KR20230083317A - 시스토이소스포라 수이스 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 샘플에서 시스토이소스포라 수이스(Cystoisospora suis)를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다 본 발명은 또한 이러한 검출에 사용될 수 있는 키트 및 재료, 예를 들어, 프라이머 또는 프로브에 관한 것이다. 본 발명은 생물학적 샘플과 같은 임의의 샘플에 사용될 수 있고, 시스토이소스포라 수이스의 특이적인 검출을 가능하게 한다.

Description

시스토이소스포라 수이스 검출 방법

본 발명은 샘플에서 시스토이소스포라 수이스(Cystoisospora suis)를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다 본 발명은 또한 이러한 검출에 사용될 수 있는 키트 및 재료, 예를 들어, 프라이머 또는 프로브에 관한 것이다. 본 발명은 생물학적 샘플과 같은 임의의 샘플에 사용될 수 있고, 시스토이소스포라 수이스의 특이적인 검출을 가능하게 한다.

시스토이소스포라 수이스(Cystoisospora suis, C. suis)는 새끼 돼지에서 심각한 설사를 야기하는 중요한 콕시디안 원생동물 기생충이다. 따라서, 샘플 내 C. 수이스의 검출은 확산 및/또는 질환 진행을 피하기 위한 적절한 치료를 가능하게 한다.

형광 현미경 및 부유 기술에 의한 접합자의 미생물수 측정을 사용하여 배설물에서 물질을 식별할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 실용적이지 않으며, 오래 지속된다.

시스토이소스포라에 대한 검출 검정은 Samarasinghe 등의 문헌[2008 (Experimental Parasitology 118: 592-595.)]에 보고되었다. 그러나, 이 방법은 종 특이적이지 않으며, 오히려 다양한 종의 시스토이소스포라 속들과 반응한다.

C. 수이스의 더욱 특이적인 검출을 허용하는 방법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.

본 발명은 샘플에서 시스토이소스포라 수이스(Cystoisospora suis)를 검출하는 신규한 방법 및 신규한 도구(시약, 키트)에 관한 것이다. 본 방법은 PCR과 같은 증폭을 사용하고, 임의의 샘플, 예컨대, 유체, 대변, 배설물, 조직 등과 같은 생물학적 샘플(또는 이의 희석제/유도체)로 구현될 수 있다. 본 발명자들은 게놈의 내부 전사 스페이서(Internal Transcribed Spacer, "ITS") 영역에서 특정 표적 서열의 증폭/검출을 허용하는 역방향 프라이머 및 프로브를 설계하였고, 이러한 방법 및 시약이 C. 수이스의 더욱 특이적이고 효율적인 검출을 가능하게한다는 것을 보여주었다. 특히, 본 발명은 C. 수이스의 미토콘드리아 게놈의 16S-23S rRNA ITS 영역 내 게놈 서열을 표적화하는 것이 효율적이고 특이적인 검출을 가능하게한다는 것을 보여준다. 검정의 온도 프로파일은 구배 실시간 PCR에 의해 최적화되었다. 또한, DNA 추출을 위해 배설물 샘플의 기계적 파괴 및 효소 용해의 파라미터를 최적화하였다. 또한 96-웰 플레이트에 적용가능한 DNA-추출 및 실시간 PCR 검정을 포함하는 전체 방법이 설계되었고, 다른 시스토이소스포라 종인 C. 오치오엔시스(C. ochioensis) 및 C. 벨리(C. belli)와 교차 반응성을 나타내지 않으며, 높은 처리량 및 효율적인 C. 수이스의 검출을 가능하게 하였다.

본 발명은 샘플에서 시스토이소스포라 수이스(Cystoisospora suis)를 검출(존재, 또는 부재, 또는 이의 양)하는 신규한 방법 및 신규한 도구(시약, 키트)에 관한 것이다. 본 방법은, 특히, C. 수이스 게놈의 특정 서열의 증폭에 기반하여 더욱 특이적(예를 들어, C.오치오엔시스(C. ochioensis) 또는 C. 벨리(C. belli)와 교차 반응성 없음)이고 효율적인 C. 수이스의 검출을 가능하게 한다 본 발명은 또한 C. 수이스의 효율적인 검출을 가능하게 하는 개선된 샘플 처리의 설계로부터 기인한다.

따라서, 본 발명은 C. 수이스의 게놈 내 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 샘플에서 C. 수이스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 통상적으로 시험관 내에서 구현된다.

본 방법은 특정 프로브를 사용하여 앰플리콘의 존재 (또는 부재) 를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 방법은 증폭 전에 샘플을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 특정 프라이머 및 프로브뿐만 아니라 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 방법, 시약 및/또는 키트를 사용하여, 샘플에서 C. 수이스 감염을 검출하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (i) 상기에 정의된 바와 같은 방법, 키트 또는 시약을 사용하여 감염을 검출 또는 확인하는 단계 및 (ii) 감염을 치료하는 단계를 포함하는, 포유동물, 특히 새끼 돼지에서 C. 수이스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

표적화된 게놈 서열 및 프라이머

본 발명은 C. 수이스의 미토콘드리아 게놈의 16S-23S rRNA ITS 영역 내 게놈 서열을 표적화하는 것이 효율적이고 더욱 특이적인 검출을 허용한다는 것을 보여준다. 더욱 구체적으로, 본 발명은, 특히, C. 수이스의 미토콘드리아 게놈의 16S-23S rRNA ITS 영역 내 400 bp 미만의 서열의 증폭에 기초한다. 더 바람직하게는, 증폭된 서열은 50 bp 초과 내지 250 bp 미만, 더욱 더 바람직하게는 50 bp 초과 및 200 bp 미만을 함유한다.

특정한 일 구현예에서, 증폭은 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머로 수행되며, 여기서 역방향 프라이머는 하기 게놈 서열의 전부 또는 일부에 특이적(즉, 완벽하게 상보적)으로 혼성화된다: 5'-GCTTCGAATGGCCGCATAAAGG-3'(서열 번호 1). 프라이머는 (전부 또는 부분적으로) 상기 서열과 완전히 또는, 상기 표적 게놈 서열의 적어도 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 또는 적어도 상기 서열의 80%(이러한 경우에, 프라이머의 나머지 부분은 C. 수이스의 게놈에서 서열 번호 1의 측면 서열에 상보적임)에 중첩될 수 있다.

바람직한 프라이머는 통상적으로 유리하게는 5 내지 50개 염기, 바람직하게는 5 내지 30개 염기, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 30개, 또는 15 내지 25개 길이인 단일-가닥 핵산을 포함한다.

상기에 나타낸 바와 같이, 역방향 프라이머는 상기 표적 서열 상에 중심을 두거나, 그와 부분적으로, 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 또는 적어도 80% 만큼 중첩될 수 있다. 80%의 중첩은 프라이머가 서열 번호 1의 적어도 18개의 연속 염기와 중첩되어야 함을 나타낸다.

본 발명에 사용하기 위한 적합한 역방향 프라이머의 구체적이고 바람직한 예가 하기에 개시된다:

CCTTTATGCGGCCATTCGAAGC(서열 번호 2)

CCTTTATGCGGCCATTCGAA(서열 번호 3)

TTTATGCGGCCATTCGAAGC(서열 번호 4)

TTATGCGGCCATTCG(서열 번호 5)

TATGCGGCCATTCGAAGCAGCC(서열 번호 6)

본 발명의 추가의 목적은 C. 수이스를 검출하는 방법에서, 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 샘플에서 C. 수이스 게놈 서열을 증폭시키기 위한, 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머를 이용한 샘플 내 핵산 증폭 단계를 포함하는, 상기 샘플에서 C. 수이스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

정방향 프라이머는, 역방향 프라이머와 조합하여, 50 내지 400 bp, 바람직하게는 50 내지 250 bp, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 200 bp의 C. 수이스 게놈 서열의 증폭을 가능하게 하는 임의의 프라이머일 수 있다.

본 발명에 사용하기에 적합한 바람직한 정방향 프라이머의 예가 하기에 제공된다:

GATCATTCACACGTGGCCCTT(서열 번호 7)

TCATTCACACGTGGCCCTT(서열 번호 8)

GATCATTCACACGTGGCCC(서열 번호 9)

ATCATTCACACGTGGCCCT(서열 번호 10)

GATCATTCACACGTGGCCCTTGA(서열 번호 11)

TCATTCACACGTGGCCCTTGA(서열 번호 12)

따라서, 본 발명의 목적은 한 쌍의 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 샘플 내 핵산 증폭 단계를 포함하는, 상기 샘플에서 C. 수이스를 검출하는 방법에 관한 것으로, 역방향 프라이머는 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택되고, 정방향 프라이머는 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나로부터 선택된다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 프라이머의 임의의 조합이 적합하다.

본 발명의 추가의 목적은 샘플에서 C. 수이스 게놈 서열을 증폭시키기 위한 한 쌍의 핵산 프라이머의 용도에 관한 것으로, 쌍은 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 역방향 프라이머 및 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나로부터 선택된 정방향 프라이머를 포함한다.

증폭 방법

샘플 내의 핵산을 증폭시키기 위한 다양한 기술이 본 발명에 사용될 수 있다. 증폭은 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR, 전사 매개 증폭(TMA), 가닥 치환 증폭(SDA), NASBA, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO)의 사용, 대립유전자 특이적 증폭, RNAseq와 같은, 당업자에게 그 자체로 알려진 다양한 방법에 따라 수행될 수 있다. 검출은 또한 예를 들어, 서던 블롯, 단일-가닥 형태 분석(SSCA), 원위치 혼성화(예를 들어, FISH), 겔 이동, 이종이중체 분석, 차세대 서열분석 등을 사용하여 이루어질 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 증폭은 예를 들어 RT-PCR, 정량적 PCR(qPCR) 또는 라이게이션-PCR과 같은 PCR에 의해 수행된다. 더 바람직하게는, 본 방법은 qPCR을 사용한다.

바람직한 일 구현예에 따르면, 본 방법은 qPCR 증폭에 의해 C. 수이스의 존재 또는 부재 또는 (상대적) 양을 결정하는 단계를 포함한다.

방법은 통상적으로 시험관 내에서 시험 샘플 내에서 수행된다. 본 방법은 개별 샘플, 또는 플레이트와 같은 다중지지체 상에서 수행되어, 여러 시험이 본질적으로 동시에 수행되게 할 수 있다.

프로브

특정한 일 구현예에서, 증폭은 앰플리콘의 존재의 검출을 가능하게 하는 표지된 프로브의 존재 하에 수행된다. 프로브는, 통상적으로, 증폭된 서열의 일부에 특이적으로 혼성화하는, 5 내지 30 nt 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 프로브는, 통상적으로, 표지, 예컨대, 형광 표지(예를 들어, SYBR, FAM, BHQ1 등)로 표지된다. 바람직한 일 구현예에서, 프로브는 서열 번호 13

GCGTTCGGGGGAAGCTGTG(서열 번호 13)이거나 이의 전부 또는 일부를 포함한다

이러한 프로브는, 위의 프라이머와 조합하여, 특히 qPCR에 의한 C. 수이스의 효율적이고 더 특이적인 검출을 가능하게 한다.

다른 대안적인 프로브가 하기 서열로부터 선택될 수 있다:

GAGCGTTCGGGGGAAGCTGTG(서열 번호 14)

GCGTTCGGGGGAAGCTGTGT(서열 번호 15)

GAGCGTTCGGGGGAAGCTGTGT(서열 번호 16)

샘플 및 처리

본 발명의 방법은 임의의 샘플, 예컨대, 임의의 생물학적 샘플에 적용 가능하다. C. 수이스가 돼지(swine)와 같은 포유동물에서 심각한 감염의 원인이기 때문에, 샘플은 통상적으로 C. 수이스 감염이 의심되는 시험 포유동물, 예컨대 돼지로부터 수득된 (또는 유래된) 생물학적 샘플이다. 이러한 생물학적 샘플의 구체적인 예는 핵산을 포함할 수 있는 임의의 조직, 기관 또는 생물학적 유체(예컨대, 대변, 배설물, 혈액, 소변, 타액 등)를 포함한다. 유리하게, 본 방법은 배설물과 같은 생물학적 샘플로 구현될 수 있다. 본 발명은 또한 C. 수이스의 검출이 필요하거나 사용되는 임의의 샘플(천연, 토양 등)에 적용될 수 있다.

샘플은, 예를 들어, 용해(기계적, 화학적, 효소 등), 정제, 원심분리, 분리 등에 의해 표적 분자에 대한 접근을 용이하게/정규화하기 위해 사전-처리될 수 있다. 샘플은 또한 표적 분자의 존재의 결정을 용이하게 하기 위해 표지(비오틴, 형광, 방사성, 발광, 화학 또는 효소 표지 등)될 수 있다. 또한, 샘플의 핵산은 분리, 처리, 농축, 정제, 단편화 등이 될 수 있다. 통상적으로, 샘플은 DNA 추출을 위해 처리된다.

특정한 일 구현예에서, 샘플은 포유동물로부터의 배설물, 더욱 구체적으로, 돼지 배설물(또는 대변)이다.

추가의 특정한 일 구현예에서, 샘플은 DNA 추출을 위해 전처리된 배설물이다. 바람직하게는, DNA 추출은 용해 및, 선택적으로, 원심분리 및/또는 단백질분해효소 처리를 포함한다.

특정한 일 구현예에서, 본 방법은 다음을 포함한다:

a) 시험할 포유동물의 대변 또는 배설물로부터 추출된 DNA를 포함하는 하나 또는 몇몇 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및

b) 상기에 정의된 바와 같은 방법에 따라 상기 샘플에서 C. 수이스의 존재를 검출하는 단계.

키트

본 출원의 또 다른 목적은 상기에 정의된 바와 같은 프라이머를 포함하는 키트에 관한 것이다.

키트는 통상적으로 동일하거나 별도의 용기에 있을 수 있는, 상기에 정의된 바와 같은 한 쌍의 프라이머를 포함한다. 키트는 또한 통상적으로 상기에 정의된 바와 같은 프로브, 및/또는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다.

본 발명의 특정 목적은 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머 및 증폭을 수행하기 위한 하나 이상의 시약(들)을 포함하는 키트에 있다.

특정한 일 구현예에서, 키트는 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머를 추가로 포함한다.

추가의 특정한 일 구현예에서, 키트는 서열 번호 13 내지 16 중 어느 하나로부터 선택된, 표지된 프로브를 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 샘플에서 C. 수이스를 검출하기 위한, 또는 포유동물 대상체, 바람직하게는 돼지에서 C. 수이스 감염을 검출하기 위한, 상기에 정의된 바와 같은 프라이머 또는 키트의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양태 및 이점은 하기 실시예를 고려하여 명백해질 것이고, 이는 예시적이고 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.

실시예

실시예 1. 배설물 샘플로부터의 DNA 추출(몇 가지 샘플)

DNA 추출을 위해, 하기에 개시된 바와 같이 제조업체의 권장 프로토콜에 대한 변형을 가지고, QIAGEN의 QIAamp® PowerFecal® DNA 키트를 사용하였다. 원심분리 단계를 실온(15 내지 25℃)에서 수행하였다.

0.1 g의 대변을 비드 튜브에 깊게 첨가하고, 파워비드 용액을 첨가하였다. 이어서, 80 ㎕의 용액 C1을 첨가하고, 튜브를 수회 뒤집고, 이어서 65℃에서 20분 동안 가열하였다. 튜브를 수평으로 고정한 후, 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 600 ㎕의 상층액을 깨끗한 2 ㎖ 수집 튜브로 옮겨, 300 ㎕의 용액 C2를 첨가하고, 잠시 볼텍싱하여 혼합하였다. 2 내지 8℃에서 10분 동안 인큐베이션을 수행한 후, 튜브를 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 상층액을 깨끗한 2 ㎖ 수집 튜브로 옮기고, 여기에 250 ㎕의 용액 C3을 첨가하고 잠시 볼텍싱하였다. 2 내지 8℃에서 5분 동안 인큐베이션을 수행한 다음, 튜브를 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 상층액을 깨끗한 2 ㎖ 수집 튜브로 옮기고, 여기에 1200 ㎕의 용액 C4를 첨가하고 볼텍싱하였다. 다음으로, 650 ㎕의 상층액을 MB 스핀 컬럼 상에 로딩하고 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 통과액을 폐기하고, 단계를 2회 반복하였다(모두 3개의 로딩). 500 ㎕의 용액 C5를 첨가하고 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 통과액을 폐기하고, 나머지를 13,000 × g에서 2분 동안 다시 원심분리하였다. MB 스핀 컬럼을 깨끗한 2 ㎖ 수집 튜브에 배치하고, 100 ㎕의 용액 C6을 필터 멤브레인의 중심에 첨가한 후, 13,000 × g에서 1분 동안 원심분리하고, MB 스핀 칼럼을 폐기하였다.

튜브는 증폭에 적합한 조건 하에서 추출된 DNA를 함유한다.

실시예 2. 96 웰 플레이트 설계에서의 DNA 추출

DNA 추출을 위해, 하기에 개시된 바와 같이 제조업체의 권장 프로토콜에 대한 변형을 가지고, QIAGEN의 QIAamp® 96 PowerFecal QIAcube® HT 키트(QIAcube® HT 핵산 추출 디바이스와 함께)를 사용하였다.

최대 100 mg의 각각의 대변 샘플을 Pathogen 용해 튜브 L 내로 페이싱하고, 1000 ㎕의 예비가온된 완충제 PW1을 각각의 샘플에 첨가한 다음, 이를 20분 간 20 ㎐로 TissueLyser II에서 균질화하였다. 튜브를 최대 속도로 1분 간 원심분리하여 대변 입자를 펠렛화하였다. 대략 400 ㎕의 상층액을 새로운 1.5 ㎖ 원심분리 튜브로 피펫팅한다. 150 ㎕ 완충제 C3을 상층액에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 4℃에서 5 내지 10분 간 인큐베이션을 유지한 후, 2분 간 최대 속도로 원심분리하였다. 20 ㎕ 단백질분해효소 K를 새로운 S-블록 웰의 각각의 웰에 첨가하고, 이전 단계로부터의 300 ㎕의 상층액 각각을 이들 웰에 첨가하고, 혼합하고, 실온(15 내지 25℃)에서 10분 간 인큐베이션하였다. 이어서, 소프트웨어의 지시에 따라, "QIAcube HT 상 QIAamp DNA 프로토콜"로 DNA 추출을 완료하였다.

과정 종료 시, 각각의 용출 마이크로튜브에서 100 ㎕의 추출물을 얻었고 이는 증폭을 위한 상태이다.

실시예 3. 증폭에 의한 C, 수이스의 검출

qPCR에 의해 검출을 수행하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:

정방향 프라이머: GATCATTCACACGTGGCCCTT, 서열 번호 7;

역방향 프라이머: CCTTTATGCGGCCATTCGAAGC; 서열 번호 2

프로브: FAM-GCGTTCGGGGGAAGCTGTG-BHQ1; 서열 번호 13

하기 반응 혼합물을 사용하였다 (QIAGEN의 QuantiNova Probe RT-PCR키트를 기반으로 함). 다른 고품질 마스터믹스가 적용가능할 수 있다.

3.4 ㎕ 몰. 생물학적 등급 H₂O

10 ㎕ QuantiNova MasterMix(2x)

0.1 ㎕ ROX^*

1 ㎕ 정방향 프라이머(10 μM)

1 ㎕ 역방향 프라이머(10 μM)

0.5 ㎕ 프로브(10 μM)

4 ㎕ 추출된 DNA

최종 부피: 20 ㎕

온도 프로파일:

95℃ 10분

95℃ 10초의 40 사이클

60℃ 40초-FAM(녹색) 채널 상 데이터 획득

처음 40회 사이클 동안 검출가능한 Ct를 생성하는 샘플은 양성으로 간주되어야 한다.

결과는 이러한 프로토콜을 사용하여 생물학적 샘플로부터 C. 수이스를 효율적으로 검출할 수 있음을 보여준다. 검정은 시스토이소스포라 수이스에 특이적이고, C. 오치오엔시스 및 C. 벨리에는 특이적이지 않은 것으로 밝혀졌다.

하기 조합의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있다:

Claims (22)

1. C. 수이스(C. suis)의 미토콘드리아 게놈의 16S-23S rRNA ITS 영역 내에서 400 bp 미만의 표적 서열의 증폭 단계를 포함하는, 샘플에서 C. 수이스를 검출하는 시험관 내 방법.
2. 제1항에 있어서, 증폭은 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 한 쌍의 프라이머로 수행되되, 상기 역방향 프라이머는 하기 게놈 서열 5'-GCTTCGAATGGCCGCATAAAGG-3'(서열 번호 1)의 전부 또는 일부에 특이적으로 혼성화되는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 서열 번호 1(전부 또는 부분적으로) 또는 서열 번호 1의 적어도 60%에 완전히 중첩되되, 상기 프라이머의 나머지 부분은 C. 수이스의 게놈 내 서열 번호 1의 측면 서열에 상보적인, 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 정방향 및 역방향 프라이머는 5 내지 50개 염기, 바람직하게는 5 내지 30개 염기, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 30개 염기, 또는 15 내지 25개 염기 사이의 길이를 갖는 단일-가닥 핵산을 포함하는, 방법.
5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 역방향 프라이머는 서열 번호 2인, 방법.
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는, 상기 역방향 프라이머와 조합하여, 50 내지 400 bp, 바람직하게는 50 내지 250 bp, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 200 bp의 C. 수이스 게놈 서열의 증폭을 가능하게 하는 프라이머인, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 역방향 프라이머는 서열 번호 7인, 방법.
8. 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머를 이용한 샘플 내 핵산 증폭 단계를 포함하는, 상기 샘플에서 C. 수이스를 검출하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 한 쌍의 정방향 및 역방향 핵산 프라이머를 이용한 상기 샘플 내 핵산 증폭 단계를 포함하되, 상기 역방향 프라이머는 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택되고, 상기 정방향 프라이머는 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나로부터 선택되며, 바람직하게는, 상기 역방향 프라이머는 서열 번호 2이고, 상기 정방향 프라이머는 서열 번호 7인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭은 PCR 증폭, 더욱 바람직하게는 qPCR 증폭인, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 포유동물, 바람직하게는 돼지(또는 새끼 돼지)로부터의 생물학적 샘플인, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 샘플은, 바람직하게는 돼지 또는 새끼 돼지로부터의 배설물 또는 대변이거나 이로부터 수득되는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 샘플은 대변으로부터 추출된 DNA이거나 이를 포함하는, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭은 5 내지 50 사이클, 예컨대 20 내지 40 사이클을 포함하는, 방법.
15. 제10항에 있어서, 앰플리콘은 프로브로 검출되는, 방법.
16. C. 수이스를 검출하는 방법에서 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머의 용도.
17. 샘플에서 C. 수이스 게놈 서열을 증폭하기 위한, 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머의 용도.
18. 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 핵산 프라이머.
19. 샘플에서 C. 수이스 게놈 서열을 증폭하기 위한 한 쌍의 핵산 프라이머의 용도로서, 쌍은 서열 번호 2 내지 6 중 어느 하나로부터 선택된 역방향 프라이머 및 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나로부터 선택된 정방향 프라이머를 포함하는, 용도.
20. 제18항의 핵산 프라이머 및 증폭을 수행하기 위한 하나 이상의 시약(들)을 포함하는 키트.
21. 제20항에 있어서, 서열 번호 7 내지 12 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머를 추가로 포함하는, 키트.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 증폭을 수행하기 위한 용기 및/또는 매뉴얼을 추가로 포함하는, 키트.