KR20230051101A - 항암 치료 개선을 위한 2-클로로-n,n-디에틸에틸아민 염산염의 용도 - Google Patents

항암 치료 개선을 위한 2-클로로-n,n-디에틸에틸아민 염산염의 용도 Download PDF

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김건우
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기초과학연구원
울산과학기술원
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Abstract

본 발명은 항암 치료 개선을 위한 2-클로로-N,N-디에틸에틸아민 염산염의 용도에 관한 것으로서, 화학식 1의 질소 머스타드계 화합물을 이용하여 DNA 염기를 알킬화시킴으로써 암 세포를 사멸시키고 기존의 PARP 저해제와 병용하여 사용함으로써 시너지 효과를 나타내는 효과가 있다.

Description

항암 치료 개선을 위한 2-클로로-N,N-디에틸에틸아민 염산염의 용도{Use of 2-Chloro-N,N-Diethylethylamine Hydrochloride for Improving Anti-Cancer Treatment}
본 발명은 암 치료 개선을 위한 2-클로로-N,N-디에틸에틸아민 염산염의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화학식 1의 질소 머스타드계 화합물을 이용하여 DNA 염기를 알킬화시킴으로써 암 세포를 사멸시키고 기존의 PARP 저해제와 병용하여 사용함으로써 시너지 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
폴리(ADP 리보스)폴리머라제(poly (ADP-ribose) polymerase, 이하, PARP라 칭함)는 DNA 손상에 결합하여 수리 효소를 끌어들이는 ADP-리보스 고분자를 형성함으로써 DNA 수리를 촉진하고, 염기 절단 수리 경로에 의한 단일 가닥 절단의 주요 효소이다. 수리되지 않은 채로 남아있는 경우, 단일 가닥 절단은 복제 중에 상동성 재조합에 의해 필수적으로 수리되는 이중 가닥 절단으로 전환된다. 따라서, PARP를 억제하는 것은 상동성 재조합이 결핍된 세포에서 치명적이다. 이러한 관찰은 이미 상동성 재조합 용량을 사용할 수 없는 돌연변이를 가진 암을 치료하기 위한 PARP 억제제의 개발을 유도하였다.
PARP가 다수의 세포 과정에 관여하므로, 종양 세포 내에서 PARP 억제제의 작용 기전은 완전히 밝혀지지 않았다. 환자는 현재 특정 종양 유형 (예컨대, 고등급 장액성 난소암 또는 삼중 음성 뇌암)을 가지거나 이들의 암이 관련 분자의 아형 (예컨대, BRCA1/2-돌연변이된 유방암, 난소암, 췌장암, 또는 전립선 암)에 속할 수 있는 경우에만 PARP 억제제 시험으로 간주된다.
PARP 억제제 (PARPi) 단일 요법은 임상에서 유망한 효능 및 안전성 프로파일을 나타냈지만, 이들의 주요 한계는 HR 결핍의 필요성과 신속한 내성의 출현이다. 초기에 PARPi 치료에 반응하는 많은 종양들은 HR 활성을 회복시키거나 대안적인 수리 경로의 활성을 자극하는 보상적 돌연변이를 통해 결국 재발된다. 따라서, PARP 억제제의 사용은 특정 종양 유형에 제한되며 임의의 암 치료에서 사용될 수 없다는 문제점이 있다.
이를 해결하기 위하여 현재 PARP 저해제와 병용하여 사용하는 다양한 조성물이 이용되고 있다.
대한민국 공개특허 제10-2018-0051500호에서는 암 치료를 위하여 디베이트 분자와 PARP 억제제를 병용하여 사용하고 있고, 대한민국 공개특허 제10-2018-0037210호는 암 치료를 위해 리포좀 이리노테칸과 PARP 저해제를 이용하는 조합요법을 개시하고 있다. 그러나, 이와 같은 병용 요법을 장기간 이용할 경우, 다양한 돌연변이(mutation)를 통해 저항성을 갖는 암세포가 항암치료 후에도 사멸되지 않는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 이러한 문제를 해결하기 위해 기존의 독성이 강한 비스-(2-클로로에틸)에틸아민에서 1개의 할로겐기를 제거함으로써 독성을 줄이고, 독성이 확연히 감소된 화합물을 이용하여 DNA 염기를 알킬화시킴으로써 암세포를 사멸시키고 기존의 PARP 저해제와 병용하여 사용함으로써 시너지 효과를 낼 수 있는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 공개특허 2007-0120163호
R.K. Singh et al., European Journal of Medicinal Chemistry doi: 10.1016/j.ejmech.2018.04.001. Subhendu Karmakar et al., Dalton Transactions DOI: 10.1039/c8dt04503h Fredrik Lehmann et al., Processes 2021, 9, 377.
본 발명의 목적은 기존의 독성이 강한 비스-(2-클로로에틸)에틸아민에서 1개의 할로겐기를 제거함으로써 독성을 줄이고, 독성이 확연히 감소된 상기 화합물을 이용하여 DNA 염기를 알킬화시킴으로써 암세포를 사멸시키는 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물과 함께 기존의 PARP 저해제와 병용하여 사용함으로써 시너지 효과를 발생하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
화학식 1에서 R은 할로겐기이다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 객체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물은 PARP 저해제에 저항성을 갖는 다양한 암세포에 적용하여 선택적, 효과적으로 사멸시켜 암 질환을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다.
도 1a는 UNI21의 구조를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 Luciferase-ATAD5 에세이, DNA 복제 및 리페어 스트레스(DNA replication & repair stress)를 측정할 수 있는 에세이를 통하여 UNI21이 스트레스를 증가시키는 약물로 스크리닝된 그래프이다. 5-FUrd는 양성 대조군(positive control)이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 KO HAP1 세포주에서 세포 생존력(cell viability)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따라 도 1c에서 사용된 세포주들의 웨스턴 블롯팅의 결과를 도시한 도면이다.
도 1e는 본 발명의 일 실시예에 따라 도 1c에서 UNI21 20μM로 측정한 데이터를 바탕으로, HAP1, HCT116, XP2OS 세포주에서 UNI21의 농도를 늘려가며 KO 세포들의 생존력을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1f는 본 발명의 일 실시예에 따라 PARP1 KO 세포에서 PARP 저해제(inhibitor) 올라파립(Olaparib)과의 시너지 효과(synergistic effect)를 확인한 결과를 도시한 도면이다.
도 1g는 도 1f에서 올리파립과 UNI21의 조건을 달리하여 실험한 결과를 도시한 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 UNI21와 DNA 염기의 in vitro 반응식을 나타낸 모식도이다.
도 2b는 UNI21 처리 CTDNA의 DEAE-퓨린의 대표적인 UPLC-HRAM-PRM 추적한 결과를 도시한 도면이다. 24시간 동안 UNI21과 함께 인큐베이션한 후, 열 가수분해에 의해 알킬화된 퓨린이 방출되었고 재료 및 방법에 설명된 대로 분석을 위해 농축되었다. 검은색 추적은 합성된 DEAE-구아닌(패널 1, m/z = 251.1615) 및 DEAE-아데닌(패널 3, m/z = 235.1662) 표준의 UPLC-HRAM-PRM 분석을 나타내었다. 빨간색 추적은 1.2 ㎍ 탈퓨린화 CTDNA에서 검출된 DEAE-구아닌(패널 2) 및 DEAE-아데닌(패널 4)의 UPLC-HRAM-PRM을 나타내었다.
도 2c는 5 ㎍ UNI21 처리 CTDNA에서 효소적으로 방출된 DEAE-피리미딘의 대표적인 UPLC-HRAM-PRM 추적한 결과를 도시한 도면이다. 상단 패널은 DEAE-dC(m/z = 327.2027)를 나타내고 하단 패널은 DEAE-dT(m/z = 342.2023)를 나타내었다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 UNI21 처리 후 HCT116의 세포 주기를 도시한 도면이다. HCT116 야생형 및 PARP1 결핍 세포를 24시간 동안 다른 용량의 UNI21과 함께 인큐베이션하고 세포 주기 단계의 상대 백분율을 Flow-Jo 소프트웨어로 계산하였다.
도 3b는 UNI21 처리로 인한 DSB 발생은 g-H2AX로 확인한 결과를 도시한 도면이다. HCT116 야생형 또는 PARP1 결핍 세포를 80μM UNI21과 함께 24시간 동안 인큐베이션하고 표시된 단백질 수준을 전체 세포 추출물에서 결정하였다.
도 3c는 UNI21 처리가 PARP1 결핍 세포에서 더 많은 DNA 손상을 향상시킨다는 결과를 확인한 도면이다. CometChip® 분석의 테일 모멘트는 Comet 분석 소프트웨어(Trevigen)를 사용하여 계산되었다.
도 3d는 UNI21 처리는 HCT116 parp1 KO 세포에서 더 빈번한 SCE를 유도한다는 결과를 확인한 도면이다.
도 3e는 SCE가 이미지화된 도 3d의 BX53 분포를 도시한 도면이다.
도 3f는 UNI21 처리는 HCT116 parp1 KO 세포에서 비정상적인 염색체를 유도한다는 것을 확인한 도면이다. 염색체 파손은 도 3F의 BX53 G 분포에 의해 이미지화되었다.
도 3h는 HCT116 parp1 KO 세포는 중기당 25개 이상의 파손이 있는 세포의 백분율이 증가한다는 것을 확인한 도면이다.
도 3i는 UNI21 치료는 PARP1 결핍 세포에서 더 많은 세포 사멸을 유발한다는 것을 확인한 도면이다. 아폽토시스 세포 사멸은 Annexin V Alexa FluorTM 488 접합체를 사용하여 정량화하고 유세포 분석으로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 UNI21이 누드 마우스에서 PARP1-결핍 이종이식(xenograft) 종양의 성장을 억제한다는 UNNI21의 In vivo 효과를 확인하기 위한 마우스 이종이식실험을 도시한 모식도이다. WT HCT116 또는 PARP1 결핍 HCT116 세포 중 4백만 개 세포를 7주 된 수컷 누드 마우스에 피하 주사하였다. 종양 크기가 약 200mm3에 도달하면 비히클(PBS) 또는 UNI21(6mg/kg)을 16일 동안 3일마다 종양 내 주사하였다. 마우스를 안락사시킨 후 지시된 분석을 수행하였다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 UNI21을 처리한 16일 후 수확(harvest)한 PARP1 KO 종양 사진이다.
도 4c는 도 4b의 종양 부피(tumor volume)을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라 3일마다 주사(injection)된 종양에서 UNI21를 추적(trace)한 결과를 그래프로 도시한 도면이다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따라 수확한 종양을 섹션(section)한 후, H&E 염색(staining), TUNEL 에세이, γ-H2AX IHC를 진행한 결과를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 다른 일 실시예에 따라서 염소(chlorine) 대신에 브롬(bromine)이 결합한 구조를 이용하여 실험한 결과를 도시한 도면이다.
도 6a 내지 도 6d는 도 2a에 나타낸 모식도를 바탕으로 실험한 질량 분석(mass spectrometry)의 결과를 도시한 도면이다.
도 7 내지 도 7d는 도 2b에 나타낸 빨간색 그래프의 질량 분석(mass spectrometry)의 결과를 도시한 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물은 PARP 저해제에 저항성을 갖는 다양한 암세포에 적용하여 선택적, 효과적으로 사멸시킬 수 있고, 더욱이 기존의 PARP 저해제와 병용하여 사용함으로써 시너지 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00002
화학식 1에서 R은 할로겐기이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 화합물을 정의하는데 사용된 용어들은 하기와 같은 의미를 갖는다.
용어 "할로겐"의 구체적인 예로는 플루오르(F), 클로린(Cl), 브롬(Br) 및 요오드(I)를 들 수 있고, 특히 클로린(Cl) 또는 브롬(Br)일 수 있다.
용어 "치료"라 함은 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
용어 "약학적 조성물"은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한"이라 함은 화합물의 생물학적 활성과 물성을 손상시키지 않는 성질을 의미한다.
용어 "담체(carrier)"라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미한다.
용어 "희석제(diluent)"라 함은 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질로 정의된다.
용어 "부형제(excipients)"라 함은 약제에 적당한 굳기나 형상을 주기 위해서, 또는 주제(主劑)의 양이 적은 경우에 일정 용량, 중량을 주어 취급하기 쉬운 크기로 할 목적으로 첨가되는 물질을 의미한다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00003
화학식 1에서 R은 할로겐기이다.
보다 구체적인 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00004
[화학식 3]
Figure pat00005
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용가능한 이의 염을 형성할 수 있다. 본 발명에서 약학적으로 허용가능한 이의 염은 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산 부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산과, 타르타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 젖산, 말론산, 말산, 살리실산, 숙신산, 옥살산, 프로피온산, 아스파르탄산, 글루탐산, 구연산 등과 같은 유기산과, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 바람직하게는 상기 약학적으로 허용가능한 이의 염은 HCl 염, HBr 염, HI 염, H2SO4 염 HNO3 염 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환될 수 있으며, 염의 제조는 별도의 설명이 없이도 상기 화학식 1의 구조를 바탕으로 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있을 것이다.
이하에서 별도의 설명이 없는 한, 화학식 1의 화합물에는 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염이 포함되며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 설명의 편의를 위하여, 본 명세서에서는 이들을 화학식 1의 화합물로 간단히 표현한다.
상기 암은 편평세포 암, 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 PARP 저해제를 추가로 포함한 조성물을 병용 요법에 사용함으로써 시너지 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PARP 저해제는 올라파립(olaparib), 탈라조파립(talazoparib), 니라파립(niraparib), 루카파립(rucaparib), 벨리파립(veliparib) 및 파미파립(pamiparib)으로 구성된 군에서 1종 이상 선택될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 객체에 투여하는 단계를 포함하는 암 질환의 치료 또는 예방방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 용도 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염은 암 질환 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 화학식 1의 퀴놀린 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염은 DNA를 알킬화시킴으로써 종양의 성장을 억제하는 활성을 가진다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 이의 염의 우수한 항암 효과는 루시퍼라제(Luciferase)-ATAD5 에세이(DNA replication & repair stress assay)를 통한 스크리닝(screening), 리페어 유전자 KO HAP1, HCT116, U2OS 세포주에서의 세포 생존력(cell viability) 측정, 올라파립(Olaparib)과의 병용 요법에서의 시너지 효과(synergistic effect)를 체크, 질량 분석(Mass spectrometry)를 통한 알킬화된 DNA 염기의 상대적인 양을 비교하여 알킬화 우선 순위의 분석(dG>>dA>dC~dT) 등의 in vitro 실험과 누드 마우스 HCT116 PARP1 KO 세포 이종이식 in vivo 실험을 통하여 증명하였다. 이에 대해서는 이하의 실시예에서 후술하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 버퍼 용액에 용해되어 있는 염을 희석제로 사용하고, 통상 사용되는 버퍼 용액은 인간 용액의 염 형태를 모방하고 있는 포스페이트 버퍼 식염수일 수 있다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형시키지 않는다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 또한 함유하는 약학적 또는 수의학적 조성물로 사용하기 위해 제형화할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 통상적인 방법에 따라 일반적으로 제조하여, 약학적으로 또는 수의학적으로 적절한 형태로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 정제, 캡슐, 당-코팅, 필름-코팅정제, 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 경구적으로 투여하거나, 또는 피하나 근육내로 또는 정맥내로 주사 또는 주입의 방법을 통하여 비경구적으로 투여할 수 있다.
환자의 연령, 체중 및 상태와 투여경로를 비롯한 각종 요인에 따라 투여량은 결정될 수 있다. 1일 투여용량은 광범위한 한도치 내에서 변할 수 있으며, 각각의 개별 경우에서 개인적 요건에 맞게 조정될 수 있다. 그러나 일반적으로, 본 화합물을 성인에게 단독 투여하는경우, 투여 경로별로 채택된 투여용량은 0.0001 내지 50 mg/kg 체중이며, 0.001 내지 10 mg/kg 체중의 범위에서 예를들면 0.01 내지 1 mg/kg 체중으로 할 수 있다.
이러한 투여 용량은 예를 들면 1 일 1 내지 5회 제공할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 적절한 1 일 용량은 0.0001 내지 1 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.0001 내지 0.1 mg/kg 체중이다. 1일 투여용량은 단일 투여분으로서 또는 분할용량 스케줄에 따라 투여할 수 있다.
본 발명에 의한 화합물은 특이적으로 암세포를 알킬화시킬 수 있다. 정상적인 세포에서는 BER(Base Excision Repair)에 중요한 PARP1 또는 NER(Nuclear Excision Repair)에 중요한 XPA (xeroderma pigmentosum group A protein)가 이러한 알킬화된 염기를 복구하는 반면에, PARP1 또는 XPA가 제 역할을 수행하지 못하는 암세포는 이러한 알킬화된 염기를 제대로 복구하지 못하여 특이적으로 사멸하는 효과를 갖는 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
[실시예]
세포주
HCT116(ATCC), XP2OS(엑손 3에서 스플라이싱 수용체를 생성하기 위해 XPA 돌연변이 c.390-1G>C(IVS3-1G>C)), WT XPA를 발현하는 XP2OS(XPA 상보적임, 이 실시예에서 생성됨) [17] U2OS(ATCC® HTB-96??), HEK293T ATAD5-LUC [15] 세포를 10% 소태아혈청(FBS, Merk), 1% 항생제-항진균제(페니실린 10000 units/mL, 스트렙토마이신 10000 μg/mL, Fungizone®(암포테리신 B) 25μg/mL, Gibco®)을 37
Figure pat00006
, 5% CO2의 존재하에 배양하였다. HAP1 세포는 5% CO2 존재 하에 37
Figure pat00007
에서 10% 소태아혈청과 1% 항생제-항진균제가 함유된 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)에서 배양되었다. DR-GFP(동종 재조합), SA-GFP(단일 가닥 어닐링), EJ2-GFP(마이크로 상동성 매개 말단 접합) 또는 EJ5-GFP(비상동 말단 접합) 리포터를 포함하는 U2OS 세포를 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신(페니실린 10000 units/mL, 스트렙토마이신 10000 μg/mL, Gibco®) 및 2μg/ml 퓨로마이신을 포함하는 DMEM에서 성장시켰다.
WT XPA와 상보적인 XP2OS 세포를 만들기 위한 렌티바이러스 세포주 형질도입
SV40으로 형질전환된 인간 섬유아세포 XP2OS(XPA 돌연변이)는 5% CO2의 존재 하에 37
Figure pat00008
에서 10% 소태아혈청(FBS, millipore) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Cytiva)에서 배양되었다. 렌티바이러스 형질도입을 위해, XPA cDNA를 함유하는 0.75㎍의 pWPXL 발현 벡터, 2.25㎍의 pMD2.G 엔벨롭 플라스미드 및 2.25 ㎍의 psPAX2 패키징 플라스미드를 리포펙타민 3000 (L3000001, Invitrogen)를 사용하여 확립된 프로토콜을 따라서 HEK293T 세포에 형질감염시키고 하루 후에 수확하였다(Salmon, P. et al., Curr Protoc Neurosci, 2006. Chapter 4: p. Unit 4 21). 형질감염 하루 전, XP2OS 세포를 50% 컨플루언시에서 6-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 감염 다중도가 2인 렌티바이러스와 함께 인큐베이션한 후 위에서 설명한 대로 성장시켰다.
플라스미드, 화학물질 및 항체
I-SceI(pCAGGS-I-SceI, pCBASce라고 함), 빈 벡터(pCAGGS-BSKX) 및 dsRED 벡터는 이전에 설명한 대로 제조하였다(Bennardo, N., et al., PLoS Genet, 2008. 4(6): p. e1000110; Bennardo, N., et al., PLoS Genet, 2009. 5(10): p. e1000683; Motegi, A., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(34): p. 12411-6). Bromo-N,N-diethylethanamine hydrobromide, 2-chloro-N,N-diethylethanamine hydrochloride, 2,2,2-trifluoroethanol, 5-FUrd, Adenine, Cytosine, Guanine, Methyl methanesulfonate (MMS), sodium acetate, thymidine을 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 올라파립(Olaparib)은 Selleckchem (AZD2281)에서 구입하였다. 항-XPA(sc-853) 및 항-알파-튜불린(DM1A, sc-32293)은 Santacruz에서 구입하였다. Anti-γH2AX (Ser139, 05-636)는 Merck Millipore에서 구입하였다. Anti-PARP1 (ALX-210-302-R100)은 Enzo Life Sciences에서 구입하였다.
ATAD5-루시페라제 분석
HEK293T ATAD5-LUC 세포(Fox, J.T., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(14): p. 5423-8)는 96-웰 백색 검정 플레이트(Costar)에 웰당 15,000개 세포의 밀도로 플레이팅되었다. 24시간 후, 세포를 5-FUrd 및 UNI21로 처리하고 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성은 One-Glo 루시퍼라제 시약(Promega)을 각 웰에 첨가하고 Synergy NEO2 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek)로 발광 강도를 측정하였다.
면역 블롯 분석
전체 세포 추출물을 분리하고 면역블롯 분석을 이전에 설명한 대로 약간 수정하여 수행하였다(Lee, K.Y., et al., J Cell Biol, 2013. 200(1): p. 31-44). 간단히 말해서, RIPA 완충액 (50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100??, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, Halt?? Protease & Phosphatase Single-Use Inhibitor Cocktail))에서 Benzonase® 뉴클레아제와 함께 얼음 위에서 세포를 40분 동안 배양하여 전체 세포 추출물을 분리하고, 초음파 처리 및 원심분리하였다. 면역블롯 분석을 위해 단백질을 SDS-PAGE로 분해하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 차단용 탈지유 5%가 첨가된 0.1% Tween 20 (TBS-T)을 함유하는 Tris-buffered saline (TBS)에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 1차 항체로 밤새 인큐베이션하였다. 블롯을 세척하고 1:5,000 희석된 TBS-T에서 1시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 2차 항체(Enzo Life Sciences)와 함께 인큐베이션하였다. 신호는 자동화된 이미징 시스템(ChemiDoc??; Bio-Rad Laboratories)에 의해 향상된 화학발광 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 검출되었다.
유세포 분석
세포를 PBS로 세척하고 PBS 중 70% 에탄올로 밤새 고정시켰다. 그런 다음 고정된 세포를 PBS로 세척하고 PBS 중 0.2 mg/mL RNase A와 함께 37
Figure pat00009
에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DNA는 PBS에서 10 μg/mL 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide)로 염색되었다. 유세포 분석은 BD FACSuite?? 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 FACSVerse?? 유세포 분석기에서 수행되었다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
아폽토시스 분석
제조사의 지침에 따라 Annexin V Alexa FluorTM 488 접합체(A13201, Thermo Fisher Scientific)와 Flow-Jo 소프트웨어(버전 10)가 있는 BD FACSVerse 기기를 사용하여 세포 사멸을 정량화하였다.
COMET 분석
COMET 분석은 제조업체의 지침에 따라 CometChip®(Trevigen, Gaithersburg, MD)을 사용하여 수행되었다. 간단히 말해서, 단일 세포 현탁액을 1.0 X 105개 cells/ml 밀도를 갖는 6 ml 배지에서 제조하였다. 웰당 100μl 세포의 분취량을 CometChip에 적용하고 세포를 고르게 퍼뜨리기 위해 10분 간격으로 3회 부드럽게 흔들면서 10분 동안 조직 배양 인큐베이터에서 배양하였다. 배지를 제거하고 96웰 CometChip® 시스템의 각 CometChip을 5 mL PBS로 부드럽게 두 번 세척하였다. 그런 다음 CometChip을 PBS 중 1% 45
Figure pat00010
저융점 아가로스 6 mL로 덮었다. 아가로스의 응고 후, 슬라이드를 4℃에서 밤새 용해 용액(Trevigen)에 침지시켰다. CometChip을 4
Figure pat00011
에서 20분 동안 알칼리성 용액에서 2회 평형화하고, 알칼리성 용액에서 22V로 4
Figure pat00012
에서 50분 동안 전기영동하고, 새로운 0.4M Tris(pH 7.4) 완충액에서 15분 동안 4
Figure pat00013
에서 중화하였다. 그런 다음 20mM Tris(pH 7.4) 완충액에서 4
Figure pat00014
에서 30분 동안 평형화하였다. CometChip의 DNA는 실온에서 2시간 동안 20mM Tris(pH 7.4) 완충액에서 0.2X SYBR® Gold로 염색되었다. 형광 현미경(BX53; Olympus, Tokyo, Japan)으로 이미지를 획득하고 Comet 분석 소프트웨어(Trevigen)를 사용하여 테일 모멘트(tail moment)를 계산하였다.
세포 생존력 분석
세포를 웰당 5,000개 세포의 최종 밀도로 백색의 단단한 바닥 96웰 플레이트에 플레이팅하고 표시된 화합물로 처리하기 전에 하루 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존력은 제조자의 프로토콜에 따라 Cell Titer-Glo (Promega)를 사용하여 처리 후 48시간 후에 결정되었다. 생존력은 Synergy NEO2 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek)에서 정량화하였다.
제조예: 2-클로로- N,N -디에틸에탄-1-아민 염산염을 사용한 핵염기의 알킬화(UNI21)
도 1a에 표시된 화학식 2의 화합물(UNI21라 칭함)은 2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 하이드로클로라이드(2-chloro-N,N-디diethylethanamine hydrochloride), SIGMA-ALDRICH)를 구매하여 사용하였다.
아데닌과 UNI21의 반응
Figure pat00015
2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염(UNI21) (28.8 mg, 0.2 mmol, 1.0 eq)을 TFE(2,2,2-Trifluoroethanol) (2.0 mL)에 용해된 아데닌(27.0 mg, 0.2 mmol, 1.0 eq) 용액에 첨가하였다. 아세트산나트륨(24.6 mg, 0.3 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 pH를 중성으로 조정하였다. 반응 혼합물을 37℃ 또는 60℃에서 3일 동안 교반하였다. 조 반응물을 시린지 필터로 여과하였다. 여과된 화학물질은 하기 기술된 바와 같이 UPLC-HRAM-PRM에 의해 특성화하였다.
구아닌과 UNI21의 반응
Figure pat00016
2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염(UNI21)(28.8mg, 0.2mmol, 1.0당량)을 TFE (2.0mL)에 용해된 구아닌(30.2 mg, 0.2 mmol, 1.0당량)의 용액에 첨가하였다. 아세트산나트륨(24.6 mg, 0.3 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 pH를 중성으로 조정하였다. 반응 혼합물을 37℃ 또는 60℃에서 3일 동안 교반하였다. 조 반응물을 시린지 필터로 여과하였다. 여과된 화학물질은 하기 기술된 바와 같이 UPLC-HRAM-PRM에 의해 특성화하였다.
티민과 UNI21의 반응
Figure pat00017
2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염(UNI21)(28.8 mg, 0.2 mmol, 1.0당량)을 TFE (2.0 mL)에 용해된 티민(25.2 mg, 0.2 mmol, 1.0당량)의 용액에 첨가하였다. 아세트산나트륨(24.6 mg, 0.3 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 pH를 중성으로 조정하였다. 반응 혼합물을 37℃ 또는 60℃에서 3일 동안 교반하였다. 조 반응물을 시린지 필터로 여과하였다. 여과된 화학물질은 하기 기술된 바와 같이 UPLC-HRAM-PRM에 의해 특성화하였다.
시토신과 UNI21의 반응
Figure pat00018
2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염(UNI21)(28.8 mg, 0.2 mmol, 1.0당량)을 TFE(2.0 mL)에 용해된 시토신(22.2 mg, 0.2 mmol, 1.0당량)의 용액에 첨가하였다. 아세트산나트륨(24.6 mg, 0.3 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 pH 중성을 조정하였다. 반응 혼합물을 37℃ 또는 60℃에서 3일 동안 교반하였다. 조 반응물을 시린지 필터로 여과하였다. 여과된 화학물질은 하기 기술된 바와 같이 UPLC-HRAM-PRM에 의해 특성화하였다.
알킬 핵염기의 고체상 추출(Solid-phase extraction, SPE) 정제
각 N-(디에틸아미노-에틸)-핵염기(DEAE-핵염기) 반응의 분취량을 물 중 5% 메탄올 1mL에서 재구성하고 30분 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 용액을 실온에서 10분 동안 14,000 rcf에서 원심분리하여 고체 침전물을 펠렛화하였다. Oasis® HLB 30 mg 추출 카트리지(Waters, Milford, MA)를 진공 매니폴드에 놓고 물 1 mL를 두 번 첨가한 다음 부드러운 진공이 적용된 메탄올 1 mL를 추가하여 조절하였다. 그런 다음 샘플 용액을 컬럼에 로딩한 다음 물에 용해된 5% 메탄올 2 mL로 두 번 세척하였다. DEAE-퓨린 핵염기와 DEAE-피리미딘 핵염기는 500 μL 100% 메탄올을 두 번 첨가하여 용리되었다. 수집된 용리액은 원심 진공에 의해 농축되었고 향후 분석을 위해 -20℃에 보관되었다.
2-클로로- N,N -디에틸에탄아민 염산염(UNI21)을 사용한 송아지 흉선 DNA(CTDNA)의 알킬화
물 또는 PBS에 녹인 100 μg의 CTDNA 분취량을 190μL의 물 또는 PBS로 희석한 다음, 10μL의 2mM 2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염을 첨가하여 최종 농도가 100 μM이 되도록 하였다. 그런 다음 용액을 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하여 뉴클레오티드의 알킬화시킨 다음 70℃에서 1시간 동안 가열하여 DEAE-퓨린 염기를 탈퓨린화하였다. 방출된 DEAE-퓨린 핵염기는 OmegaTM 10kDa 멤브레인이 있는 Nanosep® 원심 분리 장치를 통해 4℃에서 14,000rcf에서 10분 동안 원심분리하여 DNA 백본에서 분리되었다. 동일한 부피의 탈이온수(De-ionized)수를 두 번, 100 μL 50:50 ACN(Acetonitrile):DI water를 한 번 사용하여 필터를 추가로 세척하였다. 수집된 모든 용액(탈퓨린 용액)은 원심 진공에 의해 건조될 때까지 농축되었고 향후 실험을 위해 -20℃에서 보관되었다. 필터의 DNA 백본을 100 μL 물(DNA 백본 용액)에 재현탁하고 필터에서 회수하여 향후 실험을 위해 -20℃에 보관하였다.
초고성능 액체 크로마토그래피-고분해능 정밀 질량 병렬 반응 모니터링(UPLC-HRAM-PRM)을 통한 알킬-핵염기 표준물의 특성화
2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염에 의한 퓨린 및 피리미딘 핵염기의 알킬화는 다음과 같이 양성 모드에서 UPLC-HRAM-PRM 분석에 의해 SPE(solid-phase extraction, 고상 추출)-정제된 반응 생성물을 분석함으로써 확인되었다; Hypersil GOLD 1.9 mm C18 컬럼(100 x 1.0 mm)은 완충액 A (15 mM 암모늄 아세테이트, pH 7.0) 및 완충액 B (100% 아세토니트릴)의 구배를 사용하여 2% 완충액 B에서 2분 동안 시작하여 8분에 걸쳐 25% 완충액 B로 선형 증가시키고, 20분에 걸쳐 50% 완충액 B로 증가시킨 다음 2분에 걸쳐 80% 완충액 B로 증가시키고 2분 동안 80% 완충액 B에서 일정하게 유지하고, 이어서 2분에 걸쳐 2% 완충액으로 감소시키고, 마지막으로 9분 동안 2% 완충액 B에서 재평형화시켰다. 질량 분석(MS) 설정은 다음과 같다. 전자분무 전압(3500V), 모세관 온도 320℃, 전체 스캔 AGC(1e6), 전체 스캔 분해능 70,000, HESI 온도 150℃, 시스 가스(sheath gas), 보조 가스 및 스윕 가스(sweep gas) 유량 각각 35, 10 및 1 임의 단위이다. PRM(parallel reaction monitoring, 병렬 반응 모니터링) MS 설정은 다음과 같다: 35,000에서 PRM AGC(5e4) 및 PRM 분해능. DEAE-퓨린 및 DEAE-피리미딘 핵염기 PRM 설정은 다음과 같다. ESI+-PRM N7-DEAE-구아닌 및 N9-DEAE-구아닌: m/z (+1) = 9-14.0분에서 251.1615; ESI+-PRM N1-DEAE-아데닌, N3-DEAE-아데닌 및 N7-DEAE-아데닌(N9-DEAE-아데닌 가능성): m/z (+1) = 12-15분에서 235.1661; ESI+-PRM N1-DEAE-시토신 및 N3-DEAE-시토신: m/z (+1) = 4-7분 및 8-13분에서 211.1550; 및 ESI+-PRM N1-DEAE-티민 및 N3-DEAE-티민: m/z (+1) = 10-13분에서 226.1547.
UPLC-HRAM-PRM에 의한 2-클로로- N,N -디에틸에탄아민 염산염(UNI21)에 의한 CTDNA 알킬화 분석
위의 탈퓨린 용액을 50 μL 물에 재구성하고 핵염기가 존재하는지 확인하기 위해 구아노신에 대한 흡광 계수를 사용하여 마이크로볼륨 UV 분광광도계(Thermo Scientific?? NanoDrop)로 측정하였다. 탈퓨린 용액에서 1.2 μg의 CTDNA의 당량을 위에서 설명한 DEAE-퓨린 UPLC-HRAM-PRM 방법으로 분석하였다.
위의 DNA 백본 용액을 마이크로볼륨 UV 분광광도계로 측정하고 25 μg의 CTDNA 분취량을 150 μL 1X NEB 뉴클레오사이드 분해 믹스 반응 완충액으로 희석하고 2.5 μL NEB 뉴클레오사이드 분해 믹스(10 μg CTDNA당 1 μL 믹스)와 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, OmegaTM 10 kDa 멤브레인이 있는 Nanosep® 원심 장치를 통해 4℃에서 10분 동안 14,000 rcf에서 원심분리하여 소화 효소를 제거하였다. 필터는 동일한 부피의 탈이온수를 한 번 더 사용하고 100 mL 50:50 ACN: DI water를 두 번 더 사용하여 추가로 세척하였다. 수집된 모든 용액을 원심 진공으로 농축 건조시켰다. 생성된 분해물을 25 μL LC-MS 물에 재구성하고 CTDNA의 5 μg 분취량을 설명된 바와 같이 변형된 DEAE-피리미딘 뉴클레오시드 UPLC-HRAM-PRM 분석으로 분석하였다. ESI+-PRM DEAE-2'-데옥시시티딘: m/z (+1) = 11-14.0분에서 327.20270 및 ESI+-PRM DEAE-티미딘: m/z (+1) = 11-14에서 각각 342.20230. UPLC-PRM MS 설정은 위에서 설명한 DEAE-퓨린 염기 분석에 대해 설명한 것과 정확히 동일하였다.
마우스 이종이식편
동물 실험은 UNIST 동물실험연구소(IACUC)의 지침에 따라 수행되었다. 7주령 수컷 BALB/c 누드 마우스는 Orient Bio(경기, 한국)에서 구입하였다. 4백만 세포의 WT 또는 PARP1 KO HCT116을 150 μL의 멸균 HBSS(Welgene, 한국 경북)에 현탁하고 왼쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 비히클(PBS) 또는 UNI21의 종양 내 주사는 각 종양 크기가 약 200 mm3에 도달한 후 16일 동안 3일마다 수행되었다. 종양 크기는 약물 치료 후 16일 동안 3일마다 캘리퍼스를 사용하여 측정되었다. 종양 부피는 다음 공식에 의해 측정되었다:
Figure pat00019
. 모든 마우스를 안락사시켜 면역염색을 위해 종양을 수확하였다.
면역조직화학
Hematoxylin 및 Eosin(H&E) 염색, TUNEL 및 γ-H2AX 면역 염색은 Histoire(서울, 한국)에서 상업적으로 수행하였다. 수집된 종양을 포르말린으로 고정하고 Histoire에서 픽업하였다. 자세한 면역염색 과정은 히스토리아 홈페이지(http://www.histoire.co.kr/)에서 확인할 수 있다.
통계 분석
통계 분석은 GraphPad Prism(버전 9.0.0)을 사용하여 수행되었다. 유의성은 p 값으로 표현된다(p>0.5 (ns), p<0.05 (*), p<0.01 (**), p<0.001 (***), p<0.0001 (****)). 단일 통합 분산을 사용하는 일반 일원 분산 분석, Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 그룹을 비교하였다(도 1B-C). 일반 양방향 ANOVA, Sidak의 다중 비교 테스트, 단일 통합 분산을 사용하여 그룹을 비교하였다(도 1E-G, 3C, F, H, I). 짝을 이루지 않은 양측 t-검정을 사용하여 그룹을 비교하였다(도 4C, D).
실시예 1: UNI21은 XPA 또는 PARP1 결핍 세포를 선택적으로 사멸한다.
이전에 ATAD5 발현을 바이오마커로 사용하여 유전독성 화합물을 식별하는 고처리량 유전독성 스크리닝 분석을 개발하였다(Fox, J.T., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(14): p. 5423-8). 이 분석을 사용하여 2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염(UNI21)(도 1a)이 ATAD5-루시페라제 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였다(도 1b). 종양은 종종 DNA 손상 복구 경로에 결함이 있고 특정 DNA 손상 인자에 취약해진다. 예를 들어, 상동 재조합을 수행할 수 없는 BRCA1-결핍 종양은 상동성 기반 DNA 이중 가닥 파손(double-strand break, DSB) 복구에 필요한 경로이며 시스플라틴(cisplatin) 또는 이온화 방사선과 같은 DNA DSB 유발 물질에 민감하다. UNI21과 관련된 DNA 손상 복구 경로를 찾기 위해 다른 DNA 손상 복구 경로에 결함이 있는 다른 HAP1 세포주를 UNI21과 함께 48시간 동안 배양한 다음 Cell Titer-Glo 발광 세포 생존력 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정하였다. 야생형과 비교하여 xpa KO 및 parp1 KO HAP1 세포주는 20 mM UNI21 처리에 대해 유의한 민감성을 나타냈다(도 1c 및 도 1d). UNI21에 대한 유사한 민감성이 parp1 KO HCT116 세포주에서 용량 의존적 방식으로 관찰되었다(도 1D, E). 또한 XP2OS 세포와 XPA 돌연변이 XP 환자 세포에서 세포 생존력을 측정하였다. 야생형 XPA로 상보적인 XP2OS 세포와 비교하여, XP2OS 세포는 용량 의존적 방식으로 UNI21에 상당한 민감성을 나타냈다(도 1d 및 도 1e).
parp1 KO 세포주에 대한 UNI21의 선택적 민감도를 독립적으로 확인하기 위해 HAP1, HCT116 및 U2OS 세포주의 생존력을 Olaparib의 고정 농도와 증가하는 농도의 UNI21로 공동 처리한 후 평가하였다. parp1 KO 세포주와 유사하게, Olaparib의 공동 처리는 용량 의존적 방식으로 테스트된 모든 세포주에서 UNI21에 대한 민감성을 유도하였다(도 1f). 증가하는 용량의 올라파립과 고정된 농도의 UNI21을 동시에 처리하면 모든 HAP1, HCT116 및 U2OS 세포주에서 용량 의존적 방식으로 감도가 유도되었다(도 1g). 종합하면, UNI21은 NER(nucleotide excision repair) 또는 PARP1 의존적 복구 경로에 결함이 있는 세포에서 선택적으로 치명적인 영향을 일으킬 수 있다.
실시예 2: 2-클로로- N,N -디에틸에탄아민 염산염(UNI21)에 의한 알킬화된 핵염기의 특성화
UNI21은 반질소 머스타드이며 Cl 리간드가 분자내 폐환 반응에 의해 치환되어 아지리디늄 이온을 생성할 때 친전자성 특성을 갖는다. 이 반응성이 높은 친전자체는 DNA 핵염기의 친핵성 위치를 알킬화할 수 있다. 이 잠재적 메커니즘을 테스트하기 위해 UNI21에 의한 퓨린 및 피리미딘 핵염기의 알킬화를 조사하였다(도 2a). 각 핵염기 0.2mmol과 UNI21 0.2mmol의 반은 앞서 설명한 조건에 따라 수행되었다(Balcome, S., et al., Chem Res Toxicol, 2004. 17(7): p. 950-62). UNI21에 의한 퓨린 및 피리미딘 핵염기의 알킬화를 확인하기 위해 반응 혼합물을 고체상 추출로 정제하고 고해상도 정밀 질량 분석 병렬 반응 모니터링(UPLC-HRAM-PRM)으로 분석하였다. 이 분석을 사용하여 원하는 디에틸에테나미늄(DEAE)-아데닌(m/z = 235.1671), DEAE-구아닌(m/z = 251.1611), DEAE-티민(m/z = 226.0972) 및 DEAE-시토신(m/z = 211.1551)은 각각 13.1분과 14.3분(약한 피크), 10.2분과 12.1분, 11.0분과 11.5분, 4.8분과 9.2분에서 용리되는 것으로 확인되었다(도 6a). PRM(병렬 반응 모니터링) 단편화는 4개의 DEAE-핵염기 모두가 디에틸 링커에서 동일한 주요 절단 단편을 공유하여 N,N-디에틸에텐아미늄 [M - 염기 + H]+, m/z = 100.1124 및 N-비닐을 생성하는 것으로 나타났다. 핵염기 이온 [M - NC4H11]+; DEAE-아데닌 m/z = 235.1671 ~ 162.0772, DEAE-구아닌 m/z = 251.1611 ~ 178.0721, DEAE-티민 m/z = 226.0972 ~ 153.0656, DEAE-티민 m/z = 226.0972~153.0656. 2-브로모-N,N-디에티에탄-1-아민과 유사한 반응을 하여 동일한 생성물을 얻었지만 매우 감소된 수율로 아세테이트로 켄칭된 2-(디에틸아미노)에틸 아세테이트를 주요 생성물로 사용하였다. UPLC-HRAM-PRM 결과에 기초하여, 유사한 단편화 패턴을 갖는 다중 피크의 관찰은 구아닌의 N1, N3, N7, N9 또는 O 6 위치, 아데닌, 시토신의 N1, O 2 또는 N3, 티민의 N1, O 2 , N3 또는 O 4 위치.
실시예 3: 2-클로로- N,N -디에틸에탄아민 염산염(UNI21)에 의한 알킬화된 송아지 흉선 DNA(CTDNA)의 확인 및 특성화
이중 가닥 DNA의 뉴클레오티드에 대한 UNI21 알킬화를 추가로 조사하기 위해 CTDNA를 UNI21과 함께 16시간 동안 인큐베이션하였다. 알킬화된 퓨린은 열 가수분해에 의해 DNA 백본에서 방출되었고 UPLC-HRAM-PRM 분석에 의해 분석되었다. 240 ng에 해당하는 CTDNA를 분석했을 때 10.3분에 DEAE-구아닌의 존재를 확인할 수 있었다(도 2b). 이중 가닥 DNA에서 구아닌의 N9 위치에 접근할 수 없기 때문에 10.3분에 관찰된 피크는 N7-DEAE-구아닌일 것으로 예상되고 12.1분에 표준 피크는 N9-DEAE-구아닌일 것으로 예상된다. 240나노그램의 CTDNA를 분석하는 동안 DEAE-아데닌을 검출할 수 없었다. 탈퓨린화 기질이 1.2 μg의 CTDNA로 5배 증가했을 때 13.1분과 14.3분 모두에서 DEAE-아데닌에 대한 약한 신호를 감지할 수 있었다(도 2b). PRM 데이터를 분석한 결과 두 피크 모두 예상되는 단편화 패턴이 있는 것으로 나타났다. 2'-데옥시아데노신의 N3 위치가 DNA의 다른 질소 머스타드와 가장 반응성이 높은 위치임을 감안할 때(Balcome, S., et al., Chem Res Toxicol, 2004. 17(7): p. 950-62; Povirk, L.F. et al., Mutat Res, 1994. 318(3): p. 205-26), 13.1분의 약한 신호가 N1-DEAE-아데닌 또는 N7-DEAE-아데닌에 해당하고 14.3분에 더 강한 신호는 N3-DEAE-아데닌에 해당한다.
나머지 알킬화된 DNA 백본을 NEB 뉴클레오사이드 분해 믹스로 분해하여 DEAE-2'-데옥시피리미딘을 생성하였다. 변형된 DEAE-피리미딘 뉴클레오사이드 UPLC-HRAM-PRM 분석으로 5㎍의 CTDNA 분해를 분석했을 때, 11.9분과 13.3분에 2개의 DEAE-dC 피크와 12.3분에 1개의 DEAE-dT 피크를 검출할 수 있었다(도 2c). 11.9분의 DEAE-dC 피크는 2'-데옥시당 [M - dR + H]+의 절단에 해당하는 m/z = 211.1511, 138.0661 및 100.1124의 단편을 생성하고 디에틸 링커에서 N-비닐-시토신 이온 [M - NC4H11 - dR + H]+ 및 N,N-디에틸에테나미늄 [M - dC + H]+을 생성한다(도 7). 13.3분의 DEAE-dC 피크는 식별할 수 없는 m/z = 283.17488, 177.11195, 133.08587 및 89.06019의 단편을 산출하였다. 12.3분의 DEAE-dT 피크는 m/z = 226.1547, 153.0656 및 100.1124의 단편을 산출했으며, 이는 2'-데옥시당 [M - dR + H]+의 절단에 해당하고 디에틸 링커에서 N-비닐-시토신 이온 [M - NC4H11 - dR + H]+ 및 N,N-디에틸에테나미늄 [M - dT + H]+을 생성한다(도 7). 이중 가닥 DNA에서 피리미딘의 N1 위치에 접근할 수 없다는 점을 감안할 때 11.9분에 관찰된 피크는 N 3 -DEAE-dC 또는 O 2 -DEAE-dC에 해당할 것으로 예상되고 12.1분에 피크는 O2에 해당할 것으로 예상된다 -DEAE-dT, N 3 -DEAE-dT 또는 O 4 -DEAE-dT. 종합하면, UNI21(2-클로로-N,N-디에틸에탄아민 염산염)은 2'-데옥시구아노신에 가장 반응성이 좋고, 그 다음이 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시피리미딘(dG >> dA > dC ~ dT)이다.
반응성과 알킬화 가능성을 조사하기 위해 돌연변이 HAP1 세포주를 염화물 이탈기를 브로마이드 이탈기로 대체한 UNI21 유도체로 처리하였다(도 5d 및 도 5e). 그러나 UNI21과 비교하여 브로마이드-치환 유도체의 민감도는 유의하게 증가하지 않았다.
실시예 4: UNI21은 PARP1 결핍 세포에서 더 많은 DNA 절단을 유도한다
UNI21은 핵염기에 대한 알킬화를 유발하므로 UNI21 치료는 S기 진행을 방해해야 한다. HCT116 WT 및 parp1 KO 세포주에서 세포 주기 진행에 대한 UNI21의 효과를 조사하였다. 야생형 및 parp1 KO 세포는 증가하는 농도의 UNI21 처리 시 S단계에서 모두 정지되었다(도 3a). parp1 KO 세포가 UNI21에 의해 선택적으로 사멸되었기 때문에 야생형에서 80 μM UNI21과 parp1 KO 세포에서 24시간 처리 후 DNA 손상 마커를 비교하였다. 세포 생존율 결과와 일치하게, UNI21 처리된 parp1 KO 세포에서 더 높은 γH2AX 유도를 발견하였다(도 3b). 또한, 알칼리 혜성 분석으로 측정한 실제 DNA 손상은 UNI21 처리 시 야생형 세포에 비해 parp1 KO 세포에서 유도된 DNA 파손이 더 많이 나타났다(도 3c). 게놈 불안정성을 조사하기 위해 80 μM UNI21로 24시간 처리한 후 HCT116 WT 및 parp1 KO 세포에서 자매 염색분체 교환(SCE) 및 염색체 파손을 테스트하였다. 이전 연구에서 PARP1 결핍 세포는 손상 없이 SCE를 증가시킨다(Hochegger, H., et al., EMBO J, 2006. 25(6): p. 1305-14; Wang, Z.Q., et al., Genes Dev, 1997. 11(18): p. 2347-58; de Murcia, J.M., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(14): p. 7303-7; Oikawa, A., et al., Biochem Biophys Res Commun, 1980. 97(4): p. 1311-6). UNI21 처리된 parp1 KO 세포에서 더 빈번한 SCE와 중단을 발견하였다(도 3d, e, f 및 g). 특히, UNI21 처리된 parp1 KO 세포에서 중기당 25개 이상의 중단이 높게 관찰되었다(도 3H). 마지막으로, Annexin V Alexa FluorTM 488 접합체를 사용하여 세포 사멸 세포 사멸을 정량화하였다. 야생형과 비교하여 parp1 KO 세포주는 20 mM UNI21 처리에 대해 유의하게 증가된 세포자멸사를 보였다(도 3i). 이러한 결과는 UNI21이 PARP1 결핍 세포에서 더 많은 DNA 손상, 염색체 이상 및 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 5: parp1 KO 이종이식 종양의 성장은 UNI21 처리에 의해 선택적으로 억제된다
생체 내 UNI21의 효과를 확인하기 위해 누드 마우스를 사용하여 이종이식을 수행하였다(도 4a). 야생형 또는 parp1 KO HCT116의 400만 세포를 왼쪽 옆구리에 피하 주사하여 이종이식 종양을 형성하였다. 종양이 약 200 mm3에 도달했을 때, 비히클 또는 UNI21을 종양내 주사하였다. 비히클 처리된 야생형 및 parp1 KO 종양은 지속적으로 성장하였다. 야생형 종양의 지속적인 성장과 대조적으로, HCT116 parp1 KO 생착은 UNI21 처리에 의해 종양 성장의 현저한 지연을 보여주었다(도 4b 및 도 4c). 각 그룹의 정기적으로 추적된 이종이식 종양의 부피는 UNI21이 PARP1 결핍 HCT116 이종이식 종양의 증식을 선택적으로 지연시킴을 입증하였다(도 4d). TUNEL assay와 γ-H2AX 면역염색으로 세포사멸과 DNA 손상의 조직학을 조사하였다(도 4e). 시험관 내 데이터와 일치하게, UNI21 처리는 세포 사멸을 유발하고 γ-H2AX를 유도하였다. 전체적으로 UNI21은 생체 내에서 PARP1 결핍 종양의 성장을 구체적으로 억제한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00020

    화학식 1에서 R은 할로겐기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 2]
    Figure pat00021

    [화학식 3]
    Figure pat00022

  3. 제1항에 있어서, 상기 염은 HCl 염, HBr 염, HI 염, H2SO4 염 HNO3 염 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 편평세포 암, 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, PARP 저해제를 추가로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PARP 저해제는 올라파립(olaparib), 탈라조파립(talazoparib), 니라파립(niraparib), 루카파립(rucaparib), 벨리파립(veliparib) 및 파미파립(pamiparib)으로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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