KR20230111872A - 신규 fgf-1 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

신규 FGF-1 변이체 및 그의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 신규 FGF-1 변이체 및 그의 용도에 의하면, 야생형 FGF1에 비하여 증가된 단백질 분해 안정성, 및 치료 효과를 가져 관련된 용도, 예를 들면, 상처 치유, 조직 재생, 암 성장의 억제 및 혈관신생의 억제 등에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

신규 FGF-1 변이체 및 그의 용도{Novel FGF-1 variants and uses thereof}

신규 FGF-1 변이체 및 그의 용도에 관한 것이다.

인간 성장 인자는 상처 치유, 조직 재생, 혈관형성 및 종양 형성과 같은 다수의 복잡한 과정을 조율하는 데 중추적인 역할을 한다. 따라서, 다양한 질환 및 병태에서 상처 치유 및 재생 과정을 가속화시키거나, 암 성장 및 혈관형성을 저해하기 위한 단백질 치료제로서 성장 인자를 이용하는 데 엄청난 관심이 있다. 그러나, 수많은 재조합 성장 인자가 치료제로 개발되었음에도 불구하고, 단지 소수의 후보만이 임상 승인을 받을 만큼 효과적이었다. 이는 대부분, 일반적으로 낮은 안정성 및 빠른 혈액 청소율에 기인한 생체내 성장 인자의 짧은 유효 반감기로 인한 것이다. 치료용 성장 인자는 효과적이기 위해 장기간 동안 상처 부위에서 활성 상태를 유지하여야 한다. 그러나, 성장 인자는 생리적 온도와 프로테아제에 노출시 변성되거나 분해될 수 있다. 플라스민 및 메탈로프로테이나제와 같은 프로테아제는 특히 조직 리모델링에서 활성적이기 때문에, 프로테아제-매개 분해에 대한 내성이 특히 중요할 수 있다.

열 및 단백질분해 안정성을 향상시키기 위하여 다양한 성장 인자가 이전에 변형되었으며, 이것은 시험관내 기능 검정 및 생체내 실험 둘 다에서 이들의 생물학적 활성을 증대시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 세린 프로테아제, 산화 및 다이펩티딜 펩티다제 IV에 더 저항성이 되도록 설계된 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH)은 돼지의 체중 증가를 유도함에 있어서 야생형 GHRH보다 더 강력한 것으로 판명되었다. 그러나, 이러한 작제물의 대부분은 단백질-특이적 가설에 기초하여 합리적으로 설계되었고, 낮은 처리량 방식으로 시험되었다. 따라서, 안정성이 향상된 새로운 성장 인자 변이체를 생성하는 것은 어렵고 느린 프로세스 일 수 있다. 단백질분해 안정성이 증가된 조작 단백질의 경우에, 예측된 절단 부위에 직접 인접하여 단일 돌연변이가 종종 일어나는데, 이는 단백질분해 후 1차 서열 특이성 또는 질량 분광법에 기초한다. 그러나, 특정 프로테아제에 대한 단백질분해 안정성은 다인성이므로, 이 방법은 신뢰할 수 없다. 첫번째로, 특정 아미노산 서열을 절단함에 있어서 프로테아제의 활성은 절단 부위 부근의 다수의 아미노산에 의해 크게 영향을 받는다. 예측된 절단 부위(P1)의 직접 상류의 아미노산이 프로테아제의 1차 특이성과 정합하더라도, 최대 8개의 아미노산은 특정 부위에서 절단이 일어나는지의 여부 그리고 절단이 발생하는 속도를 결정할 수 있다. Gosalia 등의 간행물에서, 이들은 정확한 P1 부위의 상류의 두 아미노산(P2, P3)을 조합적으로 변화시키는 것조차 펩타이드 기질의 단백질분해 절단 속도에 급격히 영향을 미치는 것을 확인하였다. 두번째로, 단백질 기질의 단백질분해 절단은 또한 프로테아제의 효소 결합 포켓에 의해 절단 부위의 입체 접근성에 의해 결정된다. 돌연변이가 단백질 구조에 어떻게 영향을 미치는지를 예측하기 위해 계산 방법이 개선되었지만, 돌연변이가 프로테아제에 의한 잠재적 절단 부위의 접근성을 어떻게 변화시킬 수 있는지 예측하는 것은 계산상 비용이 많이 들고 기술적으로 도전과제가 남아 있다. 따라서, 합리적인 설계를 통해서 단백질분해 안정성을 증가시킬 돌연변이를 예측하는데 심각한 한계가 있다. 단백질분해 안정성을 조작하기 위한 용이하게 적응가능한 방법의 부족은 현재까지 단백질분해 안정성 성자 인자의 제한된 개발을 부분적으로 설명할 수 있다.

본 발명은 단백질분해 안정성 성장 인자를 조작하기 위한 방법을 제공함으로써 이러한 필요성을 충족시킨다. 본 발명은 또한 기재된 방법에 의해 생성된 단백질분해 안정성 FGF 펩타이드 변이체뿐만 아니라, 이러한 FGF 펩타이드 변이체를 제공한다.

일 양상은 서열번호 1의 야생형 FGF1과 비교하여 증가된 단백질 분해 안정성을 나타내는 인간 섬유아세포 성장 인자 1(fibroblast growth factor 1: FGF1)의 변이체를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 FGF1의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 Q40P, S47I, H93G, 및 K112N로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산이 치환된 변이체를 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 FGF1 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 FGF1 변이체를 유효성분으로 포함하는 상처 치유, 피부 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 FGF1 변이체를 포함하는 암 성장 및 혈관형성을 저해하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 서열번호 1의 야생형 FGF1과 비교하여 증가된 단백질 분해 안정성을 나타내는 인간 섬유아세포 성장 인자 1(fibroblast growth factor 1: FGF1)의 변이체를 제공한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 명명법 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학 및 혼성화에서의 실험실 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며 일반적으로 이용되는 것이다. 표준 기법이 핵산 및 펩타이드 합성에 사용된다. 기법 및 절차는 일반적으로 당업계의 통상적인 방법, 및 본 문헌 전체에 걸쳐 제공되는 다양한 일반적인 참조문헌에 따라 수행된다(일반적으로, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]을 참조하며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨). 본 명세서에서 사용되는 명명법 및 하기 기재된 분석 및 합성 유기 화학의 실험실 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 이용되는 것이다. 표준 기법, 또는 이의 변형이 화학 합성 및 화학 분석에 사용된다.

용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP, 및 상보적 서열뿐만 아니라, 명시적으로 표시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., 핵산 Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 인코딩되는 mRNA와 상호교환적으로 사용된다. 더욱이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 핵산은 이러한 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것으로 정의된다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드 사슬을 생성하는 데 관여하는 DNA의 절편을 의미한다. 이는 코딩 영역(리더 및 트레일러(trailer)) 앞 및 뒤의 영역뿐만 아니라, 개별 코딩 절편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있다.

핵산 또는 단백질에 적용될 때, 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질이 자연 상태에서 회합되어 있는 다른 세포 구성성분이 본질적으로 없음을 의미한다. 건조 또는 수용액일 수 있지만 바람직하게는 균질한 상태이다. 순도와 균질성은 전형적으로 분석 화학 기법, 예컨대, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 제제에 존재하는 지배적인 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 구체적으로, 단리된 유전자는 유전자에 측접하고 관심 유전자 이외의 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에서 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성함을 의미한다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 85% 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수하며, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수함을 의미한다. 단리된 핵산은 발현 벡터의 구성요소일 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 단리된 폴리펩타이드는 바람직하게는 범위로 표현되는 순도 수준을 가진다. 폴리펩타이드에 대한 순도 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 95% 초과이다. 폴리펩타이드가 약 90% 초과로 순수할 때, 그 순도는 또한 바람직하게는 범위로 표현된다. 순도 범위의 하한은 약 90%, 약 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 순도 범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100% 순도이다.

순도는 당업계에서 인정한 임의의 분석 방법(예를 들어, 은 염색 겔 상의 밴드 강도, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, HPLC, 질량분석법, 또는 유사한 수단)에 의해 결정된다.

용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 것뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조, 즉, 수소에 결합된 α 탄소, 카복실기, 아미노기, 및 R기를 가지는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이와 같은 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가지지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 유지한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이하지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 구조를 가지는 화학적 화합물을 지칭한다.

아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 상기한 특징 중 하나 이상을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe), 및 (Val: Ile, Leu)(원래 잔기: 예시적인 치환)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 상기 제시된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질의 기능적 또는 생물학적 등가물을 고려한다. 구체적으로, 본 발명의 실시형태는 모 폴리펩타이드와 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 95% 서열 동일성을 가지는 변이체를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 모 폴리펩타이드 서열, 예를 들어, 야생형 FGF1(서열번호 1)을 포함하는 야생형 성장 인자의 일부와 이러한 수준의 동일성을 가지는 변이체를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 변이체는 모 폴리펩타이드 또는 모 폴리펩타이드의 일부, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 바와 같은 야생형 FGF1(서열번호 1)을 포함하는 야생형 성장 인자와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩되는 폴리펩타이드를 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이와 같은 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 하나의 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당업자는 핵산의 각각의 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG를 제외함)은 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 산출할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포되어 있다.

용어 "모 폴리펩타이드"는 야생형 폴리펩타이드를 말하고 야생형 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열은 공개적으로 접근가능한 단백질 데이터베이스(예를 들어, EMBL Nucleotide Sequence Database, NCBI Entrez, ExPasy, Protein Data Bank 등)의 일부이다.

용어 "돌연변이 폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 변이체" 또는 "돌연변이단백질(mutein)" 또는 "변이 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드의 형태를 말하며, 여기서 이의 아미노산 서열은 이의 상응하는 야생형(모) 형태, 자연적으로 존재하는 형태 또는 임의의 다른 모 형태의 아미노산 서열과 상이하다. 돌연변이 폴리펩타이드는 돌연변이 폴리펩타이드를 초래하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 대체, 삽입, 결실 등을 포함할 수 있다.

용어 "모 폴리펩타이드에 상응하는"(또는 이 용어의 문법적 변형)은 본 발명의 폴리펩타이드를 기재하는 데 사용되며, 여기서 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 적어도 아미노산 변이의 존재에 의해서만 상응하는 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 상이하다. 전형적으로, 변이 폴리펩타이드 및 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 높은 비율의 동일성을 나타낸다. 일 예에서, "모 폴리펩타이드에 상응하는"은 변이 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일성을 가진다. 또 다른 예에서, 변이 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 모 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열과 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 동일성을 가짐을 의미한다. 일부 실시형태에서, 모 폴리펩타이드는 서열번호 1의 FGF1에 상응한다.

일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 성장 인자와 비교하여 단백질분해에 안정적인 변이체이다. 예시적인 실시형태에서, 변이체는 야생형과 비교하여 증가된 단백질분해 안정성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 성장 인자의 임의의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 변이체는 야생형 성장 인자가 결합하는 성장 인자 수용체에 대한 길항제이다.

일부 실시형태에서, 변이체는 FGF1의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 인간 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1)의 변이체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 얻어지는 FGF1 변이체가 서열번호 1의 야생형 FGF1과 비교하여 증가된 단백질분해 안정성을 나타내는 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 구성원을 포함하는 인간 섬유아세포 성장 인자 1(FGF1)의 변이체가 제공된다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 β-루프에서 또는 C-말단 근처에서 아미노산 치환, 아미노산 결실, 아미노산 부가 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 길항제이다. 본 발명은 적어도 하나의 위치에 모 FGF1 폴리펩타이드(야생형, 서열번호 1)에서 발견되지 않는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 FGF1 폴리펩타이드를 제공한다.

상기 FGF1의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 Q40P, S47I, H93G, 및 K112N로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산이 치환된 변이체인 것일 수 있다.

일부 실시형태에서, 변이체는 단리된 변이체이다. 일부 실시형태에서, 변이체는 본 폴리펩타이드에 존재하지 않는 적어도 하나의 바람직한 특징을 나타낸다. 예시적인 특징은 단백질분해 안정성의 증가, 열 안정성의 증가, 형태적 유연성의 증가 또는 감소 및 길항 활성의 증가를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 변이체는 이들 개선된 특징 중 2가지 이상의 임의의 조합을 나타낼 수 있다.

일부 실시형태에서, 변이체 FGF1은 FGFR 수용체에 대한 길항제이다. 일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진다.

일부 실시형태에서, 성장 인자 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 성장 인자 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 99.2%, 적어도 약 99.4%, 적어도 약 99.6% 또는 적어도 약 99.8%의 서열 동일성을 가진다.

일부 실시형태에서, FGF1 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 FGF1 변이체는 모 폴리펩타이드와 적어도 약 99.2%, 적어도 약 99.4%, 적어도 약 99.6% 또는 적어도 약 99.8%의 서열 동일성을 가진다.

본 발명은 하나 이상의 접합 파트너를 가지는 본 발명의 변이체의 접합체를 제공한다. 예시적인 접합 파트너는 중합체, 표적화제, 치료제, 세포독성제, 킬레이트제 및 검출가능한 작용제를 포함한다. 당업자는 이들 비제한적인 작용제 카테고리 간에 중복이 있음을 인식할 것이다.

접합 파트너 또는 "변형기"는 임의의 접합가능한 모이어티일 수 있다. 예시적인 변형기는 하기에서 논의된다. 변형기는 주어진 폴리펩타이드의 특성(예를 들어, 생물학적 또는 물리화학적 특성)을 변형하는 능력에 대하여 선택될 수 있다. 변형기의 사용에 의해 변경될 수 있는 예시적인 폴리펩타이드 특성은 약동학, 약력학, 대사 안정성, 생체분포, 수용성, 친유성, 조직 표적화 능력 및 치료 활성 프로파일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형기는 진단 응용 또는 시험관내 생물학적 분석 시스템에서 사용되는 폴리펩타이드의 변형에 유용하다.

일부 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 FGF1 변이체를 포함하는 성장 인자 변이체는 Fc 모이어티와 조합된다. Fc-모이어티는 바람직하게는 IgG인 인간 또는 동물 면역글로불린(Ig)으로부터 유래될 수 있다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다(예를 들어, 도 34 참조). 또한 Fc-모이어티는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG의 중쇄로부터 유래되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, Fc-모이어티는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 일부, 예를 들어, 도메인을 포함한다. 이와 같은 Ig 불변 영역은 바람직하게는 힌지, CH2, CH3 도메인, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 Ig 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc-모이어티는 적어도 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. Fc-모이어티는 IgG 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것이 더 바람직하다.

다수의 수용성 중합체가 당업자에게 알려져 있고, 본 발명을 실시하는 데 유용하다. 용어 수용성 중합체는, 당류(예를 들어, 덱스트란, 아밀로스, 히알루론산, 폴리(시알산), 헤파란, 헤파린 등); 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산); 핵산; 합성 중합체(예를 들어, 폴리(아크릴산), 폴리(에터), 예를 들어, 폴리(에틸렌 글라이콜)); 펩타이드, 단백질 등과 같은 종을 포함한다. 본 발명은 임의의 수용성 중합체로 실시될 수 있으며, 이때 유일한 제한은 중합체가 접합체의 나머지 부분이 부착될 수 있는 지점을 포함해야 한다는 것이다. 예를 들어, 문헌[Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); 및 Bhadra, et al., Pharmazie, 57:5-29 (2002)]을 참조한다.

상기 논의된 것과 유사한 또 다른 실시형태에서, 변형된 당은 수용성 중합체보다는 수불용성 중합체를 포함한다. 본 발명의 접합체는 또한 하나 이상의 수불용성 중합체를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 실시형태는 제어된 방식으로 치료용 폴리펩타이드를 전달하는 비히클로서 접합체의 사용에 의해 설명된다. 중합체 약물 전달 시스템은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991]을 참조한다. 당업자는 실질적으로 임의의 알려진 약물 전달 시스템이 본 발명의 접합체에 적용될 수 있음을 인식할 것이다.

다양한 실시형태에서, 변이체는 조직 재생을 위한 매트릭스의 구성성분에 접합된다. 예시적인 매트릭스는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 성장 인자 변이체의 적절한 매트릭스를 선택하고 이를 변형시키는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 성장 인자 변이체는 일반적으로 예를 들어, 눈, 간, 근육, 신경 및 심장 조직의 재생을 포함하여 재생 의학 응용에서 사용된다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 접합체의 구성성분으로서 표적화제의 존재로 인해 특정 조직에 선택적으로 국재화되는 접합체를 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 표적화제는 단백질이다. 예시적인 단백질은 트랜스페린(뇌, 혈액 풀), HS-당단백질(뼈, 뇌, 혈액 풀), 항체(뇌, 항체-특이적 항원이 있는 조직, 혈액 풀), 응고 인자 V 내지 XII(손상된 조직, 혈전, 암, 혈액 풀), 혈청 단백질, 예를 들어, α-산 당단백질, 페투인, α-태아 단백질(뇌, 혈액 풀), β2-당단백질(간, 죽상경화증 플라크, 뇌, 혈액 풀), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 및 EPO(면역 자극, 암, 혈액 풀, 적혈구 과잉생산, 신경보호), 알부민(반감기 증가), IL-2 및 IFN-α를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 성장 인자 변이체와 치료용 모이어티 사이의 접합체를 제공한다. 본 발명을 실시하는 데 유용한 치료용 모이어티는 다양한 약리학적 활성을 가지는 광범위한 약물 부류로부터의 약물을 포함한다. 치료제 및 진단제를 다양한 다른 종에 접합시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991]을 참조한다.

또 다른 양상은 상기 FGF1 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 상기 제시된 임의의 실시형태에 따른 성장 인자 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 이러한 핵산에 상보적인 핵산을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 제시된 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 양상은 상기 FGF1 변이체를 유효성분으로 포함하는 상처 치유, 피부 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 FGF1 변이체를 포함하는 암 성장 및 혈관형성을 저해하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

FGF1 변이체를 포함하는 성장 인자 변이체, 및 본 발명의 이들의 접합체는 광범위한 약제학적 응용을 가진다.

따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 비히클, 첨가제 또는 이들의 조합을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)]에서 확인된다. 약물 전달 방법에 대한 간략한 검토에 대해서는, 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참조한다.

약제학적 조성물은, 예를 들어, 국소, 경구, 비강, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방식을 위해 제형화될 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체는 바람직하게는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구 투여의 경우, 상기 담체 또는 고체 담체, 예컨대, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 및 마그네슘 카보네이트 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 마이크로스피어(예를 들어, 폴리락테이트 폴리글라이콜레이트)와 같은 생분해성 매트릭스가 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 위한 담체로 이용될 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로스피어는, 예를 들어, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다.

일반적으로, 약제학적 조성물은 피하 또는 비경구, 예를 들어, 정맥내로 투여된다. 따라서, 본 발명은 비경구 투여용 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해되거나 현탁된 화합물을 포함한다. 조성물은 또한 세제, 예컨대, 트윈(Tween) 20 및 트윈 80; 안정화제, 예컨대, 만니톨, 솔비톨, 수크로스, 및 트레할로스; 및 방부제, 예컨대, EDTA 및 메타-크레졸을 포함할 수 있다. 조성물은 생리학적 조건과 비슷하게 하는 데 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대, pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조절제, 습윤제, 세제 등을 포함할 수 있다.

이들 조성물은 통상적인 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장될 수 있거나, 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 합하여진다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9, 가장 바람직하게는 7 내지 8일 것이다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 글라이코펩타이드는 표준 소포-형성 지질로부터 형성된 리포좀에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980)], 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호 및 제4,837,028호에 기재된 바와 같이 다양한 방법이 리포좀을 제조하는 데 이용가능하다. 다양한 표적화제(예를 들어, 본 발명의 시알릴 갈락토사이드)를 사용한 리포좀의 표적화는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,957,773호 및 제4,603,044호 참조).

표적화제를 리포좀에 커플링시키기 위한 표준 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로, 표적화제, 또는 유도체화된 친유성 화합물, 예컨대, 본 발명의 지질-유도체화 글라이코펩타이드의 부착을 위해 활성화될 수 있는 지질 구성성분, 예컨대, 포스파티딜에탄올아민의 리포좀에의 혼입을 포함한다.

표적화 메커니즘은 일반적으로 표적 모이어티가 표적, 예를 들어, 세포 표면 수용체와의 상호작용을 위해 이용가능한 방식으로 리포좀의 표면 상에 위치할 것을 요구한다. 본 발명의 탄수화물은 리포좀이 당업자에게 알려진 방법(예를 들어, 장쇄 알킬 할라이드 또는 지방산을 각각 이용하여 탄수화물에 존재하는 하이드록실기의 알킬화 또는 아실화)을 사용하여 형성되기 전에 지질 분자에 부착될 수 있다.

대안적으로, 리포좀은 막을 형성할 때 커넥터 부분이 먼저 막에 통합되는 방식으로 제작될 수 있다. 커넥터 부분은 막에 단단히 포매되고 고정되는 친유성 부분을 가져야 한다. 이는 또한 리포좀의 수성 표면에서 화학적으로 이용가능한 반응성 부분을 가져야 한다. 반응성 부분은 이후에 첨가되는 표적화제 또는 탄수화물과 안정적인 화학적 결합을 형성하기에 화학적으로 적합하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 표적화제를 커넥터 분자에 직접 부착하는 것이 가능하지만, 대부분의 경우 화학적 가교 역할을 하는 제3 분자를 사용하는 것이 더 적합하며, 따라서 막에 있는 커넥터 분자를 소포 표면에서 3차원적으로 확장되는 표적화제 또는 탄수화물과 연결시킨다.

예를 들어, FGF1 변이체를 포함하여 본 발명의 방법에 의해 제조되는 성장 인자 변이체는 진단 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 표지화된 화합물은 염증이 있는 것으로 의심되는 환자에서 염증 또는 종양 전이 영역을 찾아내는 데 사용될 수 있다. 이러한 용도를 위해, 화합물은 125I, 14C, 또는 삼중수소로 표지화될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 본 발명은 질환 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이들 실시형태에서, 본 발명은 질환 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 데 충분한 양의 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예시적인 질환 상태는 암이다. 개시된 효현제(agonist) 변이체는, 특히 혈관신생을 위한 세포 성장의 촉진, 및 심혈관, 간, 근골격 및 신경 질환의 치료에 유용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 특정 폴리펩타이드 변이체는 과증식성 질환 또는 장애, 예를 들어, 다양한 형태의 암의 예방 또는 치료에 유용하다.

예시적인 실시형태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 폴리펩타이드 변이체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드 변이체가, 예를 들어, 다양한 눈 장애, 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 난소암, 두경부암, 난소암, 다발성 골수종, 간암, 위암, 식도암, 신장암, 비인두암, 췌장암, 중피종, 흑색종 및 교모세포종에서 FGF 반응성 종양 세포를 포함하는 다양한 FGF 반응성 장애의 치료에 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

예시적인 실시형태에서, 암은, 예를 들어, 결장직장, 편평 세포, 간세포, 신장, 유방 또는 폐의 암종이다.

폴리펩타이드 변이체는 종양 세포의 증식을 저해하거나 감소시키는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 접근법에서, 종양 세포는 종양 세포의 증식을 저해하거나 감소시키기 위해 치료적 유효량의 폴리펩타이드 변이체에 노출된다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 종양 세포 증식을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%만큼 저해한다.

특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 종양 세포의 증식을 저해하거나 감소시키는 데 사용되며, 여기서 변이체는 FGFR에 결합하는 FGF1의 능력을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, FGF1 폴리펩타이드 변이체는 상처 치유를 저해하거나 촉진시키는 데 사용된다.

추가적으로, 폴리펩타이드 변이체는 포유동물에서 종양 성장 또는 발달을 저해하거나 늦추는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 방법에서, 유효량의 폴리펩타이드 변이체는 포유동물에서 종양 성장을 저해하거나 늦추기 위해 포유동물에게 투여된다. 따라서, 폴리펩타이드 변이체는 예를 들어, 포유동물에서 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 방법은 치료적 유효량의 폴리펩타이드 변이체를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 종양을 치료하기 위해 단독으로 또는 또 다른 약제학적으로 활성인 분자와 조합하여 투여될 수 있다.

일반적으로, 폴리펩타이드 변이체의 치료적 유효량은 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 선택적으로 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 선택적으로 약 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 투여되는 양은 치료될 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 전달될 폴리펩타이드 변이체의 상대적인 생물학적 효능, 폴리펩타이드 변이체의 제형, 제형 중 부형제의 존재 및 유형, 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 달라질 것이다. 투여되는 초기 투약량은 원하는 혈중 농도 또는 조직 수준을 빠르게 달성하기 위해 상한 수준을 초과하여 증가될 수 있거나, 초기 투약량은 최적 투약량보다 적을 수 있고 일일 투약량은 특정 상황에 따라 치료 과정 동안 점차적으로 증가될 수 있다. 인간 투약량은, 예를 들어, 0.5 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏에서 실행되도록 설계된 종래의 I상 용량 증가 요법 연구에서 최적화될 수 있다. 투약 빈도는, 투여 경로, 투약량 및 치료될 질환 상태와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투약 빈도는 1일 1회, 1주 1회 및 2주마다 1회이다. 바람직한 투여 경로는 비경구, 예를 들어, 정맥내 주입이다. 단백질-기반 약물의 제형은 당업계의 통상의 기술 내에 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체, 예를 들어, 단백질-기반의 폴리펩타이드 변이체는 동결건조되고 투여시에 완충 식염수에서 재구성된다.

폴리펩타이드 변이체는 단독으로 또는 다른 약제학적으로 활성인 성분과 조합하여 투여될 수 있다. 다른 활성 성분, 예를 들어, 면역조절제는 폴리펩타이드 변이체와 함께 투여될 수 있거나, 폴리펩타이드 변이체 전 또는 후에 투여될 수 있다.

치료 용도를 위한 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 제형은, 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합된 폴리펩타이드 변이체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 건전한 의학적 판단 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충액, 담체, 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 양립가능하고 수용체에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 이와 관련하여, 약제학적으로 허용가능한 담체는 약제학적 투여와 양립가능한 임의의 및 모든 완충액, 용매, 분산매질, 코팅제, 등장화제 및 흡수지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적으로 활성인 물질에 대한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 알려져 있다.

제형은 투약 단위 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 약제학적 분야에 잘 알려진 임의의 방법을 포함하여 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)].

예시적인 실시형태에서, 폴리펩타이드 변이체는 시험관내 또는 생체내에서 진단 목적으로 사용되며, 폴리펩타이드 변이체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 직접 또는 간접적으로 표지화된다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사성 동위원소, 예컨대, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대, 플루오레세인 아이소티오시아네이트인 Cy5.5(GE Healthcare), Alexa Fluro® 염료(Invitrogen), IRDye® 적외선 염료(LI-COR® Biosciences), 로다민, 또는 루시페린; 효소, 예컨대, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제; 스핀 프로브, 예컨대, 스핀 표지; 또는 착색 입자, 예를 들어, 라텍스 또는 금 입자일 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는, 예를 들어, 문헌[Hunter et al. (1962) Nature 144: 945; David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain et al. (1981) J. Immunol Meth 40: 219; 및 Nygren (1982) J. Histochem and Cytochem. 30: 407]에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 다수의 접근법을 사용하여 검출가능한 모이어티에 접합될 수 있다. 표지는, 예를 들어, 시각적으로 또는 분광광도계 또는 다른 검출기 또는 다른 적절한 영상화 시스템의 도움을 이용하여 검출될 수 있다.

폴리펩타이드 변이체는 당업계에서 이용가능한 광범위한 면역분석 기법에 이용될 수 있다. 예시적인 면역분석은, 예를 들어, 샌드위치 면역분석, 경쟁 면역분석, 면역조직화학적 절차를 포함한다.

일 양상에 따른 신규 FGF-1 변이체 및 그의 용도에 의하면, 야생형 FGF1에 비하여 증가된 단백질 분해 안정성, 및 치료 효과를 가져 관련된 용도, 예를 들면, 상처 치유, 조직 재생, 암 성장의 억제 및 혈관신생의 억제 등에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 FGF-1 변이체의 열안정성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 다른 구체예에 따른 FGF-1 변이체의 열안정성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 FGF-1 변이체의 결합능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 FGF-1 변이체의 단백질 분해능 안정성을 나타낸 그래프이다.

이하, 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예 1. FGF-1 변이체의 제조

FGF-1의 안정성을 높이기 위해 Q40P와 S47I라는 두 가지 새로운 점 돌연변이를 설계했다. 또한, 5개의 안정화 단일 치환(H21Y, L44F, H93G 및 F108Y)을 포함시켰다. 모든 돌연변이 단백질은 박테리아 배양 리터당 20-60mg의 순수 단백질 수율로 발현되었습니다. 헤파린-결합 친화도를 변경하는 모든 치환 및 모든 재조합 단백질은 헤파린-세포로스 컬럼에서 정제하는 동안 매우 유사한 용리 프로파일을 나타내었다. 기본 구조 변이체의 원형 이색성(CD) 및 형광에 의해 확인되었습니다. 돌연변이의 형광 또는 원거리 및 근자외선 CD 스펙트럼에서 유의한 변화가 없었으며, 이는 2차 및 3차 구조가 보존되었음을 시사한다. CD 스펙트럼은 b-II 유형의 b-시트가 풍부한 단백질의 전형인 약 206 nm에서 최소값을 보였고 양의 피크를 보였다. 220 nm와 240 nm 사이, 중심은 228 nm 근처에 있었다.

실시예 2. FGF-1 변이체의 열안정성

FGF-변이체의 열안정성을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 1, 도 1 및 도 2에 나타내었다.

실시예 3. FGF-1 변이체의 결합능

신규 FGF-1 변이체의 결합능을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 돌연변이가 결합할 수 있음을 알 수 있었다. NIH3T3 세포에 존재하는 세포 표면 수용체에 대해 야생형 단백질과 유사한 친화도로 125I 표지된 야생형 FGF-1과 경쟁하는 능력에 차이가 없었다.

실시예 4. FGF-1의 단백질 분해 안정성

신규 FGF-1 변이체의 단백질 분해 안정성을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

야생형 FGF-1은 40 ℃에 가까운 T den 값을 가지고 있기 때문에 생물학적 활성을 37 ℃에서 수행하였다. 안정한 돌연변이체의 장점은 단백질 분해에 대한 저항성 때문일 수 있다. 생리학적 온도에서 안정한 돌연변이체의 펼쳐진 부분은 야생형보다 훨씬 낮고, 펼쳐진 단백질은 프로테아제 공격에 훨씬 더 취약하다는 것이 잘 알려져 있다. 단백질 분해 감수성, 열역학적 안정성 및 생물학적 활성 사이의 의존성을 조사하기 위해 선택된 안정한 돌연변이체를 트립신으로 처리했다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형 FGF-1은 37 ℃에서 프로테아제와 함께 1시간 인큐베이션 후에 거의 완전히 소화되었다. 대조적으로, 삼중 돌연변이 Q40P/S47I/H93G의 경우, 가장 긴 반감기와 가장 강한 유사분열 특성을 나타내었고, 트립신 소화 1시간 후에도 뚜렷한 단편화가 관찰될 수 없었고 FGF-1의 온전한 형태에 해당하는 밴드의 강도는 변하지 않았다.

<110> SP2 Therapeutics Inc. <120> Novel FGF-1 variants and uses thereof <130> PN211204 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys 1 5 10 15 Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp 20 25 30 Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala 35 40 45 Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr 50 55 60 Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn 65 70 75 80 Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr 85 90 95 Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys 100 105 110 Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140

Claims (10)

1. 서열번호 1의 야생형 FGF-1 아미노산 서열에서 Q40P, S47I, H21Y, L44F, H93G, F108Y 및 K112N로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산이 치환된, FGF-1 변이체.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 치환은 Q40P, S47I, 및 H93G인 것인 변이체.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 FGF-1 변이체는 섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor: FGFR) 길항제인 변이체.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 FGF-1 변이체는 검출가능한 모이어티, 수용성 중합체, 수불용성 중합체, 치료용 모이어티, 표적화 모이어티, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 구성원에 접합되는 변이체.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 FGF-1 변이체는 방사성동위원소, 상자성체, 형광단, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 검출가능한 모이어티에 접합되는 변이체.
6. 청구항 1의 FGF-1 변이체를 유효성분으로 포함하는 상처 치료 또는 피부 재생용 조성물.
7. 청구항 1의 FGF-1 변이체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료, 또는 혈관신생의 저해용 약학적 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 암은 결장, 구강, 간세포, 신장, 유방, 폐, 난소, 위, 뇌, 전립선, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
9. 청구항 1의 FGF-1 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
10. 청구항 9의 핵산이 발현되는, 단리된 세포.