KR20230062151A - Modified polypeptide having xylanase activity - Google Patents
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Abstract
Description
본 출원은 자일라나제(Xylanase) 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.The present application relates to variant polypeptides having xylanase activity and uses thereof.
자일라나제(Xylanase; EC 3.2.1.8)는 식물 세포벽 성분인 자일란(xylan)의 β-1,4 backbone을 무작위적으로 분해하는 가수분해효소이다. 자일라나제는 주로 동물 사료, 제빵, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등의 분야에서 바이오매스를 분해하는 데 사용된다(Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Aug;56(3-4):326-38. doi: 10.1007/s002530100704. PMID: 11548999.) Xylanase (EC 3.2.1.8) is a hydrolase that randomly degrades the β-1,4 backbone of xylan, a plant cell wall component. Xylanase is mainly used to break down biomass in fields such as animal feed, bakery, and pulp bleaching (Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. Microbial xylanases and their industrial applications: a review Appl. Microbiol Biotechnol. 2001 Aug;56(3-4):326-38. doi: 10.1007/s002530100704. PMID: 11548999.)
이와 같이, 다양한 분야에서 사용되는 자일라나제의 사용 편리를 위해, 가혹조건(고온, 염기성 조건)에서의 내성 및 활성이 요구되고 있으나, 대부분의 자일라나제는 낮은 pH 조건(4.0 ~ 6.0) 및 낮은 열안정성으로 인해 다양한 분야에 적용하기 어려운 문제점이 있다.As described above, for the convenience of use of xylanase used in various fields, resistance and activity in harsh conditions (high temperature, basic condition) are required, but most xylanase is low pH conditions (4.0 ~ 6.0) and Due to low thermal stability, there is a problem that is difficult to apply to various fields.
본 출원의 하나의 목적은 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.One object of the present application is to provide a variant polypeptide having xylanase activity.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present application is to provide a composition comprising the variant polypeptide.
본 출원의 다른 하나의 목적은 자일란-함유 물질과 반응을 위한, 상기 변이형 폴리펩티드 또는 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.Another object of the present application is to provide a use of the variant polypeptide or the composition for reaction with a xylan-containing material.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 자일란-함유 물질과 접촉시키는 것을 포함하는, 자일란-함유 물질 분해 방법; 및/또는 자일로올리고당 및/또는 자일로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present application is a xylan-containing material comprising contacting the variant polypeptide, a host cell expressing the variant polypeptide, and/or a composition comprising the variant polypeptide with the xylan-containing material. disassembly method; And / or to provide a method for producing xylooligosaccharide and / or xylose.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구조체를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드, 핵산 구조체 또는 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.Another object of the present application is a polynucleotide encoding the variant polypeptide; a nucleic acid construct comprising the polynucleotide; a vector containing the polynucleotide or nucleic acid construct; and/or a host cell containing the polynucleotide, nucleic acid construct or vector.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present application is to provide a method for producing the variant polypeptide.
본 출원의 하나의 양태는 자일라나제의 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드이다.One aspect of the present application is a variant polypeptide having xylanase activity.
하나의 구체예로서, i) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1과 70% 이상, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이고; 및/또는In one embodiment, i) the variant polypeptide is a polypeptide having a sequence identity of 70% or more and less than 100% with SEQ ID NO: 1; and/or
ii) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는ii) the variant polypeptide is a polypeptide encoded by a polynucleotide having 70% or more and less than 100% sequence identity with the sequence encoding the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1; and/or
iii) 상기 변이형 폴리펩티드는 (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는iii) the variant polypeptide comprises (a) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (b) a cDNA thereof, or (c) the full-length complement of (a) or (b) above and low stringency a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions, medium stringency conditions, medium high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions; and/or
iv) 상기 변이형 폴리펩티드는 자일라나제 활성을 갖는 i), ii) 또는 iii) 폴리펩티드의 기능적 단편이고; 및iv) the variant polypeptide is a functional fragment of i), ii) or iii) polypeptide having xylanase activity; and
상기 변이형 폴리펩티드는 46번 및 93번 중 하나 이상의 위치의 아미노산에서의 다른 아미노산으로의 치환을 포함한다:The variant polypeptide comprises a substitution of another amino acid in an amino acid at one or more of positions 46 and 93:
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.Here, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변형 46번 아미노산은 글루탐산(E); 및/또는 93번 아미노산은 아스파라긴(N)인 인 것일 수 있다.As an embodiment of any one of the above embodiments, the modified amino acid at number 46 is glutamic acid (E); And/or amino acid number 93 may be asparagine (N).
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 다음 중 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것일 수 있다:As an embodiment of any one of the above embodiments, the variant polypeptide may include any one or more of the following modifications:
46번 아미노산의 시스테인으로의 치환; 및 substitution of amino acid 46 with cysteine; and
93번 아미노산의 트립토판으로의 치환으로, 여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.Substitution of amino acid position 93 with tryptophan, wherein the position number is a position corresponding to that of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 다음의 치환을 포함하는 것일 수 있다:As an embodiment of any one of the above embodiments, the variant polypeptide may include the following substitutions:
E46C;E46C;
N93W; 또는N93W; or
E46C + N93W;E46C + N93W;
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.Here, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 서열번호 1의 28번 및 52번에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있다.As an example of any one of the above embodiments, it may include substitution of any one or more of amino acids corresponding to positions 28 and 52 of SEQ ID NO: 1.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변형 28번 아미노산 또는 52번 아미노산은 아스파라긴(N)일 수 있다.As an embodiment of any one of the above embodiments, the modified amino acid number 28 or amino acid number 52 may be asparagine (N).
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 다음 중 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것일 수 있다:As an embodiment of any one of the above embodiments, the variant polypeptide may include any one or more of the following modifications:
28번 아미노산의 알라닌(A), 글라이신(G) 또는 세린(S)으로의 치환; 및 substitution of amino acid 28 with alanine (A), glycine (G) or serine (S); and
93번 아미노산의 프롤린(P), 알라닌(A) 또는 글루탐산(E)로의 치환으로, 여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.A substitution of amino acid position 93 with proline (P), alanine (A) or glutamic acid (E), wherein the position number is a position corresponding to that of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 다음의 치환을 포함하는 것일 수 있다:As an embodiment of any one of the above embodiments, the variant polypeptide may include the following substitutions:
N28A/G/S;N28A/G/S;
N52P/A/E; 또는N52P/A/E; or
N28A/G/S + N52P/A/E;N28A/G/S + N52P/A/E;
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.Here, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 디설파이드 브리지를 형성하는 아미노산 쌍을 포함할 수 있다.As an embodiment of any one of the above embodiments, the variant polypeptide may include an amino acid pair forming a disulfide bridge.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 디설파이드 브리지를 형성하는 아미노산 쌍은 서열번호 1의 3번 및 36번에 상응하는 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the pair of amino acids forming the disulfide bridge may include substitution of amino acids corresponding to positions 3 and 36 of SEQ ID NO: 1 with cysteine.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 3번 및 36번 아미노산 쌍이 디설파이드 브리지를 형성하는 변형을 포함하는 것일 수 있다.As an embodiment of any one of the above embodiments, the variant polypeptide may include a modification in which amino acid pairs at positions 3 and 36 form a disulfide bridge.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 비하여 내열성 및/또는 열안정성이 증가한 것일 수 있다.As one specific example of the above embodiments, the mutant polypeptide may have increased heat resistance and/or heat stability compared to a polypeptide composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리펩티드 및/또는 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 포함하는 자일란-함유 물질과의 반응용 조성물이다.Another aspect of the present application is a composition for reaction with a variant polypeptide of the present application and/or a xylan-containing material comprising the variant polypeptide of the present application.
본 출원의 다른 하나의 양태는 자일란-함유 물질과의 반응을 위한, 상기 변이형 폴리펩티드 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도이다.Another aspect of the present application is the use of the variant polypeptide and/or a composition comprising the variant polypeptide for reaction with a xylan-containing material.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 자일란-함유 물질을 접촉시키는 것을 포함하는, 자일로스 및/또는 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide)을 제조하는 방법이다.Another aspect of the present application is xylose and / or xylose, comprising contacting a xylan-containing material with the variant polypeptide, a host cell expressing the variant polypeptide, and / or a composition comprising the variant polypeptide. or a method for producing xylo-oligosaccharide.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 자일란-함유 물질에 처리시키는 것을 포함하는, 자일란-함유 물질을 분해하는 방법이다.Another aspect of the present application is a xylan-containing material comprising treating the variant polypeptide, a host cell expressing the variant polypeptide, and/or a composition comprising the variant polypeptide to the xylan-containing substance how to decompose
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.Another aspect of the present application is a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체이다.Another aspect of the present application is a nucleic acid construct comprising the polynucleotide.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 핵산 구조체를 포함하는 벡터이다.Another aspect of the present application is a vector comprising the polynucleotide or the nucleic acid construct.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 핵산 구조체, 및/또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포이다.Another aspect of the present application is a host cell comprising the variant polypeptide, the polynucleotide, the nucleic acid construct, and/or the vector.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법이다.Another aspect of the present application is a method for producing a variant polypeptide comprising culturing the host cell.
본 출원의 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드는 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.The variant polypeptide having xylanase activity of the present application can be usefully used in various industrial fields.
도 1 내지 도 7은 본 출원의 변이형 폴리펩티드의 열안정성을 확인한 결과이다. 1 to 7 are results confirming the thermal stability of the variant polypeptide of the present application.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.The detailed description for carrying out the invention is as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in this application may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of various elements disclosed in this application fall within the scope of this application. In addition, the scope of the present application is not to be construed as being limited by the specific descriptions described below.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.In addition, those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific aspects of the present application described herein. Also, such equivalents are intended to be included in this application.
본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 관사("a", "an", 및 "the")에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 참조대상이 포함된다. 문맥상 달리 언급되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함한다. 본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.As used in the specification of this application and the appended claims, the singular articles "a", "an", and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Singular terms include the plural and plural terms include the singular, unless the context indicates otherwise. In the specification of this application and in the appended claims, unless stated otherwise, the use of "or" may be used to include "and/or".
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.In this application, the term "about" may be presented before a specific numeric value. As used in this application, the term "about" includes not only the exact number that follows the term, but also a range that is or is close to that number. It can be determined whether the number is close to or nearly the specific number mentioned, given the context in which it is presented. As an example, the term “about” can refer to a range of -10% to +10% of a numerical value. As another example, the term "about" can refer to a range of -5% to +5% of a given numerical value. However, it is not limited thereto.
본 출원에서, 용어 "제1, 제2, 제3,," "i), ii), iii)…" 또는 "(a), (b), (c), (d)…"와 같은 기재는 유사한 구성을 구별하기 위해 사용되었으며, 이들 용어는 연속적이거나 순서대로 수행되는 것을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 상기 용어가 방법, 용도 또는 분석의 단계(step)와 관련하여 사용되었을 경우, 이들 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간, 수 일, 또는 수 개월 간격을 두고 수행될 수 있다.In this application, descriptions such as the terms “first, second, third,,” “i), ii), iii)…” or “(a), (b), (c), (d)…” are used to distinguish similar configurations, and these terms are not meant to be performed sequentially or sequentially. For example, when the term is used in reference to steps in a method, use, or assay, there is no time interval between these steps, performed simultaneously, seconds, minutes, hours, days, Or it may be performed several months apart.
본 출원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 출원에서 청구하는 대상의 특징이 불특정 성분의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.In this application, the term "consisting essentially of" means that a non-specified component may be present if the characteristics of the subject matter claimed in this application are not substantially affected by the presence of the non-specified component.
본 출원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 특정 성분(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 일부 구체예에서, "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징 외에, 다른 임의의 성분 또는 필수적이지 않은 성분은 배제될 수 있다.In this application, the term “consisting of” means that the proportions of the specified component(s) total 100%. Ingredients or features that come after the term “consisting of” may be essential or mandatory. In some embodiments, in addition to the ingredients or features that come under "consisting of", any other ingredients or non-essential ingredients may be excluded.
본 출원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 의미하며, 하나 이상의 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본 출원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 성분 또는 특징을 더 포함할 수 있다.In this application, the term “comprising” means the presence of features, steps or components described below the term, and does not exclude the presence or addition of one or more features, steps or components. Components or features described under "comprising" in this application may be essential or mandatory, but in some embodiments may further include other optional or non-essential components or features.
본 출원에서, 용어 "포함하는" 은, 일부 구체예에서, "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"을 지칭하는 것으로 수정될 수 있다.In this application, the term “comprising” may, in some embodiments, be modified to refer to “consisting essentially of” or “consisting of”.
본 출원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질이라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.Regarding the amino acid sequence in this application, a polypeptide "comprising" the amino acid sequence set forth in a specific SEQ ID NO, a polypeptide "consisting of" the amino acid sequence set forth in a specific SEQ ID NO, or a polypeptide "having" an amino acid sequence set forth in a specific SEQ ID NO, or Even if it is described as a protein, if it has the same or equivalent activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence of the corresponding sequence number, a protein having an amino acid sequence in which a part of the sequence is deleted, modified, substituted, conservatively substituted, or added is also used in this application. It is self-evident that it can be used. For example, if the amino acid sequence has an addition of a sequence that does not change the function of the protein, a naturally occurring mutation, a silent mutation thereof, or a conservative substitution to the N-terminus and/or C-terminus of the amino acid sequence. It may, but is not limited thereto.
본 출원에서, 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 연속적인 아미노산 잔기의 폴리머 또는 올리고머를 의미한다. 본 출원에서, "폴리펩티드", "단백질", 및 "펩티드"는 "아미노산 서열"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.In this application, the term "protein" or "polypeptide" refers to a polymer or oligomer of contiguous amino acid residues. In this application, "polypeptide", "protein", and "peptide" may be used interchangeably with "amino acid sequence".
경우에 따라, 활성을 나타내는 아미노산 서열은 "효소"로 지칭할 수 있다. 본 출원에서, 아미노산 서열은 달리 표시되지 않는 한, N-말단 → C-말단 배향으로 기재된다.In some cases, an amino acid sequence that exhibits an activity may be referred to as an "enzyme." In this application, unless otherwise indicated, amino acid sequences are written in N-terminal to C-terminal orientation.
세포, 핵산, 폴리펩티드, 또는 벡터와 관련하여, 본 출원에서 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 폴리펩티드 또는 벡터가 이종(heterologous) 핵산 또는 폴리펩티드의 도입 또는 천연 핵산 또는 폴리펩티드의 변경에 의해 변형된 것, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도되는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 발현되거나 전혀 발현되지 않는, 다르게는 비정상적으로 발현되는 천연 유전자를 발현할 수 있다.With respect to a cell, nucleic acid, polypeptide, or vector, the term "recombinant" in this application means that a cell, nucleic acid, polypeptide or vector has been modified by introduction of a heterologous nucleic acid or polypeptide or alteration of a natural nucleic acid or polypeptide; or that the cell is derived from a cell so modified. Thus, for example, a recombinant cell may express a gene that is not found in the native (non-recombinant) form of the cell, or may express a native gene that is expressed or not expressed at all, or otherwise abnormally expressed.
본 출원에서, 용어 "분리된(isolated)"은 자연적으로 발생하지 않는 환경에 존재하거나 혹은 자연적으로 존재하지 않는 형태의 물질을 지칭한다. 이는 자연에서 자연적으로 회합되어 있고 자연에서 발견되는 것과 같은 물질, 예를 들어 서열, 효소 또는 핵산을 갖는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 상기 물질(서열, 효소 또는 핵산)이 적어도 실질적으로 유리되는 것을 포함한다.In this application, the term "isolated" refers to a substance in a form that does not exist or exists in a non-naturally occurring environment. This includes at least substantially the separation of a substance (sequence, enzyme or nucleic acid) from at least one other component with which it is naturally associated in nature and which has the same substance, eg, a sequence, enzyme or nucleic acid, as found in nature. .
예를 들어, 본 출원에서 제공하는 분리된 서열, 효소 또는 핵산은 하나 이상의 오염물질이 실질적으로 없는 형태로 제공될 수 있다.For example, an isolated sequence, enzyme or nucleic acid provided herein may be provided in a form that is substantially free of one or more contaminants.
분리된 물질의 예시는 i) 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring) 임의의 물질, ii) 자연 상태에서 결합되어(associated) 있는 하나, 그 이상, 또는 모든 자연적으로 발생하는 구성이 제거된 임의의 물질(예를 들어, 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 보조인자(cofactor)), iii) 자연에서 발견되는 물질이 인위적으로 변형된 임의의 물질, 또는 iv) 자연적으로 결합된 다른 구성성분에 비해 그 물질의 양을 변경하도록 변형된 물질(예를 들어, 특정 물질을 코딩하는 유전자 카피수 증가; 특정 물질을 코딩하는 유전자와 자연적으로 연결된 프로모터를 활성이 강한 프로모터로 변형 등)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. Examples of an isolated material are i) any material that is not naturally occurring, ii) any material from which one, more, or all naturally occurring constituents associated with it in nature have been removed. (e.g., enzymes, variants, nucleic acids, proteins, peptides or cofactors), iii) any substance that has been artificially modified from a substance found in nature, or iv) other constituents with which it is naturally associated. (e.g., increased copy number of a gene encoding a specific substance; modification of a promoter naturally linked to a gene encoding a specific substance into a highly active promoter, etc.) It may, but is not limited thereto.
본 출원에서, 용어 "야생형"은 인위적인 변형을 가지지 않는 천연형(naturally-occurring)인 것을 의미한다. 상기 용어 "야생형"이 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 천연형(naturally occurring) 폴리펩티드로, 하나 이상의 아미노산 위치에서 인위적인 변이(치환, 삽입, 결실 등)를 갖지 않는 것을 의미한다. 이와 유사하게, 용어 "야생형"이 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 하나 이상의 뉴클레오티드의 인위적인 변형(치환, 삽입, 결실)을 갖지 않는 것을 의미한다. 그러나 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연형 폴리뉴클레오티드에 제한되지 않으며, 임의의 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 서열도 포함한다.In this application, the term "wild type" means a naturally-occurring one without artificial modification. When the term "wild type" is used in reference to a polypeptide, it is meant to be a naturally occurring polypeptide, which does not have artificial variance (substitutions, insertions, deletions, etc.) at one or more amino acid positions. Similarly, when the term "wild type" is used in reference to a polynucleotide, it means not having artificial modifications (substitutions, insertions, deletions) of one or more nucleotides. However, polynucleotides encoding wild-type polypeptides are not limited to wild-type polynucleotides, and include sequences encoding any wild-type polypeptides.
본 출원에서, 모서열(parent sequence) 또는 골격(backbone)이란 변형(modification)를 도입하여 변이형 폴리펩티드가 되는 기준 서열을 의미한다. 즉, 모서열은 시작 서열(starting sequence)로서 치환, 삽입 및/또는 결실 등의 변이를 도입하는 대상일 수 있다. 상기 모서열은 천연형(naturally occurring) 혹은 야생형(wild type)일 수 있고, 또는 상기 천연형 또는 야생형에 하나 이상의 치환, 삽입 또는 결실이 발생한 변이체(variant)이거나, 또는 인위적으로 합성된 서열일 수 있다. 상기 모서열이 활성을 나타내는 아미노산 서열, 즉 효소의 아미노산 서열인 경우 모효소(parent enzyme)로 칭할 수 있다.In the present application, a parent sequence or backbone refers to a reference sequence that becomes a mutant polypeptide by introducing modification. That is, the parental sequence may be a target for introducing mutations such as substitution, insertion, and/or deletion as a starting sequence. The parental sequence may be a naturally occurring or wild type, or a variant in which one or more substitutions, insertions or deletions have occurred in the natural or wild type, or may be an artificially synthesized sequence. there is. When the parent sequence is an amino acid sequence showing activity, that is, an amino acid sequence of an enzyme, it may be referred to as a parent enzyme.
본 출원에서, 용어 "참조 서열(reference sequence)"은 임의의 아미노산 서열 내 아미노산의 위치(position)를 결정하는 데 사용되는 서열을 의미한다. 임의의 아미노산 서열과 참조 서열을 정렬(align)하여, 임의의 아미노산 서열 내에서 참조 서열의 특정 위치에 대응하는 아미노산의 위치를 결정할 수 있다.In this application, the term “reference sequence” refers to a sequence used to determine the position of amino acids within any amino acid sequence. Any amino acid sequence can be aligned with a reference sequence to determine the position of an amino acid within any amino acid sequence that corresponds to a particular position in the reference sequence.
본 출원에서 아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여, 용어 "단편"은 모서열(parent sequence)의 일부를 의미한다. 예를 들어, 모서열에서 하나 이상의 아미노산이 C 또는 N 말단에서 제거된 형태의 폴리펩티드일 수 있다. The term "fragment" in relation to an amino acid or nucleic acid sequence in this application means a portion of a parent sequence. For example, it may be a polypeptide in which one or more amino acids in the parental sequence are removed from the C or N terminus.
본 출원에서, 효소의 "단편"은 "기능적 단편(functional fragment)"을 지칭하는 것일 수 있다. "기능적 단편"은 활성 단편(active fragment)으로도 지칭될 수 있으며, 모효소의 일부이면서 모효소의 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 효소의 기능적 단편은 효소의 활성 부위(catalytic site)를 포함하는 것일 수 있다.In the present application, a "fragment" of an enzyme may refer to a "functional fragment". "Functional fragment" may also be referred to as an active fragment, and refers to a polypeptide that is part of a parent enzyme and has the enzymatic activity of the parent enzyme. For example, a functional fragment of an enzyme may include a catalytic site of an enzyme.
효소의 단편은 모효소의 전장(full length)의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 모효소의 전장의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상, 100% 미만의 아미노산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.A fragment of an enzyme may include a portion of the full length of the parent enzyme. For example, at least about 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% or more, but less than 100% amino acids of the full length of the parent enzyme. It may include, but is not limited thereto.
본 출원에서, "변이/변형시키는(modifying)"은 변화(changing) 또는 변경(altering)시키는 것을 의미한다. 이는 자연적으로 발생하는 것으로부터의 변경일 수 있다. 일 예로, 효소가 모서열 또는 참조 서열로부터 변경되게 하는 방식으로 효소를 변화시킬 수 있다.In this application, "modifying" means changing or altering. This may be a change from naturally occurring. In one example, an enzyme can be altered in such a way that the enzyme is altered from a parental or reference sequence.
본 출원에서, 변형된 효소는 그 자체로 자연에 존재하지 않는, 즉 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring) 효소일 수 있다.In this application, a modified enzyme may be an enzyme that does not itself exist in nature, i.e., is non-naturally occurring.
본 출원에서 용어, "변형된(modified)"은, 예를 들어 그의 자연적으로 발생하는 형태로부터 변경된 것을 의미한다. 본 출원의 변형된 효소는 자연적으로 발생하지 않는 효소 또는 자연적으로 발생하는 변이체를 포함한다. 일 예로, 본 출원의 변형된 효소는 자연에서 발견되지 않은 변형된 효소이다. 일 예로, 본 출원의 변형된 효소는 자발적으로(spontaneously) 발생되지 않은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In this application, the term "modified" means altered from, for example, its naturally occurring form. Modified enzymes of this application include non-naturally occurring enzymes or naturally occurring variants. In one example, the modified enzyme of the present application is a modified enzyme not found in nature. For example, the modified enzyme of the present application may not occur spontaneously (spontaneously), but is not limited thereto.
본 출원에서 용어 "변형(modification)"이 아미노산/핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 아미노산 서열에서 하나 이상의 부위에서 상이한 아미노산/핵산 잔기에 대한 모서열의 아미노산/핵산 잔기의 치환(substitution), 하나 이상의 부위에서 모서열의 아미노산/핵산 잔기(또는 일련의 아미노산/핵산 잔기)의 결실(deletion), 하나 이상의 부위에서 모서열의 아미노산/핵산 잔기(또는 일련의 아미노산/핵산 잔기)의 삽입(insertion), N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 서열 또는 5' 및/또는 3' 핵산 서열의 절단(truncation), 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.In this application, when the term "modification" is used in reference to an amino acid/nucleic acid sequence, it is a substitution of an amino acid/nucleic acid residue of a parent sequence for a different amino acid/nucleic acid residue at one or more sites in an amino acid sequence, one Deletion of a parental amino acid/nucleic acid residue (or set of amino acid/nucleic acid residues) at an abnormal site, insertion of a parental amino acid/nucleic acid residue (or set of amino acid/nucleic acid residues) at one or more sites , truncation of N-terminal and/or C-terminal amino acid sequences or 5' and/or 3' nucleic acid sequences, and any combination thereof.
본 출원에서, 효소의 "변이체(variant)" 또는 "변이형 폴리펩티드(modified polypeptide)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 모효소와 상이한 단백질을 지칭한다. "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 변이체 또는 변이형 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring)것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In this application, a “variant” or “modified polypeptide” of an enzyme refers to a protein that differs from the parent enzyme in one or more amino acids by conservative substitution and/or modification. do. “Variant” or “variant polypeptide” may be used interchangeably. The variant or variant polypeptide may be non-naturally occurring, but is not limited thereto.
상기 변이체는 하나 이상의 변형, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 모효소의 서열과 상이하다. Such variants differ from the sequence of the parent enzyme by one or more modifications, eg, amino acid substitutions, deletions and/or insertions.
이러한 변이체는 일반적으로 상기 모효소에서 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 모효소에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the parent enzyme and evaluating the properties of the modified protein. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or reduced compared to the parent enzyme.
또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형 폴리펩티드를 포함할 수 있다. In addition, some variants may include variant polypeptides in which one or more portions such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain are removed.
다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. Other variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
용어 "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.The term "mutant" or "mutant polypeptide" may be used interchangeably with terms such as variant, modification, mutated protein, mutation (in English, modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant, etc.), If the term is used in a modified sense, it is not limited thereto.
변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.Variants may include deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the secondary structure and properties of the polypeptide. For example, a polypeptide may be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of a protein that is involved in protein transfer either co-translationally or post-translationally. The polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to allow identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
본 출원에서, 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.In this application, the term "conservative substitution" means the substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions can generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
본 출원 명세서 전반에서, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 출원에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.Throughout the specification of this application, common one-letter and three-letter codes for naturally occurring amino acids are used. Amino acids also referred to by abbreviations in this application are described according to the IUPAC-IUB nomenclature.
알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg, Ralanine Ala, A Arginine Arg, R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, DAsparagine Asn, N Aspartic acid Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, ECysteine Cys, C Glutamic acid Glu, E
글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, GGlutamine Gln, Q Glycine Gly, G
히스티딘 His, H 이소류신 Ile, IHistidine His, H Isoleucine Ile, I
류신 Leu, L 라이신 Lys, KLeucine Leu, L Lysine Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, FMethionine Met, M Phenylalanine Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, SProline Pro, P Serine Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, WThreonine Thr, T Tryptophan Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, VTyrosine Tyr, Y Valin Val, V
한편, 임의의 아미노산은 Xaa, X로 기재할 수 있다. On the other hand, any amino acid can be described as Xaa, X.
또한, 천연적으로 존재하는 아미노산뿐만 아니라 Aib(2-Aminoisobutyric acid), Sar(N-methylglycine), 알파-메틸-글루탐산(α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용될 수 있다.In addition, the generally accepted three-letter designation for naturally occurring amino acids as well as other amino acids such as Aib (2-Aminoisobutyric acid), Sar (N-methylglycine), α-methyl-glutamic acid, etc. code can be used.
아미노산은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 분류할 수 있다. 이에, 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.Amino acids can generally be classified based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. Thus, amino acid substitutions can generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. For example, among amino acids with electrically charged side chains, positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine, and histidine, and negatively charged (acidic) amino acids are glutamic acid and aspartic acid. contain; Nonpolar amino acids among amino acids with uncharged side chains include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline, and are polar or hydrophilic ( hydrophilic) amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine, and aromatic amino acids among the non-polar amino acids include phenylalanine, tryptophan, and tyrosine.
본 출원에서 용어, "유전자(gene)"는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 코딩 영역의 앞뒤의 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 유전자는 각각의 코딩 영역(엑손; exon) 사이에 삽입되는 서열(인트론; intron)을 가질 수 있다.As used herein, the term "gene" refers to a polynucleotide that encodes a polypeptide and a polynucleotide that includes regions preceding and following the coding region. In some embodiments, a gene may have sequences (introns) inserted between each coding region (exon).
본 출원에서 용어, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.In this application, the term "homology" or "identity" refers to the degree of relatedness between two given amino acid sequences or nucleotide sequences and can be expressed as a percentage. The terms homology and identity are often used interchangeably.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides can be determined by standard alignment algorithms, together with default gap penalties established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally under moderate or high stringency conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length sequence. It can hybridize under stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes polynucleotides containing common codons or codons considering codon degeneracy in polynucleotides.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: can be determined using known computer algorithms such as the “FASTA” program using default parameters as in 2444. or, as performed in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) (GCG program package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop , [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO et al.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073. For example, BLAST of the National Center for Biotechnology Information Database, or ClustalW can be used to determine homology, similarity or identity, but is not limited thereto.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.Homology, similarity or identity of polynucleotides or polypeptides can be found in, for example, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482, eg, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. It can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program such as 48:443. In summary, the GAP program can define the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly arranged symbols (i.e., nucleotides or amino acids). The default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or 10 gap opening penalty, 0.5 gap extension penalty); and (3) no penalty for end gaps.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.In addition, whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity or identity can be confirmed by comparing the sequences by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions, and appropriate hybridization conditions defined are within the scope of the art , methods well known to those skilled in the art (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York), but is not limited thereto.
본 츨원에서, 용어 "성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)"는 신호 서열(signal sequence) 또는 프로펩타이드 서열(propeptide sequence)이 없는 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 성숙 단백질/폴리펩티드/펩티드는, 단백질/폴리펩티드/펩티드의 기능적 형태일 수 있다. 성숙 폴리펩티드는 번역 이후, 또는 번역 후 변형을 거친 최종(final form) 형태일 수 있다. 번역 후 변형의 예시로는 N-또는 C-말단 변형, 글리코실화, 인산화, 리더 서열(leader sequence) 제거 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. As used herein, the term "mature polypeptide" refers to a polypeptide in its form without a signal sequence or propeptide sequence. A mature protein/polypeptide/peptide may be a functional form of the protein/polypeptide/peptide. A mature polypeptide may be in its final form post-translational or subjected to post-translational modifications. Examples of post-translational modifications include, but are not limited to, N- or C-terminal modifications, glycosylation, phosphorylation, leader sequence removal, and the like.
본 출원에서 용어, "핵산 구조체(nucleic acid construct)"는, 하나 이상의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하고, 인위적으로 합성되거나, 자연계에 존재하지 않는 방법으로 특정 서열을 포함하도록 조작되거나, 자연으로부터 분리된 단일 혹은 이중가닥 핵산 분자를 의미한다.In this application, the term "nucleic acid construct" includes one or more regulatory sequences, is artificially synthesized, engineered to include a specific sequence by a method that does not exist in nature, or derived from nature. Refers to an isolated single or double-stranded nucleic acid molecule.
본 출원에서 용어, "발현"은 폴리펩티드의 생성에 관여하는 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "expression" includes, but is not limited to, any step involved in the production of a polypeptide, such as transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, secretion, and the like.
본 출원에서 용어, "발현 벡터"는 코딩 서열 및 이의 발현을 위해 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 선형 혹은 환형 핵산 분자를 의미한다.As used herein, the term "expression vector" refers to a linear or circular nucleic acid molecule comprising a coding sequence and operably linked regulatory sequences for its expression.
본 출원에서 용어, "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 조절 서열이 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다. 따라서 "작동가능하게 연결된"은, 프로모터, 종결자, 신호 서열 또는 인핸서 영역과 같이 알려진 혹은 원하는 활성을 가진 기능적 도메인의 조절 영역이 타겟(유전자 또는 폴리펩티드)의 발현, 분비 또는 기능을 상기의 알려진 혹은 원하는 활성에 따라 조절할 수 있도록 그 타겟에 부착되거나 연결된 것을 포함한다.As used herein, the term "operably linked" refers to a configuration in which regulatory sequences are positioned in appropriate positions such that the regulatory sequences direct expression of the coding sequence. Thus, "operably linked" means that a regulatory region of a functional domain having a known or desired activity, such as a promoter, terminator, signal sequence, or enhancer region, functions to express, secrete, or function a target (gene or polypeptide). It includes those attached to or linked to their targets so that they can be modulated according to the desired activity.
본 출원에서 용어, "cDNA"는 진핵 또는 원핵 세포로부터 얻을 수 있는 성숙된, 스플라이싱된 mRNA 분자로부터 역전사를 통해 제조될 수 있는 DNA 서열을 의미한다. cDNA 서열은 상응하는 게놈 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열을 포함하지 않는다. 초기 1차 RNA 전사체는 스플라이싱을 포함한 일련의 단계를 통해 처리되어 성숙된 스플라이싱된 mRNA로 나타나기 전 mRNA의 전구체이다.As used herein, the term "cDNA" refers to a DNA sequence that can be prepared by reverse transcription from mature, spliced mRNA molecules obtainable from eukaryotic or prokaryotic cells. A cDNA sequence does not include intronic sequences that may be present in the corresponding genomic DNA. Early primary RNA transcripts are precursors of mRNA before they are processed through a series of steps including splicing to appear as mature spliced mRNA.
본 출원에서 용어, "조절 서열(regulatory sequence)"은 코딩 서열의 발현에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 각각의 조절 서열은 코딩 서열에 대해 천연형이거나(기원이 동일함) 또는 외래(foreign; 다른 유전자에서 유래함) 서열일 수 있다. 상기 조절 서열의 예시는 리더 서열(leader sequence), 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence), 프로펩타이드 서열, 프로모터, 신호 펩타이드 서열, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 번역 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 조절 서열의 최소 단위는 프로모터, 전사 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다.As used herein, the term "regulatory sequence" refers to a polynucleotide sequence necessary for the expression of a coding sequence. Each regulatory sequence may be native (of the same origin) or foreign (from another gene) to the coding sequence. Examples of the regulatory sequence include a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates transcription and translation termination. contains sequence. The minimum unit of the regulatory sequence may include a promoter, transcriptional and translational termination sequences.
본 출원에서 제공하는 변이체를 기재하기 위해, 하기의 명명법이 사용된다. To describe the variants provided in this application, the following nomenclature is used.
본 출원에서 아미노산 서열의 특정 위치를 지칭하는 것은, 그 위치에 존재하거나 치환되는 아미노산을 지칭하는 것을 포함할 수 있다. 특정 위치의 아미노산을 지칭하는 것은 다양하게 기재할 수 있다. 예를 들어, "003번 위치"는 "3번 위치", "3번 아미노산", "3번째 아미노산"과 같이 기재할 수 있다. 또한, 예를 들어, 3번째 위치에 있는 아미노산이 아르기닌(R)인 경우 이를 "R3" 또는 "Arg3"와 같이 기재할 수 있다.In the present application, reference to a specific position in an amino acid sequence may include reference to an amino acid present or substituted at that position. Referencing an amino acid at a specific position can be described in various ways. For example, "position 003" can be written as "position 3", "amino acid 3", "3 amino acid". Also, for example, when the amino acid at position 3 is arginine (R), it may be described as "R3" or "Arg3".
아미노산의 치환은 치환 전의 아미노산, 위치, 치환되는 아미노산 순으로 기재함으로써 표현할 수 있다. 상기 아미노산은 통상의 1문자 및 3문자 코드를 사용하여 표현할 수 있다. 일 예로, 특정 서열의 5번 위치의 아미노산인 세린이 시스테인으로 치환되는 경우 "S5C" 또는 "Ser5Cys"와 같이 기재할 수 있다. Amino acid substitution can be expressed by describing the amino acid before substitution, the position, and the amino acid to be substituted in the order. The amino acids can be expressed using conventional one-letter and three-letter codes. For example, when serine, an amino acid at
특정 위치에서 임의의 아미노산은 "X"로 지칭할 수 있다. 예를 들어 X6은 6번 위치의 임의의 아미노산을 칭한다. 또한 치환되는 아미노산을 X로 표기하는 경우, 치환 전에 존재하는 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어 "V6X"는 6번 위치에서 V가 V가 아닌 임의의 아미노산으로 치환되는 것을 나타낸다.Any amino acid at a particular position may be referred to as "X". For example, X6 refers to any amino acid at
"/" 또는 "," 기호를 이용해 여러 종류의 아미노산을 동시에 기재함으로써 서로 다른 변형(different alternation)을 표현할 수 있다. 예를 들어 20번 위치의 아미노산(F)이 S 또는 C로 치환된 것은 F20S/C 또는 F20S,C 로 혼용되어 기재될 수 있다. 다른 예로, F/S20C는 치환 전의 20번 위치의 아미노산 F 또는 S가 C로 치환되는 것을 의미한다. Different alternations can be expressed by simultaneously describing several types of amino acids using "/" or "," symbols. For example, when the amino acid (F) at
다중 변이는 "+"를 이용하여 기재할 수 있다. 예를 들어, "R3C+T36C"와 같은 기재는 각각 3번 위치의 아미노산인 아르기닌이 시스테인으로, 8번 위치의 아미노산인 쓰레오닌이 시스테인으로 치환되는 것을 의미한다.Multiple mutations can be written using "+". For example, descriptions such as "R3C+T36C" mean that arginine, an amino acid at position 3, is substituted with cysteine, and threonine, an amino acid at
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다. In this application, the term “corresponding to” refers to an amino acid residue at a recited position in a protein or polypeptide, or an amino acid residue that is similar, identical, or homologous to a recited residue in a protein or polypeptide. Identification of the amino acid at the corresponding position may be determining the specific amino acid in the sequence that references the specific sequence. As used herein, “corresponding region” generally refers to a similar or corresponding position in a related or reference protein.
본 출원에서 임의의 아미노산 서열 내 아미노산의 위치(position)를 결정하는 데 서열번호 1이 참조 서열(reference sequence)로 사용될 수 있다. SEQ ID NO: 1 may be used as a reference sequence to determine the position of amino acids in any amino acid sequence in this application.
즉, 본 출원에서 개시하는 서열번호 1는 임의의 자일라나제 활성을 가지는 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 본 출원에서 달리 지칭하지 않는 한, 특정 아미노산 서열의 잔기는 서열번호 1을 기준으로 넘버링된다.That is, SEQ ID NO: 1 disclosed in this application can be used to determine the corresponding amino acid residue in any polypeptide having xylanase activity, and unless otherwise indicated in this application, the residue of a specific amino acid sequence is SEQ ID NO: They are numbered based on 1.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.For example, any amino acid sequence can be aligned with SEQ ID NO: 1, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 1. . For example, sequence alignment algorithms, such as those described herein, can identify the location of amino acids, or locations where modifications such as substitutions, insertions, or deletions occur, compared to a query sequence (also referred to as a “reference sequence”).
이러한 정렬에는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.These alignments include the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needle program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000). , Trends Genet. 16: 276-277) may be used, but is not limited thereto.
또한 다중 서열 정렬(Multiple sequence alignment)을 통해 다른 자일라나제에서 상응하는 아미노산 잔기를 식별할 수 있다. 당업계에 알려진 다중 서열 정렬 프로그램의 예시로 MUSCLE (multiple sequence comparison by log-expectation; 3.5 버전 이상; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (6.857 버전 이상; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) 등의 프로그램 및 ClustalW를 사용하는 EMBOSS EMMA (1.83 이상; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22 : 4673-4680) 등이 있으며, 상기 프로그램 각각의 기본 매개 변수를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. In addition, it is possible to identify corresponding amino acid residues in other xylanases through multiple sequence alignment. Examples of multiple sequence alignment programs known in the art include MUSCLE (multiple sequence comparison by log-expectation; version 3.5 or higher; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (version 6.857 or higher; Katoh and Kuma, 2002). , Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) and EMBOSS EMMA using ClustalW (at least 1.83; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), etc. There is, and the basic parameters of each of the above programs can be used, but are not limited thereto.
그 외에, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드로부터 갈라져 나온 효소가 종래의 서열 기반 비교로 그들의 관계를 검출하지 못하게 되는 경우, 그 밖의 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘이 사용될 수 있다(Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615). 데이터베이스를 검색하기 위한 폴리펩티드 패밀리(프로파일)의 확률론적 표시를 이용하는 검색 프로그램을 사용하여, 서열 기반 검색에서 보다 높은 민감도(sensitivity)를 얻을 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 과정을 통하여 프로파일을 산출하고, 관계도가 낮은 상동체(remote homolog)를 검출할 수 있다(Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에서 1개 이상의 표시를 가지는 경우, 훨씬 더 큰 민감성이 달성될 수 있다. GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881)와 같은 프로그램은 쿼리 시퀀스(query sequence)에 대한 구조적 폴딩을 예측하는 신경망에 대한 입력으로 PSI-BLAST, 2차 구조 예측, 구조 정렬 프로파일 및 용매화 포텐셜과 같은 다양한 소스로부터의 정보를 이용한다. 유사하게는, 구조를 알 수 없는 서열과 SCOP 데이터베이스에 존재하는 슈퍼패밀리 모델을 정렬하기 위해 Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919의 방법이 사용될 수 있다. 이들 정렬은 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 만들기 위해 차례로 사용될 수 있고, 이러한 모델은 그 목적을 위해 개발된 다양한 툴을 사용하여 정확성에 대해 평가될 수 있다.In addition, if the enzymes diverged from the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1 do not detect their relationship by conventional sequence-based comparison, other pairwise sequence comparison algorithms can be used (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615). Higher sensitivity can be achieved in sequence-based searches by using search programs that use stochastic representations of polypeptide families (profiles) to search databases. For example, the PSI-BLAST program calculates a profile through an iterative database search process and can detect remote homologs with low relationships (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Even greater sensitivity can be achieved if the family or superfamily for the polypeptide has more than one representation in the protein structure database. Programs such as GenTHEADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) have been used for neural networks that predict structural folding for query sequences. It uses information from various sources such as PSI-BLAST, secondary structure predictions, structural alignment profiles, and solvation potentials as input to the . Similarly, to align sequences of unknown structure with superfamily models present in the SCOP database, Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: The method of 903-919 can be used. These alignments can in turn be used to build homology models for polypeptides, and these models can be evaluated for accuracy using a variety of tools developed for that purpose.
공지된 구조의 단백질에 대해, 구조적 정렬을 검색하고 만들어내는 데 몇몇의 툴 및 리소스가 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리는 구조적으로 정렬되었고, 이 정렬은 접근 및 다운로드 가능하다. 둘 이상의 단백질 구조는 거리행렬 정렬(distance alignment matrix) (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) 또는 CE(Combinatiorial extension) Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747)와 같은 다양한 알고리즘을 사용하여 정렬될 수 있다. 이들 알고리즘의 구현은 가능한 구조적 상동체를 발견하기 위해, 대상 구조를 가지는 구조 데이터베이스를 질의하기 위해 추가적으로 이용될 수 있다(Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).For proteins of known structure, several tools and resources are available to search for and create structural alignments. For example, the SCOP superfamily of proteins has been structurally aligned, and these alignments are accessible and downloadable. The structure of two or more proteins can be structured in a variety of ways, such as a distance alignment matrix (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) or a combinational extension (CE) Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747). It can be sorted using an algorithm. Implementations of these algorithms can additionally be used to query structural databases with the structure of interest, to discover possible structural homologs (Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
상기의 방법들은 하나의 예시로, 이에 제한되지는 않는다.The above methods are examples, but are not limited thereto.
이하, 본 출원의 구체예를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, specific examples of the present application will be described in more detail.
본 출원에서, 자일라나제는 자일란에서 1,4-베타-D-자일로시딕(1,4-beta-D-xylosidic) 결합의 내향 가수분해(endohydrolysis)를 촉매하는 효소를 의미한다. 그 예로, EC 번호가 3.2.1.8인 효소 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In this application, xylanase refers to an enzyme that catalyzes the endohydrolysis of 1,4-beta-D-xylosidic bonds in xylan. For example, it may be an enzyme having an EC number of 3.2.1.8, but is not limited thereto.
본 출원에서 자일라나제 활성은 본 출원에 기재된 실시 양태를 포함하여, 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 측정 및 평가할 수 있다.Xylanase activity in this application can be measured and evaluated using methods known in the art, including the embodiments described in this application.
본 출원에서 "모(Parent) 자일라나제"는 본 출원의 변이체 또는 변이형 폴리펩티드를 생산하기 위하여 변형이 가해지는 자일라나제를 의미한다. 구체적으로는, 모 자일라나제, 모 효소 또는 모서열은 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드일 수 있고, 이의 성숙 폴리펩티드일 수 있으며, 이의 변이체 또는 기능적 단편을 포함할 수 있으나, 자일라나제 활성을 갖고 변이체의 모체가 될 수 있는 폴리펩티드라면 이에 제한되지는 않는다.In the present application, "Parent xylanase" refers to a xylanase to which a modification is applied to produce a variant or variant polypeptide of the present application. Specifically, the parent xylanase, parent enzyme, or parent sequence may be a naturally occurring polypeptide or wild-type polypeptide, may be a mature polypeptide thereof, may include a variant or functional fragment thereof, but may not inhibit xylanase activity. It is not limited thereto as long as it has a polypeptide that can be the parent of a variant.
본 출원에서 제공하는 모 자일라나제는, 이에 제한되지는 않으나 서열번호 1의 폴리펩티드인 것일 수 있다. 또한, 자일라나제 활성을 갖는 한, 서열번호 1의 폴리펩티드와 약 60%, 70%, 75%. 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 모 자일라나제의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다. The moxylanase provided in the present application may be the polypeptide of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto. In addition, as long as it has xylanase activity, about 60%, 70%, 75% with the polypeptide of SEQ ID NO: 1. 80%. It may be a polypeptide having a sequence identity of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more, and if it has the same or corresponding activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, all It may be included without limitation in the scope of xylanase.
본 출원에서 제공하는 변이체의 모 자일라나제는, Orpinomyces sp., Neocallimastix sp., Piromyces sp., Ruminococcus sp. 유래일 수 있다. 구체적으로 Orpinomyces sp. 유래일 수 있다.The parent xylanases of the variants provided in this application are Orpinomyces sp., Neocallimastix sp., Piromyces sp., Ruminococcus sp. may be of origin. Specifically Orpinomyces sp. may be of origin.
한편 전술한 미생물은 본 출원에서 제공하는 자일라나제가 유래될 수 있는 미생물의 일 예시로, 미생물의 명칭과 관계없이 그와 분류학적으로 상동인 미생물로부터 유래하는 것도 포함한다.Meanwhile, the above-described microorganism is an example of a microorganism from which the xylanase provided in the present application can be derived, and includes those derived from microorganisms taxonomically homologous to the microorganism regardless of the name of the microorganism.
전술한 미생물은 ATCC, DSMZ, CBS, NRRL, KCTC, KCCM과 같은 공지된 미생물 기탁기관에서 분양받을 수 있다.The aforementioned microorganisms may be distributed from known microorganism depository institutions such as ATCC, DSMZ, CBS, NRRL, KCTC, and KCCM.
본 출원에서, 특정 미생물에서 "유래하는(derived from)" 서열은 그 미생물에서 자연적으로 제조되거나 제조 가능한 것에 제한되지 않고, 그 유전자를 포함하는 미생물에서 제조되고 분리되는 유전자에 의해 코딩되는 서열도 포함한다. In this application, a sequence "derived from" a specific microorganism is not limited to those naturally produced or producible in that microorganism, but also includes sequences encoded by genes produced and isolated from the microorganism containing the gene. do.
예를 들어, Orpinomyces sp. 유래 자일라나제는 Orpinomyces 속 미생물에서 자연적으로 생산되는 자일라나제 활성을 갖는 효소뿐만 아니라 Orpinomyces 속 미생물에서 생산되는 것, 그리고 당업계에 공지된 유전적 변형(예를 들면, 상기 효소를 코딩하는 서열로 형질전환)을 통해 다른 숙주세포에서 생산되는 것 또한 포함한다.For example, Orpinomyces sp. Derived xylanase is an enzyme having xylanase activity naturally produced in microorganisms of the genus Orpinomyces as well as those produced in microorganisms of the genus Orpinomyces, and genetic modifications known in the art (eg, sequences encoding the enzymes). It also includes those produced in other host cells through transformation into).
본 출원에서 "자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드"는 모 자일라나제의 변이체일 수 있다.In the present application, "mutant polypeptide having xylanase activity" may be a variant of a parent xylanase.
본 출원에서 용어, "모 자일라나제의 변이체" 또는 "자일라나제 변이체"는 하나 이상의 아미노산이 모 자일라나제의 아미노산 서열과 상이하고, 자일라나제의 활성을 갖는 단백질을 지칭한다. In this application, the term "parent xylanase variant" or "xylanase variant" refers to a protein having at least one amino acid different from the amino acid sequence of parent xylanase and having xylanase activity.
상기 "자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드", "모 자일라나제의 변이체"와 "자일라나제 변이체"는 혼용 가능하다.The above "mutant polypeptide having xylanase activity", "parent xylanase variant" and "xylanase variant" can be used interchangeably.
본 출원에서 제공하는 변이체는 자일라나제 활성을 가지면서, 모 자일라나제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 변형은 아미노산의 치환 및/또는 디설파이드 결합 형성일 수 있다.The variant provided in the present application may have xylanase activity and include one or more amino acid modifications in the parent xylanase sequence. The modification may be amino acid substitution and/or disulfide bond formation.
또한, i) 상기 변이체는 서열번호 1과 70% 이상, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이고; 및/또는 ii) 상기 변이체는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는 iii) 상기 변이체는 (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는 iv) 상기 변이체는 자일라나제 활성을 갖는 i), ii) 또는 ii) 폴리펩티드의 기능적 단편일 수 있다. In addition, i) the variant is a polypeptide having a sequence identity of 70% or more and less than 100% with SEQ ID NO: 1; and/or ii) the variant is a polypeptide encoded by a polynucleotide having at least 70% and less than 100% sequence identity with the sequence encoding the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1; and/or iii) the variant is low in sequence with (a) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (b) the cDNA thereof, or (c) the full-length complement of (a) or (b) above. a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringency conditions, moderate stringency conditions, medium-high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions; and/or iv) said variant may be a functional fragment of i), ii) or ii) polypeptide having xylanase activity.
구체적으로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 자일라나제 활성을 가지면서, 모 자일라나제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하여 모 자일라나제 대비 하나 이상의 변경된 기능 또는 특성을 가지는 것일 수 있다.Specifically, the variant provided in the present application may have xylanase activity and at least one modified function or characteristic compared to parent xylanase, including modification of one or more amino acids in the parent xylanase sequence. there is.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 자일라나제 활성을 가지면서, 모 자일라나제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하여 모 자일라나제 대비 하나 이상의 변경된 기능 또는 특성을 가지고, 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application has xylanase activity, and has one or more altered functions or properties compared to the parent xylanase, including modification of one or more amino acids in the parent xylanase sequence. , can have one or more conservative substitutions.
본 출원에서 제공하는 변이체는 모 자일라나제의 변이체로서, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.The mutant provided in the present application is a mutant of a parent xylanase, and may be a polypeptide having xylanase activity.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 46번 및 93번 위치에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 변형(modification)을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include modifications at one or more positions corresponding to positions 46 and 93 of SEQ ID NO: 1.
본 출원에서 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치로, "상응하는" 은 상기에서 설명한 바와 같다.In this application, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1, and "corresponding" is as described above.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 E46 및 N93 중 1개 이상에 상응하는 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include modifications of amino acids corresponding to one or more of E46 and N93 of SEQ ID NO: 1.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체의 변형 전 46번 아미노산은 글루탐산(E); 및/또는 93번 아미노산은 아스파라긴(N)일 수 있다.In one embodiment, amino acid 46 before modification of the variant provided in the present application is glutamic acid (E); and/or amino acid number 93 may be asparagine (N).
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 46번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, K, R 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 S, T, C, Y, N 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 Q 또는 C로의 치환을 포함할 수 있다. In one embodiment, the variant provided in this application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y of the amino acid corresponding to position 46 of SEQ ID NO: 1 , may include substitution with N, Q, D, K, R or H, specifically may include substitution with S, T, C, Y, N or Q, more specifically with Q or C can include
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 93번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, Q, D, E, K, R 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 G, A, V, L, I, M, F, W, Y 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 W로의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in this application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y of the amino acid corresponding to position 93 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R or H, specifically may include substitution with G, A, V, L, I, M, F, W, Y or H, More specifically, it may include substitution with W.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 46번 위치에 상응하는 아미노산의 극성(polar) 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 46 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 93번 위치에 상응하는 아미노산의 비극성(nonpolar) 또는 방향족 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 93 of SEQ ID NO: 1 with a nonpolar or aromatic amino acid.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 E46C 및 N93W 중 1 이상의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include substitution of one or more of E46C and N93W of SEQ ID NO: 1.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 전술한 변형의 모든 가능한 조합을 포함한다.In one embodiment, the variants provided herein include all possible combinations of the foregoing variants.
예를 들어, 상기 변이체는 전술한 변형의 조합으로 하기에서 선택된 위치의 아미노산의 변형을 포함하는 것일 수 있다:For example, the variant may include a modification of an amino acid at a position selected from the following in a combination of the above modifications:
E46C;E46C;
N93W; 및N93W; and
E46C + N93W.E46C + N93W.
본 출원에서 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치로, "상응하는" 은 상기에서 설명한 바와 같다.In this application, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1, and "corresponding" is as described above.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 28번 및 52번 위치에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 변형을 추가로 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in this application may further include modifications at one or more positions corresponding to positions 28 and 52 of SEQ ID NO: 1.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 28번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, Q, D, E, K, R 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 A, G 또는 S로의 치환을 포함할 수 있다. In one embodiment, the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y of the amino acid corresponding to position 28 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R or H, specifically G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y or Q It may include substitution with, and more specifically, it may include substitution with A, G or S.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 52번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, Q, D, E, K, R 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 G, A, V, L, I, M, F, W, P, D, E, K, R 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 P, A 또는 E 로의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y of the amino acid corresponding to position 52 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R or H, specifically G, A, V, L, I, M, F, W, P, D, E, K, R or H It may include substitution with, and more specifically may include substitution with P, A or E.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 28번 위치에 상응하는 아미노산의 소수성 또는 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 28 of SEQ ID NO: 1 with a hydrophobic or polar amino acid.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 52번 위치에 상응하는 아미노산의 소수성 또는 산성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 52 of SEQ ID NO: 1 with a hydrophobic or acidic amino acid.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 N28A/G/S 및 N52P/A/E 중 1 이상의 치환을 포함할 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may include substitution of one or more of N28A/G/S and N52P/A/E of SEQ ID NO: 1.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 다음의 치환을 포함할 수 있다:In one embodiment, the variants provided in this application may include the following substitutions:
N28A/G/S;N28A/G/S;
N52P/A/E; 또는N52P/A/E; or
N28A/G/S + N52P/A/E.N28A/G/S + N52P/A/E.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 다음의 치환을 포함할 수 있다:In one embodiment, the variants provided in this application may include the following substitutions:
N28G;N28G;
N52P; 또는N52P; or
N28G + N52P.N28G + N52P.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 디설파이드 브리지를 형성하는 아미노산 쌍을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application may include an amino acid pair that forms a disulfide bridge.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 디설파이드 브리지를 형성하는 아미노산 쌍은 서열번호 1의 3번, 5번, 20번, 34번, 36번, 및 41번 중 2 이상의 위치에 상응하는 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, in the present application, the amino acid pair forming the disulfide bridge is located at two or more positions among
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 R3C, S5C, F20C, S34C, T36C 및 A41C 중 2 이상의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in this application may include substitution of two or more of R3C, S5C, F20C, S34C, T36C and A41C of SEQ ID NO: 1.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 하기에서 선택된 어느 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다:In one embodiment, the variant provided in this application may include any one or more substitutions selected from the following:
R3C+T36C;R3C+T36C;
S5C+S34C;S5C+S34C;
F20C+A41C;F20C+A41C;
R3C+T36C+S5C+S34C;R3C+T36C+S5C+S34C;
R3C+T36C+F20C+A41C;R3C+T36C+F20C+A41C;
S5C+S34C+F20C+A41C;S5C+S34C+F20C+A41C;
R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C.R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 변이체는 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: i) 3번 아미노산의 시스테인으로의 치환; ii) 5번 아미노산의 시스테인으로의 치환; iii) 20번 아미노산의 시스테인으로의 치환; iv) 34번 아미노산의 시스테인으로의 치환; v) 36번 아미노산의 시스테인으로의 치환; 및 vi) 41번 아미노산의 시스테인으로의 치환.In any one of the embodiments described above, the variant may include, but is not limited to, substitution of any one or more of the following i) to vi): i) substitution of amino acid 3 with cysteine; ii) substitution of
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 3번 및 36번 아미노산 쌍; 5번 및 34번 아미노산 쌍; 및/또는 20번 및 41번 아미노산 쌍이 시스테인으로 치환되어, 상기 아미노산 쌍이 디설파이드 브리지를 형성하는 것일 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application is a pair of amino acids 3 and 36; amino acid pairs at
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번 및 36번 위치에서의 변형(modification)을 포함할 수 있다. In one embodiment, the variant provided in the present application may include modifications at positions 3 and 36 of SEQ ID NO: 1.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 R3 및 T36에 상응하는 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application may include modifications of amino acids corresponding to R3 and T36 of SEQ ID NO: 1.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변형 전 서열번호 1의 3번 위치에 상응하는 아미노산은 아르기닌(R); 및/또는 36 번 위치에 상응하는 아미노산은 쓰레오닌(T)일 수 있다.In any one of the above embodiments, the amino acid corresponding to position 3 of SEQ ID NO: 1 before modification provided in the present application is arginine (R); and/or the amino acid corresponding to position 36 may be threonine (T).
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 S, T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다. In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S of the amino acid corresponding to position 3 of SEQ ID NO: 1 , T, C, Y, N, Q, D, E, K, or H, and may specifically include substitution with S, T, C, Y, N, or Q, and more Specifically, it may include substitution with C.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 36번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 S, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S of the amino acid corresponding to position 36 of SEQ ID NO: 1 , C, Y, N, Q, D, E, K, R, or H, and may specifically include substitution with S, C, Y, N, or Q, more specifically may include substitution with C.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 3 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 36번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 36 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 R3C 및 T36C 치환을 포함할 수 있다. In any one of the above embodiments, the variant provided in this application may include R3C and T36C substitutions of SEQ ID NO: 1.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번 및 36번 위치에 상응하는 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하고, 상기 치환된 2개의 아미노산 사이에 디설파이드 브리지를 형성하는 것일 수 있다.In any one of the above-described embodiments, the variant provided in the present application comprises substitution of amino acids corresponding to positions 3 and 36 of SEQ ID NO: 1 with cysteine, and between the two amino acids substituted It may be to form a disulfide bridge.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 5번 및 34번 위치에서의 변형(modification)을 포함할 수 있다. In one embodiment, the variant provided in the present application may include modifications at
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 S5 및 S34에 상응하는 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application may include modifications of amino acids corresponding to S5 and S34 of SEQ ID NO: 1.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변형 전 서열번호 1의 5번 위치에 상응하는 아미노산은 세린(S); 및/또는 34 번 위치에 상응하는 아미노산은 세린(S)일 수 있다.In any one of the above embodiments, the amino acid corresponding to position 5 of SEQ ID NO: 1 before modification provided in the present application is serine (S); and/or the amino acid corresponding to position 34 may be serine (S).
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 5번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, T of the amino acid corresponding to position 5 of SEQ ID NO: 1 , C, Y, N, Q, D, E, K, R, or H, specifically may include substitution with T, C, Y, N, or Q, more specifically may include substitution with C.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 34번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, T of the amino acid corresponding to position 34 of SEQ ID NO: 1 , C, Y, N, Q, D, E, K, R, or H, specifically may include substitution with T, C, Y, N, or Q, more specifically may include substitution with C.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 5번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 5 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 34번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 34 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 S5C 및 S34C 치환을 포함할 수 있다. In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application may include S5C and S34C substitutions of SEQ ID NO: 1.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 5번 및 34번 위치에 상응하는 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하고, 상기 치환된 2개의 아미노산 사이에 디설파이드 브리지를 형성하는 것일 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application comprises substitution of amino acids corresponding to
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 20번 및 41번 위치에서의 변형(modification)을 포함할 수 있다. In one embodiment, the variant provided in the present application may include modifications at
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 F20 및 A41에 상응하는 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application may include amino acid modifications corresponding to F20 and A41 of SEQ ID NO: 1.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변형 전 서열번호 1의 20번 위치에 상응하는 아미노산은 페닐알라닌(F); 및/또는 41 번 위치에 상응하는 아미노산은 알라닌(A)일 수 있다.In any one of the above embodiments, the amino acid corresponding to position 20 of SEQ ID NO: 1 before modification provided in the present application is phenylalanine (F); and/or the amino acid corresponding to position 41 may be alanine (A).
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 20번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 S, T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in this application is G, A, V, L, I, M, W, P, S, T of the amino acid corresponding to position 20 of SEQ ID NO: 1 , C, Y, N, Q, D, E, K, R, or H, and may specifically include substitution with S, T, C, Y, N, or Q, and more Specifically, it may include substitution with C.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 41번 위치에 상응하는 아미노산의 G, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 구체적으로 S, T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in this application is G, V, L, I, M, F, W, P, S, T of the amino acid corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 1 , C, Y, N, Q, D, E, K, R, or H, specifically with S, T, C, Y, N, or Q, and more specifically with C can do.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 20번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the embodiments described above, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 20 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 41번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application may include substitution of an amino acid corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 F20C 및 A41C 치환을 포함할 수 있다. In any one of the above embodiments, the variant provided in this application may include F20C and A41C substitutions of SEQ ID NO: 1.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 20번 및 41번 위치에 상응하는 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하고, 상기 치환된 2개의 아미노산 사이에 디설파이드 브리지를 형성하는 것일 수 있다.In any one of the above embodiments, the variant provided in the present application comprises substitution of amino acids corresponding to
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 전술한 변형의 모든 가능한 조합을 포함한다.In one embodiment, the variants provided herein include all possible combinations of the foregoing variants.
예를 들어, 상기 변이체는 전술한 변형의 조합으로 하기에서 선택된 위치의 아미노산의 변형을 포함하는 것일 수 있다: For example, the variant may include a modification of an amino acid at a position selected from the following in a combination of the above modifications:
46 46
93 93
46 + 93 46 + 93
46 + 28 46+28
46 + 52 46 + 52
46 + 3 + 36 46 + 3 + 36
93 + 28 93+28
93 + 52 93 + 52
93 + 3 + 36 93 + 3 + 36
46 + 93 + 28 46 + 93 + 28
46 + 93 + 52 46 + 93 + 52
46 + 93 + 3 + 36 46 + 93 + 3 + 36
46 + 28 + 52 46 + 28 + 52
46 + 28 + 3 + 36 46 + 28 + 3 + 36
46 + 52 + 3 + 36 46 + 52 + 3 + 36
46 + 28 + 52 + 3 + 36 46 + 28 + 52 + 3 + 36
93 + 28 + 52 93 + 28 + 52
93 + 28 + 3 + 36 93 + 28 + 3 + 36
93 + 52 + 3 + 36 93 + 52 + 3 + 36
93 + 28 + 52 + 3 + 36 93 + 28 + 52 + 3 + 36
46 + 93 + 28 + 52 46 + 93 + 28 + 52
46 + 93 + 28 + 3 + 36 46 + 93 + 28 + 3 + 36
46 + 93 + 52 + 3 + 36 46 + 93 + 52 + 3 + 36
46 + 93 + 28 + 52 + 3 + 3646 + 93 + 28 + 52 + 3 + 36
46 + 5 + 34 46 + 5 + 34
93 + 5 + 34 93 + 5 + 34
46 + 93 + 5 + 34 46 + 93 + 5 + 34
46 + 28 + 5 + 34 46 + 28 + 5 + 34
46 + 52 + 5 + 34 46 + 52 + 5 + 34
46 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 3 + 36 + 5 + 34
93 + 28 + 5 + 34 93 + 28 + 5 + 34
93 + 52 + 5 + 34 93 + 52 + 5 + 34
93 + 3 + 36 + 5 + 34 93 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 93 + 28 + 5 + 34 46 + 93 + 28 + 5 + 34
46 + 93 + 52 + 5 + 34 46 + 93 + 52 + 5 + 34
46 + 93 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 93 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 28 + 52 + 5 + 34 46 + 28 + 52 + 5 + 34
46 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34
93 + 28 + 52 + 5 + 34 93 + 28 + 52 + 5 + 34
93 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 93 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34
93 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 93 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34
93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 93 + 28 + 52 + 5 + 34 46 + 93 + 28 + 52 + 5 + 34
46 + 93 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 93 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 93 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 93 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 46 + 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34
46 + 20 + 41 46 + 20 + 41
93 + 20 + 41 93+20+41
46 + 93 + 20 + 41 46 + 93 + 20 + 41
46 + 28 + 20 + 41 46 + 28 + 20 + 41
46 + 52 + 20 + 41 46 + 52 + 20 + 41
46 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 3 + 36 + 20 + 41
93 + 28 + 20 + 41 93 + 28 + 20 + 41
93 + 52 + 20 + 41 93 + 52 + 20 + 41
93 + 3 + 36 + 20 + 41 93 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 20 + 41 46 + 93 + 28 + 20 + 41
46 + 93 + 52 + 20 + 41 46 + 93 + 52 + 20 + 41
46 + 93 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 93 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 28 + 52 + 20 + 41 46 + 28 + 52 + 20 + 41
46 + 28 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 28 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 28 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 28 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41
93 + 28 + 52 + 20 + 41 93 + 28 + 52 + 20 + 41
93 + 28 + 3 + 36 + 20 + 41 93 + 28 + 3 + 36 + 20 + 41
93 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41 93 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41
93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 52 + 20 + 41 46 + 93 + 28 + 52 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 93 + 28 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 93 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 93 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41 46 + 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 20 + 41
46 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 28 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 28 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 52 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 52 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 28 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 28 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 52 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 52 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 28 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 52 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 52 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 28 + 52 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 28 + 52 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 28 + 52 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 28 + 52 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4193 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 52 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 28 + 52 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 28 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
46 + 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 4146 + 93 + 28 + 52 + 3 + 36 + 5 + 34 + 20 + 41
또 하나의 예로, 상기 변이체는 하기에서 선택된 어느 하나 이상의 변형을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:As another example, the variant may include one or more modifications selected from the following, but is not limited thereto:
E46C E46C
N93W N93W
E46C + N93W E46C + N93W
E46C + N28A/G/S E46C + N28A/G/S
E46C + N52P/A/E E46C + N52P/A/E
E46C + R3C + T36C E46C + R3C + T36C
N93W + N28A/G/S N93W + N28A/G/S
N93W + N52P/A/E N93W + N52P/A/E
N93W + R3C + T36C N93W + R3C + T36C
E46C + N93W + N28A/G/S E46C + N93W + N28A/G/S
E46C + N93W + N52P/A/E E46C + N93W + N52P/A/E
E46C + N93W + R3C + T36C E46C + N93W + R3C + T36C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E E46C + N28A/G/S + N52P/A/E
E46C + N28A/G/S + R3C + T36C E46C + N28A/G/S + R3C + T36C
E46C + N52P/A/E + R3C + T36C E46C + N52P/A/E + R3C + T36C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E N93W + N28A/G/S + N52P/A/E
N93W + N28A/G/S + R3C + T36C N93W + N28A/G/S + R3C + T36C
N93W + N52P/A/E + R3C + T36C N93W + N52P/A/E + R3C + T36C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E
E46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C E46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C
E46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C E46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C.E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C.
E46C + S5C + S34C E46C + S5C + S34C
N93W + S5C + S34C N93W + S5C + S34C
E46C + N93W + S5C + S34C E46C + N93W + S5C + S34C
E46C + N28A/G/S + S5C + S34C E46C + N28A/G/S + S5C + S34C
E46C + N52P/A/E + S5C + S34C E46C + N52P/A/E + S5C + S34C
E46C + R3C + T36C + S5C + S34C E46C + R3C + T36C + S5C + S34C
N93W + N28A/G/S + S5C + S34C N93W + N28A/G/S + S5C + S34C
N93W + N52P/A/E + S5C + S34C N93W + N52P/A/E + S5C + S34C
N93W + R3C + T36C + S5C + S34C N93W + R3C + T36C + S5C + S34C
E46C + N93W + N28A/G/S + S5C + S34C E46C + N93W + N28A/G/S + S5C + S34C
E46C + N93W + N52P/A/E + S5C + S34C E46C + N93W + N52P/A/E + S5C + S34C
E46C + N93W + R3C + T36C + S5C + S34C E46C + N93W + R3C + T36C + S5C + S34C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C
E46C + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C E46C + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C
E46C + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C E46C + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C
N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C
N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C
E46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C E46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C
E46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C E46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C. + S5C + S34C E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C. +S5C +S34C
E46C + F20C + A41C E46C + F20C + A41C
N93W + F20C + A41C N93W + F20C + A41C
E46C + N93W + F20C + A41C E46C + N93W + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + F20C + A41C E46C + N28A/G/S + F20C + A41C
E46C + N52P/A/E + F20C + A41C E46C + N52P/A/E + F20C + A41C
E46C + R3C + T36C + F20C + A41C E46C + R3C + T36C + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + F20C + A41C N93W + N28A/G/S + F20C + A41C
N93W + N52P/A/E + F20C + A41C N93W + N52P/A/E + F20C + A41C
N93W + R3C + T36C + F20C + A41C N93W + R3C + T36C + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + F20C + A41C E46C + N93W + N28A/G/S + F20C + A41C
E46C + N93W + N52P/A/E + F20C + A41C E46C + N93W + N52P/A/E + F20C + A41C
E46C + N93W + R3C + T36C + F20C + A41C E46C + N93W + R3C + T36C + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + F20C + A41C E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + R3C + T36C + F20C + A41C E46C + N28A/G/S + R3C + T36C + F20C + A41C
E46C + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C E46C + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + F20C + A41C N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + F20C + A41C N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + F20C + A41C
N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + F20C + A41C E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + F20C + A41C E46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + F20C + A41C
E46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C E46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C. + F20C + A41C E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C. + F20C + A41C
E46C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N93W + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N28A/G/S + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + N28A/G/S + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N93W + N28A/G/S + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N93W + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N93W + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CN93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N93W + N28A/G/S + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41CE46C + N93W + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C
E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C.E46C + N93W + N28A/G/S + N52P/A/E + R3C + T36C + S5C + S34C + F20C + A41C.
구체적으로, 서열번호 1의 E46C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 3으로, 서열번호 1의 N93W 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 5로, 서열번호 1의 N93W+R3C+T36C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 7로 표시될 수 있다.Specifically, the variant comprising the E46C substitution of SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 3, the variant comprising the N93W substitution of SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 5, the variant comprising the N93W+R3C+T36C substitution of SEQ ID NO: 1 It can be represented by SEQ ID NO: 7.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 모 자일라나제; 이의 성숙 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application is a mo xylanase; At least about 60%, e.g., at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, 93 with a mature polypeptide or functional fragment thereof. % or greater, 94% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater or 99% or greater and less than 100% sequence identity.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 1과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application is about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more of SEQ ID NO: 1 , at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% and less than 100% sequence identity. .
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application is about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, At least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% and less than 100% sequence It may be a polypeptide encoded by a polynucleotide having identity.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application is (a) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (b) its cDNA, or (c) the full-length complementary sequence of (a) or (b) (full -length complement) under low stringency conditions, medium stringency conditions, medium-high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 1의 기능적 단편과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application is a functional fragment of SEQ ID NO: 1 and about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, have a sequence identity of at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% and less than 100% can
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 2로 표시되는 핵산염기 서열과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만인 핵산염기 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application is about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 % or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more and less than 100% Nucleobases It may be a polypeptide encoded by a polynucleotide having sequence identity.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 하나의 폴리펩티드일 수 있다. In one embodiment, the variant provided in the present application may be a polypeptide of any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 and 23.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 3, 5 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 하나의 아미노산 서열에서, 46번, 93번, 28번, 52번, 3번 및 36번 아미노산 중 하나 이상의 위치의 아미노산은 고정되고, 상기 서열번호의 아미노산 서열, 이의 성숙 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in this application is SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, and 23 in any one of the amino acid sequences, 46, 93, At least one amino acid at position 28, 52, 3 and 36 is fixed, and about 60% or more, for example, 65% or more, with the amino acid sequence of the above sequence number, its mature polypeptide or its functional fragment, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% It may be a polypeptide having a sequence identity of at least 99%, or at least 100%.
본 출원에서 제공하는 변이체는 다른 자일라나제, 예를 들어 야생형 자일라나제, 모 자일라나제, 다른 자일라나제 변이체 등과 비교하여, 선택되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특성 또는 속성이 1 이상 변경된 것일 수 있다.Variants provided in this application have one or more selected or detectable polypeptides of any characteristic or attribute compared to other xylanases, e.g., wild-type xylanase, parent xylanase, other xylanase variants, and the like. may have been changed.
상기의 특성 또는 속성에는, 산화 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리 안정성, pH 활성 프로파일, 단백질분해에 대한 내성, Km, kcat, kcat/Km 비율, 단백질 접힘, 면역 반응 유도, 리간드에 결합하는 능력, 수용체에 결합하는 능력, 분비되는 능력, 세포의 표면에 전시되는 능력, 올리고머를 형성하는 능력, 신호를 보내는 능력, 세포 증식을 촉진하는 능력, 세포 증식을 억제하는 능력, 세포자멸사를 유도하는 능력, 인산화 또는 글리코실화에 의해 개질되는 능력, 및/또는 질환을 치료하는 능력이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.The above properties or attributes include oxidative stability, substrate specificity, catalytic activity, thermal stability, alkali stability, pH activity profile, resistance to proteolysis, Km, k cat , k cat /Km ratio, protein folding, induction of an immune response, Ability to bind to ligands, to bind to receptors, to be secreted, to be displayed on the surface of cells, to form oligomers, to signal, to promote cell proliferation, to inhibit cell proliferation, to inhibit cell proliferation ability to induce apoptosis, ability to be modified by phosphorylation or glycosylation, and/or ability to treat disease.
일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모서열에 비해 내열성 및/또는 열안정성이 증가한 것일 수 있다.In one embodiment, the variant provided in the present application may have increased heat resistance and/or thermal stability compared to the parental sequence.
본 출원에서, "효소활성(enzymatic activity)"은 적어도 하나의 촉매 활성(catalytic activity)을 나타낸다. 구체적으로는 kcat/Km으로 주로 표현되는 효소의 전환 효율일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In this application, "enzymatic activity" refers to at least one catalytic activity. Specifically, it may be the conversion efficiency of an enzyme mainly expressed as k cat /Km, but is not limited thereto.
kcat는 효소가 기질로 완전히 포화되었을 때, 한 개의 효소에 의한 단위시간에 생성물로 전환하는 속도상수(catalytic constant)를 의미하며, 전환수(turnover number)라고도 칭해진다. Km은 반응속도가 최고값(Vmax)의 절반일 때의 기질 농도(substrate concenstration)이다. k cat means a rate constant (catalytic constant) of conversion to a product in unit time by one enzyme when the enzyme is completely saturated with a substrate, and is also referred to as a turnover number. Km is the substrate concentration when the reaction rate is half of the maximum value (Vmax).
효소 활성을 표현하는 방법의 예시로, 특이적 활성(specific activity; umol of converted substrate x mg -1 x min -1) 또는 volumetric activity (umol of converted substrate x mL -1 x min -1)등이 있다.Examples of methods of expressing enzyme activity include specific activity (umol of converted substrate x mg -1 x min -1 ) or volumetric activity (umol of converted substrate x mL -1 x min -1 ). .
다만 효소활성을 정의하는 것은 전술한 내용에 제한되지 않고, Irwin H. Segel, Enzyme kinetics, John Wiley & Sons, 1979; A. G. Marangoni, Enzyme kinetics, Wiley-Interscience, 2003; A. Fersht, Enzyme structure and mechanisms, John Wiley & Sons, 1981; Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzyme catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H. Freeman, 1999; Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden, Wiley-Blackwell 2012 and Voet ef al., "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, pages 331-332 with respect to enzymatic activity 등에 알려진 내용을 토대로 정의하고 평가할 수 있다.However, the definition of enzyme activity is not limited to the above, and Irwin H. Segel, Enzyme kinetics, John Wiley & Sons, 1979; A. G. Marangoni, Enzyme kinetics, Wiley-Interscience, 2003; A. Fersht, Enzyme structure and mechanisms, John Wiley & Sons, 1981; Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzyme catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H. Freeman, 1999; Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden, Wiley-Blackwell 2012 and Voet ef al., "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, pages 331-332 with respect to enzymatic activity can be defined and evaluated.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모효소 대비 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 또는 약 200% 이상의 증가된 효소 활성을 가질 수 있다. In one embodiment, the variant provided in the present application is about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, about 140%, about 150%, about 160%, about 170%, about 180% compared to the parent enzyme %, about 190%, or about 200% or more increased enzymatic activity.
다른 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모효소 대비 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 또는 약 20% 이하의 감소된 효소 활성을 가질 수 있다.In another embodiment, the variant provided in the present application is about 99%, about 95%, about 90%, about 80%, about 70%, about 60%, about 50%, about 40%, or It may have a reduced enzymatic activity of about 20% or less.
본 출원에서 용어 "특이적 활성(specific activity)"은 단백질 단위 중량 당 나타나는 효소의 활성으로, unit/mg으로 표현할 수 있다. 단백질의 정량은, 예를 들면 SDS-PAGE 혹은 Bradford assay 등을 이용하여 할 수 있다.In this application, the term “specific activity” is the activity of an enzyme per unit weight of protein, and can be expressed as unit/mg. Quantification of the protein can be performed using, for example, SDS-PAGE or Bradford assay.
효소 안정성(enzyme stability)이란, 효소 활성이 저장 또는 반응 시간 동안 보존되는 것을 의미한다. 이러한 안정성의 변화를 측정하기 위해, 최초 효소 활성을 정해진 조건 하에 0시간(time zero) (100%) 및 일정 시간 경과 후 (x%) 측정하여 비교함으로써, 효소활성이 상실되는 수준 내지는 효소 안정성을 표현할 수 있다.Enzyme stability means that enzyme activity is preserved during storage or reaction time. In order to measure this change in stability, the initial enzyme activity was measured and compared at time zero (100%) and after a certain amount of time (x%) under predetermined conditions to determine the level at which enzyme activity is lost or enzyme stability. can express
효소 활성에 영향을 미치는 요소는, 예를 들어 pH, 열, 다른 물질(예를 들어, 산화제, 킬레이트제)의 존재 등이 있다.Factors that affect enzyme activity include, for example, pH, heat, the presence of other substances (eg, oxidizing agents, chelating agents), and the like.
본 출원에서 용어, "pH 안정성"이란 특정 pH 범위에서 단백질이 기능할 수 있는 능력(ability)을 의미한다. 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 약 pH 4.0 내지 약 pH 12.0 에서 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. As used herein, the term "pH stability" means the ability of a protein to function in a specific pH range. In one embodiment, the variant provided in the present application may have activity at about pH 4.0 to about pH 12.0, but is not limited thereto.
특정 pH 범위에서 단백질이 기능을 유지하는 경우 "pH 안정성"을 가지는 것으로 정의할 수 있으며, pH 범위에 따라 "내산성", "알칼리 내성" 등을 가지는 것으로 정의할 수 있다.When a protein maintains its function in a specific pH range, it can be defined as having "pH stability", and according to the pH range, it can be defined as having "acid resistance", "alkali resistance", and the like.
본 출원에서 용어, "열안정성(thermal stability)"이란 특정 온도 범위에서 단백질이 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 약 20℃ 내지 약 120℃ 범위에서 활성을 가질 수 있고, 구체적으로 약 60℃ 내지 약 100℃ 범위에서 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "thermal stability" means the ability of a protein to function in a specific temperature range. In one embodiment, the variant provided in the present application may have activity in the range of about 20 ° C to about 120 ° C, and specifically may have activity in the range of about 60 ° C to about 100 ° C, but is not limited thereto. .
본 출원에서 용어, "내열성(thermal tolerance)"이란 단백질이 특정 온도, 예를 들어 고열 또는 극저온에 노출된 후 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 내열성을 갖는 단백질은 노출된 온도에서는 기능하지 않을 수 있으나, 최적 온도 환경으로 돌아오면 다시 기능을 가질 수 있다.As used herein, the term "thermal tolerance" refers to the ability of a protein to function after exposure to a specific temperature, eg, high heat or cryogenic temperature. For example, proteins that are thermotolerant may not function at the temperature they are exposed to, but may become functional again when returned to an optimal temperature environment.
안정성의 증가는 다른 효소, 예를 들어 야생형 효소, 모 효소 및/또는 다른 변이체와 비교하여, 높은 효소 활성 유지; 단백질이 기능을 유지하는 pH, 온도 및/또는 시간 등의 범위 증가를 포함한다.The increase in stability may be compared to other enzymes, eg, wild-type enzyme, parent enzyme and/or other variants, maintaining high enzyme activity; This includes increasing the range of pH, temperature and/or time, etc., over which the protein remains functional.
안정성의 감소는 다른 효소, 예를 들어 야생형 효소, 모 효소 및/또는 다른 변이체와 비교하여, 낮은 효소 활성 유지; 단백질이 기능을 유지하는 pH, 온도 및/또는 시간 등의 범위 감소를 포함한다.Reduction in stability is associated with maintenance of lower enzyme activity compared to other enzymes, e.g., wild-type enzyme, parent enzyme, and/or other variants; This includes reducing the range of pH, temperature and/or time, etc., over which the protein remains functional.
본 출원에서 용어, "기질특이성(substrate speicifity)"이란 기질 및 기질과 경쟁하는 분자들을 식별할 수 있는 효소의 능력을 의미한다. 기질특이성은 상이한 기질에 대한 효소의 활성을 측정하여 결정할 수 있다. 하나의 구체예로, 상기 기질특이성의 변화는 목적하는 산물을 생성할 수 있는 기질에 대한 특이성이 증가하는 방향으로 변화하는 것일 수 있다. 다른 하나의 구체예로, 상기 기질특이성의 변화는 목적하는 산물을 생성할 수 있는 기질에 대한 특이성이 감소하는 방향으로 변화하는 것일 수 있다.As used herein, the term “substrate specificity” refers to the ability of an enzyme to discriminate between a substrate and molecules that compete with the substrate. Substrate specificity can be determined by measuring the activity of an enzyme on different substrates. In one embodiment, the change in substrate specificity may be a change in the direction of increasing specificity for a substrate capable of producing a desired product. In another embodiment, the change in substrate specificity may be a change in a direction in which specificity for a substrate capable of producing a desired product is reduced.
본 출원에서 제공하는 변이체의 변경된 특성은 사료, 제빵, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등을 포함한 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 활성, 개선된 활성일 수 있다.The modified properties of the variants provided in this application may be suitable for application in various industrial fields, including feed, bakery, pulp bleaching, and the like, and improved activity.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전술한 변이체의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. A polynucleotide encoding a variant of the present application may include the coding sequence of the above-described variant. In the polynucleotide, various modifications may be made to the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in organisms in which the polypeptide is to be expressed. .
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 본 출원의 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. In addition, the polynucleotide of the present application is a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence that hybridizes with a complementary sequence to all or part of the nucleotide sequence under stringent conditions to encode the variant of the present application. can be included without limitation.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. The "stringent condition" means a condition that allows specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in the literature (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, Inc., New York).
예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.For example, polynucleotides with high homology or identity, 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, more specifically 99% or more 60°C, 1ХSSC, 0.1% SDS, which is a condition in which polynucleotides of the same identity or identity do not hybridize and polynucleotides having less homology or identity do not hybridize, or washing conditions of conventional southern hybridization. , Specifically, at 60 ° C., 0.1ХSSC, 0.1% SDS, more specifically at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C., 0.1ХSSC, 0.1% SDS, conditions for washing once, specifically 2 to 3 times are listed. can
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Thus, the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the entire sequence.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.Specifically, polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions. In addition, the Tm value may be 60 °C, 63 °C or 65 °C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).Appropriate stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, parameters well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
예를 들어 "높은 엄격도"는 프로브의 Tm의 약 5 내지 10℃아래에서 발생하고; "중간 엄격도"는 프로브의 Tm의 약 10 내지 20℃아래에서 발생하며; "낮은 엄격도"는 Tm의 약 20 내지 25℃아래에서 발생할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.For example, “high stringency” occurs about 5 to 10° C. below the Tm of the probe; “Medium stringency” occurs between about 10 and 20° C. below the Tm of the probe; "Low stringency" may occur at, but is not limited to, about 20 to 25° C. below the Tm.
일 예로, "낮은 엄격도 조건(low stringency condition)" 은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 25% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 50℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.In one example, "low stringency condition" is 5X SSPE, 0.3% SDS, sheared and denatured salmon, for probes of at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to Southern blotting standard procedures. Prehybridization and hybridization at 42° C. at 200 micrograms/ml of sperm DNA and 25% formamide. The carrier material can be finally washed 2 to 3 times each for 15 minutes using 2 X SSC, 0.1 to 0.2% SDS at 50 °C.
일 예로, "중간 엄격도 조건(medium stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 55℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.일 예로, "중상 엄격도 조건(medium-high stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 60℃에서 1 내지 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.As an example, "medium stringency condition" is 5X SSPE, 0.3% SDS, sheared and denatured salmon, for probes of at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to standard Southern blotting procedures. Prehybridization and hybridization at 42°C at 200 micrograms/ml of sperm DNA and 35% formamide. The carrier material can be finally washed 2-3 times with 2 X SSC, 0.1-0.2% SDS at 55°C for 15 minutes each. For example, "medium-high stringency condition" "In 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/ml of sheared and denatured salmon sperm DNA and 35% formamide, for probes of at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to standard Southern blotting procedures, It may be prehybridization and hybridization at 42°C. The carrier material can be finally washed 2 to 3 times at 60° C. with 1 to 2 X SSC, 0.1 to 0.2% SDS for 15 minutes each.
일 예로, "높은 엄격도 조건(high stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5 X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 65℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.In one example, "high stringency conditions" are 5 X SSPE, 0.3% SDS, sheared and denatured, for probes of at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to Southern blotting standard procedures. Prehybridization and hybridization at 42° C. in 200 micrograms/ml of salmon sperm DNA and 35% formamide. The carrier material can be finally washed 2 to 3 times each for 15 minutes using 2 X SSC, 0.1 to 0.2% SDS at 65 °C.
본 출원에서 제공하는 핵산 구조체는, 조절 서열에 적합한 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 코딩서열의 발현을 지시하는 1개 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 본 출원에서 제공하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.A nucleic acid construct provided herein comprises a polynucleotide encoding a variant provided herein, operably linked to one or more regulatory sequences that direct expression of the coding sequence in an appropriate host cell under conditions suitable for the regulatory sequence. do.
폴리뉴클레오티드는 변이체의 발현을 가능하게 하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 벡터로 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 전 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 그와 같은 조작은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.Polynucleotides can be engineered in a variety of ways to allow expression of variants. Depending on the expression vector, it may be desirable or necessary to manipulate the polynucleotide prior to insertion into the vector. Such manipulations may use methods known in the art.
본 출원에서 제공하는 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 본 출원의 변이체를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.The "vector" provided in the present application contains a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the variant operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so as to express the variant of the present application in a suitable host. means a DNA preparation. The expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an arbitrary operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can integrate into the genome itself.
본 출원에서 사용될 수 있는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.Vectors that can be used in the present application are not particularly limited, and any vectors known in the art may be used. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pBR-based, pUC-based, and pBluescriptII-based plasmid vectors , pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based, etc. can be used. Specifically, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 본 출원에서 제공하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.For example, a polynucleotide encoding a variant provided in the present application may be inserted into a chromosome through a vector for chromosomal insertion into a cell. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. A selection marker for determining whether the chromosome is inserted may be further included. Selectable markers are used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule has been inserted, and to give selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
본 출원의 숙주 세포는, 본 출원의 변이체를 발현할 수 있는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다.Host cells of the present application may be included without limitation as long as they can express the variants of the present application.
본 출원의 숙주 세포는 전술한 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 핵산 구조체 및/또는 벡터를 포함할 수 있다. The host cell of the present application may include the above-described variant, a polynucleotide encoding the variant, a nucleic acid construct containing the same, and/or a vector.
상기 핵산 구조체 또는 벡터는 앞서 설명된 바와 같이 염색체에 통합되거나, 또는 자가 복제되는 염색체외 벡터로 유지될 수 있다.The nucleic acid construct or vector may be maintained as a chromosomally integrated or self-replicating extrachromosomal vector as described above.
본 출원의 숙주 세포는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하여 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다. A host cell of the present application includes any progeny of the parent cell that are not identical to the parent cell due to mutations occurring during replication.
숙주 세포는 변이체의 재조합 생성에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.A host cell may be any cell useful for recombinant production of variants, such as a prokaryotic or eukaryotic cell.
원핵 숙주 세포는 임의의 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다. A prokaryotic host cell can be any gram-positive or gram-negative bacterium.
그람-양성 박테리아에는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 게오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스가 포함되나 이들에 제한되지 않는다. Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, and Streptomyces.
그람-음성 박테리아에는 캄필로박터, 에스케리키아 콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 일리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라, 비브리오(예컨대, 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens)) 및 유레아플라스마가 포함되나 이들에 제한되지 않는다.Gram-negative bacteria include Campylobacter, Escherichia coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Iliobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, Vibrio (e.g. Vibrio natriegens) ) and Ureaplasma.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 바실러스 속 숙주 세포일 수 있고, 구체적으로 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시이, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 라우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.In one embodiment, the bacterial host cell may be a host cell of the genus Bacillus, specifically, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumillus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis cells. don't
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 스트렙토코커스 속 숙주 세포일 수 있고 구체적으로 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 유베리스(Streptococcus uberis) 및 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi) 하위종 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.In one embodiment, the bacterial host cell may be a host cell of the genus Streptococcus, specifically Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis and Streptococcus equi subspecies Zooepidemicus cells.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 스트렙토마이세스 속 숙주 세포일 수 있고, 구체적으로 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.In one embodiment, the bacterial host cell may be a host cell of the genus Streptomyces, specifically Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces Coelicola, Streptomyces griseus and Streptomyces lividans cells.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 코리네박테리움 속 숙주 세포일 수 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the bacterial host cell may be a host cell of the genus Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare ( Corynebacterium singulare), Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, or Corynebacterium flavescens, but is not limited thereto.
하나의 구체 예로, 상기 숙주 세포는 에스케리키아 속 미생물일 수 있고, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), (Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티 (Escherichia albertii), 에스케리키아 페르구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니 (Escherichia hermannii), 에스케리키아 불네리스 (Escherichia vulneris), 또는 에스케리키아 블랏태 (Escherichia blattae) 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the host cell may be a microorganism of the genus Escherichia, Escherichia coli, (Escherichia coli), Escherichia albertii, Escherichia fergusonii ), Escherichia hermannii, Escherichia vulneris, or Escherichia blattae, but is not limited thereto.
숙주 세포는 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다.The host cell may be a eukaryote such as a mammalian, insect, plant or fungal cell.
숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본 출원에서 "진균"은 자낭균문, 담자균문, 통곰팡이문 및 접합균문뿐 아니라 난균문 및 모든 불완전 진균류를 포함한다.The host cell may be a fungal cell. In this application, "fungi" includes ascomycetes, basidiomycota, phylum phylum and zygomycota, as well as phylum oomycetes and all imperfect fungi.
진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본 출원의 "효모"는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes))에 속하는 효모를 포함한다. 다만, 이러한 분류는 변화할 수 있으며, Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)에 설명된 바에 따라 분류를 정의할 수 있다.Fungal host cells may be yeast cells. "Yeast" in this application refers to ascosporogenous yeast (Endomycetales), basidiosporogenous yeast and yeast belonging to Fungi imperfecti (Blastomycetes). includes However, these classifications are subject to change, and classifications may be defined as described in Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). .
효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 코마가텔라(Komagataella), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 세포, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis), 코마가텔라 파피(Komagataella phaffii) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포일 수 있다.Yeast host cells are Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Komagataella, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ( Schizosaccharomyces or Yarrowia cells, for example Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, saccharomyces Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces It may be Saccharomyces oviformis, Komagataella phaffii or Yarrowia lipolytica cells.
진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"은 진균문 및 난균문 아문의 모든 사상 형태를 포함한다(상기 문헌(Hawksworth et al., 1995)에 정의된 바와 같음). 사상 진균은 일반적으로, 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 그 밖의 복합 다당류로 이루어진 균사 벽을 특징으로 한다. 영양 성장은 균사 신장에 의한 것이며, 탄소이화는 절대적으로 호기성이다. 대조적으로, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애에 의한 영양 성장은 단세포 엽상체(thallus)의 발아에 의한 것이며, 탄소이화는 발효성일 수 있다.Fungal host cells may be filamentous fungal cells. "Filamentous fungi" includes all filamentous forms of the subphylum Mycobacterium and Oomycota (as defined above by Hawksworth et al., 1995). Filamentous fungi are generally characterized by hyphal walls composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan and other complex polysaccharides. Vegetative growth is by mycelial elongation, and carbon catabolism is strictly aerobic. In contrast, vegetative growth by yeasts, such as Saccharomyces cerevisiae, is by germination of unicellular thalluses, and carbon catabolism can be fermentative.
사상 진균 숙주 세포는 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스, 아우레오바시듐(Aureobasidium), 비어칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립코코커스(Cryptococcus), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리옵토라, 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움, 파네로차에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코데르마 세포일 수 있다.Filamentous fungal host cells include Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus ( Coprinus), Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Mycellioptora, Neocalimastics (Neocallimastix), Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus ), Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes or Trichoderma cells can be
예를 들어, 사상 진균 숙주 세포는 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 비어칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에나(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크루크웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사로크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이, 마이셀리옵토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에린지이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor), 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌지이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 론지브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.For example, filamentous fungal host cells are Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus ), Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis curry Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrupa subrufa), Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense , Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium tropicum Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusa Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium gramineum, Fusarium heterosporum, Fusarium Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarloc Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusa Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor Miehei, Mysellioptora thermophila, Neurospora crassa, Penny Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thiellabia terrestris ( Thielavia terrestris), Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibraki It may be a Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei or Trichoderma viride cell. However, it is not limited thereto.
본 출원의 변이체를 제조하는 방법은 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.The method for preparing a variant of the present application may include culturing a host cell.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 숙주 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In this application, the term "culture" means growing the host cells under appropriately controlled environmental conditions. The culture process of the present application may be performed according to suitable media and culture conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain. Specifically, the culture may be batch, continuous and fed-batch, but is not limited thereto.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 숙주 세포를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 숙주 세포를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.As used herein, the term "medium" refers to a material in which nutrients necessary for culturing the host cells are mixed as main components, and supplies nutrients and growth factors, including water essential for survival and growth. Specifically, the medium and other culture conditions used for culturing the host cells of the present application can be any medium without particular limitation as long as it is a medium used for culturing conventional host cells. It can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing phosphorus, inorganic compounds, amino acids, and/or vitamins.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.Examples of the carbon source in the present application include carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included. In addition, natural organic nutrients such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sorghum pomace and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (i.e. converted to reducing sugar). Carbohydrates such as molasses) may be used, and other carbon sources in an appropriate amount may be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.The number of persons may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto. As the inorganic compound, sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, it is not limited thereto.
또한, 상기 숙주 세포의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the pH of the medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. to the medium in an appropriate manner during the culture of the host cells. In addition, during cultivation, the formation of bubbles can be suppressed by using an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester. In addition, in order to maintain the aerobic state of the medium, oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without gas injection or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected to maintain the anaerobic and non-aerobic state. It is not.
배지의 온도는 20℃ 내지 55℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 24 시간 내지 196 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The temperature of the medium may be 20 °C to 55 °C, specifically 25 °C to 40 °C, but is not limited thereto. The culturing period may be continued until a desired production amount of a useful substance is obtained, specifically, it may be 24 hours to 196 hours, but is not limited thereto.
하나의 구체예로, 본 출원의 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법은 상기 배양단계에서 발현되는 본 출원의 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the method for producing a variant polypeptide having xylanase activity of the present application may further include recovering the variant polypeptide having xylanase activity of the present application expressed in the culturing step. there is.
다른 하나의 구체예로, 상기 배양단계에서 발현된 변이체는 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이들에 한정되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.In another embodiment, the mutant expressed in the culturing step can be recovered using a method known in the art to which the present invention belongs. For example, variants can be recovered from nutrient media by conventional procedures including, but not limited to, collection, centrifugation, filtration, extraction, spray-drying, evaporation or precipitation.
상기 회수 방법은 본 출원의 숙주 세포의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 변이체를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 숙주 세포로부터 변이체를 회수할 수 있다.The recovery method may be to collect variants using a suitable method known in the art according to the host cell culture method of the present application, for example, batch, continuous, or fed-batch culture. For example, centrifugation, filtration, treatment with a precipitating agent for crystallized proteins (salting out method), extraction, sonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity Various chromatography, HPLC, and these methods may be used in combination, and the mutant may be recovered from the medium or host cell using a suitable method known in the art.
다른 하나의 구체예로, 배양단계에서 숙주 세포에 의해 발현되는 변이체는 회수되지 않을 수 있다. 상기 구체예에서, 변이체를 발현하는 숙주 세포 자체를 변이체의 공급원으로 사용할 수 있다.In another embodiment, variants expressed by the host cell in the culture step may not be recovered. In the above embodiment, the host cell itself expressing the variant may be used as a source of the variant.
조성물composition
본 출원의 조성물은 자일란(xylan)-함유 물질을 분해하는 데에 사용될 수 있다.The composition of the present application can be used to degrade xylan-containing materials.
본 출원의 조성물은 자일란-함유 물질을 자일로스 및/또는 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide)로 전환하는 데에 사용될 수 있다.The compositions of the present application may be used to convert xylan-containing materials to xylose and/or xylo-oligosaccharides.
본 출원의 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에 다른 구성요소를 추가로 더 포함할 수 있다. 당업자는 본 출원의 조성물에 추가되는 구성요소를 적절히 선택할 수 있다. The composition of the present application may further include other components in addition to the variants provided in the present application. A person skilled in the art can appropriately select components added to the composition of the present application.
일 구체예로, 본 출원의 조성물은 자일란-함유 물질을 자일로스 및/또는 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide)으로 전환하는 데 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the composition of the present application may further include any component suitable for conversion of xylan-containing material to xylose and/or xylo-oligosaccharide.
일 구체예로, 본 출원의 조성물은 동물 사료, 제빵, 바이오매스 당화, 펄프 표백 등 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the composition of the present application may further include optional components suitable for application in various industrial fields such as animal feed, baking, biomass saccharification, and pulp bleaching.
추가될 수 있는 물질의 예시는, 안정화제, 계면활성제, 빌더, 킬레이트제, 분산제, 효소, 효소 안정제, 촉매제, 활성화제, 담체, 합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 현탁화제, 색소, 향료, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 희석제, 윤활제, 보존제 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.Examples of materials that may be added are stabilizers, surfactants, builders, chelating agents, dispersants, enzymes, enzyme stabilizers, catalysts, activators, carriers, formulations, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, suspending agents, colorant, flavoring agent, buffering agent, preservative, soothing agent, solubilizer, tonicity agent, stabilizer, diluent, lubricant, preservative and the like, but are not limited thereto.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에, 자연적으로 발생한 물질 또는 자연적으로 비발생한(Non-naturally occurring) 물질을 더 포함할 수 있다. In one embodiment, the composition provided in the present application may further include a naturally occurring material or a non-naturally occurring material, in addition to the variant provided in the present application.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에 동물 사료, 제빵, 바이오매스 당화, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등을 포함한 다양한 산업 분야에 통상 사용 되는 추가적인 효소를 더 포함할 수 있다.In one embodiment, the composition provided in this application may further include additional enzymes commonly used in various industrial fields, including animal feed, baking, biomass saccharification, pulp bleaching, etc., in addition to the variants provided in this application. can
예를 들어 상기 추가적인 효소는, 베타-아밀라아제, 셀룰라아제(베타글루코시다아제, 셀로비오히드롤라아제 및 엔도글루카나아제), 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제(엔도-자일라나제, β-자일로시다제, α-L-아라비노푸라노시다제, α-D-글루쿠로니다제. 페룰로일 에스터라제, 쿠마로일 에스터라제(coumaroyl esterase), α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, β-만나나제(mannanase) 또는 β-만노시다제), 아이소아밀라아제, 아이소머라아제, 리파아제, 피타아제, 프로테아제, 풀룰라나아제 및/또는 알파-아밀라아제와 함께 상업적 과정에서 유용한 그 밖의 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 효소를 더 포함할 수 있다.For example, the additional enzymes include beta-amylase, cellulases (beta-glucosidase, cellobiohydrolase and endoglucanase), glucoamylase, hemicellulases (endo-xylanase, β-xylosidase) , α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, feruloyl esterase, coumaroyl esterase, α-galactosidase, β-gal lactosidase, β-mannanase or β-mannosidase), isoamylase, isomerase, lipase, phytase, protease, pullulanase and/or alpha-amylase that are useful in commercial processes. Any one or more enzymes selected from the group consisting of external enzymes may be further included.
본 출원의 자일라나제 변이체 또는 본 출원의 자일라나제 변이체를 포함하는 조성물은 임의의 자일란-함유 물질을 분해시키는 데 사용될 수 있다.The xylanase variants of the present application or compositions comprising the xylanase variants of the present application can be used to degrade any xylanase-containing material.
본 출원에서, 자일란-함유 물질은 자일라나제에 의해 분해될 수 있는 임의의 물질이다. 일 예로 상기 자일란-함유 물질은 헤미셀룰로스(hemicellulose)일 수 있다. 구체적으로 상기 자일란-함유 물질은 자일란, 글루쿠로노자일란, 아라비노자일란, 글루코만난 및 자일로글루칸 중 선택되는 물질일 수 있다. 일 예로 상기 자일란-함유 물질은 자일란 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In this application, a xylan-containing material is any material that can be degraded by xylanase. For example, the xylan-containing material may be hemicellulose. Specifically, the xylan-containing material may be a material selected from xylan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan, and xyloglucan. For example, the xylan-containing material may be xylan, but is not limited thereto.
하나의 구체예로, 본 출원은 자일란-함유 물질을 분해 (또는 붕괴)시키는 방법을 제공한다. 이것은 또한 자일란의 가용화 및/또는 펜토산의 가용화로 언급될 수 있다.In one embodiment, the present application provides a method for degrading (or disintegrating) a xylan-containing material. This may also be referred to as solubilization of xylan and/or solubilization of pentosans.
본 출원의 추가 실시 형태에서, 방법은 자일란 분해로부터 유래되는 폴리머의 분해 (예를 들어, 분해)에 관한 것이다.In a further embodiment of the present application, the method relates to degradation (eg, degradation) of a polymer derived from xylan degradation.
분해 생성물 (예를 들어, 글루코스)은 임의의 발효 공정에 대한 공급원료로서, 예컨대 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올) 생산에서 또는 기타 제품, 예컨대 생화학 물질 (예를 들어, 생물 기반 아이소프렌)의 생산에서 사용될 수 있다.Decomposition products (e.g., glucose) can be used as a feedstock for any fermentation process, such as in the production of biofuels (e.g., bioethanol) or other products, such as biochemicals (e.g., biobased isoprene). can be used in the production of
본 출원의 변이체, 이를 발현하는 숙주 세포, 상기 변이체 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 이용하여 자일란을 분해할 수 있다. 자일란의 가수 분해 단계에서 본 출원의 변이체 외에 보조인자(cofactor), 조효소(coenzyme) 등이 함께 첨가될 수 있다. 기질의 가수 분해 단계는 최적 pH, 온도 조건 등에서 수행될 수 있으며 당업자가 적절한 조건을 선택할 수 있다. Xylan can be degraded using the variant of the present application, a host cell expressing the same, and a composition comprising the variant and/or the host cell. In the hydrolysis step of xylan, cofactors, coenzymes, etc. may be added together in addition to the variants of the present application. The step of hydrolyzing the substrate can be performed under optimal pH, temperature conditions, etc., and appropriate conditions can be selected by those skilled in the art.
본 출원의 자일라나제 변이체는 하기 응용들 중 어느 하나로 사용될 수 있다:The xylanase variants of the present application may be used in any of the following applications:
a) 동물 사료원료에서의 첨가제; 및/또는a) additives in animal feed ingredients; and/or
b) 동물용 사료 보충제; 및/또는b) feed supplements for animals; and/or
c) 곡물 기반 물질 (예를 들어, 이는 통곡물 또는 곡물의 일부일 수 있음)의 분해. c) degradation of grain-based material (eg, which may be whole grains or parts of grains).
일 구체예로, 본 출원의 자일라나제 변이체는 사료원료에 사용될 수 있다.In one embodiment, the xylanase variant of the present application can be used as a feed ingredient.
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 사료원료 또는 사료 성분일 수 있다.In one embodiment, the xylan-containing material may be a feed raw material or feed ingredient.
본 출원의 사료 조성물은 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.The feed composition of the present application may mean any natural or artificial diet, one meal, etc., or a component of the one meal for animals to eat, ingest, and digest, or suitable therefor, in various forms known in the art. can be manufactured
일 구체예로 본 출원의 자일라나제 변이체는 식품 조성물 또는 그 제조에 사용 될 수 있다.In one embodiment, the xylanase variant of the present application may be used for a food composition or its preparation.
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 곡물 기반 물질 (통곡물 또는 부분적인 곡물 또는 맥아 곡물, 예를 들어 맥아 보리를 포함함)일 수 있다. In one embodiment, the xylan-containing material may be a grain-based material (including whole grain or partial grain or malted grain, such as malted barley).
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 곡분 (예를 들어, 밀, 귀리, 호밀 또는 보리 가루)일 수 있다.In one embodiment, the xylan-containing material may be grain flour (eg wheat, oat, rye or barley flour).
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 보리 맥아 또는 당화액, 또는 맥아 보리 또는 이들의 조합일 수 있다.In one embodiment, the xylan-containing material may be barley malt or saccharide, or malted barley or a combination thereof.
일 예로 상기 식품 조성물은 맥주 및 와인을 포함하는 발효 음료일 수 있다. 다른 예로 상기 식품 조성물은 로브, 롤, 번, 피자, 프렛첼, 또띠야, 케익, 쿠키, 비스킷, 크랙커를 포함하는 베이커리 제품일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.For example, the food composition may be a fermented beverage including beer and wine. As another example, the food composition may be bakery products including lobes, rolls, buns, pizza, pretzels, tortillas, cakes, cookies, biscuits, and crackers. However, it is not limited thereto.
본 출원의 자일라나제 변이체는 밀 글루텐-전분 분리에 사용될 수 있다.The xylanase variants of the present application can be used for wheat gluten-starch separation.
배유로부터 밀겨 및 밀 배아의 초기 분리 후에, 밀 배유 가루의 전분 및 글루텐 분획으로의 분획화는 고품질 A-전분 및 부산물 B-전분 및 활성 글루텐을 얻기 위해 이용 될 수 있다. After initial separation of wheat bran and wheat germ from endosperm, fractionation of wheat endosperm flour into starch and gluten fractions can be used to obtain high quality A-starch and by-product B-starch and active gluten.
곡분 (예를 들어, 밀가루)을 전분 및 글루텐 분획으로 분리하기 위한 방법에서, 그 방법은 곡분 (예를 들어, 밀가루), 물 및 자일라나제 변이체를 혼합하는 단계를 포함한다. 곡분, 물 및 자일라나제 변이체는 동시에 또는 순차적으로 혼합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 자일라나제 변이체와 혼합하기 전에 곡분 (예를 들어, 밀가루)과 물을 혼합할 수 있다.In a method for separating grain flour (eg wheat flour) into starch and gluten fractions, the process includes mixing flour (eg wheat flour), water and a xylanase variant. The flour, water and xylanase variant may be mixed simultaneously or sequentially. In some embodiments, flour (e.g., wheat flour) and water may be mixed prior to mixing with the xylanase variant.
본 출원의 자일라나제 변이체를 밀 글루텐-전분 분리에 적용함으로써 더 높은 A-전분 수율 및/또는 더 우수한 품질의 글루텐 (예를 들어, 더 우수한 품질의 활성 글루텐)을 생성할 수 있다.Higher A-starch yields and/or higher quality gluten (eg, higher quality active gluten) can be produced by applying the xylanase variants of the present application to wheat gluten-starch separation.
또 다른 실시 형태에서, 본 출원의 자일라나제 변이체는 곡물 기반 물질의 분해에 사용되고, 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올) 생산 공정의 일부에 사용될 수 있다.In another embodiment, the xylanase variants of the present application are used for the degradation of grain-based materials and can be used as part of a biofuel (eg, bioethanol) production process.
일 예로, 본 출원의 자일라나제 변이체는 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올)의 생산 및 바이오 연료 산업에서의 곡물 기반 물질의 이용을 향상시킬 수 있다.For example, the xylanase variants of the present application can improve the production of biofuels (eg, bioethanol) and the use of grain-based materials in the biofuel industry.
일 예로, 바이오 연료와 자일라나제 변이체를 액화, 당화, 발효, 동시 당화 및 발효 전에 또는 그 동안에, 그리고 발효 후에, 또는 이들의 조합에서 혼합하는 단계를 포함하여 사용할 수 있다.For example, the biofuel and the xylanase variant may be used including mixing before or during liquefaction, saccharification, fermentation, simultaneous saccharification and fermentation, and after fermentation, or a combination thereof.
본 출원의 자일라나제 변이체를 바이오 연료 생산 공정에 적용할 경우, 더 많은 건조 물질 당화액이 공정에 사용될 수 있거나; 최종 시럽에서 더 높은 고형물 함량을 얻거나; 열 전달이 더욱 우수하거나; 에너지 요구량이 더욱 낮아지거나; 증발기 부착오염이 감소되거나; 세정 비용이 감소되거나; 최종 연료 수율이 증가하거나; 부산물 품질이 개선되거나; 증류 후 찌꺼기의 고체 및 액체 부분 분리가 보다 용이하거나; 또는 전술한 이점의 조합을 얻을 수 있다.When the xylanase variant of the present application is applied to a biofuel production process, more dry matter saccharification solution can be used in the process; obtaining a higher solids content in the final syrup; better heat transfer; lower energy requirements; evaporator fouling is reduced; cleaning costs are reduced; the final fuel yield is increased; by-product quality is improved; After distillation it is easier to separate the solid and liquid parts of the tail; or a combination of the foregoing advantages.
본 출원의 자일라나제 변이체는 펄프 표백에 사용 될 수 있다. The xylanase variants of the present application can be used for pulp bleaching.
예를 들어 펄프에서 착색된 리그닌이 자일란을 통해 결정 셀룰로스에 연결되어 있는 상태에서 자일라나제 변이체를 처리함으로써 자일란을 분해하고 착색된 리그닌을 방출함으로써 펄프 표백을 촉진할 수 있다.For example, while colored lignin in the pulp is linked to crystalline cellulose via xylan, treatment with a xylanase variant can degrade the xylan and release the colored lignin, thereby promoting pulp bleaching.
실시예Example
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present application will be described in more detail through Examples and Experimental Examples. However, these examples and experimental examples are for illustrative purposes of the present application, and the scope of the present application is not limited to these examples and experimental examples.
실시예 1: 변이체의 제조Example 1: Preparation of variants
1-1. 주형(Template) 제작1-1. Manufacture of template
오르피노마이세스(Orpinomyces) sp. PC-2 균주의 지노믹 DNA(Genomic DNA)에서 자일라나제(xylanase) 변이체(이하, Op Xyn로 기재, 서열번호 1) 유전자(서열번호 2)를 증폭하여 pHCE 벡터(Takara)에 클로닝 한 것을 주형(Template)으로 사용하였다.Orpinomyces sp. The gene (SEQ ID NO: 2) of the xylanase mutant (hereinafter referred to as Op Xyn, SEQ ID NO: 1) was amplified from the genomic DNA of the PC-2 strain and cloned into the pHCE vector (Takara). It was used as a template.
1-2. 점변이체 제작1-2. Production of point mutants
Op Xyn에 단일변이를 생성하기 위한 부위를 선정하였고, 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 부위지향적 돌연변이유발(Site Directed Mutagenesis:SDM)을 통해 변이체들을 제작하였다. A site for generating a single mutation in Op Xyn was selected, and mutants were prepared through site-directed mutagenesis (SDM) using the primers shown in Table 1 below.
구체적으로, 상기 자일라나제 변이체는 주형(Template, 실시예 1-1)과 프라이머(Primer, 표 1), PCR premix(iNtRON, cat no. 25185)를 사용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR은 Eppendorf Mastercycler Nexus GX2를 이용하였고, 반응 조건은 다음과 같다.Specifically, the xylanase variant was prepared through PCR using a template (Template, Example 1-1), primers (Primer, Table 1), and PCR premix (iNtRON, cat no. 25185). PCR was performed using Eppendorf Mastercycler Nexus GX2, and the reaction conditions were as follows.
최초 변성 (Initial denaturation) - 94℃, 2minInitial denaturation - 94℃, 2min
변성(Denaturation) - 94℃, 20secDenaturation - 94℃, 20sec
어닐링(Annealing) - 50℃, 10secAnnealing - 50℃, 10sec
신장(Extension) - 72℃, 10min(변성에서 신장까지 30cycle)Extension - 72℃, 10min (30 cycles from denaturation to extension)
최종 신장(Final Extension) - 72℃, 5minFinal Extension - 72℃, 5min
만들어진 변이체는 In-Fusion HD cloning kit(Takara, Cat. No. 639650)를 이용하여 라이게이션(ligation)한 다음, E.coli Dh5α 균주에 형질전환 후 시퀀싱을 통해 서열 변이 여부를 확인하였다.The resulting variants were ligated using an In-Fusion HD cloning kit (Takara, Cat. No. 639650), and then transformed into an E.coli Dh5α strain, followed by sequencing to confirm sequence mutation.
실시예 2. 내열성 평가Example 2. Evaluation of heat resistance
2-1. 변이체의 내열성 평가2-1. Heat resistance evaluation of variants
실시예 1에서 제조한 변이체 E46C, N93W 및 Op Xyn의 유전자로 각각 형질전환된 E.coli DH5α 균주를 항생제(Kanamycin)을 포함한 LB plate에 도말한 다음 37℃ 인큐베이터에서 24시간동안 정치 배양하였다. 여기서 얻어진 콜로니들을 하나씩 0.4ml LB 배지가 분주되어 있는 96 웰 플레이트에 접종하고, 37℃ 750rpm 조건에서 24시간동안 배양한 다음, 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 균체를 회수하였다(Eppendorf Centrifuge 5810R). 회수된 균체에 B-PER Bacterial Protein Extraction reagent(Thermo, #78248) 100㎕를 처리한 다음 10분간 인큐베이션한 후 300㎕ 증류수를 혼합하고, 다시 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 조효소액을 확보하였다. 상기 조효소액을 70℃ 수조에서 15분간 열처리한 후, 96 웰 플레이트에서 1/5로 스케일 다운한 자일라나제 역가 분석법을 이용하였다.E.coli DH5α strains each transformed with the genes of variants E46C, N93W and Op Xyn prepared in Example 1 were plated on LB plates containing antibiotics (Kanamycin) and then cultured in a 37 ° C incubator for 24 hours. Colonies obtained here were inoculated into a 96-well plate in which 0.4 ml LB medium was dispensed one by one, cultured for 24 hours at 37°C and 750 rpm, and then centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes to recover cells (Eppendorf Centrifuge 5810R). The recovered cells were treated with 100 μl of B-PER Bacterial Protein Extraction reagent (Thermo, #78248), incubated for 10 minutes, mixed with 300 μl of distilled water, and centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes to obtain a crude enzyme solution. After heat-treating the crude enzyme solution in a water bath at 70° C. for 15 minutes, a xylanase titer assay scaled down to 1/5 in a 96-well plate was used.
효소 역가는 1% 비치우드 자일란(xylan from beachwood, Megazyme, P-XYLNBE-10G) 96㎕에 1M pH 6.5 인산염 완충액 (phosphate buffer) 4㎕를 혼합한 다음, 희석된 효소액 100㎕를 섞고, 37℃에서 15분간 반응을 진행하여 측정하였다. 반응액에 300㎕의 DNS 용액을 혼합하여 반응을 정지시키고 이를 7분간 끓여 발색한 다음 얼음물에서 냉각하였다. 여기에 500㎕ 증류수를 혼합한 액의 550nm 흡광도를 측정하고, 자일로스(xylose, Sigma-Aldrich, X1500)로 만든 표준곡선(standard curve)를 이용하여 역가를 측정하였다.Enzyme titer was measured by mixing 4 μl of 1M pH 6.5 phosphate buffer with 96 μl of 1% xylan from beachwood (Megazyme, P-XYLNBE-10G), then mixing 100 μl of the diluted enzyme solution, and incubating at 37 ° C. The reaction was carried out for 15 minutes and measured. 300 μl of the DNS solution was mixed with the reaction solution to stop the reaction, and the color was developed by boiling for 7 minutes and then cooled in ice water. The absorbance at 550 nm of the solution mixed with 500 μl of distilled water was measured, and the titer was measured using a standard curve made of xylose (Sigma-Aldrich, X1500).
상기 DNS 용액 제조방법은 다음과 같다. 증류수 500ml이 포함된 비이커에 6.3g의 3,5-다이나이트로살리실산 (3,5-dinitrosalicylic acid, samchus, D1267)를 첨가하고 50℃에 21g의 수산화나트륨(Daejung, 7571-4400)을 첨가하였다. 300ml의 물에 타르타르산나트륨칼륨 (Potassium sodium tartrate tetrahydrate, Daejung, 6618-4400) 182g을 첨가한 후 가열하여 용해한 예비 용액에 페놀(Sigma-Aldrich, P1037) 5g을 첨가하고, 아황산나트륨 (Sodium sulfite anhydrous, Daejung, 7634-4405) 5g을 첨가하여 용해 될 때까지 교반 한 후, 냉각하였다. 여기에 증류수를 가하여 1000ml로 맞춘 다음 여과하고, 갈색병에 7 일 이상 보관한 이후에 사용하였다.The method for preparing the DNS solution is as follows. 6.3 g of 3,5-dinitrosalicylic acid (samchus, D1267) was added to a beaker containing 500 ml of distilled water, and 21 g of sodium hydroxide (Daejung, 7571-4400) was added at 50 ° C. . After adding 182 g of potassium sodium tartrate (Potassium sodium tartrate tetrahydrate, Daejung, 6618-4400) to 300 ml of water, 5 g of phenol (Sigma-Aldrich, P1037) was added to the preliminary solution dissolved by heating, and sodium sulfite (Sodium sulfite anhydrous, Daejung, 7634-4405) was added and stirred until dissolved, followed by cooling. Distilled water was added thereto to adjust the volume to 1000 ml, filtered, and stored in a brown bottle for 7 days or more before use.
Op Xyn 콜로니의 잔류 흡광도를 기준으로 잔류 흡광도가 150% 이상인 콜로니를 선별하였다. 이들을 각각 정제한 다음 열안정성 평가를 진행(70℃, 10분)하였다. 그 결과 열안정성이 개선됨을 확인하였다.Based on the residual absorbance of Op Xyn colonies, colonies having a residual absorbance of 150% or more were selected. After each of them was purified, thermal stability was evaluated (70° C., 10 minutes). As a result, it was confirmed that the thermal stability was improved.
(%)(%)
실시예 3: 추가 변이체 제작 및 평가Example 3: Creation and evaluation of additional variants
3-1. 이황화 결합 변이체 제조3-1. Preparation of disulfide bond variants
이황화결합을 생성하기 위한 아미노산 쌍 부위를 선정하고, 해당 아미노산 서열을 시스테인으로 변이시키기 위한 프라이머를 디자인하였다.An amino acid pair site for generating a disulfide bond was selected, and a primer for mutating the amino acid sequence to cysteine was designed.
3029
30
Reverse - GCTCAA ACA CTGGCCCATATGGForward - GGCCAG TGT TTGAGCGTCGG
Reverse - GCTCAA ACA CTGGCCCATATGG
3231
32
Reverse - ACCCAG ACA CATGGAACCGCTACCForward - AAGGGA TGT ACCTTCAAGGCTGAG
Reverse - ACCCAG ACA CATGGAACCGCTACC
구체적으로, 이황화결합 변이체는 주형(Template, 실시예 1-1)과 프라이머(표 3), PCR premix(iNtRON, cat no. 25185)를 사용하여 실시예 1-2와 동일한 조건으로 PCR을 통해 제작하였다. Specifically, disulfide bond variants were produced by PCR under the same conditions as in Example 1-2 using a template (Template, Example 1-1), primers (Table 3), and PCR premix (iNtRON, cat no. 25185) did
3-2. 추가적인 부위지향적 돌연변이 도입 변이체 제조3-2. Generation of additional site-directed mutagenesis variants
하기 표 4의 프라이머를 이용하여 Op Xyn 또는 이황화결합 변이체에 실시예 1-2와 동일한 조건으로 PCR을 통해 단일변이를 도입하여 변이체 N28G, N52P, DS1+N28G, DS1+N52P, DS1+N93W를 제조하였다. 또한, 이렇게 제조된 변이체에 표 1 및 표 4의 프라이머를 이용하여 실시예 1-2와 동일한 조건으로 PCR을 통해 추가 변이체를 제조하였다.Variants N28G, N52P, DS1+N28G, DS1+N52P, and DS1+N93W were prepared by introducing a single mutation through PCR under the same conditions as in Example 1-2 to Op Xyn or disulfide-linked variants using the primers shown in Table 4 below. did In addition, additional mutants were prepared through PCR under the same conditions as in Example 1-2 using the primers in Tables 1 and 4 for the mutants thus prepared.
3433
34
ReverseForward
Reverse
ATCCAGCCAGATCTCGATCTGGCTGGAT GGC ACCGGCGG
ATCCAGCCAGATCTCG
3635
36
ReverseForward
Reverse
GACAGCTGCGCTCCACTCAGCGCAGCTGTC CCC CGGGGTAAC
GACAGCTGCGCTCCACTC
3-3. 내열성 효과 확인 3-3. Check heat resistance effect
실시예 3-2에서 제조한 변이체는 상기 실시예 2의 방법과 동일한 방법을 이용하여 E.coli DH5α 균주에 형질전환 시킨 후 정제효소를 만든 다음, specific activity, 70℃ 열안정성, 80℃ 열안정성 등을 측정하였다.The variant prepared in Example 3-2 was transformed into E.coli DH5α strain using the same method as in Example 2, and then purified enzyme was prepared, and specific activity, 70 ° C heat stability, and 80 ° C heat stability etc. was measured.
그 결과, 모든 조합 변이체에서 Op Xyn에 비하여 열안정성이 더 좋아지는 것을 확인 할 수 있다(표 5, 도 1 내지 7).As a result, it can be confirmed that thermal stability is better than that of Op Xyn in all combination variants (Table 5, Figures 1 to 7).
(Specific activity)(Specific activity)
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which this application pertains will be able to understand that this application can be implemented in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present application should be construed as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the following patent claims and their equivalent concepts rather than the detailed description above.
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Modified polypeptide having xylanase activity <130> KPA211099-KR <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Op Xyn AA <400> 1 Gly Gln Arg Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Thr Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 2 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Op Xyn NT <400> 2 ggccagaggt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgaccct gggtaaggga 120 gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggtaaca gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540 ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cgcactgaac 600 gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 3 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E46C AA <400> 3 Gly Gln Arg Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Thr Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Cys Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 4 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E46C NT <400> 4 ggccagaggt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgaccct gggtaaggga 120 gctaccttca aggcttgttg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggtaaca gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc 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Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 6 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N93W NT <400> 6 ggccagaggt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgaccct gggtaaggga 120 gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggttgga gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 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ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggttgga gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaac g gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540 ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cgcactgaac 600 gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 13 <211 > 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N52P+N93W AA <400> 13 Gly Gln Arg Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Thr Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Trp Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 14 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N52P+N93W NT <400> 14 ggccagaggt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgaccct gggtaaggga 120 gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcccccggg gtaactt cct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggttgga gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggt cg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540 ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cgcactgaac 600 gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 15 <211> 22 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N28G+N52P+N93W AA <400> 15 Gly Gln Arg Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Gly Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Thr Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Pro Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Trp Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 16 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N28G+N52P +N93W NT <400> 16 ggccagaggt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga tgccaccggc ggtagcggtt ccatgaccct gggtaaggga 120 gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gt cccccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggttgga gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagg gcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540 ttcaa ggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cgcactgaac 600 gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 17 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 AA <400> 17 Gly Gln Cys Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Cys Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 18 <211> 684 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 NT <400> 18 ggccagtgtt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgtgtct gggtaaggga 120 gctacctt ca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggtaaca gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactgg tgg tgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 19 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 + N28G+N93W AA <400> 19 Gly Gln Cys Leu Ser Val Gly Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Gly Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Cys Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Trp Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 20 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 + N28G+N93W NT <400> 20 ggccagtgtt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga tgccaccggc ggtagcggtt ccatgtgtct gggtaaggga 120 gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agc ggttgga gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcaggggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggccc g accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540 ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cgcactgaac 600 gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 21 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 + N52P+N93W AA < 400 > 21 Gly Gln Cys Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Cys Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Pro Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Trp Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210> 22 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 + N52P+N93W NT <400> 22 ggccagtgtt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgtgtct gggtaaggga 120 gctaccttca aggctgagtg gagcgcag ct gtccccccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggttgga gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgat cac 540 ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cgcactgaac 600 gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 23 <21 1> 227 <212 > PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 + N28G+N52P+N93W AA <400> 23 Gly Gln Cys Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Gly Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Met Cys Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser 35 40 45 Ala Ala Val Pro Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe 50 55 60 Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Trp Ser Arg Leu 85 90 95 Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu 100 105 110 Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln 130 135 140 Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr 165 170 175 Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly 180 185 190 Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser 210 215 220 Ala Pro Arg 225 <210 > 24 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS1 + N28G+N52P+N93W NT <400> 24 ggccagtgtt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60 agctacgaga tctggctgga tgccaccggc ggtagcggtt ccatgtgtct gggtaaggga 120 gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcccccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180 ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240 gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggttgga gccgcctctg cgtctacggc 300 tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360 tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420 aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480 cagtacttca gcgtccgcc a gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540 ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cgcactgaac 600 gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660 aagcagggtt cggcccctcg ttag 684 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer _E46C_F <400> 25 accttcaagg cttgttggag cgcag 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_E46C_R <400> 26 agccttgaag gtagctccct tacc 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > primer_N93W_F <400> 27 agcgcaagcg gttggagccg c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_N93W_R <400> 28 accgcttgcg ctggcagtct g 21 <210> 29 <211 > 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_R3C_F <400> 29 ggccagtgtt tgagcgtcgg 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_R3C_R <400> 30 gctcaaacac tggcccatat gg 22 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_T36C_F <400> 31 aagggatgta ccttcaaggc tgag 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <220> <223> primer_T36C_R <400> 32 acccagacac atggaaccgc tacc 24 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_N28G_F <400> 33 atctggctgg atggcaccgg cgg 23 <210> 34 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_N28G_R <400> 34 atccagccag atctcg 16 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> primer_N52P_F <400> 35 agcgcagctg tcccccgggg taac 24 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_N52P_R<400> 36 gacagctgcg ctccactc 18
Claims (13)
i) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 가지고; 및/또는
ii) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는
iii) 상기 변이형 폴리펩티드는 (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는
iv) 상기 변이형 폴리펩티드는 자일라나제 활성을 갖는 i), ii) 또는 iii) 폴리펩티드의 기능적 단편이고; 및
상기 변이형 폴리펩티드는 46번 및 93번 중 하나 이상의 위치의 아미노산에서의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는, 변이형 폴리펩티드;
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치임.
As a variant polypeptide having xylanase activity,
i) the variant polypeptide has a sequence identity of 70% or more and less than 100% with SEQ ID NO: 1; and/or
ii) the variant polypeptide is a polypeptide encoded by a polynucleotide having 70% or more and less than 100% sequence identity with the sequence encoding the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1; and/or
iii) the variant polypeptide comprises (a) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (b) cDNA thereof, or (c) the full-length complement of (a) or (b) above and low stringency a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions, medium stringency conditions, medium high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions; and/or
iv) the variant polypeptide is a functional fragment of i), ii) or iii) polypeptide having xylanase activity; and
The variant polypeptide includes a substitution of one or more amino acids at positions 46 and 93 with other amino acids;
Here, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
및/또는 93번 아미노산은 아스파라긴인 것인, 변이형 폴리펩티드.
The method of claim 1, wherein amino acid number 46 before modification of the variant polypeptide having xylanase activity is glutamic acid;
And / or amino acid number 93 is asparagine, the mutant polypeptide.
46번 아미노산의 시스테인으로의 치환; 및
93번 아미노산의 트립토판으로의 치환으로,
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치임.
The variant polypeptide according to claim 1, wherein the variant polypeptide comprises any one or more of the following substitutions;
substitution of amino acid 46 with cysteine; and
By replacing amino acid 93 with tryptophan,
Here, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
E46C;
N93W; 또는
E46C + N93W;
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치임.
The variant polypeptide according to claim 1, wherein the variant polypeptide comprises the following substitutions:
E46C;
N93W; or
E46C + N93W;
Here, the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
The variant polypeptide according to claim 1, wherein the variant polypeptide further comprises substitution of any one or more of amino acids corresponding to positions 28 and 52 of SEQ ID NO: 1.
The variant polypeptide according to claim 1, wherein the variant polypeptide further comprises an amino acid pair forming a disulfide bridge.
The variant polypeptide according to claim 6, wherein the amino acid pair comprises substitution of amino acids corresponding to positions 3 and 36 of SEQ ID NO: 1 with cysteine.
The variant polypeptide according to claim 1, wherein the variant polypeptide has increased heat resistance and/or thermal stability compared to a polypeptide composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
Xylo, comprising contacting a xylan-containing material with the variant polypeptide of any one of claims 1 to 8, a host cell expressing the variant polypeptide, and/or a composition comprising the variant polypeptide. A method for producing oligosaccharides or xylose.
A xylan-containing material comprising treating the variant polypeptide of any one of claims 1 to 8, a host cell expressing the variant polypeptide, and/or a composition comprising the variant polypeptide to a xylan-containing material. How to break down inclusions.
A polynucleotide encoding the variant polypeptide of any one of claims 1 to 8.
A host cell comprising the variant polypeptide according to any one of claims 1 to 8 and/or the polynucleotide according to claim 13.
자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법.
Comprising the step of culturing the host cell of claim 12,
A method for producing a variant polypeptide having xylanase activity.
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