KR20230049164A - nanohybrid comprising organic-inorganic core-shell nanoparticle and method of manufacturing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유무기 코어-셀 나노입자를 포함하는 나노하이브리드 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 무기물 나노입자 코어(core)와 키토산 쉘(shell)로 구성된 나노 단위의 자기조립(self-assembled) 나노하이브리드로서, 초고함량의 무기질, 형상-성형성, 고탄력성, 나노-거칠기 표면, 다중 치료제 전달 및 골재생능을 포함한 다기능의 고유 특성을 갖는 나노하이브리드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a nanohybrid comprising organic/inorganic core-shell nanoparticles and a method for preparing the same, and more specifically, to a nano-unit self-assembly (self-assembly) composed of an inorganic nanoparticle core and a chitosan shell. -assembled) nanohybrid, which has multi-functional unique properties including ultra-high content of inorganic matter, shape-formability, high elasticity, nano-rough surface, multi-therapeutic delivery and bone regeneration, and a method for preparing the same.
생명공학 분야에서는, 천연 및 생물학적 무기-유기 하이브리드는 전례 없는 물리화학적 및 기계적 특성으로 인해 나노/마이크로 구조를 모방하는 흥미로운 모델인 경우가 많다. 치아, 뼈, 연체 동물 껍질 및 점토 광물은 천연 하이브리드의 일반적인 예로서, 유기물 성분이 강력한 접착제 및 생물학적 활성제로 작용하는 반면에, 무기물 나노성분은 단단한 빌딩 블록 역할을 한다. 이러한 시스템에서 무기물 나노성분는 유기물 성분과 완전히 통합되어 고도로 정렬된 나노 하이브리드 구조를 형성하여 궁극적으로 탁월한 물성(예: 초고강도, 인성, 연신율 등)에 기여한다. 천연 물질을 모방한 무기-유기 하이브리드 개발에 상당한 진전이 있었으나, 여전히 해결과제가 남아 있으며, 특히, 무기물 나노성분은 유기물 부분과 균일하게 삽입되지 않으므로써 무기상의 함량과 그 결과로 생긴 특성을 제한한다. In the field of biotechnology, natural and biological inorganic-organic hybrids are often interesting models for mimicking nano/microstructures due to their unprecedented physicochemical and mechanical properties. Teeth, bones, mollusk shells and clay minerals are common examples of natural hybrids, with inorganic nanocomponents acting as tough building blocks, while organic constituents act as strong adhesives and biologically active agents. In these systems, inorganic nanocomponents are fully integrated with organic constituents to form a highly ordered nanohybrid structure that ultimately contributes to excellent physical properties (e.g., ultra-high strength, toughness, elongation, etc.). Significant progress has been made in the development of inorganic-organic hybrids that mimic natural materials, but challenges remain. In particular, inorganic nanocomponents are not uniformly intercalated with organic parts, limiting the content of the inorganic phase and the resulting properties. .
이 문제를 해결하기 위해 상당한 노력을 기울였다. 예를 들어, 무기물 나노입자는 작용기(포스페이트(phosphate) 또는 아민(amine))로 변형되거나, 용매 또는 스프레이 코팅 공정을 사용하여 유기물로 코팅되었으나, 시간이 많이 소요되는 단계, 값비싼 장비 및/또는 가혹한 처리 환경(예: 독성 화학물질, 고온, 급격한 산도 변화)을 포함하여 바이오 의약 재료로서의 잠재적 유용성이 제한되고 있다. Considerable efforts have been made to address this issue. For example, inorganic nanoparticles have been modified with functional groups (phosphate or amine) or coated with organic materials using solvent or spray coating processes, but this is a time-consuming step, expensive equipment and/or Their potential usefulness as biopharmaceutical materials is limited by harsh handling environments (e.g., toxic chemicals, high temperatures, rapid acidity changes).
본 발명자들은 천연 유기상 및 균질하게 삽입된 생활성 무기물 나노입자(하이드록시아파타이트, 생활성 유리 또는 메조다공성 실리카)로, 자극이 없는 수성 조건에서 간단한 과정을 통해 무기물 성분의 초고함량을 허용할 수 있는, 바이오 의약 하이브리드 개발을 목표로 한다. 이를 위해 개별 무기물 나노입자를 균일하게 덮는(또는 코팅) 생체접착제 역할을 하는 유기상(organic phase)으로 키토산을 도입했고, 키토산으로 둘러싸인 무기물 나노입자는 코어-쉘 구조를 특징으로 하며 코어-쉘 하이브리드 나노단위는 압축된 멤브레인 또는 3D 스캐폴드에 코팅된 형태로 나노하이브리드로 추가 조립될 수 있다. The present inventors have developed bioactive inorganic nanoparticles (hydroxyapatite, bioactive glass or mesoporous silica) in a natural organic phase and homogeneously inserted bioactive inorganic nanoparticles, which can allow ultra-high content of inorganic components through a simple process in non-irritating aqueous conditions. , aims to develop a biopharmaceutical hybrid. To this end, chitosan was introduced as an organic phase that serves as a bioadhesive that uniformly covers (or coats) individual inorganic nanoparticles, and the inorganic nanoparticles surrounded by chitosan are characterized by a core-shell structure, Units can be further assembled into nanohybrids in the form of coated membranes or 3D scaffolds.
본 발명자들은 기존의 혼합 합성 재료와 비교하여 독특한 자기조립 나노구조로 인한 물리화학적 및 기계적 특성을 조사했고, 치료 잠재력을 향상시키기 위해 여러 치료 분자를 로딩한 다음 제어된(순차적) 방식으로 전달하기 위한 나노하이브리드를 추가로 설계했다. 본 발명자들은 다양한 세포 세트와 나노하이브리드의 상호 작용을 조사하고 생체 내 골형성 모델에서 치료 효능을 입증하여 3D 조직 재생을 위한 잠재적 유용성을 해결했다. The present inventors investigated the physicochemical and mechanical properties due to the unique self-assembled nanostructure compared to existing mixed synthetic materials, loading several therapeutic molecules to enhance their therapeutic potential and then delivering them in a controlled (sequential) manner. Nanohybrids were additionally designed. We addressed the potential utility for 3D tissue regeneration by investigating the interactions of the nanohybrids with various cell sets and demonstrating their therapeutic efficacy in an in vivo osteogenic model.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다. The patents and references mentioned herein are incorporated herein by reference to the same extent as if each document were individually and expressly specified by reference.
본 발명자들은 생활성 무기물 나노입자 코어(core)와 키토산 쉘(shell)로 구성된 나노 단위의 자기조립(self-assembled)을 통해 고유한 구조의 나노하이브리드(Chit@IOC)를 제조하였으며, 새로운 자기조립 나노하이브리드는 초고함량의 무기질, 형상-성형성, 고탄력성, 나노-거칠기 표면, 다중 치료제 전달 및 골 재생 잠재력을 포함한 다기능의 고유 특성을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have prepared a nanohybrid (Chit@IOC) with a unique structure through self-assembly of nano units composed of a bioactive inorganic nanoparticle core and a chitosan shell, and a new self-assembly The nanohybrid has completed the present invention by experimentally demonstrating its unique multifunctional properties, including ultra-high mineral content, shape-formability, high elasticity, nano-roughness surface, multi-therapeutic delivery, and bone regeneration potential.
따라서, 본 발명의 목적은 무기물 나노입자 코어(core) 및 키토산 쉘(shell)로 이루어지는 나노입자를 포함하는 자기조립(self-assembled) 나노하이브리드를 제공하는 것에 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a self-assembled nanohybrid comprising nanoparticles composed of an inorganic nanoparticle core and a chitosan shell.
본 발명의 다른 목적은 상기 나노하이브리드를 유효성분으로 포함하는 골재생용 조성물을 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention is to provide a composition for bone regeneration comprising the nanohybrid as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노하이브리드를 인간을 제외한 동물의 손상 골 조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention is to provide a tissue regeneration method comprising the step of treating damaged bone tissue of an animal other than human with the nanohybrid.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노하이브리드의 제조 방법을 제공하는 것에 있다. Another object of the present invention is to provide a method for preparing the nanohybrid.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다. Other objects and technical features of the present invention are presented more specifically by the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 무기물 나노입자 코어(core) 및 키토산 쉘(shell)로 이루어지는 나노입자를 포함하는 자기조립(self-assembled) 나노하이브리드을 제공한다. According to one aspect of the present invention, the present invention provides a self-assembled nanohybrid comprising nanoparticles composed of an inorganic nanoparticle core and a chitosan shell.
본 발명의 나노하이브리드는 Chit@IOC 나노단위에서 자기조립되어, 고유한 특성(초고함량의 무기질, 나노 지형, 고탄력성, 다중 치료제 전달, 우수한 세포 활성화 및 골재생능)을 가지는 것으로 확인하였다. The nanohybrid of the present invention was self-assembled in Chit@IOC nanounits and was confirmed to have unique properties (ultra-high content of minerals, nanotopography, high elasticity, delivery of multiple therapeutic agents, excellent cell activation and bone regeneration ability).
본 발명에서 “자기조립(self-assembled)”은 나노기술의 원천기술로서, 분자들 간에 서로 밀치거나 당기는 힘을 인위적으로 조작하여 재현 가능한 나노구조를 자발적으로 형성하도록 하는 것이며, 이러한 자기조립기술은 질병진단에 응용되는 바이오칩, 나노튜브를 비롯한 전자재료 및 신소재분야, 고집적 반도체의 제조에 필요한 나노구조체 제조 등에서 서로 기술적으로 융합되어 발전될 가능성이 높은 분야이다. In the present invention, “self-assembled” is a source technology of nanotechnology, which artificially manipulates the pushing or pulling forces between molecules to spontaneously form reproducible nanostructures, and this self-assembly technology It is a field with high potential for technological convergence and development in the field of electronic materials and new materials including biochips and nanotubes applied to disease diagnosis, and the manufacture of nanostructures necessary for the manufacture of high-integration semiconductors.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노하이브리드는 코팅 겔 층을 더 포함할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the nanohybrid may further include a coating gel layer.
상기 나노하이브리드는 코팅 겔 층을 더 포함하여 치료 잠재력을 향상시키기 위해 여러 약물을 이중 또는 삼중으로 로딩한 다음 제어된(순차적) 방식으로 다중 약물 전달을 위한 나노하이브리드로 활용될 수 있다. The nanohybrid may further include a coating gel layer to double or triple load multiple drugs to enhance therapeutic potential, and then may be utilized as a nanohybrid for multi-drug delivery in a controlled (sequential) manner.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노하이브리드는 무기물 나노입자 코어(core), 키토산 쉘(shell), 코팅 겔 층 또는 이들의 조합에 약물을 로딩할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the nanohybrid may load a drug into an inorganic nanoparticle core, a chitosan shell, a coating gel layer, or a combination thereof.
상기 코팅 겔은 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 알지네이트, 플루로닉 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. The coating gel includes one or more selected from the group consisting of gelatin, collagen, laminin, fibronectin, alginate, pluronic and hyaluronic acid, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 무기물 나노입자는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA) 나노입자, 생활성 유리 나노입자, 메조다공성 실리카 나노입자, 실리케이트 나노입자, 인산칼슘 나노입자 및 자성 나노입자로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. According to one embodiment of the present invention, the inorganic nanoparticles include hydroxyapatite (HA) nanoparticles, bioactive glass nanoparticles, mesoporous silica nanoparticles, silicate nanoparticles, calcium phosphate nanoparticles, and magnetic nanoparticles. It may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명에서 “하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA) 나노입자”는 인체의 뼈나 이의 주성분이 되는 무기물이다. 이는 비-면역원성(nonimmunogenicity), 비-염증성(Nonimflammatory behavior), 우수한 생체적합성(Good biocompatibility), 높은 골전도도와 골유도도(high osteoconductivity and osteoinductivity) 등의 우수한 생물학적 특성을 가지고 있다. 그러므로 조직 공학, 약물/유전자 전달학, 분자이미징, 암 치료, 정형외과적 수술 등의 영역에서 HA 나노입자가 많은 관심을 끌고 있다. HA 나노입자 표면의 물리화학적인 특성을 바꾸는 것과 동시에 우수한 생물학적 특성들이 손상되는 것을 방지하기 위해 개개의 표면을 개량하거나 기능화하려는 연구들이 시행되고 있으며, 이는 생체의학 분야의 적용을 위해 매우 중요하다. In the present invention, “hydroxyapatite (hydroxyapatite, HA) nanoparticles” are bones of the human body or an inorganic substance that is the main component thereof. It has excellent biological properties such as nonimmunogenicity, non-inflammatory behavior, good biocompatibility, and high osteoconductivity and osteoinductivity. Therefore, HA nanoparticles are attracting much attention in areas such as tissue engineering, drug/gene delivery, molecular imaging, cancer treatment, and orthopedic surgery. Researches are being conducted to improve or functionalize individual surfaces in order to change the physicochemical properties of the surface of HA nanoparticles and at the same time prevent the excellent biological properties from being damaged, which is very important for biomedical applications.
본 발명에서 “생활성 유리 나노입자(bioactive glass nanoparticle, BGn)”는 실리콘, 칼슘, 인 등의 무기성분으로 구성된 나노입자를 의미하는데, 상기 BGn는 PEG 용액에 칼슘을 포함하는 화합물과 실리콘을 포함하는 화합물을 가하여 반응시킴으로써, PEG, 칼슘 및 실리콘이 응결된 응집체를 수득하고, 상기 응집체를 소결시켜서, PEG를 제거함으로써 제조할 수 있다. 생활성 유리 나노입자(BGn)는 나노필러(nanofiller)로서 나노복합체를 제조할 수 있으며 생분자를 전달할 수 있는 등 많은 장점을 가지고 있다. 또한, 줄기세포의 골분화 촉진, 약물의 로딩과 전달 및 치아의 재미네랄화(dentinremineralization)와 같은 우수한 생물학적 특성을 나타낼 수 있다. 더 나아가, BGn은 졸-겔 제조과정에서 이의 구조 내부에 특정 이온을 결합시킬 수 있고, 고도의 다공 구조가 생성된다. 생체활성 유리 나노입자(BGn)는 종래의 마이크로입자 형태의 BG((bioactive glass)와 비교하여 나노스케일의 크기를 가지면서 더욱 큰 표면적을 가져 이와 관련된 물리화학적 특성 및 생활성 특성이 더욱 우수하다. 이에 더하여, 본 발명의 메조다공성을 가지는 BGn은 세포내 흡수는 가능하면서 치료 분자의 효과적인 담지 및 전달이 가능하다. 결과적으로, 나노스케일 크기 및 실리카-기초의 조성을 갖는 BGn은 우수한 골-생활성 및 세포 및 조직 적합성을 갖는다.In the present invention, “bioactive glass nanoparticle (BGn)” refers to nanoparticles composed of inorganic components such as silicon, calcium, and phosphorus. The BGn includes a compound containing calcium and silicon in a PEG solution It can be prepared by adding and reacting a compound to obtain an aggregate in which PEG, calcium and silicon are coagulated, and sintering the aggregate to remove PEG. Bioactive glass nanoparticles (BGn) have many advantages, such as being able to prepare nanocomposites as nanofillers and delivering biomolecules. In addition, it can exhibit excellent biological properties such as promotion of bone differentiation of stem cells, drug loading and delivery, and dentinremineralization of teeth. Furthermore, BGn can bind specific ions into its structure during the sol-gel manufacturing process, and a highly porous structure is created. Bioactive glass nanoparticles (BGn) have a nanoscale size and a larger surface area compared to conventional microparticle-type BG (bioactive glass), and thus have better physicochemical and bioactive properties. In addition, the mesoporous BGn of the present invention enables effective loading and delivery of therapeutic molecules while enabling intracellular absorption.As a result, BGn with nanoscale size and silica-based composition has excellent bone-bioactivity and It has cell and tissue compatibility.
본 발명에서 “메조다공성 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticles, MSN)”는 최근 나노공학에서 개발되고 있는 나노입자로, 가장 흔한 유형은 MCM-41과 SBA-15이다. 이는 촉매, 약물 전달체 및 이미징 물질로 사용될 수 있다. MSN은 화학적 및 열적으로 안정된 나노 재료이면서, 형태와 기공성을 쉽게 조정할 수 있다. 2 내지 30nm의 조정 가능한 반경을 가진 원기둥 형태의 균일한 기공과, 이러한 특성으로 인한 넓은 표면적, 높은 열적 화학적 안정성 및 실리카의 쉬운 기능화는 MSN이 이상적인 흡착, 촉매작용, 화학적 분리, 생체공학의 기반이 되게 만든다. 그러므로 MSN의 기공의 크기 및 형태를 조절하는 것에 많은 연구가 수행되었다. 그 결과 SBA, MSU 및 FSM과 같은 새로운 MSN이 개발되었다. 기능화된 MSN을 얻는 것은 조절된 방출을 가진 약물 전달 시스템에 사용되기 위한 생체적합한 재료를 얻기 위해 매우 중요하다. 이에 MSN을 기능화하기 위해 많은 연구들 또한 수행되었다 In the present invention, “mesoporous silica nanoparticles (MSN)” are nanoparticles recently developed in nanotechnology, and the most common types are MCM-41 and SBA-15. It can be used as a catalyst, drug delivery vehicle and imaging material. MSN is a chemically and thermally stable nanomaterial, and its morphology and porosity can be easily tuned. Uniform cylindrical pores with adjustable radii of 2 to 30 nm, large surface area due to these characteristics, high thermal and chemical stability, and easy functionalization of silica make MSN an ideal base for adsorption, catalysis, chemical separation, and bioengineering. make it become Therefore, many studies have been conducted on controlling the size and shape of MSN pores. As a result, new MSNs such as SBA, MSU and FSM have been developed. Obtaining functionalized MSN is very important to obtain biocompatible materials for use in drug delivery systems with controlled release. Therefore, many studies have also been conducted to functionalize MSN.
본 발명에서 “실리케이트 나노입자”는 실리케이트 나트륨으로 이루어진 것으로, 탄산나트륨과 실리카를 반응시켜 제조 할 수 있으며, 그 결과 실리케이트 나트륨과 이산화탄소가 만들어진다. 이는 주로 시멘트, 다양한 난연 코팅재료, 내화학성 코팅재료, 빛 투과율이 높은 코팅재료 등을 제조하는 과정에서 사용된다. 본 발명에서 “인산칼슘 나노입자(Ca3(PO4)2 nanoparticle, CPNP)는 DNA와의 상호 작용이 구체적으로 잘 알려져 있지는 않으나, 세포 내의 핵산의 효율적인 전달과 안정화를 위한 2세대 매개로 떠오르고 있다. 인산칼슘은 인체의 단단한 조직인 뼈나 이의 무기 광물이기 때문에, 좋은 생체적합성과 생분해성을 가지고 있다. 나노입자가 분산된 형태로는 생체 시스템의 운반체로 사용 될 수 있으며, 핵산이나 약물을 운반할 수 있다. 세포 안의 핵을 향해 DNA가 플라즈마 막을 통해 들어가는 과정은 형질주입(transfection)이라고 한다. 그 후 DNA는 세포에 의해서 읽히고, 부호화(encode)된 단백질이 생합성된다. 히스톤이 제거된 DNA는 그 음전하로 인해 세포안으로 들어갈 수 없다는 사실 때문에, 적합한 전달체가 필요하다. 요구되는 유전자 서열을 포유류의 세포에 투입시키는 것은 바이러스성제, 고분자제, 리포솜제 또는 무기 나노입자로 수행될 수 있고, 무기 나노입자의 예로는 인산칼슘이 있다. 이 중 인산칼슘은 명백한 생분해성과 생체적합성을 가지며, 유기체나 고분자 운반체와 달리 미생물에게 분해되지 않게 때문에, 특히 적합한 재료이다. 인산칼슘을 기능화하여 간엽 줄기 세포에 처리하는 것은 골분화를 촉진시킨다는 점이 Gonzalez-McQuire et al의 연구에 의해 알려져 있다. 이외에도 많은 시스템들이 인산칼슘을 핵산 운반체로 사용하기 위해 개발되어왔다.In the present invention, "silicate nanoparticles" are composed of sodium silicate and can be prepared by reacting sodium carbonate with silica, resulting in sodium silicate and carbon dioxide. It is mainly used in the process of manufacturing cement, various flame retardant coating materials, chemical resistant coating materials, and coating materials with high light transmittance. In the present invention, “Ca 3 (PO 4 ) 2 nanoparticle (CPNP) is emerging as a second-generation medium for efficient delivery and stabilization of nucleic acids in cells, although its interaction with DNA is not well known. Since calcium phosphate is an inorganic mineral of bones or teeth, which are hard tissues of the human body, it has good biocompatibility and biodegradability. Nanoparticles can be used as carriers in biological systems in a dispersed form, and can deliver nucleic acids or drugs. The process of DNA entering the nucleus in the cell through the plasma membrane is called transfection. The DNA is then read by the cell, and the encoded protein is biosynthesized. Due to the fact that histone-deprived DNA cannot enter cells due to its negative charge, a suitable delivery vehicle is required. Introduction of the required gene sequence into mammalian cells can be performed with a viral agent, a polymeric agent, a liposome agent, or inorganic nanoparticles, and an example of the inorganic nanoparticles is calcium phosphate. Among them, calcium phosphate is a particularly suitable material because it has obvious biodegradability and biocompatibility and is not degraded by microorganisms unlike organisms or polymer carriers. It is known from the study of Gonzalez-McQuire et al that treating mesenchymal stem cells with functionalized calcium phosphate promotes bone differentiation. In addition, many systems have been developed to use calcium phosphate as a nucleic acid carrier.
본 발명에서 “자성 나노입자(magnetic nanoparticles, MNP)는 자기장을 이용하여 조종할 수 있는 나노입자의 분류이다. 이러한 나노입자는 2가지 성분으로 구성되며, 한 가지 성분은 자성물질로 대개 철, 니켈, 코발트와 같은 물질이다. 나머지 한 성분은 화학적 성분으로, 반응성을 갖는다. 나노입자가 직경 1 마이크로비터 보다 작은 반면, 큰 마이크로비드는 직경 0.5 내지 500 마이크로미터의 크기를 갖는다. 수 많은 개개의 MNP로 이루어진 MNP 클러스터는 자성 나노비드라고 불리며, 직경 50 내지 200 나노미터의 크기를 갖는다. 자성 나노입자 클러스 터는 자성 나노체인으로 조립될 수 있다. 자성 나노입자는 나노 재료 기반 촉매, 생약물, 조직 특이 표적, 자성적으로 조절 가능한 콜로이드 형태의 광결정, 미세유체, MRI, 자성 입자 이미징, 환경 복원. 광 필터 등 다양한 분야에서 사용될 수 있는 잠재력이 있다. In the present invention, “magnetic nanoparticles (MNP) is a class of nanoparticles that can be manipulated using a magnetic field. These nanoparticles are composed of two components, one of which is a magnetic material, usually a material such as iron, nickel or cobalt. The other component is a chemical component and has reactivity. While nanoparticles are smaller than 1 micrometer in diameter, large microbeads range in size from 0.5 to 500 micrometers in diameter. MNP clusters composed of numerous individual MNPs are called magnetic nanobeads and have a size of 50 to 200 nanometers in diameter. Magnetic nanoparticle clusters can be assembled into magnetic nanochains. Magnetic nanoparticles are used in nanomaterial-based catalysis, biopharmaceuticals, tissue-specific targeting, magnetically controllable colloidal photonic crystals, microfluidics, MRI, magnetic particle imaging, and environmental remediation. It has the potential to be used in various fields such as optical filters.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 무기물 나노입자 코어와 키토산 쉘의 질량비는 1:9 ~ 9:1일 수 있으며, 키토산 쉘(shell)과 무기물 나노입자 중 무기물 나노입자의 질량비가 클수록 우수한 골 재생 효과가 나타나며, 더 좋은 친수성, 기계적 특성, 생체 적합성 및 높은 ALP 유전자 발현을 나타낸다. According to one embodiment of the present invention, the mass ratio of the inorganic nanoparticle core and the chitosan shell may be 1:9 to 9:1, and the higher the mass ratio of the inorganic nanoparticles between the chitosan shell and the inorganic nanoparticles, the better the bone It shows regenerative effect, better hydrophilicity, mechanical properties, biocompatibility and high ALP gene expression.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노하이브리드는 인장 강도가 0.8 ~ 4.0 MPa일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the nanohybrid may have a tensile strength of 0.8 to 4.0 MPa.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노하이브리드는 연신율이 60 ~ 410%일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the nanohybrid may have an elongation of 60 to 410%.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노하이브리드는 탄성 계수가 0.5~2.5 MPa일 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the nanohybrid may have an elastic modulus of 0.5 to 2.5 MPa.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노하이브리드는 생분해성 고분자로 이루어진 나노섬유 또는 스캐폴드에 코팅될 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the nanohybrid may be coated on a nanofiber or scaffold made of a biodegradable polymer.
상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(polycaprolactones), 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트 The biodegradable polymers include polycaprolactones, polyglycolides, polylactides, polytrimethylenecarbonates, and polyhydroxybutyrates.
(polyhydroxybutyrates), 폴리히드록시발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(polyorthocarbonates), 옥살산염폴리알킬렌(polyalkyleneoxalates), 숙신산염폴리알킬렌(polyalkylenesuccinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성 단백질(modified proteins), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체(terpolymers), 이들의 혼합물(mixtures) 또는 이들의 중합체 혼합물(polymer blends)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.(polyhydroxybutyrates), polyhydroxyvalerates, polydioxanones, polyorthoesters, polycarbonates, polytyrosinecarbonates, polyorthocarbonates, oxalates polyalkyleneoxalates, polyalkylenesuccinates, poly(malic acid), poly(maleic anhydride), polypeptides, polydepsis Peptides, polyvinylalcohol, polyesteramides, polyamides, polyanhydrides, polyurethanes, polyphosphazenes, polycyanoacrylates polycyanoacrylates, polyfumarates, poly(amino acids), modified polysaccharides, modified proteins, copolymers thereof, and terpolymers thereof ), mixtures thereof, or one or more selected from the group consisting of polymer blends thereof, but is not limited thereto.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노하이브리드를 유효성분으로 포함하는 골재생용 조성물을 제공한다. According to another aspect of the present invention, a composition for bone regeneration comprising the nanohybrid as an active ingredient is provided.
본 발명의 나노하이브리드는 초기 새로운 뼈 재생 과정을 가속화하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었으며, 이는 골 복구 및 재생을 위한 이식 가능한 생체 재료용으로 사용되기에 특히 적합하다. The nanohybrid of the present invention has proven to be very effective in accelerating the initial new bone regeneration process, which makes it particularly suitable for use as an implantable biomaterial for bone repair and regeneration.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 나노하이브리드를 인간을 제외한 동물의 손상 골 조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a tissue regeneration method comprising the step of treating damaged bone tissue of an animal other than human with the nanohybrid.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 나노하이브리드의 제조 방법을 제공한다: (a) 키토산을 산성 용액에 녹인 후, 무기물 나노입자(IOC)를 첨가하고 혼합물을 균질화한 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 염기성 용액을 첨가하여 중화시키고 투석한 용액을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 투석된 용액을 몰드로 옮기고, 증발시켜 막 형태의 나노하이브리드 수득하는 단계. According to another aspect of the present invention, a method for preparing a nanohybrid comprising the following steps is provided: (a) dissolving chitosan in an acidic solution, adding inorganic nanoparticles (IOC) and homogenizing the mixture; manufacturing; (b) adding a basic solution to the product of step (a) to neutralize it and obtaining a dialyzed solution; and (c) transferring the dialyzed solution of step (b) to a mold and evaporating to obtain a nanohybrid in the form of a membrane.
상기 단계 (a)의 산성 용액은 아세트산 용액이고, 상기 단계 (b)의 염기성 용액은 암모니아 용액일 수 있다. The acidic solution of step (a) may be an acetic acid solution, and the basic solution of step (b) may be an ammonia solution.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)의 나노하이브리드는 0.01~1 wt% 젤라틴 용액으로 코팅하여 코팅 겔 층을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the nanohybrid of step (c) may further include forming a coating gel layer by coating with a 0.01 to 1 wt% gelatin solution.
상기 나노하이브리드는 코팅 겔 층을 더 포함하여 치료 잠재력을 향상시키기 위해 여러 약물을 이중 또는 삼중으로 로딩한 다음 제어된(순차적) 방식으로 다중 약물 전달을 위한 나노하이브리드를 제조할 수 있다. The nanohybrid may further include a coating gel layer to double or triple load multiple drugs to improve therapeutic potential, and then prepare a nanohybrid for multi-drug delivery in a controlled (sequential) manner.
보다 구체적으로, 이중 약물 전달을 위한 나노하이브리드는 제 1 약물 로딩을 위해 산성 Chit/HA 용액을 제 1 약물-함유 용액에서 균질화하고, 염기성 용액을 첨가하여 중화시키고 증류수로 투석한 후, 수득한 Chit@HA 수용액을 몰드로 옮기고, 증발시켜 수득한 제 1 약물이 로딩된 Chit@HA 나노하이브리드를 젤라틴 용액에서 제 2 약물를 포함하는 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하여 제조될 수 있다. 간략히 설명하면, 제 1 약물이 키토산 쉘(shell)에 로딩되고, 제 2 약물이 코팅 겔 층에 로딩되어 이중 약물 방출을 위한 약물 전달용 나노하이브리드를 제조할 수 있다. More specifically, the nanohybrid for dual drug delivery is obtained by homogenizing an acidic Chit/HA solution in a first drug-containing solution for first drug loading, neutralizing by adding a basic solution and dialysis with distilled water, and then obtaining Chit It can be prepared by transferring the @HA aqueous solution to a mold and fixing the Chit@HA nanohybrid loaded with the first drug obtained by evaporation with a glutaraldehyde solution containing the second drug in a gelatin solution. Briefly, a nanohybrid for drug delivery for dual drug release can be prepared by loading a first drug on a chitosan shell and loading a second drug on a coating gel layer.
또한, 삼중 약물 전달을 위한 나노하이브리드는 제 1 약물은 BGn의 메조포어에 로딩하기 위해, 에탄올에서 BGn으로 균질화하고, 산성 Chit/BGn 용액을 제 1 약물이 로딩된 BGn으로 균질화하고, 원심분리하여 상청액을 제거한다. 그 결과로 만들어진, 제 1 약물이 로딩된 산성 Chit/BGn 용액을 제 2 약물-함유 용액에서 균질화하고 염기성 용액을 첨가하여 중화시키고 증류수로 투석한 후, 수득한 이중 약물(제 1 약물 및 제 2 약물)이 로딩된 Chit@BGn 용액을 몰드로 옮기고, 증발시켜 수득한 나노하이브리드를 젤라틴 용액에서 제 3 약물을 포함하는 글루타르알데히드 용액으로 고정하여 제조될 수 있다. 간략히 설명하면, 제 1 약물이 무기물 나노입자 코어(core)에 로딩되고, 제 2 약물이 키토산 쉘(shell)에 로딩되고, 제 3 약물이 코팅 겔 층에 로딩되어 삼중 약물 방출을 위한 약물 전달용 나노하이브리드를 제조할 수 있다. In addition, the nanohybrid for triple drug delivery is homogenized with BGn in ethanol to load the first drug into the mesopore of BGn, homogenized the acidic Chit/BGn solution with BGn loaded with the first drug, and centrifuged to obtain Remove the supernatant. The resulting acidic Chit/BGn solution loaded with the first drug was homogenized in the second drug-containing solution, neutralized by adding a basic solution and dialyzed with distilled water, and the resulting double drug (first drug and second drug) drug) may be prepared by transferring the loaded Chit@BGn solution to a mold and fixing the nanohybrid obtained by evaporation with a glutaraldehyde solution containing a third drug in a gelatin solution. Briefly, the first drug is loaded on the inorganic nanoparticle core, the second drug is loaded on the chitosan shell, and the third drug is loaded on the coating gel layer for drug delivery for triple drug release. Nanohybrids can be prepared.
본 발명은 무기물 나노입자 코어(core)와 키토산 쉘(shell)로 구성된 나노 단위의 자기조립(self-assembled) 나노하이브리드(Chit@IOC)로서, 초고함량의 무기질, 형상-성형성, 고탄력성, 나노-거칠기 표면, 다중 치료제 전달 및 골재생 능을 포함한 다기능의 고유 특성을 갖는 나노하이브리드 및 이의 제조 방법을 제공한다. The present invention is a nano-unit self-assembled nanohybrid (Chit@IOC) composed of an inorganic nanoparticle core and a chitosan shell, which has ultra-high content of inorganic matter, shape-formability, high elasticity, Provided are a nanohybrid having multi-functional unique properties including nano-roughness surface, multi-therapeutic delivery and bone regeneration ability, and a manufacturing method thereof.
도 1은 키토산과 무기산화물 나노입자(IOC)로 구성된 자기조립 나노하이브리드의 제조과정 및 일반적인 특성을 나타낸 것이다. (a)는 Chit@IOC 코어-쉘 나노단위로부터 자기조립된 나노하이브리드의 제조과정을 나타내는 개략도이다. (b)는 다른 IOC(하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 생활성 유리 및 메조다공성 실리카) 조성물을 포함한 Chit@IOC의 TEM 및 SEM 이미지를 나타낸 것이다. (c)는 5~19 nm 범위로 측정된 쉘 두께(Chit@HA이 대표적으로 제시됨)를 나타낸 것이다. (d)는 본 발명의 Chit@IOC 나노하이브리드(Chit@MSN이 대표적으로 제시됨)의 기계적 특징을 나타낸 것이다; 신축성이 있고, 접을 수 있고, 천공 가능하고, 봉합 가능하며, 외과적 치료가 필요한 이식 가능한 생체 재료, 즉 외과용 생체 재료로 활용 가능함을 보여주는 것이다. (e)는 생체 재료(Chit@MSN 및 Chit@BGn이 섬유 및 스캐폴드 코팅에 대해 각각 대표적으로 제시됨)의 표면 나노구조 및 조성물의 특성을 변경하기 위해 제어된 내용물에서의 3D 섬유 및 다공성 스캐폴드와 같은 복합적인 형상의 재료에 얇은 코팅층을 형성한 Chit@IOC의 잠재력을 나타낸 것이다.
도 2는 나노하이브리드의 물리화학적 및 기계적 특성을 나타낸 것이다(Chit@BGn이 대표적으로 제시됨). (a)는 나노하이브리드의 FESEM 및 AFM 표면 이미지로서, Chit@BGn의 경우 35.26nm이고, 순수 Chit의 경우 6.25nm의 거칠기 값을 가져, ~6배 차이를 보이는 고도로 거칠어진 나노지형학적 표면을 보여주는 것이다. (b)는 협폭 규모로 스캔한 XPS로서 자기조립 나노하이브리드 Chit@BGn이 순수 키토산(O 1s 및 N 1s의 경우) 및 순수 BGn (Ca 2p and Si 2p의 경우)에 비해 더 낮은 값으로 결합 에너지(0.5-1.7 eV만큼)가 명확하게 이동함을 보여준다. 이는 BGn의 전자 빈약/풍부한 이온과 Chit의 고극성 작용기 사이에 새로 형성된 화학적 상호작용을 나타낸다. (c)는 습윤 상태에서 나노하이브리드의 정적 인장 기계적 거동을 응력-변형률 곡선으로 표시한 것이다. 삽입된 이미지는 테스트 샘플의 전형적인 이미지로, 매우 신장된 나노하이브리드 대비 치명적으로 파손된 기존 복합체를 나타낸다. 기존 복합체의 응력-변형률 곡선도 비교된다(Chit@BGn 및 Chit + BGn 그래프의 응력 및 변형률 척도의 현저한 차이 참조). (d)는 Chit@BGn 나노하이브리드의 인장 강도 및 탄성 계수를 나타낸 것으로, 기존 복합체와 100배 차이가 나는 것을 보여준다(기존 복합체의 강도는 녹색 삼각형 기호로 표시됨). (e)는 나노하이브리드의 연신율을 나타낸 것으로, 403%(10%BGn의 경우)에서 74%(90%BGn의 경우) 범위로, 해당 BGn 함량(녹색 삼각형 기호로 표시됨)에서 기존 복합체(연신율 ~34-40%)보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. (f)는 주기적 인장 하중 조건(30 주기, 10% 변형률, 5MPa/min)에서 나노하이브리드(Chit@BGn50이 대표적으로 제시됨)의 동적 기계적 거동을 나타낸 것이다; 하중 30 주기 동안 몇 초 이내에 완전히 회복되는 연속적인 탄성 거동은 주기적 인장 하중 하에서 파손에 저항하는 나노하이브리드의 탁월한 유연성을 보여주며, 이는 외과적 핸들링 및 동적 힘 조건 하에서의 장기간 임상 적응을 통해 이식 가능한 생체 재료로서의 활용 가능성을 의미한다.
도 3은 나노하이브리드의 줄기세포 활성화와 초기 골형성을 나타낸 것이다. (a)는 나노하이브리드의 나노-지형(nano-topography) 표면에 의한 MSCs의 활성화를 보여주는 개략도이다. (b)는 액틴(적색)과 핵(청색)이 염색된 초기(4시간) 세포 부착 이미지를 나타낸 것이다. (c)는 세포 부착 면적 및 부착 세포 수에 대해서 정량분석을 한 것이다. 순수 Chit에 비해 Chit@HA70에서 초기 세포 부착 면적 및 부착 세포 수가 크게 증가한다(n = 8, *P < 0.05). (d)는 부착- 및 세포역학적신호전달 관련 유전자 발현을 나타내는 qPCR 어레이를 나타낸 것이다. Chit@HA70은 Chit에 비해 인테그린 세트(인테그린 α1, α 2, β3) 및 국소 부착 단백질(탈린 및 단백질 티로신 키나아제 2)의 유전자 발현을 상향 조절하여 초기 세포 부착을 증가시킬 수 있다(n = 3 , *P < 0.05). (e 및 f)는 알칼리성 포스파타제(ALP) 유전자 발현(n = 3, **P < 0.01) 및 효소량(n = 3, *P < 0.05)에 의해 측정된 14일째의 시험관 내 골형성을 나타낸 것이다. (g)는 랫트 두개관 결함 모델를 이용한 생체 내 실험 디자인을 나타낸 것이다. Chit@HA50 및 Chit@HA70은 대표적인 나노하이브리드 그룹으로 테스트되었다. (h)는 랫트 두개관 조직에 5주 동안 이식된 조직 샘플의 μCT 이미지로서, 분홍색으로 강조 표시된 새로운 뼈의 대표적인 3D 이미지를 나타낸 것이다(NB = 새로운 뼈, OB = 오래된 뼈). (i)는 새로 형성된 뼈의 골 부피 및 표면적 대해서 μCT 기반 정량 분석을 나타낸 것이다(Chit 대비 Chit@HA70에서 상당히 높은 수준으로 확인됨, *p < 0.05, n = 5). (j)는 조직 샘플의 H&E 염색 이미지이며, 검은색 화살표는 결함 영역의 가장자리를 나타내고, 오래된 뼈와 새로운 뼈 사이의 경계는 노란색 점선으로 표시된다. (j)는 새로운 뼈 영역의 결함 부위에 있는 조골세포에 대해 나타낸 것으로, 조골세포 수는 Chit 대비 Chit@HA에서 훨씬 더 높은 것으로 나타났다(n = 5, *P < 0.05, **P < 0.01). (k)는 면역조직화학 염색에 의해 분석된 조직 샘플에서의 ALP(적색) 및 BSP(녹색)의 발현을 나타낸 것이다. 노란색 선은 경조직의 가장자리를 나타낸다(n = 5, *P < 0.05, **P < 0.01). 새로운 뼈(NB), 오래된 뼈(OB), 조골세포(*), 파골세포(화살표). 표시되지 않은 경우, 눈금 막대는 200 μm이다.
도 4는 나노하이브리드로부터의 다중 치료 분자의 제어된 방출을 나타낸 것이다. (a)는 다중 치료제 전달 시스템을 보여주는 개략도이다. 두 개 및 세 개의 서로 다른 분자(분자 I, II 및 III)를 추가 코팅층(여기서 젤라틴 '젤'을 사용함)이 있는 코어-쉘 구조의 나노스피어에 로딩하는 것을 개략적으로 나타낸 것이다. 두 개의 서로 다른 분자가 Gel(III) 및 Chit@IOC 쉘(II)에서 분할되는 동안 메조다공성 유형의 IOC('MSN 또는 BGn', I)를 사용하여 Chit@IOC 코어에 하나 이상의 분자를 로딩할 수도 있다. (b)는 Chit@HA50-Gel의 순차적 이중-치료제의 방출 프로필을 나타낸 것이다. 가장 바깥쪽 Gel 층에 있는 독소루비신 'DOX'(약물 III)가 먼저 방출되는 반면, 파클리탁셀 'PTX'(약물 II)는 HA 코어의 Chit 쉘 내부에 갇혔다가 5일 후에 방출되는 것으로 나타났다. (c)는 Chit@BGn50-Gel로부터의 삼중 순차적 방출을 나타낸 것이다; 덱사메타손 'Dex'(약물 III)가 젤 층에서 먼저 방출된 다음 섬유아세포 성장 인자 2 'FGF2'(약물 II)가 Chit 쉘에서 방출되고, 마지막으로 BGn 코어의 메조포어에서 phenamil 'Phe'(약물 I)이 방출된다. (d)는 가장 안쪽의 비분해성 메조다공성 코어에 배치된 Phe(약물 I)의 방출 속도에 대한 제어로, Chit 쉘 두께(Chit@MSN 조성물)에 대한 의존성을 보여주는 것이다.
도 5는 골재생을 위한 삼중-분자(Chit@BGn70+Tri)가 로딩된 나노하이브리드 스캐폴드의 치료 효능을 나타낸 것이다. (a)는 항염증, 혈관신생 촉진 및 골형성 각각을 위해 삼중-분자 덱사메타손(Dex), FGF2 및 페나밀(Phe)의 시간 의존적인 순차적 방출을 나타내는 개략도이다. (b)는 가장 바깥쪽 층에서 빠르게 방출되는 약물 Dex에 의해 활성화된 대식세포 세포주(RAW264.7)에서 입증된 Chit@BGn70+Tri의 항염증 효과를 나타낸 것이다. LPS에 의해 염증유발된 RAW264.7 세포를 Chit@BGn70+Tri 추출물을 4시간 동안 처리할 경우 염증유발 유전자(IL-1β의 발현이 유의하게 하향 조절되고 Chit@BGn70보다 감소된 수준의 NO를 방출하였다(n = 4, P < 0.05). (c)는 키토산 층에서 방출된 FGF에 의한 인간 내피 세포주(HUVEC)에 대한 Chit@BGn + Tri의 혈관신생 촉진 효과를 나타낸 것이다. 12시간 동안 Chit@BGn70+Tri의 추출물을 Matrigel 코팅된 기판상의 HUVEC에 처리하였다. 관 형성(원 및 마디 수)는 Chit@BGn70(혈관신생 실리케이트 이온으로 인해)에서 크게 향상되었고 FGF 방출로 인해 Chit@BGn70+Tri에서 더욱 가속화되었다(n = 4, P < 0.05). (d 및 e)는 Chit@BGn70+Tri에 의해 자극된 MSCs의 골분화를 나타낸 것이다. Chit@BGn+Tri에서의 골형성 약물 Phe의 방출은 4일째(d)에 알칼리성 포스파타제 활성을 증가시키고 7일째(e)에 OCN 유전자 발현을 상향 조절하는데 효과적인 것으로 나타났다(n = 4, P < 0.05). (f)는 나노하이브리드 코팅된 3D-프린팅된 PCL 스캐폴드를 최대 12주 동안 투여되는 랫트 두개관 결함 모델에서의 생체 내 실험디자인을 나타낸 것이다. (g)는 12주째에 대표적으로 제시된, 결함 영역 내에서 μCT로 분석한 새로운 뼈 형성(녹색)을 나타낸 것이다. (h)는 골 부피(BV) 및 표면적(BS) 측면에서의 μCT 구성 이미지의 정량화를 나타낸 것이다. 약물이 없는 Chit@BGn70 스캐폴드보다 Chit@BGn70+Tri 스캐폴드에서 훨씬 더 높은 수준을 나타내었다(n = 5, **P < 0.01, ***<0.001).1 shows a manufacturing process and general characteristics of a self-assembled nanohybrid composed of chitosan and inorganic oxide nanoparticles (IOC). (a) is a schematic diagram showing the manufacturing process of self-assembled nanohybrids from Chit@IOC core-shell nanounits. (b) shows TEM and SEM images of Chit@IOC with different IOC (hydroxyapatite, bioactive glass and mesoporous silica) compositions. (c) shows the measured shell thickness in the range of 5 to 19 nm (Chit@HA is representatively presented). (d) shows the mechanical characteristics of the Chit@IOC nanohybrid of the present invention (Chit@MSN is representatively presented); It shows that it can be used as a biomaterial that is flexible, foldable, punctureable, sutureable, and transplantable that requires surgical treatment, that is, a biomaterial for surgery. (e) shows 3D fibers and porous scaffolds in controlled content to alter the properties of the surface nanostructure and composition of biomaterials (Chit@MSN and Chit@BGn are presented representatively for fibers and scaffold coatings, respectively). It shows the potential of Chit@IOC, which forms a thin coating layer on a material with a complex shape, such as
Figure 2 shows the physicochemical and mechanical properties of the nanohybrid (Chit@BGn is presented as a representative). (a) FESEM and AFM surface images of nanohybrids, showing highly roughened nanotopographic surfaces with roughness values of 35.26 nm for Chit@BGn and 6.25 nm for pure Chit, showing a ~6-fold difference. will be. (b) is XPS scan at narrow scale, showing lower binding energies of the self-assembled nanohybrid Chit@BGn compared to pure chitosan (for O 1s and N 1s) and pure BGn (for
Figure 3 shows the stem cell activation and early bone formation of the nanohybrid. (a) is a schematic diagram showing the activation of MSCs by the nano-topography surface of the nanohybrid. (b) shows the initial (4 hours) cell attachment image in which actin (red) and nucleus (blue) were stained. (c) is a quantitative analysis of the cell attachment area and the number of attached cells. Compared to pure Chit, the initial cell adhesion area and the number of adherent cells increased significantly in Chit@HA70 (n = 8, *P < 0.05). (d) shows a qPCR array showing adhesion- and cytomechanical signaling-related gene expression. Compared to Chit, Chit@HA70 can increase early cell adhesion by upregulating gene expression of a set of integrins (integrins α1, α2, β3) and focal adhesion proteins (talin and protein tyrosine kinase 2) (n = 3, *P < 0.05). (e and f) show in vitro bone formation at
Figure 4 shows the controlled release of multiple therapeutic molecules from nanohybrids. (a) is a schematic diagram showing a multi-therapeutic delivery system. Schematic representation of the loading of two and three different molecules (molecules I, II and III) into core-shell structured nanospheres with an additional coating layer (here a gelatin 'gel' is used). A mesoporous type of IOC ('MSN or BGn', I) can be used to load one or more molecules into the Chit@IOC core while two different molecules are partitioned in the Gel (III) and Chit@IOC shell (II). may be (b) shows the release profile of sequential dual-therapeutics of Chit@HA50-Gel. It was found that doxorubicin 'DOX' (drug III) in the outermost gel layer was released first, while paclitaxel 'PTX' (drug II) was trapped inside the Chit shell of the HA core and released after 5 days. (c) shows triple sequential release from Chit@BGn50-Gel; Dexamethasone ‘Dex’ (Drug III) was first released from the gel layer, then fibroblast growth factor 2 ‘FGF2’ (Drug II) was released from the Chit shell, and finally phenamil ‘Phe’ (Drug I) was released from the mesopores of the BGn core. ) is released. (d) is a control for the release rate of Phe (drug I) disposed in the innermost non-degradable mesoporous core, showing its dependence on the Chit shell thickness (Chit@MSN composition).
5 shows the therapeutic efficacy of the nanohybrid scaffold loaded with the triple-molecule (Chit@BGn70+Tri) for bone regeneration. (a) is a schematic diagram showing the time-dependent sequential release of the triple-molecular dexamethasone (Dex), FGF2 and phenamyl (Phe) for anti-inflammatory, angiogenic and osteogenesis, respectively. (b) shows the anti-inflammatory effect of Chit@BGn70+Tri demonstrated in a macrophage cell line (RAW264.7) activated by the rapidly released drug Dex from the outermost layer. When RAW264.7 cells inflamed by LPS were treated with Chit@BGn70+Tri extract for 4 hours, the expression of an inflammatory gene (IL-1β) was significantly down-regulated and a lower level of NO was released than Chit@BGn70. (n = 4, P < 0.05) (c) shows the angiogenesis-promoting effect of Chit@BGn + Tri on human endothelial cell line (HUVEC) by FGF released from the chitosan layer. Extracts of BGn70+Tri were treated on HUVECs on Matrigel-coated substrates: tube formation (number of circles and nodules) was greatly enhanced in Chit@BGn70 (due to angiogenic silicate ions) and in Chit@BGn70+Tri due to FGF release. (n = 4, P < 0.05) (d and e) show the osteogenic differentiation of MSCs stimulated by Chit@BGn70+Tri. The release of the osteogenic drug Phe from Chit@BGn+Tri It was shown to be effective in increasing alkaline phosphatase activity on day 4 (d) and upregulating OCN gene expression on day 7 (e) (n = 4, P < 0.05) (f) is a nanohybrid coated 3D-printed In vivo experimental design in a rat calvarial defect model in which PCL scaffolds are administered for up to 12 weeks (g) shows new bone formation analyzed by μCT within the defect area (green), representatively shown at
실시예Example
실험 재료 및 방법Experimental Materials and Methods
1. 재료1. Materials
하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite(HA) > 90 순도, 113 nm 평균 크기) 및 키토산(Chit, 분자량 190,000-310,000 Da, 탈아세틸화 정도: 75-85%)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했고, 메조다공성 실리카 나노입자(MSN, ~100 nm 크기) 및 생활성 유리 나노입자(BGn, ~50 nm 크기)는 이전 문헌(Baek, S. et al., Nanoscale,7 (2015) 14191-14216; Lee, J. H. et al., PloS One 11 (2016), e0150727)에 개시된 방법에 따라 준비되었다.Hydroxyapatite (HA) > 90 purity, 113 nm average size) and chitosan (Chit, molecular weight 190,000-310,000 Da, degree of deacetylation: 75-85%) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). ), and mesoporous silica nanoparticles (MSN, ~100 nm size) and bioactive glass nanoparticles (BGn, ~50 nm size) were previously described (Baek, S. et al., Nanoscale,7 (2015)). 14191-14216; Lee, J. H. et al., PloS One 11 (2016), e0150727).
2. 나노하이브리드 Chit@IOC의 제조2. Fabrication of nanohybrid Chit@IOC
2-1. 나노하이브리드 입자 제조 2-1. Manufacturing nanohybrid particles
Chit@IOC 나노하이브리드는 개별 무기물 나노입자 코어(HA, MSN 또는 BGn) 및 얇은 키토산(Chit) 쉘로 구성된다. 나노하이브리드 입자는 다음과 같이 Chit/IOC(inorganic nanoparticle, 무기물 나노입자) 의 다른 중량비로 제조하였다. 먼저 Chit(360, 280, 200, 120 및 40 mg)을 1 M 아세트산 용액 50mL에 녹인 후, 40, 120, 200, 280 및 360 mg의 무기물 성분을 각 Chit에 첨가하고 혼합물을 균질화기(NanoDeBee 45-3, Bee International)를 사용하여 균질화하여 산성 Chit@IOC 용액을 제조하였다. 그런 다음, 산성 Chit@IOC 용액을 1 M 암모니아 용액을 첨가하여 천천히 중화시키고, 증류수에서 2일 동안 투석(분자량 컷오프 12k-14kDa, Spectrum Laboratories, Savannah, USA)하여 작은 분자를 제거하고, 무기 부산물을 포함시킨다. 수득한 수성 Chit@IOC 용액을 테플론(Teflon) 몰드로 옮기고, 용매를 주변 조건에서 증발시켜 얇은 막 형태(Chit@BGn10, Chit@BGn30, Chit@BGn50, Chit@BGn70 및 Chit@BGn90)로 견고하고 흰색의 탄성 나노하이브리드를 생성한다. 그 형상도 별, 꽃, 원형 등 테프론 몰드의 형상을 변경하는 것만으로 원하는 대로 조정했다. 남아있는 불순물을 제거하기 위해 나노하이브리드를 증류된 탈이온수에 담가 밤새 흔들어 준 후 철처히 세척하였다.The Chit@IOC nanohybrid consists of an individual inorganic nanoparticle core (HA, MSN or BGn) and a thin chitosan (Chit) shell. Nanohybrid particles were prepared with different weight ratios of Chit/IOC (inorganic nanoparticle, inorganic nanoparticle) as follows. First, Chit (360, 280, 200, 120 and 40 mg) was dissolved in 50 mL of 1 M acetic acid solution, then 40, 120, 200, 280 and 360 mg of inorganic components were added to each Chit and the mixture was homogenized (NanoDeBee 45 -3, Bee International) to prepare an acidic Chit@IOC solution. Then, the acidic Chit@IOC solution was slowly neutralized by adding 1 M ammonia solution and dialyzed in distilled water for 2 days (molecular weight cutoff 12k-14kDa, Spectrum Laboratories, Savannah, USA) to remove small molecules and inorganic by-products. include The obtained aqueous Chit@IOC solution was transferred to a Teflon mold, and the solvent was evaporated at ambient conditions to form a solid and thin film (Chit@BGn10, Chit@BGn30, Chit@BGn50, Chit@BGn70 and Chit@BGn90). Generates white elastic nanohybrids. The shape was also adjusted as desired by simply changing the shape of the Teflon mold, such as a star, flower, or circle. To remove remaining impurities, the nanohybrid was soaked in distilled deionized water and shaken overnight, followed by thorough washing.
2-2. 복잡한 형상의 생체 재료에서의 나노하이브리드 코팅2-2. Nanohybrid coating on complex biomaterials
Chit@IOC의 코팅을 위해 나노섬유와 발포체 스캐폴드가 준비되었다. Nanofibers and foam scaffolds were prepared for coating of Chit@IOC.
첫째, 폴리(카프로락톤)(PCL; MW = 80,000, Sigma-Aldrich) 나노섬유 매트릭스는 1,2-디클로로에탄/메탄올에 용해된 12% PCL 용액의 전기방사에 의해 제조되었다. 21 게이지 바늘(21-gauge needle), 금속 수집기 및 고전압 전원 공급 장치가 장착된 주사기를 설정했다(15kV, 10cm 거리, 0.5mL/h의 주입 속도).First, a poly(caprolactone) (PCL; MW = 80,000, Sigma-Aldrich) nanofibrous matrix was prepared by electrospinning of a 12% PCL solution dissolved in 1,2-dichloroethane/methanol. A syringe equipped with a 21-gauge needle, metal collector, and high voltage power supply was set up (15 kV, 10 cm distance, injection rate of 0.5 mL/h).
발포체 스캐폴드 제조의 경우 염침출법(salt-leaching method)이 사용되었다. 폴리우레탄-PCL 혼합물(1:1)을 클로로포름에서 20%(wt/v)로 용해시킨 후 NaCl 입자(크기: 200-500 μm)로 채워진 원통형 테프론 몰드에 추가하여 -20°C에서 1일 동안 동결되었다. 동결건조 후 NaCl 입자를 2일 동안 증류수에서 침출시켰다. 코팅의 친수성을 높이기 위해 나노섬유 메쉬를 1 N NaOH로 1시간 동안 처리하고 발포체 스캐폴드를 Ar(99.9%) 플라즈마 가스(Plasma pipette, Femtoscience, Korea)에서 1분간 처리되었다. 밤새 진공 처리한 후, 샘플을 실온에서 Chit@IOC 나노입자 용액에 침지시켰다. 코팅 두께는 용액의 농도(0.5-5 mg/mL)와 침지 시간(5-120분)을 변경하여 제어할 수 있었다.In the case of foam scaffold preparation, a salt-leaching method was used. A polyurethane-PCL mixture (1:1) was dissolved at 20% (wt/v) in chloroform and then added to a cylindrical Teflon mold filled with NaCl particles (size: 200–500 μm) at -20 °C for 1 day. Frozen. After lyophilization, the NaCl particles were leached in distilled water for 2 days. To increase the hydrophilicity of the coating, the nanofibrous mesh was treated with 1 N NaOH for 1 hour, and the foam scaffold was treated with Ar (99.9%) plasma gas (Plasma pipette, Femtoscience, Korea) for 1 minute. After being vacuumed overnight, the samples were immersed in the Chit@IOC nanoparticle solution at room temperature. The coating thickness could be controlled by varying the concentration of the solution (0.5–5 mg/mL) and the soaking time (5–120 min).
3. 나노하이브리드의 특성3. Characteristics of nanohybrid
제조된 Chit@IOC 나노입자 및 이들의 벌크 나노하이브리드의 형태학적 및 물리화학적 특성을 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy(TEM), JEM 3010, JEOL, Japan), 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, JEOL 및 HITACHI S-3000H, 일본), 원자력 현미경(AFM, SPM-9700, SHIMADZU, 일본) 및 푸리에 사용 변환 적외선 분광법(FTIR; JASCO 470 PLUS, Easton, USA)을 사용하여 조사하였다.The morphological and physicochemical properties of the prepared Chit@IOC nanoparticles and their bulk nanohybrids were examined by transmission electron microscopy (TEM) (JEM 3010, JEOL, Japan), field emission scanning electron microscopy (FE-SEM, JEOL and HITACHI S-3000H, Japan), atomic force microscopy (AFM, SPM-9700, SHIMADZU, Japan) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR; JASCO 470 PLUS, Easton, USA) were used for investigation.
젖은 상태에서 나노입자의 ζ-전위는 Zeta Sizer(ZS90, Malvern, UK)로 측정하였다. TEM 분석을 위해, 샘플을 DW에 분산시키고, 나노입자 분산액의 한 방울을 구리 그리드에 떨어뜨리고 공기 건조시켰다. FE-SEM 분석을 위해 샘플을 ~10 nm의 Pt로 스퍼터 코팅하였다. 적외선 스펙트럼은 4 cm-1의 해상도에서 400-4000 cm-1 범위의 고체상의 샘플로부터 기록되었다. 열중량 분석(TGA)은 공기 중에서 25~900℃ 범위의 온도에서 10℃/min의 가열 속도로 4 mg의 샘플을 사용하여 수행되었다. X-선 광전자 스펙트럼은 모노크롬산화된(monochromatized) 알루미늄 K 양극(350W, 25mA)이 있는 PHI 5800 ESCA 시스템(XPS, Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 기록되었다. 나노입자 상은 X-선 회절(XRD; Ultima IV, Rigaku, Japan)에 의해 확인되었다. 이온 방출 테스트를 위해 샘플을 PBS (50 mg)에 담그고, 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법(ICP-AES; OPTIMA 4300DV)에 의한 분석을 위해 그 상등액을 수집했다.The ζ-potential of the nanoparticles in the wet state was measured with a Zeta Sizer (ZS90, Malvern, UK). For TEM analysis, the sample was dispersed in DW, and a drop of the nanoparticle dispersion was dropped onto a copper grid and allowed to air dry. Samples were sputter coated with ~10 nm of Pt for FE-SEM analysis. Infrared spectra were recorded from solid phase samples in the range of 400-4000 cm -1 at a resolution of 4 cm -1 . Thermogravimetric analysis (TGA) was performed using a 4 mg sample in air at temperatures ranging from 25 to 900 °C at a heating rate of 10 °C/min. X-ray photoelectron spectra were recorded using a PHI 5800 ESCA system (XPS, Thermo Fisher Scientific, USA) with a monochromatized aluminum K anode (350 W, 25 mA). The nanoparticle phase was confirmed by X-ray diffraction (XRD; Ultima IV, Rigaku, Japan). Samples were immersed in PBS (50 mg) for ion release testing, and the supernatant was collected for analysis by inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES; OPTIMA 4300DV).
4. 정적 및 동적 기계적 테스트4. Static and Dynamic Mechanical Testing
나노하이브리드의 인장 기계적 특성은 건조하고 습한 조건에서 테스트되었다. 샘플은 얇은 막 형태(10 mm × 5 mm × 0.21 ± 0.016 mm의 치수)로 준비되었다. 샘플의 두께는 0.01 mm의 해상도에서 버니어 캘리퍼(Vernier caliper)를 사용하여 측정되었다. 각 샘플에 정적 인장 하중을 가했다. 기록된 응력-변형률 곡선을 기반으로 탄성 계수, 최대 인장 강도 및 연신율을 평가하였다. 6개의 샘플을 테스트하고 그 평균값을 기록했다. 주기적인 인장 하중도 10%의 연신율로 30주기 동안 각 샘플에 적용되었다.The tensile mechanical properties of the nanohybrids were tested under dry and wet conditions. Samples were prepared in the form of thin films (dimensions of 10 mm × 5 mm × 0.21 ± 0.016 mm). The thickness of the sample was measured using a Vernier caliper at a resolution of 0.01 mm. A static tensile load was applied to each sample. Based on the recorded stress-strain curves, the elastic modulus, ultimate tensile strength and elongation were evaluated. Six samples were tested and the average value was recorded. A cyclic tensile load was also applied to each sample for 30 cycles at an elongation of 10%.
5. 다중 약물 전달을 위한 나노하이브리드 설계5. Nanohybrid design for multiple drug delivery
나노하이브리드는 여러 약물을 로딩하도록 설계되었다. 먼저, 파클리탁셀(PTX, 삼양바이오팜)과 독소루비신(DOX, 염산염 형태, TCI)이 이중 약물 로딩을 위해 선택되었다. PTX 로딩을 위해 산성 Chit/HA 용액을 PTX 함유 용액에서 균질화했다. 1 M 암모니아 용액을 첨가하여 용액을 천천히 중화시킨 후 증류수로 2일 동안 투석하였다. 수득한 Chit@HA 수용액을 테프론 몰드로 옮기고, 용매는 주변 조건에서 증발되었다. 수득한 PTX가 로딩된 Chit@HA 나노하이브리드를 0.1 wt% 젤라틴 용액(30분, pH 6)에서 DOX 약물를 포함하는 0.1 wt% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 잔류 불순물을 제거하기 위해 샘플을 증류수에 담가 밤새 약하게 흔들어 주었다.Nanohybrids are designed to load multiple drugs. First, paclitaxel (PTX, Samyang Biopharm) and doxorubicin (DOX, hydrochloride form, TCI) were selected for dual drug loading. For PTX loading, the acidic Chit/HA solution was homogenized in the PTX containing solution. After slowly neutralizing the solution by adding 1 M ammonia solution, it was dialyzed with distilled water for 2 days. The obtained Chit@HA aqueous solution was transferred to a Teflon mold and the solvent was evaporated at ambient conditions. The obtained PTX-loaded Chit@HA nanohybrid was fixed with a 0.1 wt% glutaraldehyde solution containing DOX drug in a 0.1 wt% gelatin solution (30 min, pH 6). To remove residual impurities, the samples were immersed in distilled water and gently shaken overnight.
다음으로, Phenamil(Phe), FGF2 및 덱사메타손(Dex)으로 삼중 약물 전달 시스템을 설계하였다. 이를 위해, BGn을 코어 무기 입자로 사용하였다. Phe(Sigma)는 우선 BGn의 메조포어에 로딩하기 위해 에탄올에서 BGn으로 균질화되었고, 산성 Chit/BGn 용액을 Phe-로딩된 BGn으로 균질화하고, 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 그 결과로 만들어진, Phe-로딩된 산성 Chit/BGn 용액을 또 다른 분자인 FGF2(GFP-conjugated, Sigma)-함유 용액에서 균질화하고 1 M 암모니아 용액을 첨가하여 천천히 중화시킨 후 증류수로 2일 동안 투석하였다. 수득한 이중 약물(Phe 및 FGF2)이 로딩된 Chit@BGn 용액을 테플론 몰드로 옮기고, 용매를 주위 조건에서 증발되도록 하였다. 수득한 나노하이브리드를 0.1 wt% 젤라틴 용액(30분, pH 6)에 3번째 분자 Dex(21-phosphate disodium form, Sigma)를 포함하는 0.1 wt% 글루타르알데히드 용액으로 고정하였다. 잔류 불순물을 제거하기 위해 샘플을 증류수에 담가 밤새 약하게 흔들어 주었다. Phe가 로딩된 Chit@MSN 나노하이브리드의 경우, 다양한 조성(다양한 Chit 쉘 두께로)을 사용하여 Phe의 쉘 두께 의존 방출을 조사하였다.Next, a triple drug delivery system was designed with Phenamil (Phe), FGF2 and dexamethasone (Dex). For this purpose, BGn was used as the core inorganic particle. Phe (Sigma) was first homogenized with BGn in ethanol for loading into the mesopores of BGn, the acidic Chit/BGn solution was homogenized with Phe-loaded BGn, and centrifuged at 10,000 rpm for 5 min to remove the supernatant. The resulting Phe-loaded acidic Chit/BGn solution was homogenized in a solution containing another molecule, FGF2 (GFP-conjugated, Sigma)-, neutralized slowly by the addition of 1 M ammonia solution, and then dialyzed with distilled water for 2 days. did The obtained dual drug (Phe and FGF2) loaded Chit@BGn solution was transferred to a Teflon mold and the solvent was allowed to evaporate at ambient conditions. The obtained nanohybrid was fixed with a 0.1 wt% glutaraldehyde solution containing the third molecule Dex (21-phosphate disodium form, Sigma) in a 0.1 wt% gelatin solution (30 min, pH 6). To remove residual impurities, the samples were immersed in distilled water and gently shaken overnight. For the Phe-loaded Chit@MSN nanohybrids, the shell thickness dependent release of Phe was investigated using different compositions (with different Chit shell thicknesses).
6. 약물량 분석6. Drug dose analysis
검체에서 로딩 및 방출되는 약물(또는 염료)의 양(1.25 cm2/mL)는 직경 4 μm 및 크기 4.6 mm × 150 mm의 스테인리스강 ET-RP1 4D(Shodex, Tokyo, Japan) 분석 컬럼를 이용한 HPLC (LC20A Series, Shimadzu, Kyoto, Japan)와 UV-vis 분광광도계(Evolution 300, Thermo Fisher, USA)에 의해 측정되었다. HPLC 분리는 1 mL/min의 유속으로 수행되었으며, 이동상으로 아세토니트릴/물(50/50(v/v))을 사용하고, PTX의 농도는 210 nm의 파장에서 모니터링되었다. UV-vis 분광법을 사용하여 PBS에서 243 nm, 480 nm 및 DMSO에서 368 nm에서 Dex, DOX 및 Phe의 농도를 각각 결정하였다. 형광 분광법을 사용하여 에탄올에서 538 nm에서 FGF2의 농도(GFP 강도에 의해)를 결정하였다. 간략히 설명하면, 수득한 모든 약물(또는 염료) 관련 샘플을 동결 건조에 의해 분말화한 다음, 적절한 용매에 용해시키고 준비된 용액을 주사기 필터(PTFE 멤브레인, 0.20 μm)를 사용하여 샘플 바이알로 옮기고 약물(또는 염료)의 농도는 검량선(calibration curve)을 기반으로 결정되었다.The amount of drug (or dye) loaded and released from the sample (1.25 cm 2 /mL) was measured by HPLC ( LC20A Series, Shimadzu, Kyoto, Japan) and UV-vis spectrophotometer (
7. 중간엽줄기세포 부착 및 증식7. Mesenchymal stem cell attachment and proliferation
랫트의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells (MSCs))는 이전에 보고된 프로토콜에 따라 대퇴골 및 경골에 있는 5주령 수컷 랫트의 골수에서 채취하였다. 상기 MSCs는 계대 5(passage 5)까지 사용되었다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 맞게 제작된 각 표본에 총 80,000개의 세포를 씨딩(seeding)하여 배양하였다(4시간 ~ 7일). 초기 부착 4시간 후, 추가 배양 전에 비부착 세포를 제거하였다. 세포는 10% 소태아혈청(FBS, Gibco, Wal tham, MA, USA)과 1% P/S(Gibco)를 함유하는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 37℃/5% CO2의 습한 분위기에서 배양되었다. 초기 세포 부착 수준(4시간 및 24시간)을 정량화하기 위해 샘플(n = 8)을 4% PFA로 고정한 다음, 핵의 경우 DAPI(파란색, Thermo Fisher, USA)로, α-액틴의 경우 팔로이딘(적색, Thermo Fisher)으로 제조사의 프로토콜에 따라 염색하였고, 형광현미경(CelenaS, Logos Biosystems, 경기도 안양시, 대한민국)으로 촬영한 디지털 이미지를 ImageJ((NIH, USA, ver. 1.52a, n = 8)로 정량화하였다. Rat mesenchymal stem cells (MSCs) were harvested from the bone marrow of 5-week-old male rats from the femur and tibia according to a previously reported protocol. The MSCs were used until
MSC 증식 수준은 MTS assay(Promega, Madison, WI, USA)로 조사하였다. 간략히 설명하면, 각 배양 샘플(n = 5)에 대해 20 μL의 MTS 용액을 200 μL의 보충된 배양 배지에 첨가하고 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 흡광도(490 nm에서)는 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax M2e, Molecular Devices)를 사용하여 측정되었다.The MSC proliferation level was examined by MTS assay (Promega, Madison, WI, USA). Briefly, for each culture sample (n = 5), 20 μL of MTS solution was added to 200 μL of supplemented culture medium and the cells were incubated at 37 °C for 3 hours. Absorbance (at 490 nm) was measured using a microplate reader (SpectraMax M2e, Molecular Devices).
8. 정량적 PCR 어레이8. Quantitative PCR Array
총 800,000개의 세포가 각 표본에 2시간 동안 씨딩(seeding)되었다. 총 RNA는 Ribospin(GeneAll, 한국)를 사용하여 부착된 MSCs로부터 추출되었고, 키트(AccuPower® RocketscriptTM Cycle RT Premix, BIONEER, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사되었다. qPCR 어레이에 대한 PCR 증폭에 사용되는 프라이머는 BIONEER(www. bioneer.co.kr)에 보고되었다: integrin α1, α2, α3, α4, α5, αv, β1, β2, β3, actin, fibronectin, talin, protein tyrosine kinase, lamin a/c, vinculin, sun1, nesprin1, nesprin2 및 GAPDH. 타겟 유전자의 발현 수준은 GAPDH 발현에 대해 평가되었고, 2- ΔΔCt 방법으로 표현되었다. 역전사된 총 RNA의 1 μg으로부터의 Real-Time PCR은 이전에 보고된 절차에 따라 Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER)을 사용하여 수행되었다. 모든 반응은 다음 조건에서 수행되었다: 95℃에서 10분; 95℃에서 5초, 58℃에서 25초, 72℃에서 30초 및 65℃에서 5초의 40 사이클. 모든 반응은 삼중으로 수행되었다(n = 3).A total of 800,000 cells were seeded in each sample for 2 hours. Total RNA was extracted from attached MSCs using Ribospin (GeneAll, Korea) and reverse transcribed into cDNA using a kit (AccuPower® Rocketscript TM Cycle RT Premix, BIONEER, Korea). Primers used for PCR amplification for qPCR arrays have been reported in BIONEER (www.bioneer.co.kr): integrin α1, α2, α3, α4, α5, αv, β1, β2, β3, actin, fibronectin, talin, protein tyrosine kinase, lamin a/c, vinculin, sun1, nesprin1, nesprin2 and GAPDH. Expression levels of target genes were evaluated for GAPDH expression and expressed by the 2 - ΔΔCt method. Real-Time PCR from 1 μg of reverse transcribed total RNA was performed using an Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (BIONEER) according to a previously reported procedure. All reactions were performed under the following conditions: 10 min at 95°C; 40 cycles of 5 seconds at 95°C, 25 seconds at 58°C, 30 seconds at 72°C and 5 seconds at 65°C. All reactions were performed in triplicate (n = 3).
9. 골형성 유전자의 발현9. Expression of osteogenic genes
분화를 유도하기 전에, 10,000개의 MSCs가 초기에 24-웰 플레이트의 각 웰에 씨딩(seeding)되었다. 골형성 유도 14일 후(α-MEM supplemented with 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glycerophosphate, 50 μg/mL ascorbic acid, and 10 nM dexamethasone), 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase (ALP)) 및 오스테오칼신(osteocalcin (OCN))의 발현은 qPCR에 의해 정량적으로 분석되었다(성장 배지 배양 그룹에 의해 정규화됨).Before inducing differentiation, 10,000 MSCs were initially seeded into each well of a 24-well plate. 14 days after osteogenic induction (α-MEM supplemented with 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glycerophosphate, 50 μg/mL ascorbic acid, and 10 nM dexamethasone), alkaline phosphatase (ALP) and expression of osteocalcin (OCN) was analyzed quantitatively by qPCR (normalized by growth medium culture group).
간략히 설명하면, 첫 번째 가닥 cDNA는 1 μg 올리고 DT 및 Accupower RT 프리믹스(K 2043, Bioneer, 한국)와 혼합된 총 RNA (1 μg)으로부터 VeritiTM 96-well thermal cycler (9902, Applied Biosystems, USA)를 사용하여 합성되었다. 이후, 제조사의 지시에 따라 StepOnePlus real time PCR systems (Applied Biosystems)을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 상대적인 전사 수준은 내인성 참조 유전자로 GAPDH를 사용하여 2-ΔΔCt 방법으로 평가되었다(n = 3). 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 기재하였다.Briefly, first-strand cDNA was prepared from total RNA (1 μg) mixed with 1 μg oligo DT and Accupower RT premix (K 2043, Bioneer, Korea) in a VeritiTM 96-well thermal cycler (9902, Applied Biosystems, USA). synthesized using Then, qRT-PCR was performed using StepOnePlus real time PCR systems (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions. Relative transcript levels were assessed with the 2 -ΔΔCt method using GAPDH as an endogenous reference gene (n = 3). Base sequences of the primers are shown in Table 1 below.
명칭primer
designation
10. 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase (ALP)) 효소 활성10. Alkaline phosphatase (ALP) enzyme activity
분화를 유도하기 전에, 10,000개의 MSCs가 초기에 24-웰 플레이트의 각 웰에 씨딩(seeding)되었다. 7일 및 14일 동안 배양한 후 분화 배지에서 배양된 MSCs의 골형성 분화를 ALP 효소 활성(Invitrogen, n = 3)에 기초하여 평가하였다. 효소 반응을 위해 각 샘플을 ALP 반응 배지에 첨가하였다. 효소 반응 생성물(p-니트로-페놀)의 함량은 흡광도(405 nm에서)로부터 평가하였다. ALP 함량은 총 DNA 양(Quant-iT PicoGreen Kit, Invitrogen)으로 정규화되었다.Before inducing differentiation, 10,000 MSCs were initially seeded into each well of a 24-well plate. After culturing for 7 and 14 days, the osteogenic differentiation of MSCs cultured in differentiation medium was evaluated based on ALP enzyme activity (Invitrogen, n = 3). Each sample was added to the ALP reaction medium for enzymatic reaction. The content of the enzymatic reaction product (p-nitro-phenol) was evaluated from absorbance (at 405 nm). ALP content was normalized to total DNA amount (Quant-iT PicoGreen Kit, Invitrogen).
11. 여러 약물을 전달하는 나노하이브리드의 시험관 내(In vitro) 생물학적 테스트11. In vitro biological testing of nanohybrids delivering multiple drugs
추출물(1.25 cm2/mL)을 사용하여 삼중 약물(Dex, FGF2 및 Phe)이 로딩된 나노하이브리드의 생물학적 효과를 테스트하였다. 검체(Chit, Chit@BGn70, Chit@BGn70+triple drug)를 얇은 막 형태로 준비하고 수평이동 쉐이커(120 rpm)에서 7일간 추출하였다. The biological effects of nanohybrids loaded with triple drugs (Dex, FGF2 and Phe) were tested using the extract (1.25 cm 2 /mL). Specimens (Chit, Chit@BGn70, Chit@BGn70+triple drug) were prepared in the form of thin films and extracted for 7 days in a horizontal shaker (120 rpm).
특정 기본 배지를 사용하여 4시간, 12시간, 2일, 4일 및 7일에 추출물을 수집한 다음, 추출물을 각 유형의 세포에 처리하였다; 즉, 대식세포 세포주 Raw 264.7 (ATCC TIB-71) 및 내피 세포주 HUVEC (ATCC, PCS-100-010)에는 50% 추출물을 처리하고 MSC 1차 세포에는 25% 추출물을 처리하였다(상기에서 설명됨). Raw264.7(DMEM, 10% FBS, LPS 10ng/mL)에는 완전 배지를 사용했으며, HUVEC에는 내피 세포 성장 키트-VEGF(ATCC, PCS-100-041)가 보충된 혈관 세포 기본 배지(ATCC, PCS-100-030)를 사용하였다. 각각의 배지를 수집한 후, 추출물의 기본 배지를 다시 채우고, 24-웰 플레이트의 각 웰에 세포를 씨딩(seeding)하고 24시간 후, 배지를 교체하였다. 4시간 배양 후, 4시간 동안 추출물을 처리한 Raw 264.7 세포를 상기 프로토콜에 따라 qPCR 분석을 위해 수집하고, 배양 배지를 사용하여 제조사의 프로토콜(iNtRON, Korea)에 따라 NO 생성을 조사하고 IL-1β 유전자 발현을 조사하였다. IL-1β 유전자 발현 조사를 위한 프라이머의 염기서열은 하기 표 2에 기재하였다.Extracts were collected at 4 hours, 12 hours, 2 days, 4 days and 7 days using specific basal media, and then the extracts were treated with each type of cells; That is, macrophage cell line Raw 264.7 (ATCC TIB-71) and endothelial cell line HUVEC (ATCC, PCS-100-010) were treated with 50% extract and MSC primary cells were treated with 25% extract (described above). . Complete medium was used for Raw264.7 (DMEM, 10% FBS,
명칭primer
designation
MSCs의 골형성은 최대 7일 동안 수행되었으며, MSCs에 처리된 25% 추출물은 4시간, 12시간, 2일, 4일 및 7일에 다시 채워졌다. 샘플의 ALP 염색은 4일차에(FAST BCIP/NBT B5655, Sigma-Aldrich) 수행되었고, OCN 유전자의 qPCR 분석은 7일차에 수행되었다. OCN 유전자의 qPCR 분석을 위한 프라이머의 염기서열은 하기 표 3에 기재하였다.
Osteogenesis of MSCs was performed for up to 7 days, and 25% extract treated MSCs were replenished at 4 hours, 12 hours, 2 days, 4 days and 7 days. ALP staining of the samples was performed on day 4 (FAST BCIP/NBT B5655, Sigma-Aldrich), and qPCR analysis of the OCN gene was performed on
명칭primer
designation
혈관신생(angiogenesis) 연구를 위해 Matrigel(Corning, USA)이 코팅된 24-웰 플레이트에서 50% 추출물과 함께 5 × 104 HUVEC를 배양하고 Juli Stage(NanoEntek Inc., 한국)를 사용하여 최대 12시간 동안 세관 형성(tubule formation)을 모니터링하였다. ALP 염색 및 세관 형성에 대한 이미지는 Image J에 의해 분석되었다.For angiogenesis study, 5 × 10 4 HUVECs were cultured with 50% extract in a 24-well plate coated with Matrigel (Corning, USA) and cultured for up to 12 hours using a Juli Stage (NanoEntek Inc., Korea). During this time, tubule formation was monitored. Images for ALP staining and tubule formation were analyzed by Image J.
12. 생체 내(In vivo) 동물 모델 및 수술12. In vivo animal models and surgery
생체 내 실험은 단국대학교 실험동물운영위원회(승인번호: 17-011)의 승인을 받은 후 수행되었다. 건강한 수컷의 9-10주령 Sprague-Dawley 랫트를 본 연구에 사용하였다. 다음의 두 가지 별도의 실험이 수행되었다; i) 약물이 없는 멤브레인 형태(순수 Chit, Chit@BGn50, Chit@BGn70) 및 ii) 약물이 있는 스캐폴드 형태(Chit@BGn70 및 삼중 약물을 포함하는 Chit@BGn70).In vivo experiments were performed after receiving approval from the Laboratory Animal Steering Committee of Dankook University (approval number: 17-011). Healthy male 9-10 week old Sprague-Dawley rats were used in this study. Two separate experiments were performed; i) membrane form without drug (pure Chit, Chit@BGn50, Chit@BGn70) and ii) scaffold form with drug (Chit@BGn70 and Chit@BGn70 with triple drug).
각 실험에는 대조군(Empty defect control)이 사용되었다. 멤브레인 형태의 샘플은 상기에 설명된 것으로 사용되었다. 스캐폴드 샘플의 경우 3D 프린팅된 PCL이 새로운 골 형성에 대한 더 나은 분석을 위한 3D 프레임워크로 사용되었다. 3D 프린팅 과정은 이전 연구에서 자세히 설명되어 있다(Won, J.E. et al., Biomaterials, 227 (2020) 119548). 3D 프린팅된 PCL 스캐폴드에 상기에 설명된 절차에 따라 Chit@BGn70을 코팅하였다. 또한, 삼중 약물(Dex, FGF2 및 Phe)이 상기 스캐폴드에 로딩되었다. 각 그룹(n = 5)에 대해 5개의 표본을 생체 내 실험에 사용하였다. A control group (Empty defect control) was used in each experiment. Samples in the form of membranes were used as described above. For scaffold samples, 3D printed PCL was used as a 3D framework for better analysis of new bone formation. The 3D printing process has been described in detail in a previous study (Won, J.E. et al., Biomaterials, 227 (2020) 119548). The 3D printed PCL scaffold was coated with Chit@BGn70 according to the procedure described above. In addition, a triple drug (Dex, FGF2 and Phe) was loaded onto the scaffold. Five specimens for each group (n = 5) were used for in vivo experiments.
수술을 위해 케타민(80 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg) 혼합물의 근육 주사로 실험동물을 마취시켰다. 두개골 병변을 면도한 후 요오드와 70% 에탄올로 수술 부위를 닦고 수술용 칼날로 피부에 선형 절개를 하였다. 전체 두께의 플랩(flap)을 집어넣고 두개관(calvarium) 뼈를 노출시켰다. 각 랫트에서, 치과 핸드피스와 5mm 직경 트레핀 드릴(trephine drill, 한국)을 사용하여 멸균 식염수와 냉각 조건하에서 정수리 뼈(parietal bone)의 양쪽에 하나씩 2개의 5mm 직경의 두개관 골 결함(calvarium bone defects)이 생성되었다. 실험동물의 수술 부위는 이식 전에 실험 그룹에 무작위로 할당되었다. 이식 후 피하조직과 골막(periosteum)을 흡수성 봉합사(4-0 Vicryl®Ethicon, Germany)로 봉합하고 피부를 비흡수성 봉합사(4-0 Prolene, Ethicon, Germany)로 봉합하였다. 감염, 염증 또는 임의의 부작용을 나타내는 임상 징후에 대해 실험동물을 매일 모니터링하였다. 멤브레인 실험을 위해 실험동물을 5주째에 희생시켜 상대적으로 초기 골 형성을 조사하였다. 반면에 스캐폴드 이식된 실험동물은 분석을 위해 초기(4주) 및 후기 시점(12주)에서 희생시켰다. 실험동물을 CO2 흡입으로 안락사시키고, 이식된 두개관(calvarium) 결함 주변 조직을 채취하여 조직학적 및 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT) 분석을 위해 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다. For surgery, experimental animals were anesthetized by intramuscular injection of a mixture of ketamine (80 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg). After shaving the skull lesion, the surgical site was cleaned with iodine and 70% ethanol, and a linear incision was made in the skin with a surgical blade. A full-thickness flap was retracted and the calvarium bone was exposed. In each rat, two 5 mm diameter calvarium bone defects, one on each side of the parietal bone, were placed under sterile saline and cooling conditions using a dental handpiece and a 5 mm diameter trephine drill (Korea). defects) were created. The surgical sites of the experimental animals were randomly assigned to the experimental groups prior to implantation. After transplantation, the subcutaneous tissue and periosteum were sutured with absorbable sutures (4-0 Vicryl® Ethicon, Germany), and the skin was sutured with non-absorbable sutures (4-0 Prolene, Ethicon, Germany). Experimental animals were monitored daily for clinical signs indicating infection, inflammation or any side effects. For the membrane experiment, the experimental animals were sacrificed at 5 weeks to investigate relatively early bone formation. On the other hand, scaffold-implanted experimental animals were sacrificed at the early (4 weeks) and late time points (12 weeks) for analysis. Experimental animals were euthanized by CO 2 inhalation, and tissue around the implanted calvarium defect was collected and fixed in 10% neutral buffered formalin for 24 hours at room temperature for histological and micro-computed tomography (micro-CT) analysis. did
13. 조직학 및 마이크로-CT(micro-CT)에 의한 분석13. Analysis by histology and micro-CT
마이크로-CT(micro-CT) 영상은 골 재생 분석을 위한 대표적인 기법으로 사용되었다. 수집된 샘플은 각 절편(μm)에 대해 279 ms의 노출 시간으로 65 kV 및 385 μA에서 X-선을 사용하여 마이크로-CT 영상촬영(Skyscan 1176, Skyscan, Belgium)하였다. 스캔에서 재구성된 이미지는 CTAn 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)에 대한 경조직 형성을 분석하는 데 사용되었다. 결함 부위의 새로 형성된 골 부피(mm3)와 표면적(mm2)을 평가하였다. CTvol 소프트웨어(ver. 2.3.2.0)를 사용하여 3차원 이미지를 구성하고 시각화하였다.Micro-CT imaging has been used as a representative technique for analyzing bone regeneration. The collected samples were subjected to micro-CT imaging (Skyscan 1176, Skyscan, Belgium) using X-rays at 65 kV and 385 μA with an exposure time of 279 ms for each slice (μm). Images reconstructed from the scans were used to analyze hard tissue formation over regions of interest (ROIs) using CTAn software. The newly formed bone volume (mm 3 ) and surface area (mm 2 ) of the defect were evaluated. Three-dimensional images were constructed and visualized using CTvol software (ver. 2.3.2.0).
조직학적 분석을 위해 고정된 조직 샘플을 RapidCal™ 용액(BBC Chemical Co., USA)에서 14일 동안 석회질 제거하였다. 탈석회화 후, 샘플은 등급이 매겨진 일련의 에탄올 용액에서 탈수된 다음 파라핀에 포매되었다. 전자동 회전 마이크로톰(Leica RM2245, Leica Biosystems, Germany)을 사용하여 결함 부위의 중앙 영역의 관상 절편(Coronal sections, 5 μm)을 준비하였다. 상기 조직 샘플의 절편을 코팅된 유리 슬라이드로 옮긴 후 조직 절편 슬라이드로 만들고 광학 현미경 분석을 위해 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) (H&E)으로 염색하였다.For histological analysis, fixed tissue samples were decalcified in RapidCal™ solution (BBC Chemical Co., USA) for 14 days. After decalcification, the samples were dehydrated in a graded series of ethanol solutions and then embedded in paraffin. Coronal sections (5 μm) of the central region of the defect were prepared using a fully automated rotating microtome (Leica RM2245, Leica Biosystems, Germany). Sections of the tissue samples were transferred to coated glass slides, made into tissue section slides, and stained with hematoxylin and eosin (H&E) for light microscopy analysis.
새로운 뼈 영역을 분석하기 위해, 조직 샘플의 면역조직화학적 염색을 수행하였다. 면역조직화학분석을 위해, 항-BSP II 항체(1:200, sc-73634, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA), 항 ALP 항체(1:200, sc-23430, Santa Cruz Biotechnology Inc.), 플루오레세인(fluorescein, FITC) AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) 및 로다민(rhodamine, TRITC) AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG(1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)을 사용하여 새로 형성된 뼈에서 골 단백질 마커인, BSP 및 ALP를 정량화하였다. 이미지는 Olympus 도립현미경(IX71, Olympus, Tokyo, Japan)으로 촬영한 것이다. 조직학적 절편에서 각 결함 한계(margin)의 새로운 뼈 영역에서의 조골세포(osteoblasts)를 분석하였다. 편심 핵(eccentric nuclei)을 가진 입방 세포(cuboidal cells)는 조골세포로 간주되었다. 전체 새로운 뼈 영역의 형광 강도(fluorescence intensity)는 ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/)에 의해 정량화되었다.Immunohistochemical staining of tissue samples was performed to analyze new bone regions. For immunohistochemical analysis, anti-BSP II antibody (1:200, sc-73634, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA), anti-ALP antibody (1:200, sc-23430, Santa Cruz Biotechnology Inc.), Fluo Rescein (fluorescein, FITC) AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) and rhodamine (rhodamine, TRITC) AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) ) was used to quantify bone protein markers, BSP and ALP, in newly formed bone. Images were taken with an Olympus inverted microscope (IX71, Olympus, Tokyo, Japan). Histological sections were analyzed for osteoblasts in the new bone region of each defect margin. Cuboidal cells with eccentric nuclei were considered osteoblasts. The fluorescence intensity of the entire new bone area was quantified by ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/).
14. 통계학적 분석14. Statistical Analysis
데이터는 평균 ± 1 표준 편차(1SD)로 나타내었다. 그룹 간의 비교는 Bonferroni 사후 검정(post hoc test)과 함께 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었다. 통계적 유의성은 다른 수준에서 고려되었다(*p < 0.05, **p < 0.01).Data are presented as mean ± 1 standard deviation (1SD). Comparisons between groups were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc test. Statistical significance was considered at different levels (*p < 0.05, **p < 0.01).
실험 결과Experiment result
1. 코어-쉘 나노단위는 초고함량의 무기물 성분을 갖는 나노하이브리드로 자가조립된다1. Core-shell nanounits self-assemble into nanohybrids with ultra-high content of inorganic components
먼저 자기조립 나노하이브리드의 빌딩 블록으로 사용되는, 무기물 나노입자(inorganic nanoparticle, IOC)와 얇은 키토산 쉘로 만들어진 코어-쉘 구조의 나노단위를 합성하였다.First, core-shell nanounits made of inorganic nanoparticles (IOCs) and thin chitosan shells, which are used as building blocks for self-assembled nanohybrids, were synthesized.
도 1a에 도시된 바와 같이, 낮은 pH(산성) 수용액에 분산된 키토산 분자는 수소결합을 통해 pH(중성 또는 염기성)가 증가함에 따라 접착력을 갖게 되면서 IOC (IOC 모델로 사용되는, 하이드록시아파타이트(HA), 생활성 유리 나노입자 (BGn) 또는 메조 다공성 실리카 나노입자 (MSN))의 표면에 부착되어 코어-쉘 하이브리드 나노단위를 생성한다. 보다 구체적으로, 키토산의 아민기(-NH2)는 산성 조건에서, 암모늄기(-NH3 +)로 전환되어 균일한 분산을 초래하는 반면, 중성 또는 염기성 조건에서, 탈양성자화(deprotonation)는 아민기를 재생하여 IOC 표면에 키토산 분자의 조립이 이루어진다. 수득한 키토산 쉘/IOC 코어 나노스피어(Chit@IOC로 표시)는 증발(evaporation)하는 동안 지지 기판 상의 자기조립 과정을 통해 나노하이브리드로 구조화되었으며, 여기서 나노하이브리드의 형태는 기판의 유형에 크게 의존할 수 있다. 즉, 평평한 유리에서는 부피가 큰 멤브레인으로 형성되거나 3D 섬유/다공성 스캐폴드의 표면에는 제어된 양으로 코팅될 수 있다. 이 과정을 통해 나노하이브리드의 무기물 함량이 90 wt%까지 도달할 수 있다는 사실은 주목할 가치가 있다. 무기물 함량의 90%는 거의 최대치이다; 이전의 노력으로는 훨씬 적은 함량의 무기물 입자로 나노복합체를 얻을 수 있지만 자연계의 일부만이 이렇게 높은 함량의 무기물 상(inorganic phase)을 함유할 수 있다. 이는 주로 유기물 상(organic phase)이 무기물 나노성분사이에 열악하게 배치되어 결과적으로 유기물 상이 결여된 무기물 나노입자가 응집되기 때문이다. 실제로 키토산 분자와 무기물 나노입자(즉, 'Chti + HA', 'Chit + MSN' 또는 'Chit + BGn')의 기존 혼합을 통해 최대 30-50 wt%의 무기물 상만 추가할 수 있었다. 이는 여기에서 새로이 접근한 방법에 의해 생성된 나노하이브리드 'Chit@HA', 'Chit@MSN' 또는 'Chit@BGn'과 현저하게 대조된다.As shown in FIG. 1A, the chitosan molecules dispersed in a low pH (acidic) aqueous solution have adhesive strength as the pH (neutral or basic) increases through hydrogen bonding, resulting in IOC (hydroxyapatite (used as an IOC model, hydroxyapatite ( HA), bioactive glass nanoparticles (BGn) or mesoporous silica nanoparticles (MSN)) to create core-shell hybrid nanounits. More specifically, the amine group (-NH 2 ) of chitosan is converted to an ammonium group (-NH 3 + ) under acidic conditions, resulting in uniform dispersion, whereas under neutral or basic conditions, deprotonation is amine Chitosan molecules are assembled on the surface of the IOC by regenerating the groups. The obtained chitosan shell/IOC core nanospheres (denoted as Chit@IOC) were structured into nanohybrids through a process of self-assembly on a supporting substrate during evaporation, where the morphology of the nanohybrids would be highly dependent on the type of substrate. can That is, on flat glass, it can be formed into a bulky membrane or coated in a controlled amount on the surface of a 3D fiber/porous scaffold. It is worth noting that through this process, the inorganic content of nanohybrids can reach up to 90 wt%. 90% of the mineral content is near maximum; Previous efforts have yielded nanocomposites with much lower content of inorganic particles, but only a fraction of the natural world can contain such high content of the inorganic phase. This is mainly because the organic phase is poorly disposed between the inorganic nanocomponents, resulting in aggregation of the inorganic nanoparticles lacking the organic phase. In practice, conventional mixing of chitosan molecules and inorganic nanoparticles (i.e. 'Chti + HA', 'Chit + MSN' or 'Chit + BGn') could only add up to 30–50 wt% of the inorganic phase. This contrasts markedly with the nanohybrids 'Chit@HA', 'Chit@MSN' or 'Chit@BGn' produced by the method newly approached here.
다른 조성을 가진 Chit@IOC의 나노스케일 코어-쉘 형태는 TEM에 의해 조사되었다(도 1b). TEM 이미지에서, 키토산이 무기 나노입자를 상당히 균일하게 둘러싸고 있는, 코어-쉘 구조의 하이브리드 나노입자를 잘 확인할 수 있었다. 대표적인 조성(50% IOC)을 갖는 나노하이브리드의 FE-SEM 이미지는 내부 코어 무기 형태가 키토산 코팅 후 잘 보존되었음을 나타내었다(도 1b). 무기 코어의 쉘 두께는 반응 중 Chit 및 IOC 함량의 비율을 조정하여 제어할 수 있었다. 쉘 두께는 Chit@HA(도 1c)의 경우 5~19 nm, Chit@MSN의 경우 10~38 nm 범위로 측정되었고, Chit 쉘 두께는 Chit의 함량과 잘 관련되었다. 이러한 관찰로서, 5 nm 및 10 nm 두께는 HA 및 MSN 각각에 대해 활용하기에 가장 얇은 Chit 층으로 간주되며 궁극적으로 사용된 무기물 함량의 ~90wt%에 해당한다. TGA에 의해 확인된 바와 같이, 무기물 나노입자의 실제 함량은 디자인된 것과 잘 일치하며, Chit과 무기물 나노입자가 거의 완전히 반응하여 생성된 나노하이브리드가 자기 조립됨을 시사한다.The nanoscale core-shell morphology of Chit@IOC with different compositions was investigated by TEM (Fig. 1b). In the TEM image, the core-shell structured hybrid nanoparticles, in which chitosan fairly uniformly surrounded the inorganic nanoparticles, could be well identified. FE-SEM images of nanohybrids with representative composition (50% IOC) showed that the inner core inorganic morphology was well preserved after chitosan coating (Fig. 1b). The shell thickness of the inorganic core could be controlled by adjusting the ratio of Chit and IOC contents during the reaction. The shell thickness was measured in the range of 5 to 19 nm for Chit@HA (Fig. 1c) and 10 to 38 nm for Chit@MSN, and the chit shell thickness correlated well with the chit content. As such an observation, 5 nm and 10 nm thicknesses are considered to be the thinnest Chit layers available for HA and MSN, respectively, and ultimately correspond to ~90 wt% of the mineral content used. As confirmed by TGA, the actual content of inorganic nanoparticles was in good agreement with the designed one, suggesting that chit and inorganic nanoparticles reacted almost completely to self-assemble the resulting nanohybrids.
IOC의 표면에 형성된 Chit 쉘로 인해 하이브리드 나노단위의 표면 ζ 전위가 음에서 양으로 이동하였다. Chit@IOC 나노하이브리드의 또 다른 주목할만한 특징은 유연성과 형태 성형성이다.Due to the Chit shell formed on the surface of the IOC, the surface ζ potential of the hybrid nanounits shifted from negative to positive. Another noteworthy feature of the Chit@IOC nanohybrid is its flexibility and shape-formability.
도 1d에 나타난 바와 같이, 멤브레인 형태로 제조된 나노하이브리드는 IOC의 유형에 상관없이 접을 수 있고, 신축성이 있고, 천공될 수 있음을 확인하였으며, 이는 외과용 임플란트, 즉 외과용 친화적 생체 재료용으로 활용 가능함을 의미한다. 나노하이브리드는 또한 IOC의 유형에 관계없이 제어된 함량으로 나노섬유 및 다공성 3D 스캐폴드와 같은 복잡한 형태의 재료의 표면을 덮을 수 있다. 이는 나노하이브리드가 하기 3D 이식 가능한 생체 재료의 표면 나노구조 및 성분 특성을 변경하기 위해 코팅층으로 사용될 수 있음을 시사한다(도 1e).As shown in FIG. 1D, it was confirmed that the nanohybrid fabricated in the form of a membrane was foldable, stretchable, and puncture regardless of the type of IOC, which is suitable for surgical implants, that is, surgical-friendly biomaterials. means available. Nanohybrids can also cover the surface of materials with complex shapes, such as nanofibers and porous 3D scaffolds, with a controlled content regardless of the type of IOC. This suggests that the nanohybrid can be used as a coating layer to change the surface nanostructure and component properties of the following 3D implantable biomaterial (Fig. 1e).
2. 나노하이브리드는 독특한 물리-화학적 및 기계적 특성을 나타낸다2. Nanohybrids exhibit unique physical-chemical and mechanical properties
Chit@IOC 나노하이브리드는 FE-SEM 및 AFM 이미지(도 2a에 Chit@BGn70이 대표적으로 제시됨)를 기반으로 고도로 거친 나노토포그래피를 나타내었고, 초박형 키토산 쉘 상 아래의 코어 나노입자 형태를 잘 반영하였다. 나노하이브리드의 나노 거칠기(nano roughness)(Chit@BGn70의 경우 35.26 nm, Chit@HA70의 경우 45.48 nm)는 순수 Chit (6.2nm)보다 ~6-8배 더 높았다. 나노하이브리드의 이러한 고도로 거칠어진 나노지형학적 특징은 특히, 초기 세포 부착 과정에서의 생물학적 상호작용에 대한 영향이 있을 수 있음을 의미한다.The Chit@IOC nanohybrid exhibited highly rough nanotopography based on FE-SEM and AFM images (Chit@BGn70 is representatively shown in Fig. 2a), and well reflected the core nanoparticle morphology under the ultrathin chitosan shell. . The nano roughness of the nanohybrid (35.26 nm for Chit@BGn70 and 45.48 nm for Chit@HA70) was ~6-8 times higher than that of pure Chit (6.2 nm). These highly roughened nanotopographic features of the nanohybrid suggest that there may be an influence on biological interactions, especially during the initial cell attachment process.
다음으로, 자기조립 나노하이브리드(Chit@BGn이 대표적으로 분석됨)가 XPS에 의해 분석되었다. 광폭 스캔상에서, Chit 관련 피크는 286.2(C 1s), 400.0(N 1s) 및 533.5 eV(O 1s)이고, BGn 관련 피크는 347.5(Ca 2p) 및 104.5 eV(Si 2p)로 모든 나노하이브리드 조성물에서 뚜렷하게 검출되었다. 협폭 스캔상에서, Chit의 탄소(C 1s)는 나노하이브리드에서 두 개의 피크(C-C 및 C-O)를 나타내는 반면에, O 1s 및 N 1s 피크는 나노하이브리드 조성물에 따라 결합 에너지에서의 약간의 이동을 나타내었다. 또한, BGn 관련 원소(Ca 2p 및 Si 2p)의 피크는 결합 에너지에서의 이동을 나타내었다. 참고로, 원소(O 1s, N 1s, Ca 2p 및 Si 2p)의 결합 에너지(0.5-1.7 eV)의 이러한 이동, 특히, 순수 Chit (O 1s 및 N 1s의 경우) 및 순수 BGn (Ca 2p 및 Si 2p의 경우)에 비해 더 낮은 값으로의 이동은 BGn (Ca2+/SiO4+/OH-)의 전자가 빈약하거나 풍부한 이온과 Chit (C=O, N-H 및 O-H)의 극성이 높은 작용기 사이에 새로 형성된 화학적 상호작용을 나타낸다. 자기조립된 Chit@BGn 나노하이브리드와 달리, 기존의 혼합 복합체(Chit + BGn)는 특히 N 1s, Ca 2p 및 Si 2p 결합 에너지에서 그러한 명확한 이동을 나타내지 않았다(도 2b에서 비교됨). 순수 Chit에 비해 더 낮은 값으로의 원소(O, N, Ca 및 P)의 결합 에너지 이동은 Chit@HA 나노하이브리드에서도 유사하게 관찰되었고, 이는 기존의 Chit + HA 복합체에서는 거의 관찰되지 않았다. XPS 결과는 기존 복합체와 대조되는 Chit과 IOC 사이의 화학적 상호 작용을 강조한다.Next, the self-assembled nanohybrids (Chit@BGn was analyzed representatively) were analyzed by XPS. On the wide scan, Chit-related peaks are 286.2 (C 1s), 400.0 (N 1s), and 533.5 eV (O 1s), and BGn-related peaks are 347.5 (
Chit@IOC 나노하이브리드는 순수 Chit에 비해 친수성이 증가했으며, 이는 IOC 함량이 증가함에 따라 더욱 두드러지게 나타났다. IOC (BGn 및 HA)의 고유한 친수성 특성과 나노하이브리드의 표면 나노크기의 거친(nano-roughened) 지형은 친수성 증가에 영향을 미칠 수 있다. 나노하이브리드는 또한 쉘의 특성인, 천연 고분자 Chit의 수분 흡수능 수준을 보여주었다. IOC 함량이 증가함에 따라 수분 흡수 용량은 감소하였다. 나노하이브리드의 관찰된 특성(친수성 증가와 함께 감소된 팽윤 거동)은 안정적인 이식 가능한 생체 재료로서의 활용에 적합함을 나타낸다. 다음으로, 4주에 걸쳐 Chit@IOC 나노하이브리드의 가수분해에 의한 분해(37℃의 PBS에서)를 측정하였다. Chit@BGn의 경우 BGn 함량이 증가함에 따라 분해가 증가했으며 4주 동안의 중량 변화는 순수 Chit(~6%)보다 더 높은 것으로 기록되었다(~10-20% ~ 70%BGn); Chit@BGn90의 경우 분해가 매우 빠르게 나타났다(4주 동안 ~100%). Chit@HA의 경우, 90% HA에서도 분해가 순수 Chit보다 더 빠르게 나타났다. IOC의 가수분해에 의한 분해 특성은 나노하이브리드의 분해를 반영할 수 있다. 즉, BGn은 HA보다 더 빨리 분해됨을 의미한다. The hydrophilicity of the Chit@IOC nanohybrid increased compared to that of pure Chit, which became more pronounced as the IOC content increased. The unique hydrophilic properties of IOCs (BGn and HA) and the nano-roughened topography of the surface of nanohybrids can influence the increase in hydrophilicity. The nanohybrid also showed the level of water absorption capacity of the natural polymer Chit, a characteristic of the shell. As the IOC content increased, the water absorption capacity decreased. The observed properties of the nanohybrid (reduced swelling behavior with increased hydrophilicity) indicate that it is suitable for use as a stable implantable biomaterial. Next, the hydrolytic degradation (in PBS at 37° C.) of the Chit@IOC nanohybrids was measured over 4 weeks. For Chit@BGn, degradation increased with increasing BGn content and the weight change over 4 weeks was recorded as higher (~10-20% to 70% BGn) than pure Chit (~6%); In the case of Chit@BGn90, degradation was very rapid (~100% in 4 weeks). In the case of Chit@HA, degradation was faster than that of pure Chit even at 90% HA. The degradation characteristics of IOC by hydrolysis may reflect the degradation of the nanohybrid. That is, BGn decomposes faster than HA.
다음으로, 습윤 상태에서 Chit@IOC 나노하이브리드의 인장 강도의 기계적 특성을 조사하였다. 이식 가능한 생체 재료로 활용하기 위해서는, 탄성 변형을 가지는 유리한 수술적 핸들링과 동적 힘 하에서의 결함에 대한 장기적인 적응이 주요 요구사항 중 일부이다. Chit@HA30 나노하이브리드는 기존의 Chit + HA30 복합체보다 가해진 인장 강도에 더 효과적으로 저항하였다. 기계적 특성의 정량적 분석은 Chit@BGn과 Chit + BGn을 비교하여 수행되었다. 첫째, 기록된 Chit@BGn 나노하이브리드의 인장 강도(0.99-3.20 MPa)는 Chit + BGn 복합체(0.18-0.31 MPa)의 인장 강도보다 거의 10배 정도 차이가 나는 것으로 확인되었다(도 2c). 인장 강도는 BGn 함량 증가에 따라 나노하이브리드의 탄성 계수가 점진적으로 증가하는 동안 ~50% BGn에서 정점을 이루는 바이모달 거동(bimodal behavior)을 나타내었다(도 2d). 이는 다른 생물 및 공학 시스템의 유기-무기 나노복합체에서 일반적으로 관찰되는 거동이다. 주목할만한 것은 나노하이브리드의 연신율(elongation)이었다(도 2e); Chit@BGn 나노하이브리드가 높은 연신율(74-403% 연신율)을 가지는 것에 비해, Chit + BGn 기존 복합체는 쉽게 부서지고 제한된 연신율(34-40%)을 가지는 것으로 나타났는데, 이는 본 발명의 나노하이브리드의 높은 탄력성을 보여주는 것이다. Next, the mechanical properties of the tensile strength of the Chit@IOC nanohybrid in a wet state were investigated. To utilize them as implantable biomaterials, favorable surgical handling with elastic deformation and long-term adaptation to defects under dynamic forces are some of the key requirements. The Chit@HA30 nanohybrid resisted the applied tensile strength more effectively than the conventional Chit + HA30 composite. Quantitative analysis of mechanical properties was performed comparing Chit@BGn and Chit + BGn. First, it was confirmed that the recorded tensile strength of the Chit@BGn nanohybrid (0.99–3.20 MPa) was approximately 10 times higher than that of the Chit + BGn composite (0.18–0.31 MPa) (Fig. 2c). The tensile strength exhibited a bimodal behavior peaking at ~50% BGn while the elastic modulus of the nanohybrid gradually increased with increasing BGn content (Fig. 2d). This is a commonly observed behavior for organic-inorganic nanocomposites in other biological and engineering systems. Noteworthy was the elongation of the nanohybrid (Fig. 2e); Compared to the high elongation of the Chit@BGn nanohybrid (74-403% elongation), the conventional Chit + BGn composite was found to be easily broken and had limited elongation (34-40%), which is This shows high elasticity.
Chit@BGn에서 관찰된 이러한 기계적 거동은 Chit@HA 및 Chit@MSN에서도 유사하게 입증되었다. 기존 복합체의 열악한 기계적 특성은 잠재적으로 응력 발생 및 파손 원인으로 작용하는, 균일한 Chit 적용범위가 없는 응집된 무기물 입자에 기인한다. 관찰된 우수한 기계적 특성은 자기조립된 나노하이브리드의 유기물 및 무기물 성분들이 모두 나노스케일에서 계층적 조직과 함께 인장 응력 하에서 파손에 대한 저항에 효과적으로 기여한다는 점을 강조한다. 샘플의 건조 상태에서 기계적 특성에서도 유사한 경향이 확인되었다.This mechanical behavior observed in Chit@BGn was similarly demonstrated in Chit@HA and Chit@MSN. The poor mechanical properties of existing composites are attributed to agglomerated inorganic particles without uniform chit coverage, potentially acting as sources of stress and failure. The excellent mechanical properties observed highlight that both the organic and inorganic components of the self-assembled nanohybrids effectively contribute to their resistance to breakage under tensile stress along with their hierarchical organization at the nanoscale. A similar trend was confirmed in the mechanical properties of the samples in the dry state.
다음으로, 동적 스트레스 조건하에서, 나노하이브리드의 기계적 거동을 조사하였다. 인장 강도가 가장 높은 샘플(Chit@BGn50)을 선택하여 30 주기(10%, 5 MPa/min)까지 주기적인 인장 하중을 가하였다. 몇 초 이내에 완전히 회복되는 지속적인 탄성 거동이 하중의 30 주기 동안 관찰되었다(도 2f). 다른 나노하이브리드인, Chit@HA 및 Chit@MSN에서도 유사한 주기적인 거동이 관찰되었다. 이러한 결과는 Chit@IOC가 주기적인 인장 하중하에서 파손에 저항하기 위해 매우 탄력적이고 유연함을 보여주는 것으로, 이는 외과적 핸들링 및 동적 힘 조건 하에서의 장기간 임상 적응을 통해 이식 가능한 생체 재료로서의 활용 가능성을 뒷받침할 수 있으나, 아직 생체 내 주기적인 하중 환경에서 추가 확인이 필요하다.Next, the mechanical behavior of the nanohybrid was investigated under dynamic stress conditions. A sample with the highest tensile strength (Chit@BGn50) was selected and subjected to cyclic tensile load up to 30 cycles (10%, 5 MPa/min). A sustained elastic behavior with full recovery within a few seconds was observed during 30 cycles of loading (Fig. 2f). Similar periodic behavior was observed in the other nanohybrids, Chit@HA and Chit@MSN. These results show that Chit@IOC is highly elastic and flexible to resist breakage under cyclic tensile load, which can support its potential as an implantable biomaterial through surgical handling and long-term clinical adaptation under dynamic force conditions. However, additional confirmation is still needed in the cyclic load environment in vivo.
3. 나노하이브리드는 부착-의존적 세포 과정을 활성화하고 조직 복구를 지원한다3. Nanohybrids activate adhesion-dependent cellular processes and support tissue repair
이식 가능한 생체 재료로서 Chit@IOC 나노하이브리드의 생물학적 효능을 밝히기 위해, 먼저 Chit@HA를 사용하여 시험관 내에서 세포와의 상호 작용을 조사하였다. 다른 특성들 중에서 본 발명자들의 관심은 나노하이브리드의 나노크기의 거친 지형(nano-roughened topography)에 초점을 맞추었다. 도 3a에 개략적으로 도시된 바와 같이, 세포(여기서 중간엽줄기세포 'MSC'가 고려됨)는 하기 나노 지형을 감지한 다음 부착, 확산 및 분화와 같은 후속 프로세스를 채택한다. 나노지형관련 세포 및 조직 실험에서 나노하이브리드 모델로 Chit@HA를 사용하였다; HA에 비해서, 용해도가 더 높은 BGn은 특히 장기간에 걸쳐 세포에 대한 나노지형관련 효과를 복잡하게 만들 수 있다. 4시간 또는 24시간 동안 성장 배지에서 대표적인 나노하이브리드 Chit@HA70에서 MSC를 배양하고 세포 부착 거동을 분석하였다. 4시간째에, 나노하이브리드는 순수 Chit에 비해 부착된 세포의 수와 확산 면적을 상당히 증가시켰다(도 3b 및 c). TCP 제어와 관련하여 나노하이브리드는 세포확산을 약간 제한하면서 유사한 부착 세포 수를 보여주었다. 24시간째에, 나노하이브리드에 부착된 세포는 확산영역에서 많은 변화를 나타내지 않은 반면, 순수 Chit에 부착된 세포는 훨씬 더 낮은 세포부착 수로 실질적으로 확산되었다. Chit@BGn70을 사용하는 경우 이러한 초기 세포 부착 거동도 유사하게 관찰되었다. 이러한 결과는 초기에 활성화된 세포 부착이 나노하이브리드의 나노크기의 거친 지형에 기인하며, 이는 IOC의 종류에 관계없이 일반적인 현상임을 입증하는 것이다. To elucidate the biological efficacy of Chit@IOC nanohybrids as implantable biomaterials, we first investigated the interaction with cells in vitro using Chit@HA. Among other properties, our interest has focused on the nano-roughened topography of nanohybrids. As schematically shown in Figure 3a, cells (here mesenchymal stem cells 'MSC' are considered) sense the following nanotopography and then adopt subsequent processes such as attachment, proliferation and differentiation. Chit@HA was used as a nanohybrid model in nanotopography-related cell and tissue experiments; Compared to HA, the more soluble BGn can complicate nanotopography-related effects on cells, especially over long periods of time. MSCs were cultured in representative nanohybrid Chit@HA70 in growth medium for 4 or 24 hours and cell adhesion behavior was analyzed. At 4 h, the nanohybrid significantly increased the number of attached cells and the spreading area compared to pure Chit (Fig. 3b and c). Regarding the TCP control, nanohybrids showed similar adherent cell numbers while slightly limiting cell proliferation. At 24 hours, cells attached to nanohybrids did not show much change in the area of spread, whereas cells attached to naive Chit spread substantially with a much lower number of attached cells. When Chit@BGn70 was used, this initial cell attachment behavior was similarly observed. These results demonstrate that the initially activated cell adhesion is due to the nano-sized rough topography of the nanohybrid, which is a general phenomenon regardless of the type of IOC.
활성화된 부착 이벤트의 기초가 되는 생물학적 메커니즘을 결정하기 위해, 배양 2시간째에 qPCR 어레이를 수행하고 인테그린 세트 (integrin sets), 국소 부착 단백질 (focal adhesion proteins), α-액틴 (α-actin), 핵골격 및 세포골격 링커 복합체(linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex) 및 핵 라민 (nucleus lamin) A/C를 포함하는 세포역학적신호전달(mechanotransduction)-관련 유전자를 기반으로 데이터를 분석하였다(도 3d). 나노하이브리드 샘플은 Chit과 비교할 때, 인테그린 세트(인테그린 α2, α3, β1)와 인테그린을 액틴 필라멘트에 연결하는 어댑터 단백질(탈린(talin) 및 국소 부착 키나제(focal adhesion kinase))의 유전자 발현을 크게 향상시켰다. 이는 나노하이브리드에서 MSCs의 변경된 초기 부착 이벤트가 인테그린(구체적으로는 α2β1 및 α3β1)-의존성 국소 부착을 통해 크게 매개됨을 입증하는 것이다. 반면에, 세포 내 기계적 신호를 직접 핵으로 전달하는 LINC 복합체(Sun1, Nesprin1 및 Nesprin2)와 핵 라민 A/C는 기질에 관계없이 동일한 mRNA 수준으로 유지되어 이러한 세포역학적신호전달(mechanotransduction) 장치가 이벤트나 단백질(유전자 아님) 수준의 자극 가능성에 강하게 관여하지 않았으므로 아직 추가 연구가 필요하다. 분석 도구의 이러한 제한에도 불구하고, qPCR 어레이 결과는 나노하이브리드가 초기 세포 부착 수와 α2β1 및 α3β1 매개 국소 부착을 통한 MSCs의 확산에 영향을 미쳐, 추가 골형성 캐스케이드를 가속화할 가능성이 있음을 시사한다. 자극된 부착 신호에 대한 원인에 관해서, 나노하이브리드(vs. Chit)의 상당히 변경된 나노크기의 거친(nano-roughened) 표면 지형(8배 더 높은 나노- 거칠기)가 주로 증가된 습윤성 (~50° vs. ~80°)에 기인하는 것으로 여겨진다. 특히, AFM으로 기록된 나노하이브리드의 나노-거칠기 수준(45.48 nm)은 세포외 리간드의 역학감지(mechanosensing)에 효과적인 인테그린 클러스터의 크기와 일치하는 것으로 간주된다. 즉, 인테그린을 통한 외부-인 기계수용성(outside-in mechanosensitive) 신호전달을 위해, 수십 나노미터의 지형적 특징이 다른 나노스케일 범위(몇 또는 수백 나노미터)보다 더 효과적임을 의미한다. 배양 7일 동안 부착된 세포의 증식 능력도 순수 Chit보다 나노하이브리드에서 더 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 바탕으로 나노하이브리드는 줄기세포의 부착과 성장을 위한 적절한 기질 조건을 제공할 것으로 판단된다.To determine the biological mechanisms underlying the activated adhesion event, qPCR arrays were performed at 2 h of culture and integrin sets, focal adhesion proteins, α-actin, Data were analyzed based on mechanotransduction-related genes including linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex and nucleus lamin A/C (Fig. 3d). Nanohybrid samples significantly enhanced gene expression of a set of integrins (integrin α2, α3, β1) and adapter proteins (talin and focal adhesion kinase) that connect integrins to actin filaments when compared to Chit made it This demonstrates that the altered initial adhesion events of MSCs in nanohybrids are largely mediated through integrin (specifically, α2β1 and α3β1)-dependent focal adhesion. On the other hand, the LINC complexes (Sun1, Nesprin1, and Nesprin2) and nuclear lamin A/C, which directly transmit intracellular mechanical signals to the nucleus, remain at the same mRNA level regardless of the substrate, so that these mechanotransduction machinery However, further studies are still needed as the stimulation potential at the protein (not genetic) level has not been strongly implicated. Despite these limitations of the analytical tool, the qPCR array results suggest that nanohybrids have the potential to accelerate further osteogenic cascades by affecting the number of initial cell attachments and proliferation of MSCs via α2β1- and α3β1-mediated focal adhesions. . Regarding the cause for the stimulated adhesion signal, the significantly altered nano-roughened surface topography (8-fold higher nano-roughness) of the nanohybrid ( vs. Chit) was mainly responsible for the increased wettability (~50° vs. Chit) . . ~80°). In particular, the nano-roughness level (45.48 nm) of nanohybrids recorded by AFM is considered to be consistent with the size of integrin clusters effective for mechanosensing extracellular ligands. That is, for outside-in mechanosensitive signal transduction through integrins, topographic features of tens of nanometers are more effective than other nanoscale ranges (few or hundreds of nanometers). It was also confirmed that the proliferation ability of attached cells during 7 days of culture was higher in the nanohybrid than in pure Chit. Based on these results, it is judged that the nanohybrid will provide an appropriate substrate condition for the attachment and growth of stem cells.
다음으로, 골 재생 재료로서 나노하이브리드의 용도를 찾기 위해 MSCs의 골분화 거동을 평가하였다. 골유도 배지 조건에서 14일 동안 배양한 후, 골-관련 유전자 발현 수준(ALP 기준)을 qPCR에 의해 평가하였다. ALP는 골 무기질 침착 부위에 고농도의 인산염을 제공하는데 필수적이므로, 골형성의 초기 마커로 간주된다. 상당히 높은 ALP 발현 수준(~2.5배)이 순수 Chit보다 나노하이브리드에서 성장할 때 확인되었다(도 3e). 7일 및 14일째에 측정된 ALP 활성이 나노하이브리드에서 상당히 더 높은 수준으로 시간에 따라 지속적으로 증가됨을 추가로 확인되었다(도 3f). 시험관 내 결과는 나노하이브리드가 초기 세포 부착, 증식 및 골형성 자극 측면에서 MSC에 우수한 세포외 기질 조건을 제공함을 입증하는 것이며, 이는 유망한 골 수리 및 재생용으로 활용될 수 있음을 뒷받침한다.
Next, the bone differentiation behavior of MSCs was evaluated to find the use of the nanohybrid as a bone regeneration material. After culturing for 14 days in osteoinductive medium conditions, bone-related gene expression levels (based on ALP) were evaluated by qPCR. ALP is considered an early marker of bone formation because it is essential for providing high concentrations of phosphate to the site of bone mineral deposition. Significantly higher ALP expression levels (~2.5-fold) were observed when grown on nanohybrids than on pure Chit (Fig. 3e). It was further confirmed that the ALP activity measured on
시험관 내 연구에 이어, 직교 이방성 조건(orthotropic conditions)(랫트 두개관 결함 모델에서)에서 조직과의 상호 작용을 조사하기 위해 생체 내 실험을 수행하였다. 두 가지 나노하이브리드 조성물(Chit@HA50 및 Chit@HA70 나노하이브리드)가 사용된 반면 Chit@HA90은 취성(취약한) 기계적 특성으로 인해 제외되었다. 샘플은 얇은 막 형태로 만들어진 후 랫트 두개관 결함 부위에 투여하여 골 재생을 유도하고 5주 동안의 '초기' 새로운 뼈(neo-bone) 형성을 μCT 및 조직학적 염색으로 조사하였다(도 3g). 모든 동물이 심각한 염증 징후 및 섬유 조직 내성장이 없이 유리한 골 형성 치유 반응을 나타내었는데, 이는 양호한 조직 적합성과 GBR(Guided Bone Regeneration) 멤브레인과 같은 섬유 조직 침범에 대한 장벽 역할을 하는 것을 시사한다. μCT 3D 이미지는 결함 영역 내에서 새로운 뼈('NB') 형성을 나타내었다. 짧은 치유 시간(5주)으로 인해 모든 그룹에서 완전하지는 않지만, 골 부피와 표면적 관련해서는, 새로운 뼈 형성이 순수 Chit보다 나노하이브리드에서 유의하게 더 높았다(도 3h 및 3i). H&E 염색된 샘플의 조직학적 분석을 통해, 치유 부위에서 새로 형성된 뼈와 유골(osteoid)이 관찰되었다. 새로운 뼈 조직은 오래된 뼈('OB') 가장자리에서 중앙 결함 영역을 향해서 자라는 것으로 관찰되었다. 주목할 점으로, Chit@HA70 그룹의 새로운 뼈 조직은 밀도가 높은 골아세포(*), 파골세포(#), 골세포(arrowheads) 및 섬유주(trabecular, T) 구조를 나타내어 골 기질 침착과 석회화가 동시에 진행되는 골 재형성 과정의 전형적인 재생 과정을 나타내었다. 결함(lacunae) 부위의 조골 세포의 수는 nanohybrids에서 유의하게 더 높은 것으로 분석되었다(도 3j). 또한, BSP(bone sialoprotein) 및 ALP와 같은 골 형성 세포에서 분비되는 필수 골 기질 분자는 나노하이브리드에서 더 높은 강도로 염색되었다(도 3k). 생체 내 결과를 종합하면, 나노하이브리드는 초기 새로운 뼈 재생 과정을 가속화하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었으며, 이는 골 복구 및 재생을 위한 이식 가능한 생체 재료로서의 활용 가능성을 시사한다. 여기에서 나노하이브리드의 생체 내 성능은 원래 형태로 분석되었으며, 다음 섹션에서 설명되는 바와 같이, 후보 치료 분자가 로딩될 경우 골재생능이 더욱 가속화될 것이다. Following in vitro studies, in vivo experiments were performed to investigate the interaction with tissue under orthotropic conditions (in a rat calvarial defect model). Two nanohybrid compositions (Chit@HA50 and Chit@HA70 nanohybrid) were used while Chit@HA90 was excluded due to its brittle (brittle) mechanical properties. After the sample was made in the form of a thin film, bone regeneration was induced by administering it to the rat calvarial defect, and 'initial' new bone (neo-bone) formation was examined by μCT and histological staining for 5 weeks (Fig. 3g). All animals exhibited favorable osteogenic healing responses without significant signs of inflammation and fibrous tissue growth, suggesting good histocompatibility and a barrier to fibrous tissue invasion, such as the Guided Bone Regeneration (GBR) membrane. The
4. 치료 분자를 전달하는 3D 골 재생용으로 디자인된 나노하이브리드4. Nanohybrids designed for 3D bone regeneration that deliver therapeutic molecules
나노하이브리드가 치료 분자를 로딩하고 전달할 수 있을 때, 조직 재생능이 크게 향상될 수 있다. 여기에서, 이러한 목적, 특히 다중 치료제의 전달을 위해 나노하이브리드가 디자인되었으며, 이는 고유한 코어-쉘 구조(및 필요한 경우 추가 코팅 공정)를 기반으로 하였다. 두 가지 및 세 가지 다른 약물(약물 I, II 및 III)을 추가 코팅층(여기서 젤라틴 '젤'을 사용함)을 포함하는 코어-쉘 구조의 나노스피어(nanospheres)에 로딩하는 방식이 도 4a에 개략적으로 나타내었다. 두 개의 다른 분자가 Gel과 Chit@IOC에서 분할되는 동안 메조다공성 유형의 IOC('MSN 또는 BGn')에 하나 이상의 분자가 로딩될 수도 있다. 개념 입증 실험에서 소수성 약물(약물 II, 'PTX'로 표시되는 파클리탁셀(paclitaxel))이 Chit 층에 포함되었고, 친수성 약물(약물 III, 'DOX'로 표시되는 독소루비신 염산염(doxorubicin hydrochloride))이 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 의해 겔 층에 침착되었다. Gel의 추가 코팅은 Chit@IOC의 초기 형태를 잘 보존하는 것으로 나타났다. 그 다음에 로딩된 약물의 방출을 측정하고 보정 곡선을 참조하여 표시하였다. 그 다음에 Chit@HA50-Gel의 이중 약물 방출 프로필을 조사하였다. 추가 Gel 층에 로딩된 약물 III('DOX')는 1일째부터 방출되기 시작하여 최대 7일 동안 선형 방출 속도를 보인 후 방출 속도가 느려지는 것으로 나타났다(도 4b). 반면에, 내부 Chit 층에 배치된 약물 II('PTX')는 ~5일 후에 방출되기 시작하여 ~15일에서 포화될때까지 점진적인 방출을 프로파일링하였다. 이러한 결과는 잘 디자인된 나노하이브리드 전달 시스템으로부터의 두 가지 다른 약물의 시간 의존적인 순차적 방출을 명확히 입증하였다.When nanohybrids can load and deliver therapeutic molecules, tissue regeneration can be greatly enhanced. Here, a nanohybrid was designed for this purpose, especially for the delivery of multiple therapeutic agents, which was based on a unique core-shell structure (and additional coating process if necessary). The loading of two and three different drugs (Drugs I, II and III) into core-shell structured nanospheres containing an additional coating layer (here a gelatin 'gel' is used) is schematically illustrated in Figure 4a. showed up More than one molecule can be loaded into a mesoporous type of IOC ('MSN or BGn') while two other molecules are resolved in Gel and Chit@IOC. In proof-of-concept experiments, a hydrophobic drug (Drug II, paclitaxel, denoted 'PTX') was incorporated into the Chit layer, and a hydrophilic drug (Drug III, doxorubicin hydrochloride, denoted 'DOX') was incorporated into the glutarate layer. The gel layer was deposited by means of glutaraldehyde. The additional coating of Gel was found to preserve the initial morphology of Chit@IOC well. The release of the loaded drug was then measured and plotted with reference to a calibration curve. The dual drug release profile of Chit@HA50-Gel was then investigated. Drug III ('DOX') loaded on the additional gel layer was released from
다음으로, Chit@BGn50-Gel 나노하이브리드를 제조하기 전에, 메조다공성 BGn 코어 내에서 약물 I(Phenamil, 'Phe')을 로딩하여 삼중 치료제 전달 시스템을 준비하였다. 이 경우, FGF2-GFP('FGF2', 약물 II) 및 덱사메타손('Dex'로 표시됨, 약물 III)은 각각 Chit 및 Gel에 포함된 다른 두 모델 치료 분자로 사용되었다. 계획한 대로, 세 분자 모두의 시간-순차적 방출이 확인되었다; 처음에는 분자 III('Dex')가 가장 바깥쪽 층(Gel)에서 방출되고 분자 II('FGF2')가 ~3일 후에 시작하여 내부 Chit 층에서 방출되고 마지막으로 분자 I('Phe')이 BGn의 메조포어에서 ~18일까지 방출되었다(도 4c). 주목할 점으로, 세 가지 치료제 모두의 방출 거동은 초기 폭발적인 방출 없이 상당히 점진적이었고, 며칠에서 몇 주 동안 지속 가능하여, 일관되게 방출된 분자의 장기적인 치료 효능을 나타낼 수 있음을 시사한다. 또한, 가장 안쪽의 메조다공성 코어에 배치한 Phe의 방출 속도는 비분해성 메조다공성 코어(MSN)가 사용된 Chit 쉘 두께(Chit@MSN 조성물에서 허용됨)에 따라 제어되었다; 36일 동안 방출된 Phe의 양은 Chit@MSN70-Gel, Chit@MSN50-Gel 및 Chit@MSN30-Gel에 대해 각각 ~90%, ~66% 및 ~27%로 나타났다(도 4d). 이러한 결과는 Chit 쉘이 코어 내부에 배치된 치료 분자의 확산 장벽으로 효과적으로 작용할 수 있으며, 또한 나노하이브리드가 제어된 치료 전달 시스템에 사용될 수 있음을 시사한다.Next, before fabricating the Chit@BGn50-Gel nanohybrid, a triple therapeutic agent delivery system was prepared by loading drug I (Phenamil, 'Phe') in the mesoporous BGn core. In this case, FGF2-GFP (‘FGF2’, drug II) and dexamethasone (denoted ‘Dex’, drug III) were used as the other two model therapeutic molecules included in Chit and Gel, respectively. As planned, time-sequential release of all three molecules was confirmed; Initially, molecule III ('Dex') is released from the outermost layer (Gel), molecule II ('FGF2') is released from the inner Chit layer starting ~3 days later, and finally molecule I ('Phe') is released. It was released from the mesopores of BGn by ~18 days (Fig. 4c). Of note, the release behavior of all three therapeutics was fairly gradual without an initial burst release and was sustained over days to weeks, suggesting a possible long-term therapeutic efficacy of consistently released molecules. In addition, the release rate of Phe placed in the innermost mesoporous core was controlled according to the Chit shell thickness (allowed for the Chit@MSN composition) in which the non-degradable mesoporous core (MSN) was used; The amount of Phe released over 36 days was ~90%, ~66%, and ~27% for Chit@MSN70-Gel, Chit@MSN50-Gel, and Chit@MSN30-Gel, respectively (Fig. 4d). These results suggest that the Chit shell can effectively act as a diffusion barrier for therapeutic molecules disposed inside the core, and that the nanohybrid can also be used in a controlled therapeutic delivery system.
다음으로, 다중 치료제 전달 시스템으로서 나노하이브리드의 시험관 내 및 생체 내 생물학적 효능을 조사하였다. 대표적인 실험 그룹으로, 세가지 다른 치료 분자(Dex, FGF2 및 Phe)를 로딩한 Chit@BGn70을 실험하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 세가지 분자의 시간 의존적인 순차적 방출은 골 재생 과정의 상이한 시간 프레임에서 요구되는 생물학적 이벤트(항염, 혈관신생 촉진 및 골 자극)을 효과적으로 조절하는 것으로 간주된다. 먼저, 상대적으로 빠르게 방출된다고 간주되는 Dex의 생물학적 기능을 대식세포 세포주(RAW264.7)에 대한 항염증 효과 측면에서 조사하였다. 나노하이브리드 추출물로 4시간 동안 배양한 대식세포는 염증유발 마커인, 산화질소(nitric oxide, NO)를 더 적은 양으로 방출하고, 염증유발 유전자(IL-1β를 현저하게 낮게 발현하는 것으로 나타났다. 이는 염증반응을 보조하는데 있어서, 나노하이브리드에서 처음에 방출된 Dex의 생물학적 효능을 보여주는 것이다(도 5b). 한 가지 주목해야 할 점은 약물이 없는 Chit@BGn70에서 세포의 항염증 징후가 Chit에 비해 현저히 감소했는데, 이는 BGn을 포함하는 나노하이브리드에서 방출된 이온에 기인될 수 있고(실리케이트 및 Ca 이온 방출 데이터에서 추론됨), Chit@BGn 나노하이브리드는 이러한 이온이 이전에 혈관신생 및 골 촉진으로 나타났기 때문에 이온 방출과 관련된 추가적인 치료 장점을 가지고 있음을 명확히 보여주는 것이다.Next, the in vitro and in vivo biological efficacy of the nanohybrid as a multi-therapeutic delivery system was investigated. As a representative experimental group, Chit@BGn70 loaded with three different therapeutic molecules (Dex, FGF2 and Phe) were tested. As shown in FIG. 5A , the time-dependent sequential release of the three molecules is considered to effectively modulate the biological events (anti-inflammation, promotion of angiogenesis and bone stimulation) required in different time frames of the bone regeneration process. First, the biological function of Dex, which is considered to be released relatively quickly, was investigated in terms of its anti-inflammatory effect on macrophage cell line (RAW264.7). It was found that macrophages cultured for 4 hours with the nanohybrid extract released a lower amount of the inflammatory marker, nitric oxide (NO), and expressed significantly lower levels of the inflammatory gene (IL-1β). It shows the biological efficacy of Dex initially released from the nanohybrid in supporting the inflammatory response (Fig. 5b) One thing to note is that the anti-inflammatory signs of cells in drug-free Chit@BGn70 were significantly greater than in Chit. decreased, which could be attributed to ions released from nanohybrids containing BGn (inferred from silicate and Ca ion release data), and Chit@BGn nanohybrids, as these ions had previously been shown to promote angiogenesis and bone It clearly shows that it has additional therapeutic advantages related to ion release.
다음으로, 인간 내피 세포주(HUVECs)를 사용하여 나노하이브리드에서 두 번째로 방출되는 FGF2(약물 II)의 혈관신생 역할을 분석하였습니다. 나노하이브리드 추출물을 처리한 HUVECs을 Matrigel이 코팅된 배양 디쉬에서 배양하여 관(tubule) 형성이 가능하도록 하였다. 12시간째에, 나노하이브리드 처리된 세포는 관의 원(circle) 및 마디(node) 수 측면에서 상당히 향상된 관 형성을 나타내었고, 내피 세포를 자극하는 FGF2의 생물학적 역할을 입증하였다(도 5c). 마지막으로, 가장 천천히 방출되는 약물 Phe의 골분화에 대한 효과는 Phe가 BMP 신호 활성화제로 알려져 있기 때문에 MSC를 사용하여 조사했다. MSCs를 골형성 배지에서 나노하이브리드 추출물과 함께 배양하고 골형성 성숙도를 평가하였다. Phe가 로딩된 나노하이브리드 샘플로 4일 동안 배양했을 때, MSCs는 Phe가 로딩되지 않은 샘플로 배양된 것보다 유의하게 더 높은 ALP 활성을 나타냈다(도 5d). 더욱이, 후기 골형성 마커인, 오스테오칼신(OCN)의 발현은 Phe-방출 나노하이브리드에 의해 고도로 상향 조절되었다(도 5e). 종합하면, 삼중 분자(Dex, FGF2 및 Phe)가 로딩된 Chit@BGn 나노하이브리드는 다른 치료 분자의 순차적 효과를 부각하면서, 초기에 대식세포에 대한 항염증 효과를 나타내고(~4시간), 그 다음 내피 세포의 혈관신생 활성화(~12시간), 마지막으로 장기간(~7일)에 MSCs의 골형성 자극을 보여준다; 중요하게도, 이러한 점은 일련의 대식세포의 항염증, 내피 세포의 혈관신생 촉진 및 상주하는 MSCs의 골형성이 집합적으로 및/또는 순차적으로 필요한, 골재생의 경우와 관련이 있다.Next, we analyzed the angiogenic role of the second released FGF2 (drug II) from the nanohybrid using human endothelial cell lines (HUVECs). HUVECs treated with the nanohybrid extract were cultured on Matrigel-coated culture dishes to allow tubule formation. At 12 h, nanohybrid-treated cells exhibited significantly improved tube formation in terms of number of tube circles and nodes, demonstrating the biological role of FGF2 in stimulating endothelial cells (FIG. 5c). Finally, the effect of the slow-release drug Phe on osteogenic differentiation was investigated using MSCs because Phe is known to be a BMP signaling activator. MSCs were cultured with the nanohybrid extract in an osteogenic medium and the degree of osteogenic maturity was evaluated. When cultured with Phe-loaded nanohybrid samples for 4 days, MSCs showed significantly higher ALP activity than those cultured with non-Phe-loaded samples (Fig. 5d). Moreover, the expression of osteocalcin (OCN), a late osteogenic marker, was highly upregulated by the Phe-releasing nanohybrid (Fig. 5e). Taken together, the Chit@BGn nanohybrid loaded with the triple molecule (Dex, FGF2 and Phe) shows an anti-inflammatory effect on macrophages initially (~4 hours), followed by an anti-inflammatory effect on macrophages, highlighting the sequential effects of the other therapeutic molecules. Angiogenic activation of endothelial cells (~12 h), and finally osteogenic stimulation of MSCs over a long period (~7 days) is shown; Importantly, this is relevant in the case of bone regeneration, where a series of macrophage anti-inflammation, endothelial cell angiogenesis promotion and resident MSCs osteogenesis are required collectively and/or sequentially.
상기 시험관 내 연구에 따라, 생체 내에서 골재생 환경에서 삼중-치료제 전달 가능성을 입증하는 실험을 수행하였다. 이를 위해서, 두 가지 다른 조성물(Chit@BGn70 및 Chit@BGn70+Tri)를 3D 프린팅된 PCL 스캐폴드에 코팅하여 최대 12주 동안 랫트 두개관 결함 모델에 이식했다(도 5f). 12주째에 촬영한 μCT 3D 이미지는 약물이 없는 Chit@BGn70 그룹보다 Chit@BGn70+Tri 그룹의 결함 영역 내에서 새로운 뼈 형성(녹색)이 크게 증가한 것으로 나타났다(도 5g). 정량분석시, 새로운 뼈 형성은 특히, 12주째에 골 부피 및 표면적 모두에서 Chit@BGn70보다 Chit@BGn70+Tri에서 유의하게 더 증가하였다(도 5h). 시험관 내 및 생체 내 결과로 볼 때, 삼중 치료제가 로딩된 나노하이브리드는 새로운 뼈 재생 과정을 가속화하는 것으로 입증되었으며, 이는 생체 내 샘플에서 분석되지는 않았지만 시험관 내 연구로부터, 방출된 치료 분자에 의한 항염증, 혈관신생 촉진 및 골자극의 집합적인 이벤트일 수 있다. 또한, 이러한 발견은 나노하이브리드 기반 3D 스캐폴드가 골 복구 및 재생을 위한 다중 약물 전달 이식 가능한 생체 재료로서 잠재적으로 유용할 수 있음을 시사한다. 이러한 개념은 뼈에 국한되지 않고, 다양한 조직에도 적용될 수 있고(예: 피부, 근육 및 신경), 다중 치료제의 제어되고 순차적인 전달이 잠재적으로 상처 치유 및 조직 복구 과정을 가속화해야 할 필요가 있는 표적 조직을 위한 적절한 코어 조성물 및 치료 분자로 제형화될 때, 이것은 연구의 추가 분석할 여지가 있다.According to the above in vitro study, an experiment was conducted to demonstrate the possibility of delivering the triple-therapeutic agent in an in vivo bone regeneration environment. To this end, two different compositions (Chit@BGn70 and Chit@BGn70+Tri) were coated on 3D printed PCL scaffolds and implanted into a rat calvarial defect model for up to 12 weeks (Fig. 5f).
종합하면, 새로운 자기조립 나노하이브리드는 초고함량의 무기질, 형상-성형성, 고탄력성, 나노-거칠기 표면, 다중 치료제 전달 및 골 재생 잠재력을 포함한 다기능의 고유 특성을 보여주면서, 뼈를 포함한 조직의 재생 및 복구를 위한 유망한 이식 가능한 3D 생체 재료 플랫폼으로 고려될 수 있다.Taken together, the novel self-assembling nanohybrids show multifunctional unique properties including ultra-high mineral content, shape-formability, high elasticity, nano-rough surface, multi-therapeutic delivery and bone regeneration potential, while regenerating tissues including bone. and a promising implantable 3D biomaterials platform for repair.
본 명세서에서 설명된 상기 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다. The specific embodiments described in this specification are meant to represent preferred embodiments or examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby. It will be apparent to those skilled in the art that variations and other uses of the present invention do not depart from the scope of the invention described in the claims.
<110> DANKOOK UNIVERSITY CHEONAN CAMPUS INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> nanohybrid comprising organic-inorganic core-shell nanoparticle and method of manufacturing the same <130> APP2021-0440KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for ALP gene <400> 1 ctctgccgtt gtttctctat 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for ALP gene <400> 2 aggtgctttg ggaatctg 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for GAPDH(1) gene <400> 3 caaggatact gagagcaaga g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for GAPDH(1) gene <400> 4 atggaattgt gagggagatg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for IL-1 beta gene <400> 5 ctgtgactca tgggatgatg atg 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for IL-1 beta gene <400> 6 gcctgtagtg cagttgtcta at 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for GAPDH(2) gene <400> 7 gaaacctgcc aagtatgatg 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for GAPDH(2) gene <400> 8 ggagttgctg ttgaagtc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for OCN gene <400> 9 gcttcagctt tggctact 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for OCN gene <400> 10 cgttcctcat ctggacctta t 21 <110> DANKOOK UNIVERSITY CHEONAN CAMPUS INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> nanohybrid comprising organic-inorganic core-shell nanoparticle and method of manufacturing the same <130> APP2021-0440EN <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward PCR primer for ALP gene <400> 1 ctctgccgtt gtttctctat 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse PCR primer for ALP gene <400> 2 aggtgctttg ggaatctg 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward PCR primer for GAPDH(1) gene <400> 3 caaggatact gagagcaaga g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse PCR primer for GAPDH(1) gene <400> 4 atggaattgt gagggagatg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward PCR primer for IL-1 beta gene <400> 5 ctgtgactca tgggatgatg atg 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse PCR primer for IL-1 beta gene <400> 6 gcctgtagtg cagttgtcta at 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward PCR primer for GAPDH(2) gene <400> 7 gaaacctgcc aagtatgatg 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse PCR primer for GAPDH(2) gene <400> 8 ggagttgctg ttgaagtc 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward PCR primer for OCN gene <400> 9 gcttcagctt tggctact 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse PCR primer for OCN gene <400> 10 cgttcctcat ctggacctta t 21
Claims (14)
A self-assembled nanohybrid comprising nanoparticles composed of an inorganic nanoparticle core and a chitosan shell.
상기 나노하이브리드는 코팅 겔 층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 1,
The nanohybrid further comprises a coating gel layer.
상기 코팅 겔은 젤라틴, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 알지네이트, 플루로닉 및 히알루론산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 2,
The coating gel is a nanohybrid, characterized in that it comprises at least one selected from the group consisting of gelatin, collagen, laminin, fibronectin, alginate, pluronic and hyaluronic acid.
상기 무기물 나노입자는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 나노입자, 생활성 유리 나노입자, 메조다공성 실리카 나노입자, 실리케이트 나노입자, 인산칼슘 나노입자 및 자성 나노입자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 1,
The inorganic nanoparticles are nanohybrids, characterized in that selected from the group consisting of hydroxyapatite nanoparticles, bioactive glass nanoparticles, mesoporous silica nanoparticles, silicate nanoparticles, calcium phosphate nanoparticles and magnetic nanoparticles .
상기 무기물 나노입자 코어와 키토산 쉘의 질량비는 1:9 ~ 9:1인 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 1,
Nanohybrid, characterized in that the mass ratio of the inorganic nanoparticle core and the chitosan shell is 1: 9 ~ 9: 1.
상기 나노하이브리드는 인장 강도가 0.8 ~ 4.0 MPa인 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 1,
The nanohybrid is a nanohybrid, characterized in that the tensile strength of 0.8 ~ 4.0 MPa.
상기 나노하이브리드는 연신율이 60 ~ 410%인 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 1,
The nanohybrid is a nanohybrid, characterized in that the elongation is 60 ~ 410%.
상기 나노하이브리드는 탄성 계수가 0.5~2.5 MPa인 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 1,
The nanohybrid is a nanohybrid, characterized in that the elastic modulus is 0.5 ~ 2.5 MPa.
상기 나노하이브리드는 생분해성 고분자로 이루어진 나노섬유 또는 스캐폴드에 코팅되는 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 1,
The nanohybrid is a nanohybrid, characterized in that coated on a nanofiber or scaffold made of a biodegradable polymer.
상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(polycaprolactones), 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트
(polyhydroxybutyrates), 폴리히드록시발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(polyorthocarbonates), 옥살산염폴리알킬렌(polyalkyleneoxalates), 숙신산염폴리알킬렌(polyalkylenesuccinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성 단백질(modified proteins), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체(terpolymers), 이들의 혼합물(mixtures) 또는 이들의 중합체 혼합물(polymer blends)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노하이브리드.
According to claim 9,
The biodegradable polymers include polycaprolactones, polyglycolides, polylactides, polytrimethylenecarbonates, and polyhydroxybutyrates.
(polyhydroxybutyrates), polyhydroxyvalerates, polydioxanones, polyorthoesters, polycarbonates, polytyrosinecarbonates, polyorthocarbonates, oxalates polyalkyleneoxalates, polyalkylenesuccinates, poly(malic acid), poly(maleic anhydride), polypeptides, polydepsis Peptides, polyvinylalcohol, polyesteramides, polyamides, polyanhydrides, polyurethanes, polyphosphazenes, polycyanoacrylates polycyanoacrylates, polyfumarates, poly(amino acids), modified polysaccharides, modified proteins, copolymers thereof, and terpolymers thereof ), a mixture thereof, or a nanohybrid, characterized in that at least one selected from the group consisting of polymer blends thereof.
A composition for bone regeneration comprising the nanohybrid of any one of claims 1 to 10 as an active ingredient.
A tissue regeneration method comprising the step of treating damaged bone tissue of an animal other than human with the nanohybrid of any one of claims 1 to 10.
(a) 키토산을 산성 용액에 녹인 후, 무기물 나노입자(IOC)를 첨가하고 혼합물을 균질화한 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 염기성 용액을 첨가하여 중화시키고 투석한 용액을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 투석된 용액을 몰드로 옮기고, 증발시켜 막 형태의 나노하이브리드 수득하는 단계.
A method for preparing the nanohybrid of any one of claims 1 to 10 comprising the following steps:
(a) dissolving chitosan in an acidic solution, adding inorganic nanoparticles (IOC) and preparing a homogenized solution;
(b) adding a basic solution to the product of step (a) to neutralize it and obtaining a dialyzed solution; and
(c) transferring the dialyzed solution of step (b) to a mold and evaporating to obtain a nanohybrid in the form of a membrane.
상기 단계 (c)의 나노하이브리드는 0.01~1 wt% 젤라틴 용액으로 코팅하여 코팅 겔 층을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.According to claim 13,
The nanohybrid of step (c) is coated with a 0.01 to 1 wt% gelatin solution to form a coating gel layer.
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