)되는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 c)의 핵산 작제물이 플라스미드 벡터, 미니써클(minicircle) 벡터, 도기 본(doggy bone) DNA 공여체 벡터(donor vector), 렌티바이러스 벡터 및 렌트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터에 포함되는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 DNA 결합 단백질이 Cas 단백질을 포함하는 RNA-가이드된(guided) 뉴클레아제이고, 여기서 상기 조성물이 세포 게놈의 특이적 부위에 상기 LAMA2 트랜스진을 통합하기 위한 표적 핵산 서열에 대한 상보적 서열을 포함하는 가이드 RNA를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 Cas 단백질이 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas 9 단백질인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 가이드 RNA가 서열번호: 90 내지 97 중 어느 하나를 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제가 변형된 과활성(hyperactive) Piggybac 트랜스포사제 또는 슬리피 뷰티(Sleepy Beauty) 트랜스포사제, 바람직하게는 변형되지 않은 과활성 Piggybac과 비교하여 절제 활성(excision activity)을 증가시키기 위한 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 및 변형되지 않은 과활성 Piggybac과 비교하여 DNA 결합 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제인 조성물.
  11. 제10항에 있었서, 상기 과활성 PiggyBac 트랜스포사제가 V34, T43, Y177, M194, R202, S230, R245, R275, R277, G325, S351, N347, R372, K375, R376, E377, E380, A411, D450, T560, S564, S573, M589, S592, 및 F594로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며 바람직하게는 아미노산 Y177, R202, S230, R245, R275, R277, G325, N347, S351, E377, D450, R372 및 K375, E377, T560, S564, S573, M589, S592, F594의 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이며, 상기 위치 번호가 서열번호:　9의 변형되지 않은 과활성 Piggybac의 아미노산 번호에 상응하는, 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 과활성 PiggyBac 트랜스포사제가 M194, R245, R275, R277, G325, R372, K375, R376, E377, E380, D450 및 S573으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 바람직하게는 아미노산 D450, R372 및 R375의 돌연변이를 포함하는 변형된 과활성 PiggyBac 트랜스포사제이며, 상기 위치 번호가 서열번호:　9의 변형되지 않은 과활성 Piggybac의 아미노산 번호에 상응하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제가 링커, 바람직하게는 GGS, XTEN 또는 FOKI를 포함하는 펩티드 링커, 보다 바람직하게는 서열번호:　53의 XTEN에 의해 상기 부위-특이적 DNA 결합 단백질에 N-말단으로 융합되는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 나노입자 내에 패키징(packaging)되는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, LAMA2 트랜스진을 세포의 게놈 내의 표적 핵산 서열로 통합하기 위한 시험관내 방법.
  16. 제15항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 조작된 세포(engineered cell)로서, 여기서 조작된 세포가 이의 게놈 내에 통합된 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 인테그라제- 및/또는 트랜스포사제-매개 유전자 삽입을 위한 작동 서열에 의해 플랭킹되는 라미닌-α2 단백질을 코딩하는 트랜스진을 포함하는, 조작된 세포.
  17. 제16항에 있어서, 트랜스진을 플랭킹하는 작동 서열(operational sequence)이 서열번호:　88 및 89를 포함하거나 이로 이루어진 조작된 세포.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, ITR 간 크기(inter-ITR size)가 적어도 300　bp인 조작된 세포.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 전장(full-length) 라미닌-α2 단백질을 코딩하는 조작된 세포.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물, 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포를, 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 요법(therapy)에 사용하기 위한, 특히 메로신-결핍 선천성 근이영양증 1A형(merosin-deficient congenital muscular dystrophy type 1A) (MDC1A)의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 조작된 세포 또는 제20항의 약제학적 조성물.
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WO2018175872A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Methods of genome engineering by nuclease-transposase fusion proteins
US20220235379A1 (en) * 2019-06-11 2022-07-28 Universitat Pompeu Fabra Targeted gene editing constructs and methods of using the same

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