KR20230101794A - 샘플을 취급하기 위한 시스템, 키트, 방법, 및 공정 - Google Patents

샘플을 취급하기 위한 시스템, 키트, 방법, 및 공정 Download PDF

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KR20230101794A
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지안니 메도로
알렉스 칼랑카
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메나리니 실리콘 바이오시스템스 에스.피.에이.
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Abstract

강자성 입자(FP)에 결합된 입자(CE)를 포함하는 샘플을 취급하기 위한 시스템 및 방법으로서, 입자(CE)가 컨테이너(3)의 측벽(4)에 끌리도록 샘플(TS)이 내부에 배열된 컨테이너(3)에 자기장이 생성되고; 샘플(TS)의 일부는 캐뉼라(8)를 통해 흡입되고 정렬 디바이스(10)에 의해 제자리에 유지되어 측벽(4)에 접촉되어 남아있는 입자(CE)를 빼내지 않고 컨테이너(3)의 측벽(4)에 접촉하지 않도록 한다.

Description

샘플을 취급하기 위한 시스템, 키트, 방법, 및 공정
관련 출원에 대한 교차 참조
이 특허 출원은 2020년 9월 2일에 출원된 이탈리아 특허 출원 제 102020000020890호를 우선권으로 청구하고, 이의 전체 개시 내용은 인용에 의해 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 샘플을 취급하기 위한 시스템, 키트(kit), 방법, 및 공정(process)에 관한 것이다.
입자(특히, 세포)를 포함하는 샘플의 취급 분야에서, 하나 이상의 유형의 입자가 풍부한 샘플을 얻을 필요성이 느껴진다.
이와 관련하여, 현재 사용되는 방법 중 하나는 샘플의 특정 입자에 대해 특정한 리간드로 기능화된 강자성 입자(ferromagnetic particle)를 포함하는 특정 시약을 생물학적 물질(예를 들어 혈액 또는 혈장의 적어도 일부가 제거된 혈액)의 샘플을 포함하는 시험관에 수동으로 삽입하는 것을 수반하여, 해당 입자가 선택적으로 표시되도록 한다.
그 후, 표시된 입자가 시험관 벽에 집중되도록 자기장이 적용된다. 이 시점에서, 작업자는 시험관에 피펫을 삽입하고 벽에 가깝지 않은 샘플 부분을 수동으로 흡입한다. 이러한 방식으로 표시된 입자가 풍부한 샘플(시험관 내부)이 얻어지며, 이는 적절한 시약을 사용하여 강자성 입자로부터 (후속적으로) 분리될 수 있다.
이 방법의 특히 흥미로운 예는 특허 U6620627호 및 논문 혈액 내 유방 종양 세포 농축을 위한 자성유체 및 프로토콜의 최적화(Optimization of ferrofluids and protocols for enrichment of breast tumor cells in blood), Paul A. Liberti, Chandra G. Rao, Leon W. M. M. Terstappen, 자기 및 자성 재료 저널(Journal of Magnetism and Magnetic Materials) 225(2001), 301-307 에 설명되어 있다.
그러나 위에서 설명한 방법은 복잡하고 시간이 오래 걸리며 힘들고 부정확하다는 점에 유의해야 한다. 사실, 필요한 활동은 시간이 많이 걸린다: 피펫으로 시험관 벽을 만지지 않도록 주의하고, 시험관을 너무 많이 흔들지 않고, 샘플을 너무 빨리 흡입하지 않도록 주의해야 한다.
이러한 양태 중 하나 이상의 오류는 마킹된 입자의 일부(또는 전부)도 흡입할 위험을 증가시킨다.
더욱이 고도로 훈련된 조작자라도 피펫(특히 피펫의 팁)이 벽에서 충분한 거리를 유지하고 올바른 흡입 속도가 적용될 것이라고 보장할 수 없다.
이러한 결점을 해결하기 위해 작업자의 활동을 보다 빠르고 재현 가능한 방식으로 재현하는 완전히 자동화된 시스템의 사용이 제안되었다.
그러나, 이러한 시스템은 매우 복잡하고 비용이 많이 든다.
본 발명의 목적은 공지된 기술의 결점을 적어도 부분적으로 극복하고 동시에 생산하기 쉽고 저렴하게 샘플을 취급하기 위한 시스템, 키트, 방법, 및 공정을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 다음의 독립항, 바람직하게는 독립항에 직접적으로 또는 간접적으로 의존하는 청구항 중 어느 하나에서 청구된 바와 같이 샘플을 취급하기 위한 시스템, 키트, 방법, 및 공정이 제공된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 제 1 유형의 입자(청구범위에 언급됨)는 CTC, 순환 내피 세포(Circulating Endothelial Cells; CEC), 순환 흑색종 세포(Circulating Melanoma Cells; CMC), 순환 다발성 골수종 세포(Circulating Multiple Myeloma Cells; CMMC), 종양 유래 엑스트라 소포(tumor derived Extra Vescicles; tdEV), 엑소좀, 태아 세포, 줄기 세포, 기타 희귀 세포, 바이러스, 박테리아, 포르말린 고정 파라핀 임베디드(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded; FFPE), 정자, 혈액 세포, 상피 세포, DNA, RNA, 및 미세구로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
특히, 제 1 유형의 입자(청구범위에 언급됨)는 세포이다.
일부 비제한적인 경우에, 제 1 유형의 입자는 CTC, 순환 내피 세포(Circulating Endothelial Cells; CEC), 순환 흑색종 세포(Circulating Melanoma Cells; CMC), 순환 다발성 골수종 세포(Circulating Multiple Myeloma Cells; CMMC), 종양 유래 엑스트라 소포(tumor derived Extra Vescicles; tdEV), 엑소좀, 태아 세포, 줄기 세포, 기타 희귀 세포, 바이러스, 박테리아, 포르말린 고정 파라핀 임베디드(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded; FFPE), 정자, 혈액 세포, 상피 세포, DNA, 및 RNA로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
예를 들어, 제 1 유형의 입자(청구범위에 언급됨)는 종양 세포, 백혈구(WBC), 간질 세포, 정자, 순환 종양 세포(circulating tumor cell; CTC), 포자, 태아 세포, 리포좀, 엑소좀, 상피 세포, 적아세포, 영양막, 바이러스, 박테리아, 적혈구(및 이들의 조합)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 특정한 비제한적인 경우에, 제 1 유형의 입자는 순환 종양 세포(CTC)이다.
세포는 살아 있거나 고정되어 있을 수 있다.
달리 명시적으로 지정되지 않는 한, 현재 본문에서, 다음 용어는 아래에 표시된 의미를 갖는다.
강자성 입자(ferromagnetic particle)란 약 10 ㎛ 미만(유리하게는 약 1 ㎛ 미만, 특히 약 100 nm)의 가장 큰 치수를 갖는 미립자를 의미한다. 일부 바람직하지만 비제한적인 구현예에 따르면, 강자성 입자의 가장 큰 치수는 적어도 약 40nm(특히, 약 200nm까지)이다.
입자의 치수는 표준 모드에서 눈금 현미경 또는 눈금이 있는 슬라이드(입자가 침착되는)와 함께 사용되는 일반 현미경으로 측정할 수 있다.
현재 본문에서, 입자의 치수(dimensions of a particle)란 입자의 길이, 폭, 및 두께를 의미한다.
본 발명은 이의 비제한적 구현예를 예시하는 첨부된 도면을 참조하여 아래에서 설명된다:
- 도 1은 본 발명에 따른 시스템의 개략적인 측면도이고;
- 도 2는 명확성을 위해 일부 부품이 제거된 도 1의 시스템의 사시도이고;
- 도 3은 도 1의 시스템 상세의 정면도이고;
- 도 4는 도 3의 상세의 IV-IV선에 따른 단면이고;
- 도 5는 명확성을 위해 일부 부품이 제거된 도 3의 상세 정면도이고;
- 도 6은 도 5의 상세의 VI-VI선에 따른 단면이고;
- 도 7은 명확성을 위해 일부 부품이 제거된 도 3의 상세 정면도이고;
- 도 8은 도 7의 상세의 VIII-VIII 선에 따른 단면이고;
- 도 9는 도 3 및 도 7의 일부를 확대한 평면도이고;
- 도 10은 도 9 부분의 X-X 선을 따른 단면이고;
- 도 11은 이전 도면의 시스템의 가능한 사용 예를 개략적으로 예시하고;
- 도 12 내지 도 14는 이전 도면의 시스템 작동을 검증하기 위해 수행되는 테스트를 개략적으로 예시하고;
- 도 15는 본 발명에 따른 방법의 단계 동안 발생하는 상황을 개략적으로 예시한다.
도 1에서, 본 발명의 제 1 양태에 따르면, 참조 번호 1은 처리된 입자(treated particle; TP)를 포함하는 (특히, 생물학적 기원의) 처리된 샘플(TS)(도 15 참조)을 취급하기 위한 시스템 전체를 나타내며, 상기 처리된 입자 각각은 제 1 유형의 입자(CE) 및 상기 제 1 유형의 입자(CE)에 결합된 적어도 강자성 입자(FP)를 포함한다.
상기 시스템(1)은 처리 챔버(treatment chamber; 2)(특히, 도 4 및 도 6 참조); 처리된 샘플(TS)를 포함하도록 구성(설계)되고 처리 챔버(2)에 (적어도 부분적으로) 배열되고 적어도 하나의 측벽(4)(또한 도 7 및 도 8 참조), 바닥(5)(특히 바닥 벽(5)), 및 바닥(5) 반대편의 (단부)(개구(opening))(6)를 갖는 컨테이너(3)(특히, 시험관); 및 컨테이너(3)의 측벽(4)(특히 상기 측벽과 접촉하고 접촉을 유지하도록) 상에 처리된 입자(TP)의 적어도 일부를 이동시키기 위해 처리 챔버(2)의 적어도 일부에 적어도 자기장을 생성하도록 구성된(설계된) 자기 디바이스(7)를 포함한다.
보다 정확하게는 반드시 그런 것은 아니지만, 처리 챔버(2)는 일부 비제한적 구현예에 따라 자기 사중극자를 포함하는 자기 디바이스(7)의 일부이다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 자기 디바이스(7)는 적어도 하나의 전자석(특히, 4개의 전자석)을 포함한다.
대안적으로(또는 추가적으로), 자기 디바이스(7)는 적어도 하나의 영구 자석(특히, 4개의 영구 자석)을 포함한다.
반드시는 아니지만 유리하게는, 자기 디바이스(7)(특히, 각각의 전자석 및/또는 영구 자석)는 적어도 3000 가우스(특히, 적어도 4000가우스, 특히 7000가우스 이하, 보다 특히 자기장은 홀 효과 자기계에 의해 - 예를 들어 Hirst Magnetic Instruments Ltd.(테슬라 하우스, 트레고니지, 팰머스, 콘월)에 의해 인스트루먼트 GM70에 의해 측정될 수 있다)의 자기장을 (자기 디바이스의 표면-특히 축방향 대칭 점에)생성하도록 구성된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 컨테이너(3)(특히, 도 6 내지 도 8 참조)는 개구(6)가 배열되는 제 1 단부 및 제 1 단부와 대향하고 바닥(5)이 배열되는 제 2 단부를 갖는다. 특히, 측벽(4)은 제 2 단부 쪽으로(특히, 바닥(5) 쪽으로) 테이퍼진다.
일부 비제한적인 경우에는, 바닥(5)과 측벽(4) 사이에 중단이 없다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 컨테이너(3)는 실질적으로 원형(내부) 단면을 갖는다(특히, 측벽(4)은 컨테이너(3)의 종방향 연장 축선(A)에 대해 원형으로 연장된다).
시스템(1)은 컨테이너(3) 내부에 배열된 개방 단부(open end; 9)를 갖는 캐뉼라(cannula; 8); 컨테이너(3)의 영역에 실질적으로 고정된 방식으로 배열되고 캐뉼라(8)가 연장되는 통공(through hole; 11)(특히, 도 9 참조)을 갖는 정렬 디바이스(alignment device; 10); 및 처리된 샘플(TS)의 일부가 캐뉼라(8)를 통해 컨테이너(3) 외부로(처리 챔버(2)의 외부로) 운반되도록 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하도록 구성(설계)된 흡입 디바이스(suction device; 12)(도 1 및 2)를 더 포함한다.
특히, 캐뉼라(8)는 컨테이너(3)의 개구(6)를 통해 연장된다.
캐뉼라(8) 및 정렬 디바이스(10)(특히, 통공(11))는 (캐뉼라(8)가 - 적어도 부분적으로 - 컨테이너(3) 내부로 연장하고) 개방 단부(9)가 컨테이너(3)의 측벽(4)으로부터 분리된(이격된) 컨테이너(3) 내부에 배열되도록 구성된다.
이러한 방식으로, 캐뉼라(8)를 통해 흡입되는 처리된 입자(TP)의 가능성이 감소된다는 것이 실험적으로 관찰되었음을 주목해야 한다. 보다 정확하게는 정렬 디바이스(10)와 캐뉼라(8)의 구조 덕분에 이러한 결과가 얻어지는 것으로 관찰되었다. 이러한 경우, 복잡한 로봇 디바이스가 필요하지 않으며 작업자는 정렬 디바이스(10)(특히 통공(11)을 통해)를 통해 캐뉼라(8)를 처리 챔버(2)(보다 특히, 컨테이너(3) 내부에) 우수한 속도와 측벽(4)과 접촉하고 이에 따라 후속적으로 캐뉼라(8)를 통해 흡입될 수 있는 처리 입자(TP)의 이동을 유발하는 캐뉼라의 감소된 위험으로 삽입할 수 있다.
즉, 정렬 디바이스(10)(특히, 통공(11))는 의외로 캐뉼라(8)를 처리 챔버(2)에 삽입하기 위한 가이드 역할을 하여 작업자의 활동을 보다 빠르고 정확하게 만든다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 캐뉼라(8) 및 정렬 디바이스(10)(특히, 통공(11))는 캐뉼라(8)가 컨테이너(3)의 종방향 연장 축선(A)(특히 축선(A))에 실질적으로 평행하게 연장되도록 구성된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 개방 단부(9)가 바닥(5)과 접촉한다. 이러한 방식으로, 캐뉼라(8)의 수직 위치는 바닥 부분(5)의 지지에 의해 보장된다.
특히(예를 들어, 도 2, 도 4, 및 도 8 참조), 개방 단부(9)는 캐뉼라(8)의 종방향 연장부에 대해 대각선으로 연장된다(보다 특히, 단부(9)는 축선(A)에 대해 대각선으로 연장된다).
이와 같이, 단부(9)가 바닥(5)에 접한 경우에도, 유체는 단부(9)를 통과할 수 있다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 캐뉼라(8)는 제거 가능한 방식으로 통공(11)을 통해 연장된다. 즉, 캐뉼라(8)는 통공(11)을 통과하도록 함으로써 정렬 디바이스(10)(보다 정확하게는 컨테이너(3))에 삽입되거나 제거될 수 있다.
특히, 통공(11)은 사용시 캐뉼라(8)가 통공(11)을 통해 삽입되는 동안 캐뉼라(8)의 개방 단부(9)(특히 - 모두 - 캐뉼라(8))가 측벽(4)으로부터 이격되어 유지되도록 구성된다.
필수적이지는 않지만 유리하게는, 통공(9)은 특히 캐뉼라(8)의 종방향 연장부의 적어도 약 0.5 cm에 대해(특히 축선(A)에 평행) 캐뉼라(8) 주위로 연장되는(특히 캐뉼라(8)의 외부 표면과 접촉하는) 내부 표면을 갖는다.
추가로 또는 대안적으로, 통공의 내부 표면은 캐뉼라(8)의 폭(보다 정확하게는 직경)의 적어도 2.5배 동안 캐뉼라(8) 주위로 연장된다.
비제한적 구현예에 따르면, 통공(11)은 캐뉼라(8)의 폭(외경)보다 약 1 mm 미만(특히, 약 0.5 mm 미만; 특히, 약 0.3 mm 미만; 더욱 특히, 적어도 약 0.1 mm) 만큼 더 큰 폭(내경)을 갖는다.
일부 비제한적인 경우에, 통공(11)은 실질적으로 원형(특히, 실질적으로 일정한) 단면을 갖는다.
특히, 캐뉼라(8)는 통공(11)의 내부 표면과 캐뉼라(8)의 외부 표면 사이의 접촉으로 인해 실질적으로 제 위치에 유지된다. 특히, 위에서 더 잘 설명된 바와 같이, 캐뉼라(8)는 바닥(5)과의 접촉으로 인해 제 위치에서 실질적으로 수직으로 유지된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 캐뉼라(8)는 실질적으로 강성이다(즉, 사용 중(아래 설명된 방법 참조) 및/또는 통공(11)을 통해 삽입될 때 크게 변형되지 않음).
일부 바람직한 비제한적 구현예에 따르면, 캐뉼라(8)는 실질적으로 직선형이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 통공(11)은 실질적으로 직선이다.
특히, 캐뉼라(8) 및 통공(11)은 컨테이너(3)의 종방향 연장 방향으로(특히, 축선(A)에 평행한 - 보다 특히, 축선(A)을 따라) 연장된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 정렬 디바이스(10)는 컨테이너(3)의 개구(6)에 배열된다. 이러한 방식으로, 정렬 디바이스(10)(특히, 정렬 디바이스의 통공(11))는 캐뉼라(8)에 의해 보다 쉽게 접근될 수 있다(따라서 조작자에 의한 캐뉼라(8)의 컨테이너(3)로의 삽입이 용이해진다).
특히, 정렬 디바이스(10)는 개구(6)를 부분적으로 폐쇄한다(공기가 통과하지 않도록).
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 정렬 디바이스(10)는 제거 가능한 방식으로 컨테이너(3)(특히, 개구(6))에 배치된다. 이로써, 처리된 샘플(TS)(또는 처리될 샘플)을 컨테이너(3)에 보다 용이하게 삽입 및 제거될 수 있다.
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 정렬 디바이스(10)(특히, 통공(11)) 및 캐뉼라(8)는 캐뉼라(8)가 측벽(4)으로부터 분리(이격)되도록 배열되게 구성된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 시스템(1)(특히, 흡입 디바이스(12))은 유체 운반 방식(fluid-carrying manner)으로 캐뉼라(8)에 연결되고 처리 챔버(2)(및 컨테이너(3))외부에 배열되는 수집 챔버(13)(특히, 도 1 및 2 참조)를 포함한다. 흡입 디바이스(12)는 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하도록(설계되어) 구성되어 처리된 샘플(TS)의 전술한 부분이 캐뉼라(8)를 통해 수집 챔버(13)로 운반된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 처리된 샘플(TS)(생물학적 기원의)은 임의의 생물학적 액체를 포함한다(특히, 생물학적 액체이다).
반드시는 아니지만 유리하게는, 처리된 샘플(TS)은 혈액, 혈장, 타액, 소변, 액체 생검(liquid biopsy), 현탁액(재부유)의 (특히 조직의) 세포를 포함하는 면봉 및/또는 현탁액(재부유)의 세포 함유 배양 배지를 포함한다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 처리된 샘플(TS)는 혈액, 혈장, 타액, 소변, 및 이들의 조합을 포함한다(특히, 혈액, 혈장, 타액, 소변, 및 이들의 조합이다).
일부 특정한 비제한적인 경우에, 처리된 샘플(TS)는 혈액 및/또는 혈장(특히, 혈액)을 포함한다(특히 혈액 및/또는 혈장이다).
일부 비제한적 구현예에 따르면, 시스템(1)(특히, 흡입 디바이스(12))은 또한 캐뉼라(8)를 유체 운반 방식으로 수집 챔버(13)에 연결하는 덕트(duct; 14)를 포함한다.
반드시는 아니지만 유리하게는, 흡입 디바이스(12) 및 캐뉼라(8)(및 필요한 경우 덕트)는 (개방 단부(9)가 물에 잠겨 있을 때) 개방 단부(9)를 통한(캐뉼라(8)를 통한) 물 흐름 속도(water flow speed)를 약 30 mL/분 이하(보다 정확하게는 미만), 특히 약 15 mL/분 이하(보다 정확하게는 미만), 보다 특히 약 13 mL/분 이하(보다 정확하게는 미만)로 얻도록 구성된다.
이러한 방식으로 컨테이너(3)로부터 처리된 입자(TP)를 빼낼 위험이 더욱 감소된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 흡입 디바이스(12) 및 캐뉼라(8)(및 특히 상기 덕트(14))는 적어도 약 1 mL/분, 보다 특히, 적어도 약 3 mL/분, 훨씬 보다 특히, 적어도 약 4 mL/분의 (개방 단부가 물에 잠길 때) 개방 단부(9)를 통한(캐뉼라(8)를 통한) 물 흐름 속도를 얻도록 구성된다.
흐름 속도는 상온(및 외부 압력 1atm)에서 10 mL의 물을 흡입할 때 발생하는 평균 유속으로 계산된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 흡입 디바이스(12)(특히, 캐뉼라(8), 보다 특히 덕트(14))는 개방 단부(9)를 통한(캐뉼라(8)를 통한) 액체의 약 50 mL 이하(특히, 약 30 mL 이하; 보다 특히, 약 15 mL 이하)를 흡입하도록(설계) 구성된다.
추가로 또는 대안적으로, 흡입 디바이스(12)(및 특히, 수집 챔버(13))는 개방 단부(9)를 통해(캐뉼라(8)를 통해) 액체의 적어도 약 20μL(특히, 적어도 약 1 mL, 보다 특히, 적어도 약 3 mL)를 흡입하도록 구성(설계)된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 흡입 디바이스(12)는 연동 펌프, 진공 펌프, 주사기 펌프, 예압 스프링에 의해 작동되는 주사기 또는 중력에 의해 작동되는 주사기로 구성된 그룹으로부터 선택된 디바이스를 포함한다(특히, 디바이스이다).
일부 경우(도 1 및 2에 도시된 것과 같은), 흡입 디바이스(12)는 예압 스프링에 의해 작동되는 주사기를 포함한다(특히, 주사기이다).
특히(이러한 경우 - 도 2에 더 잘 도시된 바와 같이), 흡입 디바이스(12)는 수집 챔버(13), 피스톤(16)(수집 챔버(13) 내부에서 슬라이딩) 및 피스톤(16)에 움직임을 부여하여 결과적으로 수집 챔버(13) 내부에 함몰부를 생성하도록 구성(설계)된 스프링(17)이 제공되는 주사기(15)를 포함한다. 상기 함몰부는 컨테이너(3)로부터 처리된 샘플(TS)의 상기 언급된 부분을 흡입하도록 캐뉼라(8)(특히, 덕트(14)를 통해)로 전달된다.
특정하지만 비제한적인 일부 구현예에 따르면, 스프링(17)(원형이고)은 약 28-34 mm(특히, 약 31 mm)의 내경, 약 31-37 mm(특히, 약 34 mm)의 외경, 약 1.2~1.7 mm(특히 약 1.5 mm)의 직경, 및 약 100~115 mm(특히 약 107 mm)의 길이를 갖는 와이어를 갖는다.
특히, 스프링(17)은 스테인레스 강으로 제조된다.
경우에 따라, 스프링(17)은 약 220 N/m 내지 약 250 N/m(특히, 약 234 N/m)의 탄성 상수를 갖는다.
특히, 스프링(17)은 수집 챔버(13)의 제 1 단부(18)로부터 멀어지는 운동을 피스톤(16)에 부여하도록 구성(설계)된다.
특히, 덕트(14)는 제 1 단부(18)로부터 연장된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 흡입 디바이스(12)는 제 1 단부(18) 반대편에 있는 수집 챔버(13)의 제 2 단부(20)에 배열된 수집 챔버(13)의 플랜지와 일체로 장착되는 접합 요소(19)를 더 포함하여 스프링(17)의 단부에 대한 지지를 정의한다. 특히, 흡입 디바이스(12)는 또한 스프링(17)의 다른 단부에 대한 지지를 정의하기 위해 수집 챔버(13) 외부의 피스톤(16)의 일단과 일체로 장착된 제 2 인접 요소(21)를 포함한다.
접합 요소(19 및 21)에는 서로 링크된 접합 요소(19 및 21)를 유지하기 위해 서로 커플링(coupling)될 수 있는 그루브(22) 및 핀(31)이 제공된다.
특히, 사용 중에 작업자는 핀(31)이 각각의 그루브(22)에 들어갈 때까지 제 1 단부(18)를 향해 피스톤(16)을 밀 수 있다. 이 시점에서, 접합 요소(21)를 회전시킴으로써 접합 요소(19, 21) 사이의 커플링이 안정화되고 스프링(17)의 예압이 얻어진다.
이러한 방식으로, 적절한 경우, 작업자는 접합 요소(19)를 회전시킴으로써 전술한 바와 같이 피스톤(16)을 이동시킬 스프링(17)을 작동시킬 것이다.
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 컨테이너(3)는 약 55 mL 이하(특히, 약 30 mL 이하, 보다 특히, 약 17 mL 이하, 훨씬 보다 특히, 약 13 mL 이하, 특히, 적어도 약 100μL, 보다 특히, 적어도 약 1.5 mL, 훨씬 보다 특히, 적어도 약 8 mL)의 내부 부피를 갖는다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 캐뉼라(8)는 약 12 mm 이하(특히, 약 10 mm 이하; 특히, 약 1 mm 이하; 보다 특히 약 0.9 mm 이하)의 내부 직경을 갖는다. 특히, 캐뉼라(8)는 적어도 약 0.3 mm, 보다 특히 적어도 약 0.5 mm의 내부 직경을 갖는다.
추가로 또는 대안적으로, 덕트(14)는 약 12 mm 이하(특히, 약 10 mm 이하, 특히 약 1 mm 이하, 보다 특히 약 0.9 mm 이하)의 내경을 갖는다. 특히, 덕트(14)는 적어도 약 0.3 mm, 보다 특히 적어도 0.5 mm의 내부 직경을 갖는다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 적어도 하나의 (각각의) (-각각-처리된 입자(TP)의)강자성 입자(FP)는 (적어도) 항체에 의해 제 1 유형의 (각각의) 입자(CE)에 결합된다(해당 입자에 따라 다름). 예를 들어, 제 1 유형의 입자(CE)가 CTC인 경우, 항체는 상피 세포 접착 분자(Epithelial Cell Adhesion Molecule; EPCAM)에 (특히, 선택적으로) 결합된다.
특히 도 15를 참조하면, 반드시는 아니지만 유리하게는, 처리된 입자(TP)에서 여러 강자성 입자(FP)가 서로 결합되어 자기장에 대한 상기 처리된 입자(TP)의 반응을 증가시킨다. 예를 들어, 이를 위해, 데스티오비스틴(desthiobiotin; DTB)와 스트렙타비딘(Streptavidin; STR) 간의 상호 작용을 이용할 수 있다.
본 발명의 추가 양태에 따르면, 처리된 샘플(TS)(특히, 위에서 정의된 바와 같음)를 취급하기 위한 키트가 제공된다.
특히, 키트는 전술한 바와 같이 시스템(1)을 제공하도록 구성(설계)된다.
키트는: 처리 챔버(2)를 갖고 처리 챔버(2)에 자기장을 생성하도록 구성된(설계된) 자기 디바이스(7); 처리된 샘플(TS)을 수용하고 처리 챔버(2) 내부에 수용되도록(설계) 구성되고, 적어도 측벽(4), 바닥(5) 및 바닥(5) 반대편의 (단부) 개구(6)를 갖는 컨테이너(3); 및 개방 단부(9)를 갖는 캐뉼라(8)를 포함한다.
키트는 컨테이너(3)에 실질적으로 고정되는 방식으로(그러나, 특히, 조작자에 의해 제거 가능) 장착되도록 구성(설계)되고 캐뉼라(8)에 의해 맞물리고 실질적으로 고정된 위치에 캐뉼라(8)를 유지하도록 구성(설계)되고 캐뉼라(8)가 측벽(4)으로부터 이격되는 배향을 갖는 통공(11)을 갖는 정렬 디바이스(10); 및 처리된 샘플(TS)의 일부가 캐뉼라(8)를 통해 컨테이너(3) 및 처리 챔버(2) 밖으로 운반되도록 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하도록 구성된(설계된) 흡입 디바이스(12)를 포함한다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 키트는 유체 운반 방식으로 캐뉼라(8)와 흡입 디바이스(12)를 연결하도록 구성된(설계된) 덕트(14)를 포함한다.
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 정렬 디바이스(10)는 컨테이너(3)의 개구(6) 영역에 배열되도록 구성(설계)된다.
특히, 덕트(14)는 캐뉼라(8)와 결합하도록 구성된(설계된) 제 1 단부 및 흡입 디바이스(12)와 커플링되도록 구성된(설계된) 제 2 단부를 갖는다.
특히, 덕트(8)는 유연하다.
필수적이지는 않지만 유리하게는, 키트는 제 1 유형의 입자(CE)와 (특히, 선택적인 방식으로) 결합하도록 설계된(구성된) 강자성 입자(FP)를 포함한다.
특히, 강자성 입자에는 제 1 유형의 입자(CE)와 (보다 특히, 선택적인 방식으로) 결합하도록 구성된(설계된) 적어도 하나의 항체가 제공된다. 예를 들어, 제 1 유형의 입자(CE)가 CTC인 경우, 항체는 상피 세포 접착 분자(Epithelial Cell Adhesion Molecule; EPCAM)과 (특히, 선택적으로) 결합하도록 설계된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 키트는 일부 입자(특히, 제 1 유형의 입자(CE))를 (특히, 실질적으로 선택적으로) 마킹하기 위한 마커를 더 포함한다.
더 정확하지만 반드시 그런 것은 아니지만, 마커는(특히, 형광성이며) 하나이상의 주어진 파장(특히, 자외선)에서 방출한다.
반드시는 아니지만 유리하게는, 마커는 종양 세포(특히, CTC)에 대한 마커, 백혈구(WBC)에 대한 마커, 세포 핵에 대한 마커 및 이들의 조합(즉, 이들의 혼합물)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 비제한적 예에 따르면, 마커는 사이토케라틴(cytokeratin)(특히, 종양 세포를 표시하기 위한 것 - 보다 특히 CTC를 표시하기 위한 것), 특히 백혈구(WBC)를 표시하기 위한 CD45(PTPRC - 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 C), 특히 세포의 핵을 표시하기 위한 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌), 및 이들의 조합(즉, 이들의 혼합물)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 상기 언급된 키트의 다양한 구성요소는 시스템(1)과 관련하여 위에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 추가 양태에 따르면, 처리된 샘플(TS)를 취급하기 위한 취급 방법이 제공된다.
상기 방법은 예비 단계로서, 이 단계 동안 (생물학적 기원의) 처리된 샘플(이 처리된 입자(TP)를 포함하고, 처리된 입자 각각이 제 1 유형의 입자(CE) 및 제 1 유형의 입자(CE)에 결합된 적어도 하나의 강자성 입자(FP)를 포함하고, 적어도 하나의 측벽(4), 바닥(5) 및 바닥(5) 반대편의 (단부) 개구(6)를 갖는 컨테이너(3) 내부에 있는, 예비 단계; 삽입 단계로서, 상기 삽입 단계 동안 컨테이너(3)가 자기 디바이스(7)의 처리 챔버(2)에 삽입되는, 삽입 단계; 및 상기 예비단계에 후속하는 커플링 단계로서, 상기 커플링 단계 동안 통공(11)을 갖는 정렬 디바이스(10)가 컨테이너(3)에 안정적으로 커플링되는, 커플링 단계를 포함한다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 삽입 단계는 예비 단계에 후속한다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 예비 단계, 삽입 단계, 및 커플링 단계는 조작자에 의해(특히, 손으로) 수행된다.
이 방법은 커플링 단계에 후속하는 위치 설정 단계(positioning step)로서, 위치 설정 단계 동안 개방 단부(9)를 갖는 캐뉼라(8)가 개방 단부(9)가 측벽(4)으로부터 분리(이격)된 컨테이너(3) 내부에 배열되는 주어진 위치(특히, 바닥(5)과 접촉하도록)에 도달할 때가지 측벽(4)과 접촉하지 않고 통공(11)을 통하여 슬라이드하는, 위치 설정 단계; 삽입 단계에 후속하는 활성화 단계로서, 활성화 단계 동안 자기 디바이스(7)가 처리된 입자(TP)의 적어도 일부를 측벽(4)과 접촉하게 하는 자기장을 생성하는(특히, 생성하도록 작동되는). 활성화 단계; 및 위치 설정 단계 및 작동 단계에 후속하는 흡입 단계로서, 흡입 단계 동안 흡입 디바이스(12)가 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하여 처리된 샘플(TS)의 일부가 캐뉼라(8)를 통해 컨테이너(3) 밖으로 (및 상기 처리 챔버(2) 밖으로) 운반되어 처리된 입자(TP)의 적어도 일부를 컨테이너(3) 내부에(특히, 측벽(4)과 접촉하여) 남겨두는 흡입 단계를 더 포함한다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 위치 설정 단계(작동 단계) 및 흡입 단계는 조작자에 의해(특히, 손으로) 수행된다. 특히, 흡입 단계 동안 작업자는 흡입 디바이스(12)를 활성화한다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 상기 방법은 전술한 키트에 의해 구현된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 처리된 샘플(TS)은 제 2 유형의 입자(도시안됨)를 포함하고, 적어도 대부분은 흡입 단계 동안 캐뉼라(8)를 통해 컨테이너(3) 밖으로 운반된다.
특히, 강자성 입자(FP)는 제 1 유형의 입자(CE)에만 선택적으로 결합하고 제 2 유형의 입자에는 결합하지 않는다.
일부 비제한적인 경우에, 제 1 유형의 입자(CE)는 관심 대상이다(특히, 추가로 취급 및/또는 분석됨). 이러한 경우 특히 제 2 유형의 입자는 단순히 폐기된다.
대안적으로, 제 2 유형의 입자는 관심 대상이다(특히, 추가로 처리 및/또는 분석됨). 이러한 경우에, 특히 제 1 유형의 입자(CE)는 단순히 폐기된다.
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 적어도 하나의 (각각의) 강자성 입자(FP)(각각 처리된 입자(TP) 중 하나)는 (적어도) 하나의 항체에 의해 제 1 유형의 (각각의) 입자(CE)에 결합된다(해당 입자에 따라 다름).
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 방법은 또한 강자성 입자(FP)의 적어도 일부가 제 1 유형의 입자(CE)로부터 분리되는 디커플링 단계(decoupling step)를 포함한다. 이러한 경우, 예를 들어 데스티오비오틴(DTB)와 스트렙타비딘(STR) 사이의 상호 작용이 활용된 경우 비오틴을 사용할 수 있다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 처리된 샘플(TS)은 제 1 유형의 입자(CE)와 다른 추가 유형의 입자를 포함한다. 이러한 경우에, 상기 방법은 특히 마킹 단계로서, 상기 마킹 단계 동안, 마커는 실질적으로 선택적인 방식으로(특히 추가 유형의 입자에 대해) 제 1 유형의 입자(CE)와 또는 실질적으로 선택적인 방식으로(특히, 제 1 유형의 입자(CE)에 대해) 추가 유형의 입자와 결합한다. 마커는 제 1 유형의 입자(CE)와 추가 유형의 입자 사이의 구별을 향상시킨다.
예를 들어, 마커는 하나 이상의 주어진 파장(특히, 자외선)을 갖는 형광 분자(fluorescent molecule)를 포함한다.
특히, 마커는 제 1 유형의 입자(CE) 또는 추가 유형의 입자와 선택적으로 결합하도록 설계된 항체를 포함한다. 보다 구체적으로, 마커는 (각각) (적어도) 항체(제 1 유형의 입자(CE) 또는 추가 유형의 입자와 선택적으로 결합하도록 설계됨) 및 (적어도) 형광단으로 이루어지는 분자(이다)를 포함한다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 마커는 종양 세포(특히, CTC)에 대한 마커, 백혈구(WBC)에 대한 마커, 세포 핵에 대한 마커 및 이들의 조합(즉 이들의 혼합물)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 비제한적 예에 따르면, 마커는 사이토케라틴(특히, 종양 세포 표시용), 특히 백혈구(WBC) 표시용 CD45(PTPRC - 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 C), 특히 핵이 있는 세포 표시용 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌), 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 마킹 단계는 흡입 단계에 후속한다.
특히, 마킹 단계 동안, 마커를 포함하는 용액이 컨테이너(3)에 배치된다(컨테이너 내부에 처리된 입자(TP)가 배열됨 - 보다 정확하게는 처리된 샘플(TS)이 배열됨).
반드시는 아니지만 유리하게는, 마커를 포함하는 용액이 컨테이너(3)에 배치되는 동안, 처리된 입자(TP)는 자기 디바이스(7)에 의해 생성된 자기장 덕분에 측벽(4)과 접촉을 유지한다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 마킹 단계 동안, 상기 언급된 마커는 실질적으로 선택적인 방식으로(특히, 추가 유형의 입자에 대해) 제 1 유형의 입자(CE)와 결합하고 추가 마커(상기 언급된 마커와 상이함)는 추가 유형의 입자와 실질적으로 선택적인 방식으로(특히, 제 1 유형의 입자(CE)에 대해) 결합한다.
이러한 경우에, 특히 추가 마커는 제 1 유형의 입자(CE)와 선택적으로 결합하도록 설계된 항체를 포함한다. 보다 구체적으로, 추가 마커는 (각각) 항체(제 1 유형의 입자(CE)와 선택적으로 결합하도록 설계됨) 및 (적어도) 형광단으로 (각각) 구성된 분자(이다)를 포함한다. 또한, 추가 마커는 추가 유형의 입자와 선택적으로 결합하도록 설계된 항체를 포함한다. 보다 구체적으로, 추가 마커는 (적어도) 항체(추가 유형의 입자와 선택적으로 결합하도록 설계됨) 및 (적어도) 추가 형광단으로 구성된 분자(이다)를 포함한다.
일부 비제한적 예에 따르면, 추가 마커는 사이토케라틴(특히 종양 세포 표시용), 특히 백혈구 세포(WBC) 표시용 CD45(PTPRC - 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 C), 특히 핵을 구비한 세포의 표시용 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌), 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 마킹 단계는 투과의 하위 단계를 더 포함하고, 상기 투과의 하위 단계 동안, 제 1 유형(또는 추가 유형)의 입자(CE)의 외부 (세포) 막의 투과성이 증가되어 마커(또는 추가 마커)가 제 1 유형(또는 추가 유형)의 입자(CE)의 내부로 들어가는 것을 허용한다.
일부 비제한적인 변형예에 따르면, 적절한 시약을 사용하여 멤브레인의 투과성 증가를 얻을 수 있다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 상기 방법은 마킹 단계 이후 또는 이전(또는 동시에)(특히, 활성화 단계 이전) 고정 단계를 포함한다. 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로, 고정 단계는 예비 단계 이후에 있다.
일부 비제한적 변형에 따라, 고정은 적절한 시약을 사용하여 얻어진다.
반드시는 아니지만 유리하게는, 상기 방법은 (적어도 부분적으로) 마킹 단계에 후속하는 제거 단계도 포함하고, 상기 제거 단계 동안 마커를 함유하는 용액의 적어도 일부가 컨테이너(3)로부터 제거된다.
특히, 제거 단계 동안, 처리된 입자(TP)는 자기 디바이스(7)에 의해 생성된 자기장 덕분에 측벽(4)과 접촉을 유지한다.
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 상기 방법은 또한 (적어도 부분적으로) 제거 단계에 후속하는 세척 단계를 포함하고, 상기 세척 단계 동안 완충액이 컨테이너(3)에 삽입되고, 이어서 적어도 부분적으로 제거된다.
특히, 세척 단계 동안, 처리된 입자(TP)는 자기 디바이스(7)에 의해 생성된 자기장 덕분에 측벽(4)과 접촉을 유지한다.
일부 비제한적 변형에 따르면, 추가 유형의 입자는 제 2 유형의 입자의 일부이다(예를 들어, 흡입 단계 후 컨테이너(3) 내부에 남음). 대안적으로, 추가 유형의 입자는 제 2 유형의 입자와 상이하다.
본 발명의 추가 양태에 따르면, 제 1 유형(예를 들어, CTC)의 입자(CE)를 포함하는 (생물학적 기원의) 초기 샘플을 취급하기 위한 공정이 제공된다. 상기 공정은 처리 단계; 및 전술한 바와 같은 취급 방법을 포함하고, 상기 처리 단계 동안 제 1 유형의 입자(CE)와 선택적으로 결합할 수 있는 강자성 입자(FP)가 제 1 유형의 입자(CE)와 조합되어 처리된 입자(TP)를 포함하는 처리된 샘플(TS)을 얻고, 처리된 입자 각각은 제 1 유형의 입자(CE) 및 제 1 유형의 입자(CE)에 결합된 적어도 강자성 입자(FP)를 포함한다.
일부 비제한적인 구현예에 따르면, 강자성 입자(FP)에는 제 1 유형의 입자(CE)와 (특히, 선택적인 방식으로) 결합하도록 구성된(설계된) 적어도 하나의 항체가 제공된다. 특히, 처리 단계 동안 강자성 입자(FP)는 인용된 항체에 의해 제 1 유형의 각각의 입자(CE)와 결합한다.
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 처리 단계가 예비 단계에 선행한다. 특히, 처리 단계 동안 강자성 입자(FP)는 입자(CE)가 배열된(특히, 초기 샘플이 배열된) 컨테이너(3) 내부에 삽입된다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, (생물학적 기원의) 초기 샘플은 임의의 생물학적 액체를 포함한다(특히 임의의 생물학적 액체이다).
반드시 그런 것은 아니지만 유리하게는, 초기 샘플은 (특히) 혈액, 혈장, 타액, 소변, 액체 생검, 현탁(재현탁)된 세포(특히, 조직의)를 포함하는 완충액 및/또는 현탁(재현탁)된 세포(특히, 조직)를 포함하는 배양 배지(특히 이다)를 포함한다.
일부 비제한적 구현예에 따르면, 초기 샘플은 혈액, 혈장, 타액, 소변 및 이들의 조합(특히 이다)을 포함한다.
일부 특정한 비제한적인 경우에, 초기 샘플은 혈액 및/또는 혈장(특히, 혈액)(특히 이다)을 포함한다.
반드시는 아니지만 유리하게는, 공정은 또한 처리 단계 전(특히, 예비 단계 전)인 제거 단계를 포함하고, 상기 제거 단계 동안 초기 샘플(초기 샘플에 포함된 혈장)의 적어도 대부분이 제 1 유형의 입자(CE)로부터 제거되고 분리된다(컨테이너(3)로부터). 특히 0.5 내지 1 mL의 혈장이 컨테이너(3) 내부에 남게 된다.
도 11은 상술된 공정의 비제한적 예를 개략적으로 예시하고, 여기에는 초기 샘플(혈액)에 완충액을 첨가하여 원심분리(혈장 분리)하고(A); 희석된 혈장이 제거되고(B); 강자성 입자(FP)(및 추가 완충제)를 첨가하여(C) 처리된 입자(TP)를 포함하는 처리된 샘플(TS)를 얻고; 처리된 입자를 컨테이너(3)의 측벽(4)으로 운반하기 위해 자기장(D)이 인가되고; (마킹되지 않은 세포를 포함하는) 처리된 샘플(TS)의 일부가 제거되고(F); 처리된 입자(TP)는 세척되고(G); 염료 시약은 처리된 입자(TP)(H)에 첨가되며, 자기장의 새로운 인가 후에 다시 세척되고(I); 처리된 입자(TP)는 작은 부피(L)로 재현탁되고 분석 및/또는 계수 디바이스에 로드된다.
상기에 따라, 본 발명의 요지는 간단하고 신속하며 저렴한 방식으로 관심 입자(특히, 세포)의 농축(및 마킹) 및 음성 입자(특히, 세포)의 제거를 허용한다(관심 있는 입자를 포함하는 양의 샘플 분획과 음의 입자가 있는 음의 분획을 모두 사용할 수 있다).
얻은 결과는 분석/분류 시스템/디바이스(예를 들어 동일한 출원인이 생산한 DEPArrayTM 디바이스 이전) 또는 세포 배양, 유전자 분석, 계수, 세포 측정 등을 위한 재료를 준비하는 데 사용할 수 있다.
달리 명시적으로 표시되지 않는 한, 본문에 인용된 참고문헌(논문, 서적, 특허 출원 등)의 내용은 모두 여기에 언급된다. 특히 언급된 참고문헌은 인용에 의해 본원에 포함된다.
본 발명의 추가 특징은 단지 예시적이고 비제한적인 실시예의 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
실시예 1
이 실시예는 수행된 일부 실험 테스트의 결과를 설명한다.
본 발명의 요지가 테스트되고 현재 시장에 나와 있는 완전 자동화 시스템(상기 시스템은 CellSearchTM이라함)으로 얻은 결과와 비교 테스트를 수행하였다.
특히 도 12를 참조하여, 완충 용액에 현탁된 상피 세포 샘플에서 시작하여 테스트를 수행하였다. 결과는 아래 표 1에 나와 있다.
CM CS1 CS2
테스트 횟수 11 2 12
유입 시 제 1 색상으로 표시된 샘플의 평균 유형 1088 1088 1108
유입 시 제 2 색상으로 표시된 샘플의 평균 유형 50 50 57
유출 시 제 1 색상으로 표시된 샘플의 평균 유형 899 (82.6%) 985 (90.5%) 968 (87.4%)
유출 시 제 2 색상으로 표시된 샘플의 평균 유형 45.8 (91.6%) 45 (90%) 54.8 (96.2%)
유출시 제 1 색상으로 표시된 샘플의 평균의 S.D. 16.60% 1.90% 2.60%
유출시 제 2 색상으로 표시된 샘플의 평균의 S.D. 29% 14.10% 14.80%
위의 표 1에서 CM은 본 발명에 따른 시스템(1)으로 얻은 결과를 나타내고; CS1 및 CS2는 현재 시장에 나와 있는 완전히 자동화된 시스템(CellSearchTM)의 두 가지 다른 버전으로 얻은 결과를 나타내고; S.D.는 표준 편차를 나타낸다.
도 12에서, 참조 번호 23은 세포 계수기(특히, Celltracks Analyzer II®)를 나타낸다.
특히 도 13을 참조하여, 건강한 기증자로부터 채취한 혈액(BL)에서 얻은 샘플에서 시작하여 종양 세포(PC3-9)가 추가된 테스트를 수행하였다. 결과는 아래 표 2에 나와 있다.
CM CS1
테스트 횟수 8 8
유입시 PC3-9의 개수 1087 1087
유출시 PC3-9 평균 45.85% 42.04%
유출시 S.D.PC3-9 평균 7.44% 3.41%
상기 표 2에서 CM은 본 발명에 따른 시스템(1)으로 얻은 결과를 나타낸다.
도 13에서, 참조 번호 23은 세포 계수기(특히, Celltracks Analyzer II®)를 나타내고, 참조 번호 24는 현재 시장에 나와 있는 상기 완전 자동화 시스템(CELLTRACKS® AUTOPREP® System)을 나타낸다.
특히 도 14를 참조하여, 건강한 기증자로부터 채취한 혈액(BL)에서 얻은 샘플에서 시작하여 테스트를 수행했으며 여기에 종양 세포(SKBr3)가 추가되었다. 결과는 아래 표 3에 나와 있다.
CM CS1
테스트 횟수 15 15
유입시 샘플의 개수 542개를 구비한 13 테스트,
2168개를 구비한 2 테스트		 542개를 구비한 13 테스트,
2168개를 구비한 2 테스트
유출시 평균 샘플 51.67% 61.25%
유출시 S.D. 평균 샘플 10.69% 15.67%
상기 표 3에서 CM은 본 발명에 따른 시스템(1)으로 얻은 결과를 나타내고; CS1은 현재 시장에 나와 있는 완전히 자동화된 시스템(CellSearchTM)으로 얻은 결과를 나타내고; S.D.는 표준 편차를 나타낸다.
위의 표 1과 3에 표시된 이벤트는 단일 SKBr3 또는 SKBr3 클러스터(응집 경향이 있음)를 나타낸다.
도 13 및 도 14에서, 참조 번호 23은 세포 계수기(특히, Celltracks Analyzer II®)를 나타내고; 참조 번호 24는 현재 시장에 나와 있는 상기 완전 자동화 시스템을 나타내고; 참조 번호 25는 세척 시스템(특히, 15 ml 시험관 및 1.5 ml PCR 시험관용 원심분리기: 임의 공급자)을 나타내고; 참조 번호 26은 부피 감소를 위한 시스템을 나타내고(특히, Menarini Silicon Biosystems의 VRNxTTM이 사용됨); 참조 번호 27은 상품명 DEPArrayTM로 알려진 분류 디바이스를 나타낸다.
상기 실험 데이터로부터 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 요지는 확실히 더 낮은 비용과 복잡성에도 불구하고 비교 가능한 정밀도를 가졌고 어떤 경우에는 현재 시장에 나와 있는 자동화 시스템보다 더 높았다.
수행된 테스트에서, 다음이 사용되었다:
0.03%의 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하고 0.05%에서 ProClin 300을 보존하는 완충액에서 상피 세포에 존재하는 세포 표면 마커 EpCAM에 특이적인 마우스 단클론 항체에 결합된 자성 입자의 0.022% 현탁액을 함유하는 항-EpCAM 자성유체.
0.1% 아지드화나트륨이 포함된 희석 완충액.
다음 절차(방법의 비제한적인 실시예를 나타냄)를 따랐다. 7.5 ml의 혈액을 시험관에 옮기고 6.5 ml의 완충액으로 희석한 후 교반하고 약 10분간 원심분리하였다(약 800g에서). 혈장(상청액)을 피펫으로 제거하고 약 0.5-1 ml를 남기고 약 6 ml의 희석 완충액을 첨가하였다.
시험관의 짧은 교반 후, 포획을 개선하기 위해 150μl의 시약(제어된 철유체 응집을 위한 0.02% 시약, 0.5% BSA, 완충액 내 아지드화나트륨 0.1%) 및 위에서 언급한 자성유체(150μl)를 첨가하였다.
짧은 교반 후, 시험관을 자기 디바이스(7)(도 1 내지 도 10)의 처리 챔버(2)에 10분 동안 두었다.
추가 교반(챔버로부터 시험관 제거와 함께) 및 약 20분 동안 처리 챔버(2)에 고정된 체류 후, 흡입 디바이스(12)를 장착하고 작동시켜(시험관을 자기 디바이스(7) 내부에 유지함) 음의 분획을 흡입하였다.
얻어진 샘플을 유사한 방법에 따라 자기 디바이스(7)를 사용하여 희석 완충액으로 세척하였다.
형광 이미지를 통해 표적 세포를 인식할 수 있도록, 샘플을 투과성 시약, 염료 시약(피코에리트린(phycoerythrin; PE)에 결합된 사이토케라틴에 특이적인 마우스 단일클론 항체 및 알로피코시아닌(allophycocyanin; APC)에 결합된 마우스 단일클론 항체 항-CD45 포함) 및 핵산용 염료(4 '6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드 (DAPI) 함유) 로 추가 처리하여, 시약의 혼합이 가능하도록 샘플을 재현탁하고 암실에서 20분 동안 주변 온도에서 배양한다.
샘플은 2 ml의 희석 완충액으로 희석하여 세척되었고, 흡입 디바이스(12)에 의해 흡입이 수행되기 전에 약 15분 동안 자기 디바이스(7)에 시험관을 유지하였다. 마지막으로, 샘플은 세포 고정액에 의해 고정되고 최종 부피에서 재현탁되었다.
DEPArrayTM 및 CellSearchTM는 각각의 제조업체 지침에 따라 사용되었다.
DEPArrayTM으로 처리된 샘플은 최종 부피에 재현탁되기 전에 추가 완충액으로 세척되었다.

Claims (18)

  1. 제 1 유형의 입자(CE) 및 상기 제 1 유형의 입자(CE)에 결합된 적어도 하나의 강자성 입자(ferromagnetic particle; FP)를 각각 포함하는 처리된 입자(treated particle; TP)를 포함하는 처리된 샘플(TS)을 취급하기 위한 시스템으로서,
    상기 시스템(1)은 처리 챔버(treatment chamber; 2); 상기 처리된 샘플(TS)을 포함하도록 구성되고 상기 처리 챔버(2) 내에 적어도 부분적으로 배치되고, 적어도 측벽(4), 바닥(5), 및 상기 바닥(5) 반대편의 개구(opening; 6)를 가지는, 컨테이너(3); 처리된 입자(TP)의 적어도 일부를 상기 컨테이너(3)의 측벽(4) 상으로 이동시키기 위해 상기 처리 챔버(2)의 적어도 일부에 적어도 하나의 자기장을 생성하도록 구성된, 자기 디바이스(7); 상기 컨테이너(3) 내부에 배치된 개방 단부(open end; 9)를 갖는 캐뉼라(cannula; 8); 상기 컨테이너(3)의 영역에 실질적으로 고정된 방식으로 배치되고 상기 캐뉼라(8)가 관통하여 연장하는 통공(through hole; 11)을 갖는 정렬 디바이스(alignment device; 10); 및 상기 처리된 샘플(TS)의 일부가 상기 캐뉼라(8)를 통해 상기 컨테이너(3) 밖으로 운반되도록 상기 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하도록 구성된, 흡입 디바이스(suction device; 12);를 포함하고,
    상기 캐뉼라(8) 및 상기 정렬 디바이스(10)(특히, 상기 통공)는 상기 개방 단부(9)가 상기 컨테이어(3)의 상기 측벽(4)으로부터 이격된 상기 컨테이너(3) 내부에 배치되도록 구성되는, 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 정렬 디바이스(10)는 상기 컨테이너(3)의 상기 개구(6) 영역에 배치되고; 상기 정렬 디바이스(10)(특히, 상기 통공) 및 상기 캐뉼라(8)는 상기 캐뉼라(8)가 측벽(4)으로부터 이격되도록 구성되는, 시스템.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 정렬 디바이스(10)는 제거 가능한 방식으로 상기 컨테이너(3)의 영역(특히, 상기 컨테이너의 상기 개구(6)의 영역)에 배치되고; 상기 캐뉼라(8)는 제거 가능한 방식으로 상기 통공(11)을 통해 연장되고; 상기 통공(11)은 사용시 상기 캐뉼라(8)가 상기 통공(11)을 통해 삽입되는 동안 상기 캐뉼라(8)의 상기 개방 단부(9)(특히, 상기 캐뉼라)가 상기 측벽(4)으로부터 일정한 거리를 유지하도록 구성되고; 특히, 상기 캐뉼라(8)는 실질적으로 강성인, 시스템.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캐뉼라(8)에 유체 운반 방식(fluid-carrying manner)으로 연결되고 상기 처리 챔버(2)의 외부에 배치되는 수집 챔버(13)를 포함하고; 상기 흡입 디바이스(12)는 상기 처리된 샘플(TS)의 상기 부분이 상기 캐뉼라(8)를 통해 상기 수집 챔버(13)로 운반되도록 상기 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하도록 구성되고; 특히, 상기 시스템(1)은 또한 유체 운반 방식으로 상기 캐뉼라(8)를 상기 수집 챔버(13)에 연결하는 덕트(duct; 14)를 포함하는, 시스템.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 흡입 디바이스(12) 및 상기 캐뉼라(8)(및, 특히 상기 덕트)는 약 30 mL/분 이하, 특히 약 15 mL/분 이하로 상기 개구 단부(9)를 통한 물 흐름 속도(water flow speed)를 얻도록 구성되고; 특히, 상기 흡입 디바이스(12) 및 상기 캐뉼라(8)(및 특히 상기 덕트)는 적어도 약 1 mL/분, 보다 특히, 적어도 약 4 mL/분의 개방 단부(9)를 통한 물 흐름 속도를 얻도록 구성되는, 시스템.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 흡입 디바이스(12)(및, 특히 상기 수집 챔버(13); 보다 특히, 상기 캐뉼라(8); 및 보다 특히 상기 덕트)는 상기 개방 단부(9)를 통해 약 50 mL 이하(특히, 약 30 mL 이하)의 액체를 흡입하도록 구성되고; 특히, 상기 처리 챔버(2) 및 상기 컨테이너(3) 각각은 약 55 mL 이하(특히, 약 13 mL 이하)의 내부 부피를 갖는, 시스템.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 통공(11)은 상기 캐뉼라(8)의 종방향 연장부의 적어도 약 0.5 cm를 따라 상기 캐뉼라(8) 주위로 연장되는 내부 표면을 갖는, 시스템.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캐뉼라(8)는 실질적으로 직선이고; 상기 통공(11)은 실질적으로 직선인, 시스템.
  9. 처리된 샘플(TS)을 취급하기 위한 키트(kit)로서;
    상기 키트는 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 시스템(1)을 얻도록 구성되고; 상기 키트는:
    처리 챔버(2)를 갖고 상기 처리 챔버(2)에서 자기장을 생성하도록 구성된 자기 디바이스(7);
    상기 처리된 샘플(TS)을 포함하고 상기 처리 챔버(2) 내부에 수용되도록 구성되고 적어도 측벽(4), 바닥(5), 및 상기 바닥(5) 반대편의 개구(6)를 갖는, 컨테이너(3);
    개방 단부(9)를 갖는 캐뉼라(8);
    상기 컨테이너(3)의 영역에 실질적으로 고정된 방식으로 장착되도록 구성되고 상기 캐뉼라(8)와 맞물리도록 그리고 캐뉼라(8)가 실질적으로 고정된 위치에 있고 실질적으로 고정된 배향을 가지며 상기 캐뉼라(8)가 상기 컨테이너(3)의 상기 측벽(4)으로부터 이격되도록 구성된 통공(11)을 갖는 정렬 디바이스(10); 및
    상기 처리된 샘플(TS)의 일부가 상기 캐뉼라(8)를 통해 상기 컨테이너(3) 외부로 운반되도록 상기 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하도록 구성된 흡입 디바이스(12)를 포함하는, 키트.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 캐뉼라(8)와 상기 흡입 디바이스(12)를 유체 운반 방식으로 연결하도록 구성된 덕트(14)를 포함하고; 상기 정렬 디바이스(10)는 상기 컨테이너(3)의 상기 개구(6) 영역에 배치되도록 구성되며; 특히, 상기 덕트(14)는 상기 캐뉼라(8)에 결합되도록 구성된 제 1 단부 및 상기 흡입 디바이스(12)에 결합되도록 구성된 제 2 단부를 갖고; 특히, 상기 덕트(14)는 유연한, 키트.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 캐뉼라(8)는 약 12 mm 이하, 특히 약 1 cm 이하의 내경을 갖고; 특히, 상기 캐뉼라(8)는 적어도 약 0.3 mm , 보다 특히 적어도 약 0.5 mm의 내경을 갖는, 키트.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 유형의 입자(CE)에 결합하도록 구성된 적어도 하나의 항체가 제공되는 강자성 입자(FP)를 포함하고;
    상기 키트는 종양 세포(특히, CTC)에 대한 마커, 백혈구(WBC)에 대한 마커, 세포 핵에 대한 마커, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 더 포함하고; 특히, 상기 마커는 사이토케라틴, CD45(PTPRC - 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 C), DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커를 더 포함하는, 키트.
  13. 처리된 샘플(TS)을 취급하는 방법으로서,
    예비 단계로서, 상기 예비 단계 동안, 각각이 제 1 유형의 입자(CE) 및 상기 제 1 유형의 입자(CE)에 결합된 적어도 하나의 강자성 입자(FP)를 포함하는, 처리된 입자(TP)를 포함하는 처리된 샘플(TS)이 적어도 측벽(4), 바닥(5) 및 상기 바닥(5) 반대편의 개구(6)를 갖는 컨테이너(3) 내에 있는, 예비 단계;
    삽입 단계로서, 상기 삽입 단계 동안, 상기 컨테이너(3)가 자기 디바이스(7)의 처리 챔버(2)에 삽입되는, 삽입 단계;
    상기 예비단계에 후속하는 커플링 단계(coupling step)로서, 상기 커플링 단계 동안, 통공(11)을 갖는 정렬 디바이스(10)가 상기 컨테이너(3)에 안정적 방식으로 커플링되는, 커플링 단계;
    상기 커플링 단계에 후속하는 위치 설정 단계(positioning step)로서, 상기 위치 설정 단계 동안, 개방 단부(9)를 갖는 캐뉼라(8)가 주어진 위치에 도달할 때까지 상기 측벽(4)을 접촉하지 않고 상기 통공(11)을 통과하도록 하고, 상기 개방 단부(9)가 상기 컨테이너(3)의 상기 측벽(4)과 분리된 상기 컨테이너(3) 내부에 배치되는, 위치 설정 단계;
    상기 삽입 단계에 후속하는 활성화 단계로서, 상기 활성화 단계 동안 상기 자기 디바이스(7)가 자기장을 생성하여 상기 처리된 입자(TP)의 적어도 일부가 상기 측벽(4)과 접촉하게 하는, 활성화 단계; 및
    상기 위치 설정 단계 및 상기 활성화 단계에 후속하는 흡입 단계로서, 상기 흡입 단계 동안 흡입 디바이스(12)가 상기 캐뉼라(8) 내부에 함몰부를 생성하여 상기 처리된 샘플(TS)의 일부가 상기 캐뉼라(8)를 통해 상기 컨테이너(3)의 외부로 운반되어 상기 처리된 입자(PT)의 적어도 일부를 상기 컨테이너 내부에 남기는, 흡입 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 키트에 의해 구현되고,
    특히, 상기 처리된 샘플(TS)은 제 2 유형의 입자를 포함하고, 적어도 주요 부분은 상기 흡입 단계 동안 상기 캐뉼라(8)를 통해 상기 컨테이너(3) 외부로 운반되고; 특히, 제 1 유형의 입자(CE)는 순환 종양 세포(circulating tumor cell)인, 방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    상기 제 1 유형의 입자(CE)는 CTC, 순환 내피 세포(Circulating Endothelial Cells; CEC), 순환 흑색종 세포(Circulating Melanoma Cells; CMC), 순환 다발성 골수종 세포(Circulating Multiple Myeloma Cells; CMMC), 종양 유래 엑스트라 소포(tumor derived Extra Vescicles; tdEV), 엑소좀, 태아 세포, 줄기 세포, 기타 희귀 세포, 바이러스, 박테리아, 포르말린 고정 파라핀 임베디드(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded; FFPE), 정자, 혈액 세포, 상피 세포, DNA, RNA, 및 미세구로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 처리된 샘플(TS)이 제 1 유형의 입자(CE)와 상이한 추가 유형의 입자를 포함하고;
    상기 방법은 마킹 단계를 포함하고, 상기 마킹 단계 동안, 마커는 제 1 유형의 입자(CE)에 선택적인 방식으로(특히, 추가 유형의 입자에 대해) 또는 선택적인 방식으로(특히, 추가 유형의 입자(CE)에 대해) 상기 추가 유형의 입자에 결합되고; 예를 들어, 상기 마커는 하나 이상의 주어진 파장을 가진 형광 분자(fluorescent molecule)를 포함하는, 방법.
  17. 제 1 유형의 입자(CE)를 포함하는 초기 샘플을 취급하는 공정(process)로서,
    처리 단계; 및 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 포함하고,
    상기 처리 단계 동안, 제 1 유형의 입자(CE)에 선택적으로 결합할 수 있는 강자성 입자(FP)가 제 1 유형의 입자(CE)와 혼합되어, 각각이 제 1 유형의 입자(CE) 및 상기 제 1 유형의 입자(CE)에 결합된 적어도 하나의 강자성 입자(FP)를 포함하는, 처리된 입자(TP)를 포함하는 처리된 샘플(TS)을 얻는, 공정.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 초기 샘플이 혈액, 혈장, 타액, 소변, 액체 생검(liquid biopsy), 현탁액에 세포를 함유하는 면봉, 현탁액에 세포를 함유하는 배양 배지, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 생물학적 액체를 포함하고; 특히, 상기 공정은 또한 상기 처리 단계 전에 제거 단계를 포함하고, 상기 제거 단계 동안 상기 초기 샘플의 적어도 대부분이 제거되고 제 1 유형의 입자(CE)로부터 분리되는, 공정.
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