KR20230111529A - An immune biosensor, an immune bio kit including the same, a method of manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor and a method of regenerating the immune biosensor. - Google Patents

An immune biosensor, an immune bio kit including the same, a method of manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor and a method of regenerating the immune biosensor. Download PDF

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KR20230111529A KR1020220007489A KR20220007489A KR20230111529A KR 20230111529 A KR20230111529 A KR 20230111529A KR 1020220007489 A KR1020220007489 A KR 1020220007489A KR 20220007489 A KR20220007489 A KR 20220007489A KR 20230111529 A KR20230111529 A KR 20230111529A
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recognition layer
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한림대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명의 면역 바이오센서는 분자 인식층을 포함하고, 분자 인식층은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 것을 특징으로 한다.The immune biosensor of the present invention includes a molecular recognition layer, and the molecular recognition layer is characterized in that an orientation-controlled antibody that specifically binds to a biological material is covalently fixed.

Description

면역 바이오센서, 이를 포함하는 면역 바이오 키트, 상기 면역 바이오 센서의 분자 인식층 제조방법 및 상기 면역 바이오센서의 재생방법{An immune biosensor, an immune bio kit including the same, a method of manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor and a method of regenerating the immune biosensor.}An immune biosensor, an immune bio kit including the same, a method of manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor and a method of regenerating the immune biosensor.}

본 발명은 면역 바이오센서, 이를 포함하는 면역 바이오 키트, 상기 면역 바이오 센서의 분자 인식층 제조방법 및 상기 면역 바이오센서의 재생방법에 관한 것이다. 구체적으로, 재사용이 가능한 면역 바이오센서, 이를 포함하는 면역 바이오 키트, 상기 면역 바이오 센서의 분자 인식층 제조방법 및 상기 면역 바이오센서의 재생방법에 관한 것이다. The present invention relates to an immune biosensor, an immune biosensor kit including the same, a method for manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor, and a method for regenerating the immune biosensor. Specifically, it relates to a reusable immune biosensor, an immune biosensor including the same, a method for manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor, and a method for regenerating the immune biosensor.

면역 바이오센서의 분자 인식층은 바이오센서의 주요 구성요소 중 하나로 분석대상 물질을 선택적으로 인식하고 분석대상 물질과 특이적 결합 및 항원-항체반응이 일어나는 곳이다. 일반적으로 분자 인식층은 면역 바이오센서 표면에 고정된 항체로 구성된다. The molecular recognition layer of the immune biosensor is one of the main components of the biosensor, and is a place where a substance to be analyzed is selectively recognized and specific binding and antigen-antibody reactions with the substance to be analyzed occur. In general, the molecular recognition layer consists of antibodies immobilized on the surface of an immune biosensor.

면역 바이오센서의 감도를 향상시키기 위해서는 항체와 항원 간의 반응이 충분히 일어날 수 있도록 항체의 항원 결합 부위가 최대한으로 노출되어야 한다. 하지만, 항체를 2차원적 기질에 무작위로 고정시킬 경우, 고정화된 항체들 중에서 결합에 적합한 배향을 갖는 항체가 20% 미만으로 나타나는 것으로 알려진다. 따라서, 항체의 항원 결합 부위가 최대한으로 노출될 수 있도록 하는 항체 고정화 기술이 요구된다.In order to improve the sensitivity of the immune biosensor, the antigen-binding site of the antibody should be maximally exposed so that a reaction between the antibody and the antigen can occur sufficiently. However, it is known that when antibodies are randomly immobilized on a two-dimensional substrate, less than 20% of the immobilized antibodies have an orientation suitable for binding. Therefore, an antibody immobilization technique that allows the antigen-binding site of the antibody to be maximally exposed is required.

한편, 바이오센서는 바이오 물질들 간의 특이적이고 안정한 결합력을 신호검출의 원리로 분석한다. 그러나 이와 같이 특이적이고 안정한 결합에 기인하여 현재까지 개발된 바이오센서들은 한번 사용하면 재생이 불가능한 한계가 있어 비경제적인 문제점이 있다. 한 번의 특이적 결합반응이 유도되고 나면 사용된 바이오센서의 표면은 비가역적으로 측정 대상물에 의하여 변형되기 때문이다.On the other hand, the biosensor analyzes the specific and stable binding force between biomaterials as a signal detection principle. However, biosensors developed to date due to such specific and stable binding have limitations in that they cannot be reproduced once used, and thus have uneconomical problems. This is because once a specific binding reaction is induced, the surface of the biosensor used is irreversibly deformed by the measurement object.

따라서, 경제적 효과를 위한 방안으로 바이오센서를 재생할 수 있는 연구가 진행되고 있으나, 바이오 물질을 인지할 수 있는 분자 인식층 전체가 제거되는 문제점이 발생하여 분자 인식층을 새로 형성하기 위한 추가의 시간 및 비용이 소요되고 있다. 이에, 보다 경제적인 효과를 도출할 수 있는 재사용 가능한 바이오센서에 대한 기술 개발이 요구된다.Therefore, research to regenerate the biosensor is being conducted as a method for economic effect, but there is a problem in that the entire molecular recognition layer capable of recognizing biomaterials is removed, and additional time and cost are required to newly form the molecular recognition layer. Accordingly, it is required to develop a technology for a reusable biosensor that can produce more economical effects.

한편, 전술한 배경기술은 반드시 본 발명의 출원 전에 일반 공중에게 공개된 공지기술이라 할 수는 없다.On the other hand, the foregoing background art is not necessarily known art disclosed to the general public prior to the filing of the present invention.

대한민국 등록특허 제10-2200173호Republic of Korea Patent No. 10-2200173

본 발명의 일 실시예는 결합을 위한 항체 배향이 적합한 동시에 재사용이 가능하도록 구성된 분자 인식층을 포함하는 면역 바이오센서 및 상술한 분자 인식층의 제조방법을 제공하는 데에 목적이 있다.An object of the present invention is to provide an immune biosensor including a molecular recognition layer configured to be reusable while suitable for antibody orientation for binding, and a method for manufacturing the above-described molecular recognition layer.

또한, 본 발명의 일 실시예는 상술한 면역 바이오센서를 포함하는 생체 검출용 키트를 제공할 수 있다.In addition, an embodiment of the present invention may provide a kit for detecting a living body including the immune biosensor described above.

또한, 본 발명의 일 실시예는 상술한 면역 바이오센서를 재사용할 수 있는 면역 바이오센서의 재생방법을 제공하는 데에 목적이 있다.In addition, an object of one embodiment of the present invention is to provide a method for regenerating an immune biosensor capable of reusing the above-described immune biosensor.

상술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 면역 바이오센서는 분자 인식층을 포함하고, 상기 분자 인식층은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 것을 특징으로 한다.As a technical means for achieving the above-described technical problem, the immune biosensor of the present invention includes a molecular recognition layer, and the molecular recognition layer is characterized in that an orientation-controlled antibody that specifically binds to a biological material is covalently fixed.

예컨대, 분자 인식층은 세번 이내 반복사용이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.For example, the molecular recognition layer may be characterized in that it can be repeatedly used within three times.

예컨대, 분자 인식층은 세번 반복사용 시, 450 nm의 파장에서 TMB 반응의 광학 밀도(OD) 값이 최초 면역반응 시 OD 값의 70% 이상으로 나타나는 것을 특징으로 할 수 있다.For example, when the molecular recognition layer is repeatedly used three times, the optical density (OD) value of the TMB reaction at a wavelength of 450 nm may be characterized by appearing as 70% or more of the OD value during the initial immune reaction.

예컨대, 분자 인식층은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.For example, the molecular recognition layer may be characterized in that it includes an outer membrane of E. coli in which the Z-domain is self-labeled.

예컨대, 생체 물질은 항원, 항체, 펩타이드, 단백질, 박테리아, 바이러스, 및 진균으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.For example, the biological material may be characterized in that it is any one selected from the group consisting of antigens, antibodies, peptides, proteins, bacteria, viruses, and fungi.

예컨대, 면역 바이오센서는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 및 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.For example, the immune biosensor may be selected from the group consisting of a SURFACE PLASMON RESONANCE (SPR) biosensor, a QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE (QCM) biosensor, a SURFACE ACOUSTIC WAVE (SAW) biosensor, and a FLEXURAL PLATE WAVE (FPW) biosensor.

본 발명의 생체 물질 검출용 키트는 분자 인식층을 포함하고, 상기 분자인식층은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 바이오센서, 트윈-20(tween-20) 및 글리신 용액이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼를 포함한다.The kit for detecting a biological material of the present invention includes a molecular recognition layer, wherein the molecular recognition layer comprises an immune biosensor in which an orientation-controlled antibody that specifically binds to a biological material is covalently immobilized, and a buffer for reproducing an immune biosensor containing tween-20 and a glycine solution.

예컨대, 면역 바이오센서 재생용 버퍼는 버퍼의 총 함량을 기준으로 2%의 트윈-20(tween-20) 및 0.1M 글리신이 함유된 것을 특징으로 할 수 있다.For example, the buffer for reproducing the immune biosensor may contain 2% of tween-20 and 0.1M glycine based on the total content of the buffer.

본 발명의 면역 바이오센서용 반자 인식층 제조방법은 항체를 배향제어 하는 항체 배향제어단계, 배향제어된 항체를 Disccinimidly(디숙신이미딜) 기반의 가교제 처리하여 고체 지지체 표면에 공유결합 시키는 화학적 고정단계를 포함한다.The method for manufacturing a semi-magnetic recognition layer for an immune biosensor of the present invention includes an antibody orientation control step of controlling the orientation of an antibody, and a chemical fixation step of covalently binding the orientation-controlled antibody to the surface of a solid support by treating the orientation-controlled antibody with a disccinimidly (disuccinimidyl)-based crosslinking agent.

예컨대, 항체 배향제어단계는Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막을 고체 지지체 표면에 코팅하는 단계 및 코팅된 고체 지지체 표면에 항체를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.For example, the antibody orientation control step may include coating the surface of the solid support with the outer cell membrane of E. coli labeled with the Z-domain, and treating the surface of the coated solid support with the antibody.

예컨대, 화학적 고정단계는 디숙신이미딜 글루타레이트(disuccinimidyl glutarate, DSG), 디숙신이미딜 수베레이트 (disuccinimidyl suberate, DSS) 및 폴리(에틸렌 글리콜)일화 비스(설포숙신이미딜)수베레이트 (poly(ethylene glycol)ylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate, BS(PEG)5) 중 적어도 어느 하나를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.For example, the chemical fixation step may include a step of treating at least one of disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS), and poly(ethylene glycol)ylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS(PEG) 5 ).

예컨대, 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법은 DSG를 31μM의 농도로 처리하는 하는 단계를 포함할 수 있다.For example, a method for preparing a molecular recognition layer for an immune biosensor may include treating DSG at a concentration of 31 μM.

예컨대, 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법은 DSS를 500μM의 농도로 처리하는 하는 단계를 포함할 수 있다.For example, a method for preparing a molecular recognition layer for an immune biosensor may include a step of treating DSS at a concentration of 500 μM.

예컨대, 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법은 BS(PEG)5를 125μM의 농도로 처리하는 하는 단계를 포함할 수 있다.For example, a method for preparing a molecular recognition layer for an immune biosensor may include a step of treating BS(PEG) 5 at a concentration of 125 μM.

본 발명의 면역 바이오센서 재생방법은 분자인식층을 포함하고, 상기 분자인식층은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 바이오센서를 이용하여 면역 반응을 수행한 후, 트윈-20(tween-20) 및 0.1M 글리신이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼로 상기 면역 바이오센서를 세척하는 단계를 포함한다.The immune biosensor regeneration method of the present invention includes a molecular recognition layer, wherein the molecular recognition layer is characterized in that an orientation-controlled antibody that specifically binds to a biological material is covalently fixed thereto. After performing an immune reaction using an immune biosensor, washing the immune biosensor with an immune biosensor regeneration buffer containing tween-20 and 0.1 M glycine.

전술한 본 발명의 과제 해결 수단 중 어느 하나에 의하면, 본 발명의 일 실시예 따른 면역 바이오센서는 한 번의 특이적 결합반응이 유도된 후 여러 차례 반복적으로 재사용할 수 있다.According to any one of the above-described means for solving the problems of the present invention, the immune biosensor according to an embodiment of the present invention can be repeatedly reused several times after a specific binding reaction is induced once.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 바이오센서는 반복 사용 시 분자 인식층 전체가 제거되어 재사용 때마다 분자 인식층을 새로 형성하여야 하는 문제점을 방지할 수 있다.In addition, the immune biosensor according to an embodiment of the present invention can prevent the problem of having to form a new molecular recognition layer every time it is reused because the entire molecular recognition layer is removed when repeatedly used.

본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. Effects obtainable in the present invention are not limited to the effects mentioned above, and other effects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 도 1의 항체 배향제어(S10)단계의 순서도이다.
도 3a 내지 3h는 가교제의 종류에 따른 OD값 및 1차 HRP 처리 시 면역분석 값을 참조로 사용하여 계산된 상대 OD값을 나타낸 것이다.
도 4는 각각의 가교제를 최적의 농도로 처리하였을 경우 1차 HRP 처리 시 면역분석 값을 참조로 사용하여 계산된 450 nm 파장에서의 상대 OD 값을 나타내는 도면이다.
도 5는 최적의 가교제 조건을 이용한 재생 면역 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM) 및 일반 대장균을 기반으로 한 면역분석 결과를 나타낸 것으로, 재생 처리 횟수에 따른 면역분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 SPR 바이오센서용 분자 인식층에 대한 SPR 반응 신호값을 확인한 결과를 나타낸 것이다.1 is a flowchart illustrating a method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a flow chart of the antibody orientation control (S10) step of Figure 1.
3a to 3h show OD values according to types of crosslinking agents and relative OD values calculated using immunoassay values upon first HRP treatment as reference.
4 is a diagram showing relative OD values at a wavelength of 450 nm calculated using immunoassay values as references when each cross-linking agent was treated at an optimal concentration.
5 is a graph showing the results of regeneration immunoassay using optimal crosslinking agent conditions.
6 is a graph showing the immunoassay results based on the Z-domain self-labeled outer cell membrane (OM) of E. coli and general E. coli, and showing the immunoassay results according to the number of regeneration treatments.
7 shows the result of confirming the SPR response signal value for the molecular recognition layer for the SPR biosensor.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art can easily practice the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein. And in order to clearly explain the present invention in the drawings, parts irrelevant to the description are omitted, and similar reference numerals are attached to similar parts throughout the specification.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 구성을 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part is said to be “connected” to another part, this includes not only the case where it is “directly connected” but also the case where it is “indirectly connected” with another component intervening therebetween. In addition, when a certain component is said to "include", this means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명은 재사용이 가능한 면역 바이오센서를 제공하는 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a reusable immune biosensor.

면역 바이오센서란, 바이오센서 중에서 특이적인 항원-항체 결합반응을 이용하는 분자 인식층을 포함하고 있는 바이오센서로, 시료 내의 분석 대상물을 센서 표면에 선택적으로 흡착한 후, 흡착량을 전기신호로 출력하는 모든 기기를 말한다. An immune biosensor is a biosensor that includes a molecular recognition layer that uses a specific antigen-antibody binding reaction among biosensors. After selectively adsorbing an analyte in a sample to the sensor surface, it refers to any device that outputs the amount of adsorption as an electrical signal.

면역 바이오센서는 여러 성분이 함유된 시료 내에서 분석 대상물만을 선택적으로 인식 및 흡착하는 분자 인식층(molecular recognition layer), 인식된 흡착량을 전기신호화 하는 신호 변환기(signal transducer) 및 신호를 발생시키는 신호 발생층(signal-generating part)으로 구성된다. An immune biosensor consists of a molecular recognition layer that selectively recognizes and adsorbs only the analyte in a sample containing various components, a signal transducer that converts the recognized adsorbed amount into an electrical signal, and a signal-generating part that generates a signal.

분자 인식층은 인식 및 흡착하고자 하는 분석 대상물을 선택적으로 인지하는 항체를 센서 표면에 결합시킨 것이며, 분자 인식층에 고정된 항체는 분석 대상물을 특이적으로 흡착 또는 결합하게 되고, 이와 같이 분자 인식층에 분석 대상물이 흡착 또는 결합하면 다양한 물리적인 변화가 발생한다. 신호 변환기는 상기와 같이 분자 인식층에 결합된 항체와 분석 대상물 간의 특이적 결합에 의하여 발생한 물리적 변화를 전기 신호화시키는 장치로서, 신호화된 물리적 변화는 신호 발생층(signal-generating part)을 통해 수치화 또는 이미지화 된다.The molecular recognition layer is obtained by binding an antibody that selectively recognizes an analyte to be recognized and adsorbed to the sensor surface, and the antibody immobilized on the molecular recognition layer specifically adsorbs or binds to the analyte. When the analyte is adsorbed or bound to the molecular recognition layer, various physical changes occur. The signal transducer is a device that electrically converts physical changes generated by specific binding between an antibody bound to a molecular recognition layer and an analysis target as described above, and the signalized physical changes are digitized or imaged through a signal-generating part.

본 발명의 일 실시예에 따른 면역 바이오센서는 분자 인식층, 신호 변환기, 신호 발생층으로 구성될 수 있다. An immune biosensor according to an embodiment of the present invention may be composed of a molecular recognition layer, a signal transducer, and a signal generating layer.

면역 바이오센서를 이용하여 분석 대상 물질의 검출 효율을 증진시키기 위해서는, 항체가 적합한 배향을 가진 상태로 분자 인식층에 충분한 밀도로 고정되어야 한다.In order to improve the detection efficiency of the analyte using the immune biosensor, the antibody should be immobilized at a sufficient density on the molecular recognition layer in a state with a suitable orientation.

이에, 본 발명의 분자 인식층은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)과 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체로 구성될 수 있다. Thus, the molecular recognition layer of the present invention may be composed of an antibody that specifically binds to the outer membrane of E. coli autodisplaying the Z-domain and to a biological material.

타겟 분석대상 물질인 타겟 항원과 결합하는 특이적 항체는 Y자 형태의 구조를 가지며, 항원과 결합하는 부위는 이중의 2개 말단 Fab 영역과 항원과 결합하지 않는 다른쪽 가지의 말단 Fc 영역으로 구성된다. 항체와 항원간의 반응이 충분히 일어나기 위해서는 항체의 Fab 영역이 최대한으로 노출되어야 한다. 즉, 항체의 Fab 영역이 바깥쪽의 방향성으로 배향되어야 한다.A specific antibody that binds to a target antigen, which is a target analyte, has a Y-shaped structure, and the antigen-binding site is composed of a double terminal Fab region and a terminal Fc region of the other branch that does not bind to the antigen. In order for the reaction between the antibody and the antigen to occur sufficiently, the Fab region of the antibody should be maximally exposed. That is, the Fab region of the antibody should be oriented in an outward direction.

단백질 A(protein A)는 항체 결합 단백질로서 이뮤노글로불린(Immunoglobulin, Ig) 등의 면역 단백질과 선택적 친화성이 높은 단백질이다. 단백질 A는 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus) 유래의 막 결합 단백질로 5개의 도메인을 가지고 있으며, 이중 B 도메인에서 유래한 Z-도메인은 항체 Fc 부분과의 결합 특이성을 갖는다.Protein A is an antibody-binding protein and has high selective affinity for immune proteins such as immunoglobulin (Ig). Protein A is a membrane-bound protein derived from Staphylococcus aureus and has five domains, and the Z-domain derived from the double B domain has binding specificity to the antibody Fc portion.

단백질 A의 Z-도메인은 단백질 A 가 미생물의 세포 외벽 표면에 발현 가능하면서도, 다양한 면역 단백질, 특히 IgG 등과 특이적이고 강력한 친화성을 나타내는 부위로서, 미생물로부터 발현시켜 정제하여 사용할 수도 있고, 또는 합성하여 사용할 수도 있다. 본 발명에 따른 단백질 A의 Z-도메인은 서열번호 1로 기재된 펩타이드 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 서열번호 2의 염기서열(폴리뉴클레오티드)에 의해 코딩되는 것일 수 있다.The Z-domain of protein A is a site where protein A can be expressed on the cell outer wall surface of microorganisms and shows specific and strong affinity to various immune proteins, especially IgG, etc. The Z-domain of protein A according to the present invention may consist of the peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or may be encoded by the nucleotide sequence (polynucleotide) of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막은 표면발현기술을 이용하여 Z-도메인을 대장균의 외막에 발현한 것이다.The outer cell membrane of E. coli in which the Z-domain of the present invention is self-labeled is obtained by expressing the Z-domain on the outer membrane of E. coli using surface expression technology.

자가 표지(Autodisplay)는 일종의 표면발현기술 중 하나로, 그람 음성 박테리아의 외막(outermembrane)에 타겟 단백질을 AIDA-I(adhesin involved in diffuse adherence)과 같은 자동트랜스퍼(autotransporter)에 융합하여 발현시킨다. 이때 타겟 단백질의 N-말단은 신호 펩타이드와 연결되고, C-말단은 링커, β과 연결되어 발현된다. 신호 펩타이드는 발현된 단백질이 내막(inner membrane)을 통과하여 페리플라즘(periplasm)으로 이동할 수 있게 한다. 이렇게 발현된 타겟 단백질은 별도의 인위적인 처리 박테리아의 외부 세포막(outermembrane)에 β-barrel을 통해 C-말단이 고정된 타입 Va 분비 기작(secretion mechanism)을 통해 정착하게 된다.Autodisplay is a type of surface expression technology, in which a target protein is fused to an autotransporter such as AIDA-I (adhesin involved in diffuse adherence) and expressed on the outer membrane of Gram-negative bacteria. At this time, the N-terminus of the target protein is linked to a signal peptide, and the C-terminus is linked to a linker, β, to express. The signal peptide allows the movement of the expressed protein across the inner membrane to the periplasm. The target protein expressed in this way settles on the outer cell membrane (outermembrane) of a separate artificially treated bacterium through a type Va secretion mechanism in which the C-terminus is fixed through a β-barrel.

IgG 결합능을 가지는 Z-도메인이 자가 표지를 통하여 대장균 외부 세포막에 발현되면, Z-도메인의 방향은 항상 같은 구조를 이루기에, 여기에 항체(capture antibody)를 처리하게 되면 항체의 Fc부분이 대장균의 외부 세포막 쪽으로 배향되어 항원 결합부위를 노출시킬 수 있게 되므로, 궁극적으로 항체의 배향 조절을 통해 바이오센서의 감도를 향상시킬 수 있다.When the Z-domain having IgG-binding ability is expressed on the outer cell membrane of E. coli through self-labeling, the orientation of the Z-domain always forms the same structure, so when the antibody (capture antibody) is treated thereon, the Fc portion of the antibody is oriented toward the outer cell membrane of E. coli to expose the antigen-binding site, so ultimately the sensitivity of the biosensor can be improved by adjusting the orientation of the antibody.

즉, 본 발명의 분자 인식층은 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막에 배향제어 된 항체가 결합된 상태로 구성될 수 있다. That is, the molecular recognition layer of the present invention may be configured in a state in which an orientation-controlled antibody is bound to the outer cell membrane of E. coli whose Z-domain is self-labeled.

또한, 본 발명의 분자 인식층은 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막과 배향제어 된 항체가 공유결합을 이룬 상태로 고정될 수 있다. 구체적으로, 디숙신이미딜(Disccinimidly) 기반의 가교제에 의해 공유결합을 이룬 상태로 화학적 고정될 수 있다. 이에 대한 자세한 내용은 후술하도록 한다.In addition, the molecular recognition layer of the present invention can be immobilized in a state in which the Z-domain self-labeled E. coli outer cell membrane and the controlled antibody are covalently bonded. Specifically, it may be chemically fixed in a covalently bonded state by a disuccinimidyl-based crosslinking agent. Details on this will be described later.

본 발명의 일 실시예에 따른 면역 바이오센서의 상술한 분자 인식층 외에 신호 변환기 및 신호 발생층은 종래 면역 바이오센서의 구조 및 제조방법이 동일할 수 있다.In addition to the above-described molecular recognition layer of the immune biosensor according to an embodiment of the present invention, the structure and manufacturing method of the conventional immune biosensor may be the same as the signal transducer and signal generation layer.

한편, 본 발명의 면역 바이오센서는 항원-항체의 면역 반응을 이용하여 분석대상물질을 검출할 수 있는 것으로, SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM(QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 또는 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서일 수 있고, 바람직하게는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서일 수 있다.On the other hand, the immuno biosensor of the present invention can detect analytical materials using an antigen-antibody's immune response, SPR (Surface Plasmon Resonance) biosensor, QCM (QCM) biosensor, SAW (SURFACE ACOUSTIC W AVE) may be a biosensor or a FPW (FLEXURAL PLATE WAVE) biosensor, preferably a SPR (surface plasmon resonance) biosensor.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조방법을 나타낸 순서도이다.1 is a flowchart illustrating a method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor according to an embodiment of the present invention.

도 1을 참조하면, 본 발명의 분자 인식층 제조방법은 항체를 배향제어 하는 항체 배향제어(S10) 단계, 배향제어 된 항체를 Disccinimidly 기반의 가교제 처리하여 고체 지지체 표면에 공유결합 시키는 화학적 고정(S20) 단계를 포함한다.Referring to FIG. 1, the method for manufacturing a molecular recognition layer of the present invention includes an antibody orientation control (S10) step of controlling the orientation of an antibody, and a chemical fixation (S20) step of covalently binding the orientation-controlled antibody to the surface of a solid support by treating the orientation-controlled antibody with a disccinimidly-based crosslinking agent.

항체 배향제어(S10)단계는 항체의 항원이 결합하는 Fab 부분이 노출될 수 있도록 항체의 배향을 제어하는 단계일 수 있다. The antibody orientation control step (S10) may be a step of controlling the orientation of the antibody so that the Fab portion to which the antigen of the antibody binds may be exposed.

도 2는 도1의 항체 배향제어(S10)단계의 순서도이다.Figure 2 is a flow chart of the antibody orientation control (S10) step of Figure 1.

도 2를 참조하면, 항체 배향제어(S10)단계는 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막을 고체 지지체 표면에 코팅(S11)하는 단계 및 코팅된 고체 지지체 표면에 항체를 처리(S12)하는 단계를 포함할 수 있다.Referring to FIG. 2, the antibody orientation control step (S10) may include coating (S11) the outer cell membrane of E. coli labeled with the Z-domain on the surface of a solid support and treating the surface of the coated solid support with an antibody (S12).

Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막을 고체 지지체 표면에 코팅(S11)하는 단계는 항체의 Fc 부분이 대장균의 외부 세포막 쪽으로 배향되도록 하기 위한 단계일 수 있다.The step of coating (S11) the outer cell membrane of E. coli labeled with the Z-domain on the surface of the solid support may be a step for orienting the Fc portion of the antibody toward the outer cell membrane of E. coli.

Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막을 고체 지지체 표면에 코팅(S11)하는 단계는 단백질 A의 Z 도메인 코딩 유전자를 발현 벡터에 클로닝하고, 발현 벡터 미생물로서 대장균을 선택하여 형질전환시킨 뒤, 형질전환된 대장균을 배양하여 대장균의 외부 세포막에 단백질 A의 Z 도메인이 발현된 대장균을 제조한 후, 대장균으로부터 Z 도메인이 자가 표지된 외부 세포막을 분리한 다음, 이를 고체 지지체 표면 상에 코팅하는 방식으로 수행될 수 있다.The step of coating the outer cell membrane of E. coli self-labeled with the Z-domain on the surface of the solid support (S11) can be performed by cloning the gene encoding the Z domain of protein A into an expression vector, selecting and transforming E. coli as an expression vector microorganism, culturing the transformed E. coli to prepare E. coli expressing the Z domain of protein A on the outer cell membrane of E. coli, separating the outer cell membrane self-labeled with the Z domain from E. coli, and then coating it on the surface of the solid support.

코팅된 고체 지지체 표면에 항체를 처리(S12)하는 단계는 생체 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 고체 지지체 표면에 결합시키기 위한 단계일 수 있다.The step of treating the surface of the coated solid support with an antibody (S12) may be a step for binding an antibody capable of specifically binding to a biological material to the surface of the solid support.

항체를 처리하면, 항체의 Fc 부분은 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막 쪽으로 배향되어 결합될 수 있다. 이때, Z-도메인과 항체는 수소결합을 통해 2차 결합으로 결합될 수 있다.When the antibody is treated, the Fc portion of the antibody can be oriented and bound to the outer cell membrane of E. coli in which the Z-domain is self-labeled. At this time, the Z-domain and the antibody may be bonded through a secondary bond through a hydrogen bond.

항체의 배향제어가 완료되면, 배향제어 된 항체를 Disccinimidly 기반의 가교제로 처리하여 화학적 고정(S20)할 수 있다.When the orientation control of the antibody is completed, the orientation-controlled antibody may be chemically fixed (S20) by treating with a Disccinimidly-based cross-linking agent.

화학적 고정(S20)단계는 Z-도메인과 항체 사이에 공유결합을 형성시키기 위한 단계일 수 있다.The chemical fixation (S20) step may be a step for forming a covalent bond between the Z-domain and the antibody.

공유결합은 2차 결합보다 강한 결합력을 형성하므로, 화학적 가교에 의한 공유 고정화는 Z-도메인과 항체 사이에 보다 강한 결합을 제공할 수 있다. 하지만, 가교제 처리 시, 가교제가 항체의 항원과 결합하는 부위에 결합하면 항원 결합 친화도가 감소할 수 있다. 따라서, 항원 결합 친화도를 감소시키지 않으며 강한 결합을 제공하도록 하는 화학적 가교제를 사용하여야 한다.Since covalent bonds form stronger binding forces than secondary bonds, covalent immobilization by chemical cross-linking can provide stronger bonds between the Z-domain and the antibody. However, upon treatment with a cross-linking agent, antigen-binding affinity may decrease if the cross-linking agent binds to an antigen-binding site of an antibody. Therefore, a chemical crosslinker that does not reduce antigen binding affinity and provides strong binding should be used.

이에, 본 발명의 화학적 고정(S20)단계는 Disccinimidly 기반의 가교제를 처리하는 방식으로 수행될 수 있다.Accordingly, the chemical fixation (S20) step of the present invention may be performed in a manner of treating a Disccinimidly-based crosslinking agent.

Disccinimidly 기반의 가교제로는 디숙신이미딜 글루타레이트 (disuccinimidyl glutarate, DSG), 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate, DSS) 및 폴리(에틸렌 글리콜)일화 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(poly(ethylene glycol)ylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate, BS(PEG)5)가 사용될 수 있다.Disccinimidly-based crosslinking agents include disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and poly (ethylene glycol) ylated bis (sulfosuccinimidyl) suberate (poly (ethylene glycol) ylated bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS (PEG) 5 ) can be used.

Disccinimidly 기반의 가교제는 항체의 항원과 결합하는 부위에 결합하지 않아, 항체의 항원 결합 활성에 영향을 미치지 않을 수 있다. 구체적으로, 항체가 항원을 감지 및 포착하는 활성이 유지될 수 있다.Disccinimidly-based crosslinkers do not bind to the antigen-binding site of the antibody, and thus may not affect the antigen-binding activity of the antibody. Specifically, the activity of the antibody to detect and capture the antigen can be maintained.

또한, Disccinimidly 기반의 가교제는 항체의 방향제어를 유지시킬 수 있다.In addition, Disccinimidly-based crosslinkers can maintain antibody directionality.

나아가, Disccinimidly 기반의 가교제는 Z-도메인과 항체 사이에 공유결합을 형성시키므로, 면역 바이오센서 재사용 시, 분자 인식층을 재생 버퍼로 처리하더라도, Z-도메인과 항체 사이의 결합력이 유지될 수 있다. 구체적으로, 반복 사용 시 Z-도메인과 항체 사이의 결합력 감소에 의해 항체가 이탈하여 재사용 때마다 분자 인식층을 재형성해야 하는 문제를 방지할 수 있다.Furthermore, since the disccinimidly-based crosslinking agent forms a covalent bond between the Z-domain and the antibody, when the immunobiosensor is reused, even if the molecular recognition layer is treated with a regeneration buffer, the binding force between the Z-domain and the antibody can be maintained. Specifically, it is possible to prevent a problem in which the molecular recognition layer must be reformed each time the antibody is separated due to a decrease in binding force between the Z-domain and the antibody during repeated use.

이때, 가교제의 종류에 따라 적절한 농도로 가교제를 처리하여야 한다. 예를 들어, DSG 가교제를 사용할 경우에는, 31μM의 농도로 처리하고, DSS 가교제를 사용할 경우에는 500μM의 농도로 처리, BS(PEG)5 가교제를 사용할 경우에는 125μM의 농도로 처리하는 것이 적절할 수 있다.At this time, the crosslinking agent should be treated with an appropriate concentration according to the type of crosslinking agent. For example, treatment at a concentration of 31 μM when a DSG crosslinker is used, treatment at a concentration of 500 μM when a DSS crosslinker is used, and treatment at a concentration of 125 μM when a BS(PEG) 5 crosslinker are used may be appropriate.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 생체 물질 검출용 키트는 재사용 가능한 면역 바이오센서 및 면역 바이오센서 재생용 버퍼로 구성될 수 있다.Meanwhile, a kit for detecting a biomaterial according to an embodiment of the present invention may be composed of a reusable immune biosensor and a buffer for reproducing the immune biosensor.

본 발명의 면역 바이오센서는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어 된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 분자 인식층을 포함한다. 본 발명은 상술한 분자 인식층을 포함하므로, 반복 사용이 가능하다.The immune biosensor of the present invention includes a molecular recognition layer to which a controlled antibody specifically binding to a biological material is covalently immobilized. Since the present invention includes the molecular recognition layer described above, repeated use is possible.

본 발명의 면역 바이오센서 재생용 버퍼는 트윈-20(tween-20) 및 글리신 용액이 함유된다. 면역 바이오 센서 재생용 버퍼 총 함량 기준 트윈-20은 2%(w/w)의 농도로 함유될 수 있으며, 글리신은 0.1M 농도로 함유될 수 있다. 이때, 글리신은 pH가 2.5로 유지될 수 있다.The immune biosensor regeneration buffer of the present invention contains a solution of tween-20 and glycine. Based on the total content of the buffer for immune biosensor regeneration, Tween-20 may be contained at a concentration of 2% (w/w), and glycine may be contained at a concentration of 0.1M. At this time, the pH of glycine may be maintained at 2.5.

본 발명의 면역 바이오센서 재생용 버퍼는 상술한 농도의 유효성분을 함유하도록 구성되므로, 재사용 시, 면역 바이오센서에 코팅되어 있는 Z-도메인 및 이에 결합되어 있는 항체의 구조가 심하게 변형되는 것을 방지할 수 있다. Since the buffer for regeneration of the immune biosensor of the present invention is configured to contain the above concentration of the active ingredient, when reused, the structure of the Z-domain coated on the immune biosensor and the antibody bound thereto can be prevented from being severely altered.

한편, 여기서 검출하고자 하는 생체 물질은 통상적으로 면역 바이오센서를 이용하여 검출할 수 있는 모든 물질을 의미하며, 이에 제한되지는 않으나, 항원, 항체, 펩타이드, 단백질, 박테리아, 바이러스, 진균류 등 일 수 있다. On the other hand, the biological material to be detected here usually means any material that can be detected using an immune biosensor, but is not limited thereto, but may be antigens, antibodies, peptides, proteins, bacteria, viruses, fungi, etc.

또한, 본 발명의 생체 검출용 키트에 적용 가능한 시료는 생물체로부터 분리되거나 환경 중에서 얻어진 모든 시료일 수 있으며, 예컨대, 혈액, 체액, 세포, 조직 등의 생체 시료 또는 음용수, 토양 등도 포함될 수 있다.In addition, the sample applicable to the kit for biological detection of the present invention may be any sample isolated from a living organism or obtained from the environment, and may include, for example, biological samples such as blood, body fluids, cells, tissues, drinking water, soil, and the like.

본 발명의 일 실시예에 따른 면역 바이오센서 재생방법은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 분자 인식층을 포함하는 면역 바이오센서를 이용하여 면역 반응을 수행한 후, 트윈-20(tween-20) 및 0.1M 글리신이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼로 상기 면역 바이오센서를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.An immune biosensor regeneration method according to an embodiment of the present invention may include performing an immune reaction using an immune biosensor including a molecular recognition layer to which an orientation-controlled antibody specifically binding to a biological material is covalently immobilized, and then washing the immune biosensor with an immune biosensor regeneration buffer containing tween-20 and 0.1 M glycine.

본 발명의 면역 바이오센서는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 분자 인식층을 포함하므로, 항체의 항원과 결합하는 부위를 보다 많이 노출시킬 수 있고, 이에 민감도가 향상될 수 있다.Since the immune biosensor of the present invention includes a molecular recognition layer in which an orientation-controlled antibody that specifically binds to a biological material is covalently immobilized, more antigen-binding sites of the antibody can be exposed, thereby improving sensitivity.

또한, 본 발명의 면역 바이오센서는 배향제어된 항체가 화학적으로 고정되므로, 한번의 특이적 결합반응이 유도된 후에도 반복 사용이 가능할 수 있다.In addition, the immune biosensor of the present invention can be used repeatedly even after a specific binding reaction is induced once because the orientation-controlled antibody is chemically immobilized.

본 발명의 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조방법은 항체를 배향제어하는 단계를 포함하므로, 항체의 항원과 결합하는 부위를 보다 많이 노출시킬 수 있다. Since the method for preparing a molecular recognition layer for an immune biosensor of the present invention includes the step of controlling the orientation of an antibody, more antigen-binding sites of the antibody can be exposed.

또한, 본 발명의 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조방법은 배향제어된 항체를 Disccinimidly 기반의 가교제 처리하여 고체 지지체 표면에 공유결합 시키는 화학적 고정단계를 포함하므로, 배향제어된 항체를 보다 단단하게 결합시킬 수 있으며, 반복 사용 시 항원과의 결합 친화도가 감소하는 것을 방지할 수 있다. In addition, since the method for preparing a molecular recognition layer for an immune biosensor of the present invention includes a chemical immobilization step of covalently binding the orientation-controlled antibodies to the surface of a solid support by treating them with a disccinimidly-based cross-linking agent, the orientation-controlled antibodies can be bound more firmly, and the decrease in binding affinity to the antigen can be prevented during repeated use.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<준비예><Preparation example>

시약준비reagent preparation

하기 본 발명의 실험에서 사용된 시약은 다음과 같다. GA, DSS, DSG, BS(PEG)5, HRP(Materials Horseradish peroxidase), CRP(C-reactive protein), 인간 IgG (hIgG), 트윈-20, 트리톤 X-100, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG), 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 글리신 및 염산은 머크사(Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 토끼 폴리클로날 항-HRP 항체, 토끼 폴리클로날 항-CRP 항체, 플루오레세인 이소 티오시아네이트가 결합된 염소 폴리클로날 항-CRP(anti-CRP(FITC)) 항체 및 플루오레세인 이소티오시안이 표지된 염소 폴리클로날 항-인간(anti-human(FITC)) 항체는 Abcam사 (Cambridge, UK)로부터 구입하여 사용하였다. LPS 용액(대전, 한국)에서 인산 완충 식염수(PBS)를 취하여 항체 용해 버퍼로 사용하였고, 96 웰 마이크로 플레이트는 SPL Life Science(포천, 한국)사로부터 구입하여 사용하였다. 3,3 ',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 키트는 Thermo Fisher Scientific 사(Waltham, US)에서 입수하여 사용하였다.The reagents used in the experiments of the present invention are as follows. GA, DSS, DSG, BS (PEG) 5 , Materials Horseradish peroxidase (HRP), C-reactive protein (CRP), human IgG (hIgG), Tween-20, Triton X-100, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), glycine and hydrochloric acid were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). and used it. Rabbit polyclonal anti-HRP antibody, rabbit polyclonal anti-CRP antibody, fluorescein isothiocyanate-conjugated goat polyclonal anti-CRP (anti-CRP (FITC)) antibody and fluorescein isothiocyanate-labeled goat polyclonal anti-human (FITC) antibody were purchased from Abcam (Cambridge, UK) and used. Phosphate buffered saline (PBS) was taken from the LPS solution (Daejeon, Korea) and used as an antibody dissolution buffer, and a 96-well microplate was purchased from SPL Life Science (Pocheon, Korea). A 3,3 ',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate kit was obtained from Thermo Fisher Scientific (Waltham, US) and used.

<실험방법><Experiment method>

① Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 배양 및 외부 세포막의 분리① Cultivation of self-labeled E. coli with Z-domain and separation of outer cell membrane

S. aureus에서 단백질 A의 B-도메인으로부터 PCR로 증폭하여 제작한 펩타이드인 Z-도메인을 클로닝하여 Z-도메인이 자가 표지된 벡터인 pET-Z-18-3을 제조하였다. Z-도메인이 자가 표지된 pET-Z-18-3 플라스미드를 대장균(BL21(DE3))으로 일렉트로포레이션 방법을 통해 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균은 37℃에서 암피실린이 함유된 LB(Luria-Bertani) 배지로 12시간 이상 배양하였고, 이후 100배 희석한 신선한 LB 배지를 이용하여 세척하였다. 형질감염된 대장균의 배양은 600nm의 파장에서 OD가 0.7이 될 때까지 교반하면서 배양하였다. 자가 표지된 Z-도메인의 발현유도(induction)을 위해, 1 mM IPTG를 상기 대장균에 첨가하고 30℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 수집하고 PBS로 세척하였다. Z-도메인이 발현된 대장균으로부터 외부 세포막을 분리하기 위해, 먼저 대장균의 세포벽인 단단한 펩티도글리칸 층을 200μg/mL의 리소자임(lysozyme)을 처리하여 가수분해시켜 스페로플라스트(spheroplast) 형태가 되도록 하였다. 또한, 리소자임의 페리플라즘(periplasm)으로의 침투를 돕기 위해 20 mM sucrose 및 0.2 mM EDTA를 처리하여 삼투작용이 증가하도록 하였고, 세포막 표면의 전하를 조절하였다. 페로플라스트(spheroplast 형성 후) 대장균의 외부 세포막 50 mM Tris-HCl pH 8.0에서 10 mM MgCl2를 포함한 2 % Triton X-100 용액을 첨가하여 리포솜으로 분리하였고, 분리된 외부 세포막 입자들은 20,000 rpm으로 연속적인 원심분리를 수행하여 최종적으로 외부 세포막을 분리하였으며 PBS 버퍼로 용해시켰다.The Z-domain, a peptide prepared by PCR amplification from the B-domain of protein A in S. aureus, was cloned to construct a self-labeled vector, pET-Z-18-3. The pET-Z-18-3 plasmid self-labeled with the Z-domain was transfected into Escherichia coli (BL21(DE3)) by electroporation. The transfected E. coli was cultured in LB (Luria-Bertani) medium containing ampicillin at 37° C. for more than 12 hours, and then washed with 100-fold diluted fresh LB medium. The culture of the transfected E. coli was cultured at a wavelength of 600 nm while stirring until the OD reached 0.7. For induction of self-labeled Z-domain expression, 1 mM IPTG was added to the E. coli and incubated at 30° C. for 1 hour. Cells were then collected and washed with PBS. In order to isolate the outer cell membrane from E. coli expressing the Z-domain, first, the hard peptidoglycan layer, which is the cell wall of E. coli, was hydrolyzed by treating with 200 μg/mL lysozyme to form a spheroplast. In addition, osmotic action was increased by treatment with 20 mM sucrose and 0.2 mM EDTA to help penetration of lysozyme into the periplasm, and charge on the cell membrane surface was controlled. The outer cell membrane of ferroplast (after formation of spheroplast) E. coli was separated into liposomes by adding 2% Triton X-100 solution containing 10 mM MgCl 2 in 50 mM Tris-HCl pH 8.0, and the separated outer cell membrane particles were continuously centrifuged at 20,000 rpm to finally separate the outer cell membrane and dissolved in PBS buffer.

② 대장균 세포 및 그 외부 세포막을 기반으로 한 재생 분석(Regenerative assays)② Regenerative assays based on E. coli cells and their outer cell membranes

대장균 세포 기반의 재생 가능성 여부의 분석을 위해, Z-도메인이 자가 표지된 대장균 세포를 OD 600의 값이 1.0이 되도록 PBS로 현탁시켰다. 이후 1.0 μg /mL 농도의 항-HRP 항체가 함유된 PBS 용액에 Z-도메인이 자가 표지된 대장균 세포 100μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시키고 PBS로 대장균 세포를 3회 세척하였다. 이후, 항체의 공유 고정화를 위해 100μL의 가교제를 첨가하였다. 그 다음, 10-ng/mL HRP를 첨가하고 1시간 동안 반응시키고, 다시 세척한 후 pH 2.5에서 2%의 트윈-20 및 0.1M 글리신이 함유된 재생 버퍼 100μl를 첨가하여, 대장균 세포에 고정된 항체로부터 분석물만을 용리시켰다. 재생반응 후, 대장균 세포를 3회 세척한 다음, 100μL의 PBS로 현탁시켰다. 공유 고정화된 항체를 가진 재생된 대장균 세포는 다시 HRP 면역 분석을 위한 새로운 고체 지지체로 사용하였다. 결합된 HRP의 정량분석을 위해 발색반응용 TMB 용액을 사용하였다. 100μl의 TMB 용액을 대장균 세포에 30분 동안 처리하고 2M의 황산용액으로 반응을 중지시켰다. 이후, 마이크로 플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 450 nm의 파장에서 OD 값을 측정하였다. To analyze the regeneration potential of E. coli cells, E. coli cells self-labeled with the Z-domain were suspended in PBS so that the OD 600 value was 1.0. Thereafter, 100 μL of Z-domain-labeled E. coli cells were added to a PBS solution containing an anti-HRP antibody at a concentration of 1.0 μg/mL, reacted for 1 hour, and the E. coli cells were washed three times with PBS. Then, 100 μL of cross-linking agent was added for covalent immobilization of the antibody. Then, 10-ng/mL HRP was added, reacted for 1 hour, washed again, and 100 μl of regeneration buffer containing 2% Tween-20 and 0.1 M glycine at pH 2.5 was added to elute only the analyte from the antibody immobilized on E. coli cells. After the regeneration reaction, the E. coli cells were washed three times and then suspended in 100 μL of PBS. Regenerated E. coli cells with covalently immobilized antibodies were again used as a new solid support for HRP immunoassay. For quantitative analysis of bound HRP, a TMB solution for color reaction was used. E. coli cells were treated with 100 μl of TMB solution for 30 minutes, and the reaction was stopped with 2M sulfuric acid solution. Then, the OD value was measured at a wavelength of 450 nm using a microplate reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

또한, 대장균의 외부 세포막(OM; outer cell membrane)을 기반으로 한 재생분석은 다음과 같은 방법을 통해 수행하였다.In addition, regeneration analysis based on the outer cell membrane (OM) of E. coli was performed through the following method.

상기 방법으로 분리한 외부 세포막 300 μg/mL를 96 웰 마이크로플레이트에 분주하고 2시간 동안 배양하여 마이크로플레이트 표면 상에 외부 세포막이 형성되도록 하였다. 이후 외부 세포막 층이 마이크로플레이트 표면 상에 형성되면 PBS로 3회 세척하고 1.0 μg/mL 농도의 항-HRP 항체를 1시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 마이크로플레이트를 세척하고, 고정화를 위해 가교제를 처리하였다. 면역 복합체 형성 후, 재생 버퍼를 첨가하여 2분 동안 반응시키고, 용출된 항체와 항원을 바로 세척하였다. 공유 고정화된 항체를 가진 재생된 OM 층은 면역 바이오센서의 새로운 고체 지지체로 사용되었다. 결합된 HRP의 정량분석을 위해 TMB 용액을 처리하고, 황산 용액으로 반응을 중지시킨 후 450 nm 파장에서 OD 값을 측정하였다. 여기서, 모든 검사는 세번 반복되었다. 300 μg/mL of the outer cell membrane separated by the above method was dispensed into a 96-well microplate and incubated for 2 hours to form an outer cell membrane on the surface of the microplate. Then, when an outer cell membrane layer was formed on the surface of the microplate, it was washed three times with PBS and reacted with an anti-HRP antibody at a concentration of 1.0 μg/mL for 1 hour. Then, the microplate was washed and treated with a cross-linking agent for immobilization. After immune complex formation, regeneration buffer was added and reacted for 2 minutes, and the eluted antibody and antigen were immediately washed. The regenerated OM layer with covalently immobilized antibodies was used as a novel solid support for an immune biosensor. For quantitative analysis of the bound HRP, the TMB solution was treated, and the reaction was stopped with a sulfuric acid solution, and the OD value was measured at a wavelength of 450 nm. Here, all tests were repeated three times.

③ 표면 플라즈몬 공명분석 (SPR; surface plasmon resonance 분석)③ Surface plasmon resonance analysis (SPR; surface plasmon resonance analysis)

SPR 분석을 위해 ICLUEBIO 기업(한국 성남시)의 시판되는 SPR 바이오센서 시스템을 사용하였다. 또한, OM 기반의 재생 바이오센싱 분석을 위해 베어 콜드 칩(bare gold chip)을 사용하였다. 골드 칩 표면에 면역친화성 층이 형성되도록 300μg/mL 농도의 분리한 OM 용액을 2시간동안 처리하였다. 나머지 OM 분리 입자는 PBS로 세척하였다. OM 층이 형성되면 1μg/mL의 항-CRP 항체를 처리하여 상기 OM 층의 자동 표지된 Z-도메인과 결합되도록 하였다. 세척 후, 항체의 공유 고정화를 위해 가교제를 처리하였다. 그런 뒤, CRP 샘플을 30분 동안 처리하였다. 자동 표시된 Z 도메인이 있는 OM 면역 친화성 층의 재생을 위해, 재생용 버퍼는 2분 동안 처리되었다. 재생 단계에 따라 SPR 바이오센서의 골드 칩에 재생된 OM 층을 사용하여 CRP 바이오센싱을 4회 반복했다. CRP 처리 전 SPR 신호로부터 CRP 처리 후의 SPR 신호 값을 차감하여 CRP를 정량화 하였고, 재생률은 OM 층 형성 후 SPR 신호와 재생 후 SPR 신호를 비교하여 계산하였다. For SPR analysis, a commercially available SPR biosensor system from ICLUEBIO company (Seongnam-si, Korea) was used. In addition, a bare gold chip was used for OM-based regeneration biosensing analysis. The separated OM solution at a concentration of 300 μg/mL was treated for 2 hours to form an immunoaffinity layer on the surface of the gold chip. The remaining OM separated particles were washed with PBS. When the OM layer was formed, 1 μg/mL of anti-CRP antibody was treated to bind to the auto-labeled Z-domain of the OM layer. After washing, a cross-linking agent was treated for covalent immobilization of the antibody. Then, the CRP samples were treated for 30 minutes. For regeneration of the OM immunoaffinity layer with auto-labeled Z domains, the regeneration buffer was incubated for 2 min. Following the regeneration step, CRP biosensing was repeated 4 times using the regenerated OM layer on the gold chip of the SPR biosensor. CRP was quantified by subtracting the SPR signal value after CRP treatment from the SPR signal before CRP treatment, and the regeneration rate was calculated by comparing the SPR signal after OM layer formation with the SPR signal after regeneration.

<실시예 1><Example 1>

최적의 화학적 고정화 조건 규명Identification of optimal chemical immobilization conditions

<1-1> 최적의 가교제 종류 확립<1-1> Establishment of optimal crosslinking agent type

본 출원의 발명자들은 항원 결합 활성의 감소 없이 항체의 화학적 고정화를 위한 효과적인 가교제를 찾기 위해 다양한 스페이서 암, 디숙신이미딜 글루타레이트(DSG), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS) 및 폴리(에틸렌 글리콜)일화 비스(에틸렌 글리콜)일화 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS(PEG)5)를 테스트했다. 이때, 비교를 위해 단백질 고정에 가장 많이 사용되는 가교제인 글루타르알데히드(GA)도 함께 사용하여 테스트했다.The inventors of the present application tested various spacer arms, disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and poly(ethylene glycol)ylated bis(ethylene glycol)ylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS(PEG) 5 ), to find effective crosslinkers for chemical immobilization of antibodies without reducing antigen-binding activity. At this time, for comparison, glutaraldehyde (GA), a cross-linking agent most often used for protein fixation, was also used and tested.

또한, Fc 영역 결합 활성을 갖는 Z-도메인은 E. coli의 OM에 자동 표시되었고 E. coli 세포는 면역분석의 고체 지지체로 사용되었다.In addition, the Z-domain with Fc region-binding activity was automatically displayed in the OM of E. coli, and E. coli cells were used as a solid support for the immunoassay.

최적의 가교제 종류를 확립하기 위한 실험은 다음과 같이 수행되었다. 자세한 처리조건은 실험방법 ② 에 개시하였다.Experiments to establish the optimum type of crosslinker were performed as follows. Detailed treatment conditions were disclosed in Experimental Method ②.

1) 포획항체를 방향제어하고, GA, DSG, DSS, BS(PEG)5를 처리하여 화학적 고정화 진행하였다. 1) The capture antibody was directionally controlled, and chemical immobilization was performed by treating with GA, DSG, DSS, and BS(PEG) 5 .

2) 세척 후, 10ng/mL의 HRP를 첨가하여 반응시키고, 450 nm의 파장에서 TMB 반응의 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 2) After washing, 10 ng/mL of HRP was added and reacted, and the optical density (OD) of the TMB reaction was measured at a wavelength of 450 nm.

3) 이후, 재생용 버퍼를 처리하여 재생을 수행하였다. 3) After that, regeneration was performed by processing the regeneration buffer.

4) 재생 후 2)에서와 동일한 농도의 HRP를 처리하고 결합된 HRP를 TMB 반응으로 정량하였다.4) After regeneration, the same concentration of HRP as in 2) was treated, and bound HRP was quantified by TMB reaction.

도 3a 내지 3h는 가교제의 종류에 따른 OD값 및 첫 번째 HRP 처리를 참조로 사용하여 계산된 상대 OD값을 나타낸 것이다.3a to 3h show OD values according to the type of crosslinking agent and relative OD values calculated using the first HRP treatment as a reference.

도 3a를 참조하면, GA를 각기 다른 농도로 처리하였을 경우, 1차 HRP 처리 시 OD값(1st HRP)은 전체적으로 균일한 OD 값을 나타낸다. 이는 고정화된 포획 항체에 대한 GA 처리가 항체의 항원 결합 활성에 영향을 미치지 않았음을 의미한다. Referring to FIG. 3A, when GA was treated at different concentrations, the OD value (1 st HRP) during the first HRP treatment showed a uniform OD value as a whole. This means that GA treatment of the immobilized capture antibody did not affect the antigen binding activity of the antibody.

도 3a의 재생 단계 시 OD 값(Regeneration) 및 HRP 2차 처리 시 OD값(2nd HRP)을 1차 HRP 처리 OD 값에 대한 상대값은 도 3b와 같이 계산되었다.Relative values of the OD value (Regeneration) and the OD value (2 nd HRP) during the second HRP treatment in the regeneration step of FIG. 3a to the OD value of the first HRP treatment were calculated as shown in FIG. 3B.

도 3b를 참조하면, 모든 재생 단계 상대 OD 값(■)은 25%에도 미치지 못하는 것으로 나타났다. 이는 포획 항체로부터 분석물이 효과적으로 용출되었음을 알 수 있다.Referring to FIG. 3B , the relative OD values (■) of all regeneration stages were found to be less than 25%. This indicates that the analyte was effectively eluted from the capture antibody.

재생된 대장균 세포에 HRP 2차 처리 시 상대 OD 값(●)은 125μM 이하의 농도에서 재생 단계 상대 OD 값(■)과 거의 유사하게 나타났다. 250μM 이상의 농도에서는 상대 OD 값(●)이 증가하였으나, 500μM에서 53%의 상대 OD 값(●)을 보인 후 감소했다. 이는 GA 처리 시, 항HRP 항체가 화학적으로 고정화되지 않아 재생 버퍼에 의해 항원과 함께 용출되었음을 의미한다. 이러한 결과를 통해 GA 처리는 Z-도메인 결합 항체를 화학적 결합으로 고정하는 데 적합하지 않음을 알 수 있다.The relative OD value (●) of the second treatment of HRP to the regenerated E. coli cells was almost similar to the relative OD value (■) at the concentration of 125 μM or less. At concentrations higher than 250μM, the relative OD value (●) increased, but at 500μM, a relative OD value (●) of 53% was shown and then decreased. This means that during GA treatment, the anti-HRP antibody was not chemically immobilized and was eluted together with the antigen by the regeneration buffer. These results indicate that GA treatment is not suitable for chemically fixing Z-domain-bound antibodies.

도 3c를 참조하면, DSG를 각기 다른 농도로 처리하였을 경우, 1차 HRP 처리 시 OD값(1st HRP)은 0.66과 0.85 사이에서 전체적으로 균일한 OD 값을 나타낸다. 이를 통해, DSG 처리가 항체의 항원 결합 활성에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.Referring to FIG. 3c, when DSG was treated at different concentrations, the OD value ( 1st HRP) during the first HRP treatment showed a generally uniform OD value between 0.66 and 0.85. Through this, it can be seen that DSG treatment does not significantly affect the antigen-binding activity of the antibody.

도 3c의 재생 단계 시 OD 값(Regeneration) 및 2차 HRP 처리 시 OD값(2nd HRP)을 1차 HRP 처리 OD 값에 대한 상대값은 도 3d와 같이 계산되었다.The relative values of the OD value during the regeneration step (Regeneration) of FIG. 3C and the OD value (2 nd HRP) during the second HRP treatment with respect to the OD value of the first HRP treatment were calculated as shown in FIG. 3D.

도 3d를 참조하면, 모든 재생 단계 상대 OD 값(■)은 30%에도 미치지 못하는 것으로 나타났다. 이는 포획 항체로부터 분석물이 효과적으로 용출되었음을 알 수 있다.Referring to FIG. 3D , the relative OD values (■) of all regeneration stages were found to be less than 30%. This indicates that the analyte was effectively eluted from the capture antibody.

2차 HRP 처리 시 상대 OD값(●)은 GA 처리 때보다 71%(125μM)~89%(31μM) 사이의 상대적으로 높은 상대 OD 값(●)을 나타냈다. 이는 DSG 처리가 GA 처리보다 더 효과적으로 항-HRP 항체를 화학적으로 고정하기 때문에 고정된 포획 항체가 재생 완충액에 의해 모두 용출되지 않았음을 의미한다. The relative OD value (●) during the secondary HRP treatment showed a relatively higher relative OD value (●) between 71% (125 μM) and 89% (31 μM) than that of the GA treatment. This means that the immobilized capture antibody was not all eluted by the regeneration buffer because the DSG treatment chemically immobilized the anti-HRP antibody more effectively than the GA treatment.

도 3e를 참조하면, DSS를 각기 다른 농도로 처리하였을 경우, 1차 HRP 처리 시 OD값(1st HRP)은 0.53에서 0.58 사이의 전체적으로 균일한 OD 값을 보여주었다. 이를 통해, DSS 처리가 항체의 항원 결합 활성에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.Referring to FIG. 3e, when DSS was treated at different concentrations, the OD value (1 st HRP) during the first HRP treatment showed an overall uniform OD value between 0.53 and 0.58. Through this, it can be seen that DSS treatment does not significantly affect the antigen-binding activity of the antibody.

도 3e의 재생 단계 시 OD 값(Regeneration) 및 HRP 2차 처리 시 OD값(2nd HRP)을 1차 HRP 처리 OD 값에 대한 상대값은 도 3f와 같이 계산되었다.The relative values of the OD value during the regeneration step (Regeneration) of FIG. 3E and the OD value (2 nd HRP) during the second HRP treatment with respect to the OD value of the first HRP treatment were calculated as shown in FIG. 3F.

도 3f를 참조하면, 모든 재생 단계 상대 OD 값(■)은 50%에도 미치지 못하는 것으로 나타났다. 이는 포획 항체로부터 분석물이 효과적으로 용출되었음을 알 수 있다.Referring to FIG. 3F , the relative OD values (■) of all regeneration stages were found to be less than 50%. This indicates that the analyte was effectively eluted from the capture antibody.

재생된 대장균 세포에 HRP 2차 처리 시 상대 OD 값(●)은 GA 처리 때보다 93%(1mM)에서 120%(250μM)의 더 높은 상대 OD 값(●)을 나타냈다. 이는 DSS 처리가 GA 처리보다 더 효과적으로 항-HRP 항체를 화학적으로 고정하기 때문에 고정된 포획 항체가 재생 완충액에 의해 모두 용출되지 않았음을 의미한다. Relative OD values (●) of regenerated E. coli cells treated with HRP for the second time showed higher relative OD values (●), ranging from 93% (1 mM) to 120% (250 μM), compared to GA treatment. This means that the immobilized capture antibody was not all eluted by the regeneration buffer because the DSS treatment chemically immobilized the anti-HRP antibody more effectively than the GA treatment.

도 3g를 참조하면, BS(PEG)5를 각기 다른 농도로 처리하였을 경우, 다른 가교제와 마찬가지로, 1차 HRP 처리 시 OD값(1st HRP)은 0.84와 0.98 사이에서 전체적으로 균일한 OD 값을 나타낸다. 이를 통해, BS(PEG)5 처리가 항체의 항원 결합 활성에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.Referring to FIG. 3g, when BS(PEG) 5 was treated at different concentrations, as with other crosslinking agents, the OD value ( 1st HRP) during the first HRP treatment showed an overall uniform OD value between 0.84 and 0.98. Through this, it can be seen that BS(PEG) 5 treatment does not significantly affect the antigen-binding activity of the antibody.

도 3g의 재생 단계 시 OD 값(Regeneration) 및 HRP 2차 처리 시 OD값(2nd HRP)을 1차 HRP 처리 OD 값에 대한 상대값은 도 3h와 같이 계산되었다.The relative values of the OD value during the regeneration step (Regeneration) of FIG. 3G and the OD value (2 nd HRP) during the second HRP treatment with respect to the OD value of the first HRP treatment were calculated as shown in FIG. 3H.

도 3h를 참조하면, 모든 재생 단계 상대 OD 값(■)은 25%에도 미치지 못하는 것으로 나타났다. 이는 포획 항체로부터 분석물이 효과적으로 용출되었음을 알 수 있다.Referring to FIG. 3H, the relative OD values (■) of all regeneration stages were found to be less than 25%. This indicates that the analyte was effectively eluted from the capture antibody.

재생된 대장균 세포에 HRP 2차 처리 시 상대 OD 값(●)은 GA처리 때보다 45%(16μM)에서 70%(1mM) 사이의 더 높은 상대 OD 값(●)을 나타냈다. 이는 DSS 처리가 BS(PEG)5 처리보다 더 효과적으로 항-HRP 항체를 화학적으로 고정하기 때문에 고정된 포획 항체가 재생 완충액에 의해 모두 용출되지 않았음을 의미한다. Relative OD values (●) of regenerated E. coli cells treated with HRP for the second time showed higher relative OD values (●) between 45% (16 μM) and 70% (1 mM) than those with GA treatment. This means that the immobilized capture antibody was not eluted by the regeneration buffer because the DSS treatment chemically immobilized the anti-HRP antibody more effectively than the BS(PEG) 5 treatment.

<1-2> 최적의 가교제 농도 확립<1-2> Establishment of optimum crosslinker concentration

상기 시험 및 도 3a 내지 3h를 참조하면, GA, DSG, DSS 및 BS(PEG)5의 최적 농도는 각각 500, 31, 500 및 125μM으로 나타난다. 이에, 본 출원의 발명자들은 각각의 가교제의 최적의 농도를 확립하기 위해 GA, DSG, DSS 및 BS(PEG)5의 농도를 각각 500, 31, 500 및 125μM로 첨가한 뒤, HRP 면역분석을 수행하였다. 이때, HRP 면역분석은 두 번의 재생 단계로 세 번 반복되었다.Referring to the above test and FIGS. 3A to 3H, the optimum concentrations of GA, DSG, DSS and BS(PEG) 5 are 500, 31, 500 and 125 μM, respectively. Accordingly, the inventors of the present application added concentrations of GA, DSG, DSS, and BS(PEG) 5 at 500, 31, 500, and 125 μM, respectively, in order to establish the optimal concentration of each cross-linking agent, and then performed HRP immunoassay. At this time, the HRP immunoassay was repeated three times with two regeneration steps.

도 4는 각각의 가교제를 최적의 농도로 처리하였을 경우, 1차 HRP 처리 시의 OD 값을 참조로 사용하여 계산된 450nm 파장에서의 상대 OD 값을 나타내는 도면이다.4 is a view showing relative OD values at a wavelength of 450 nm calculated using the OD values in the first HRP treatment as reference when each crosslinking agent was treated at an optimal concentration.

도 4를 참조하면, 가교제의 종류에 관계없이 모든 재생 단계의 상대 OD 값(1st Regeneration, 2nd Regeneration)은 40% 미만의 값으로 나타났다. 이는 재생 버퍼에 의해 항체 결합 분석물이 효과적으로 용출되었음을 알 수 있다.Referring to FIG. 4, the relative OD values (1 st Regeneration, 2 nd Regeneration) of all regeneration steps were less than 40% regardless of the type of crosslinking agent. This indicates that the antibody-binding analyte was effectively eluted by the regeneration buffer.

GA 처리 시, 2차 HRP 단계의 상대 OD 값(2nd HRP) 및 3차 HRP 단계의 상대 OD 값(3rd HRP)은 각각 62% 및 56%로 재생 횟수가 증가함에 따라 상대 OD 값이 감소하는 것으로 나타났다.In the case of GA treatment, the relative OD values of the 2nd HRP step ( 2nd HRP) and the 3rd HRP step ( 3rd HRP) were 62% and 56%, respectively, indicating that the relative OD values decreased with increasing number of regenerations.

DSG 처리 시, 2차 HRP 단계의 상대 OD 값(2nd HRP) 및 3차 HRP 단계의 상대 OD 값(3rd HRP)은 각각 83% 및 87%로 유사한 값으로 나타났다. When treated with DSG, the relative OD values of the 2nd HRP step (2 nd HRP) and the 3rd HRP step (3 rd HRP) were similar at 83% and 87%, respectively.

DSS 처리 시, 2차 HRP 단계의 상대 OD 값(2nd HRP) 및 3차 HRP 단계의 상대 OD 값(3rd HRP)은 각각 101% 및 100%로 유사한 값으로 나타났다.In the case of DSS treatment, the relative OD values of the 2nd HRP step (2 nd HRP) and the 3rd HRP step (3 rd HRP) were similar values of 101% and 100%, respectively.

BS(PEG)5 처리 시, 2차 HRP 단계의 상대 OD 값(2nd HRP) 및 3차 HRP 단계의 상대 OD 값(3rd HRP)은 각각 79% 및 81% 로 유사한 값으로 나타났다.In the case of BS(PEG) 5 treatment, the relative OD values of the 2nd HRP step (2 nd HRP) and the 3rd HRP step (3 rd HRP) were similar values of 79% and 81%, respectively.

이를 통해, 디숙신이미딜 기반 가교제를 처리할 경우 2차 HRP 단계의 상대 OD 값(2nd HRP) 및 3차 HRP 단계의 상대 OD 값(3rd HRP)이 유사하게 나타남을 확인하였다. 이는 디숙신이미딜 기반 가교제가 항체의 항원 결합 활성에 영향을 미치지 않고, 공유 결합에 의해 포획 항체를 효과적으로 고정시킴을 의미한다. Through this, it was confirmed that the relative OD value of the 2nd HRP step ( 2nd HRP) and the 3rd HRP step ( 3rd HRP) appeared similar when the disuccinimidyl-based crosslinking agent was treated. This means that the disuccinimidyl-based crosslinker effectively immobilizes the capture antibody by covalent bonding without affecting the antigen-binding activity of the antibody.

특히, DSS를 500μM 농도로 처리할 경우에 2차 HRP 단계의 상대 OD 값(2nd HRP) 및 3차 HRP 단계의 상대 OD 값(3rd HRP)이 1차 HRP 단계 때와 거의 비슷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 2차, 3차 면역반응 시, 1차 면역반응 때와 거의 동일한 수준으로 항원 항체 반응이 일어나는 것을 의미할 수 있다. 즉, DSS를 500μM 농도로 처리하는 것이 항체의 항원 결합 활성에 영향을 미치지 않고, 공유 결합에 의해 포획 항체를 가장 효과적으로 고정시킴을 알 수 있다.In particular, when DSS was treated at a concentration of 500 μM, it was confirmed that the relative OD values of the 2nd HRP step ( 2nd HRP) and the 3rd HRP step ( 3rd HRP) were almost similar to those of the 1st HRP step. This may mean that an antigen-antibody reaction occurs at almost the same level as in the first immune reaction during the second and third immune reactions. That is, it can be seen that treatment with DSS at a concentration of 500 μM most effectively immobilizes the capture antibody by covalent binding without affecting the antigen-binding activity of the antibody.

<1-3> 최적의 가교제 조건을 이용한 재생 면역 분석<1-3> Regenerative immunoassay using optimal crosslinker conditions

최적 조건으로 공유 고정화되고 방향제어 된 항체를 사용하여 재사용 면역분석을 수행하였다. 실험은 다음과 같은 순서로 진행되었다. Reuse immunoassays were performed using antibodies that were covalently immobilized and directed in optimal conditions. The experiment proceeded in the following order.

1) 항-HRP 항체가 Z-도메인에 결합한 후, 최적 조건의 가교제, 500μM의 DSS를 화학적 고정을 위해 처리하였다. 1) After the anti-HRP antibody was bound to the Z-domain, a cross-linking agent under optimal conditions, 500 μM DSS, was treated for chemical fixation.

2) 20ng/mL의 HRP를 처리하고 퍼옥사이드 존재 하에 TMB와 반응시켜 정량화 하였다.2) 20 ng/mL of HRP was treated and reacted with TMB in the presence of peroxide to quantify.

3) HRP 면역분석 후 재생을 위해 pH 2.5에서 100mM 글리신 완충액에서 2% 트윈-20을 처리하여 분석물을 용리하였다.3) For regeneration after HRP immunoassay, analyte was eluted by treatment with 2% Tween-20 in 100 mM glycine buffer at pH 2.5.

4) HRP 면역분석을 세번의 재생 단계로 네번 반복하였다.4) HRP immunoassay was repeated four times with three regeneration steps.

도 5는 최적의 가교제 조건을 이용한 재생 면역 분석결과를 나타낸 그래프이다.5 is a graph showing the results of regeneration immunoassay using optimal crosslinking agent conditions.

또한, 도 5를 참조하면, 1차, 2차, 3차 및 4차 HRP 면역 측정 시 OD 값(HRP treatment)은 각각 0.52, 0.52, 0.50 및 0.22으로 나타났다. 1차 HRP 면역분석 값과 비교하여, 2차 및 3차 HRP 면역분석 값은 100%에 상당히 근접하였다. 이에 반해, 4차 HRP 면역분석 값은 1차 HRP 면역분석 값에 비해 43% 감소하였다. 이때, 4차와 1차 HRP 면역분석 사이의 Student's t-test의 p value 값은 0.0001 미만이었다. 0.05 보다 작은 이 p value 값은 4차 HRP 면역분석이 이전 면역분석과 통계적으로 유의한 차이가 있음을 나타낸다. 즉, 3차 HRP 면역분석까지는 면역분석 값이 1차 HRP 면역분석 값과 거의 유사할 수 있으나, 4차 면역분석부터는 통계적으로 유의미하게 다른 결과 값이 나올 수 있는 우려가 있음을 알 수 있었다. In addition, referring to FIG. 5, the OD values (HRP treatment) of the first, second, third, and fourth HRP immunoassays were 0.52, 0.52, 0.50, and 0.22, respectively. Compared to the first HRP immunoassay values, the second and third HRP immunoassay values were fairly close to 100%. In contrast, the 4th HRP immunoassay value decreased by 43% compared to the 1st HRP immunoassay value. At this time, the p value of Student's t-test between the 4th and 1st HRP immunoassays was less than 0.0001. This p value of less than 0.05 indicates that the 4th HRP immunoassay has a statistically significant difference from the previous immunoassay. That is, it was found that the immunoassay values may be almost similar to the first HRP immunoassay values up to the third HRP immunoassay, but there is a concern that statistically significant different result values may be obtained from the fourth immunoassay.

한편, 재생 단계의 OD 값(Regeneration)은 1차부터 3차까지 순서대로 0.06, 0.05, 0.03이었다. 1차 HRP 면역 측정의 OD 값과 비교하여 1차 내지 3차 재생 단계의 OD 값(Regeneration)은 각각 12, 9, 5%였으며 각 재생 단계와 1차 HRP 면역 측정 사이의 모든 p value 값은 0.0001 미만이었다. Meanwhile, the OD values (Regeneration) of the regeneration step were 0.06, 0.05, and 0.03 in order from the first to the third. Compared to the OD values of the first HRP immunoassay, the OD values (Regeneration) of the first to third regeneration stages were 12, 9, and 5%, respectively, and all p values between each regeneration stage and the first HRP immunoassay were less than 0.0001.

이러한 데이터를 통해 방향 제어가 있는 자동 표시 Z-도메인 결합 항체에 대한 DSS 처리는 공유 결합을 통해 효과적으로 고정될 수 있으며 공유 고정 및 방향 제어 캡처 항체가 있는 대장균 세포는 고체 지지체로서 재생 면역분석에 적합한 것을 확인하였다.These data confirm that DSS treatment for auto-labeled Z-domain binding antibodies with direction control can effectively immobilize via covalent linkage and that E. coli cells with covalent immobilization and direction control capture antibodies are suitable for regenerative immunoassays as solid supports.

한편, 대장균 세포 기반의 면역분석에서 분석 횟수와 재생처리의 횟수가 증가할수록 OD 450값이 감소하는 것으로 나타났는데, 이는 버퍼 교체와 세척을 위한 원심분리 과정에서 야기되는 세포의 손실에서 발생하는 문제점인 것으로 사료된다. 따라서 계속적인 면역분석과 재생처리의 반복은 고형의 지지체인 대장균 세포의 손실을 일으키고 이는 전반적인 OD 450값의 감소를 일으키게 된다.On the other hand, in the E. coli cell-based immunoassay, it was found that the OD 450 value decreased as the number of assays and regeneration treatment increased. Therefore, continuous repetition of immunoassay and regeneration treatment causes loss of E. coli cells, which are solid supports, which causes a decrease in the overall OD 450 value.

<실시예 2><Example 2>

Z-domain이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막 및 일반 대장균의 외부 세포막 기반의 면역분석 Z-domain self-labeled E. coli outer cell membrane and general E. coli outer cell membrane-based immunoassay

본 출원의 발명자들은 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막과 항체를 배향제어하고 화학적으로 고정할 경우와 일반 대장균 세포에 항체를 배향제어하고 화학적으로 고정할 경우의 면역 분석을 수행하였다.The inventors of the present application conducted an immunoassay when the Z-domain self-labeled outer cell membrane of E. coli and the antibody were chemically immobilized after orientation control, and when the antibody was directed and chemically immobilized in general E. coli cells.

본 실험은 다음과 같은 순서로 수행되었다.This experiment was conducted in the following order.

1) 대장균의 외부 세포막 코팅 후, 포획 항체 및 DSS의 순차적 처리에 의해 공유 고정화되고 방향 제어된 분자 인식층을 형성하였다. 1) After coating the outer cell membrane of Escherichia coli, a molecular recognition layer with a covalent immobilization and direction control was formed by sequential treatment of capture antibody and DSS.

2) 20ng/mL의 HRP를 처리하고 TMB 처리로 정량하였다.2) 20 ng/mL of HRP was treated and quantified by TMB treatment.

3) 면역검정은 네번의 재생 단계로 다섯번 반복하였다.3) The immunoassay was repeated five times with four regeneration steps.

도 6의 (a)는 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM)을 기반으로 한 면역분석 결과를 나타낸 것으로, 재생 처리 횟수에 따른 면역분석 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 6 (a) shows the result of immunoassay based on the outer cell membrane (OM) of Escherichia coli in which the Z-domain is self-labeled, and is a graph showing the immunoassay result according to the number of regeneration treatments.

도 6의 (a)를 참조하면, 1차 내지 5차 HRP 면역분석 시, OD 값(HRP treatment)은 각각 0.38, 0.35, 0.36, 0.35, 0.35으로 나타났다. 1차 HRP 면역 분석값과 비교하여 2차 내지 5차 면역 분석까지의 상대 OD 값은 각각 93, 96, 93 및 93%으로 나타났다.Referring to (a) of FIG. 6, in the first to fifth HRP immunoassays, the OD values (HRP treatment) were 0.38, 0.35, 0.36, 0.35, and 0.35, respectively. Compared to the first HRP immunoassay value, the relative OD values from the second to fifth immunoassays were 93, 96, 93, and 93%, respectively.

이를 통해, 모든 HRP 면역검정이 안정적인 신호를 보였고 재생 면역검정이 5차 HRP 처리까지 편차 10% 미만으로 검증되었음을 확인할 수 있었다.Through this, it was confirmed that all HRP immunoassays showed stable signals and that the regeneration immunoassay was verified with less than 10% deviation until the 5th HRP treatment.

재생 단계의 OD 값은 모두 0.01 미만이었고, 1차 HRP 면역 분석과 비교하여 재생 단계의 상대 OD 값과 p-값은 각각 2% 및 0.001 미만이었다. 이러한 결과는 신호가 재생 단계 후 2% 미만으로 통계적으로 유의하게 감소되었음을 나타낸다. The OD values of the regeneration phase were all less than 0.01, and the relative OD values and p-values of the regeneration phase compared to the primary HRP immunoassay were 2% and less than 0.001, respectively. These results indicate that the signal was statistically significantly reduced to less than 2% after the regeneration step.

도 6의 (b)는 일반 대장균의 외부 세포막을 기반으로 한 면역분석 결과를 나타낸 것으로, 재생 처리 횟수에 따른 면역분석 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 6 (b) shows the immunoassay results based on the outer cell membrane of general E. coli, and is a graph showing the immunoassay results according to the number of regeneration treatments.

도 6의 (b)를 참조하면, 모든 HRP 면역 측정 및 재생 단계의 OD 값과 p-값은 각각 0.01 및 0.001 미만이었다.Referring to (b) of FIG. 6 , the OD values and p-values of all HRP immunoassay and regeneration steps were less than 0.01 and 0.001, respectively.

이러한 결과를 통해 DSS의 처리가 방향 제어 포획 항체와 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막은 공유 결합을 형성하고, 이에 두 물질 간 결합력이 향상되어 효과적으로 고정되어 분자 인식층으로서 재생 면역분석에 적합함을 확인하였다. 또한, 가교제와 재생 완충제를 모두 처리하여도 포획 항체의 분석물 결합 활성을 유지함을 확인하였다.Through these results, DSS treatment forms a covalent bond between the direction-controlled capture antibody and the Z-domain self-labeled outer cell membrane of E. coli, which improves the binding force between the two materials and effectively fixes them, confirming that it is suitable for regenerative immunoassay as a molecular recognition layer. In addition, it was confirmed that the analyte-binding activity of the capture antibody was maintained even after treatment with both the cross-linking agent and the regeneration buffer.

<실시예 3><Example 3>

본 발명의 분자 인식층SPR 바이오센서 적용 및 이의 재생능 분석Application of molecular recognition layer SPR biosensor of the present invention and analysis of its regeneration ability

상기 실시예에서 분리한 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막과 항체를 화학적 고정한 분자 인식층을 제조하였고, 이를 SPR 바이오센서에 적용한 뒤, 재생능을 분석하였다.A molecular recognition layer was prepared by chemically immobilizing the outer cell membrane of Escherichia coli in which the Z-domain isolated in the above example was self-labeled and the antibody was chemically fixed, and then applied to the SPR biosensor and the regenerative ability was analyzed.

분자 인식층은 본 발명의 면역 바이오센서용 분자 인식층 제조방법과 동일하게 제조되었으며, 재생 버퍼로는 2% tween-20 이 포함된 0.1 M 글리신 용액(pH 2.5)을 사용한 사용하였다.The molecular recognition layer was prepared in the same manner as in the method for preparing a molecular recognition layer for an immune biosensor of the present invention, and a 0.1 M glycine solution (pH 2.5) containing 2% tween-20 was used as a regeneration buffer.

분석대상 물질로는 급성 염증성 CRP을 선택하여 사용하였다. CRP는 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염, 혈관염, 종양과 같은 염증성 질환 진단을 위한 바이오 마커로 널리 사용되고 있다. Acute inflammatory CRP was selected and used as the material to be analyzed. CRP is widely used as a biomarker for diagnosing inflammatory diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, infections, vasculitis, and tumors.

먼저, SPR 바이오센서의 표면 상에 대장균의 외부 세포막(OM)을 코팅처리한 후, 항-CRP 항체를 1시간 동안 첨가하여 반응시켰다. 이후, DSS를 첨가하여 화학적 고정시키고, 농도 100ng/mL의 CRP를 첨가하여 반응시켰다. 반응 후, CRP를 측정한 다음, SPR 바이오센서는 재생 버퍼인 2% tween-20 이 포함된 0.1 M 글리신 용액(pH 2.5)로 세척하여 재생처리 하였다. 재생처리 후, CRP에 대한 분석을 수행하였고, 이러한 재생 단계를 5회 반복하였으며, CRP 바이오 센싱 분석은 5 회 반복 수행하였다. 이때 자동 표지된 Z-도메인이 없는 외부 세포막 층으로 코팅된 SPR 바이오센서를 대조군으로 사용하였다. SPR 반응은 재생 처리 중에 계속적으로 모니터링 하였다.First, after coating the outer cell membrane (OM) of E. coli on the surface of the SPR biosensor, anti-CRP antibody was added and reacted for 1 hour. Thereafter, chemical fixation was performed by adding DSS, and reaction was performed by adding CRP at a concentration of 100 ng/mL. After the reaction, CRP was measured, and then the SPR biosensor was washed and regenerated with a 0.1 M glycine solution (pH 2.5) containing 2% tween-20 as a regeneration buffer. After the regeneration treatment, analysis of CRP was performed, and this regeneration step was repeated 5 times, and CRP biosensing analysis was repeated 5 times. At this time, an SPR biosensor coated with an outer cell membrane layer without an auto-labeled Z-domain was used as a control. The SPR response was continuously monitored during the regeneration process.

도 7은 SPR 바이오센서용 분자 인식층에 대한 SPR 반응 신호값을 확인한 것으로, 도 7의 (a)는 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM)을 이용한 실험군의 결과를 나타낸 것이고, 도 7의 (b)는 Z-도메인이 표지되지 않은 일반 대장균의 외부 세포막(OM)을 이용한 대조군의 결과를 나타낸 것이다.Figure 7 confirms the SPR response signal value for the molecular recognition layer for the SPR biosensor, Figure 7 (a) shows the results of the experimental group using the outer cell membrane (OM) of E. coli self-labeled with the Z-domain, and Figure 7 (b) shows the results of the control group using the outer cell membrane (OM) of normal E. coli unlabeled with the Z-domain.

도 7의 (a)를 참조하면, 항-CPR 처리 시 SPR 반응값은 11.85 A.U 증가하였고, DSS 처리 후 SPR 반응값은 3.82 A.U 증가하였다. 이를 통해, DSS 처리에 의해 항체가 대장균의 외부 세포막에 결합되고, 항체와 자동 표지된 Z-도메인 사이에 공유 결합이 형성되었음을 확인할 수 있다.Referring to (a) of FIG. 7, the SPR response value increased by 11.85 A.U during anti-CPR treatment, and the SPR response value increased by 3.82 A.U after DSS treatment. Through this, it can be confirmed that the DSS treatment binds the antibody to the outer cell membrane of E. coli and forms a covalent bond between the antibody and the automatically labeled Z-domain.

1차에서 5차 CPR 처리 시 SPR 반응값은 각각 7.62, 7.59, 8.33, 8.05 및 8.21 A.U로 계산되었다. 2차에서 5차까지의 CRP 처리에서 상대 신호는 1차 CRP 처리와 비교하여 각각 100, 109, 106 및 108%였다. 이를 통해 5번의 재생 바이오 센싱 신호가 10% 편차 미만의 안정적인 신호를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, SPR 바이오센싱의 반복성은 4.27%의 변동계수로 계산되었다. 이러한 결과는 본 발명의 분자 인식층의 재생이 좋은 반복성을 나타낸다는 것을 의미한다.In the first to fifth CPR treatments, the SPR response values were calculated to be 7.62, 7.59, 8.33, 8.05, and 8.21 A.U, respectively. The relative signals in the 2nd to 5th CRP treatments were 100, 109, 106 and 108%, respectively, compared to the 1st CRP treatment. Through this, it was found that the 5 regenerated biosensing signals showed a stable signal with less than 10% deviation. In addition, the repeatability of SPR biosensing was calculated with a coefficient of variation of 4.27%. These results indicate that the reproduction of the molecular recognition layer of the present invention exhibits good repeatability.

한편, 재생 단계의 경우 재생 버퍼 처리 중에 높은 SPR 응답이 모니터링되었다. 이는 재생 버퍼의 조성과 농도가 다른 PBS 기반 용액과 다르기 때문이다. 모든 SPR 반응은 버퍼의 조성이나 농도에 영향을 받지 않도록 세척 단계 후 동일한 PBS 용액을 사용하여 측정되었다. On the other hand, for the regeneration step, a high SPR response was monitored during regeneration buffer processing. This is because the composition and concentration of the regeneration buffer are different from other PBS-based solutions. All SPR reactions were measured using the same PBS solution after washing steps so that the composition or concentration of the buffer was not affected.

면역친화층 반응의 SPR 반응과 비교하여, 1차에서 5차 재생 단계까지의 신호는 각각 0.63, 0.36, 0.32, 0.09 및 0.58 A.U.로 계산되었다. 모든 신호는 첫 번째 CRP 처리의 신호와 비교하여 8% 미만이었다. 이를 통해, 바이오센서의 분자 인식층이 성공적으로 재생되었음을 알 수 있다. 즉, 방향 제어되고 공유 고정화된 분자 인식층이 SPR 바이오센서에 형성되었고, 상기 분자 인식층은 재생 단계에 의해 재사용 가능하다는 것을 알 수 있다.Compared with the SPR response of the immunoaffinity layer reaction, the signals from the 1st to 5th regeneration stages were calculated as 0.63, 0.36, 0.32, 0.09 and 0.58 A.U., respectively. All signals were less than 8% compared to that of the first CRP treatment. Through this, it can be seen that the molecular recognition layer of the biosensor was successfully regenerated. That is, it can be seen that a directionally controlled and covalently immobilized molecular recognition layer is formed on the SPR biosensor, and the molecular recognition layer can be reused by the regeneration step.

도 7의 (b)를 참조하면, 대장균의 외부 세포막 형성 후 SPR 반응값은 0.12 및 2.78 A.U만 변경되었다. 항-CRP와 DSS를 순차적으로 처리했을 때, 항체 처리는 항체와 결합하는 자동 표시 Z-도메인이 없었기 때문에 자동 표시 벡터가 있는 대장균의 외부 세포막과 비교하여 1.5% 미만의 신호 변화를 보였다.Referring to (b) of FIG. 7 , after the formation of the outer cell membrane of E. coli, the SPR response values were only changed by 0.12 and 2.78 A.U. When anti-CRP and DSS were treated sequentially, the antibody treatment showed a signal change of less than 1.5% compared to the outer cell membrane of E. coli with the auto-labeling vector because there was no auto-labeling Z-domain binding to the antibody.

고정된 항체는 없었지만 DSS는 외부 세포막의 다른 막 단백질을 고정할 수 있으므로 SPR 반응은 2.78 A.U만큼 변경되었다. DSS 처리 후, 1차에서 5차 CRP 처리까지 증가된 SPR 반응은 1.02, 0.91, 0.93, 0.68, 0.66 A.U으로 나타났다. 첫 번째부터 다섯번째까지의 재생 단계는 각각 0.86, 0.32, 0.53, 0.67, 0.68 A.U.으로 나타났다. 모든 신호는 자동 표시되는 Z-도메인이 있는 분자 인식층을 사용한 CRP 처리와 비교하여 15% 미만이었다. Although no antibodies were immobilized, the SPR response was altered by 2.78 A.U. as DSS could immobilize other membrane proteins in the outer cell membrane. After DSS treatment, the increased SPR response from the first to the fifth CRP treatment was 1.02, 0.91, 0.93, 0.68, and 0.66 A.U. The first to fifth regeneration stages showed 0.86, 0.32, 0.53, 0.67, and 0.68 A.U., respectively. All signals were less than 15% compared to CRP treatment using a molecular recognition layer with an auto-labeled Z-domain.

따라서 본 출원의 발명자들은 바이오센서에 적용된 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막은 항체 또는 분석물질의 비특이적 결합을 효율적으로 방지함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 5배의 재생 능력으로 SPR 바이오센서에서 공유 고정화되고 방향 제어된 항체를 갖는 재생 분자 인식층이 성공적으로 형성되었음을 확인할 수 있었다. 즉, 5회 재생 및 5회 CRP 측정이 가능하므로 최소 4개의 추가 SPR 칩과 분자 인식층 형성에 소요되는 시간 및 비용을 절약할 수 있는 효과를 도출함을 알 수 있었다. 또한, SPR 바이오센서용 자가 표지기술에 의한 항체의 방향 제어는 감도를 향상시키는 것으로 확인되었다. Z-도메인의 자가 표지에 의한 항체의 방향 제어 외에 가교제 처리에 의한 공유 고정화 역시 분자 인식층의 안정성을 증가시킬 수 있으므로 비용과 시간을 절감하면서 민감하고 재생적인 바이오센싱을 실현할 수 있음을 확인하였다.Accordingly, the inventors of the present application could confirm that the Z-domain applied to the biosensor effectively prevents non-specific binding of antibodies or analytes to the outer cell membrane of E. coli labeled with the self. Specifically, it was confirmed that a regenerative molecule recognition layer having an antibody covalently immobilized and direction-controlled in the SPR biosensor was successfully formed with a 5-fold regeneration capacity. That is, since 5 times of regeneration and 5 times of CRP measurement are possible, it can be seen that at least 4 additional SPR chips and the time and cost required for forming the molecular recognition layer can be saved. In addition, it was confirmed that the direction control of the antibody by the self-labeling technology for the SPR biosensor improves the sensitivity. In addition to direction control of the antibody by self-labeling of the Z-domain, covalent immobilization by cross-linking agent treatment can also increase the stability of the molecular recognition layer, so it was confirmed that sensitive and reproducible biosensing can be realized while reducing cost and time.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the claims to be described later rather than the detailed description above, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and equivalent concepts thereof should be construed as being included in the scope of the present invention.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Hallym University <120> An immune biosensor, an immune bio kit including the same, a method of manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor and a method of regenerating the immune biosensor. <130> P210059KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence of Z-domain <400> 1 Val Ala Leu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Pro His Glu Ala 1 5 10 15 Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Gly Leu Asn Ala Ser Asn 20 25 30 Ala Leu Ala Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu 35 40 45 His Ile Ser Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Ser Asn Gly 50 55 60 Leu Gly Leu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro 65 70 75 80 His Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Leu Tyr Ser 85 90 95 Ala Ser Pro Ala Ser Pro Pro Arg Ser Glu Arg Gly Leu Asn Ser Glu 100 105 110 Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Leu Glu Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Asn Ala Ser 130 135 140 Pro Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ala Leu Ala Pro Arg Ala Leu Tyr Ser 145 150 155 160 <210> 2 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence of Z-domain <400> 2 gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt acatttacct 60 aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt taaaagatga cccaagccaa 120 agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaa 174 <110> Industry Academic Cooperation Foundation of Hallym University <120> An immune biosensor, an immune bio kit including the same, a method of manufacturing a molecular recognition layer of the immune biosensor and a method of regenerating the immune biosensor. <130> P210059KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Protein sequence of Z-domain <400> 1 Val Ala Leu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Pro His Glu Ala 1 5 10 15 Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Gly Leu Asn Ala Ser Asn 20 25 30 Ala Leu Ala Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu 35 40 45 His Ile Ser Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Ser Asn Gly 50 55 60 Leu Gly Leu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro 65 70 75 80 His Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Leu Tyr Ser 85 90 95 Ala Ser Pro Ala Ser Pro Pro Arg Ser Glu Arg Gly Leu Asn Ser Glu 100 105 110 Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Leu Glu Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Asn Ala Ser 130 135 140 Pro Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ala Leu Ala Pro Arg Ala Leu Tyr Ser 145 150 155 160 <210> 2 <211> 174 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Protein sequence of Z-domain <400> 2 gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt acatttacct 60 aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt taaaagatga cccaagccaa 120 agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaa 174

Claims (15)

분자 인식층을 포함하고,
상기 분자 인식층은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는,
면역 바이오센서.Including a molecular recognition layer,
The molecular recognition layer is characterized in that the orientation-controlled antibody that specifically binds to the biological material is covalently fixed.
immune biosensor. 제1항에 있어서,
상기 분자 인식층은 세 번 이내 반복사용이 가능한 것을 특징으로 하는,
면역 바이오센서.According to claim 1,
Characterized in that the molecular recognition layer can be used repeatedly within three times,
immune biosensor. 제1항에 있어서
상기 분자 인식층은 세번 반복사용 시,
450 nm의 파장에서 TMB 반응의 광학 밀도(OD) 값이 최초 면역반응 시 OD 값의 70% 이상으로 나타나는 것을 특징으로 하는
면역 바이오센서.According to claim 1
When the molecular recognition layer is used repeatedly three times,
Characterized in that the optical density (OD) value of the TMB reaction at a wavelength of 450 nm appears as 70% or more of the OD value during the first immunoreaction
immune biosensor. 제1항에 있어서,
상기 분자 인식층은
Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)을 포함하는 것을 특징으로 하는
면역 바이오센서.According to claim 1,
The molecular recognition layer
Characterized in that the Z-domain includes the outer membrane of E. coli, which is self-labeled (autodisplaying)
immune biosensor. 제1항에 있어서,
상기 생체 물질은 항원, 항체, 펩타이드, 단백질, 박테리아, 바이러스, 및 진균으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는
면역 바이오센서.According to claim 1,
Characterized in that the biological material is any one selected from the group consisting of antigens, antibodies, peptides, proteins, bacteria, viruses, and fungi
immune biosensor. 제1항에 있어서,
상기 면역 바이오센서는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바 이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 및 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는,
면역 바이오센서.According to claim 1,
The immune biosensor is selected from the group consisting of a SURFACE PLASMON RESONANCE (SPR) biosensor, a QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE (QCM) biosensor, a SURFACE ACOUSTIC WAVE (SAW) biosensor, and a FLEXURAL PLATE WAVE (FPW) biosensor.
immune biosensor. 분자인식층을 포함하고, 상기 분자인식층은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 바이오센서; 및
트윈-20(tween-20) 및 글리신 용액이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼를 포함하는
생체 물질 검출용 키트.an immune biosensor comprising a molecular recognition layer, wherein the molecular recognition layer is immobilized by a covalent bond with a controlled orientation antibody that specifically binds to a biological material; and
Buffer for immune biosensor regeneration containing tween-20 and glycine solution
Kits for detecting biomaterials. 제7항에 있어서,
상기 면역 바이오센서 재생용 버퍼는
상기 버퍼의 총 함량을 기준으로 2%의 트윈-20(tween-20) 및 0.1M 글리신이 함유된 것을 특징으로 하는.
생체 물질 검출용 키트.According to claim 7,
The buffer for regeneration of the immune biosensor
Characterized in that it contains 2% of tween-20 and 0.1M glycine based on the total content of the buffer.
Kits for detecting biomaterials. 항체를 배향제어 하는 항체 배향제어단계;
상기 배향제어된 항체를 Disccinimidly(디숙신이미딜) 기반의 가교제 처리하여 고체 지지체 표면에 공유결합 시키는 화학적 고정단계를 포함하는,
면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법.Antibody orientation control step of orientation control of the antibody;
Comprising a chemical fixation step of covalently binding the orientation-controlled antibody to the surface of a solid support by treatment with a disccinimidly (disuccinimidyl)-based crosslinking agent,
A method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor. 제9항에 있어서,
상기 항체 배향제어단계는
Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막을 고체 지지체 표면에 코팅하는 단계; 및
상기 코팅된 고체 지지체 표면에 항체를 처리하는 단계를 포함하는,
면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법.According to claim 9,
The antibody orientation control step
coating the surface of the solid support with the outer cell membrane of E. coli labeled with the Z-domain; and
Comprising the step of treating the antibody on the surface of the coated solid support,
A method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor. 제9항에 있어서,
상기 화학적 고정단계는
디숙신이미딜 글루타레이트(disuccinimidyl glutarate, DSG), 디숙신이미딜 수베레이트 (disuccinimidyl suberate, DSS) 및 폴리(에틸렌 글리콜)일화 비스(설포숙신이미딜)수베레이트 (poly(ethylene glycol)ylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate, BS(PEG)5) 중 적어도 어느 하나를 처리하는 단계를 포함하는,
면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법.According to claim 9,
The chemical fixation step is
Disuccinimidyl glutarate (DSG), disuccinimidyl suberate (DSS) and poly (ethylene glycol) ylated bis (sulfosuccinimidyl) suberate (poly (ethylene glycol) ylated bis (sulfosuccinimidyl) suberate, BS (PEG) 5 ), comprising the step of treating at least one of
A method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor. 제11항에 있어서,
상기 DSG를 31μM의 농도로 처리하는 하는 단계를 포함하는
면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법.According to claim 11,
Comprising the step of treating the DSG at a concentration of 31 μM
A method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor. 제11항에 있어서,
상기 DSS를 500μM의 농도로 처리하는 하는 단계를 포함하는
면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법.According to claim 11,
Comprising the step of treating the DSS at a concentration of 500 μM
A method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor. 제11항에 있어서,
상기 BS(PEG)5를 125μM의 농도로 처리하는 하는 단계를 포함하는
면역 바이오센서용 분자 인식층 제조 방법.According to claim 11,
Comprising the step of treating the BS (PEG) 5 at a concentration of 125 μM
A method for manufacturing a molecular recognition layer for an immune biosensor. 분자인식층을 포함하고, 상기 분자인식층은 생체 물질에 특이적으로 결합하는 배향제어된 항체가 공유결합으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 바이오센서를 이용하여 면역 반응을 수행한 후,
트윈-20(tween-20) 및 0.1M 글리신이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼로 상기 면역 바이오센서를 세척하는 단계를 포함하는,
면역 바이오센서의 재생방법.
After carrying out an immune response using an immune biosensor comprising a molecular recognition layer, wherein the molecular recognition layer is immobilized with an orientation-controlled antibody that specifically binds to a biological material by a covalent bond,
Washing the immune biosensor with a buffer for immune biosensor regeneration containing tween-20 and 0.1M glycine,
Regeneration method of immune biosensor.
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