KR20230105738A - RECEPTOR BINDING DOMAIN OF SPIKE PROTEIN OF SARS-CoV-2 PRODUCED FROM GLYCOENGINEERING PLANTS AND USES THEREOF - Google Patents

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KR20230105738A
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Abstract

본 발명은 식물로부터 생산된 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 유전자를 형질전환 식물체에 적용하여, 수용성 형태의 변형된 당쇄를 갖는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있다. 또한, 상기 식물 유래의 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 항원으로서 단독 또는 보조제와 함께 개체에 주입하여 중화 항체를 효과적으로 생성하고, 강력한 체액성 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 식물 유래 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a receptor binding domain of a spike protein of SARS-CoV-2 produced from plants and uses thereof. By applying the RBD gene of the codon-optimized SARS-CoV-2 spike protein according to the present invention to transgenic plants, the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein having a modified sugar chain in a water-soluble form can be efficiently mass-produced. there is. In addition, by injecting the RBD protein of the plant-derived SARS-CoV-2 spike protein as an antigen alone or together with an adjuvant, neutralizing antibodies can be effectively generated and a strong humoral immune response can be induced. Therefore, the RBD protein of the plant-derived SARS-CoV-2 spike protein according to the present invention can be usefully used for preventing or treating coronavirus infection-19 (COVID-19).

Description

당쇄 구조가 변형된 식물로부터 생산된 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 및 이의 용도{RECEPTOR BINDING DOMAIN OF SPIKE PROTEIN OF SARS-CoV-2 PRODUCED FROM GLYCOENGINEERING PLANTS AND USES THEREOF}Receptor binding domain of spike protein of SARS-CoV-2 produced from plants with modified sugar chain structure and uses thereof

본 발명은 당쇄 구조를 변형시킨 식물로부터 생산된 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a receptor binding domain of a spike protein of SARS-CoV-2 produced from a plant having a modified sugar chain structure and a use thereof.

코로나바이러스 감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의해 발병하는 새로운 호흡기 감염질환이다. 2019년 12월 중국 우한지역에서 처음 발생한 뒤 전 세계적으로 감염이 폭발적으로 증가하는 추세를 보이며, 세계적으로 심각한 보건 문제로 대두되고 있다.Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a new respiratory infectious disease caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Since the first outbreak in Wuhan, China in December 2019, infections have been explosively increasing worldwide, emerging as a serious global health problem.

SARS-CoV-2 바이러스는 RNA 바이러스로, 30 kb의 염기서열을 가지며 4개의 중요한 구조 단백질인 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid, N), 스파이크(Spike, S), 막(Membrane, M) 및 외피(Envelope, E) 단백질을 가지고 있다. 이중 SARS-CoV-2의 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)은 숙주세포 감염 시 S1과 S2의 서브유닛으로 숙주세포 단백질 분해효소(proteases)에 의해 분리되며, S1은 RBD를 통해 숙주세포의 수용체인 ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)와 결합하는데 돕는 역할을 한다(Renhong Yan et al., Science., 367(6485):1444-1448, 2020). 현재까지 오직 S 당단백질만 중화 항체를 유도할 수 있을 것으로 알려지고 있으며, 이에 따라 S 단백질의 RBD 도메인이 중요한 백신 표적으로 연구되고 있다.SARS-CoV-2 virus is an RNA virus with a 30 kb nucleotide sequence and four important structural proteins: Nucleocapsid (N), Spike (S), Membrane (M), and Envelope (Envelope). , E) has a protein. Among them, the spike glycoprotein of SARS-CoV-2 is separated by host cell proteases into S1 and S2 subunits during host cell infection, and S1 binds to ACE2, the host cell receptor, through RBD. (Angiotensin-converting enzyme 2) (Renhong Yan et al ., Science., 367 (6485): 1444-1448, 2020). To date, it is known that only S glycoprotein can induce neutralizing antibodies, and accordingly, the RBD domain of S protein is being studied as an important vaccine target.

한편, 상기와 같은 COVID-19 예방을 위한 효율적인 백신 제조와 백신용 항원 단백질의 생산을 위한 의료산업계의 요구는 단기간에 유용 생리활성 물질의 대량생산 시스템의 개발이다. 식물체를 이용한 유용 생리활성 물질의 생산은, 동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 생산하는 방법에서 발생할 수 있는 여러가지 오염원을 원천 배제할 수 있다. 또한, 해당 유용물질의 수요가 급증할 때 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템과 비교하면 절대적으로 유리하기 때문에, 최단기간에 저비용으로 대량생산이 가능하다는 장점으로 인해 최근 백신 개발 및 치료제 개발 등 의료산업 분야에 널리 사용되고 있다(한국공개특허 제10-2008-0094918호).On the other hand, the demand of the medical industry for the production of efficient vaccine production and vaccine antigen protein for the prevention of COVID-19 as described above is the development of a system for mass production of useful physiologically active substances in a short period of time. Production of useful physiologically active substances using plants can exclude various sources of contamination that may occur in the method of producing proteins synthesized in animal cells or microorganisms. In addition, when the demand for useful substances soars, it is absolutely advantageous compared to existing animal cell systems in terms of equipment technology or cost required for mass production, so recent vaccines can be mass produced at low cost in the shortest time. It is widely used in the medical industry, such as development and treatment development (Korean Patent Publication No. 10-2008-0094918).

KRKR 10-2008-0094918 10-2008-0094918 AA

Renhong Yan et al., Science., 367(6485):1444-1448, 2020Renhong Yan et al., Science., 367(6485):1444-1448, 2020

이에 본 발명자들은 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 효과적인 백신을 식물체로부터 대량생산하고자 연구 개발하였다. 그 결과, 식물 발현 시스템에 도입되는 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 유전자를 도출하고, 이를 식물 특이적 N-당사슬(N-glycan)이 제거된 당단백질을 생산하는 형질전환 식물체에 적용하여, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질이 효율적으로 대량생산될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 대량생산된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 항원으로서 마우스 모델에 단독 투여 또는 보조제(adjuvant)와 동시 투여함에 의해 효과적으로 중화 항체가 생성되고, 강력한 체액성 면역반응이 유도됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors researched and developed an effective vaccine for coronavirus infection-19 (COVID-19) in order to mass-produce it from plants. As a result, the RBD gene of the codon-optimized SARS-CoV-2 spike protein introduced into the plant expression system was derived, and this was applied to transgenic plants producing glycoproteins from which the plant-specific N-glycan was removed. By application, it was confirmed that the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein can be efficiently mass-produced. In addition, it was confirmed that neutralizing antibodies were effectively generated and a strong humoral immune response was induced by administering the RBD protein of the mass-produced SARS-CoV-2 spike protein as an antigen to a mouse model alone or co-administered with an adjuvant. By doing so, the present invention was completed.

상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention provides a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the receptor binding domain (RBD) protein of the SARS-CoV-2 spike protein.

본 발명의 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 적재된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 재조합 벡터를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a recombinant vector for producing the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein loaded with the polynucleotide.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 생산하는 형질전환된 식물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a transformed plant that produces the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein transformed with the recombinant vector.

본 발명의 또 다른 측면은, 형질전환 식물에서 발현된 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 제공한다.Another aspect of the present invention provides an RBD protein of a plant-derived SARS-CoV-2 spike protein expressed in a transgenic plant.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 RBD 단백질을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 예방용 백신 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a vaccine composition for preventing SARS-CoV-2 infection comprising the RBD protein as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 RBD 단백질을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 치료용 약학 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating SARS-CoV-2 infection comprising the RBD protein as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 RBD 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 SARS-CoV-2 감염증 예방 및 치료 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method for preventing and treating SARS-CoV-2 infection in a subject, comprising administering the RBD protein to the subject.

본 발명의 또 다른 측면은, a) 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물을 제조하는 단계; b) 상기 형질전환 식물로부터 태그(Tag)가 결합된 RBD 단백질을 수득하는 단계; 및 c) 프로테아제를 처리하여 RBD 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention, a) preparing a transgenic plant by introducing a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein into a plant; b) obtaining a tag-linked RBD protein from the transgenic plant; And c) processing the protease to obtain the RBD protein; provides a method for mass production of RBD protein of plant-derived SARS-CoV-2 spike protein including.

본 발명에 따른 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 유전자가 도입된 식물 발현 시스템을 식물 특이적 N-당사슬(N-glycan)이 제거된 당단백질을 생산하는 형질전환 식물체에 적용하여, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 효율적으로 대량생산할 수 있다. 한편, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 식물체로부터 수용성(soluble) 형태로 생산가능하며, 동물세포 사용에 따른 고가의 비용 또한 절감할 수 있다. 또한, 상기 변형된 당쇄를 갖는, 식물 유래의 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 항원으로서 단독 또는 보조제(adjuvant)와 함께 개체에 주입할 경우, 이에 대한 중화 항체를 효과적으로 생성하고, 강력한 체액성 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 형질전환된 식물로부터 대량생산된 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.By applying the plant expression system into which the RBD gene of the codon-optimized SARS-CoV-2 spike protein according to the present invention has been introduced is applied to transgenic plants that produce glycoproteins from which the plant-specific N-glycan has been removed, RBD protein of SARS-CoV-2 spike protein can be efficiently mass-produced. On the other hand, the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein can be produced in a water-soluble form from plants, and expensive costs associated with the use of animal cells can also be reduced. In addition, when the RBD protein of the plant-derived SARS-CoV-2 spike protein having the modified sugar chain is injected into a subject alone or together with an adjuvant, neutralizing antibodies against it are effectively generated and strong May induce a humoral immune response. Therefore, the RBD protein of the spike protein of SARS-CoV-2 mass-produced from the transformed plant of the present invention can be usefully used for preventing or treating coronavirus infection-19 (COVID-19).

도 1은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질(RBD)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 2는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 단편을 코딩하는 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 코돈 최적화된 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 단편을 코딩하는 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 4는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 식물에 발현시키기 위한 코돈 최적화된 유전자 구축물(construct)을 도식화한 도면이다. 구체적으로, 당사슬(glycan) 패턴이 조작된 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD를 포함하는 4가지 다른 구축물의 T-DNA 영역을 도식화한 것이다. 상기 구축물은 RBD의 5'(MSP 또는 LS 및 MSP) 및 3'(6×His 또는 6×His 및 SEKDEL)에 추가 서열을 더하여 제조하였다. 여기에서, LB는 T-DNA 좌측 보더(left border), RB는 T-DNA 우측 보더(right border), 35S는 CaMV 35S 프로모터, Ω는 TMV 리더 서열, Replicase는 TMV 레플리카제, MP는 TMV 이동단백질, GOI는 관심 유전자, 3'NTR은 TMV 3' 비번역 영역, LS는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 리더 서열, CP는 TMV 외피단백질, Rz는 리보자임, MSP는 마우스 신호 펩티드, RBD-Opti는 최적화된 RBD 식물 코돈, TB는 트롬빈 프로테아제 절단 부위, SSGSSG는 링커, 6×His는 헥사 히스티딘 태그, SEKDEL은 ER 보유 신호 펩티드 서열이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 당사슬 패턴이 조작된 Nicotiana benthamiana에서 4가지 종류의 RBD 구축물(T10, T11, T12 및 T13)이 발현된 샘플링한 담배잎 사진으로, 4 DPI(day after infiltration)에 촬영한 것이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 당사슬 패턴이 조작된 Nicotiana benthamiana에서 4가지 종류의 RBD 구축물(T10, T11, T12 및 T13)이 발현된 샘플링한 담배잎 사진으로, 각각 4, 5, 6 및 7 DPI(day after infiltration)에 촬영한 것이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 당사슬 패턴이 조작된 Nicotiana benthamiana에서 4가지 종류의 RBD 구축물(T10, T11, T12 및 T13)이 발현된 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 면역블롯 분석을 통해 검출한 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, 4 DPI 담배잎에서 추출한 RBD 단백질이 수용성 형태로 발현됨을 확인한 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 당사슬 패턴이 조작된 Nicotiana benthamiana에서 4가지 종류의 RBD 구축물(T10, T11, T12 및 T13)이 발현된 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 면역블롯 분석을 통해 검출한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, RBD 단백질은 침윤 4일 후(4 DPI) 수확된 담배잎에서 추출되었다. 면역블롯 멤브레인은 토끼 다클론성(rabbit polyclonal) 항-SARS-CoV-2(COVID-19) 스파이크 RBD 항체로 조사되었다. 단백질 밴드 아래의 숫자는 각 레인에서 단백질의 밀도 강도 비율을 나타낸 것이다. 여기에서, M은 단백질 크기 마커, R은 Expi293F 세포의 SARS-CoV-2 RBD 단백질 100 ng(양성 대조군), N은 비침윤된 식물 단백질(음성 대조군)이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 당사슬 패턴이 조작된 Nicotiana benthamiana에서 4가지 종류의 RBD 구축물(T10, T11, T12 및 T13)이 발현된 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 면역블롯 분석을 통해 검출한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, RBD 단백질은 침윤 4일, 5일, 6일 및 7일 후(DPI) 수확된 담배잎에서 추출되었다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 당사슬 패턴이 조작된 Nicotiana benthamiana에서 발현된 식물 유래 RBD 단백질 및 인간 세포 Expi293F 기반 RBD 단백질에 대해 PNGase F 또는 PNGase A를 처리하여 탈당화시킨 RBD의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, PNGase F에 의한 Expi293F 기반 RBD의 탈당화는 약 35 kDa 내지 약 30 kDa로 밴드 이동(shift)을 보였고, 식물 기반 RBD는 펩티드-N-글리코시다제(PNGase) 처리 여부에 관계없이 30 kDa를 유지하였다. 밴드 크기 약 36 kDa 및 약 64 kDa은 각각 효소 PNGase F 및 PNGase A에 해당하며, 여기에서, M은 단백질 크기 마커이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 당사슬 패턴이 조작된 Nicotiana benthamiana 잎으로부터 생산된 RBD 단백질의 정제 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 RBD 단백질의 정제 과정 중 1차 His 컬럼 크로마토그래피의 정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 RBD 단백질의 정제 과정 중 2차 SP 컬럼 크로마토그래피의 정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 RBD 단백질에 대해 수행한 1차 His 컬럼 크로마토그래피로부터 수득한 정제물의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 RBD 단백질에 대해 수행한 2차 SP 컬럼 크로마토그래피로부터 수득한 정제물의 SDS-PAGE(좌) 및 웨스턴 블롯(우) 결과를 나타낸 도면이다. 여기에서 M은 단백질 크기 마커이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD의 쿠마시블루 염색 결과(a)와, SARS-CoV-2 RBD 항체 (b) 및 항-6×His (c) 항체의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도면이다. 여기에서, M은 단백질 크기 마커, 레인 1은 비침윤된 총 용해성 단백질(total soluble protein, TSP), 레인 2는 RBD-침윤된 TSP, 레인 3은 담배 식물 잎에서 정제된 재조합 RBD이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제된 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질을 토끼 다클론성(rabbit polyclonal) 항-SARS-CoV-2(COVID-19) 스파이크 RBD 항체 (a) 및 6×His HRP 항체로 탐침한 면역 블롯에서 검출한 결과를 나타낸 도면이다. 여기에서, 단백질 밴드 상하의 숫자는 각 레인에서 단백질의 밀도 강도 비율을 나타낸다. M은 단백질 크기 마커, 레인 1은 비침윤된 총 용해성 단백질(TSP), 레인 2는 RBD-침윤된 TSP, 레인 3은 담배 식물 잎에서 정제된 재조합 RBD이다.
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 당쇄 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 14b는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질로부터 검출된 당쇄 구조를 이미지로 나타낸 도면이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 면역원성을 확인하기 위한 실험 일정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 구체적으로, SARS-CoV-2 RBD 항원성 단백질 접종 시기 및 혈액 채취 시기를 도식화한 것이다.
도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질로 면역화된 마우스 혈청의 항체 활성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, 형질전환 담배 식물의 잎으로부터 생산된 RBD 단백질, 상기 RBD 단백질과 보조제(adjvuant)인 알럼(AlumTM), 알루미늄 하이드록사이드(Alhydrogel®) 또는 스쿠알렌-수중유형 에멀젼(AddaVaxTM)과 혼합하여 1차, 2차 및 3차 접종한 후, 면역화시킨 마우스의 혈액 내 IgG 생성률을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15c는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질로 면역화된 마우스 혈청의 항체 활성을 확인한 결과로, 2차 접종 후 RBD 특이적 IgG 수준을 종말점 희석(endpoint dilution) ELISA를 사용하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15d 및 도 15e는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질로 면역화된 마우스 혈청에서 생성된 항체의 종류를 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, 3차 접종 후 수집한 혈청의 항체 이소형(isotype) IgG1 (도 15d) 및 IgG2a (도 15e)에 대한 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 16a 및 도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질로 면역화된 마우스 혈청의 바이러스 특이적 중화능 분석 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로, 형질전환 담배 식물의 잎으로부터 생산된 RBD 단백질, 상기 RBD 단백질과 보조제(adjvuant)인 알럼(AlumTM), 알루미늄 하이드록사이드(Alhydrogel®) 또는 스쿠알렌-수중유형 에멀젼(AddaVaxTM)과 혼합하여 2차 (도 16a) 및 3차 (도 16b) 접종 후, 생성된 중화 항체의 역가를 측정한 결과로서 혈청의 중화 활성에 대한 용량-반응 곡선을 나타낸 것이다.
도 16c는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질로 면역화된 마우스 혈청의 바이러스 특이적 중화능 분석 결과로, 각 그룹에 대한 50% 초점 감소 중화 테스트(FRNT50) 값을 비교하여 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질로 면역화된 마우스 혈청의 SARS-CoV-2 바이러스 특이적 중화 효능을 입증하기 위한 FRNT 분석의 대표적인 패널을 나타낸 사진이다. 이때, 혈청 샘플은 식물 기반 RBD 단독 또는 RBD + 보조제로 3회 면역화된 마우스로부터 수득하였다.1 is a diagram showing the amino acid sequence of the receptor binding domain protein (RBD) of the spike protein of SARS-CoV-2.
Figure 2 is a diagram showing the nucleotide sequence encoding a fragment of the RBD protein of the spike protein of SARS-CoV-2.
3 is a diagram showing a nucleotide sequence encoding a fragment of the RBD protein of the spike protein of codon-optimized SARS-CoV-2 according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a schematic diagram of a codon-optimized gene construct for expressing the RBD protein of the spike protein of SARS-CoV-2 in plants. Specifically, the T-DNA regions of four different constructs including the plant-based SARS-CoV-2 RBD of Nicotiana benthamiana with engineered glycan patterns are schematically illustrated. The construct was prepared by adding additional sequences to the 5' (MSP or LS and MSP) and 3' (6xHis or 6xHis and SEKDEL) of the RBD. Here, LB is the T-DNA left border, RB is the T-DNA right border, 35S is the CaMV 35S promoter, Ω is the TMV leader sequence, Replicase is the TMV replicase, and MP is the TMV mobile protein. , GOI is the gene of interest, 3'NTR is the TMV 3' untranslated region, LS is the leader sequence of the SARS-CoV-2 spike protein, CP is the TMV envelope protein, Rz is the ribozyme, MSP is the mouse signal peptide, RBD-Opti is an optimized RBD plant codon, TB is a thrombin protease cleavage site, SSGSSG is a linker, 6×His is a hexahistidine tag, and SEKDEL is an ER-bearing signal peptide sequence.
Figure 5a is a photograph of tobacco leaves sampled with four types of RBD constructs (T10, T11, T12 and T13) expressed in Nicotiana benthamiana in which the sugar chain pattern was manipulated according to an embodiment of the present invention, 4 DPI (day after infiltration). ) was filmed.
Figure 5b is a photograph of tobacco leaves sampled in which four types of RBD constructs (T10, T11, T12 and T13) were expressed in Nicotiana benthamiana in which the sugar chain pattern was engineered according to an embodiment of the present invention, respectively, 4, 5, and 6 and 7 DPI (day after infiltration).
Figure 6a is an immunoblot analysis of plant-based SARS-CoV-2 RBD proteins expressing four types of RBD constructs (T10, T11, T12 and T13) in Nicotiana benthamiana in which the sugar chain pattern was engineered according to an embodiment of the present invention. This is a diagram showing the result detected through Specifically, it shows the results of immunoblot analysis confirming that the RBD protein extracted from 4 DPI tobacco leaves is expressed in a water-soluble form.
Figure 6b is an immunoblot analysis of plant-based SARS-CoV-2 RBD proteins expressing four types of RBD constructs (T10, T11, T12 and T13) in Nicotiana benthamiana in which the sugar chain pattern was engineered according to an embodiment of the present invention. This is a diagram showing the result detected through At this time, RBD protein was extracted from tobacco leaves harvested 4 days after infiltration (4 DPI). Immunoblot membranes were probed with a rabbit polyclonal anti-SARS-CoV-2 (COVID-19) spike RBD antibody. Numbers below the protein bands represent the density-intensity ratio of proteins in each lane. Here, M is a protein size marker, R is 100 ng of SARS-CoV-2 RBD protein from Expi293F cells (positive control), and N is non-infiltrated plant protein (negative control).
Figure 6c is an immunoblot analysis of plant-based SARS-CoV-2 RBD proteins expressing four types of RBD constructs (T10, T11, T12 and T13) in Nicotiana benthamiana in which the sugar chain pattern was engineered according to an embodiment of the present invention. This is a diagram showing the result detected through At this time, RBD proteins were extracted from tobacco leaves harvested after 4 days, 5 days, 6 days and 7 days of infiltration (DPI).
Figure 6d is SDS-PAGE of RBD deglycosylated by treating PNGase F or PNGase A for plant-derived RBD protein and human cell Expi293F-based RBD protein expressed in Nicotiana benthamiana whose sugar chain pattern was engineered according to an embodiment of the present invention. This is a diagram showing the result. Specifically, deglycosylation of Expi293F-based RBD by PNGase F showed a band shift from about 35 kDa to about 30 kDa, and plant-based RBD was treated with or without peptide-N-glycosidase (PNGase) for 30 kDa was maintained. Band sizes of about 36 kDa and about 64 kDa correspond to the enzymes PNGase F and PNGase A, respectively, where M is a protein size marker.
7 is a diagram schematically showing a purification process of RBD protein produced from Nicotiana benthamiana leaves engineered with a sugar chain pattern according to an embodiment of the present invention.
8 is a diagram showing purification results of primary His column chromatography during the purification process of RBD protein according to an embodiment of the present invention.
9 is a view showing the purification results of secondary SP column chromatography during the purification process of RBD protein according to an embodiment of the present invention.
10 is a diagram showing SDS-PAGE results of purified products obtained from primary His column chromatography performed on RBD protein according to an embodiment of the present invention.
11 is a view showing the results of SDS-PAGE (left) and Western blotting (right) of a purified product obtained from secondary SP column chromatography performed on RBD protein according to an embodiment of the present invention. where M is a protein size marker.
12 shows Coomassie blue staining results of purified plant-based SARS-CoV-2 RBD according to an embodiment of the present invention (a), SARS-CoV-2 RBD antibody (b) and anti-6×His (c) ) It is a diagram showing the result of Western blotting of the antibody. Here, M is a protein size marker, lane 1 is non-infiltrated total soluble protein (TSP), lane 2 is RBD-infiltrated TSP, and lane 3 is recombinant RBD purified from tobacco plant leaves.
13 is a rabbit polyclonal anti-SARS-CoV-2 (COVID-19) spike RBD antibody (a) and a purified plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention It is a diagram showing the result of detection in immunoblot probed with 6×His HRP antibody. Here, the numbers above and below the protein band represent the density-intensity ratio of the protein in each lane. M is a protein size marker, lane 1 is non-infiltrated total soluble protein (TSP), lane 2 is RBD-infiltrated TSP, and lane 3 is recombinant RBD purified from tobacco plant leaves.
14a is a view showing the results of sugar chain analysis of plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention.
14b is a view showing an image of a sugar chain structure detected from a plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention.
15a is a diagram schematically showing an experimental schedule for confirming the immunogenicity of a plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention. Specifically, the time of inoculation with SARS-CoV-2 RBD antigenic protein and the time of blood collection are diagrammed.
15B is a view showing the result of confirming the antibody activity of mouse serum immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention. Specifically, RBD protein produced from the leaves of transgenic tobacco plants, the RBD protein and an adjuvant, alum (Alum TM ), aluminum hydroxide (Alhydrogel ® ) or squalene-in-water emulsion (AddaVax TM ) mixed with After the 1st, 2nd and 3rd inoculation, the IgG production rate in the blood of the immunized mouse was confirmed through ELISA analysis.
15c is a result of confirming the antibody activity of mouse serum immunized with a plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention, and the RBD-specific IgG level after the second inoculation was measured by endpoint dilution ELISA It shows the result of checking using .
15D and 15E are diagrams showing the results of confirming the type of antibody produced in the serum of a mouse immunized with a plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention. Specifically, the results for antibody isotype IgG1 (FIG. 15d) and IgG2a (FIG. 15e) of serum collected after the third inoculation are shown, respectively.
16a and 16b are diagrams showing virus-specific neutralizing ability analysis results of mouse serum immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention. Specifically, RBD protein produced from the leaves of transgenic tobacco plants, the RBD protein and an adjuvant, alum (Alum TM ), aluminum hydroxide (Alhydrogel ® ) or squalene-in-water emulsion (AddaVax TM ) mixed with After the second (FIG. 16a) and third (FIG. 16b) inoculations, titers of neutralizing antibodies produced were measured, and a dose-response curve for neutralizing activity of serum was shown.
16c is a result of virus-specific neutralization ability analysis of mouse serum immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention, and 50% focus reduction neutralization test (FRNT 50 ) values for each group is shown by comparison.
17 is a photograph showing a representative panel of FRNT analysis to demonstrate the SARS-CoV-2 virus-specific neutralizing efficacy of mouse serum immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD protein according to an embodiment of the present invention. At this time, serum samples were obtained from mice immunized three times with plant-based RBD alone or RBD + adjuvant.

코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 유전자 RBD gene of codon-optimized SARS-CoV-2 spike protein

본 발명의 일 측면은, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.One aspect of the present invention provides a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the receptor binding domain (RBD) protein of the SARS-CoV-2 spike protein.

본 명세서에서 사용된 용어, "SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)"는 코로나바이러스 감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19) 호흡기 감염질환을 유발하는 신종 코로나바이러스이다.As used herein, the term "Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)" is a novel coronavirus that causes coronavirus disease 2019 (COVID-19) respiratory infectious disease.

상기 SARS-CoV-2는 RNA 바이러스로서 30 kb의 뉴클레오티드를 가지며, 4개의 중요한 구조 단백질인 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid, N), 스파이크(Spike, S), 막(Membrane, M), 외피(Envelope, E) 단백질을 가지고 있다. 이중 스파이크 당단백질은 숙주세포의 수용체와 결합하는 것으로 알려진 중요한 부위이며, 세포 내로 바이러스 뉴클레오캡시드를 전달하며 복제가 이루어진다. SARS-CoV-2를 퇴치하는 가장 간단하고 직접적인 방법은 숙주세포로 들어가는 바이러스를 중화시키는 것으로, 이는 SARS-CoV-2가 세포 내로 유입되어 복제가 일어나고 새로운 비리온(virion)이 분비되어 다른 세포를 감염시키는 메커니즘을 차단하는 것이다.The SARS-CoV-2 is an RNA virus with 30 kb of nucleotides and four important structural proteins, Nucleocapsid (N), Spike (S), Membrane (M), and Envelope (Envelope, E) It has protein. The double spike glycoprotein is an important site known to bind to the host cell's receptor, and replication takes place while transferring the viral nucleocapsid into the cell. The simplest and most direct way to combat SARS-CoV-2 is to neutralize the virus entering the host cell, which means that SARS-CoV-2 enters the cell, where it replicates and secretes new virions to infect other cells. It is to block the mechanism of infection.

SARS-CoV-2는 숙주세포의 수용체인 ACE2(angiotensin converting enzyme 2)와 결합하여 바이러스 복제가 가능한 것으로 알려졌다. 코로나바이러스의 스파이크 단백질 중 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)은 숙주세포의 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 영역이며, SARS-CoV-2 감염에 대한 강력한 중화 항체를 유도하여 COVID-19의 치료 및 백신 개발에 핵심 표적이 될 수 있다.SARS-CoV-2 is known to be capable of viral replication by binding to ACE2 (angiotensin converting enzyme 2), a receptor in host cells. Among the spike proteins of the coronavirus, the receptor-binding domain (RBD) is a key region that binds to the host cell's ACE2 receptor, and induces strong neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 infection to treat and treat COVID-19. It could be a key target for vaccine development.

본 명세서에서 사용된 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체로, 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 지칭한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 단백질을 코딩하는 DNA 서열로, 서열번호 1로 표시된다. As used herein, the term "polynucleotide" refers to a polymer of nucleotides in which nucleotide units are covalently linked in a long chain shape, and refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer. The polynucleotide according to the present invention is a DNA sequence encoding the receptor binding domain (RBD) protein of the SARS-CoV-2 spike protein, represented by SEQ ID NO: 1.

상기 폴리뉴클레오티드는 SARS-CoV-2의 S 단백질 1,273개 아미노산(서열번호 7) 중 RBD 영역 319-541 아미노산(서열번호 2)에 대한 염기서열(서열번호 6)을 식물 발현 시스템에 맞게 코돈 최적화(codon optimization)한 것이다.The polynucleotide is a codon optimization (SEQ ID NO: 6) for the RBD region 319-541 amino acids (SEQ ID NO: 2) among 1,273 amino acids (SEQ ID NO: 7) of the S protein of SARS-CoV-2 to suit the plant expression system ( codon optimization).

본 발명에 있어서, 식물 발현 시스템에 맞게 코돈 최적화는 식물에서 유래하지 않은 유전자가 식물의 세포에서 최대한 발현될 수 있도록 유전자를 재조합하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 특히 식물에서 유래하지 않은 유전자의 코돈을 식물이 선호하는 코돈으로 변환하는 것을 의미한다. 상기 '코돈(codon)'은 특정 아미노산을 지정하는 연속된 세 개의 염기 서열을 의미한다. 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 시토신(C)으로 구성되는 61 종류의 코돈이 20개의 아미노산을 지정하게 되므로 특정 아미노산을 지정하는 코돈은 복수로 존재하며, 생물종마다 선호하는 코돈, 즉 서로 다른 생물종의 유전자에서의 코돈의 발생 빈도가 모두 다르다는 것이 알려져 있다.In the present invention, codon optimization to suit the plant expression system means recombining genes so that genes not derived from plants can be expressed maximally in plant cells, and for the purpose of the present invention, in particular, It means converting codons into plant-preferred codons. The 'codon' refers to a sequence of three consecutive bases designating a specific amino acid. Since 61 types of codons composed of adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C) specify 20 amino acids, there are multiple codons that specify specific amino acids, and each species prefers them. It is known that the frequency of occurrence of codons in the genes of different species is different.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.In addition, the polynucleotide may be modified. Such modifications include additions, deletions or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides. A polynucleotide encoding the amino acid sequence is also construed to include a nucleotide sequence exhibiting substantial identity to the nucleotide sequence. The substantial identity is, when the nucleotide sequence and any other sequence are arranged to correspond as much as possible and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art, at least 80% homology, at least 90 % homology or at least 95% homology.

상기 폴리뉴클레오티드는 이에 제한되지는 않으나, 이의 5'-말단에 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열을 더 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 분비성 단백질, 수용성 단백질, 막단백질과 같은 소포체에서 합성되는 단백질의 아미노 말단의 선도 펩티드로, 식물로부터 유래할 수 있거나 비식물로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신호 펩티드는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 신호 펩티드는 서열번호 10의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.The polynucleotide is not limited thereto, but may further include a nucleotide sequence encoding a signal peptide at its 5'-end. A signal peptide is an amino-terminal leader peptide of a protein synthesized in the endoplasmic reticulum, such as a secretory protein, a water-soluble protein, or a membrane protein, and may be derived from plants or non-plant sources. In one embodiment of the present invention, the signal peptide may have the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9. In addition, the signal peptide may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 이에 제한되지는 않으나, 이의 5'-말단 또는 3'-말단에 생산된 RBD 단백질을 정제하기 위한 태그(Tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 태그는 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 및 GST 태그로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 태그일 수 있다. 구체적으로, 상기 RBD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 3'-말단에 태그(Tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다.In addition, the polynucleotide is not limited thereto, but may further include a polynucleotide sequence encoding a tag for purifying the RBD protein produced at its 5'-end or 3'-end. At this time, the tag is Avi tag, Calmodulin tag, polyglutamate tag, E tag, FLAG tag, HA tag, His tag, Myc tag, S tag, SBP tag, IgG-Fc tag, CTB tag, Softag 1 tag, Softag 3 tag , Strep tag, TC tag, V5 tag, VSV tag, Xpress tag, and GST tag. Specifically, a polynucleotide sequence encoding a tag may be further included at the 3'-end of the polynucleotide encoding the RBD.

또한, 정제된 RBD 단백질에서 상기 태그(Tag)를 제거하기 위해서, 프로테아제 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 프로테아제 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RBD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치할 수 있다. 상기 프로테아제 인식 부위는 이에 제한되지는 않으나, 트롬빈, 엔테로키나아제 및 팩터 Xa로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 대한 인식 부위를 가질 수 있다. 구체적으로, LVPRGS(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser), DDDDK(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 및 IEGR(Ile-Glu-Gly-Arg)로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 인식 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로테아제 인식 부위는 트롬빈에 의해 절단되는 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 11로 표시되는 염기서열일 수 있다. 한편, 상기 프로테아제 인식 부위와 연결되는 펩티드 링커는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.In addition, in order to remove the tag (Tag) from the purified RBD protein, a polynucleotide encoding a protease recognition site may be further included. Specifically, the polynucleotide encoding the protease recognition site may be located between a polynucleotide encoding an RBD and a polynucleotide encoding a tag. The protease recognition site may have a recognition site for a protease selected from the group consisting of, but not limited to, thrombin, enterokinase and factor Xa. Specifically, a protease recognition sequence selected from the group consisting of LVPRGS (Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser), DDDDK (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) and IEGR (Ile-Glu-Gly-Arg) can have In one embodiment of the present invention, the protease recognition site may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 encoding an amino acid sequence cleaved by thrombin. On the other hand, the peptide linker connected to the protease recognition site is not limited thereto, but may be one represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.

또한, 상기 프로테아제 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 링커는 펩타이드 링커로서 1 내지 20개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 5 내지 15개의 아미노산을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, a polynucleotide sequence encoding a linker between the polynucleotide encoding the protease recognition site and the polynucleotide encoding the tag may be further included. In this case, the linker may include 1 to 20 amino acids as a peptide linker, and may include 5 to 15 amino acids, but is not limited thereto.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 재조합 벡터Recombinant vector for production of RBD protein of SARS-CoV-2 spike protein

본 발명의 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드가 적재된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 재조합 벡터를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a recombinant vector for producing the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein loaded with the polynucleotide.

본 명세서에서 사용된 용어, "재조합 벡터"는 벡터 내에 삽입된 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 본 발명에 따른 식물 발현 시스템에 맞게 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 숙주세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. As used herein, the term "recombinant vector" refers to a vector capable of expressing a peptide or protein encoded by a nucleic acid inserted into the vector, preferably codon-optimized for the plant expression system according to the present invention. It means a vector prepared to include a polynucleotide encoding the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein. The "vector" refers to any medium for introducing and/or transferring a base into a host cell in vitro, ex vivo or in vivo, and includes, for example, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and adenovirus vectors. , retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.

본 발명의 재조합 벡터는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있다. 또한, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별용 마커 유전자에는 대표적으로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있다. The recombinant vector of the present invention includes a promoter, which is a transcription initiation factor to which RNA polymerase binds, an arbitrary operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. , terminator, etc. In addition, marker genes for selection such as antibiotic resistance genes for selecting transformants may be further included. Representatively, the selection marker genes include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, chloram Antibiotic resistance genes such as phenylcol (chloramphenicol), aadA genes, and the like may be included.

상기 프로모터에는 대표적으로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 대표적으로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 튜머패시언스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 추가되는 유전자의 종류는 기존에 재조합 단백질의 제조에 사용되고 있는 종류라면 제한이 없다.Representative examples of the promoter include pEMU promoter, MAS promoter, histone promoter, Clp promoter, cauliflower mosaic virus-derived 35S promoter, cauliflower mosaic virus-derived 19S RNA promoter, plant actin protein promoter, Ubiquitin protein promoter, CMV (Cytomegalovirus) promoter, SV40 (Simian virus 40) promoter, RSV (Respiratory syncytial virus) promoter, EF-1α (Elongation factor-1 alpha) promoter, etc. may be included, and the terminator is typically nopaline Synthase (NOS), rice amylase RAmy1 A terminator, phaseolin terminator, Agrobacterium tumefaciens octopine gene terminator, Escherichia coli rrnB1/B2 terminator, etc. It is not limited as long as it is used for the production of recombinant proteins.

구체적으로, 상기 재조합 벡터는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 유전자 서열과, 상기 유전자 서열의 5'-말단에 신호 펩티드 서열과 3'-말단에 프로테아제 인식 부위를 코딩하는 서열을 삽입하여 제조될 수 있다. 또한, 3'-말단에 프로테아제 인식 부위 외에 특정 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 링커 및 His 태그 유전자를 더 삽입하여 제조될 수 있다(도 4).Specifically, the recombinant vector is prepared by inserting an RBD protein gene sequence of the SARS-CoV-2 spike protein, a signal peptide sequence at the 5'-end of the gene sequence, and a sequence encoding a protease recognition site at the 3'-end. It can be. In addition, it can be prepared by further inserting a peptide linker consisting of a specific amino acid sequence and a His tag gene in addition to the protease recognition site at the 3'-end (FIG. 4).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 유전자 서열은 식물 발현 시스템에 맞게 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the RBD protein gene sequence of the SARS-CoV-2 spike protein is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the RBD protein of the codon-optimized SARS-CoV-2 spike protein to suit the plant expression system. may be indicated by

또한, 상기 5'-말단의 신호 펩티드 서열은 소포체로의 진입을 위한 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 가지는 마우스 신호 펩티드일 수 있다. 또한, 상기 3'-말단의 프로테아제 인식 부위는 본 발명의 목적 단백질인 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 효소적 절단을 통해 생산하기 위한 역할로서, 구체적으로 트롬빈에 의해 절단되는 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 11로 표시되는 염기서열일 수 있다. 한편, 상기 프로테아제 인식 부위와 연결되는 펩티드 링커는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다. 상기 His 태그 유전자는 발현 목적 단백질의 정제를 쉽게 하기 위한 역할로서, 6×His 유전자 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the signal peptide sequence at the 5'-terminus may be a mouse signal peptide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 for entry into the endoplasmic reticulum. In addition, the protease recognition site at the 3'-end serves to produce the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein, which is the target protein of the present invention, through enzymatic cleavage, and specifically, the amino acid sequence cleaved by thrombin It may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 that encodes. On the other hand, the peptide linker connected to the protease recognition site is not limited thereto, but may be one represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12. The His tag gene serves to facilitate the purification of the protein to be expressed, and may be a 6×His gene, but is not limited thereto.

SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 형질전환 식물Transgenic plants for production of RBD protein of SARS-CoV-2 spike protein

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 생산하는 형질전환된 식물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a transformed plant that produces the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein transformed with the recombinant vector.

본 명세서에서 사용된 용어, "형질전환"은 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭한다.As used herein, the term "transformation" refers to changes in the genetic properties of organisms by injected DNA.

본 명세서에서 사용된 용어, "식물" 또는 "식물체"는 목적 단백질을 대량생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 식물은 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것 일 수 있다. 바람직하게는, 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 목적 단백질 대량생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 니코티아나 벤타미아나 L.(Nicotiana benthamiana L.) 또는 니코티아나 타바쿰 cv. 잔티(Nicotiana tabacum cv. Xanthi) 등의 품종을 이용할 수 있다.As used herein, the term "plant" or "plant body" may be used without limitation as long as it is a plant capable of mass-producing a target protein. More specifically, the plant is derived from any one selected from the group consisting of tobacco, Arabidopsis, corn, rice, soybean, canola, alfalfa, sunflower, sorghum, wheat, cotton, peanut, tomato, potato, lettuce and red pepper it can be Preferably, it may be tobacco. Tobacco in the present invention is not particularly limited as long as it is a plant of the tobacco genus (Nicotiana genus) and can overexpress proteins, and the present invention is carried out by selecting an appropriate variety according to the transformation method and the purpose of mass production of the target protein can do. For example Nicotiana benthamiana L. ( Nicotiana benthamiana L.) or Nicotiana tabacum cv. Varieties such as Xanthi ( Nicotiana tabacum cv. Xanthi ) may be used.

구체적으로, 상기 "식물"은 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 기술을 사용하여 식물의 당패턴 형성 유전자를 선택적으로 제거한 당쇄공학이 적용된 식물일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 식물은 식물 특이적 N-당사슬(glycan)인 알파 1,3-푸코스(alpha 1,3-fucose), 베타 1,2-자일로스(beta 1,2-xylose), 베타 1,3-갈락토스(beta 1,3-galactose) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식물 특이적 N-당사슬이 제거된(즉, 부착되지 않은) 당단백질을 생산하는 형질전환 식물일 수 있다.Specifically, the "plant" may be a plant to which glycoengineering is applied by selectively removing the plant's glycopattern forming gene using CRISPR/Cas9-based genome editing technology. More specifically, the plant is a plant-specific N-glycan alpha 1,3-fucose (alpha 1,3-fucose), beta 1,2-xylose (beta 1,2-xylose), beta A transgenic plant producing a glycoprotein from which any one plant-specific N-sugar chain is removed (i.e., unattached) selected from the group consisting of 1,3-galactose (beta 1,3-galactose) and combinations thereof can be

상기 형질전환된 식물은 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제(alpha 1,3 fucosyltransferase, FucT13), 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제(beta 1,2-xylosyltransferase, XylT12), 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(beta 1,3-galactosyltransferase, GalT13) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현이 억제된 것일 수 있다.The transformed plant contains alpha 1,3-fucosyltransferase (FucT13), beta 1,2-xylosyltransferase (XylT12), beta 1,3 - The expression of any one selected from the group consisting of beta 1,3-galactosyltransferase (GalT13) and combinations thereof may be inhibited.

구체적으로, 상기 형질전환 식물은 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제(alpha 1,3 fucosyltransferase, FucT13)의 발현이 억제된 형질전환 식물일 수 있다. 상기 형질전환 식물은 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제의 발현이 추가적으로 억제된 것일 수 있으며, 이 경우, 상기 형질전환 식물은 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제의 발현이 억제된 것일 수 있다. 상기 형질전환 식물은 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 발현이 추가적으로 억제된 것일 수 있으며, 이 경우, 상기 형질전환 식물은 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제 및 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 발현이 억제된 것일 수 있다. 상기 형질전환 식물은 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제 및 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 발현이 추가적으로 억제된 것일 수 있으며, 이 경우, 상기 형질전환 식물은 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제, 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제 및 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 발현이 억제된 것일 수 있다. Specifically, the transgenic plant may be a transgenic plant in which the expression of alpha 1,3 fucosyltransferase (FucT13) is suppressed. The transgenic plant may be one in which the expression of beta 1,2-xylosyltransferase is additionally suppressed. In this case, the transgenic plant is alpha 1,3-fucosyltransferase and beta 1,2-xylosyltransferase. Expression of sealtransferase may be suppressed. The transgenic plant may be one in which the expression of beta 1,3-galactosyltransferase is additionally suppressed. In this case, the transgenic plant is alpha 1,3-fucosyltransferase and beta 1,3-galacto Expression of sealtransferase may be suppressed. The transgenic plant may be one in which the expression of beta 1,2-xylosyltransferase and beta 1,3-galactosyltransferase is additionally suppressed. In this case, the transgenic plant is alpha 1,3-foucault. The expression of the seal transferase, beta 1,2-xylosyltransferase and beta 1,3-galactosyltransferase may be suppressed.

보다 구체적으로, 상기 식물 특이적 N-당사슬이 제거된(즉, 부착되지 않은) 당단백질을 생산하는 형질전환 식물은 본 발명자들의 한국공개특허 제10-2021-0062588호의 실시예 등을 참조하여 제작할 수 있다.More specifically, a transgenic plant producing a glycoprotein in which the plant-specific N-sugar chain is removed (ie, not attached) can be prepared by referring to the examples of Korean Patent Publication No. 10-2021-0062588 of the present inventors. can

상기 형질전환된 식물은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 재조합 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.The transformed plants are Agrobacterium-mediated transformation method, particle gun bombardment, sonication, electroporation and PEG (Polyethylen glycol)-mediated transformation It can be produced by methods such as methods, but is not limited as long as it is a method capable of injecting the recombinant vector of the present invention.

본 발명의 일실시예에서, 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 열충격법을 이용하여 형질전환하고, 형질전환된 아그로박테리움 균주를 당쇄공학이 적용된 니코티니아 벤타미아나 잎에 진공침윤을 수행하여 주입함으로써 형질전환된 식물체를 제조하였다.In one embodiment of the present invention, the recombinant vector according to the present invention is transformed into an Agrobacterium tumefaciens strain using a heat shock method, and the transformed Agrobacterium strain is Nicotinia bentamia to which glycosylation is applied. Transformed plants were prepared by performing vacuum infiltration on the leaves and injecting them.

상기 형질전환된 식물은 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 과발현하며, 식물의 세포, 조직 또는 그 배양물일 수 있으며 식물의 일부 또는 전체를 포함한다.The transformed plant overexpresses the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein according to the present invention, and may be a plant cell, tissue, or culture thereof, and includes a part or all of the plant.

식물에서 유용물질을 생산하는 것은 여러가지 장점이 있는데, 1) 생산 단가를 파격적으로 줄일 수 있고, 2) 종래 대중적 방법(동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 분리 정제하는)에서 발생할 수 있는 여러가지 오염원(바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있으며, 3) 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 seed stock 관리가 가능하다는 점에서 유리한 점을 갖는다. 또한, 4) 해당물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포시스템에 비해 절대적으로 유리하기 때문에 최단 기간에 높아진 수요에 따른 공급이 가능하다는 것도 장점이다. 이와 같이 식물체를 형질전환시켜 이로부터 유용물질을 생산하는 방법이 주목을 받는 배경은 식물체의 단백질 합성경로에 있다. 포유동물의 단백질 합성에는 해독 후 수식 과정이 필수적인데, 식물체는 진핵생물 단백질의 합성 경로를 가지고 있기 때문에 포유동물에서 발현되는 단백질과 거의 유사한 단백질을 생산할 수 있다.Producing useful substances from plants has several advantages: 1) the unit cost of production can be drastically reduced, 2) various contaminants that can occur in conventional popular methods (separation and purification of proteins synthesized from animal cells or microorganisms) ( viruses, cancer genes, enterotoxins, etc.) can be excluded at source, and 3) seed stock management is possible even at the commercialization stage, unlike animal cells or microorganisms. In addition, 4) when the demand for the material soars, it is absolutely advantageous compared to the existing animal cell system in terms of equipment technology and cost required for mass production, so it is possible to supply according to the increased demand in the shortest period of time. The background to which the method for producing useful substances by transforming plants in this way is attracting attention lies in the protein synthesis pathway of plants. A post-translational modification process is essential for protein synthesis in mammals, and since plants have a synthesis pathway for eukaryotic proteins, they can produce proteins almost similar to those expressed in mammals.

당쇄공학이 적용된 식물 유래의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질RBD protein of plant-derived SARS-CoV-2 spike protein to which glycosylation is applied

본 발명의 또 다른 측면은, 형질전환 식물에서 발현된 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 제공한다.Another aspect of the present invention provides an RBD protein of a plant-derived SARS-CoV-2 spike protein expressed in a transgenic plant.

상기 형질전환 식물은 당쇄공학이 적용된 식물로 상술한 바와 같으며, 상기 식물 유래의 당화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. The transgenic plant is as described above as a plant to which glycosylation engineering is applied, and the RBD protein of the plant-derived glycosylated SARS-CoV-2 spike protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 명세서에서 사용된 용어, "당화(glycosylation)"는 세포(진핵생물)의 단백질 번역 후 과정으로서 N-당화와 O-당화로 나뉘는데, 이는 붙는 작용기에 따라 다르며 세포에서 생성된 단백질에 락토스(lactose) 등의 당이 붙는 과정을 통틀어 "당화"라고 한다. 당화 과정으로 당사슬이 단백질에 연결되면 단백질이 "폴딩" 과정을 거쳐 입체적인 구조물을 형성하며, 이는 단백질이 풀어지지 않고 오랫동안 유지될 수 있는 안정성을 부여한다. 또한, 단백질에 붙어진 당사슬을 세포막으로 가서 세포막 단백질이 되어 항원과 같은 효과를 내기도 한다.As used herein, the term "glycosylation" is a post-translational process of proteins in cells (eukaryotes), which is divided into N-glycosylation and O-glycosylation, which differs depending on the functional group to which cells are attached, and lactose (lactose) in proteins produced in cells. ), etc. The whole process of attaching sugars is called "saccharification". When sugar chains are linked to proteins through the glycosylation process, the proteins undergo a "folding" process to form a three-dimensional structure, which gives the proteins stability that can be maintained for a long time without unraveling. In addition, the sugar chain attached to the protein goes to the cell membrane and becomes a cell membrane protein to produce the same effect as the antigen.

상기 형질전환 식물 유래의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 변형된 당쇄를 갖는 것일 수 있다.The RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein derived from the transgenic plant may have a modified sugar chain.

상기 변형된 당쇄는 푸코스(fucose), 자일로스(xylose), 갈락토스(galactose) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 잔기가 포함되지 않거나 극미량을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 변형된 당쇄는 푸코스를 포함하지 않거나 극미량을 포함하는 것일 수 있다. 상기 변형된 당쇄는 푸코스 및 자일로스; 푸코스 및 갈락토스를 포함하지 않거나 극미량을 포함하는 것일 수 있다. 상기 변형된 당쇄는 푸코스, 자일로스 및 갈락토스를 포함하지 않거나 극미량을 포함하는 것일 수 있다.The modified sugar chain may not contain any one residue selected from the group consisting of fucose, xylose, galactose, and combinations thereof, or may contain a very small amount. Specifically, the modified sugar chain may not contain fucose or contain a very small amount of fucose. The modified sugar chains include fucose and xylose; It may be one that does not contain fucose and galactose or contains trace amounts. The modified sugar chain may not contain fucose, xylose, or galactose, or may contain very small amounts.

상기 RBD 단백질은 M3, M3G0, G0, M7, M8 및 Man9으로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 당쇄를 가지는 것일 수 있다.The RBD protein may have one sugar chain selected from the group consisting of M3, M3G0, G0, M7, M8, and Man9.

상기 당쇄의 상대적 비율은 생성된 RBD 단백질의 총량을 100%로 하였을 때, M3는 25 내지 30%이고, M3G0는 20 내지 25%이고, G0는 30 내지 35%이고, M7은 1 내지 3%이고, M8은 3 내지 5%이고, Man9는 2 내지 4%일 수 있다. 일 구체예에서, M3는 27.3%이고, M3G0는 22.5%이고, G0는 31.9%이고, M7은 2.2%이고, M8은 3.3%이고, Man9는 2.5%일 수 있다.The relative ratio of sugar chains is 25 to 30% for M3, 20 to 25% for M3G0, 30 to 35% for G0, and 1 to 3% for M7, when the total amount of RBD protein produced is 100%. , M8 may be 3-5%, and Man9 may be 2-4%. In one embodiment, M3 is 27.3%, M3G0 is 22.5%, G0 is 31.9%, M7 is 2.2%, M8 is 3.3%, and Man9 is 2.5%.

이때, M3는

Figure pat00001
, M3G0는
Figure pat00002
, G0는
Figure pat00003
, M7은
Figure pat00004
, M8은
Figure pat00005
, Man9은
Figure pat00006
의 구조를 가지는 당쇄를 의미한다.At this time, M3 is
Figure pat00001
, M3G0 is
Figure pat00002
, G0 is
Figure pat00003
, M7 is
Figure pat00004
, M8 is
Figure pat00005
, Man9 is
Figure pat00006
It means a sugar chain having the structure of

또한, RBD 단백질은 M3G1F 또는 G1F 당쇄를 포함하되, 상기 당쇄의 함량이 동물 세포에서 생산된 RBD 단백질 보다 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.In addition, the RBD protein may include M3G1F or G1F sugar chains, but the content of the sugar chains may be lower than that of RBD proteins produced in animal cells.

이때, M3G1F는 식물 유래

Figure pat00007
또는 동물 유래
Figure pat00008
의 구조를 가지는 당쇄를 의미한다. 또한, G1F는 식물 유래
Figure pat00009
또는 동물 유래
Figure pat00010
의 구조를 가지는 당쇄를 의미한다. 이때, 상기
Figure pat00011
는 갈락토오스이고, 상기
Figure pat00012
는 N-아세틸글루코사민이고, 상기
Figure pat00013
는 만노스이고, 상기
Figure pat00014
는 푸코스이다.At this time, M3G1F is plant-derived
Figure pat00007
or of animal origin
Figure pat00008
It means a sugar chain having the structure of In addition, G1F is plant-derived
Figure pat00009
or of animal origin
Figure pat00010
It means a sugar chain having the structure of At this time, the
Figure pat00011
is galactose, wherein
Figure pat00012
Is N-acetylglucosamine, wherein
Figure pat00013
is mannose, wherein
Figure pat00014
is fucose.

상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제, 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제, 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현이 억제된 형질전환 식물로부터 생산되는 것일 수 있다. 상기 형질전환 식물은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 형질전환 식물에서 상술한 바와 같다.The RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein is a group consisting of alpha 1,3-fucosyltransferase, beta 1,2-xylosyltransferase, beta 1,3-galactosyltransferase, and combinations thereof. It may be produced from a transgenic plant in which any one expression selected from is suppressed. The transgenic plants are as described above in the transgenic plants for producing the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein.

한편, 상기 형질전환 식물 유래의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 서열번호 2로 표시되는 223개의 아미노산 서열로 이루어지며, 약 30~35 kDa 크기를 갖는 수용성(soluble) 단백질이다.On the other hand, the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein derived from the transgenic plant consists of a 223 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and is a soluble protein having a size of about 30 to 35 kDa.

본 명세서에서 사용된 용어, "수용성(soluble)"이란 목적 단백질 또는 펩티드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 수용성의 목적 단백질은 분리, 정제에 유리하며, 응집이 억제되어 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.As used herein, the term “soluble” means the degree to which a target protein or peptide can be dissolved in a solvent suitable for administration to the human body. A water-soluble target protein is advantageous for separation and purification, and has an advantage of maintaining physiological or pharmacological activity of the protein by inhibiting aggregation.

식물 유래 RBD 단백질을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 예방용 백신 조성물Vaccine composition for preventing SARS-CoV-2 infection containing plant-derived RBD protein

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 예방용 백신 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a vaccine composition for preventing SARS-CoV-2 infection comprising the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein as an active ingredient.

상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 상술한 바와 같이, 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제, 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제, 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현이 억제된 형질전환 식물로부터 생산되는 것일 수 있다. 상기 형질전환 식물은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 형질전환 식물에서 상술한 바와 같다.As described above, the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein is alpha 1,3-fucosyltransferase, beta 1,2-xylosyltransferase, beta 1,3-galactosyltransferase and these It may be produced from a transgenic plant in which any one expression selected from the group consisting of a combination of is inhibited. The transgenic plants are as described above in the transgenic plants for producing the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein.

상기 백신 조성물은 변형된 당쇄를 갖는, 형질전환 식물 유래의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 포함하며, 이는 상술한 바와 같다.The vaccine composition includes an RBD protein of a SARS-CoV-2 spike protein derived from a transgenic plant having a modified sugar chain, as described above.

본 명세서에서 사용된 용어, "SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염증"은 SARS-CoV-2에 의해 발병하는 새로운 호흡기 감염질환으로, 코로나바이러스 감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)로도 명명된다. 코로나바이러스 감염증-19에 감염되면 나타나는 주 증상으로는 무기력감, 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 두통, 호흡곤란 및 폐렴 등의 증상이 발생하며, 폐 손상에 의한 호흡부전 등이 있으며, 심하면 사망에 이를 수 있다.As used herein, the term "Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection" is a new respiratory infectious disease caused by SARS-CoV-2, and is a novel coronavirus disease 2019 (COVID-19) disease. -19) is also named. The main symptoms of infection with COVID-19 include lethargy, high fever of 37.5 degrees or higher, cough, sore throat, phlegm, muscle pain, headache, shortness of breath and pneumonia, and respiratory failure due to lung damage. , can lead to death in severe cases.

본 명세서에서 사용된 용어, "백신(vaccine)"은 생체에 면역반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 비경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "vaccine" is a biological agent containing an antigen that induces an immune response in a living body, which is injected or parenterally administered to humans or animals to prevent infection, thereby inducing immunity to the living body. refers to the immunogen. The animal is a human or non-human animal, and the non-human animal refers to pigs, cows, horses, dogs, goats, sheep, etc., but is not limited thereto.

본 명세서에서 사용된 용어, "항원(antigen)"은 체내에서 면역반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "antigen" refers to all substances that cause an immune response in the body, and is preferably a virus, chemical substance, bacterium, pollen, cancer cell, shrimp, etc., or some peptide or protein thereof. However, it is not limited thereto as long as it is a substance capable of inducing an immune response in the body.

본 명세서에서 사용된 용어, "예방(prevention)"은 본 발명에 따른 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 투여에 의해 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "prevention" refers to inhibiting or delaying the onset of coronavirus infection-19 (COVID-19) by administering RBD protein of plant-derived SARS-CoV-2 spike protein according to the present invention. means all actions.

본 발명의 일실시예에 있어서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 항원으로서 마우스 모델에 단독 투여 또는 보조제(adjuvant)와 동시 투여함에 의해 효과적으로 중화 항체가 생성되고, 강력한 체액성 면역반응이 유도됨을 확인하였다(도 16a 내지 도 16c). 이를 통해, 본 발명의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 SARS-CoV-2 감염증 예방용 백신 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.In one embodiment of the present invention, by administering the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein as an antigen to a mouse model alone or simultaneously with an adjuvant, neutralizing antibodies are effectively generated and a strong humoral immune response is produced. It was confirmed that it was induced (FIGS. 16a to 16c). Through this, it was found that the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein of the present invention can be usefully used as a vaccine composition for preventing SARS-CoV-2 infection.

본 발명의 "백신 조성물"은 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 백신 조성물은 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함하여 조제할 수 있다. The "vaccine composition" of the present invention may be formulated and used in the form of a sterile injection solution according to a conventional method. The vaccine composition may be prepared by additionally including a pharmaceutically acceptable adjuvant, excipient or diluent in addition to the carrier.

본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.As used herein, the term "pharmaceutically acceptable" refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders and dizziness or similar reactions when administered to humans. Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In addition, fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers and preservatives may be further included.

본 발명에 따른 백신 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 비경구, 예를 들면 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.The vaccine composition according to the present invention can be administered by various routes, for example, parenteral administration, such as transdermal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal, or intrathecal administration. It can be administered using an implantable device for continuous or repeated release. The frequency of administration may be administered once a day or divided into several times within a desired range, and the administration period is not particularly limited.

본 발명에 따른 백신 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로써 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 또한, 상기 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.The dose of the vaccine composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the individual. The amount required to induce an immune response in a subject without significant side effects may vary depending on the presence of the recombinant protein used as the immunogen and any excipients. In addition, in the case of the vaccine composition, repeated antigenic stimulation may be optionally performed after the initial dose, if necessary.

본 발명에 따른 백신 조성물은 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 것일 수 있다.The vaccine composition according to the present invention may further include an adjuvant.

본 명세서에서 사용된 용어, "보조제(adjuvant)", "어쥬번트", 또는 "면역증강제"는 백신 또는 약학적으로 활성이 있는 성분들에 첨가되어 면역반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어(carrier) 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성이 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 "보조제"는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 보조제에 통합되거나 상기 보조제와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진할 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagem)을 의미한다. 또한, 보조제는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나누어질 수 있다.As used herein, the term "adjuvant", "adjuvant", or "immune enhancer" refers to a substance or composition that is added to a vaccine or pharmaceutically active ingredients to increase or affect the immune response. says Typically means a carrier or auxiliary substance for an immunogen and/or other pharmacologically active substances or compositions. Typically, the term "adjuvant" is to be interpreted in a broad sense and refers to a wide range of substances or strategies capable of enhancing the immunogenicity of an antigen incorporated into or administered with the adjuvant. . In addition, the adjuvant may be divided into, but not limited to, an immune potentiator, an antigen delivery system, or a combination thereof.

또한, 상기 보조제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.In addition, the adjuvant includes Freund's incomplete or complete adjuvant, aluminum hydroxide gel, vegetable and mineral oil, and the like, and the excipient includes aluminum phosphate, aluminum hydroxide or aluminum potassium sulfate. It is not limited, and may further include materials used in vaccine production well known to those skilled in the art.

구체적으로, 상기 보조제는 이에 제한되지는 않으나, 알럼(alum), 알루미늄 하이드록사이드(Alhydrogel®), 스쿠알렌-수중유형 에멀젼(Squalene-Oil-in-water emulsions; AddavaxTM)일 수 있다. 바람직하게는 스쿠알렌-수중유형 에멀젼, 예컨대 AddavaxTM 일 수 있으나, 어쥬번트로 사용하기에 적합한 어떤 종류의 알루미늄 솔트(aluminium salt), 고분자라도 본 발명에 사용될 수 있다.Specifically, the adjuvant may be, but is not limited to, alum, aluminum hydroxide (Alhydrogel ® ), and squalene-oil-in-water emulsions (Addavax TM ). It may preferably be a squalene-in-water emulsion, such as Addavax ™ , but any type of aluminum salt, polymer suitable for use as an adjuvant may be used in the present invention.

식물 유래 RBD 단백질을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 치료용 약학 조성물Pharmaceutical composition for treatment of SARS-CoV-2 infection containing plant-derived RBD protein

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 치료용 약학 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating SARS-CoV-2 infection comprising the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein as an active ingredient.

상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 상술한 바와 같이, 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제, 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제, 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현이 억제된 형질전환 식물로부터 생산되는 것일 수 있다. 상기 형질전환 식물은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 형질전환 식물에서 상술한 바와 같다. As described above, the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein is alpha 1,3-fucosyltransferase, beta 1,2-xylosyltransferase, beta 1,3-galactosyltransferase and these It may be produced from a transgenic plant in which any one expression selected from the group consisting of a combination of is inhibited. The transgenic plants are as described above in the transgenic plants for producing the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein.

본 명세서에서 사용된 용어, "치료(treatment)"는 본 발명에 따른 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 투여에 의해 코로나바이러스 감염증-19(COVID-19)의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "treatment" means that the symptoms of coronavirus infection-19 (COVID-19) are improved or beneficially altered by administration of the RBD protein of the plant-derived SARS-CoV-2 spike protein according to the present invention. means all actions that

본 발명의 일실시예에 있어서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 항원으로서 마우스 모델에 단독 투여 또는 보조제(adjuvant)와 동시 투여함에 의해 효과적으로 중화 항체가 생성되고, 강력한 체액성 면역반응이 유도됨을 확인하였다(도 16a 내지 도 16c). 이를 통해, 본 발명의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질이 바이러스 중화, 즉, 바이러스의 감염력을 약화시킴에 의해 SARS-CoV-2 감염증 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.In one embodiment of the present invention, by administering the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein as an antigen to a mouse model alone or simultaneously with an adjuvant, neutralizing antibodies are effectively generated and a strong humoral immune response is produced. It was confirmed that it was induced (FIGS. 16a to 16c). Through this, it was found that the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for treating SARS-CoV-2 infection by neutralizing the virus, that is, weakening the infectivity of the virus. .

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated and used in the form of a sterile injectable solution according to a conventional method.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.When formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations and suppositories. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들어 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration are contemplated, for example by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.

본 발명에서 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is based on the type, severity, and activity of the drug in the patient. , sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Specifically, the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and may be divided and administered 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, severity of disease, sex, weight, age, etc., the dosage is not limited to the scope of the present invention in any way.

식물 유래 RBD 단백질을 이용한 SARS-CoV-2 감염증 예방 및 치료 방법Method for preventing and treating SARS-CoV-2 infection using plant-derived RBD protein

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 SARS-CoV-2 감염증 예방 및 치료 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method for preventing and treating SARS-CoV-2 infection in a subject, comprising administering the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein to the subject.

상기 "SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질" 및 "SARS-CoV-2 감염증"은 상술한 바와 같다.The "RBD protein of SARS-CoV-2 spike protein" and "SARS-CoV-2 infection" are as described above.

본 명세서에서 사용된 용어, "개체"란 SARS-CoV-2에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 개체에 투여, 예컨대 상기 RBD 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물 또는 약학 조성물 형태로 투여함으로써, 상기 SARS-CoV-2 감염증을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다.As used herein, the term "individual" refers to all animals, including humans, who are already infected or may be infected with SARS-CoV-2. Efficient prevention and can be cured

상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 바작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 RBD 단백질은 치료하고자 하는 질환, 즉 SARS-CoV-2 감염증에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생화학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.The route of administration, dosage and frequency of administration of the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein can be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method and dosage And the frequency of administration can be selected within an appropriate range by a person skilled in the art. In addition, the RBD protein may be administered in combination with other drugs or biochemically active substances known to have therapeutic effects on the disease to be treated, that is, SARS-CoV-2 infection, or formulated in combination with other drugs. there is.

식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 대량 생산 방법Method for mass production of RBD protein of plant-derived SARS-CoV-2 spike protein

본 발명의 또 다른 측면은, a) 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물을 제조하는 단계; b) 상기 형질전환 식물로부터 태그(Tag)가 결합된 RBD 단백질을 수득하는 단계; 및 c) 프로테아제를 처리하여 RBD 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention, a) preparing a transgenic plant by introducing a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein into a plant; b) obtaining a tag-linked RBD protein from the transgenic plant; And c) processing the protease to obtain the RBD protein; provides a method for mass production of RBD protein of plant-derived SARS-CoV-2 spike protein including.

상기 "SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드", "재조합 벡터", "형질전환 식물", "프로테아제 인식 부위" 및 "SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질"은 상술한 바와 같다.The "polynucleotide encoding the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein", "recombinant vector", "transformed plant", "protease recognition site" and "RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein" are described above. It's like a bar.

상기 a) 단계는 형질전환 식물에 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 도입하는 단계이다. 구체적으로, 상기 식물을 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 식물의 형질전환 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 당업자는 숙주로 선택한 식물의 특성을 고려하여 특정 식물에 적절한 공지의 형질전환 방법을 선택하여 실시할 수 있다.Step a) is a step of introducing a recombinant vector containing a polynucleotide encoding the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein into the transgenic plant. Specifically, as a method for transforming the plant, a plant transformation method known in the art may be used without limitation. A person skilled in the art can select and carry out a known transformation method suitable for a particular plant in consideration of the characteristics of the plant selected as a host.

식물의 형질전환 방법으로는, 예를 들어, 발현벡터를 포함하는 리포좀과 식물 원형질체를 융합하는 방법, PEG를 이용하여 발현벡터를 식물 원형질체로 주입하는 방법, 발현벡터의 식물세포로의 직접주입법, 미세입자충격법, 유전자총, 전기천공법(electroporation), 바이러스를 이용한 형질전환법, 진공을 이용한 형질전환법(vaccum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dippingmethod) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물을 형질전환시키는 방법은 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.Plant transformation methods include, for example, a method of fusing a liposome containing an expression vector with a plant protoplast, a method of injecting an expression vector into a plant protoplast using PEG, a method of direct injection of an expression vector into plant cells, A microparticle bombardment method, a gene gun, electroporation, a transformation method using a virus, a transformation method using a vacuum, a floral meristem dipping method, and the like can be used. Preferably, a transformation method using Agrobacterium may be used as a method for transforming the plant.

상기 '아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법'은 식물의 뿌리와 줄기에 종양을 일으키는 토양의 그람 음성 세균인 아그로박테리움을 이용하여 식물세포에 외부 유전자를 전달하는 방법이다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등의 아그로박테리움에서 발견되는 종양 유발 플라스미드(tumor-inducing plasmid, Ti plasmid)의 T-DNA(transfer DNA)가 식물의 유전체(genome)에 삽입되는 현상을 이용한 방법이다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환에서는 식물에 도입하려는 외부 유전자(exogenous DNA)와 T-DNA(외부 유전자의 양쪽 가장자리에 위치하는 LB와 RB 서열)를 포함하는 바이너리 플라스미드(또는 바이너리 벡터) 및 T-DNA가 식물 유전체에 삽입되도록 하는 보조 플라스미드(helper plasmid)의 두 가지 플라스미드로 이루어진 바이너리 시스템을 이용하는 것이 일반적이다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법은 잎, 줄기, 뿌리 등 다양한 식물의 조직에 사용할 수 있으며, 어린 조직이 형질전환이 잘되는 경향이 있다.The 'transformation method using Agrobacterium' is a method of transferring an external gene to plant cells using Agrobacterium, a gram-negative soil bacterium that causes tumors in the roots and stems of plants. T-DNA (transfer DNA) of tumor-inducing plasmid (Ti plasmid) found in Agrobacterium such as Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes It is a method using the phenomenon of being inserted into the genome of a plant. In transformation using Agrobacterium, a binary plasmid (or binary vector) containing the exogenous DNA and T-DNA (LB and RB sequences located on both edges of the exogenous gene) to be introduced into the plant and T-DNA It is common to use a binary system consisting of two plasmids, a helper plasmid that allows the insertion of A into the plant genome. The transformation method using Agrobacterium can be used for various plant tissues such as leaves, stems, and roots, and young tissues tend to be well transformed.

본 발명에서의 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 이용하여 재조합 단백질을 일시적으로 발현(transient expression)할 수도 있고, 안정적으로 발현(stable expression)할 수도 있다.The recombinant protein may be transiently expressed or stably expressed by using the transformation method using Agrobacterium in the present invention.

일시적인 발현을 위해서는 식물의 일부, 예를 들어 식물의 잎을 재조합 발현벡터를 포함하는 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환하고, 목적하는 단백질, 즉, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질이 충분히 발현될 수 있는 시간이 지난 뒤 식물에서 감염된 부분을 수득할 수 있다.For transient expression, a part of a plant, for example, a leaf of a plant, is infected and transformed with Agrobacterium containing a recombinant expression vector, and the desired protein, that is, the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein is sufficiently expressed. After a reasonable amount of time, infected parts of the plant can be obtained.

안정적 발현을 위하여 식물의 세포나 조직을 배양하여 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환한 뒤, 추가 배양하여 적합한 형질전환체를 선별하고 재분화 과정을 거친 뒤, 완전한 구조를 갖는 형질전환 식물체로 배양할 수 있다. 상기 형질전환 식물체에서 종자를 수득하고 발아시킴으로써 다음 세대에서도 안정적으로 형질전환 식물을 수득할 수 있다.For stable expression, plant cells or tissues are cultured, infected with Agrobacterium, transformed, further cultured, suitable transformants are selected, re-differentiated, and then cultured into transformed plants with complete structures. there is. By obtaining and germinating seeds from the transgenic plants, transgenic plants can be stably obtained in the next generation.

또한, 상기 형질전환 식물은 상술한 바와 같다.In addition, the transgenic plants are as described above.

상기 b) 단계는 형질전환 식물로부터 태그(Tag)가 결합된 RBD 단백질을 수득하는 단계이다. 구체적으로, 상기 단계는 재배한 형질전환 식물을 수득하고, 상기 수득한 식물의 전체 또는 일부로부터 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 분리 및 회수하는 단계이다. 이때, RBD 단백질을 분리 및 회수하는 방법은 상기 수득한 형질전환 식물을 분쇄하고 여과함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 추출할 수 있다.Step b) is a step of obtaining tag-linked RBD protein from the transgenic plant. Specifically, the step is a step of obtaining a cultivated transgenic plant, isolating and recovering the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein from all or part of the obtained plant. At this time, the method of separating and recovering the RBD protein can extract the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein by crushing and filtering the obtained transgenic plant.

보다 구체적으로, 상기 형질전환 식물은 목적하는 바에 부합하는 양의 RBD 단백질을 발현하는 시간 동안 식물의 성장에 필요한 빛, 온도, 습도 등의 환경 조건과 물, 무기염류, 영양소, 호르몬 등 식물 성장에 필요한 요소들을 제공하여 재배될 수 있다.More specifically, the transgenic plants are required for plant growth, such as environmental conditions such as light, temperature, and humidity, and water, inorganic salts, nutrients, and hormones necessary for plant growth for a time when the desired amount of RBD protein is expressed. It can be grown by providing the necessary elements.

또한, 상기 재배된 형질전환 식물의 전체 또는 일부, 예컨대 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 종자 등을 수득하여 목적하는 단백질인 RBD 단백질을 분리 및 회수할 수 있다. 또한, 상기 RBD 단백질은 형질전환된 식물의 식물세포나 조직의 배양물, 예컨대, 형질전환된 캘러스나 원형질체 등으로부터도 수득될 수 있다.In addition, the whole or part of the cultivated transgenic plant, such as the root, stem, leaf, seed, etc. of the plant can be obtained to isolate and recover the RBD protein, which is the desired protein. In addition, the RBD protein may be obtained from a plant cell or tissue culture of a transformed plant, such as a transformed callus or protoplast.

마지막으로, 상기 c) 단계는 프로테아제를 처리하여 RBD 단백질을 수득하는 단계이다. 이때, 프로테아제는 상술한 바와 같이 프로테아제를 인식하는 서열을 타겟팅할 수 있는 프로테아제라면 한정되지 않는다.Finally, step c) is a step of obtaining RBD protein by treating with protease. In this case, the protease is not limited as long as it can target a sequence recognizing the protease as described above.

또한, 상기 추출한 RBD 단백질은 크로마토그래피 등의 공지의 방법으로 여과하여 목적 단백질인 RBD 단백질을 고순도로 분리해낼 수 있다. 목적 단백질인 상기 RBD 단백질을 추출하기 위하여 식물을 냉동, 건조시키는 등의 전처리를 할 수 있다. 본 발명에 따른 목적 단백질을 과발현하는 형질전환체 담배를 대량으로 급속 증식하여 목적 단백질을 대량생산할 수 있다.In addition, the extracted RBD protein can be filtered by a known method such as chromatography to isolate the RBD protein as a target protein with high purity. In order to extract the target protein, the RBD protein, plants may be subjected to pretreatment such as freezing and drying. Transgenic tobacco overexpressing the target protein according to the present invention can be rapidly grown in large quantities to mass-produce the target protein.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, the following examples are only for exemplifying the present invention, and the scope of the present invention is not limited only to these.

I. 형질전환 식물체로부터 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 제조I. RBD protein production of SARS-CoV-2 spike protein from transgenic plants

식물체로부터 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 단백질을 생산하고자, 식물에서 발현이 잘 되도록 상기 수용체 결합 도메인을 코딩하는 유전자의 코돈을 최적화하였다. 이후, 이를 형질전환 식물체에 도입하여 효율적으로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 식물을 기반으로 하여 제조하였다. 이하, 실시예 및 실험예 등을 통해 구체적으로 기술한다.of SARS-CoV-2 from plants In order to produce a receptor binding domain (RBD) protein of the spike protein, the codon of the gene encoding the receptor binding domain was optimized so that it can be expressed well in plants. Then, it was introduced into the transgenic plant to efficiently prepare the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein based on the plant. Hereinafter, examples and experimental examples will be described in detail.

실시예 1. 플라스미드 제작Example 1. Plasmid construction

코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크(spike, S) 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 미국 국립생명공학정보센터에서 입수하였다. RBD에 해당하는 S 단백질 (NC_045512.2; Protein ID YP_009724390.1)의 319-541 아미노산 잔기(도 1의 청색 표시 부위)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(도 2)은 담배(Nicotiana benthamiana)에서 발현을 개선하기 위해 자체적으로 코돈 최적화 후 미국 GenScript 사를 통하여 유전자 합성하였다(도 3). RBD를 코딩하는 DNA 서열은 도 4에 제시된 다양한 구축물(construct)을 생성하기 위해 클로닝 과정에서 하기 표 1의 특정 프라이머 세트를 사용였다. PCR 증폭 후 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England Biolabs, UK)를 이용하여 플라스미드를 제작하였다(도 4). 사용된 pJL-TRBO 벡터(플라스미드 #80082, John Lindbo, http://n2t.net/addgene:80082; RRID:Addgene_80082)는 Addgene에서 구입하였다.covid The nucleotide and amino acid sequences of the SARS-CoV-2 spike (S) protein were obtained from the National Center for Biotechnology Information. Nucleotide sequence encoding amino acid residues 319-541 (shown in blue in Figure 1) of S protein (NC_045512.2; Protein ID YP_009724390.1) corresponding to RBD (Figure 2) improves expression in tobacco ( Nicotiana benthamiana ) In order to do so, the gene was synthesized through GenScript, USA after optimizing the codon itself (FIG. 3). The DNA sequence encoding RBD was cloned using specific primer sets in Table 1 below to generate the various constructs shown in FIG. 4 . After PCR amplification, a plasmid was prepared using NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs, UK) (FIG. 4). The pJL-TRBO vector used (plasmid #80082, John Lindbo, http://n2t.net/addgene:80082; RRID:Addgene_80082) was purchased from Addgene.

구축물
(Construct)structure
(Construct) 주형
(Template)template
(Template) 정방향 프라이머
(Forward primer)forward primer
(Forward primer) 역방향 프라이머
(Reverse primer)reverse primer
(Reverse primer) pGV105_T10pGV105_T10 LS_MSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHisLS_MSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHis TRBO_Pacl_LS-FTRBO_Pacl_LS-F TRBO_Notl_6xhis-RTRBO_Notl_6xhis-R pGV105_T11pGV105_T11 MSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHisMSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHis TRBO_Pacl_Msp-FTRBO_Pacl_Msp-F TRBO_Notl_6xhis-RTRBO_Notl_6xhis-R pGV105_T12pGV105_T12 LS_MSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHis_SEKDELLS_MSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHis_SEKDEL TRBO_Pacl_LS-FTRBO_Pacl_LS-F TRBO_Notl_SEKDEL_6xhis-RTRBO_Notl_SEKDEL_6xhis-R pGV105_T13pGV105_T13 MSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHis_SEKDELMSP_RBD opti3_ThrombinS_linker_6xHis_SEKDEL TRBO_Pacl_Msp-FTRBO_Pacl_Msp-F TRBO_Notl_SEKDEL_6xhis-RTRBO_Notl_SEKDEL_6xhis-R

실시예 2. 니코티아나 벤타미아나(Example 2. Nicotiana benthamiana ( Nicotiana BenthamianaNicotiana Benthamiana )의 침윤) of infiltration

열충격 방법을 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA105에 RBD 벡터를 형질전환하였다(도 4). 아그로박테리움 세포를 항생제로서 카나마이신(kanamycin; 100 mg/L) 및 리팜피신(rifampicin; 25 mg/L)이 포함된 YEP 배지에서 2일 동안 28℃로 배양하였다. 세포 현탁액을 침투 완충액(10 mM 2-N-모르폴리노에탄 설폰산(2-(N-morpholino)cthansulfonic acid; MES) pH 5.6, 10 mM 황산마그네슘)으로 OD600 = 0.2가 되도록 희석하였다.The RBD vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 using the heat shock method (FIG. 4). Agrobacterium cells were cultured at 28° C. for 2 days in YEP medium containing kanamycin (100 mg/L) and rifampicin (25 mg/L) as antibiotics. The cell suspension was diluted to an OD 600 = 0.2 with infiltration buffer (10 mM 2-(N-morpholino)cthansulfonic acid (MES) pH 5.6, 10 mM magnesium sulfate).

당쇄공학이 적용된, 구체적으로 알파 1,3 푸코실트랜스퍼라제 및 베타 1,2 자일로실트랜스퍼라제 녹-아웃(한국공개특허 제10-2021-0062588호 참조)된 N. benthamiana는 수경 시스템에서 낮에는 22℃, 밤에는 24℃, 50% 습도, 16시간 명/8시간 암주기로 밀폐된 항온항습실에서 4~5주 동안 재배하였다. 개별 잎에 주입하기 위해 주사기를 사용하여 진공침윤(agroinfiltration)을 수행하였으며, 대규모 단백질 생산 및 정제를 위해서는 식물 전체를 침윤 배지에 담궈 진공침윤을 수행하였다. 침윤된 담배 식물은 회수실에서 수확 전 4~7일 동안 재배하였다.In a hydroponic system, N. benthamiana , to which sugar chain engineering was applied, specifically alpha 1,3 fucosyltransferase and beta 1,2 xylosyltransferase knock-out (refer to Korean Patent Publication No. 10-2021-0062588), It was cultivated for 4 to 5 weeks in a closed constant temperature and humidity room at 22 ℃ at night and 24 ℃ at night, 50% humidity, and a 16-hour light / 8-hour dark cycle. In order to inject into individual leaves, agroinfiltration was performed using a syringe, and for large-scale protein production and purification, vacuum infiltration was performed by immersing the entire plant in an infiltration medium. Infiltrated tobacco plants were grown for 4-7 days before harvest in the recovery room.

실시예 3. RBD 단백질 발현 분석Example 3. RBD protein expression analysis

표적 단백질 발현을 측정하기 위해 담배잎을 아그로박테리움 침투 후 4~5일에 수확하고 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 구체적으로, 갓 수확한 잎(100 mg)을 50 mM 트리스(Tris) 완충액, pH 8.8로 추출하였다. 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, Bradford assay(BioRad)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 추출된 단백질(20 ㎍)을 10% 트리스-글리신(Tris-glycine) SDS-PAGE 젤에 로딩한 후, EasyStain(DG-GS1000, Dogenbio, Korea)을 사용하여 염색하거나 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 토끼 기반 다클론성(rabbit polyclonal) anti-SARS-CoV-2(COVID-19) 스파이크(Spike) RBD 항체(10-529, ProSci)로 멤브레인을 탐침(probe)하고, ECL 검출 시약을 사용하여 재조합 RBD를 검출하였다. 단백질 수율을 결정하기 위해 Expi293TM 발현 시스템 키트(Expi293TM Expression System Kit; ThermoFisher Scientific, US)를 사용하여 인간 Expi293F-세포에서 발현된 RBD 단백질(100 ng)을 양성 대조군으로 사용하였고, 양성대조군 대비 밴드 밀도의 부피 백분율을 분석하여 RBD의 양을 계산하였다. 신호 강도는 젤 이미징 시스템(UVITECH, UK)을 사용하여 측정하였다.To measure the expression of target proteins, tobacco leaves were harvested 4 to 5 days after Agrobacterium infiltration and Western blot analysis was performed. Specifically, freshly harvested leaves (100 mg) were extracted with 50 mM Tris buffer, pH 8.8. The supernatant was transferred to a new tube, and the protein concentration was measured using Bradford assay (BioRad). The extracted proteins (20 μg) were loaded on a 10% Tris-glycine SDS-PAGE gel, then stained using EasyStain (DG-GS1000, Dogenbio, Korea) or transferred to a PVDF membrane. Probe the membrane with a rabbit-based polyclonal anti-SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (10-529, ProSci), and recombine using an ECL detection reagent RBD was detected. To determine the protein yield, RBD protein (100 ng) expressed in human Expi293F-cells using the Expi293 TM Expression System Kit (ThermoFisher Scientific, US) was used as a positive control, and the positive control band The volume percentage of the density was analyzed to calculate the amount of RBD. Signal intensity was measured using a gel imaging system (UVITECH, UK).

실시예 4. 식물 기반 RBD의 정제Example 4. Purification of plant-based RBD

침윤 4일 후에 담배잎을 수확하여 미리 냉각된 추출 완충액(10 mM 인산나트륨, pH 7.4)과 혼합하고, 진공침윤을 사용하여 세포에 확산시킨 후 4℃에서 15분간 배양하였다. 착즙기를 사용하여 총 수용성(soluble) 단백질 추출물을 얻었다. 총 수용성 단백질 추출물을 10분 동안 10,000 rpm에서 원심분리한 후 0.45 ㎛(EATON, ALP-AG-30-0.45-3E) 및 0.20 ㎛ 필터(PARKER, ESBS-302-CAS)를 통해 여과하였다. 여과된 추출물을 5 mL prepack His 친화성 컬럼(HisTrap FF resin, Cytiva, 17-5255-01)에 로딩하고 10 컬럼 부피(CV)의 His 완충액 A(10 mM 인산나트륨, 5 mM 이미다졸, pH 7.4)로 평형화시켰다. 컬럼을 먼저 15 CV의 His 완충액 A로 세척한 후, 15 CV의 His 완충액 A 및 3%의 His 완충액 B(10 mM 인산나트륨, 500 mM 이미다졸, pH 7.4)로 세척하였다.After 4 days of infiltration, tobacco leaves were harvested, mixed with pre-chilled extraction buffer (10 mM sodium phosphate, pH 7.4), spread on cells using vacuum infiltration, and incubated at 4°C for 15 minutes. Total soluble protein extract was obtained using a juicer. Total soluble protein extracts were centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes and then filtered through 0.45 μm (EATON, ALP-AG-30-0.45-3E) and 0.20 μm filters (PARKER, ESBS-302-CAS). The filtered extract was loaded onto a 5 mL prepack His affinity column (HisTrap FF resin, Cytiva, 17-5255-01) and 10 column volumes (CV) of His buffer A (10 mM sodium phosphate, 5 mM imidazole, pH 7.4). ) was equilibrated. The column was washed first with 15 CV of His buffer A, then with 15 CV of His buffer A and 3% His buffer B (10 mM sodium phosphate, 500 mM imidazole, pH 7.4).

결합된 단백질은 AKTA Avant 크로마토그래피 시스템과 선형 구배(3%~50% His 완충액 B)를 사용하여 30 CV의 His 완충액 A 및 B로 용리시켰다. 분획은 20 mAU~50 mAU 범위의 흡광도에서 수집하였다. 용출된 분획을 5 mL prepacked SP 컬럼(SP 세파로스 컬럼, Cytiva, 17-5054-01)에 주입하고, 30 CV의 SP 완충액 A(10 mM 인산나트륨, pH 7.4)로 평형화시킨 후 15 CV SP 완충액 A로 세척하였다. 이후 SP 완충액 A 및 B(0%~50%)의 15 CV 선형 구배를 사용하여 용출하였다. 용출된 분획을 합치고, 10-K 분자량 컷오프 원심분리 튜브(Amicon Ultra-4, Merck Millipore)에서 1× PBS를 사용하여 완충액 교환 및 단백질 농도 측정을 수행하였다. 정제된 재조합 RBD의 순도는 상술한 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 평가하였다.Bound proteins were eluted with 30 CV of His buffers A and B using an AKTA Avant chromatography system and a linear gradient (3% to 50% His buffer B). Fractions were collected at absorbances ranging from 20 mAU to 50 mAU. The eluted fraction was injected into a 5 mL prepacked SP column (SP Sepharose column, Cytiva, 17-5054-01), equilibrated with 30 CV of SP buffer A (10 mM sodium phosphate, pH 7.4) and then 15 CV of SP buffer washed with A. Elution was then performed using a 15 CV linear gradient of SP buffers A and B (0% to 50%). The eluted fractions were combined, and buffer exchange and protein concentration determination were performed using 1× PBS in 10-K molecular weight cutoff centrifuge tubes (Amicon Ultra-4, Merck Millipore). The purity of the purified recombinant RBD was evaluated using the Western blot analysis method described above.

정제된 RBD의 농도는 BCA 분석을 사용하여 확인하였다. 10% 트리스-글리신 젤을 이용하여 SDS-PAGE를 실시한 후, EZ-Gel 염색 용액(DG-GS1000, DoGenBio, Korea)을 이용하여 젤염색하거나 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 마우스 단클론성(mouse monoclonal) SARS-CoV-2 스파이크 RBD 항체(MAB10540, R&D System) 및 6×His-HRP 항체(ab1187, Abcam)를 사용하여 멤브레인을 탐침하였다. 멤브레인에 결합된 재조합 RBD는 ECL 시약을 사용하여 검출하고, 화학발광 이미징 시스템(MINI HD9, UVITEC Cambridge)을 사용하여 이미지화하였다.The concentration of purified RBD was confirmed using the BCA assay. After performing SDS-PAGE using a 10% Tris-glycine gel, the gel was stained using EZ-Gel staining solution (DG-GS1000, DoGenBio, Korea) or transferred to a PVDF membrane. Membranes were probed using mouse monoclonal SARS-CoV-2 spike RBD antibody (MAB10540, R&D System) and 6xHis-HRP antibody (ab1187, Abcam). Recombinant RBD bound to the membrane was detected using ECL reagent and imaged using a chemiluminescent imaging system (MINI HD9, UVITEC Cambridge).

실시예 5. 단백질 탈당화Example 5. Protein Deglycosylation

인간 Expi293F 기반 및 식물 기반 RBD(2 ㎍)의 탈당화는 각각 1 ㎕의 PNGase F 또는 PNGase A(New England Biolabs, UK)를 사용하여 수행하였다. 탈당화 후 샘플은 SDS-PAGE를 수행하고, EZ-Gel 염색 용액(DG-GS1000, DoGenBio, Korea)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 젤을 염색하였다.Deglycosylation of human Expi293F-based and plant-based RBD (2 μg) was performed using 1 μl each of PNGase F or PNGase A (New England Biolabs, UK). After deglycosylation, the sample was subjected to SDS-PAGE, and the gel was stained using EZ-Gel staining solution (DG-GS1000, DoGenBio, Korea) according to the manufacturer's instructions.

실시예 6. LTQ-orbitrap 질량분석기Example 6. LTQ-orbitrap mass spectrometer

식물로부터 정제된 RBD 밴드를 SDS-PAGE를 통하여 분리하였다. 젤 슬라이스의 단백질을 밤새 37℃에서 트립신 처리하였다. 용출 후, 단백질 샘플을 선형 구배(A: 100% H2O, 0.1% 포름산 및 B: 100% ACN)로 C18 컬럼(150 mm×0.1 mm, 기공 크기 3 ㎛, Agilent) 상에서 300 mL/min의 유속으로 분리하였다. 질량 스펙트럼은 nano-LC 시스템(EASY nLC, Thermo Scientific)에 연결된 이중 질량 분석기(LTQ Orbitrap Velos, Thermo Scientific)를 사용하여 분석하였다. 질량 데이터는 하나의 전체 MS 스캔(질량 범위 150-2000 m/z)을 결합한 주기를 사용하여 얻었고, 얻은 단백질은 직렬 질량 분석 데이터베이스 검색 프로그램 SEQUEST를 사용하여 MS/MS 스펙트럼을 검색하여 식별하였다.RBD bands purified from plants were separated through SDS-PAGE. Proteins in gel slices were trypsinized overnight at 37°C. After elution, protein samples were run on a C18 column (150 mm×0.1 mm, pore size 3 μm, Agilent) with a linear gradient (A: 100% H 2 O, 0.1% formic acid and B: 100% ACN) at 300 mL/min. separated by flow rate. Mass spectra were analyzed using a dual mass spectrometer (LTQ Orbitrap Velos, Thermo Scientific) coupled to a nano-LC system (EASY nLC, Thermo Scientific). Mass data were obtained using cycles combining one full MS scan (mass range 150–2000 m/z), and the obtained proteins were identified by searching the MS/MS spectra using the serial mass spectrometry database search program SEQUEST.

실시결과 1. 형질전환 식물체에서 SARS-CoV-2 RBD의 일시적 발현 분석Results 1. Temporary expression analysis of SARS-CoV-2 RBD in transgenic plants

니코티아나 베타미아나(N. benthamiana)에서 RBD를 일시적으로 발현시키기 위해, 식물 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 RBD 아미노산 서열 319-541을 TMV(tobacco mosaic virus) 바이럴 벡터의 N-말단 및 C-말단에 추가 서열이 있는 플라스미드 T10, T11, T12 및 T13, 총 4종을 제작하였다(도 4).To transiently express RBD in Nicotiana betamiana ( N. benthamiana ), the plant codon-optimized SARS-CoV-2 RBD amino acid sequence 319-541 was used at the N-terminus and C-terminus of a tobacco mosaic virus (TMV) viral vector. A total of four plasmids, T10, T11, T12 and T13, each having an additional sequence at the end were constructed (FIG. 4).

높은 수율의 RBD를 얻기 위해, 각 RBD 발현 카세트를 포함하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 기술을 사용하여 식물 특이적 알파-(1,3)-푸코실트랜스퍼라제(F) 및 베타-(1,2)-자일로실트랜스퍼라제(X)를 녹아웃시킨, 당쇄엔지니어링된(glycoengineered) 식물체에 침윤시켰다. 침윤된 담배잎(침투 후 4일 [DPI(days postinfiltration)])은 괴사 표현형을 발생시켰으며, 이는 T12 및 T13에 비해 T10 및 T11에서 더 심각하게 나타났다(도 5a). 침윤된 잎을 4~7 DPI에 수확하고(도 5b), SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 통하여 재조합 RBD의 발현을 분석하였다.In order to obtain high yields of RBD, Agrobacterium containing each RBD expression cassette was converted to plant-specific alpha-(1,3)-fucosyltransferase (F) using CRISPR/Cas9-based genome editing technology. and beta-(1,2)-xylosyltransferase (X) knocked out, glycoengineered plants were infiltrated. Infiltrated tobacco leaves (4 days postinfiltration [DPI]) developed a necrotic phenotype, which was more severe at T10 and T11 compared to T12 and T13 (Fig. 5a). The infiltrated leaves were harvested at 4-7 DPI (FIG. 5b), and the expression of recombinant RBD was analyzed by SDS-PAGE and Western blot.

도 6a 내지 도 6c에 나타낸 바와 같이, RBD 단백질 밴드는 예측된 27 kDa에 해당하는 25 kDa와 35 kDa 사이에서 관찰되었다. 식물 기반 재조합 RBD는 4가지 플라스미드 모두 4 DPI부터 발현되었으며, T10 및 T11은 가장 높은 수준으로 발현되었다. 또한, 침투된 식물에서 재조합 RBD는 4 DPI에서 T11이 가장 높았고 점차 감소하였으며, 식물 추출물의 총 용해성 단백질에서 4 DPI의 T11 RBD 농도는 92 mg/kg 생엽 중량(fresh leaf weight)이었다. 따라서, 최종적으로 RBD 생산 수율이 가장 우수한 T11을 사용하여 RBD를 생산하였다.As shown in Figures 6a to 6c, the RBD protein band was observed between 25 kDa and 35 kDa corresponding to the predicted 27 kDa. Plant-based recombinant RBD was expressed from 4 DPI by all four plasmids, with T10 and T11 being expressed at the highest levels. In addition, recombinant RBD in infiltrated plants was the highest at T11 at 4 DPI and gradually decreased, and the concentration of T11 RBD at 4 DPI in the total soluble protein of plant extract was 92 mg/kg fresh leaf weight. Therefore, RBD was finally produced using T11, which had the highest RBD production yield.

한편, 단백질 전기영동시 식물 기반 및 인간 Expi293F 기반 RBD는 35 kDa 마커의 위치와 비교하여 각각 더 빠르고 느리게 이동하였다. 이는 식물 기반 RBD에 연결된 식물 특이적 푸코스 및 자일로스 잔기의 부족 또는 인간 Expi293F 세포 대 식물 세포의 N-글리코실화 및 O-글리코실화 간의 차이로 설명될 수 있다(도 6d). Expi293F 기반 RBD를 펩타이드-N-글리코시다제(PNGase) F로 처리하면 식물 기반 RBD와 유사하게 사이즈의 밴드가 생성된 반면, 식물 기반 RBD는 PNGase A 처리와 상관없이 유사하였다. 이러한 발견은 -FX 담배 식물에 N-글리칸 푸코오스와 자일로오스가 없기 때문일 수 있다(도 6d). 또한, 아미노산 서열에서 예측된 27 kDa와 비교하여 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD의 상대적 분자 질량이 더 높은 것은 O-글리코실화에 의해 설명될 수 있다.On the other hand, during protein electrophoresis, plant-based and human Expi293F-based RBD migrated faster and slower, respectively, compared to the position of the 35 kDa marker. This could be explained by the lack of plant-specific fucose and xylose residues linked to the plant-based RBD or the difference between N- and O-glycosylation of human Expi293F cells versus plant cells (Fig. 6d). Treatment of Expi293F-based RBD with peptide-N-glycosidase (PNGase) F produced bands of similar size to plant-based RBD, whereas plant-based RBD was similar regardless of PNGase A treatment. This finding may be due to the absence of N-glycan fucose and xylose in -FX tobacco plants (Fig. 6d). In addition, the higher relative molecular mass of the plant-based SARS-CoV-2 RBD compared to the 27 kDa predicted from the amino acid sequence can be explained by O-glycosylation.

실시결과 2. 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 정제Results 2. Purification of plant-based SARS-CoV-2 RBD protein

식물 기반 재조합 RBD는 도 7에 나타낸 바와 같이 2 단계로 정제를 수행하였다. 이때, 1차 His 컬럼 크로마토그래피의 정제시 조건은 하기 표 2에 나타낸 바와 같으며, 2차 SP 컬럼 크로마토그래피의 정제시 조건은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 이에 따른, 1차 His 컬럼 크로마토그래피 및 2차 SP 컬럼 크로마토그래피의 정제 결과는 각각 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같다. 한편, 1차 His 컬럼 크로마토그래피의 정제물에 대해 SDS-PAGE를 수행한 결과는 도 10에 나타내었고, 2차 SP 컬럼 크로마토그래피의 정제물에 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 수행한 결과는 도 11에 나타내었다.Plant-based recombinant RBD was purified in two steps as shown in FIG. 7 . In this case, the purification conditions of the first His column chromatography are as shown in Table 2 below, and the purification conditions of the second SP column chromatography are as shown in Table 3 below. Accordingly, the purification results of the first His column chromatography and the second SP column chromatography are shown in FIGS. 8 and 9, respectively. On the other hand, the results of performing SDS-PAGE on the purified product of the first His column chromatography are shown in FIG. 10, and the results of performing SDS-PAGE and Western blot on the purified product of the second SP column chromatography are shown in FIG. 11.

단계(Step)Step 공정(Process)Process 코멘트(Comments)Comments 1One 컬럼 정보column information 수지(Resin)Resin HisTrapFFHisTrapFF -- 컬럼 유형column type Prepack 5 mLPrepack 5mL -- 베드(Bed) 높이Bed height 2.5 cm2.5cm -- 컬럼 부피column volume 5 mL5 mL -- 선형 유속
(Linear flow rate)linear flow rate
(Linear flow rate) 150 cm/h150cm/h 33 평형화
(Equilibration)equilibration
(Equilibration) His 완충액 AHis buffer A 10 CV10 CV -- 44 샘플 로딩sample loading 여과액(Filtrate)Filtrate -- 55 세척 1wash 1 His 완충액 AHis buffer A 15 CV15 CV 66 세척 2wash 2 His 완충액 A+BHis buffer A+B 15 CV15 CV B: 3%B: 3% 77 용출(Elution)Elution His 완충액 A+BHis buffer A+B - OD 20 mAU 이상이면 수집 시작
- OD 50 mAU 이하로 떨어지면 수집 종료- Start collecting when OD is over 20 mAU
- Collection ends when OD falls below 50 mAU 선형 구배 용출
(Linear gradient elution)
(3-50%), 30 CVlinear gradient elution
(Linear gradient elution)
(3-50%), 30 CV 88 세척 3wash 3 His 완충액 BHis buffer B 10 CV10 CV 99 CIPCIP His 완충액 CHis buffer C 15 CV15 CV -- 1010 재-평형화
(Re-equilibration)re-equilibration
(Re-equilibration) His 완충액 AHis buffer A 10 CV10 CV -- 1111 컬럼 보관column storage His 완충액 DHis buffer D 10 CV10 CV --

단계(Step)Step 공정(Process)Process 코멘트(Comments)Comments 1One 컬럼 정보column information 수지(Resin)Resin SP Sepharose FFSP Sepharose FF -- 컬럼 유형column type Prepack 5 mLPrepack 5mL -- 베드(Bed) 높이Bed height 2.5 cm2.5cm -- 컬럼 부피column volume 5 mL5 mL -- 선형 유속
(Linear flow rate)linear flow rate
(Linear flow rate) 150 cm/h150cm/h 33 평형화
(Equilibration)equilibration
(Equilibration) SP 완충액 ASP Buffer A 10 CV10 CV -- 44 샘플 로딩sample loading 여과액(Filtrate)Filtrate -- 55 세척 1wash 1 SP 완충액 ASP Buffer A 15 CV15 CV 77 용출(Elution)Elution SP 완충액 A+BSP buffer A+B OD 20 mAU 이상이면 수집 시작
OD 50 mAU 이하로 떨어지면 수집 종료Start collecting when OD is greater than 20 mAU
End collection when OD falls below 50 mAU 선형 구배 용출
(Linear gradient elution)
(0-50%), 30 CVlinear gradient elution
(Linear gradient elution)
(0-50%), 30 CV 88 세척 2wash 2 SP 완충액 BSP Buffer B 10 CV10 CV 99 CIPCIP SP 완충액 CSP Buffer C 15 CV15 CV -- 1010 재-평형화
(Re-equilibration)re-equilibration
(Re-equilibration) SP 완충액 ASP Buffer A 10 CV10 CV -- 1111 컬럼 보관column storage SP 완충액 DSP Buffer D 10 CV10 CV --

상기 2 단계로 정제된 RBD는 SDS-PAGE를 통해 25 kDa~35 kDa에서 단일(염색된 젤, 도 12의 a) 또는 2개의 밴드(웨스턴 블롯, 도 12의 b 및 c)로 SARS-CoV-2 스파이크 RBD 및 His 에피토프 태그에 대한 항체(도 12의 b 및 c, 및 도 13의 a 및 b)를 통하여 확인되었다. 또한, LC/LTQ-OrbiTrap MS를 사용한 N-말단 펩타이드 시퀀싱으로 SDS-PAGE 젤에서 절단된 RBD 밴드의 아미노산 서열을 확인하였다. 정제된 RBD의 수율은 6 mg/kg(사용된 식물체의 초기 생 중량)이었다. 항-RBD 및 에피토프 태그된 항체를 통하여 각각 RBD 이량체와 일치하는 64 kDa에 해당하는 밴드를 확인하였다(도 12의 b 및 c).The RBD purified in the above two steps showed a single (stained gel, Fig. 12 a) or two bands (western blot, Fig. 12 b and c) at 25 kDa to 35 kDa through SDS-PAGE. It was confirmed through antibodies against 2 spike RBD and His epitope tags (Fig. 12 b and c, and Fig. 13 a and b). In addition, the amino acid sequence of the cleaved RBD band in the SDS-PAGE gel was confirmed by N-terminal peptide sequencing using LC/LTQ-OrbiTrap MS. The yield of purified RBD was 6 mg/kg (initial fresh weight of the plant used). Through anti-RBD and epitope-tagged antibodies, a band corresponding to 64 kDa consistent with the RBD dimer was identified (Fig. 12 b and c).

실시결과 3. 형질전환 식물체로부터 생산된 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 당쇄 분석Result 3. Sugar chain analysis of SARS-CoV-2 RBD protein produced from transgenic plants

상기 실시예 2에서 정제하여 최종 수득한 형질전환 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질과 동물 유래 RBD 간의 N-당사슬(glycan) 프로파일링 결과를 분석하였다. 그 결과는 하기 표 4, 도 14a 및 도 14b에 나타낸 바와 같다.The results of N-glycan profiling between the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein derived from transgenic plants finally obtained by purification in Example 2 and the RBD derived from animals were analyzed. The results are shown in Table 4 and FIGS. 14A and 14B below.

구체적으로, 정제된 식물 기반 RBD 및 Expi 동물 기반 RBD 50 μg에 각각 PNGase A 및 PNGase F(P0707 및 P0704; New England Biolabs)를 처리하여 당을 분리하였다. 단백질에서 분리된 글리칸 분자는 탄화그래프(carbograph) 카트리지(#210142; S*Pure Pte Ltd., Singapore)를 사용하여 고체상 추출하였다. 글리칸을 2-아미노벤즈아미드(PP0520; Sigma-Aldrich)로 유도체화한 후 시아노 카트리지(12102007; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)로 고체상 추출하였다. 표지된 글리칸을 고속 진공에서 건조하고 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행 질량 분석기(MALDI-TOF MS)를 사용하여 분석하였다.Specifically, 50 μg of purified plant-based RBD and Expi animal-based RBD were treated with PNGase A and PNGase F (P0707 and P0704; New England Biolabs), respectively, to separate sugars. Glycan molecules isolated from proteins were subjected to solid phase extraction using a carbograph cartridge (#210142; S*Pure Pte Ltd., Singapore). Glycans were derivatized with 2-aminobenzamide (PP0520; Sigma-Aldrich) followed by solid phase extraction with a cyano cartridge (12102007; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA). The labeled glycans were dried in high-speed vacuum and analyzed using matrix assisted laser desorption ionization-in-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).

구체적으로, 2-AB 표지된 N-글리칸 샘플을 5 mg/mL 농도로 증류수에 용해시켰다. 포화 용액은 2,5-디히드록시벤조산(DHB)을 0.1% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴(TFA:ACN, 1:1, v/v)에 용해시켜 제조하였다. 포화 용액과 10 mM NaCl(7:3, v/v)을 혼합하여 매트릭스 용액을 제조하였다. 샘플 2 μL를 연마된 강철 384 타겟 플레이트에 스팟팅하고, 2 μL의 매트릭스 용액과 혼합하여 진공 건조하였다. 각 샘플은 MALDI-TOF로 분석되었다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 337 nm 펄스 질소 레이저가 장착된 autoflex maX 질량 분석기(Bruker Daltonics, Germany)에서 획득하였다. 스펙트럼 획득에는 Flex Control 3.4 소프트웨어가 사용되었다.Specifically, 2-AB-labeled N-glycan samples were dissolved in distilled water at a concentration of 5 mg/mL. A saturated solution was prepared by dissolving 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) in 0.1% trifluoroacetic acid-acetonitrile (TFA:ACN, 1:1, v/v). A matrix solution was prepared by mixing a saturated solution with 10 mM NaCl (7:3, v/v). 2 μL of the sample was spotted onto a polished steel 384 target plate, mixed with 2 μL of matrix solution and vacuum dried. Each sample was analyzed by MALDI-TOF. MALDI-TOF mass spectra were acquired on an autoflex maX mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany) equipped with a 337 nm pulsed nitrogen laser. Flex Control 3.4 software was used for spectral acquisition.

결과적으로, 동물 유래 RBD는 α-1,6 푸코스를 포함한 당화가 다수 측정되었고, 주요 당패턴이 푸코스를 포함하고 있음이 확인되었다. 반면, 식물 유래 RBD는 기주식물에서 제거한 α-1,3 코어푸코스와 β(1,2) 자일로스가 없는 당화 패턴이 측정되었다. 주요 당패턴 역시 푸코스를 미포함하고 있음을 확인하였다.As a result, a number of glycosylation including α-1,6 fucose was measured in animal-derived RBD, and it was confirmed that the main sugar pattern included fucose. On the other hand, plant-derived RBD was measured for glycosylation patterns without α-1,3 core fucose and β(1,2) xylose removed from the host plant. It was confirmed that the main sugar pattern also did not contain fucose.

N-glycanN-glycan 예측 m/zPrediction m/z 실측 m/zGround truth m/z 차이difference 식물 유래 RBDplant-derived RBD 예측 m/zPrediction m/z 실측 m/zGround truth m/z 동물 유래 RBD (Expi293-RBD)Animal-derived RBD (Expi293-RBD) 강도robbery %% 강도robbery %% M3M3 1053.01053.0 1053.371053.37 0.370.37 5695756957 27.327.3 0.00.0 MMF3 MMF 3 1199.11199.1 0.00.0 1199.481199.48 0.380.38 65906590 0.80.8 M4M4 1215.21215.2 1215.431215.43 0.180.18 13491349 0.60.6 1215.481215.48 0.230.23 1411314113 1.71.7 M3G0M3G0 1256.31256.3 1256.461256.46 0.180.18 4681446814 22.522.5 1256.511256.51 0.240.24 1212812128 1.51.5 M5M5 1377.31377.3 1377.491377.49 0.190.19 62486248 3.03.0 1377.551377.55 0.250.25 223694223694 27.027.0 M3G0FM3G0F 1402.31402.3 0.00.0 1402.581402.58 0.280.28 4941849418 6.06.0 GnMF3/
MGnF3 GnMF 3 /
MGnF 3 1402.31402.3 M3G1M3G1 1418.31418.3 1418.501418.50 0.170.17 19981998 1.01.0 0.00.0 G0G0 1459.41459.4 1459.541459.54 0.140.14 6658866588 31.931.9 0.00.0 M6M6 1539.41539.4 1539.541539.54 0.140.14 44714471 2.12.1 1539.611539.61 0.210.21 76167616 0.90.9 M3G1FM3G1F 1564.41564.4 1564.571564.57 0.180.18 19411941 0.90.9 1564.651564.65 0.260.26 1778417784 2.12.1 M4G1M4G1 1580.41580.4 1580.581580.58 0.200.20 14631463 0.70.7 0.00.0 M5G0M5G0 1580.41580.4 0.00.0 0.00.0 M3G0F+NGM3G0F+NG 1605.41605.4 0.00.0 1605.671605.67 0.260.26 151942151942 18.318.3 M7M7 1701.61701.6 1701.591701.59 -0.01-0.01 45744574 2.22.2 0.00.0 G1FG1F 1767.71767.7 1767.651767.65 -0.05-0.05 40504050 1.91.9 1767.731767.73 0.030.03 9827098270 11.911.9 G0F+GNG0F+GN 1808.51808.5 0.00.0 1808.761808.76 0.270.27 9973199731 12.012.0 M8M8 1863.71863.7 1863.631863.63 -0.07-0.07 67986798 3.33.3 0.00.0 G2FG2F 1929.51929.5 0.00.0 1929.791929.79 0.270.27 6599465994 8.08.0 G1F+NGG1F+NG 1970.51970.5 0.00.0 1970.811970.81 0.270.27 8189881898 9.99.9 Man9Man9 2025.82025.8 2025.702025.70 -0.10-0.10 51695169 2.52.5 0.00.0

II. 형질전환 식물체로부터 생산된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 백신 효능 분석II. Analysis of vaccine efficacy of RBD protein of SARS-CoV-2 spike protein produced from transgenic plants

본 발명의 형질전환 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 백신 효능을 분석하고자, 상기 제조한 SARS-CoV-2 RBD 단백질 및/또는 보조제(adjuvant)를 마우스 모델에 투여하여 식물 기반 RBD 단백질의 면역원성을 확인하였다. 이하, 실험예 및 실시예 등을 통해 구체적으로 기술한다.In order to analyze the vaccine efficacy of the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein derived from the transgenic plant of the present invention, the prepared SARS-CoV-2 RBD protein and / or adjuvant were administered to a mouse model to plant-based RBD The immunogenicity of the protein was confirmed. Hereinafter, it will be described in detail through experimental examples and examples.

실험예 1. 마우스 및 면역화 프로토콜Experimental Example 1. Mice and immunization protocol

18~20 g(5주령)의 암컷 BALB/cAnHsd 마우스를 KOATECH(한국)에서 구입하여 국제백신연구소(IVI, 한국)의 동물 시설에 수용하고 면역 7일 동안 순응시켰다. 연구는 이 연구를 승인한 IVI-기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행하였다(IACUC, PN 2020-002). 25 ㎕의 Imject AlumTM 보조제(77161, Thermo Scientific), Alhydrogel® 보조제(vac-alu-250, Invivogen) 또는 AddaVaxTM(vac-adx-10, Invivogen)를 사용하여 총 부피를 50 ㎕가 되도록 혼합한 후, 10 ㎍의 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD를 2주마다 마우스에 3회 근육 주사하였다. 대조군 마우스에는 Imject Alum, Alhydrogel 또는 AddaVax를 주사하였다. 시험군 및 대조군은 각 5마리의 마우스를 사용하였다. 각 주사 후 13일에 안와정맥총(retro-orbital plexus)에서 3회 채혈하여 혈청을 수득하고, 이를 원심분리하여 -80℃에 보관하였다.Female BALB/cAnHsd mice weighing 18-20 g (5 weeks old) were purchased from KOATECH (Korea), housed in the animal facility of the International Vaccine Institute (IVI, Korea), and immunized for 7 days. The study was performed in accordance with the guidelines of the IVI-Institutional Animal Care and Use Committee that approved this study (IACUC, PN 2020-002). 25 μl of Imject Alum TM adjuvant (77161, Thermo Scientific), Alhydrogel ® adjuvant (vac-alu-250, Invivogen) or AddaVax TM (vac-adx-10, Invivogen) were mixed to a total volume of 50 μl. Afterwards, 10 μg of plant-based SARS-CoV-2 RBD was intramuscularly injected into the mice three times every two weeks. Control mice were injected with Imject Alum, Alhydrogel or AddaVax. The test group and control group used 5 mice each. On day 13 after each injection, blood was collected from the retro-orbital plexus three times to obtain serum, which was centrifuged and stored at -80°C.

실험예 2. 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)Experimental Example 2. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

PBS에 현탁한 Expi293F-기반 RBD(1 ㎍/mL, 웰당 100 ㎕)를 사용하여 96웰 플레이트의 웰을 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션하고, 0.05% Tween이 포함된 TBS 완충액 200 ㎕로 3회 세척하였다. 이후 웰당 0.05% Tween 및 5% 탈지유를 포함하는 TBS 100 ㎕로 실온(RT)에서 1시간 동안 블록킹(blocking)을 수행하였다. 1회 세척한 후, 0.05% Tween 및 5% 탈지유를 함유하는 TBS로 1:100으로 희석한 혈청 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 역가를 측정하기 위해 연속 희석된 혈청(1/100~1/218,700)을 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.Wells of a 96-well plate were coated with Expi293F-based RBD (1 μg/mL, 100 μL per well) suspended in PBS. Plates were incubated overnight at 4° C. and washed 3 times with 200 μl of TBS buffer containing 0.05% Tween. Thereafter, blocking was performed for 1 hour at room temperature (RT) with 100 μl of TBS containing 0.05% Tween and 5% skim milk per well. After washing once, 100 μl of serum diluted 1:100 with TBS containing 0.05% Tween and 5% skim milk was added to each well. To measure the titer, serially diluted serum (1/100 to 1/218,700) was added to the wells, and the plates were allowed to react at room temperature for 2 hours.

5회 세척 후, 0.05% Tween 및 5% 탈지유가 포함된 TBS를 첨가하여 HRP 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG(1030-05, Southern Biotech), IgG1(1070-05, Southern Biotech) 또는 IgG2a(1080-05, Southern Biotech)를 1:3,000으로 희석하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 5회 세척한 후 TMB/E(ES001, Millipore) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 100 ㎕의 0.5 M HCl을 사용하여 반응을 중지하고, 플레이트 판독기(FLUOstar Omega, BMG Labtech)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 본 실험에 사용된 Expi293F-기반 RBD는 Expi293™ 발현 시스템(Expi293™ Expression System; A14635, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 제조하였다.After washing 5 times, HRP conjugated anti-mouse IgG (1030-05, Southern Biotech), IgG1 (1070-05, Southern Biotech) or IgG2a (1080- 05, Southern Biotech) was diluted 1:3,000, and the plate was allowed to react for 2 hours at room temperature. After washing 5 times, 100 μl of TMB/E (ES001, Millipore) was added to each well. The reaction was stopped with 100 μl of 0.5 M HCl and the optical density was measured at 450 nm using a plate reader (FLUOstar Omega, BMG Labtech). The Expi293F-based RBD used in this experiment was prepared using the Expi293™ Expression System (A14635, Thermo Fisher Scientific).

실험예 3. 초점 감소 중화 테스트(FRNT)Experimental Example 3. Focus reduction neutralization test (FRNT)

Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주; ATCC CCL-81) 세포 및 Vero E6(ATCC CCL-1586) 세포를 10% 소태아 혈청(FBS; HyClone) 및 100 U/mL의 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Carlsbad, CA)이 함유된 고-글루코스 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium; HyClone, Logan, UT) 배지에서 성장시켰다. 국내 환자로부터 분리된 SARS-CoV-2(BetaCoV/Korea/KCDC03/2020)는 질병관리본부(KCDC)에서 입수하여 Vero 세포에서 증식시켰다.Vero (African green monkey kidney cell line; ATCC CCL-81) cells and Vero E6 (ATCC CCL-1586) cells were cultured in 10% fetal bovine serum (FBS; HyClone) and 100 U/mL of penicillin-streptomycin (Gibco, Carlsbad; CA) was grown in high-glucose DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium; HyClone, Logan, UT) medium. SARS-CoV-2 (BetaCoV/Korea/KCDC03/2020), isolated from a domestic patient, was procured from the Korea Centers for Disease Control and Prevention (KCDC) and proliferated in Vero cells.

마우스 혈청 샘플의 중화 활성은 FRNT50 분석을 사용하여 결정하였다. 간략하게, 열 불활성화된 마우스 혈청을 2% FBS가 함유된 EMEM(Eagle's minimum essential medium) 배지에 연속적으로 희석하고, 8×103 플라크 형성 단위(plaque forming unit, PFU)와 혼합하여 최종 부피 50 ㎕로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 혼합물을 각 웰의 4×104개의 Vero E6 세포에 첨가하였다.The neutralizing activity of mouse serum samples was determined using the FRNT 50 assay. Briefly, heat-inactivated mouse serum was serially diluted in Eagle's minimum essential medium (EMEM) medium containing 2% FBS and mixed with 8×10 3 plaque forming units (PFU) to a final volume of 50 [mu]l and incubated at 37°C for 1 hour. This mixture was added to 4×10 4 Vero E6 cells in each well.

37℃에서 8시간 동안 배양한 후 세포를 세척하고 고정한 후, SARS-CoV-2 N-특이적 항체(40143-R001, Sino Biological)와 2차 HRP-컨쥬게이션된 goat antirabbit IgG(Biorad)로 염색하였다. 불용성 TMB 기질(Promega)을 사용하여 신호를 발생시키고, ImmunoSpot 판독기(CTL, Shaker Height, OH)를 사용하여 감염된 세포의 수를 계산하였다. 50% 중화(FRNT50)를 달성한 혈청 희석 인자는 GraphPad Prism 8.0 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀 분석으로 계산하였다.After incubation at 37°C for 8 hours, cells were washed and fixed, then stained with SARS-CoV-2 N-specific antibody (40143-R001, Sino Biological) and secondary HRP-conjugated goat antirabbit IgG (Biorad) did Signals were generated using insoluble TMB substrate (Promega) and the number of infected cells was counted using an ImmunoSpot reader (CTL, Shaker Height, OH). The serum dilution factor that achieved 50% neutralization (FRNT 50 ) was calculated by non-linear regression analysis using GraphPad Prism 8.0 software.

실험예 4. 통계 분석Experimental Example 4. Statistical Analysis

모든 데이터는 GraphPad Prism 8.0 소프트웨어로 분석하였다. 두 그룹 간의 통계적으로 유의한 차이는 unpaired Student's t-검정을 사용하여 결정하였다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.All data were analyzed with GraphPad Prism 8.0 software. Statistically significant differences between the two groups were determined using unpaired Student's t-test. p < 0.05 was considered statistically significant.

실험결과 4. 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD로 면역화된 마우스 모델의 혈청 항체 활성 평가Experimental results 4. Evaluation of serum antibody activity in mouse models immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD

마우스에서 식물 기반 RBD의 면역원성을 평가하기 위해, 먼저 AlumTM 보조제(77161, Thermo Scientific), Alhydrogel® 보조제(vac-alu-250, Invivogen) 및 AddaVaxTM(vac-adx-10, Invivogen)가 식물 기반 RBD에 대한 마우스의 면역반응에 미치는 보조 효과를 비교하였다(표 5 및 도 15a). ELISA는 RBD-특이적 IgG가 RBD-면역화된 마우스의 혈청에 존재하고, 총 IgG 수준이 세 번째(3rd) 면역화 후에 유의하게 증가함을 보여주었다(도 15b).To evaluate the immunogenicity of plant-based RBDs in mice, Alum TM adjuvant (77161, Thermo Scientific), Alhydrogel ® adjuvant (vac-alu-250, Invivogen) and AddaVax TM (vac-adx-10, Invivogen) were first tested in plant The adjuvant effect on the immune response of mice to the based RBD was compared (Table 5 and Figure 15a). ELISA showed that RBD-specific IgG was present in the serum of RBD-immunized mice, and total IgG levels increased significantly after the third (3 rd ) immunization ( FIG. 15B ).

대조적으로, RBD의 첫 번째(1st) 투여 후에 수집된 혈청의 ELISA 역가와 PBS 또는 보조제 단독으로 처리된 마우스의 역가의 차이는 무시할 만하였다. 식물 기반 RBD 단독 투여만으로도 특이적 항체의 높은 ELISA 역가를 유도하였지만, 보조제의 경우에는 역가를 현저하게 증가시켰다(도 15b). AddaVax 보조제는 가장 효과적인 보조제로 확인되었다. 각각의 첫 번째 및 두 번째 부스트(boost) 후에 ELISA 항체 역가가 점진적으로 유의하게 증가하였다. 구체적으로, RBD + 보조제로 두 번째(2nd) 부스트 후 ELISA 역가는 하기 표 6 및 도 15c에 나타낸 바와 같다. 이러한 결과를 통해 RBD 단독 또는 보조제 첨가된 RBD가 강력한 체액성 면역반응을 유도함을 알 수 있었다.In contrast, the difference between ELISA titers of serum collected after the first ( 1st ) administration of RBD and mice treated with PBS or adjuvant alone was negligible. Administration of plant-based RBD alone induced high ELISA titers of specific antibodies, but adjuvants significantly increased titers (FIG. 15b). AddaVax supplements were identified as the most effective supplements. ELISA antibody titers progressively and significantly increased after each first and second boost. Specifically, the ELISA titers after the second (2 nd ) boost with RBD + adjuvant are as shown in Table 6 and FIG. 15C below. Through these results, it was found that RBD alone or RBD with an adjuvant induced a strong humoral immune response.

No.No. 그룹group 마우스 수number of mice 항원antigen 보조제
(adjuvant)supplements
(adjuvant) 총 부피total volume 면역화 경로immunization pathway 1One PBSPBS 55 -- -- 50 ㎕50 µL 근육주사
(I.M.)intramuscular injection
(IM) 22 RBD 단독RBD alone 55 RBD 10 ㎍RBD 10 μg -- 33 RBD + AlumRBD + Alum 55 RBD 10 ㎍RBD 10 μg AlumAlum 44 RBD + AlhydrogelRBD + Alhydrogel 55 RBD 10 ㎍RBD 10 μg AlhydrogelAlhydrogel 55 RBD + AddaVaxRBD + AddaVax 55 RBD 10 ㎍RBD 10 μg AddaVaxAddaVax 66 Alum 단독Alum alone 55 -- AlumAlum 77 Alhydrogel 단독Alhydrogel alone 55 -- AlhydrogelAlhydrogel 88 AddaVax 단독AddaVax alone 55 -- AddaVaxAddaVax

그룹group 평균 혈청 역가mean serum titer RBD 단독 투여Administration of RBD alone 약 1.3 × 104 about 1.3 × 10 4 RBD + AddaVaxRBD + AddaVax 1.3 × 105 1.3 × 10 5 RBD + AlhydrogelRBD + Alhydrogel 7.3 × 104 7.3 × 10 4 RBD + AlumRBD + Alum 4.1 × 104 4.1 × 10 4

Th1 및 Th2 T 헬퍼(Th) 림프구는 각각 IgG2a 및 IgG1의 생성과 관련이 있다. IgG1 대 IgG2a의 비율은 세포성 매개 면역과 체액성 면역 사이의 균형을 나타낸다. 식물 기반 RBD에 의해 유도된 면역반응의 유형을 확인하기 위해, 3차 면역화 후 수집된 혈청에서 IgG1 및 IgG2a 수준을 측정하였다. RBD 단독 또는 보조제와 함께 제형화된 RBD로 면역화된 마우스의 혈청은 RBD에 대해 높은 항-IgG1 역가를 갖고, 대조적으로, IgG2a 역가는 검출할 수 없었다(도 15d 및 도 15e). 이러한 결과를 통해 마우스에서 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD에 의하여 Th2형 체액성 면역반응이 유도됨을 알 수 있었다.Th1 and Th2 T helper (Th) lymphocytes are involved in the production of IgG2a and IgG1, respectively. The ratio of IgG1 to IgG2a represents the balance between cellular-mediated and humoral immunity. To confirm the type of immune response induced by plant-based RBD, IgG1 and IgG2a levels were measured in serum collected after the third immunization. Serum from mice immunized with RBD alone or formulated with adjuvant had high anti-IgG1 titers against RBD and, in contrast, no detectable IgG2a titers (FIGS. 15D and 15E). Through these results, it was found that a Th2-type humoral immune response was induced by the plant-based SARS-CoV-2 RBD in mice.

실험결과 5. 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD로 면역화된 마우스 모델의 항혈청 바이러스 중화 활성 평가Experimental results 5. Evaluation of antiserum virus neutralizing activity of mouse models immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD

마우스 항혈청(antisera)의 바이러스 중화능력을 확인하기 위해, 살아있는 SARS-CoV-2가 감염된 Vero E6 세포를 사용하여 두 번째 및 세 번째 면역화 후에 수집된 4개의 혈청 그룹에 대한 FRNT 분석을 수행하였다(도 16a, 도 16b 및 도 17). 두 번째 면역화 후 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD로 면역화된 마우스에서 수집한 혈청의 평균 FRNT50 값은 1,843으로 다른 그룹의 값에 비해 상당히 높았다(도 16c 및 표 7). 또한, 중화 항체의 역가는 다른 3개의 보조제 및 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD로 면역화된 마우스에서 증가하였다. 3차 접종 후 식물 기반 RBD 단독 투여군의 중화 항체의 역가에는 유의한 차이가 없었다.To confirm the virus-neutralizing ability of mouse antisera, FRNT analysis was performed on four groups of sera collected after the second and third immunizations using live SARS-CoV-2-infected Vero E6 cells (Fig. 16a, 16b and 17). After the second immunization, the average FRNT 50 value of serum collected from mice immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD was 1,843, which was significantly higher than that of the other groups (Fig. 16c and Table 7). In addition, titers of neutralizing antibodies were increased in mice immunized with the other three adjuvants and plant-based SARS-CoV-2 RBD. After the third inoculation, there was no significant difference in the neutralizing antibody titer of the plant-based RBD alone group.

또한, 식물 기반 SARS-CoV-2 RBD 및 보조제로 면역화된 모든 그룹의 중화 항체 역가가 유의하게 증가하였으며(도 16c), 3개의 보조제 중에서 AddaVax로 제형화된 RBD가 가장 높은 중화 항체 평균 역가(FRNT50 = 6,412)를 달성하였다(표 8). 이러한 결과를 통해 식물 기반 RBD가 마우스에서 SARS-CoV-2 감염된 Vero E6 세포를 보호하는 RBD 특이적 항혈청을 유도함을 확인하였으며, 이에 따라 식물 기반 RBD가 효과적인 COVID-19 백신으로서 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.In addition, the neutralizing antibody titer of all groups immunized with plant-based SARS-CoV-2 RBD and adjuvant significantly increased (FIG. 16c), and among the three adjuvants, RBD formulated with AddaVax had the highest average neutralizing antibody titer (FRNT). 50 = 6,412) was achieved (Table 8). These results confirm that plant-based RBD induces RBD-specific antiserum that protects Vero E6 cells infected with SARS-CoV-2 in mice, and thus plant-based RBD can be usefully utilized as an effective COVID-19 vaccine And it was found.

그룹group FRNT50 FRNT 50 RBD 단독 투여Administration of RBD alone 1,8431,843 RBD + AddaVaxRBD + AddaVax 3,3403,340 RBD + AlhydrogelRBD + Alhydrogel 1,3001,300 RBD + AlumRBD + Alum 1,3271,327

그룹group FRNT50 FRNT 50 RBD 단독 투여Administration of RBD alone 1,5511,551 RBD + AddaVaxRBD + AddaVax 6,4126,412 RBD + AlhydrogelRBD + Alhydrogel 2,2042,204 RBD + AlumRBD + Alum 4,2014,201

<110> G+FLAS Life Sciences <120> RECEPTOR BINDING DOMAIN OF SPIKE PROTEIN OF SARS-CoV-2 PRODUCED FROM GLYCOENGINEERING PLANTS AND USES THEREOF <130> SPD21-096-GFS <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of optimized RBD fragment of spike protein of SARS-CoV-2 <400> 1 agggtccaac ctactgagtc tattgtgcgt ttcccaaaca tcaccaactt gtgccctttc 60 ggagaggttt tcaacgctac taggtttgcc tccgtctacg cttggaaccg taagaggatt 120 agtaactgcg tggccgatta cagcgttctt tacaactctg cttccttcag tacctttaag 180 tgctacggcg tcagcccaac taagctcaac gacttgtgct tcaccaacgt gtacgccgat 240 tcttttgtta tccgtggaga cgaagtcagg cagattgctc ctggtcaaac tggcaagatc 300 gcagactaca actacaagct tccagacgat ttcaccggat gcgtgattgc ttggaactcc 360 aacaacctcg acagtaaggt tggtggcaac tacaactact tgtaccgtct ttttaggaag 420 agcaacctca agcctttcga gcgtgatatc tctactgaaa tttaccaggc cggaagcacc 480 ccatgcaacg gtgtcgaggg gttcaattgc tacttccctt tgcagtccta cggatttcag 540 ccaactaacg gtgtgggcta ccagccgtac agagttgtcg tgcttagctt cgaactcttg 600 cacgctcctg ccaccgtttg cggacccaag aagtctacta atcttgtcaa gaacaagtgc 660 gtgaatttc 669 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD fragment of spike protein Of SARS-CoV-2 <400> 2 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 210 215 220 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site <400> 3 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 4 Ser Ser Gly Ser Ser Gly 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6xHis <400> 5 His His His His His His 1 5 <210> 6 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for RBD fragment of spike protein of SARS-CoV-2 <400> 6 agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60 ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120 agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180 tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240 tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300 gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360 aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420 tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480 ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540 cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600 catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660 gtcaatttc 669 <210> 7 <211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD of spike protein of SARS-CoV-2 <400> 7 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val 1025 1030 1035 1040 Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1045 1050 1055 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu 1060 1065 1070 Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His 1075 1080 1085 Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1205 1210 1215 Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile 1220 1225 1230 Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 8 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD fragment of spike protein Of SARS-CoV-2 with Protease recognition site, Peptide linker, 6xHis <400> 8 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 18 22 27 32 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 37 42 47 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 52 57 62 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 67 72 77 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 82 87 92 97 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 102 107 112 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 117 122 127 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 132 137 142 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 147 152 157 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 162 167 172 177 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 182 187 192 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 197 202 207 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 212 217 222 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Leu 227 232 237 Val Pro Arg Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ser Gly His His His His His 242 247 252 257 His <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Signal peptide <400> 10 atgggatgga gctgcatcat cctctttttg gttgctactg ctactggtgt ccactcc 57 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Protease recognition site <400> 11 ttggtgccgc gcggcagc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Peptide linker <400> 12 agcagcggca gcagcggc 18 <110> G+FLAS Life Sciences <120> RECEPTOR BINDING DOMAIN OF SPIKE PROTEIN OF SARS-CoV-2 PRODUCED FROM GLYCOENGINEERING PLANTS AND USES THEREOF <130> SPD21-096-GFS <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of optimized RBD fragment of spike protein of SARS-CoV-2 <400> 1 agggtccaac ctactgagtc tattgtgcgt ttcccaaaca tcaccaactt gtgccctttc 60 ggagaggttt tcaacgctac taggtttgcc tccgtctacg cttggaaccg taagaggatt 120 agtaactgcg tggccgatta cagcgttctt tacaactctg cttccttcag tacctttaag 180 tgctacggcg tcagcccaac taagctcaac gacttgtgct tcaccaacgt gtacgccgat 240 tcttttgtta tccgtttgtta tccgttggaga cgaagtcagg cagattgctc ctggtcaaac tggcaagatc 300 gcagactaca actacaagct tccagacgat ttcaccggat gcgtgattgc ttggaactcc 360 aacaacctcg acagtaaggt tggtggcaac tacaactact tgtaccgtct ttttaggaag 420 agcaacctca agcctttcga gcgtg atatc tctactgaaa tttaccaggc cggaagcacc 480 ccatgcaacg gtgtcgaggg gttcaattgc tacttccctt tgcagtccta cggatttcag 540 ccaactaacg gtgtgggcta ccagccgtac agagttgtcg tgcttagctt cgaactcttg 600 cacgctcctg ccaccgttg cggacccaag aagtctacta atcttgtcaa gaacaagtgc 660 gtgaatttc 669 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD fragment of spike protein Of SARS-CoV -2 <400> 2 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 210 215 220 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protease recognition site <400> 3 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 4 Ser Ser Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 < 210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 6xHis <400> 5 His His His His His His 1 5 <210> 6 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence for RBD fragment of spike protein of SARS-CoV-2 <400> 6 agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60 ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaat c 120 agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180 tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttataatgt ctatgcagat 240 tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300 gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360 aacaatcttg attctaaggt tgg tgttgg tta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600 catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660 gtcaatttc 669 <210> 7 <211> 1273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD of spike protein of SARS-CoV-2 <400> 7 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val 1025 1030 1035 1040 Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1045 1050 1055 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu 1060 1065 1070 Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His 1075 1080 1085 Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1205 1210 1215 Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile 1220 1225 1230 Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 8 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RBD fragment of spike protein Of SARS -CoV-2 with Protease recognition site, Peptide linker, 6xHis <400> 8 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 18 22 27 32 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 37 42 47 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 52 57 62 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 67 72 77 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 82 87 92 97 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 102 107 112 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 117 122 127 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 132 137 142 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 147 152 157 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 162 167 172 177 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 182 187 192 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 197 202 207 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 212 217 222 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Leu 227 232 237 Val Pro Arg Gly Ser Ser Ser Gly Ser Ser Gly His His His His His 242 247 252 257 His <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 10 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Signal peptide <400> 10 atgggatgga gctgcatcat cctctttttg gttgctactg ctactggtgt ccactcc 57 <210 > 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Protease recognition site <400> 11 ttggtgccgc gcggcagc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of Peptide linker<400> 12 agcagcggca gcagcggc 18

Claims (18)

SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.A polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the receptor binding domain (RBD) protein of the SARS-CoV-2 spike protein. 제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열을 더 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.According to claim 1,
A polynucleotide further comprising a base sequence encoding a signal peptide at the 5'-end of the polynucleotide. 제1항 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 프로테아제 인식 부위를 코딩하는 염기서열을 더 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.According to claim 1,
A polynucleotide further comprising a nucleotide sequence encoding a protease recognition site at the 3'-end of the polynucleotide. 제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 3'-말단에 태그(Tag)를 더 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.According to claim 1,
The polynucleotide further comprises a tag (Tag) at the 3'-end, polynucleotide. 제1항의 폴리뉴클레오티드가 적재된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질 생산용 재조합 벡터.A recombinant vector for producing the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein loaded with the polynucleotide of claim 1. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 생산하는 형질전환된 식물.A transformed plant that produces the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein transformed with the recombinant vector of claim 5. 제6항에 있어서,
알파 1,3-푸코스(alpha 1,3-fucose), 베타 1,2-자일로스(beta 1,2-xylose), 베타 1,3-갈락토스(beta 1,3-galactose) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식물 특이적 N-당사슬이 제거된 당단백질을 생산하는, 형질전환된 식물.According to claim 6,
Alpha 1,3-fucose, beta 1,2-xylose, beta 1,3-galactose, and combinations thereof A transformed plant that produces a glycoprotein from which any one plant-specific N-sugar chain is removed selected from the group consisting of. 제6항에 있어서,
상기 식물은 알파 1,3-푸코실트랜스퍼라제(alpha 1,3 fucosyltransferase, FucT13), 베타 1,2-자일로실트랜스퍼라제(beta 1,2-xylosyltransferase, XylT12), 베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(beta 1,3-galactosyltransferase, GalT13) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현이 억제된 것인, 형질전환된 식물.According to claim 6,
The plant is alpha 1,3-fucosyltransferase (FucT13), beta 1,2-xylosyltransferase (XylT12), beta 1,3-galacto Siltransferase (beta 1,3-galactosyltransferase, GalT13) and any one expression selected from the group consisting of combinations thereof is suppressed, the transformed plant. 제6항에 있어서,
상기 식물은 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것인, 형질전환된 식물.According to claim 6,
The plant is derived from any one selected from the group consisting of tobacco, Arabidopsis, corn, rice, soybean, canola, alfalfa, sunflower, sorghum, wheat, cotton, peanut, tomato, potato, lettuce and pepper. converted plants. 형질전환 식물에서 발현된 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질.RBD protein of plant-derived SARS-CoV-2 spike protein expressed in transgenic plants. 제10항에 있어서,
상기 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질은 변형된 당쇄를 갖는 것인, RBD 단백질.According to claim 10,
The RBD protein of the plant-derived SARS-CoV-2 spike protein has a modified sugar chain, RBD protein. 제10항에 있어서,
상기 RBD 단백질은 M3, M3G0, G0, M7, M8 및 Man9으로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나의 당쇄를 가지는 것인, RBD 단백질.According to claim 10,
The RBD protein having any one sugar chain selected from the group consisting of M3, M3G0, G0, M7, M8 and Man9. 제10항에 있어서,
상기 RBD 단백질은 M3G1F 또는 G1F 당쇄를 포함하되, 상기 당쇄의 함량이 동물 세포에서 생산된 RBD 단백질 보다 낮은 것을 특징으로 하는, RBD 단백질.According to claim 10,
The RBD protein comprises M3G1F or G1F sugar chains, characterized in that the content of the sugar chains is lower than that of RBD proteins produced in animal cells. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 RBD 단백질을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 예방용 백신 조성물.A vaccine composition for preventing SARS-CoV-2 infection comprising the RBD protein of any one of claims 10 to 13 as an active ingredient. 제14항에 있어서,
상기 백신 조성물은 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 것인, 백신 조성물.According to claim 14,
The vaccine composition further comprises an adjuvant, the vaccine composition. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 RBD 단백질을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for treating SARS-CoV-2 infection comprising the RBD protein of any one of claims 10 to 13 as an active ingredient. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 RBD 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 SARS-CoV-2 감염증 예방 및 치료 방법.A method for preventing and treating SARS-CoV-2 infection in an individual, comprising administering the RBD protein of any one of claims 10 to 13 to the individual. a) 제5항의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 도입하여 형질전환 식물을 제조하는 단계;
b) 상기 형질전환 식물로부터 태그(Tag)가 결합된 RBD 단백질을 수득하는 단계; 및
c) 프로테아제를 처리하여 RBD 단백질을 수득하는 단계;를 포함하는 식물 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 단백질의 대량 생산 방법.a) preparing a transgenic plant by introducing a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the RBD protein of the SARS-CoV-2 spike protein of claim 5 into a plant;
b) obtaining a tag-linked RBD protein from the transgenic plant; and
c) processing a protease to obtain an RBD protein; a method for mass-producing RBD protein of a plant-derived SARS-CoV-2 spike protein.
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