KR20230074194A - 신규 세린 프로테아제 - Google Patents

Abstract

개선을 나타내도록 조작된 세린 프로테아제, 뿐만 아니라 이들 신규 세린 프로테아제를 포함하는 세포 및 유기체, 및 식물 건강 또는 성장을 개선시키기 위해 재조합 세린 프로테아제를 사용하는 방법.

Description

신규 세린 프로테아제

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 9월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/081,271에 대한 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록의 포함

2021년 8월 4일에 생성되고 14개의 서열을 포함하는 32 킬로바이트 (엠에스-윈도우즈(MS-WINDOWS)®에서 측정됨)인 파일명 "BCS209004WO_ST25.txt"의 서열 목록은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본 발명은 개선을 나타내도록 조작된 재조합 세린 프로테아제, 뿐만 아니라 이들 신규 세린 프로테아제를 포함하는 세포 및 유기체에 관한 것이다. 식물 건강 또는 성장을 개선시키기 위해 재조합 세린 프로테아제를 사용하는 방법이 추가로 제공된다.

식물 기생충 및 병원체는 상업적 작물에서 수확량 손실의 주요 원인이며, 이는 유의한 경제적 비용을 초래한다. 종자, 잎 또는 토양 처리를 통한 미생물로의 식물의 처리는 외인성 단백질을 식물 또는 주변 토양에 제공함으로써 식물 건강을 개선시킬 수 있다. 박테리아의 특정 균주는 세린 프로테아제의 발현으로 인해 식물을 해충, 예컨대 식물-기생 선충류 및 진균 식물 병원체로부터 보호한다. 세린 프로테아제는 단백질의 특이적 인식 부위 내의 세린 잔기에서 펩티드 결합을 절단하고, 선충류의 장 조직을 분해할 뿐만 아니라 특정 진균에 특이적인 항진균 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다양한 농업 재배지 환경에서 작물 식물 성장 및 수확량을 추가로 개선시키는 데 사용될 수 있는 신규 미생물 조성물 및 방법의 개발에 대한 계속적인 필요가 관련 기술분야에 존재한다.

한 측면에서, 본 발명은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 폴리펩티드는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 잔기 49에 상응하는 잔기에서 아스파르트산을 포함할 수 있거나, 또는 서열식별번호: 1의 잔기 86에 상응하는 잔기에서 히스티딘을 포함할 수 있거나, 또는 서열식별번호: 1의 잔기 244에 상응하는 잔기에서 세린을 포함할 수 있거나, 또는 이들 3개의 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 포함할 수 있고, 서열식별번호: 1에 비해 적어도 제1 아미노산 잔기 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 잔기 49에 상응하는 잔기에서 아스파르트산, 및 서열식별번호: 1의 잔기 86에 상응하는 잔기에서 히스티딘, 및 서열식별번호: 1의 잔기 244에 상응하는 잔기에서 세린을 포함할 수 있거나, 또는 이들 3개의 잔기 중 어느 것 또는 모두의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제공된 재조합 DNA 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 잔기 177-243 중 어느 것에 상응하는 적어도 1개의 잔기의 아미노산 결실, 또는 서열식별번호: 1의 잔기 181-240 중 어느 것에 상응하는 적어도 1개의 잔기의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 결실은 서열식별번호: 1의 잔기 181-240의 전부 미만에 상응한다. 추가 실시양태에서, 코딩된 폴리펩티드는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 226-241에 상응하는 잔기의 아미노산 결실, 또는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 182-211에 상응하는 잔기의 아미노산 결실, 또는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 178-243에 상응하는 잔기의 아미노산 결실, 또는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 178-240에 상응하는 잔기의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 서열식별번호: 2 또는 4-13 중 어느 것의 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 증가된 세린 프로테아제 활성을 나타낼 수 있거나, 또는 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 증가된 살선충 활성 또는 증가된 항진균 활성을 나타낼 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 또한 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 동일하거나 증가된 기질 결합을 나타낼 수 있다. 코딩된 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 잔기 122에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 123에 상응하는 잔기에서 세린, 서열식별번호: 1의 잔기 124에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 125에 상응하는 잔기에서 글루타민, 서열식별번호: 1의 잔기 126에 상응하는 잔기에서 티로신, 서열식별번호: 1의 잔기 146에 상응하는 잔기에서 메티오닌, 서열식별번호: 1의 잔기 147에 상응하는 잔기에서 세린, 서열식별번호: 1의 잔기 148에 상응하는 위치에서 류신, 서열식별번호: 1의 잔기 149에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 150에 상응하는 잔기에서 글리신, 및 서열식별번호: 1의 잔기 151에 상응하는 잔기에서 프롤린, 또는 이들 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 재조합 DNA 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2 또는 4-13, 예를 들어 서열식별번호: 2, 4-6 또는 8-10 중 어느 것으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 구축물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포, 예컨대 바실루스(Bacillus) 속으로부터의 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실루스 미코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 슈도미코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 사마니이(Bacillus samanii), 바실루스 가에모켄시스(Bacillus gaemokensis), 바실루스 웨이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis), 및 바실루스 토요넨시스(Bacillus toyonensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 바실루스 숙주 세포일 수 있다. 숙주 세포 및 농업상 허용되는 담체를 포함하는 제제가 추가로 제공된다. 본원에 개시된 제제로 처리된 식물 종자가 또한 제공된다.

추가 측면에서, 본원에 제공된 재조합 숙주 세포를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하는 것을 포함하는, 식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 선충류를 방제하는 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 폴리펩티드, 예컨대 서열식별번호: 1의 잔기 49에 상응하는 잔기에서 아스파르트산, 또는 서열식별번호: 1의 잔기 86에 상응하는 잔기에서 히스티딘, 또는 서열식별번호: 1의 잔기 244에 상응하는 잔기에서 세린, 또는 이들 3개의 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 포함하고, 서열식별번호: 1에 비해 적어도 제1 아미노산 잔기 결실을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 식물 부분, 및 트랜스제닉 종자를 제공한다. 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드를 발현하거나 또는 그를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 식물 부분, 및 트랜스제닉 종자를 추가로 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 잔기 49에 상응하는 잔기에서 아스파르트산, 서열식별번호: 1의 잔기 86에 상응하는 잔기에서 히스티딘 및 서열식별번호: 1의 잔기 244에 상응하는 잔기에서 세린, 또는 이들 3개의 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 포함하는 것인 트랜스제닉 식물 세포, 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 식물 부분 및 트랜스제닉 종자를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포, 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 식물 부분 및 트랜스제닉 종자는 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하거나 또는 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 잔기 49에 상응하는 잔기에서의 아스파르트산, 서열식별번호: 1의 잔기 86에 상응하는 잔기에서의 히스티딘 및 서열식별번호: 1의 잔기 244에 상응하는 잔기에서의 세린, 또는 이들 3개의 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 포함한다. 이들 실시양태의 한 측면에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1을 포함하고; 또 다른 측면에서 폴리펩티드는 서열식별번호: 2를 포함하고; 또 다른 측면에서 폴리펩티드는 서열식별번호: 4-13 중 어느 하나를 포함한다.

본원에 제공된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 식물 세포, 식물, 식물 부분 및 종자는 식물-기생 선충류에 대한 저항성 또는 진균 저항성을 나타낼 수 있다. 본원에 개시된 재조합 DNA 분자를 포함하는 자손 식물이 추가로 제공된다.

또한, 식물 세포를 본 발명의 재조합 DNA 분자로 형질전환시켜 형질전환된 식물 세포를 생산하고, 형질전환된 식물 세포를 재생시켜 트랜스제닉 식물을 생산하는 것을 포함하는, 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 생성된 트랜스제닉 식물은 식물-기생 선충류에 대한 증가된 저항성 또는 진균 저항성을 나타낼 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물을 그 자체와 또는 또 다른 식물과 교배시켜 1종 이상의 자손 식물을 생산하고, 재조합 DNA 분자를 포함하는 자손 식물을 선택하는 것을 포함하는, 본원에 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 자손 식물은 식물-기생 선충류에 대한 증가된 저항성 또는 진균 저항성을 나타낼 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명은 a) 융합 단백질을 재조합 바실루스 숙주 세포의 포자외막으로 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편; 및 b) 본원에 제공된 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편은 서열 X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆을 포함하고, 여기서:

X₁은 임의의 아미노산이거나 또는 부재하고;

X₂는 페닐알라닌 (F), 류신 (L), 이소류신 (I), 또는 메티오닌 (M)이고;

X₃은 임의의 아미노산이고;

X₄는 프롤린 (P) 또는 세린 (S)이고;

X₅는 임의의 아미노산이고;

X₆은 류신 (L), 아스파라긴 (N), 세린 (S), 또는 이소류신 (I)이고;

X₇은 발린 (V) 또는 이소류신 (I)이고;

X₈은 글리신 (G)이고;

X₉는 프롤린 (P)이고;

X₁₀은 트레오닌 (T) 또는 프롤린 (P)이고;

X₁₁은 류신 (L) 또는 페닐알라닌 (F)이고;

X₁₂는 프롤린 (P)이고;

X₁₃은 임의의 아미노산이고;

X₁₄는 임의의 아미노산이고;

X₁₅는 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 또는 트레오닌 (T)이고;

X₁₆은 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 세린 (S)이다.

또 다른 실시양태에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 서열식별번호: 14를 포함한다.

융합 단백질을 포함하는 재조합 숙주 세포, 예컨대 박테리아 숙주 세포가 추가로 제공된다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질을 포함하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 박테리아 숙주 세포가 제공된다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 미코이데스, 바실루스 슈도미코이데스, 바실루스 사마니이, 바실루스 가에모켄시스, 바실루스 웨이헨스테파넨시스, 또는 바실루스 토요넨시스이다. 이러한 실시양태의 특정한 측면에서, 바실루스 세레우스 패밀리 구성원은 바실루스 투린기엔시스이다. 박테리아 숙주 세포를 포함하는 발효 생성물, 및 발효 생성물 및 농업상 허용되는 담체를 포함하는 제제가 추가로 제공된다.

추가 측면에서, 본원에 제공된 제제를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하는 것을 포함하는, 식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 선충류를 방제하는 방법이 제공된다.

도 1은 단백질을 발현하지 않거나, 야생형 세린 프로테아제 (서열식별번호: 1)를 발현하거나, 또는 세린 프로테아제 변이체 (서열식별번호: 2)를 발현하는 바실루스 투린기엔시스의 전체 브로쓰 배양물에서의 세린 프로테아제 활성을 보여준다.
도 2a-2f는 야생형 바실루스 피르무스(Bacillus firmus) DS-1 세포내 세린 프로테아제 (서열식별번호: 1), 바실루스 피르무스로부터의 세린 프로테아제의 변이체 (서열식별번호: 2), 상동성 모델링을 위한 상동 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3), 서열식별번호: 2와 비교하여 중간 결실을 포함하는 세린 프로테아제 변이체 (서열식별번호: 4-6), 및 서열식별번호: 2와 비교하여 연장된 결실을 포함하는 세린 프로테아제 변이체 (서열식별번호: 7-13)의 다중 서열 정렬을 보여준다.
도 3은 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 야생형 바실루스 피르무스 DS-1 세린 프로테아제 (서열식별번호: 1)의 구조를 보여준다.
도 4는 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 바실루스 피르무스 균주 DS-1로부터의 세린 프로테아제의 변이체 (Sep1 말단절단) (서열식별번호: 2)의 구조를 보여준다.
도 5는 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 중간_결실_1의 변이체 (서열식별번호: 4)의 구조를 보여준다.
도 6은 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 중간_결실_2의 변이체 (서열식별번호: 5)의 구조를 보여준다.
도 7은 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 중간_결실_3의 변이체 (서열식별번호: 6)의 구조를 보여준다.
도 8은 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 연장된_결실_1의 변이체 (서열식별번호: 7)의 구조를 보여준다.
도 9는 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 연장된_결실_2의 변이체 (서열식별번호: 8)의 구조를 보여준다.
도 10은 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 연장된_결실_3의 변이체 (서열식별번호: 9)의 구조를 보여준다.
도 11은 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 연장된_결실_4의 변이체 (서열식별번호: 10)의 구조를 보여준다.
도 12는 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 연장된_결실_5의 변이체 (서열식별번호: 11)의 구조를 보여준다.
도 13은 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 연장된_결실_6의 변이체 (서열식별번호: 12)의 구조를 보여준다.
도 14는 (a) 상동성 모델링에 사용된 세린 프로테아제 주형 (서열식별번호: 3)의 구조; 및 (b) 상동성 모델링 후 세린 프로테아제 연장된_결실_7의 변이체 (서열식별번호: 13)의 구조를 보여준다.

서열의 간단한 설명

서열식별번호: 1은 야생형 바실루스 피르무스 DS-1 세포내 세린 프로테아제 (유니프롯 수탁 번호 W7KRH1_BACFI)이다.

서열식별번호: 2는 서열식별번호: 1의 위치 181-240에 상응하는 잔기가 결실된 서열식별번호: 1의 바실루스 피르무스 DS-1 세포내 세린 프로테아제의 변이체이다.

서열식별번호: 3은 상동성 모델링을 위한 주형으로서 사용된 바실루스 푸밀루스로부터의 세린 프로테아제 (유니프롯 수탁 번호 P07518 (SUBT_BACPU))이다.

서열식별번호: 4는 서열식별번호: 1의 위치 226-242에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 중간_결실_1이다.

서열식별번호: 5는 서열식별번호: 1의 위치 212-241에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 중간_결실_2이다.

서열식별번호: 6은 서열식별번호: 1의 위치 182-211에 상응하는 잔기가 결실되고, 서열식별번호: 1의 위치 243에 상응하는 잔기에서 D가 T를 치환한 변이체 세린 프로테아제인 중간_결실_3이다.

서열식별번호: 7은 서열식별번호: 1의 위치 181-243에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 연장된_결실_1이다.

서열식별번호: 8은 서열식별번호: 1의 위치 178-240에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 연장된_결실_2이다.

서열식별번호: 9는 서열식별번호: 1의 위치 178-243에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 연장된_결실_3이다.

서열식별번호: 10은 서열식별번호: 1의 위치 177-243에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 연장된_결실_4이다.

서열식별번호: 11은 서열식별번호: 1의 위치 176-243에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 연장된_결실_5이다.

서열식별번호: 12는 서열식별번호: 1의 위치 175-243에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 연장된_결실_6이다.

서열식별번호: 13은 서열식별번호: 1의 위치 174-243에 상응하는 잔기가 결실된 변이체 세린 프로테아제인 연장된_결실_7이다.

서열식별번호: 14는 비. 안트라시스 스턴(B. anthracis Sterne)으로부터의 BclA의 아미노산 1-41이다.

상세한 설명

식물 해충 및 병원체는 작물 식물에 유의한 손상을 유발하여, 실질적인 경제적 손실을 초래할 수 있다. 최근 연구는 식물 건강 및 수확량을 개선시키기 위한 종자, 잎 또는 토양 처리로서 사용될 수 있는, 식물 해충 또는 병원체로부터의 손상을 감소시킬 수 있는 효소를 발현하는 박테리아 균주의 개발로 이어졌다. 그러나, 특히 광범위한 수확량 손실의 원인이 되는 특정 해충, 예컨대 식물-기생 선충류의 처리를 위한 개선된 효소가 필요하다.

세린 프로테아제를 발현하는 박테리아는 살선충뿐만 아니라 항진균 활성을 나타낸다. 본 발명은 식물 건강을 개선시키고 수확량을 증가시키기 위한, 재조합 박테리아 균주에서 발현될 수 있는 개선된 세린 프로테아제 활성을 갖는 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 제공한다.

I. 세린 프로테아제

세린 프로테아제는 가장 크고 대부분 광범위하게 분포된 부류의 프로테아제 중 1종이다. 세린 프로테아제는 단백질의 특이적 인식 부위 내의 세린 잔기에서 펩티드 결합을 절단하고, 환경에서 영양소 스캐빈징을 위해 박테리아에 의해 빈번하게 사용된다. 세린 프로테아제는 또한 선충류에서 장 조직의 소화를 통해 살선충 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 및 대두 낭포 선충류에 대한 살선충 활성을 나타내는 바실루스 피르무스 균주 DS-1의 연구는 그러한 균주에 의해 생산된 세린 프로테아제가 세린 프로테아제 활성을 갖고 선충류의 장 조직을 분해하였음을 밝혀내었다. 문헌 [Geng, C., et al., Scientific Reports, 2016, vol. 6, no. 25012].

다른 연구는 세린 프로테아제가 병원체, 예컨대 진균 식물 병원체 및 난균류, 예컨대 피티움(Pythium)에 대해 활성을 갖는다는 것을 제시하였다. 문헌 [Dunne, et al., Microbiology, 2000, vol. 146, pp. 2069-2078, 및 Yen, Y., et al., Enzyme and Microbial Technology, 2006, vol. 39, pp. 311-317].

본원에 제공된 서열식별번호: 1 및 2는 세린 프로테아제 활성을 나타내거나 또는 나타낼 것으로 예측되는 야생형 및 변이체 효소에 대한 아미노산 서열이다. 따라서, 예를 들어 서열식별번호: 1은 야생형 세린 프로테아제 효소에 대한 아미노산 서열을 제공한다. 서열식별번호: 2는 서열식별번호: 1 및 2가 81% 서열 유사성을 갖게 된 서열식별번호: 1의 아미노산 181-240의 결실을 제외하고는, 서열식별번호: 1과 동일한 효소에 대한 아미노산 서열을 제공한다. 문헌 [Geng, et al., 2016]에 언급된 촉매 잔기는 서열식별번호: 2의 변이체 세린 프로테아제 아미노산 서열에서 유지된다.

II. 세린 프로테아제 변이체

본원에 기재된 바와 같은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 바실루스 피르무스로부터의 세린 프로테아제를 포함할 수 있으며, 이는 또한 바실루스 피르무스 세린 프로테아제 효소로도 지칭된다. 또 다른 실시양태에서, 바실루스 피르무스로부터의 세린 프로테아제는 바실루스 피르무스 균주로부터의 Sep1 효소일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제는 서열식별번호: 1인 바실루스 피르무스 DS-1로부터의 Sep1 효소일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제는 또 다른 바실루스 피르무스 균주로부터의 Sep1 효소일 수 있다.

추가적으로 또는 대안적으로, 세린 프로테아제 활성을 갖는 본원에 제공된 효소는 바실루스 피르무스 박테리아로부터의 야생형 세린 프로테아제 효소의 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 치환 또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 아미노산 치환 또는 결실은 야생형 효소의 촉매 잔기를 보유하고, 동일한 조건 하에서의 야생형 세린 프로테아제 효소의 세린 프로테아제 활성과 비교하여 동일하거나 증가된 세린 프로테아제 활성을 발생시킨다.

일부 실시양태에서, 효소는 동일한 조건 하에서의 야생형 세린 프로테아제 효소의 세린 프로테아제 활성과 비교하여 증가된 세린 프로테아제 활성을 갖는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 세린 프로테아제는, 동일한 조건이지만 변이체 세린 프로테아제에 의한 처리의 부재 하에 생산된 식물과 비교하여, 처리된 식물에 대한 선충류 및/또는 선충류 손상을 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12% 감소시킨다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 세린 프로테아제는, 동일한 조건이지만 변이체 세린 프로테아제에 의한 처리의 부재 하에 생산된 식물과 비교하여, 처리된 식물에 대한 진균 성장 및/또는 진균 손상을 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12% 감소시킨다.

본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 이들이 유래된 염기 서열에 비해 1개 이상의 돌연변이, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1과 비교하여 1개 이상의 돌연변이, 결실 또는 삽입을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1-13 중 어느 것과 비교하여 1개 이상의 돌연변이, 결실 또는 삽입을 가질 수 있다. 서열식별번호: 1-13 중 어느 것으로부터 유래된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1-13 중 어느 것의 세린 프로테아제 활성을 가질 수 있다. 서열식별번호: 1-13 중 어느 것으로부터 유래된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1-13과 비교하여 증가된 세린 프로테아제 활성을 가질 수 있거나, 또는 서열식별번호: 1-13과 비교하여 감소된 세린 프로테아제 활성을 가질 수 있다.

본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 주어진 잔기에 상응하는 잔기에서 1개 이상의 돌연변이, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "서열식별번호: 1의 주어진 잔기에 상응하는 잔기"는 잔기를 포함하는 서열을 서열식별번호: 1과 최적으로 정렬한 경우에, 잔기가 서열식별번호: 1의 주어진 잔기와 정렬된 것을 의미한다. 예를 들어, 서열이 서열식별번호: 1의 잔기 49에 상응하는 잔기에서 아스파르트산을 포함하는 경우에, 서열은 2개의 서열을 최적으로 정렬하였을 때 서열식별번호: 1의 잔기 49와 정렬된 아스파르트산을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 181-240 중 어느 것에 상응하는 적어도 1개의 잔기의 아미노산 결실을 포함한다 (서열식별번호: 2에서와 같음). 이러한 실시양태의 한 측면에서, 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 181-240의 전부의 결실을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 아미노산 결실은 서열식별번호: 1의 잔기 181-240 중 어느 것에 상응하는 적어도 2개의 잔기, 적어도 3개의 잔기, 적어도 4개의 잔기, 적어도 5개의 잔기, 적어도 6개의 잔기, 적어도 7개의 잔기, 적어도 8개의 잔기, 적어도 9개의 잔기, 적어도 10개의 잔기, 적어도 11개의 잔기, 적어도 12개의 잔기, 적어도 13개의 잔기, 적어도 14개의 잔기, 적어도 15개의 잔기, 적어도 16개의 잔기, 적어도 약 20개의 잔기, 적어도 약 30개의 잔기, 적어도 약 40개의 잔기, 적어도 약 50개의 잔기, 적어도 약 51개의 잔기, 적어도 약 52개의 잔기, 적어도 약 53개의 잔기, 적어도 약 54개의 잔기, 적어도 약 55개의 잔기, 적어도 약 56개의 잔기, 적어도 약 57개의 잔기, 적어도 약 58개의 잔기, 또는 적어도 약 59개의 잔기를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 세린 프로테아제 변이체는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 182-211에 상응하는 잔기의 아미노산 결실을 포함한다 (서열식별번호: 6).

다른 실시양태에서, 본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 181-240 중 일부 또는 전부 및 추가의 아미노산 잔기의 아미노산 결실을 포함한다. 본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 226-242에 상응하는 잔기의 아미노산 결실 (서열식별번호: 4) 또는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 212-241에 상응하는 잔기의 아미노산 결실 (서열식별번호: 5)을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 177-243에 상응하는 잔기의 아미노산 결실 (서열식별번호: 10) 또는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 178-243에 상응하는 잔기의 아미노산 결실 (서열식별번호: 9) 또는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 178-240에 상응하는 잔기의 아미노산 결실 (서열식별번호: 8) 또는 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 181-243에 상응하는 잔기의 아미노산 결실 (서열식별번호: 7)을 추가로 포함할 수 있다.

제공된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 증가된 세린 프로테아제 활성 또는 증가된 항진균 활성을 나타낼 수 있다.

본원에 개시된 세린 프로테아제 변이체는 이들이 유래된 염기 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1-13 중 어느 것, 또는 하나의 예시적 실시양태에서 서열식별번호: 1과 비교하여 1개 이상의 보존적 돌연변이를 포함할 수 있다. 도 2에 제시된 바와 같이, 세린 프로테아제 변이체는 정렬된 서열 사이에 유의한 정도의 아미노산 잔기 유형 유사성을 공유한다. 예를 들어, 아미노산은 구조, 크기, 전하, 및 수중 아미노산의 용해도에 대한 영향에 따라 5개의 군으로 분류될 수 있다: 비극성 지방족 (글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 및 프롤린), 방향족 (페닐알라닌, 티로신, 트립토판), 극성 비하전 (세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민), 음으로 하전 (아스파르테이트, 글루타메이트), 및 양으로 하전 (리신, 아르기닌, 히스티딘). 따라서, 본 발명의 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1-13 중 어느 것과 비교하여 비극성 지방족 잔기가 상이한 비극성 지방족 잔기로 대체되거나, 방향족 잔기가 상이한 방향족 잔기로 대체되거나, 극성 비하전 잔기가 상이한 극성 비하전 잔기로 대체되거나, 음으로 하전된 잔기가 상이한 음으로 하전된 잔기로 대체되거나, 또는 양으로 하전된 잔기가 상이한 양으로 하전된 잔기로 대체된 보존적 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 세린 프로테아제 변이체는 또한 서열식별번호: 1-13 중 어느 것과 비교하여 아미노산 잔기가 유사한 R-기를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체된, 예를 들어 세린/트레오닌, 아스파르테이트/글루타메이트, 아스파라긴/글루타민 또는 류신/이소류신의 보존적 돌연변이를 포함할 수 있다. 보존적 돌연변이를 포함하는 세린 프로테아제 변이체는 이들이 유래된 염기 서열과 동일하거나, 더 크거나, 또는 더 낮은 세린 프로테아제 활성을 나타낼 수 있다.

본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 세린 프로테아제 활성 또는 그의 보존적 치환과 연관된 1개 이상의 보존된 잔기, 영역 또는 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 49에 상응하는 위치에서 아스파르트산 잔기를 포함할 수 있다. 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 86에 상응하는 위치에서 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 잔기 244에 상응하는 위치에서 세린 잔기를 포함할 수 있다. Asp49, His86 및 Ser244는 야생형 효소에서 촉매 트리아드에 수반되며, 이는 도 2에서 직사각형에 의해 확인된다. 문헌 [Geng, et al., 2016]. 세린 프로테아제 변이체는 또한 서열식별번호: 1의 Asp49, His86, 및 S244의 촉매 트리아드에 상응하는 잔기 중 어느 것에서 보존적 돌연변이를 포함할 수 있다. 세린 프로테아제 변이체는 또한 서열식별번호: 1의 잔기 177에 상응하는 위치에서 아스파라긴 잔기 또는 그의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 Gly122, Ser123, Gly124, Gln125 및 Tyr126 및/또는 Met146, Ser147, Leu148, Gly149, Gly150, Pro151에 상응하는 위치에서 보존된 기질 결합 홈을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 Gly122, Ser123, Gly124, Gln125 및 Tyr126 및/또는 Met146, Ser147, Leu148, Gly149, Gly150, Pro151에 상응하는 위치에서 서열식별번호: 1과 동일한 잔기를 포함한다. 본 발명의 세린 프로테아제 변이체는 또한 서열식별번호: 1의 잔기 122-126 및 146-151에 상응하는 위치에서 보존적 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 동일하거나 증가된 기질 결합을 나타낼 수 있고, 서열식별번호: 1의 잔기 122에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 123에 상응하는 잔기에서 세린, 서열식별번호: 1의 잔기 124에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 125에 상응하는 잔기에서 글루타민, 서열식별번호: 1의 잔기 126에 상응하는 잔기에서 티로신, 서열식별번호: 1의 잔기 146에 상응하는 잔기에서 메티오닌, 서열식별번호: 1의 잔기 147에 상응하는 잔기에서 세린, 서열식별번호: 1의 잔기 148에 상응하는 위치에서 류신, 서열식별번호: 1의 잔기 149에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 150에 상응하는 잔기에서 글리신, 또는 서열식별번호: 1의 잔기 151에 상응하는 잔기에서 프롤린, 또는 이들 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

본원에 제공된 세린 프로테아제 변이체는 또한 치환된 아미노산을 갖는 세린 프로테아제 변이체가 세린 프로테아제 활성을 보유하는 한, 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기에 대해 이러한 치환된 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 변이체는 합성적으로 생산되거나 조작된 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 2개 이상의 이종 폴리펩티드의 융합을 통해 생산될 수 있다. 변형된 세린 프로테아제 변이체 또는 세린 프로테아제 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 유전자 코드의 축중성으로 인해, 다양한 상이한 폴리뉴클레오티드 서열이 본원에 개시된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 코딩할 수 있다. 모든 가능한 삼중 코돈 (및 U가 또한 T를 대체하는 경우) 및 각각의 코돈에 의해 코딩되는 아미노산은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 동일한, 또는 본질적으로 동일한 본 개시내용의 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 대안적 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 것은 충분히 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다. 본 개시내용의 야생형 또는 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 대립유전자 변이체가 또한 본 개시내용의 범주 내에 포괄된다.

본 발명은 본원에 개시된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 추가로 제공한다. 프로모터 또는 다른 조절 요소와 작동가능하게 연결된, 본 발명의 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 재조합 DNA 구축물이 추가로 제공된다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 재조합 DNA 분자에 대해 이종일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "이종"은 2개 이상의 DNA 분자의 조합이 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 경우에 이러한 조합을 지칭한다. 예를 들어, 2개의 DNA 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있고/거나 2개의 DNA 분자는 상이한 유전자, 예를 들어 동일한 종으로부터의 상이한 유전자 또는 상이한 종으로부터의 동일한 유전자로부터 유래될 수 있다. 따라서, 조절 요소는 이러한 조합이 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 경우, 즉 재조합 DNA 분자가 프로모터에 작동가능하게 연결되어 자연 발생하지 않는 경우에, 작동가능하게 연결된 전사가능한 DNA 분자에 대해 이종이다.

본원에 사용된 "재조합 폴리펩티드"는 인간 개입 없이는 함께 자연 발생하지 않을 폴리펩티드의 조합을 포함하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 서로에 대해 이종인 적어도 2개의 폴리펩티드로 구성된 폴리펩티드, 자연에 존재하는 폴리펩티드 서열로부터 벗어난 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 유전자 형질전환 또는 유전자 편집에 의해 숙주 세포의 DNA 내로 혼입된 재조합 DNA 서열에 의해 발현된 폴리펩티드일 수 있다.

본 출원에서 "단리된 폴리펩티드" 또는 등가의 용어 또는 어구에 대한 언급은 폴리펩티드가 단독으로 또는 다른 조성물과 조합되어 존재하지만 그의 자연 환경 내에 존재하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 유사하게, 세린 프로테아제 또는 임의의 자연 발생 세린 프로테아제 변이체를 코딩하는 DNA 분자는, 단백질을 코딩하는 서열이 자연적으로 발견되는 박테리아의 DNA 내에 뉴클레오티드 서열이 존재하지 않는 한, 단리된 DNA 분자일 것이다. 자연 발생 세린 프로테아제의 아미노산 서열을 코딩하는 합성 뉴클레오티드 서열은 본 개시내용의 목적상 단리된 것으로 간주될 것이다. 본 개시내용의 목적상, 임의의 트랜스제닉 뉴클레오티드 서열, 즉, 식물 또는 박테리아의 세포의 게놈 내로 삽입되거나 또는 염색체외 벡터에 존재하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 플라스미드 내에 존재하든 또는 세포를 형질전환시키는데 사용된 유사한 구조 내에 존재하든, 식물 또는 박테리아의 게놈 내에 존재하든, 또는 식물 또는 박테리아로부터 유래된 조직, 자손, 생물학적 샘플 또는 범용 제품에 검출가능한 양으로 존재하든 관계 없이, 단리된 뉴클레오티드 서열인 것으로 간주될 것이다.

본 개시내용은 세린 프로테아제의 개선된 변이체가 관련 기술분야에 공지된 다양한 유전자 편집 방법을 사용하는 것에 의해 세포 내에서 조작될 수 있다는 것을 추가로 고려한다. 게놈 편집에 사용되는 이러한 기술은 ZFN (아연-핑거 뉴클레아제), 메가뉴클레아제, TALEN (전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제), 및 CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)/Cas (CRISPR-연관) 시스템을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 게놈 편집 방법은 식물 세포 내에서 형질전환된 세린 프로테아제 코딩 서열을 상이한 세린 프로테아제 코딩 서열로 변경시키는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 이들 방법을 통해, 세린 프로테아제 코딩 서열 내의 1개 이상의 코돈은 새로운 단백질 아미노산 서열을 조작하도록 변경된다. 대안적으로, 새로운 세린 프로테아제 코딩 서열을 조작하기 위해 코딩 서열 내의 단편이 대체 또는 결실되거나, 또는 추가의 DNA 단편이 코딩 서열 내로 삽입된다. 새로운 코딩 서열은 곤충 해충에 대해 증가된 활성 또는 스펙트럼과 같은 새로운 특성을 갖는 세린 프로테아제를 코딩할 수 있을 뿐만 아니라, 원래의 곤충 독소 단백질에 대해 저항성이 발생한 곤충 해충 종에 대해 활성을 제공할 수 있다. 유전자 편집된 세린 프로테아제 코딩 서열을 포함하는 식물 세포는 변형된 세린 프로테아제를 발현하는 박테리아 또는 식물 세포를 포함한 세포를 생성하기 위해 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 사용될 수 있다.

본원에 기재된 세린 프로테아제 효소의 경우에, "서열 동일성" 또는 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "% 서열 동일성"은 하나의 서열을 정렬되는 다른 서열의 정확한 카피로 변환시키기 위해 최소 수의 편집 작업 (예를 들어, 삽입, 결실 및 치환)이 필요하도록 최적의 매칭을 수득하는 방식으로 서열의 전체 길이를 정렬시키는 것에 의해 결정된다. 유럽 생물정보학 연구소 (EMBL-EBI) 웹사이트를 통해 이용가능한 알고리즘인 EMBOSS 니들 쌍별 서열 정렬이 이러한 분석의 한 예이다.

대안적으로 또는 추가로, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 1개 이상에 대해 적어도 99% 동일성을 갖는 것으로 정의된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

세린 프로테아제 활성을 갖는 효소는 서열식별번호: 1-13 중 어느 것에 대해 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, 효소는 서열식별번호: 1-13 중 어느 것을 포함할 수 있다.

대안적으로, 효소는 서열식별번호: 1-13 중 어느 것으로 이루어질 수 있다.

또한, 세린 프로테아제 활성을 갖고 서열식별번호: 1-13 중 어느 하나 이상에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 효소는 (서열식별번호: 1의 아미노산 181-240의) 서열식별번호: 2에서의 결실을 포함할 수 있다.

III. 유리 효소

본원에 기재된 효소 중 어느 것은 또한 유리 효소로서 또는 재조합 미생물에서 발현된 효소로서 사용될 수 있다.

IV. 바실루스 세레우스의 포자외막 상에서의 세린 프로테아제 변이체의 발현

본 발명의 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 변이체는 또한 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막으로 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바실루스 세레우스 박테리아에서 발현되는 경우, 이들 융합 단백질은 포자의 포자외막 층으로 표적화되고, 세린 프로테아제가 포자의 외부에 디스플레이되도록 물리적으로 배향된다.

본원에 기재된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막으로 표적화할 수 있는 임의의 표적화 서열을 포함할 수 있다. BclA 및 BclB의 N-말단 영역으로부터의 특정 서열이 펩티드 또는 단백질을 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 내생포자의 포자외막으로 표적화하는데 사용될 수 있다는 것이 이전에 발견되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 2010/0233124 및 2011/0281316, 및 문헌 [Thompson et al., "Targeting of the BclA and BclB Proteins to the Bacillus anthracis Spore Surface", Molecular Microbiology 70(2):421-34 (2008)] 참조). 또한, 바실루스 안트라시스의 BetA/BAS3290 단백질이 포자외막에 국재화된다는 것이 확인되었다. 융합 단백질 내로 혼입되고 관심 펩티드 또는 단백질을 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막으로 표적화하는데 사용될 수 있는 추가의 표적화 서열, 뿐만 아니라 포자외막 단백질 및 포자외막 단백질의 단편은 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0031948 및 2016/0108096에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

바실루스는 막대형 박테리아 속이다. 박테리아의 바실루스 세레우스 패밀리는 포자외막을 생산할 수 있는 임의의 바실루스 종을 포함한다. 따라서, 바실루스 세레우스 패밀리의 박테리아는 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 미코이데스, 바실루스 슈도미코이데스, 바실루스 사마니이, 바실루스 가에모켄시스, 바실루스 웨이헨스테파넨시스, 및 바실루스 토요넨시스 종을 포함한다. 스트레스성 환경 조건 하에, 바실루스 세레우스 패밀리 박테리아는 포자형성을 겪고, 연장된 기간 동안 휴면 상태를 유지할 수 있는 타원형 내생포자를 형성한다. 내생포자의 최외각 층은 포자외막으로 공지되어 있고, 헤어-유사 돌기의 외부 털에 의해 둘러싸인 기저 층을 포함한다. 헤어-유사 털 상의 필라멘트는 콜라겐-유사 당단백질 BclA에 의해 우세하게 형성되는 한편, 기저 층은 다수의 상이한 단백질로 구성된다. 또 다른 콜라겐-관련 단백질인 BclB도 또한 포자외막에 존재하고, 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 내생포자에 노출된다. 표면 털의 주요 구성성분인 BclA는 포자외막에 부착되며, 그의 아미노-말단 (N-말단)은 기저 층에 위치하고 그의 카르복시-말단 (C-말단)은 포자로부터 바깥쪽으로 연장된 것으로 제시되었다.

과학 문헌은 바실루스 세레우스 "패밀리" 또는 "군"을 바실루스 속 내의 하위군으로서 기재한다. 문헌 [Priest et al., "Population Structure and Evolution of the Bacillus cereus Group," J. Bacteriology, 2004, vol. 186, no. 23, pp. 7959-7970; Peng et al., "The Regulation of Exosporium-Related Genes in Bacillus thuringiensis," Nature Scientific Reports, 2016, vol. 6, no. 19005, pp. 1-12]을 참조한다. 펭(Peng) 등은 하기를 언급한다:

비. 세레우스 군의 포자는 복잡한 다층 구조이다. 핵양체 함유 코어는 포자 외피에 의해 둘러싸인 펩티도글리칸 피층 내에 봉입된다. 모든 비. 세레우스 군 종의 포자는 다른 종, 예컨대 바실루스 서브틸리스 상에는 존재하지 않는 포자외막으로 불리는 추가의 느슨한-핏팅 층에 의해 에워싸이고, 그에 대한 외피는 성숙 포자의 최외각 층을 구성한다. 포자외막은 포자의 외부 투과성 장벽으로서 작용하고 포자 생존 및 병독성에 기여하는 풍선-유사 층이다.

본 발명의 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 또한 표적화 기능을 제공하는 모티프의 관점에서 기재될 수 있다. BclA의 아미노-말단 영역 (서열식별번호: 14)과 다수의 다른 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자외막 단백질의 상응하는 아미노-말단 영역의 서열 정렬은 BclA의 아미노산 20-35에 보존된 모티프가 존재하고, BclA의 아미노산 25-35에 보다 고도로 보존된 모티프가 존재한다는 것을 보여준다. 보다 상세하게, 국제 공개 번호 WO 2019/060574의 도 1A 및 1B에 제공된 정렬을 참조한다. 이러한 보다 고도로 보존된 영역은 ExsFA/BxpB/ExsFB 및 상동체에 대한 인식 서열로서, 이는 기재된 포자외막 단백질을 포자외막의 표면 상으로 지시하고 어셈블리한다.

또한, BclA의 아미노산 20-35는 보존되고, 아미노산 25-35는 보다 보존되지만, 단백질을 포자외막으로 표적화하는 표적화 서열의 능력에는 영향을 미치지 않으면서, 이 영역에 어느 정도의 변이가 이루어질 수 있다. BclA의 아미노산 20-35와 43.8%만큼 낮은 표적화 서열 동일성을 갖고 (서열식별번호: 14), 여기서 BclA의 아미노산 25-35와의 동일성은 54.5%인 서열은 융합 단백질을 포자외막으로 표적화하는 능력을 보유한다. 일부 데이터는 PCT 공개 번호 WO 2016/044661의 실시예 59의 표 58에 제공되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

이들 데이터는 관심 단백질 (예를 들어, 효소)의 포자외막 단백질으로의 표적화가 BclA의 아미노산 20-35에 대해 50-68.8% 동일성을 갖고 (서열식별번호: 14), 여기서 BclA의 아미노산 25-35에 대한 동일성은 63.6% 내지 81.8%인 표적화 서열을 사용하여 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 모티프는 융합 단백질을 재조합 바실루스 박테리아의 포자외막으로 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편에 존재하고, 서열 X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆을 포함하며, 여기서:

X₁은 임의의 아미노산이거나 또는 부재하고;

X₂는 페닐알라닌 (F), 류신 (L), 이소류신 (I), 또는 메티오닌 (M)이고;

X₃은 임의의 아미노산이고;

X₄는 프롤린 (P) 또는 세린 (S)이고;

X₅는 임의의 아미노산이고;

X₆은 류신 (L), 아스파라긴 (N), 세린 (S), 또는 이소류신 (I)이고;

X₇은 발린 (V) 또는 이소류신 (I)이고;

X₈은 글리신 (G)이고;

X₉는 프롤린 (P)이고;

X₁₀은 트레오닌 (T) 또는 프롤린 (P)이고;

X₁₁은 류신 (L) 또는 페닐알라닌 (F)이고;

X₁₂는 프롤린 (P)이고;

X₁₃은 임의의 아미노산이고;

X₁₄는 임의의 아미노산이고;

X₁₅는 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 또는 트레오닌 (T)이고;

X₁₆은 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 세린 (S)이다.

표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편 중 어느 것은 본원에 기재된 세린 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 비롯한 임의의 관심 단백질 또는 펩티드를 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막으로 표적화하는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 융합 단백질 중 어느 것을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자형성 동안, 표적화 모티프, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 포자 포자외막 어셈블리 기구에 의해 인식되고 포자외막에 대해 지시되어, 포자의 외부에 융합 단백질의 단백질 또는 펩티드의 관심 부분 (예를 들어, 세린 프로테아제 활성을 갖는 효소)의 디스플레이를 발생시킨다.

상이한 표적화 서열의 사용은 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 포자의 표면 상에서의 융합 단백질의 발현 수준의 제어를 가능하게 한다. 본원에 기재된 특정 표적화 서열의 사용은 융합 단백질의 보다 높은 발현 수준을 발생시킬 것인 반면, 다른 표적화 서열의 사용은 포자의 표면 상에서의 융합 단백질의 보다 낮은 발현 수준을 발생시킬 것이다.

본원에 기재된 융합 단백질 중 어느 것에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 그의 카르복시 말단에 아미노산 서열 GXT를 포함할 수 있고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.

본원에 기재된 융합 단백질 중 어느 것에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 서열식별번호: 14의 아미노산 20에 상응하는 표적화 서열의 위치에서 알라닌 잔기를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 융합 단백질 중 어느 것에서, 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편은 표적화 서열, 포자외막 단백질 또는 포자외막 단백질 단편의 제1 아미노산 바로 앞의 아미노산 위치에서 또는 서열식별번호: 14의 아미노산 20에 상응하는 표적화 서열의 위치에서 메티오닌, 세린 또는 트레오닌 잔기를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 바실루스 포자외막 디스플레이 (BEMD) 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 식물 (예를 들어, 식물 잎, 과실, 꽃, 줄기 또는 뿌리)에 또는 식물 성장 배지, 예컨대 토양에 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 토양 또는 또 다른 식물 성장 배지에 전달된 효소 및 단백질은 장기간 동안 토양에서 지속되고 활성을 나타낸다. 본원에 기재된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 박테리아를 식물의 토양 또는 근권 내로 도입하는 것은 많은 상이한 토양 조건에서 식물 성장의 유익한 증진 및/또는 해충, 예컨대 선충류의 방제를 발생시킨다. 이들 효소를 생성하기 위한 BEMD의 사용은 이들이 식물의 생애 첫달에 걸쳐 식물 및 근권에 그의 유익한 결과를 계속해서 발휘하도록 한다.

또한, BEMD 시스템은 국제 공개 번호 WO 2016/044661에 기재된 바와 같이, 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 포자외막이 포자로부터 떨어져 융합 단백질을 함유하는 포자외막 단편을 생성할 수 있도록 변형될 수 있다. 포자외막 단편은 또한 무세포 제제에서 식물에 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 전달하는데 사용될 수 있다.

V. 제제

본원에 제공된 재조합 세린 프로테아제 중 어느 것을 포함하는 숙주 세포를 포함하는 제제가 추가로 제공된다. 특정 예에서, 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원일 수 있다. 본원에 제공된 제제는 농업상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 본원에 제공된 재조합 세린 프로테아제 중 어느 것을 포함하는 숙주 세포로부터 유래된 포자외막 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포자외막 단편은 박테리아 숙주 세포, 예컨대 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터 유래될 수 있다. 제제는 농업상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

VI. 트랜스제닉 식물

본 발명의 측면은 본 발명에 의해 제공된 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 변이체를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 트랜스제닉 식물 조직, 트랜스제닉 식물, 및 트랜스제닉 종자를 포함한다. 본 발명은 본원에 개시된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 발현하거나 또는 이를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 트랜스제닉 식물 조직, 트랜스제닉 식물, 및 트랜스제닉 종자를 추가로 제공한다. 재조합 DNA 분자, 세린 프로테아제, 또는 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 이들 식물 세포, 식물 조직, 식물, 및 종자는 식물-기생 선충류에 대한 저항성 또는 진균 저항성을 나타낼 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 숙주 식물 세포의 형질전환에 적합한 방법은 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 (예를 들어, 재조합 DNA 구축물이 식물 염색체 내로 안정하게 통합되는) 실질적으로 임의의 방법을 포함하며, 이는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 재조합 DNA 구축물을 식물 내로 도입하기 위한 예시적이고 널리 이용되는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 아그로박테리움 형질전환 시스템이다. 트랜스제닉 식물은 식물 세포 배양 방법에 의해 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다.

본 발명의 트랜스제닉 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물 부분은 또한 1종 이상의 추가의 트랜스제닉 형질을 함유할 수 있다. 추가의 트랜스제닉 형질은 본 발명에 의해 제공된 재조합 DNA 분자를 포함하는 트랜스진을 함유하는 식물을 추가의 트랜스제닉 형질(들)을 함유하는 또 다른 식물과 교배시키는 것에 의해 도입될 수 있다. 본원에 사용된 "교배"는 2종의 개별 식물을 육종하여 자손 식물을 생산하는 것을 의미한다. 따라서, 2종의 트랜스제닉 식물을 교배시켜 트랜스제닉 형질을 함유하는 자손을 생산할 수 있다. 본원에 사용된 "자손"은 모 식물의 임의의 세대의 후손을 의미하고, 트랜스제닉 자손은 본 발명에 의해 제공되고 적어도 1종의 모 식물로부터 유전된 DNA 구축물을 포함한다. 대안적으로, 추가의 트랜스제닉 형질(들)은 그러한 추가의 트랜스제닉 형질(들)에 대한 DNA 구축물을 본 발명에 의해 제공되는 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 구축물과 함께 (예를 들어, 식물 형질전환에 사용되는 동일한 벡터의 일부로서 존재하는 모든 DNA 구축물과 함께) 공동-형질전환시키는 것에 의해, 또는 추가의 형질(들)을 본 발명에 의해 제공되는 DNA 구축물을 포함하는 트랜스제닉 식물 내로 삽입하거나 또는 그 반대로 삽입하는 것에 의해 (예를 들어, 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포에 대한 식물 형질전환 방법 중 어느 것을 사용하는 것에 의해) 도입될 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 트랜스제닉 형질을 함유하는 트랜스제닉 식물 및 자손은 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있는 임의의 육종 방법과 함께 사용될 수 있다. 2종 이상의 트랜스제닉 형질을 포함하는 식물 계통에서, 트랜스제닉 형질은 독립적으로 분리될 수 있거나, 연결될 수 있거나, 또는 3종 이상의 트랜스제닉 형질을 포함하는 식물 계통에서 둘 다의 조합일 수 있다. 영양 번식과 마찬가지로, 모 식물과의 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종교배가 또한 고려된다. 상이한 형질 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 육종 방법에 대한 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 특정한 식물 또는 종자 내의 트랜스진(들)의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 분자 생물학 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR, 및 DNA 서열분석; 생화학적 검정, 예컨대 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 또는 효소적 기능에 의한 단백질 생성물의 존재의 검출; 식물 부분 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 또한 전체 식물의 표현형 분석에 의하는 것을 포함한다.

VII. 처리된 종자

처리된 식물 종자가 추가로 제공된다. 식물 종자는 본원에 제공된 재조합 세린 프로테아제 중 어느 것을 포함하는 숙주 세포, 예컨대 재조합 박테리아로 처리될 수 있다. 재조합 박테리아는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원일 수 있다. 재조합 박테리아는 본원에 기재된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체 중 어느 것을 발현할 수 있다.

본원에 기재된 포자외막 단편 중 어느 것으로 처리된 것일 수 있는, 처리된 식물 종자가 추가로 제공된다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체 중 어느 것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 제제 중 어느 것으로 처리된 식물 종자가 추가로 제공된다.

제공된 처리된 식물 종자 중 어느 것에서, 식물 종자는 본원에 제공된 재조합 세린 프로테아제 중 어느 것을 포함하는 숙주 세포, 예컨대 재조합 박테리아에 의해, 또는 제공된 재조합 세린 프로테아제를 포함하는 포자외막 단편에 의해, 또는 제공된 재조합 세린 프로테아제를 포함하는 제제에 의해 코팅될 수 있다.

숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제는 종자 처리제, 예를 들어 종자 코팅 또는 드레싱으로서 사용될 수 있다. 종자 코팅 또는 드레싱 제제는 액체 담체 제제, 슬러리 제제 또는 분말 제제의 형태일 수 있다.

종자 코팅 또는 드레싱 제제는 종자 처리제가 종자에 점착하여 이를 코팅하는 점착성 품질을 갖도록 하기 위해 제공되는 통상적인 첨가제와 함께 적용될 수 있다. 적합한 첨가제는 활석, 흑연, 검, 안정화 중합체, 코팅 중합체, 마감 중합체, 종자 유동 및 식재성을 위한 슬립제, 화장료제, 및 셀룰로스 물질, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 등을 포함한다.

종자 처리 제제는 착색제 및/또는 다른 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

종자 처리 제제(들)는 적합한 담체, 예컨대 물 또는 분말 중에서 종자에 적용될 수 있다. 이어서, 종자를 통상적인 방식으로 건조시키고 식재할 수 있다. 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제는 용액으로서 또는 다른 상업적으로 입수가능한 첨가제와 조합되어 종자에 직접 적용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제는 묘목-허용되는 담체(들) (예를 들어, 액체 담체 또는 고체 담체)와 조합되어 적용될 수 있다.

재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 함유하는 용액은 (예를 들어, 종자 슬러리 또는 종자 침지액 중에서) 종자에 분무되거나 또는 달리 적용될 수 있다.

재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 함유하는 고체 또는 건조 물질은 또한 초기 묘목 정착 동안 효과적인 묘목 발아, 성장 및 보호를 촉진하는데 유용하다.

재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제는 가용화 담체, 예컨대 물, 완충제 (예를 들어, 시트레이트 또는 포스페이트 완충제), 다른 처리제 (예를 들어, 알콜 또는 또 다른 용매), 및/또는 임의의 가용성 작용제와 함께 사용될 수 있다.

또한, 소량의 건조제 증진제, 예컨대 저급 알콜 등이 종자 코팅 제제에 사용될 수 있다.

계면활성제, 유화제 및 보존제는 또한 종자 코팅 생성물의 안정성을 증진시키기 위해 비교적 낮은 (예를 들어, 약 0.5% w/v 이하) 수준으로 첨가될 수 있다.

종자는 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 함유하는 수용액을 종자 상에 또는 종자 위에 붓거나, 펌핑하거나, 드리즐링하거나, 또는 분무하는 것; 또는 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 컨베이어 시스템의 사용 하에 또는 사용 없이 종자 층 상에 분무하거나 또는 적용하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법을 사용하여 처리될 수 있다.

종자 처리에 유용한 혼합 장치는 텀블러, 혼합 수조, 혼합 드럼, 및 코팅 동안 종자를 담는데 사용되는 수조 또는 드럼을 포함하는 유체 적용 장치를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

종자 처리 후에, 종자는 공기-건조될 수 있거나 또는 건조 공기의 스트림이 종자 코팅의 건조를 보조하기 위해 임의로 사용될 수 있다.

재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 함유하는 종자 처리제는 임의의 상업적으로 입수가능한 종자 처리 기구를 사용하여 적용될 수 있거나, 또는 임의의 허용되는 비-상업적 방법(들)을 사용하여, 예컨대 시린지 또는 임의의 다른 종자 처리 장치의 사용에 의해 또한 적용될 수 있다.

VIII. 식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 식물 병원체를 방제하는 방법

식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 식물 해충, 예컨대 선충류를 방제하고/거나 식물 병원체를 방제하는 방법이 제공된다. 방법은 본원에 제공된 세린 프로테아제를 포함하는 숙주 세포를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하고, 식물 해충을 재조합 숙주 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 재조합 숙주 세포는 본원에 기재된 재조합 숙주 세포 중 어느 것을 포함할 수 있다. 재조합 숙주 세포는 본원에 기재된 세린 프로테아제 중 어느 것을 발현할 수 있다.

식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 식물 해충, 예컨대 선충류를 방제하고/거나 식물 병원체를 방제하기 위한 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 포자외막 단편을 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하거나 또는 식물 해충을 포자외막 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 중 어느 것으로부터 유래된 포자외막 단편을 포함할 수 있다. 포자외막 단편은 본원에 기재된 세린 프로테아제 중 어느 것을 포함할 수 있다.

식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 식물 해충, 예컨대 선충류를 방제하고/거나 식물 병원체를 방제하기 위한 또 다른 방법이 제공된다. 방법은 본원에 제공된 제제를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하는 것을 포함한다. 제제는 본원에 기재된 제제 중 어느 것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 방법은 재조합 박테리아 숙주 세포를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하기 전에 재조합 박테리아 숙주 세포를 불활성화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 방법은 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 식물 성장 배지에 적용하는 것을 포함할 수 있다.

식물 성장 배지의 사용을 수반하는 본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 식물 성장 배지는 토양, 물, 수용액, 모래, 자갈, 폴리사카라이드, 멀치, 퇴비, 초탄, 짚, 통나무, 점토, 대두분, 효모 추출물 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

식물 성장 배지는 비료를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것은 식물 성장 배지를 효소에 대한 기질로 보충하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 기질은 단백질분, 카세인, 젤라틴, 알부민, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 방법은 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 식물에 적용하는 것을 포함할 수 있다.

예를 들어, 방법은 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 식물의 뿌리에 적용하는 것을 포함할 수 있다.

대안적으로 또는 추가로, 방법은 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 잎에 적용하는 것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 방법은 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 식물 종자에 적용하는 것을 포함할 수 있다.

방법이 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 식물 종자에 적용하는 것을 포함하는 경우에, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 식물 종자에 적용하는 것은 (a) 식재 시점에 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제를 식물 종자에 적용하는 것; 또는 (b) 식물 종자를 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제로 코팅하는 것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 방제되는 식물 해충은 선형동물문, 예를 들어, 아글렌쿠스(Aglenchus) 종, 안구이나(Anguina) 종, 아펠렌코이데스(Aphelenchoides) 종, 벨로놀라이무스(Belonolaimus) 종, 부르사펠렌쿠스(Bursaphelenchus) 종, 카코파우루스(Cacopaurus) 종, 크리코네멜라(Criconemella) 종, 크리코네모이데스(Criconemoides) 종, 디틸렌쿠스(Ditylenchus) 종, 돌리코도루스(Dolichodorus) 종, 글로보데라(Globodera) 종, 헬리코틸렌쿠스(Helicotylenchus) 종, 헤미크리코네모이데스(Hemicriconemoides) 종, 헤미시클리오포라(Hemicycliophora) 종, 헤테로데라(Heterodera) 종, 호플롤라이무스(Hoplolaimus) 종, 롱기도루스(Longidorus) 종, 리구스(Lygus) 종, 멜로이도기네(Meloidogyne) 종, 멜로이네마(Meloinema) 종, 나코부스(Nacobbus) 종, 네오틸렌쿠스(Neotylenchus) 종, 파라롱기도루스(Paralongidorus) 종, 파라펠렌쿠스(Paraphelenchus) 종, 파라트리코도루스(Paratrichodorus) 종, 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종, 슈도할렌쿠스(Pseudohalenchus) 종, 프실렌쿠스(Psilenchus) 종, 푼크토데라(Punctodera) 종, 퀴니술시우스(Quinisulcius) 종, 라도폴루스(Radopholus) 종, 로틸렌쿨루스(Rotylenchulus) 종, 로틸렌쿠스(Rotylenchus) 종, 스쿠텔로네마(Scutellonema) 종, 수반구이나(Subanguina) 종, 트리코도루스(Trichodorus) 종, 틸렌쿨루스(Tylenchulus) 종, 틸렌코린쿠스(Tylenchorhynchus) 종, 크시피네마(Xiphinema) 종으로부터의 식물기생성 해충일 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 증가된 성장을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제가 적용된 종자는 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물이 적용되지 않은 종자와 비교하여 증가된 발아율을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 증가된 영양소 흡수를 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 해충, 예컨대 선충류에 대해 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 뿌리 중량당 혹생성 감소, 낭포 감소, 및/또는 선충류 감소를 포함하여, 감소된 선충류 손상을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제가 적용된 식물 또는 식물이 성장한 생육지, 예컨대 토양은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 토양 부피당 감소된 선충류 알 및/또는 감소된 선충류를 나타낼 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제는, 동일한 조건이지만 처리의 부재 하에 생산된 식물과 비교할 경우, 선충류 및/또는 선충류 손상을 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12%만큼 감소시킨다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 병원체에 대해 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 환경적 스트레스 (예를 들어, 가뭄, 홍수, 열, 동결, 염, 중금속, 낮은 pH, 높은 pH 또는 그의 임의의 조합)에 대해 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 증가된 뿌리 근류형성을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 더 높은 작물 수확량을 나타낼 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제는, 동일한 조건이지만 처리의 부재 하에 생산된 식물과 비교할 경우, 수확량 또는 총 식물 중량을 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12%만큼 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제는, 동일한 조건이지만 처리의 부재 하에 생산된 식물과 비교할 경우, 식물 활력의 일부 측면, 예컨대 발아를 적어도 약 0.5%, 또는 적어도 약 1%, 또는 적어도 약 2%, 또는 적어도 약 3%, 또는 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 6%, 또는 적어도 약 7%, 또는 적어도 약 8%, 또는 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 11%, 또는 적어도 약 12%만큼 개선시킨다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 재조합 숙주 세포, 재조합 박테리아, 포자외막 단편 또는 제제의 존재 하에 성장한 식물은 동일한 조건 하에 효소 또는 미생물의 부재 하에 성장한 식물과 비교하여 변경된 잎 노화를 나타낼 수 있다.

IX. 담체

상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 제제는 농업상 허용되는 담체를 포함한다.

농업상 허용되는 담체는 분산제, 계면활성제 (예를 들어, 중질 석유 오일, 중질 석유 증류물, 폴리올 지방산 에스테르, 폴리에톡실화 지방산 에스테르, 아릴 알킬 폴리옥시에틸렌 글리콜, 알킬 아민 아세테이트, 알킬 아릴 술포네이트, 다가 알콜, 알킬 포스페이트, 또는 그의 임의의 조합), 첨가제 (예를 들어, 오일, 검, 수지, 점토, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 테르펜, 점성 유기물, 지방산 에스테르, 황산화 알콜, 알킬 술포네이트, 석유 술포네이트, 알콜 술페이트, 소듐 알킬 부탄 디아메이트, 소듐 티오부탄 디오에이트의 폴리에스테르, 벤젠 아세토니트릴 유도체, 단백질성 물질, 또는 그의 임의의 조합), 물, 증점제 (폴리에틸렌 글리콜의 장쇄 알킬술포네이트, 폴리옥시에틸렌 올레에이트, 또는 그의 임의의 조합), 케이킹방지제 (예를 들어, 나트륨 염, 탄산칼슘, 규조토, 또는 그의 임의의 조합), 잔류물 파괴 생성물, 퇴비화 제제, 과립상 적용물, 규조토, 오일, 착색제, 안정화제, 보존제, 중합체, 코팅, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

농업상 허용되는 담체가 계면활성제를 포함하는 경우에, 계면활성제는 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.

농업상 허용되는 담체가 첨가제를 포함하고, 첨가제가 단백질성 물질을 포함하는 경우에, 단백질성 물질은 유제품, 밀가루, 대두분, 혈액, 알부민, 젤라틴, 알팔파분, 효모 추출물, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

농업상 허용되는 담체가 케이킹방지제를 포함하고, 케이킹방지제가 나트륨 염을 포함하는 경우에, 나트륨 염은 모노메틸 나프탈렌 술포네이트의 나트륨 염, 디메틸 나프탈렌 술포네이트의 나트륨 염, 아황산나트륨, 황산나트륨, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

농업상 허용되는 담체는 버미큘라이트, 목탄, 당 공장 탄산화 프레스 머드, 왕겨, 카르복시메틸 셀룰로스, 토탄, 펄라이트, 미세 모래, 탄산칼슘, 가루, 명반, 전분, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 제제 중 어느 것은 종자 코팅 제제 (예를 들어, 종자에 적용하기 위한 수성 또는 오일-기재 용액 또는 종자에 적용하기 위한 분말 또는 과립상 제제), 식물 또는 식물 성장 배지에 적용하기 위한 액체 제제 (예를 들어, 농축 제제 또는 즉시 사용가능한 제제), 또는 식물 또는 식물 성장 배지에 적용하기 위한 고체 제제 (예를 들어, 과립상 제제 또는 분말 작용제)를 포함할 수 있다.

농업상 허용되는 담체는 제제 성분을 포함할 수 있다. 제제 성분은 습윤제, 증량제, 용매, 자발성 촉진제, 유화제, 분산제, 결빙 보호제, 증점제 및/또는 아주반트일 수 있다. 한 실시양태에서, 제제 성분은 습윤제이다.

본 발명의 조성물은 회수율, 효능 또는 물리적 특성을 개선시키고/거나 가공, 포장 및 투여를 보조하기 위해 본 발명의 조성물에 첨가되는 제제 성분을 포함할 수 있다. 이러한 제제 성분은 개별적으로 또는 조합되어 첨가될 수 있다.

제제 성분은 효능, 안정성 및 물리적 특성, 사용성을 개선시키고/거나 가공, 포장 및 최종-사용 적용을 용이하게 하기 위해 세포, 무세포 제제 및/또는 포자외막 단편을 포함하는 조성물에 첨가될 수 있다. 이러한 제제 성분은 불활성제, 안정화제, 보존제, 영양소, 또는 물리적 특성 개질제를 포함할 수 있으며, 이는 개별적으로 또는 조합되어 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체는 액체 물질, 예컨대 물, 오일, 및 다른 유기 또는 무기 용매 및 고체 물질, 예컨대 미네랄, 중합체, 또는 생물학적으로 또는 화학적 합성에 의해 유래된 중합체 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 성분은 식물 부분, 예컨대 잎, 종자 또는 뿌리에 대한 조성물의 부착을 용이하게 하는 결합제, 아주반트 또는 접착제이다. 예를 들어, 문헌 [Taylor, A.G., et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments," Annu. Rev. Phytopathol., 28: 321-339 (1990)]을 참조한다. 안정화제는 케이킹방지제, 항산화제, 침강방지제, 소포제, 건조제, 보호제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 영양소는 탄소, 질소 및 인 공급원, 예컨대 당, 폴리사카라이드, 오일, 단백질, 아미노산, 지방산 및 포스페이트를 포함할 수 있다. 물리적 특성 개질제는 벌킹제, 습윤제, 증점제, pH 개질제, 레올로지 개질제, 분산제, 아주반트, 계면활성제, 필름-형성제, 굴수성제, 빌더, 동결방지제 또는 착색제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포, 무세포 제제 및/또는 포자외막 단편을 포함하는 조성물은 임의의 다른 제제화 제제 없이 희석제로서 물과 함께 또는 물 없이 직접 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 발효로부터 생성된 전체 브로쓰의 건조된 농축물, 예컨대 동결-건조되거나 분무-건조된 분말에 습윤제 또는 분산제가 첨가된다. 습윤제는 확산 및 침투 특성을 증가시키거나, 또는 분산제는 표면에 적용될 때 (일단 희석되면) 활성 성분의 분산성 및 용해도를 증가시킨다. 예시적인 습윤제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 술포숙시네이트 및 유도체, 예컨대 멀티웨트(MULTIWET)™ MO-70R (크로다 인크.(Croda Inc.), 뉴저지주 에디슨); 실록산, 예컨대 브레이크-스루(BREAK-THRU)® (에보닉(Evonik), 독일); 비이온성 화합물, 예컨대 아틀록스(ATLOX)™ 4894 (크로다 인크., 뉴저지주 에디슨); 알킬 폴리글루코시드, 예컨대 테르웨트(TERWET)® 3001 (헌츠만 인터내셔널 엘엘씨(Huntsman International LLC), 텍사스주 더 우드랜드); C12-C14 알콜 에톡실레이트, 예컨대 테르지톨(TERGITOL)® 15-S-15 (더 다우 케미칼 캄파니(The Dow Chemical Company), 미시간주 미들랜드); 포스페이트 에스테르, 예컨대 로다팍(RHODAFAC)® BG-510 (로디아, 인크.(Rhodia, Inc.)); 및 알킬 에테르 카르복실레이트, 예컨대 에멀소겐(EMULSOGEN)™ LS (클라리언트 코포레이션(Clariant Corporation), 노스 캐롤라이나주)를 포함한다.

상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 제제 중 어느 것은 농약을 포함할 수 있다.

X. 식물

식물에 관한 본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 식물은 쌍자엽식물, 단자엽식물, 겉씨식물 또는 속씨식물일 수 있다.

마찬가지로, 본원에 기재된 종자 중 어느 것에 대해 종자는 쌍자엽식물, 단자엽식물, 겉씨식물 또는 속씨식물의 종자일 수 있다.

예를 들어, 식물이 쌍자엽식물이거나 또는 종자가 쌍자엽식물의 종자인 경우에, 쌍자엽식물은 콩, 완두, 토마토, 페퍼, 스쿼시, 알팔파, 아몬드, 아니스종자, 사과, 살구, 아라카, 아티초크, 아보카도, 밤바라 땅콩, 비트, 베르가모트, 블랙 페퍼, 블랙 와틀, 블랙베리, 블루베리, 비터 오렌지, 청경채, 브라질 넛, 빵나무, 브로콜리, 잠두, 브뤼셀 스프라우트, 메밀, 양배추, 카멜리나, 배추, 카카오, 칸탈루프, 캐러웨이 종자, 카르둔, 캐롭, 당근, 캐슈넛, 카사바, 피마자 콩, 콜리플라워, 셀러리악, 셀러리, 체리, 밤, 병아리콩, 치커리, 칠리 페퍼, 크리산테뭄, 시나몬, 시트론, 시트러스, 클레멘타인, 클로브, 클로버, 커피, 콜라 넛, 콜자, 옥수수, 목화, 목화씨, 동부, 크람베, 크랜베리, 큰다닥냉이, 오이, 커런트, 커스타드 사과, 드럼스틱 나무, 땅 완두, 가지, 엔디브, 펜넬, 호로파, 무화과, 개암, 아마, 제라늄, 구스베리, 고드, 포도, 그레이프프루트, 구아바, 대마, 대마씨, 헤나, 홉, 말 콩, 호스래디시, 인디고, 자스민, 예루살렘 아티초크, 황마, 케일, 케이폭, 케나프, 키위, 콜라비, 금귤, 라벤더, 레몬, 렌틸, 레스페데자, 상추, 라임, 감초, 여지속, 비파, 루핀, 마카다미아 넛, 메이스, 만다린, 만겔, 망고, 서양모과, 멜론, 민트, 멀베리, 머스타드, 승도복숭아, 니거 종자, 넛멕, 오크라, 올리브, 오피움, 오렌지, 파파야, 파스닙, 완두, 복숭아, 땅콩, 배, 피칸 넛, 감, 비둘기콩, 피스타치오 넛, 플랜테인, 자두, 석류, 포멜로, 양귀비씨, 감자, 고구마, 프룬, 호박, 케브라초, 모과, 신코나 속 나무, 퀴노아, 무, 모시풀, 평지씨, 라즈베리, 레아, 루바브, 장미, 고무, 루타바가, 홍화, 된장풀, 서양우엉, 사포딜라, 사쓰마, 스코르조네라, 참깨, 시어버터 나무, 대두, 시금치, 스쿼시, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 스웨드, 스위트 페퍼, 탄제린, 차나무, 테프, 담배, 토마토, 토끼풀, 유동 나무, 순무, 유리너, 살갈퀴, 호두, 수박, 예르바 마테, 겨울냉이, 냉이, 큰다닥냉이, 다닥냉이 무리, 물냉이, 말냉이, 스타 아니스, 라우렐, 월계수, 카시아, 자문, 딜, 타마린드, 페퍼민트, 오레가노, 로즈마리, 세이지, 가시여지, 자반풀류, 칼로필룸, 여주, 쿠쿠이 넛, 타히티 밤, 바질, 월귤나무, 히비스쿠스, 패션프루트, 스타 사과, 사사프라스, 선인장, 세인트 존스 워트, 큰까치수염, 산사나무, 고수, 커리 플랜트, 키위, 타임, 주키니, 울루코, 히카마, 워터리프, 스피니 원숭이 오렌지, 노랑 몸빈, 스타프루트, 아마란스, 와사비, 일본 페퍼, 황색 자두, 마슈아, 참죽나무, 뉴질랜드 시금치, 바우어 시금치, 우구, 쑥국화, 별꽃, 호꼬떼, 말레이 사과, 파라크레스, 방가지똥, 중국 감자, 말 파슬리, 노랑장대, 캠피온, 아게이트, 캐소드 트리, 엉겅퀴, 버넷, 스타 구스베리, 소송나물, 퉁퉁마디, 수영, 실버 레이스 양치식물, 콜라드 그린, 앵초, 카우슬립, 퍼슬린, 마디풀, 테레빈, 나무 상추, 야생 베틀, 서아프리카 페퍼, 예르바 산타, 타라곤, 파슬리, 처빌, 나도 냉이, 버넷 색시프라주, 허니허브, 머위, 차조기, 여뀌, 들깨, 비터 빈, 안데스괭이밥, 캄퐁, 중국 셀러리, 레몬 바질, 타이 바질, 물 미모사, 시슬리, 양배추-나무, 모링가, 마우카, 타조 양치식물, 소엽풀, 황색 사와 상추, 러비지, 페퍼 그래스, 마카, 호리병박, 히아신스 콩, 물 시금치, 금혼초, 약모밀, 오키나와 시금치, 로투스 스위트주스, 별꽃아재비, 쿨란트로, 아루굴라, 카르둔, 카이구아, 미추바, 치플린, 샘파이어, 맘파트, 주홍서나물, 빔바, 양배추 엉겅퀴, 갯배추, 차야, 후아우존틀, 에티오피아 겨자, 마젠타 스프린, 굿 킹 헨리, 에파졸, 명아주, 센텔라 플루메드 맨드라미, 케이퍼, 라피니, 나파 양배추, 미주나, 중국 사보이, 카이-란, 겨잣잎, 말라바르 시금치, 근대, 마시멜로, 차옴, 어저귀, 파프리카, 안나토 종자, 스피아민트, 세이보리, 마조람, 쿠민, 카모마일, 레몬밤, 올스파이스, 빌베리, 체리모야, 클라우드베리, 담손, 피타야, 두리안, 엘더베리, 페이조아, 잭프루트, 잠불, 대추, 피살리스, 퍼플 망고스틴, 람부탄, 레드커런트, 블랙커런트, 살랄 베리, 온주귤, 어글리 프루트, 팥, 검정콩, 동부 완두, 볼로티 콩, 일반콩, 껍질 콩, 강낭콩, 리마콩, 녹두, 네이비 빈, 핀토콩, 적화강낭콩, 깍지완두, 스냅 완두, 사향 완두, 브로코플라워, 칼라브레세, 쐐기풀, 벨 페퍼, 라디치오, 무, 백색 무, 감자개발나물, 타트 소이, 브로콜리니, 흑색 무, 우엉 뿌리, 잠두, 브로콜리 라브, 불콩, 루핀, 스테르쿨리아, 벨벳 콩, 날개 콩, 참마 콩, 멀가, 엉겅퀴 꽃, 엄브렐라 부쉬, 티준티줄라, 와칼풀카, 위체티 부쉬, 와이리 와틀, 치아, 너도밤나무 넛, 캔들넛, 콜로신스, 마몬치요, 마야 넛, 몬곤고, 오그보노 넛, 파라다이스 넛, 및 쳄페닥으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

식물이 단자엽식물이거나 또는 종자가 단자엽식물의 종자인 경우에, 단자엽식물은 옥수수, 밀, 귀리, 벼, 보리, 기장, 바나나, 양파, 마늘, 아스파라거스, 독보리, 기장, 포니오, 라이산, 니파 그래스, 강황, 사프론, 양강, 골파, 카르다몸, 대추 야자, 파인애플, 샬롯, 리크, 스칼리온, 마름, 램프, 율무, 대나무, 왕바랭이, 분개구리밥, 화살잎 코끼리귀, 타히티 시금치, 아바카, 아레카, 바즈라, 베텔 넛, 브룸 기장, 브룸 수수, 시트로넬라, 코코넛, 코코얌, 메이즈, 타로토란, 팥수수, 듀럼 밀, 에도, 피크, 포르미오, 생강, 오리새, 에스파르토 그래스, 수단 그래스, 기니 옥수수, 마닐라삼, 헤네켄, 잡종 메이즈, 조와, 레몬 그래스, 용설란, 불러쉬 기장, 핑거 기장, 조, 일본 기장, 프로소 기장, 뉴질랜드 아마, 귀리, 기름 야자, 팔미라 야자, 사고 야자, 레드톱, 사이잘, 수수, 스펠트 밀, 단옥수수, 단수수, 사탕수수, 토란, 테프, 티모시 그래스, 트리티케일, 바닐라, 밀, 및 얌으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

식물이 겉씨식물이거나 또는 종자가 겉씨식물의 종자인 경우에, 겉씨식물은 아라우카리아세아에(Araucariaceae), 보웨니아세아에(Boweniaceae), 브라시카세아에(Brassicaceae), 세팔로탁사세아에(Cephalotaxaceae), 쿠프레사세아에(Cupressaceae), 시카다세아에(Cycadaceae), 에페드라세아에(Ephedraceae), 징코아세아에(Ginkgoaceae), 그네타세아에(Gnetaceae), 피나세아에(Pinaceae), 포도카르파세아에(Podocarpaceae), 탁사세아에(Taxaceae), 탁소디아세아에(Taxodiaceae), 웰위치아세아에(Welwitschiaceae), 및 자미아세아에(Zamiaceae)로 이루어진 군으로부터 선택된 패밀리로부터의 것일 수 있다.

본원에 기재된 식물 및 식물 종자는 트랜스제닉 식물 또는 식물 종자, 예컨대 트랜스제닉 곡류 (밀, 벼), 메이즈, 대두, 감자, 목화, 담배, 유지종자 평지 및 과실 식물 (사과, 배, 감귤류 및 와인 포도를 포함한 포도 과실)을 포함할 수 있다. 바람직한 트랜스제닉 식물은 옥수수, 대두, 감자, 목화, 담배, 사탕무, 사탕수수 및 유지종자 평지를 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 식물 종자는 유전자 변형될 수 있다 (예를 들어, 제초제 내성, 환경 인자, 예컨대 물 스트레스, 가뭄, 바이러스 및 질소 생산에 대한 내성, 또는 박테리아, 진균 또는 곤충 독소에 대한 저항성을 발현하는 유전자 변형된 식물 또는 식물 부분을 생성하는 임의의 종자). 적합한 유전자 변형 종자는 서양평지 작물, 채소, 과실, 나무, 섬유 작물, 오일 작물, 괴경 작물, 커피, 꽃, 콩과식물, 곡류, 뿐만 아니라 단자엽식물 및 쌍자엽식물 종의 다른 식물의 종자를 포함한다. 바람직하게는, 유전자 변형 종자는 땅콩, 담배, 그래스, 밀, 보리, 호밀, 수수, 벼, 평지씨, 사탕무, 해바라기, 토마토, 페퍼, 콩, 상추, 감자 및 당근을 포함한다. 가장 바람직하게는, 유전자 변형 종자는 목화, 대두, 및 옥수수 (단옥수수, 가축사료용 옥수수, 종자 옥수수, 또는 팝콘 옥수수)를 포함한다.

본 발명에 따라 처리될 수 있는 특히 유용한 트랜스제닉 식물은, 예를 들어 다양한 국가 또는 지역 규제 기관으로부터의 데이터베이스 (예를 들어 www.gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx 및 www.agbios.com/dbase.php 참조)에 열거된 형질전환 사건 또는 형질전환 사건의 조합을 함유하는 식물이다.

본 발명을 상세하게 기재하였지만, 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 변형 및 변경이 가능하다는 것이 명백할 것이다.

실시예

실시예 1

바실루스 세레우스에서의 Sep1 또는 Sep1 변이체의 세린 프로테아제 활성에 대한 검정

1. 세린 프로테아제 또는 세린 프로테아제 변이체를 디스플레이하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원의 구축

야생형 및 변이체 세린 프로테아제의 세린 프로테아제 활성을 평가하기 위해, 서열식별번호: 1의 세린 프로테아제 또는 서열식별번호: 2의 세린 프로테아제 변이체를 디스플레이하는 바실루스 세레우스 패밀리 구성원을 구축하였다. pUC57 플라스미드 (암피실린 저항성 카세트 및 ColE1 복제 기점 함유)와 바실루스 세레우스로부터의 pBC16-1 플라스미드 (테트라시클린 저항성 유전자, repU 복제 유전자 및 oriU 복제 기점 함유)의 융합을 통해 pSUPER 플라스미드를 생성하였다. 이러한 5.8 kb 플라스미드는 이. 콜라이 및 바실루스 종 둘 다에서 복제할 수 있고, 이. 콜라이에서는 β-락탐 항생제에 대한 저항성을 부여함으로써, 바실루스 종에서 테트라시클린에 대한 저항성을 부여함으로써 선택될 수 있다. 기본 pSUPER 플라스미드를 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 인 프레임으로 프로모터, 개시 코돈, 표적화 서열, 및 알라닌 링커 서열을 융합시킨 PCR-생성된 단편의 삽입에 의해 변형시켜 pSUPER 플라스미드를 생성하였다. 이들 구축물로 이. 콜라이를 형질전환시키고, 용원성 브로쓰 플레이트 플러스 암피실린 (100 μg/mL) 상에 플레이팅하여 단일 콜로니를 수득하였다. 개별 콜로니를 사용하여 용원성 브로쓰 플러스 암피실린에 접종하고, 37℃, 300 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 배양물로부터의 플라스미드를 상업적 플라스미드 정제 키트를 사용하여 추출하였다. 이들 플라스미드 추출물의 DNA 농도를 분광광도측정법을 통해 결정하고, 수득된 플라스미드를 제한 효소의 적절한 조합을 사용한 분석적 소화에 적용하였다. 생성된 소화 패턴을 아가로스 겔 전기영동에 의해 가시화하여 플라스미드 크기 및 별개의 플라스미드 특색의 존재를 조사하였다. 정제된 pSUPER 유도체의 관련 절편, 예컨대 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2 발현 카세트를 생어 서열분석에 의해 추가로 조사하였다.

추가적으로, 상기 기재된 pSUPER 플라스미드의 유도체 플라스미드를 다음과 같이 생성하였다. 상기 기재된 pSUPER 플라스미드의 pBC 단편 (BclA/세린 프로테아제 변이체 발현 카세트 및 테트라시클린 저항성을 포함하는 pSUPER의 pBC16-1-유래 절편)을 PCR에 의해 증폭시키고, 후속적으로 평활-단부 라이게이션에 의해 원형화하였다.

상기 기재된 바와 같이 확인된 pSUPER, 및 pBC 플라스미드 라이게이션을 전기천공에 의해 바실루스 투린기엔시스 BT013A (수탁 번호 NRRL B-50924) 내로 도입하였다. 테트라시클린 (10 μg/mL)을 함유하는 영양 브로쓰 플레이트 상에 플레이팅함으로써 단일 형질전환된 콜로니를 단리하였다. 개별 양성 콜로니를 사용하여 테트라시클린 (10 μg/mL)을 함유하는 뇌 심장 주입 브로쓰에 접종하고, 30℃, 300 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 생성된 배양물의 게놈 DNA를 정제하고, pSUPER 플라스미드 또는 pBC 플라스미드의 관련 절편을 재서열분석하여 클로닝된 서열의 유전자 순도, 및 pBC의 경우, 정확한 라이게이션 부위를 확인하였다. 확인된 콜로니를 10 μg/mL 테트라시클린을 함유하는 뇌 심장 주입 브로쓰에서 밤새 성장시키고, 효모 추출물-기반 배지에서 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하는 것을 통해 포자형성하도록 유도하였다.

2. 세린 프로테아제 변이체를 발현하는 바실루스 투린기엔시스의 녹아웃 돌연변이체 균주의 구축 및 정제

바실루스 투린기엔시스 BT013A의 exsY 녹아웃 (KO) 돌연변이체 균주를 제조하기 위해, 이. 콜라이에서 복제할 수 있는 pUC57 백본, 뿐만 아니라 복제 기점 및 pE194로부터의 에리트로마이신 저항성 카세트를 함유하는 플라스미드 pKOKI 셔틀 및 통합 벡터를 구축하였다. 이 구축물은 이. 콜라이 및 바실루스 종 둘 다에서 복제할 수 있다. exsY 유전자의 상류 영역에 상응하는 1 kb DNA 영역 및 유전자 exsY의 하류 영역에 상응하는 1 kb 영역을 함유하는 구축물을 제조하였고, 이들 둘 다를 바실루스 투린기엔시스 BT013A로부터 PCR 증폭시켰다. 이어서, 각각의 구축물에 대해, 2개의 1 kb 영역을 각각 서로에 대한 중첩 영역 및 pKOKI 플라스미드와 상동 재조합을 사용하여 함께 스플라이싱하였다. 이 플라스미드 구축물을 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 클론을 에리트로마이신 저항성에 대해 스크리닝하였다.

클론을 뇌 심장 주입 브로쓰에서 고온 (40℃) 하에 계대배양하였다. 개별 콜로니를 에리트로마이신 5 μg/mL를 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 투스픽킹하고, 30℃에서 성장시키고, 콜로니 PCR에 의해 염색체 내로 통합된 pKOKI 플라스미드의 존재에 대해 스크리닝하였다. 통합 사건을 갖는 콜로니를 계대배양을 통해 계속하여 에리트로마이신 저항성을 상실한 단일 콜로니에 대해 스크리닝하였다 (재조합에 의한 플라스미드의 손실 및 exsY 유전자의 제거를 의미함). 확인된 결실을 PCR 증폭 및 염색체의 표적 영역의 서열분석에 의해 확인하였다. 최종적으로, (상기 기재된) pSUPER 플라스미드의 PCR-증폭된, 원형화된 pBC 절편을 BT013A의 이러한 exsY 돌연변이체 균주 내로 형질전환시켰다.

서열식별번호: 1의 세린 프로테아제 또는 서열식별번호: 2의 세린 프로테아제 변이체를 발현하는 각각의 esxYKO 돌연변이체에 대해, 밤샘 배양물을 항생제 선택이 있는 배플형 플라스크에서 BHI 배지 중 30℃, 300 rpm에서 성장시켰다. 이러한 밤샘 배양물 1 밀리리터를 배플형 플라스크 내의 효모 추출물-기반 배지 (50 mL) 내로 접종하고, 30℃에서 2일 동안 성장시켰다. 포자의 분취물을 제거하고, 포자를 볼텍싱에 의해 교반하였다. 포자를 8,000 x g에서 10분 동안 원심분리를 통해 수집하고, 포자외막 단편을 함유하는 상청액을 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 임의의 잔류 포자를 제거하였다. 여과물에서는 포자가 발견되지 않았다.

3. 세린 프로테아제 변이체의 활성

재조합 플라스미드가 없거나 (9.79 x 10⁷ CFU/mL), 또는 서열식별번호: 1 (7.06 x 10⁷ CFU/mL) 또는 서열식별번호: 2 (7.06 x 10⁷ CFU/mL)의 세린 프로테아제를 발현하는 esxYKO 돌연변이체의 전체 브로쓰 배양물을 각각의 균주 다음에 지정된 CFU 농도로 성장시켰다. 포자외막 단편 여과물을 생성하고, 각각의 동등한 부피를 다음과 같이 시험하였다. 합성 펩티드 기질 (Ala-Ala-Pro-Phe)을 사용하여 효소 활성을 결정하였다. 펩티드 기질은 C-말단에서 니트로 페닐 및 N-말단에서 숙시닐 기와 융합된다. 펩티드는 프로테아제 절단 전에 320 nm에서 최대 흡광도를 나타내고, 절단 후에 390 nm로 이동한다. 검정 혼합물은 5 mM CaCl₂를 함유하는 240 μL의 50 mM Hepes 완충제 pH 7.5 중 10 μL의 2.5 mg/mL 펩티드 기질로 이루어졌다. 기질 및 완충제를 실온에서 사전-인큐베이션한 후, 효소 용액 25 μL를 첨가하였다. 결과를 도 1에 제시한다. 이 데이터는 둘 다의 전체 브로쓰 배양물이 효소적 활성을 갖고, 세린 프로테아제 변이체 서열식별번호: 2를 포함하는 균주가 서열식별번호: 1을 포함하는 균주보다 약간 더 높은 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 어떠한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 출원인은 변이체 세린 프로테아제 (서열식별번호: 2)를 갖는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원이 전장 세린 프로테아제 (서열식별번호: 1)를 갖는 재조합 바실루스 세레우스 패밀리 구성원보다 더 큰 생물학적 활성을 갖는 것으로 가설화하였다. 또한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 서열식별번호: 2의 세린 프로테아제 변이체 내의 결실은 서열식별번호: 1의 잔기 122-126 및 146-151에 상응하는 결합 홈을 기질에 보다 접근가능하게 함으로써 세린 프로테아제 활성을 변경 또는 개선시킬 수 있는 것으로 가설화하였다.

실시예 2

세린 프로테아제 변이체의 컴퓨터 모델링

세린 프로테아제 활성에 대한 서열 변형의 효과를 추가로 조사하기 위해, 추가의 세린 프로테아제 변이체를 개발하고 시험하였다. 촉매 트리아드에 대한 구조적 특색 제거 또는 고의적 교란의 효과를 조사하기 위해 본 연구에 사용된 야생형 및 변이체 서열을 표 1에 제시한다.

표 1. 상동성 모델링에 사용된 바실루스 피르무스의 Sep1 세린 프로테아제의 변이체.

서열식별번호: 1은 바실루스 피르무스 균주 DS-1로부터의 야생형 Sep1 세린 프로테아제이다. 서열식별번호: 2는 서열식별번호: 1의 아미노산 181-240을 결실시킴으로써 구축된 서열식별번호: 1의 변이체이다. 상기 실시예 1에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 2는 세린 프로테아제 활성을 나타낸다. 서열식별번호: 4-6은 서열식별번호: 1의 중간 결실을 나타낸다. 서열식별번호: 7-13은, 서열식별번호: 2와 비교하여 추가의 잔기가 결실된, 서열식별번호: 1의 연장된 결실을 나타낸다.

모델링 연구를 위해, 바실루스 푸밀루스로부터의 상동 세린 프로테아제 (유닛프롯 수탁 번호 P07518 (SUBT_BACPU); 서열식별번호: 3)를 상동성 주형으로서 선택하였다. 주형은 서열 유사성 및 일반적으로 세린 프로테아제 사이에서의 고도의 구조적 특색 보존에 기초하여 선택하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 3의 주형 서열은 정렬된 서열 사이에서 유의한 정도의 아미노산 잔기 유형 유사성을 보여준다. 예를 들어, 극성 잔기는 상이한 극성 잔기와 정렬된다.

또한, 도 2의 다중 서열 정렬에 제시된 바와 같이, 야생형 세린 프로테아제의 주요 특색은 촉매 트리아드 및 결합 영역에서 보존된다. 예를 들어, 야생형 서열에서 촉매 트리아드를 형성하는 서열식별번호: 1의 Asp49, His86, 및 Ser244에 상응하는 잔기 (도 2a, 2b, 및 2e에서 직사각형에 의해 확인됨)는 각각의 모델링된 변이체에서 보존된다. 추가적으로, 서열식별번호: 1의 Gly122, Ser123, Gly124, Gln125, 및 Tyr126 및 Met146, Ser147, Leu148, Gly149, Gly150, Pro151에 상응하는 기질 결합 영역 (도 2c에서 직사각형에 의해 확인됨)은 다중 서열 정렬에 기초하면 모델링된 변이체와 서열식별번호: 3 사이에서 완전히 보존된다. 또한, 촉매 트리아드 및 결합 홈 내의 보존된 잔기는 도 3-14의 모델에 제시된 바와 같이 그의 일반적인 기하학적 위치를 유지한다.

실시예 3

세린 프로테아제 변이체 사이의 2차 구조의 보존

서열을 모델링 주형으로서 바실루스 푸밀루스에 대해 1MEE PDB 엔트리 (유닛프롯 수탁 번호 P07518 (SUBT_BACPU); 서열식별번호: 3)를 갖는 트리아드 모델링 스위트 (프로타비트, 엘엘씨(Protabit, LLC))를 사용하여 모델링하였다. 표준 정밀화 설정으로 주형-기반 상동성 모델링을 수행하였다. 구체적으로, 소프트웨어는 각각의 모델링 사이클에서 무작위 원자 교란 반경을 조정할 수 있게 하였다. 추가적으로, 주형 특색을 보존하기 위해 6회의 가중 구속 사이클을 [1.0, 0.001, 0.75, 0.001, 0.25, 0.0]의 가중치로 수행하여, 이에 따라 구조를 주형에 가깝게 "흔든" 다음, 이를 주형으로부터 멀어지게 하였다. 주형이 그의 서열 유사성에 있어서 합리적인 모델링을 위해 제공되었고, 계통발생학적으로 관련된 종으로부터 유래된 바와 같을 때 [1.0]의 트림 오차 역치를 사용하였다. 참조 정렬, 대칭 구속, 또는 비정렬된 서열 트리밍은 수행하지 않았다. 최상의 점수화 모델을 출력을 위해 선택하였다. 트리아드에서 추가의 분석은 수행하지 않았다. 생성된 구조를 시각화하고, 정렬하고, PyMol (슈뢰딩거(Schroedinger))을 사용하여 분석하였다.

도 3에 제시된 바와 같이, 상동성 모델링은 서열식별번호: 3의 주형과 야생형 (서열식별번호: 1) 사이의 강한 구조적 보존을 나타낸다. 구조는 또한 도 4에 제시된 바와 같이 주형 서열식별번호: 3과 변이체 세린 프로테아제 서열식별번호: 2 사이에서 보존된다.

도 5-7은 시험된 모든 중간 결실 변이체 (서열식별번호: 4-6)와 주형 서열 (서열식별번호: 3) 사이의 구조적 보존을 보여준다. 도 8-13에 제시된 바와 같이, 모든 연장된 결실 변이체도 또한, 특히 보존된 촉매 트리아드 및 결합 영역 내에서 유사한 구조를 유지할 것으로 예측된다.

실시예 4

Sep1 변이체에서의 촉매 트리아드 기하구조의 분석

전하 전달은 세린 프로테아제 효소적 활성에 필요하고, 촉매 트리아드의 유의한 왜곡은 전하 전달 및 촉매 적격성을 파괴할 것이다. 상동성 모델링 후 및 세린 프로테아제 변이체에서 촉매 트리아드의 기하구조를 조사하기 위해, 1MEE 상동성 주형 (서열식별번호: 3) 대비 알파 탄소 거리를 촉매 트리아드의 각각의 잔기에 대해 계산하였다. 1MEE와 비교한 트리아드에 대한 평균 제곱근 편차 (RMSD)를 또한 계산하였다. 대략 1 Å의 트리아드 RMSD를 갖는 변이체는 실질적인 구조적 유사성을 나타내고, 공지된 활성 주형과 비교하여 생성된 모델에서의 서열 정렬 및 2차 구조의 일반적 보존에 비추어 전하 전달 기능 및 효소적 활성을 보유할 가능성이 있다.

표 2. 세린 프로테아제 변이체의 촉매 트리아드 기하구조의 분석.

표 2에 제시된 바와 같이, 야생형 세린 프로테아제 (W7KRH1_BACFI; 서열식별번호: 1)는 촉매 트리아드를 구성하는 잔기의 최소 교란을 나타내었다. 유사하게, 각각의 중간 결실 변이체 (서열식별번호: 4-6)는 상동성 주형에 대한 구조적 유사성을 유지하였다. 말단절단 변이체 (서열식별번호: 2), 뿐만 아니라 연장된_결실_2 (서열식별번호: 8) 및 연장된_결실_4 (서열식별번호: 10)도 또한 촉매 트리아드에 대해 최소의 교란을 나타내었다. 연장된_결실_3 (서열식별번호: 9)은 촉매 트리아드에 대해 중간 정도의 교란을 나타낸 한편, 연장된_결실_1 (서열식별번호: 7), 연장된_결실_5 (서열식별번호: 11), 연장된_결실_7 (서열식별번호: 13) 및 연장된_결실_6 (서열식별번호: 12)은 1.80 Å 이상의 RMSD를 나타내었다.

이들 데이터는 실시예 1에서 세린 프로테아제 활성을 갖는 것으로 밝혀진 서열식별번호: 2가 육안적 2차 특색의 면에서, 특히 단백질의 결합 홈 내에서 및 촉매 트리아드의 위치결정과 관련하여, 구조적 유사성을 유지한다는 것을 입증한다. 유사하게, 보다 짧은 및 중간 결실 변이체 (서열식별번호: 4-6 및 8-10)에 대한 촉매 트리아드 알파 탄소의 상대 기하학과 관련하여 구조의 최소 교란이 관찰된다.

서열식별번호: 2와 비교하여 N-말단 방향에서 7개 초과의 추가의 잔기의 결실은 특히 세린 잔기에서 촉매 트리아드에 대해 보다 유의한 기하학적 교란을 겪는 것으로 보인다. 또한, 서열식별번호: 2와 비교하여 촉매 세린으로부터 N-말단을 향한 7개의 추가의 잔기의 결실은 서열식별번호: 2의 위치 177에서 아스파라긴을 결실시킨다. Asn177은 촉매작용 동안 활성 부위 내의 산소음이온 홀에 참여하도록 위치하고, 이러한 잔기의 파괴는 촉매 능력을 감소시킬 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer CropScience LP <120> Novel Serine Proteases <130> BCS209004 WO <150> 63/081,271 <151> 2020-09-21 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 321 <212> PRT <213> Bacillus firmus <400> 1 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys 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Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Glu Gly Asp Gly Asp Asp Ser Thr Asp Glu Phe Ala Tyr Pro Gly 180 185 190 Cys Tyr Asn Glu Val Ile Ser Val Gly Ala Ile Asn Leu Glu Arg Asp 195 200 205 Ser Ser Asp Phe Thr Asn Ser His Asn Glu Ile Asp Leu Val Ala Pro 210 215 220 Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Ile 225 230 235 240 Lys Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro Glu 245 250 255 Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser Pro 260 265 270 Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His Leu 275 280 285 Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile 290 295 300 <210> 5 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 5 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Glu Gly Asp Gly Asp Asp Ser Thr Asp Glu Phe Ala Tyr Pro Gly 180 185 190 Cys Tyr Asn Glu Val Ile Ser Val Gly Ala Ile Asn Leu Glu Arg Asp 195 200 205 Ser Ser Asp Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu 210 215 220 Ala Leu Ile Lys Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser 225 230 235 240 Glu Pro Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly 245 250 255 Asn Ser Pro Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro 260 265 270 Asp His Leu Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu 275 280 285 Asn Ala Ile 290 <210> 6 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 6 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Glu Gly Asp Gly Phe Thr Asn Ser His Asn Glu Ile Asp Leu Val 180 185 190 Ala Pro Gly Glu Gly Ile Leu Ser Thr Phe Leu Asn Gly Lys Tyr Ala 195 200 205 Thr Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu 210 215 220 Ala Leu Ile Lys Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser 225 230 235 240 Glu Pro Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly 245 250 255 Asn Ser Pro Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro 260 265 270 Asp His Leu Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu 275 280 285 Asn Ala Ile 290 <210> 7 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 7 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Glu Gly Asp Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala 180 185 190 Leu Ile Lys Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu 195 200 205 Pro Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn 210 215 220 Ser Pro Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp 225 230 235 240 His Leu Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn 245 250 255 Ala Ile <210> 8 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 8 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Ser Gly Thr Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala 180 185 190 Leu Ile Lys Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu 195 200 205 Pro Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn 210 215 220 Ser Pro Lys Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp 225 230 235 240 His Leu Ala Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn 245 250 255 Ala Ile <210> 9 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 9 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Asn Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Ile Lys 180 185 190 Asp Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro Glu Leu 195 200 205 Tyr Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser Pro Lys 210 215 220 Leu Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His Leu Ala 225 230 235 240 Gly Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile 245 250 255 <210> 10 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 10 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Gly 165 170 175 Ser Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Ile Lys Asp 180 185 190 Phe Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro Glu Leu Tyr 195 200 205 Ala Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser Pro Lys Leu 210 215 220 Glu Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His Leu Ala Gly 225 230 235 240 Ile Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile 245 250 <210> 11 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 11 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ala Ser 165 170 175 Met Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Ile Lys Asp Phe 180 185 190 Ala Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro Glu Leu Tyr Ala 195 200 205 Gln Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser Pro Lys Leu Glu 210 215 220 Gly Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His Leu Ala Gly Ile 225 230 235 240 Phe Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile 245 250 <210> 12 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 12 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ala Ser Met 165 170 175 Ala Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Ile Lys Asp Phe Ala 180 185 190 Asn Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro Glu Leu Tyr Ala Gln 195 200 205 Leu Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser Pro Lys Leu Glu Gly 210 215 220 Asn Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His Leu Ala Gly Ile Phe 225 230 235 240 Asp Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile 245 250 <210> 13 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant polypeptide <400> 13 Met Glu Gln Tyr Val Arg Val Ile Pro Tyr Lys Val Ile Gln Gln Glu 1 5 10 15 Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Lys Gly Val Glu Leu Ile Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Val Trp Ser Glu Thr Lys Gly Lys Gly Ile Lys Ile Ala Val Leu 35 40 45 Asp Thr Gly Cys Asp Ile Ser His Pro Asp Leu Lys Asp Arg Val Thr 50 55 60 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Asp Asp Asp Asn Ser Asp Pro Asn Ser Phe 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala 85 90 95 Tyr Glu Asn Asn Ala Gly Val Ile Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Leu 100 105 110 Leu Ile Val Lys Val Leu Asn Lys Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Glu Trp 115 120 125 Ile Ile Lys Gly Ile His Tyr Ala Ile Glu Gln Asn Ala Asp Ile Ile 130 135 140 Ser Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Asp Val Pro Glu Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ala Val Asn Lys Asn Ile Leu Val Val Cys Ser Met Ala 165 170 175 Ala Pro His Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Ile Lys Asp Phe Ala Asn 180 185 190 Arg Gln Phe Glu Arg Lys Leu Ser Glu Pro Glu Leu Tyr Ala Gln Leu 195 200 205 Ile Arg Arg Thr Val Pro Leu Gly Asn Ser Pro Lys Leu Glu Gly Asn 210 215 220 Gly Leu Val Tyr Leu Thr Val Pro Asp His Leu Ala Gly Ile Phe Asp 225 230 235 240 Gln Glu Leu Lys Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile 245 250 <210> 14 <211> 41 <212> PRT <213> B. anthracis Sterne <400> 14 Met Ser Asn Asn Asn Tyr Ser Asn Gly Leu Asn Pro Asp Glu Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ala Phe Asp Pro Asn Leu Val Gly Pro Thr Leu Pro Pro 20 25 30 Ile Pro Pro Phe Thr Leu Pro Thr Gly 35 40

Claims (28)

1. 세린 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 잔기 49에 상응하는 잔기에서 아스파르트산, 서열식별번호: 1의 잔기 86에 상응하는 잔기에서 히스티딘, 및 서열식별번호: 1의 잔기 244에 상응하는 잔기에서 세린, 또는 이들 3개의 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 비해 적어도 제1 아미노산 잔기 결실을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
2. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 잔기 177-243 중 어느 것에 상응하는 적어도 1개의 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
3. 제2항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 잔기 181-240 중 어느 것에 상응하는 적어도 1개의 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
4. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 226-241에 상응하는 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
5. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 182-211에 상응하는 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
6. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 178-243에 상응하는 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
7. 제5항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 적어도 서열식별번호: 1의 잔기 178-240에 상응하는 잔기의 아미노산 결실을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
8. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 증가된 세린 프로테아제 활성을 나타내는 것인 재조합 DNA 분자.
9. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 증가된 살선충 활성 또는 증가된 항진균 활성을 나타내는 것인 재조합 DNA 분자.
10. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하여 동일하거나 증가된 기질 결합을 나타내는 것인 재조합 DNA 분자.
11. 제1항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열식별번호: 1의 잔기 122에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 123에 상응하는 잔기에서 세린, 서열식별번호: 1의 잔기 124에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 125에 상응하는 잔기에서 글루타민, 서열식별번호: 1의 잔기 126에 상응하는 잔기에서 티로신, 서열식별번호: 1의 잔기 146에 상응하는 잔기에서 메티오닌, 서열식별번호: 1의 잔기 147에 상응하는 잔기에서 세린, 서열식별번호: 1의 잔기 148에 상응하는 위치에서 류신, 서열식별번호: 1의 잔기 149에 상응하는 잔기에서 글리신, 서열식별번호: 1의 잔기 150에 상응하는 잔기에서 글리신, 및 서열식별번호: 1의 잔기 151에 상응하는 잔기에서 프롤린, 또는 이들 잔기 중 어느 것의 보존적 치환을 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드.
13. 제12항에 있어서, 서열식별번호: 2, 4-6 또는 8-10으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드.
14. 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 DNA 구축물.
15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포.
16. 제15항에 있어서, 박테리아 숙주 세포인 숙주 세포.
17. 제16항에 있어서, 박테리아 숙주 세포가 바실루스(Bacillus) 속으로부터의 것인 숙주 세포.
18. 제17항에 있어서, 바실루스 숙주 세포가 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 바실루스 미코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 슈도미코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 사마니이(Bacillus samanii), 바실루스 가에모켄시스(Bacillus gaemokensis), 바실루스 웨이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis), 및 바실루스 토요넨시스(Bacillus toyonensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 숙주 세포.
19. 제15항의 숙주 세포 및 농업상 허용되는 담체를 포함하는 제제.
20. 제19항의 제제로 처리된 식물 종자.
21. 제15항의 재조합 숙주 세포를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하는 것을 포함하는, 식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 선충류를 방제하는 방법.
22. a) 융합 단백질을 재조합 바실루스 숙주 세포의 포자외막으로 표적화하는 표적화 서열, 포자외막 단백질, 또는 포자외막 단백질 단편; 및
    b) 제12항의 폴리펩티드
    를 포함하는 융합 단백질.
23. 제22항의 융합 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포.
24. 제23항에 있어서, 박테리아 숙주 세포인 숙주 세포.
25. 제24항에 있어서, 박테리아 숙주 세포가 바실루스 세레우스 패밀리 구성원으로부터의 것인 숙주 세포.
26. 제23항의 박테리아 숙주 세포의 발효 생성물.
27. 제26항의 발효 생성물 및 농업상 허용되는 담체를 포함하는 제제.
28. 제27항의 제제를 식물 성장 배지, 식물, 식물 종자, 또는 식물 또는 식물 종자의 주변 구역에 적용하는 것을 포함하는, 식물 성장을 자극하고/거나 식물 건강을 촉진하고/거나 선충류를 방제하는 방법.

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