KR20230086163A - 플루페녹수론을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

플루페녹수론을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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송권화
임화선
함지연
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고려대학교 산학협력단
국민대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 조성물은 정소 세포주의 증식을 억제하고, 생식샘자극호르몬 억제 단백질의 발현을 감소시키는 효과가 있는바, 정소 세포주의 비정상적 증식에 의한 남성 생식기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품, 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

플루페녹수론을 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating male reproductive disease comprising flufenoxuron}
본 발명은 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
고환염, 음낭수종, 고환암 등의 남성 생식기관 질환은 정소 세포의 비정상적 증식, 과도한 염증반응으로 인해 발병하는 질병이다. 정소 세포인 라이디히 세포(Leydig cell)와 세르톨리 세포 (Sertoli cell)는 남성 호르몬을 만들어 내고 정자를 생산하는 핵심 세포로서, 손상이 발생하는 경우 생식 세포의 사멸, 세포 주기 조절 단백질 감소, 세포내 활성 산소 증가에 따른 불임이 야기될 수 있다 (Rindone, G.M., et al., Reproduction, 2018. 156(2): p. 93-101. / Kirk, D. and U. Mittwoch, Humangenetik, 1975. 26(2): p. 105-11. / Pan, B., et al., Cancer Med, 2016. 5(11): p. 3214-3222).
상기 남성 생식기관 질환 중 고환암은 국내 10만명당 0.45명이 발병하는 드문 암이고 병기가 낮은 경우 90%이상의 완치율을 보이지만, 20-40세 사이의 청장년층에서 발병률이 전 세계적으로 증가하고 있으며 정상 남성보다 불임을 일으킬 확률이 세배 이상 높으며 (Scott M., et al. , Urologic Clinics of North America, 2015. 42(3): p.269-275), 고환암 환자는 통증이 없기 때문에 진행된 병기에서 발견하는 경우가 많고, 림프절을 따라 전이가 쉽게 일어나는 것으로 알려져있다 (Mariotto A.B., et al., CA Cancer J Clin 2014; 64: pp. 252-271).
한편, 플루페녹수론(dinitramine)은 벤질유레아계 화합물로 키틴 합성을 저해하여 과일, 곡물, 야채 등에 존재하는 해충을 박멸하는 성분으로, 포유류나 사람에게는 상대적으로 독성이 낮은 것으로 알려져 있으나, 현재까지 플루페녹수론의 남성 생식기 질환 치료 효과에 대해서는 보고된 바 없다.
전술한 기술적 배경하에서 본 발명자들은 남성 생식기 질환 치료 물질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 플루페녹수론이 비정상적으로 증식된 정소 세포주의 증식을 억제하고, 세포사멸효과를 유도하는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 조성물은 비정상적으로 증식된 정소 세포주의 증식을 억제하고, 세포 사멸 효과를 향상시키는 효과가 있는바, 정소 세포주의 비정상적 증식에 의한 남성 생식기 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품, 기능성 식품과 관련된 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 플루페녹수론이 정소 세포주의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 플루페녹수론에 의한 정소 세포주 내 미토콘드리아 기능장애 유발 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 플루페녹수론에 의한 소포체 스트레스 유도 및 미토콘드리아-소포체 간 연결 단백질의 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 플루페녹수론과 칼슘 저해제 병용 처리가 미토콘드리아의 기능에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 플루페녹수론이 정소 세포주 내 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달 기전에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 플루페녹수론과 신호전달기전 억제제의 병용 처리가 정소 세포주 내 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달 기전에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 플루페녹수론을 마우스에 경구 투여 시 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 플루페녹수론의 정소 세포주 내 작용 기전을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 플루페녹수론에 의한, 비정상적으로 증식된 정소 세포주의 증식 억제 및 세포 사멸 기전을 밝혔다(도 8).
본 발명은 일 관점에서 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 담체는 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염, 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 할 수 있고, 완충제, 항균성 보존제, 계면활성제, 산화방지제, 긴장성 조정제, 방부제, 증점제 및 점도 개질제로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔 및 분말로 구성된 군에서 선택되는 제형을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여시간 등과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률 제6722호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 식품을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있고, 과립제, 정제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 껌, 차, 젤리, 각종 음료수, 드링크제, 알코올 음료 등으로 제조될 수 있으며, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 인체를 비롯한 동물 신체에 투여하기 적합한 임의의 생약 형태, 더욱 구체적으로는 경구 투여에 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료, 식품 또는 사료의 첨가제 및 보조제, 강화된 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 캡슐 및 발포 배합물 등과 같은 고체 형태 또는 용액, 현탁액, 유화액, 음료, 페이스트 등과 같은 액체형태 일 수 있고, 영양제, 비타민, 전해질, 감미제, 착색제, 유기산, 방부제 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분들을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 플루페녹수론이 정소 세포주의 증식과 관련된 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 플루페녹수론이 미토콘드리아 기능 및 칼슘 항상성을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 플루페녹수론이 스테로이드 생합성, 세포주기, 호르몬 수용체 및 정자형성과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 남성 생식기 질환은 라이디히(Leydig) 세포 또는 세르톨리(Sertoli) 세포의 과증식에 의해 유발되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 상기 남성 생식기 질환은 라이디히 세포 종양, 세르톨리 세포 종양, 고환염, 부고환염, 고환암, 음낭수종, 전립선 비대증 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 플루페녹수론을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 플루페녹수론을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<실험 방법>
실험 재료
후보 조성물질인 플루페녹수론은 Sigma-Aldrich, Inc로부터 구매하였으며, DMSO에 녹여 20 mM 원액을 만들어 실험을 위해 희석하여 사용하였다.
세포배양
라이디히 세포주 TM3(immature mouse leydig cell), 세르톨리 세포주 TM4 (immature mouse sertoli cell) 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 구매하여 사용하였으며, 세포의 단층배양을 위해서 high glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)에 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함께 혼합하여 사용하였다.
실험 동물
20마리의 3주령 C57BL/6 수컷 마우스를 DBL에서 구입하여 사육장에 1주일간 사육하며 환경에 적응시켰다. 마우스들은 표준사료(standard chow)를 섭취하였으며, 12시간 주기로 소등되는 환경에서 길러졌다. 모든 실험 절차는 고려대학교의 IACUC 승인 (KUIACUC-2018-0024)을 받아 진행되었으며, 적응기간이 끝난 후 무작위로 두 그룹으로 나뉘어 실험을 시작하였다. 4주간 매일 플루페녹수론을 100 mg/kg 농도로 경구투여하였으며, 4주 후 정소조직은 각각 RNA 추출을 위해 샘플링되었다.
BrdU를 이용한 세포 증식 능력 분석
마우스 정소 세포주의 증식 능력에 플루페녹수론이 미치는 영향을 확인하기 위하여 FBS 기아 조건으로 배양한 5×103개의 세포와 배지 100㎕를 96 well에 분주하고 플루페녹수론을 용량의존적으로 (0, 2, 5, 10, 20μM) 처리하여 24시간 동안 배양한 다음, BrdU 키트 (Cat No: 1167229001, Roche)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험을 수행하였다. 48시간 인큐베이션 후, 10 μM BrdU를 각 well에 추가적으로 넣어 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양하였다. 라이디히 세포와 세르톨리 세포에 BrdU를 labeling 하고 세포를 고정하여 anti-BrdU-POD 용액을 상온에서 90분 인큐베이션 시킨 이후 3차례 씻어주었다. 마지막으로 100 μl의 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine substrate으로 세포를 반응시키고, ELISA 리더기를 사용하여 370 nm, 492 nm 내 흡광도를 측정하여 세포 증식 능력을 분석하였다.
면역형광법
3×104개의 라이디히 세포 및 세르톨리 세포를 10% FBS가 포함된 배지 300 μl와 함께 confocal dish (catalog number: 100350, SPL Life Science, Republic of Korea)에 분주하여 배양한 뒤, 24시간 FBS 기아상태로 추가로 배양하여 플루페녹수론을 20 μM으로 24시간 동안 처리한 뒤 메탄올로 10분간 세포를 고정하고, Santa Cruz Biothecnology사에서 구입하여 2 μg/ml로 희석된 PCNA 항체를 처리하였으며 대조군에는 mouse IgG를 처리하여 4℃에서 16시간 인큐베이션 하였다. 이후, 0.1% BSA (bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 2번의 워싱과정을 거쳐 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG Alexa 488 (catalog number: A-11001, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 antibody dilution buffer에 1:200으로 희석하여 상온에서 1시간동안 배양하였다. 세포를 0.1% BSA-PBS로 워싱한 다음 DAPI 염색을 추가적으로 시행하여 세포 내 타겟 단백질뿐만 아니라 핵을 동시에 관찰할 수 있도록 하였다. 실험 종료 후 LSM710 (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA) 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰 및 촬영하였다.
Propidium iodide (PI)를 이용한 세포주기 분석
플루페녹수론의 마우스 정소 세포주의 세포주기의 정지 효과를 확인하기 위하여 BD Biosicences사의 Propidium iodide (PI) 시약을 사용하여 실험을 진행하였다. 먼저 5×105 세포를 6 well에 배양하고 70 ~ 80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 플루페녹수론을 용량의존적으로 (0, 2, 5, 10, 20 μM) 처리하여 24시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 PBS로 2번 워싱을 진행하고 70%의 에탄올로 고정시켜 4℃에 하루 동안 보관하였다. 다음으로 PBS로 2번 워싱을 진행하고 10 mg/ml의 RNase A 5 μL, 50 mg/ml PI 5 μL을 PBS에 함께 혼합하여 실온에 30분 동안 빛을 차단한 채 염색하였다. 이후, PBS 400 μL 추가하여 5 mL FACS 튜브에 염색된 용액을 옮겨 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석함으로써 세포주기의 변화를 측정하였다.
Rhod -2 AM 염색을 통한 미토콘드리아 기질 내 칼슘 농도 측정
세포질 내 칼슘농도를 측정하기 위해 Rhod2-AM을 사용하여 측정하였다. 5×105 개의 마우스 정소 세포주를 6 well에 배양하고 70 ~ 80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 플루페녹수론을 용량의존적으로 처리하여 24시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 원심분리 하여 세포 pellet을 얻었다. 세포는 Rhod2 staining solution에 풀어준 후 빛을 차단시켜 4℃ 냉장상태 내에서 30분 간 인큐베이션 하였다. 염색된 세포는 다시 원심분리하여 HBSS (w/o Ca2 +, Mg2+) 500 μl로 세포 pellet을 풀어준 후 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 10분 동안 배양하였다. 이후, 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
JC -1 염색을 통한 미토콘드리아 막전위 측정
JC-1 미토콘드리아 막 전위 (MMP) 변화는 mitochondria staining kit (Cat No: CS0390, Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다. 5×105개의 마우스 정소 세포를 6 well에 배양하고 70 ~ 80% 배양 접시에 세포가 찼을 때 24시간 FBS 기아상태로 추가 배양하였다. 이후, 플루페녹수론을 용량의존적으로 처리하여 24시간 동안 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이후, 트립신을 사용하여 세포를 배양 접시에서 떼어 원심분리 하여 세포 pellet을 얻었다. 세포는 JC-1 staining solution에 풀어준 후 37℃/5% CO2 인큐베이터 내에서 20분간 인큐베이션 하였다. 염색된 세포를 다시 원심분리하여 1x JC-1 staining buffer로 워싱한 후 유세포 분석기를 사용하여 형광 강도를 분석하였다.
단백질 발현 분석 ( 웨스턴블롯 )
마우스 정소 세포에 플루페녹수론 또는 세포신호전달기전 억제제와의 혼합물을 처리한 다음 정소 세포주로부터 전체 단백질을 추출하여 Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 단백질을 정량하였다. 이후, 추출한 단백질을 95℃에서 5분간 변성하였으며 10% SDS/PAGE 젤을 이용하여 전기영동 수행한 뒤, nitrocellulose membrane으로 옮겨주고, 1차 항체와 2차 항체를 차례로 인큐베이션 시킨 다음 chemiluminescence detection (SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, USA) 시약, ChemiDoc EQ system과 Quantity One software (Bio-Rad) 기기를 사용하여 타겟 단백질의 발현을 분석하였다.
정량적 역전사 중합효소 연쇄반응
라이디히 세포 및 세르톨리 세포와 샘플링한 정소 조직을 Trizol reagent를 통해 제조사의 매뉴얼대로 RNA 추출을 시행하였다. cDNA는 total RNA 1 μg과 AccuPower premix로 합성하였으며, 유전자 발현은 SYBR Green (Sigma-Aldrich)과 StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)로 측정하였다. 타겟 유전자의 발현은 CT값으로 계산하였으며, GAPDH 발현을 기준으로 표준화하였다. PCR 조건은 95℃로 3분 진행한 후, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 조건을 40회 증폭하였다.
통계분석
본 실험결과는 SAS (statistical analysis system) 통계프로그램을 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. P < 0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
<결과 및 고찰>
플루페녹수론의 마우스 라이디히 (TM3) 및 세르톨리 (TM4) 세포에 대한 세포 증식 억제 및 세포주기 정지 효과
마우스 정소 세포주인 라이디히 세포 (TM3) 및 세르톨리 세포 (TM4)에 플루페녹수론을 용량의존적으로 (0, 2, 5, 10, 20 μM) 처리하여 항증식 효과를 확인하였다(도 1). 그 결과, TM3세포의 증식능은 10, 20 μM의 플루페녹수론을 처리하였을 때, 대조군에 비해 약 67%, 47%까지 감소하였다 (도 1A). TM4 세포의 증식능은 2 μM부터 유의적으로 감소하여 최대 41.2%까지 감소하였다 (도 1B). 또한, 세포증식 마커인 PCNA의 발현 (초록색 형광)이 감소함을 확인하였다 (도 1C). TM3에서 유의적 변화는 없었지만 (도 1D), TM4에서 sub-G1과 G0/G1기에 해당하는 세포군의 양이 1.8배까지 증가하고, S기와 G2/M에 해당되는 세포의 양이 대조군 대비 최대 32% 감소함을 통해 G0/G1 세포주기 정지가 발생함을 알 수 있었다 (도 1E).
플루페녹수론의 마우스 세포주 내 칼슘항상성 와해 효과
플루페녹수론 처리가 마우스 정소 세포주 내 미토콘드리아 기능장애를 일으키는지 확인하기 위해, Rhod2를 이용하여 미토콘드리아 기질 내 상대적인 칼슘이온의 농도를 측정하였다. 그 결과, TM3와 TM4 세포 내 플루페녹수론 (20 μM) 처리에 의해 미토콘드리아 기질 내 칼슘이온의 농도가 대조군에 비해 약 7.8배, 18배 증가하였다 (도 2A). 게다가, TM3와 TM4세포 내 미토콘드리아 막전위의 탈분극 2 μM부터 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다 (도 2B). TM3에서는 플루페녹수론에 의해 최대 26배, TM4세포에서는 최대 21배까지 증가함을 확인하였다. 또한, 플루페녹수론 처리 (0, 5, 10, 20 μM) 에 따른, 미토콘드리아에 의한 세포자멸사와 연관된 단백질들의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다. 그 결과, 프로-아폽토틱 단백질인 Bak은 플루페녹수론 처리에 따라 TM3, TM4세포에서 각각 최대 1.3배, 1.7배증가하고, 안티-아폽토틱 단백질인 Bcl-xL는 TM4세포에서 유의적으로 감소하는 경향을 보였고 및 Bad의 인산화는 TM3세포에서 플루페녹수론 처리에 의해 절반 가까이 감소하는 것으로 나타났다 (도 2C-E).
플루페녹수론에 의한 소포체 스트레스 유발 및 미토콘드리아- 소포체간 상호작용에 관한 분석
웨스턴 블랏을 통해 플루페녹수론 처리에 따른 마우스 정소 세포주 내 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 측정하였다. 그 결과, TM3 세포에서 플루페녹수론의 용량의존적 (0, 5, 10, 20 μM) 처리에 따라 하위 소포체 스트레스 인자인 Chop의 발현이 2.3배까지 증가하였으며, TM4 세포에서도 Ire1a, Eif2a의 인산화 및 Chop의 발현이 20 μM 농도에서 각각 대조군 대비 1.7배, 1.7배, 1.5배 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3A-C). 추가적으로, 미토콘드리아-연관 막 단백질의 발현을 확인한 결과, Grp75 및 Vdac 단백질은 플루페녹수론에 의해 TM4 세포에서 1.3배 및 1.8배까지 증가하는 양상을 보였지만, TM3 세포에서는 유의적 변화가 일어나지 않았다 (도 3D-F). 소포체와 미토콘드리아 외막을 연결하는 단백질인 Vapb와 Fam82a2 단백질의 경우 TM3세포에서 플루페녹수론에 의해 1.5배, 1.8배까지 증가하였으며, TM4세포에서는 Vapb 발현이 최대 1.5배, Fam82a2의 경우 3.1배ㄲㆍ지 증가함을 확인하였다 (도 3D-F). 또한, 자가포식 마커인 p62 단백질의 인산화 역시 농도의존적으로 증가하여 TM3세포에서는 1.2배ㄲㆍ지, TM4세포에서는 1.8배까지 증가하는 양상을 보였다 (도 3D-F). 이러한 결과를 통해, 본 발명의 유효성분인 플루페녹수론이 마우스 정소 세포주 내에서 소포체 스트레스를 활성화 시키고, 미토콘드리아-소포체 간 상호작용에 영향을 미쳐 미토콘드리아 내 칼슘농도의 증가를 유발한다는 것을 확인하였다.
풀루페녹수론과 칼슘 킬레이트제와의 병용처리 시 미토콘드리아에 미치는 영향 분석
칼슘 저해제인 루테니움 레드 (ruthenium red, 이하 RR)를 플루페녹수론과 병용처리하여, 소포체와 미토콘드리아 내 관계를 보다 명확히 확인하고자 하였다. 측정 결과, 4 μM의 RR의 처리는 TM3세포에서 플루페녹수론에 의해 유도된 미토콘드리아 내 칼슘 이온 농도를 188%에서 158%까지 약 30% 정도 감소시켰으며, TM4에서는 거의 대조군 수준(116%)으로 회복시키는 양상을 보였다 (도 4A-C). 미토콘드리아 막전위의 경우에도 TM3세포에서 플루페녹수론에 의해 200%까지 증가한 탈분극의 정도가 RR과의 병용처리에 의해 103% 수준으로 완화됨을 확인하였다 (도 4D-E). TM4세포에서는 플루페녹수론에 의해 857%까지 증가한 탈분극의 정도가 병용 처리시 대조군 대비 660% 수준으로 완화되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4D, F).
마우스 정소 세포주 내 MAPK / PI3K 신호전달 경로에 플루페녹수론이 미치는 영향 분석
플루페녹수론이 마우스 정소 세포주 내 MAPK/PI3K 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인한 결과, Erk1/2의 인산화는 플루페녹수론의 용량의존적 (0, 5, 10, 20 μM) 처리에 따라 TM3 및 TM4 세포 내에서 각각 1.6배, 1.8배증가하는 양상을 보였다 (도 5A). Jnk의 인산화 역시 두 세포주에서 플로페녹수론 처리에 따라 최대 1.8배, 1.5배 증가함을 확인하였다 (도 5B). PI3k/Akt 신호전달 경로 중 Akt의 인산화 역시 20 μM의 플루페녹수론 처리에 의해 유의적으로 1.3-1.4배가량 증가하는 것으로 나타났다 (도 5C). 이와는 반대로 Rps6ka1의 인산화는 10, 20 μM의 플루페녹수론에 의해 TM3세포에서 대조군 대비 62%, 50% 감소하였으며, TM4세포에서는 72%, 48%까지 유의적으로 감소함을 확인하였다(도 5D), Rps6kb1의 인산화 역시 약간 감소하는 경향을 보였다 (도 5E). 이러한 결과를 통해, 본 발명의 유효성분인 플루페녹수론은 마우스 정소 세포주 내에서 Mapk와 Akt의 활성화를 유도한다는 것을 확인하였다.
플루페녹수론과 신호전달기전 억제제의 병용처리 시 신호전달 경로의 변화 양상 분석
플루페녹수론에 의한 신호전달기전 변화 양상을 보다 명확하게 확인하기 위하여 각 신호전달 단백질의 약리학적 억제제를 플루페녹수론과 병용 처리하였다. 구체적으로, 10 μM의 약리학적 억제제 (U0126, LY294002, SP600125)를 20 μM의 플루페녹수론을 처리하기 전, 2시간 동안 전처리하였다.
측정 결과, 플루페녹수론에 의한 Erk1/2의 인산화는 TM3와 TM4 세포 내에서 U0126, SP600125에 의해 억제되었다 (도 6A). LY294002의 전처리는 TM3 세포에서는 효과가 없었지만, TM4 세포에서는 대조군 대비 1.4배 증가한 Erk1/2의 인산화를 대조군대비 0.6배 정도로 억제하는 경향을 보였다 (도 6A). 또한, TM4 세포에서 플루페녹수론에 의한 Jnk의 인산화는 모든 약리학적 억제제에 의해 억제되어 대조군 수준을 감소하거나 그 이상 감소하는 경향을 보였다 (도 6B). 또한, Akt의 인산화는 LY294002 및 SP600125와의 병용처리 시 유이적으로 감소하는 경향을 보였다 (도 6C). 또한, TM3의 플루페녹수론에 의한 Rps6ka1의 인산화는 LY294002, SP600125와의 병용 처리시 대조군 대비 0.8배 정도로 큰 유의적 변화가 없었고, TM4에서는 플루페녹수론에 이해 감소된 인산화를 대조군 대비 26%, 42% 수준으로 더욱 감소시키는 경향을 보였다 (도 6D). 또한, 두 세포주 모두에서 플루페녹수론에 의해 감소된 Rps6kb1의 인산화는 U0126와의 병용처리에 의해 TM3세포에서는 대조군 대비 0.9배로, TM4세포는 1.42배정도로 원래 수준으로 회복되는 양상을 보였다 (도 6E). 또한, SP600125의 병용처리 역시 TM3에서 Rps6kb1의 인산화를 원래 수준으로 회복시키는 것으로 나타났다 (도 6E).
C57BL /6 마우스에 플루페녹수론의 경구 투여시 효과 분석
C57BL/6 마우스에 플루페녹수론 (100 mg/kg per bw)을 4주간 매일 경구 투여하였고, 이후, 정소, 간, 신장 조직을 동정하여 무게를 측정하였다 (도 7A). 또한, 정소 조직에서 RNA를 추출하여 정소 기능 및 스테로이드합성과 관련된 유전자들의 발현을 확인하였다 (도 7B-I). 측정 결과, Ar, Jun, Jund mRNA의 발현은 플루페녹수론의 경구 투여에 의해 0.72배, 0.75배, 0.82배 감소하였으며, Hsd17b1를 제외한 Star, Hsd17b3, Cyp17a1, Cyp19a1 유전자의 발현은 대조군에 비해 약 10~30%가량 증가하는 양상을 보였다 (도 7B-I).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플루페녹수론이 PI3K/AKT 및 MAPK 신호전달기전을 조절하는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 플루페녹수론이 미토콘드리아 기능 및 칼슘 항상성을 조절하는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 남성 생식기 질환은 라이디히(Leydig) 세포 또는 세르톨리(Sertoli) 세포의 과증식에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 남성 생식기 질환은 라이디히 세포 종양, 세르톨리 세포 종양, 고환염, 부고환염, 고환암, 음낭수종, 전립선 비대증 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 플루페녹수론을 유효성분으로 포함하는 남성 생식기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 플루페녹수론을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 증식 능력을 억제시키는 방법.
  8. 플루페녹수론을 포함하는 조성물을 이용하여 인간을 제외한 포유동물 유래 정소 세포주의 사멸 효과를 향상시키는 방법.
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