KR20230088872A

KR20230088872A - 에피제닌을 포함하는 피부 보호용 조성물

Info

Publication number: KR20230088872A
Application number: KR1020230066354A
Authority: KR
Inventors: 박영진; 박채훤; 민선영; 유혜원
Original assignee: 주식회사 포러스젠
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2023-05-23
Publication date: 2023-06-20
Also published as: KR20220011874A

Abstract

본 발명은 에피제닌 (apigenin)을 포함하는 항염증, 항알러지 또는 피부 장벽 보호 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 에피제닌은 산화질소 억제 효과 이외에 β-hexosaminidase 내지 염증성 사이토카인, MAPK 및 알러지 신호 분자의 수준을 우수하게 억제하고, 피부 화학적 장벽 방벽 및 화학적 장벽 수준을 우수하게 증가시키므로, 항염증, 항알러지 또는 피부 장벽 보호 내지 염증성 질환 또는 피부 장벽 보호 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서 효과적으로 제공될 수 있다.

Description

에피제닌을 포함하는 피부 보호용 조성물{Composition for skin-protective comprising apigenin}

본 발명은 에피제닌 (apigenin)을 포함하는 항염증 (anti-inflammatory), 항알러지 (anti-allergic) 또는 피부 보호 (skin-protective) 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다.

염증 (inflammation)은 조직의 손상, 외부의 자극 또는 다양한 감염원에 대한 생체조직의 방어기작 중 하나로, 외부로부터 유입된 유해물질이나 유기체 등 다양한 요인에 의해 세포나 조직이 손상을 입거나 파괴되었을 때, 이를 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키기 위해 국소적으로 일어나는 면역반응이다. 즉, 염증반응은 생체를 보호하고 조직 손상으로 생성된 산물들을 제거하는데 유용한 방어기작이다.

체내에서의 염증반응 진행은 COX (cyclooxygenase) 효소 활성과 관련된 것으로 알려져 있다. COX 효소는 생체 내에 존재하는 프로스타글란딘 (prostaglandin)의 생합성에 관련하는 주 효소로서, 두 종류의 이성 효소인 COX-1과 COX-2가 존재하는 것으로 알려져 있다. COX-1은 위나 신장과 같은 조직에 일정 수준으로 존재하면서 항상성을 유지하는데 관여하는 반면, COX-2는 염증이나 기타 면역 반응 시 세포분열인자 (mitogen) 또는 사이토카인 (cytokines)에 의해 세포 내에서 일시적이고 빠르게 발현되는 효소이다.

또 하나의 강력한 염증 매개물질인 산화질소 (NO, Nitric Oxide)는 일산화질소 합성효소 (NOS)에 의해 L-알지닌으로부터 생성되며, 자외선 (UV)과 같은 외부 스트레스나 엔도톡신 또는 사이토카인과 같은 물질에 의해 많은 종류의 세포에서 생성된다. 이러한 염증 자극들은 세포 내의 유도성 NOS (iNOS)의 발현을 증가시키고, 이는 다시 세포 내에서 일산화질소 생성을 유도하고 대식 세포를 활성화시킴으로써 염증 반응을 일으킬 수 있다. 이에 따라, 최근 효과적으로 염증을 완화시키기 위한 방안으로 일산화질소의 생성을 억제할 수 있는 물질이나 조성물에 대한 연구가 다수 진행되고 있다.

일반적으로 산화질소와 같은 염증 매개체에는 TNFα , IL-1β 및 IL-6를 포함한 염증성 사이토카인이 동반된다. TNFα는 다른 염증성 사이토카인을 강화시키고, T 세포 및 대식세포를 활성화시킴으로써 염증 반응을 유도하는데 중요한 역할을 한다. IL-6 또한 LPS 유도에 의한 대식세포에서 분비되는 중요한 염증 인자이다. IL-1β는 TNFα와 밀접한 관련이 있는 대표적인 사이토카인이며, 세포 성장 또는 낮은 농도의 항상성 유지에 필요하지만 염증 반응, 상처 또는 면역 자극 동안 과잉 생산되어 인간의 질병을 악화시킬 수 있다.

또한 유사분열물질 단백질 인산화 효소 (Mitogen-activated protein kinase, MAPK)는 세린 트레오닌 단백질 키나제 (serine-threonine kinase)이며, 사이토카인, 스트레스에 의한 세포 반응, 세포 성장 및 분화의 조절에 중요한 역할을 한다. ERK는 자극제에 의해 활성화되며, 다양한 전사 인자를 인산화 할 수 있다. p38 및 JNK는 스트레스 반응 경로의 일부이며, 염증성 사이토카인과 같은 요인에 의하여 활성화 된다. JNK 신호 경로는 LPS 또는 TNFα와 같은 면역 염증 자극에 반응하며, 세포 형태 또는 사이토카인 전사에 관여한다.

통상 염증의 치료는 소염작용을 통해 촉진될 수 있다. 소염작용이란 침입균의 증식을 억제하거나, 이물질을 탐식하는 대식세포 (macrophage)의 활성화를 통한 염증치료 촉진작용을 의미한다. 현재 가장 강력한 항염작용을 지니고 있는 약제로는 스테로이드 제제이다.

그러나, 대부분의 스테로이드 제제는 화학적으로 합성된 물질로, 장기간 사용하는 경우 부신억제, 체액의 저류, 백내장 등의 부작용을 수반하게 되는 경우가 많다. 따라서, 천연식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약품이나, 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취할 수 있으며, 다양한 염증을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한편, 피부질환의 아토피 피부염 (atopic dermatitis, AD)은 피부와 관련된 내인성 요인및 외인성 요인에 의해 발행하며, 급성 또는 만성 피부 손상은 다양한 알레르겐이 피부에 쉽게 접근할 수 있게 하여 알레르기성 염증 반응을 증가시킨다. 다양한 염증 매개체 중에서, Th2 (type-2 helper T cells)의 활성화 후에 생성된 IL-4 및 IL-13은 과잉 발현되며, 알레르기성 피부염 및 AD 환자에서 면역글로불린 E (IgE)의 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다.

알레르기 반응 유도는 비만세포 또는 호염기구 세포에서 항원 β-hexosaminidase를 분비함으로써 알레르기 반응을 일으킬 수 있다. 비만세포는 항원 가교된 IgE에 결합하여 활성화되며, IgE는 이종사량성 수용체 (heterotetrameric receptor)인 IgE 고친화성 수용체 (FcεRI)의 서브유닛(하나의 α, β 및 두 개의 γ subunit)에 결합하여 탈과립 및 다양한 사이토카인 합성 및 분비를 촉진시킴으로써 알레르기 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 비만세포의 활성화 및 염증반응은 TNFα, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13을 포함한 사이토카인의 생성 및 분비에 의해 조절되며, FcεRI의 β-서브 유닛에 결합된 Lyn (Src-family kinase)의 활성화로 인하여 γ-서브유닛의 인산화 또는 활성화를 유도한다. FcεRI의 β- 또는 γ-서브유닛에 결합한 Lyn kinase에 의해 인산화된 ITAM (immunoreceptor-based activation motif)는 타이로신 인산화를 통해 Syk kinase의 활성화를 유도하며, 활성화된 Syk은 phospholipase Cγ1 또는 MAPK의 하위 신호 분자를 순차적으로 활성화하여 다양한 알레르기 반응을 유발하는 매개체를 분비하는 것으로 알려져 있다.

피부는 표피, 진피 및 피하조직을 포함하고 있으며, 수분을 유지하는 장벽으로 작용한다. 표피를 구성하는 각질세포는 인볼루크린 (involucrin, IVL) 및 로리크린 (loricrin, LOL)을 생산하여 각질 필라멘트 (keratin filaments)를 응집시키고, 각질화 된 세포 외피를 형성한다. 또한 각질 세포 및 섬유 모세포에서 히알루론산 신타아제 (hyaluronic acid synthase, HAS)에 의해 합성된 히알루론산 (hyaluronic acid, HA)은 피부의 보습 장벽으로써 작용하며, 감염성 물질에 대한 방어를 위해 디펜신 (human β-defensin, HBD), 카텔리시딘 (cathelicidin), 데미시딘 (dermcidin) 및 아드레노메둘린 (adrenomedullin) 항균성 펩타이드를 생산한다. 높은 박테리아 감염률에 의한 만성 피부 질환은 항균성 펩타이드의 발현 감소와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 피부 세포 성분과 항균성 펩타이드의 이상은 유전적, 환경적 요인 및 면역 반응의 불균형 요인과 함께 아토피 피부염의 원인으로 추정된다.

본 발명의 에피제닌 (apigenin)은 산화질소 억제 효과 이외에 β-hexosaminidase 내지 염증성 사이토카인, MAPK 및 알러지 신호 분자의 수준을 우수하게 억제함을 확인하고, 또한 에피제닌은 피부 화학적 장벽 방벽 및 화학적 장벽 수준을 우수하게 증가시키므로, 항염증, 항알러지 또는 피부 장벽 보호 내지 염증성 질환 또는 피부 장벽 보호 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 청보리, 보리순 또는 보리새싹의 우수한 항염증 및 항알러지 효과를 연구하던 중 청보리, 보리순 또는 보리새싹이 페놀 화합물의 일종인 에피제닌 (apigenin, 4’,5,7-trihydroxyflavone)을 함유하고 있는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 인체에 부작용을 일으키지 않으면서 항염증, 항알러지 내지 피부 장벽 보호에 우수한 물질을 제공고자 예의 노력한 결과, 에피제닌이 효과적인 항염증, 항알러지 내지 피부 장벽 보호 활성을 제공할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는 항염증, 항알러지 또는 피부 장벽 보호 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 산화질소 억제능을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 항알러지 효과를 가지는, 피부 장벽 보호용 화장료 조성물에서, 상기 항알러지 효과는 β-hexosaminidase 탈과립 억제 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 사이토카인 및 MAPK 발현의 억제 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 FcεRIα 발현 억제 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 IgE 활성 신호 분자 발현 억제 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 LOR, HAS-1, HAS-3, hBD-1, hBD-2, hBD-3 또는 LL-37의 발현을 증가시키는 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 염증성 질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 알레르기, 아토피, 치주염, 치은염, 중이염, 인후염, 관절염, 류마티스 관절염, 건염, 건초염, 퇴행성 신경 염증 및 급성 내지 만성 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 에피제닌은 산화질소 억제 효과 이외에 β-hexosaminidase 내지 염증성 사이토카인, MAPK 및 알러지 신호 분자 수준을 우수하게 억제하고, 피부 물리적 장벽 및 화학적 장벽 수준을 우수하게 증가시키므로, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는 항염증, 항알러지 또는 피부 장벽 보호용 조성물 내지 염증성 질환 또는 피부 장벽 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서 효과적으로 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명의 에피제닌의 대식세포, 호염기성 과립구 및 각질형성세포에 대한 세포독성을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 에피제닌의 산화질소(NO) 생성 저해능 및 β-hexosaminidase 탈과립 억제능을 농도별로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 에피제닌의 항염증 효과를 나타낸 도이다. 상기 에피제닌이 ERK 또는 JNK 인산화를 통해 MAPK 신호전달경로의 억제를 통해 염증매개 사이토카인인 IL-1β, IL-6, iNOS 또는 COX2의 발현을 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 본 발명의 에피제닌의 항알러지 효과를 나타낸 도이다. 에피제닌이 염증매개 사이토카인인 TNFα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, COX-2 또는 FcεRIα의 발현을 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 본 발명의 에피제닌의 항알러지 효과를 나타낸 도이다. 에피제닌이 MAPK 및 IgE 활성화 신호 분자인 ERK, JNK, FcεRIγ, Lyn, Syk 또는 PLCγ1의 인산화를 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 본 발명의 에피제닌의 피부 장벽 보호 효과를 나타낸 도이다. 에피제닌이 물리적 장벽 및 화학적 장벽 기능 관련 유전자인 LOR, HAS-1, HAS-3, HBD-1, HBD-2, HBD-3 또는 LL-37의 발현을 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기 기재한 바와 같이, 기존에 염증 생성을 억제하는데 사용되던 소재들은 항염증 내지 항알러지 효과가 미미하거나 피부에 대한 안전성이 부족하다는 한계점이 존재하여 우수한 효과를 제공할 수 있는 대체제가 요구되고 있는 실정이었다.

일 측면에서, 본 발명은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물을 제공한다.

또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 의약외품 조성물을 제공한다.

마지막으로, 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 에피제닌 (apigenin)은 대식세포 또는 호염기성 과립구에 독성을 띄지 않는 조건에서 이의 산화질소 생성 내지 β-hexosaminidase 분비 수준을 효과적으로 억제한다 (실시예 1 및 실시예 2). 또한, 염증 매개 사이토카인, MAPK 내지 알러지 신호 분자 수준의 발현을 효과적으로 억제하여 항염증 및 항알러지 효과를 제공할 수 있다 (실시예 3, 실시예 4 및 실시예 5). 추가적으로 본 발명의 에피제닌은 사람 피부 각질 형성 세포에 독성을 띄지 않는 조건에서 이의 피부 물리적 장벽 내지 화학적 장벽 수준을 유의하게 증가시켜 피부 장벽 보호 효과도 제공할 수 있다 (실시예 6).

본 발명의 에피제닌이란, 분자식 C₁₅H₁₀O₅를 갖는 플라보노이드이며, 식물의 2차 대사산물이다. 또한 에피제닌은 주로 파슬리 (parsley), 셀러리 (celery), 양파 (onion), 오렌지 (orange), 카모마일 (chamomile), 백리향 (thyme), 오레가노 (oregano), 바질 (basil), 사과 (apple), 콩 (bean), 토마토 (tomato), 브로콜리 (broccoli), 체리 (cherry), 포도 (grape), 고추 (chilli), 엉겅퀴 (thistle), 차 (tea), 맥주 (beer) 및 와인 (wine) 등에 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다. 플라보노이드는 당-연결 글리코사이드 및 아글리콘 (aglycone)을 포함하며, 아글리콘과 부착된 당 부분의 다른 조합에 의해 여러 플라보노이드가 자연적으로 발생한다. 에피제닌의 플라본 계열에는 apigenin 6-C-arabinoside-8-C-glucoside (isoschaftoside), apigenin 6-C-glucoside-8-C-arabinoside (schaftoside), apigenin 6-C-glucoside (isovitexin), isovitexin 7-O-(6”-O-feruloyl) glucoside (6”-O-feruloylsaponarin), isovitexin 7-O-(6”-O-feruloyl) glucoside-4’-O-glucoside, isovitexin 7-O-(6”-O-sinapoyl) glucoside (6”-O-sinapoylsaponarin), isovitexin 7-O-glucoside (saponarin), 및 isovitexin 7-O-rutinoside가 있다.

본 발명의 ‘항염증’이란, ‘염증 억제 또는 개선’과 혼용될 수 있으며, 염증 반응이 완화되는 모든 작용을 의미할 수 있다.

본 발명의 ‘예방’이란, 본 발명의 에피제닌으로 인해 염증성 질환 내지 과색소침착 관련 질환이 억제되거나 그 발병이 지연되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 ‘개선’ 또는 ‘치료’란, 본 발명의 에피제닌으로 인해 염증성 질환 내지 피부 장벽 보호 관련 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

따라서, 본 발명은 에에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 보호용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 “화장료 조성물”은 상술한 본 발명의 에피제닌의 화장품학적 유효량 (cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 표피 각질형성세포의 증식을 통한 피부 재생 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형 (리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말 (foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 에피제닌 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한 (制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

상기 염증성 질환은 상기 염증성 질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 알레르기, 아토피, 치주염, 치은염, 중이염, 인후염, 관절염, 류마티스 관절염, 건염, 건초염, 퇴행성 신경 염증 및 급성 내지 만성 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 에피제닌을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능성식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능성식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 에피제닌을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 에피제닌을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 에피제닌 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용 (건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 에피제닌을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 에피제닌과 염증성 질환 예방 또는 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 에피제닌을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

또한, 본 발명의 에피제닌은 염증성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 염증성 질환 예방 또는 개선 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 에피제닌과 함께 염증성 질환에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 에피제닌을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물은 그대로 첨가되거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독청경제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제일 수 있다.

또한, 본 발명은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 에피제닌은 상기 항염증, 항알러지 또는 피부 장벽 보호 조성물에 포함되는 것과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.

또한, 본 발명은 에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제 (예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트 (예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분 (옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 향료, 유화제, 가용화제, 분산제, 향미제, 항산화제, 포장제, 안료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.

상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 에피제닌을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 에피제닌을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 에피제닌을 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다. 본 발명의 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

실시예 1. 에피제닌의 항염증 활성 분석

<1-1> 에피제닌의 세포 독성 확인

에피제닌이 뮤린 대식세포 세포주 (murine macrophage cell, ATCC)에 독성을 띄는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, RAW 264.7 세포를 DMEM 배지에 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 항생제 (페니실린 및 스트렙토마이신)를 첨가하고 37 ℃ (5% CO₂)에서 배양하였다. 배양된 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 24-웰 플레이트에 웰 당 5 × 10⁴ 세포로 37 ℃ (5% CO₂)에서 24 시간 동안 부착시킨 후 농도별 에피제닌 (20, 40, 60, 80 또는 100 ㎍/㎖) 또는 지질다당류 (Lipopolysaccharides, LPS; 1 ㎍/㎖)를 처리하여 24 시간 배양 후 배지에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2-5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하고 암조건에서 2 시간 동안 추가 배양 하였다. 배양 후 배지를 제거하고, dimethyl sulfoxide (DMSO) 200 ㎕를 첨가하여 570 nm 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다.

그 결과, [도 1]에서 나타나는 바와 같이 50 ~ 100 ㎍/㎖의 에피제닌 처리는 RAW 264.7 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

<1-2> 에피제닌의 산화질소 억제능 확인

상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 배양된 세포에 다양한 농도의 에피제닌 (20, 40, 60, 80 또는 100 ㎍/㎖)을 처리하여 37℃ 에서 30 분 동안 반응하였다. 반응 후 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하고 37 ℃ 에서 24 시간 추가 배양하여 산화질소 (NO) 생성을 유도하였다. 530 nm 에서 마이크로 플레이트리더를 이용하여 흡광도를 측정하고 아질산염 (nitrite) 표준 검량 곡선과 비교하여 NO 생성 억제능을 평가하였다. 퀘르세틴 (15 μM)은 양성대조군으로 사용하였다.

그 결과, [도 2]에서 나타나는 바와 같이, 세포생존율을 저해하지 않는 60 ~ 100 ㎍/㎖ 농도의 에피제닌이 LPS 처리로 인한 NO 생성을 유의적으로 억제하였다.

실시예 2. 에피제닌의 항알러지 활성 분석

<2-1> 에피제닌의 세포 독성 확인

에피제닌이 호염기성 과립구 (rat basophilic leukemia cell, ATCC)에 독성을 띄는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, RBL-2H3 세포를 DMEM 배지에 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 항생제 (페니실린 및 스트렙토마이신)를 첨가하고 37 ℃ (5% CO₂)에서 배양하였다. 배양된 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 24-웰 플레이트에 웰 당 5 × 10⁴ 세포로 37 ℃ (5% CO₂)에서 24 시간 동안 부착시킨 후 농도별 에피제닌 (5, 10, 20, 30 또는 40 ㎍/㎖)을 처리하여 24 시간 배양 후 배지에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2-5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하고 암조건에서 2 시간 동안 추가 배양 하였다. 배양 후 배지를 제거하고, dimethyl sulfoxide (DMSO) 200 ㎕를 첨가하여 570 nm 흡광도를 측정하여 하기 [수학식 1]으로 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, [도 1]에서 나타나는 바와 같이 5 ~ 30 ㎍/㎖의 에피제닌 처리는 RBL-2H3 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

[수학식 1]

세포 생존율(%) = (대조군 흡광도/실험군 흡광도)×100

<2-2> 에피제닌의 β-hexosaminidase 탈과립 억제능 확인

세포 생존율에 영향을 미치지 않는 에피제닌의 농도로 호염기성 과립구 세포에 대한 β-hexosaminidase 탈과립 억제능을 평가하고자 하였다.

구체적으로, RBL-2H3 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 24-웰 플레이트에 2×10⁵ cells/well 의 농도로 분주한 후 0.5 ㎍/㎖ DNP-IgE를 처리하고 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. Tyrode buffer로 2회 세척하고 에피제닌 5 ~ 30 ㎍/㎖ 또는 사이클로스포린 A (1 ㎍/㎖)를 처리하여 20분 배양 후 DNP-BSA (100 ng/㎖)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂조건으로 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후 24-웰 플레이트를 4℃에 10분 동안 반응하여 반응을 종결시켰다. 그리고 96-웰 플레이트에 상등액 100㎕ 및 substrate buffer 100㎕를 넣어 37℃, 5% CO₂배양기에서 1 시간 동안 처리하여 탈과립을 유도하였다. Stop solution 100㎕를 각 웰당 넣고 ELISA 리더로 407nm에서 흡광도를 측정하였으며, 사이클로스포린 A는 양성대조군으로 사용하였다. β-hexosaminidase 분비능 (%)은 하기 [수학식 2]을 이용하여 계산하였다.

[수학식 2]

β-hexosaminidase 분비능(%) = (대조군 흡광도/실험군 흡광도)×100

그 결과, [도 2]에서 나타나는 바와 같이, 세포생존율을 저해하지 않는 5 ~ 30 ㎍/㎖ 농도의 에피제닌이 IgE 처리로 인한 β-hexosaminidase 분비를 유의하게 억제하였으며, 이는 양성대조군과 유사한 수준임을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 에피제닌의 염증매개 사이토카인 및 MAPK 발현 억제 활성 분석

<3-1> 에피제닌의 염증매개 사이토카인 발현 억제 확인

세포 생존율에 영향을 미치지 않는 농도의 에피제닌 처리에 따른 RAW 264.7의 TNFα, IL-1β, IL-6, COX-2 및 iNOS 사이토카인 발현량을 확인하고자 하였다.

구체적으로 100 ㎍/㎖ 농도의 에피제닌이 처리된 RAW 264.7 세포의 총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 추출하였으며, 1 ㎍의 RNA를 oligo-dT 프라이머 및 ImProm-II reverse transcriptase와 혼합하고 42 ℃에서 60 분 동안 반응하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 1 ㎕를 12.5 ㎕의 Sensi-FAST SYBR No_ROX 및 10 pmol의 염증매개 사이토카인 유전자 특이 프라이머 (표 1)와 혼합한 후 최종 25 ㎕의 반응액으로 95 ℃에서 3분 1 회, 95 ℃에서 5초, 60 ℃에서 10초로 40회 및 최종 72 ℃에서 15초 반응하여 정량 PCR 분석을 수행하였다. 각 사이토카인의 발현량은 대조구인 GAPDH 유전자 발현량을 기준으로 표준화고 LPS 처리구와 비교하여 상대적인 발현량으로 나타내었다.

유전자	프라이머 서열 (5'-3')	서열번호
IL-6	F: TGCTGGTGACAACCACGGCC	1
IL-6	R: GTACTCCAGAAGACCAGAGG	2
iNOS	F: CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC	3
iNOS	R: GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG	4
COX2	F: CACTACATCCTGACCCACTT	5
COX2	R: ATGCTCCTGCTTGAGTATGT	6
TNFα	F: CCTGTAGCCCACGTCGTAGC	7
TNFα	R: TTGACCTCAGCGCTGAGTTG	8
IL-1β	F: CAGGATGAGGACATGAGCACC	9
IL-1β	R: CTCTGCAGACTCAAACTCCAC	10

그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이, 에피제닌은 IL-1β, IL-6, iNOS 또는 COX2 사이토카인의 발현을 유의적인 수준에서 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

<3-2> 에피제닌의 MAPK 신호분자 발현 억제 활성 확인

RAW 264.7의 MAPK 신호분자 발현을 측정하기 위하여, 웨스턴블로팅을 시도하였다. 세포추출물의 단백질을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 80V로 전기영동하였다. 겔 상의 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전이시킨 다음, 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 3% BSA와 함께 배양하였다. ERK, JNK 및 p38의 1차 항체 (cell signaling technology)를 각각 1,000배로 희석하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 더해주고, 이를 교반하면서 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 후, 이차 항체인 염소 항-마우스 고추냉이 퍼록시다제 (goat anti-mouse horseradish peroxidase) (산타 크루즈 바이오테크사)를 5,000배 희석하여, 상기 멤브레인에 더해주고 1시간 동안 배양하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겨진 단백질은 ECL TM 프라임 웨스턴 블로팅 탐지 시약 (Prime Western Blotting Detection Reagent) (GE 헬스케어사)로 검출하여, 발광 이미지 분석기 (Luminescent Image Analyzer) LAS-3000 (후지필름 라이프 사이언스사)로 촬영하였다.

그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이, 에피제닌은 ERK 또는 JNK 인산화 발현을 유의적인 수준에서 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 에피제닌의 염증매개 사이토카인 및 FcεRIα 발현 억제 활성 분석

세포 생존율에 영향을 미치지 않는 농도의 에피제닌 처리에 따른 RBL-2H3의 TNFα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, COX-2 사이토카인 또는 FcεRIα 발현량을 확인하고자 하였다.

구체적으로 30 ㎍/㎖ 농도의 에피제닌이 처리된 RBL-2H3 세포의 총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 추출하였으며, 1 ㎍의 RNA를 oligo-dT 프라이머 및 ImProm-II reverse transcriptase와 혼합하고 42 ℃에서 60 분 동안 반응하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 1 ㎕를 12.5 ㎕의 Sensi-FAST SYBR No_ROX 및 10 pmol의 염증매개 사이토카인 유전자 특이 프라이머 (표 2)와 혼합한 후 최종 25 ㎕의 반응액으로 95 ℃에서 3분 1 회, 95 ℃에서 5초, 60 ℃에서 10초로 40회 및 최종 72 ℃에서 15초 반응하여 정량 PCR 분석을 수행하였다. 각 사이토카인의 발현량은 대조구인 GAPDH 유전자 발현량을 기준으로 표준화고 IgE 처리구와 비교하여 상대적인 발현량으로 나타내었다.

유전자	프라이머 서열 (5'-3')	서열번호
TNFα	F: TCAGCCTCTTCTCATTCCTGC	1
TNFα	R: TTGGTGGTTTGCTACGACGTG	2
IL-4	F: GGATGTAACGACAGCCCTCT	3
IL-4	R: GTGTTCCTTGTTGCCGTAAG	4
IL-5	F: CTCTGTTGACGAGCAATGAG	5
IL-5	R: CTCTTGCAGGTAATCCAGGA	6
IL-6	F: GGATGTAACGACAGCCCTCT	7
IL-6	R: TCTGACAGTGCATCATCGCT	8
IL-13	F: GCTCTCGCTTGCCTTGGTGGTC	9
IL-13	R: CATCCGAGGCCTTTTGGTTACAG	10
COX-2	F: TGACTTTGGCAGGCTGGATT	11
COX-2	R: ACTGCACTTCTGGTACCGTG	12
FcεRⅠα	F: AGATGCCGTAGCTGGAAGAAA	13
FcεRⅠα	R: AATGATGGGAAAATGAGTTGTAGC	14

그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이, 에피제닌은 TNFα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, COX-2 사이토카인 또는 FcεRIα의 발현을 유의적인 수준에서 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 에피제닌의 MAPK 및 IgE 활성 신호 분자 발현 억제 활성 분석

RBL-2H3의 MAPK 및 IgE 활성 신호분자 발현을 측정하기 위하여, 웨스턴블로팅을 시도하였다. 세포추출물의 단백질을 8% SDS-PAGE 겔 상에서 80V로 전기영동하였다. 겔 상의 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전이시킨 다음, 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 5% BSA와 함께 배양하였다. ERK, JNK, p38, FcεRIγ, Lyn, Syk 또는 PLCγ1의 1차 항체 (cell signaling technology)를 각각 1,000배로 희석하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 더해주고, 이를 교반하면서 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 후, 이차 항체인 염소 항-마우스 고추냉이 퍼록시다제 (goat anti-mouse horseradish peroxidase) (산타 크루즈 바이오테크사)를 5,000배 희석하여, 상기 멤브레인에 더해주고 1시간 동안 배양하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겨진 단백질은 ECL TM 프라임 웨스턴 블로팅 탐지 시약 (Prime Western Blotting Detection Reagent) (GE 헬스케어사)로 검출하여, 발광 이미지 분석기(Luminescent Image Analyzer) LAS-3000 (후지필름 라이프 사이언스사)로 촬영하였다.

그 결과, [도 5]에서 나타나는 바와 같이, 에피제닌은 ERK, JNK, FcεRI, Lyn, Syk 또는 PLCγ1 인산화 발현을 유의적인 수준에서 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 에피제닌의 피부 장벽 보호 기능 관련 유전자 발현 활성 분석

<6-1> 에피제닌의 세포 독성 확인

에피제닌이 사람 피부 각질 형성 세포 (human keratinocyte cell, ATCC)에 독성을 띄는지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 DMEM 배지에 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 1% 항생제 (페니실린 및 스트렙토마이신)를 첨가하고 37 ℃ (5% CO₂)에서 배양하였다. 배양된 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 24-웰 플레이트에 웰 당 5 × 10⁴ 세포로 37 ℃(5% CO₂)에서 24 시간 동안 부착시킨 후 농도별 에피제닌 (10. 20. 30. 40 또는 50 ㎍/㎖)을 처리하여 24 시간 배양 후 배지에 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2-5-diphenyltetrazolium bromide)를 첨가하고 암조건에서 2 시간 동안 추가 배양 하였다. 배양 후 배지를 제거하고, dimethyl sulfoxide (DMSO) 200 ㎕를 첨가하여 570 nm 흡광도를 측정하여 하기 [수학식 1]으로 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, [도 1]에서 나타나는 바와 같이, 10 ~ 20 ㎍/㎖의 에피제닌 처리는 HaCaT 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.

<6-2> 에피제닌의 피부 장벽 보호 기능 유전자 발현 분석

세포 생존율에 영향을 미치지 않는 농도의 에피제닌 처리에 따른 HaCaT의 물리적 장벽 및 화학적 장벽 기능 관련 유전자인 IVL, LOR, HAS-1, HAS-2, HAS-3, HBD-1, HBD-2, HBD-3 또는 LL-37 발현량을 확인하고자 하였다.

구체적으로 20 ㎍/㎖ 농도의 에피제닌이 처리된 HaCaT 세포의 총 RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 추출하였으며, 1 ㎍의 RNA를 oligo-dT 프라이머 및 ImProm-II reverse transcriptase와 혼합하고 42 ℃에서 60 분 동안 반응하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 1 ㎕를 12.5 ㎕의 Sensi-FAST SYBR No_ROX 및 10 pmol의 염증매개 사이토카인 유전자 특이 프라이머(표 3)와 혼합한 후 최종 25 ㎕의 반응액으로 95 ℃에서 3분 1 회, 95 ℃에서 5초, 60 ℃에서 10초로 40회 및 최종 72 ℃에서 15초 반응하여 정량 PCR 분석을 수행하였다. 각 사이토카인의 발현량은 대조구인 GAPDH 유전자 발현량을 기준으로 표준화고 IgE 처리구와 비교하여 상대적인 발현량으로 나타내었다.

유전자	프라이머 서열 (5'-3')	서열번호
IVL	F: GGCCACCCAAACATAAATAACC	1
IVL	R: CCTAGCGGACCCGAAATAAG	2
LOR	F: GAGGTGTTTTCCAGGGGCA	3
LOR	R: TGGGGTTGGGAGGTAGTTGTA	4
HAS-1	F: GTCTCCAGGGAGGGTATTTATTG	5
HAS-1	R: TCCTGATCACACAGTAGAAATGG	6
HAS-2	F: CTGGGACGAAGTGTGGATTATG	7
HAS-2	R: CTCCAACCATGGGATCTTCTTC	8
HAS-3	F: AGGTATGGCAGTAGAGGATGA	9
HAS-3	R: CCTGCTCACCATTGGAGAAT	10
hBD-1	F: TCTGCTGTTTACTCTCTGCTTAC	11
hBD-1	R: GGCAGGCAGAATAGAGACATT	12
hBD-2	F: GATGCCTCTTCCAGGTGTTT	13
hBD-2	R: CCACAGGTGCCAATTTGTTTAT	14
hBD-3	F: CCAGGTCATGGAGGAATCATAAA	15
hBD-3	R: CGATCTGTTCCTCCTTTGGAAG	16
LL-37	F: CCCTGCTGGGTGATTTCTT	17
LL-37	R: CTCTGTCCTGGGTACAAGATTC	18

그 결과, [도 6]에서 나타나는 바와 같이, 에피제닌은 LOR, HAS-1 및 HAS-3 물리적 장벽과 hBD-1, hBD-2, hBD-3 및 LL-37 화학적 장벽의 발현을 유의적인 수준에서 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

상기 실시예들에 의해 본 발명의 에피제닌은 산화질소 억제 효과 이외에 β-hexosaminidase 내지 염증성 사이토카인, MAPK 및 알러지 신호 분자의 수준을 우수하게 억제함을 확인하였고, 피부 화학적 장벽 방벽 및 화학적 장벽 수준을 우수하게 증가시킴을 확인하여, 이는 항염증, 항알러지 또는 피부 장벽 보호 내지 염증성 질환 또는 피부 장벽 보호 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서 효과적이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Claims

에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 보호용 화장료 조성물에서,
상기 피부 장벽은 물리적 장벽 및 화학적 장벽을 포함하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 물리장벽 관련 요소인 인볼루크린 (involucrin), 로리크린(loricrin) 및 히알루론산 신타아제(hyaluronic acid synthase)의 발현을 증가시키는 것인, 피부 장벽 보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 화학장벽 관련 요소인 베타-디펜신(β-defensin) 및 카텔리시딘(cathelicidin)의 발현을 증가시키는 것인, 피부 장벽 보호용 화장료 조성물.
에피제닌을 유효성분으로 포함하는, 피부 장벽 보호용 식품 조성물에서,
상기 피부 장벽은 물리적 장벽 및 화학적 장벽을 포함하는 것인, 식품 조성물.