KR20230044631A

KR20230044631A - mRNA/DNA hybrid system capable of self-amplification and synthesizing protein and composition thereof

Info

Publication number: KR20230044631A
Application number: KR1020210126970A
Authority: KR
Inventors: 김성천
Original assignee: 김성천
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2023-04-04

Abstract

In order to efficiently edit the genome of interest, the present invention provides a replicable genome editing system with a self-replicating genome editing tool and a composition thereof. There is at least one component in the cell capable of protein synthesis and replication, wherein the system comprises: (i) an RNA cassette for expressing RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (RdRp RNA cassette); and (ii) a DNA cassette encoding the mRNA replicon of interest that can be replicated by the RdRp (replicon DNA cassette).

Description

자가 증폭이 가능하고 단백질을 합성하는 mRNA/DNA 하이브리드 시스템 및 이의 조성물{mRNA/DNA hybrid system capable of self-amplification and synthesizing protein and composition thereof}mRNA/DNA hybrid system capable of self-amplification and synthesizing protein and composition thereof

본 발명은 효율적인 단백질 합성을 하기 위해서 자가 증폭이 가능한 mRNA/DNA 하이브리드 시스템 및 이의 조성물에 대한 기술이다.The present invention relates to a self-amplifying mRNA/DNA hybrid system and a composition thereof for efficient protein synthesis.

유전자 치료(gene therapy) 및 유전적 백신 접종(genetic vaccination)은 근대 의학의 가장 유망하고 빠르게 개발되는 방법이다. 그들은 매우 다양한 질환(disease)의 치료를 위한 특이적이고 각각의 옵션(option)을 제공할 수 있다. 특히, 선천성 유전적 질환(inherited genetic disease)뿐만 아니라 자가 면역 질환(autoimmune disease), 감염성 질환(infectious disease), 암성(cancerous) 또는 종양-연관 질환 뿐만 아니라 염증성 질환(inflammatory disease)은 이러한 치료 접근법의 대상이 될 수 있다. 또한, 이들 접근법에 의해 이와 같은 질환의 (조기) 발병을 예방할 수 있다.Gene therapy and genetic vaccination are the most promising and rapidly developing methods of modern medicine. They can provide specific and individual options for the treatment of a wide variety of diseases. In particular, inherited genetic diseases as well as autoimmune, infectious, cancerous or tumor-associated diseases as well as inflammatory diseases are examples of such treatment approaches. can be a target In addition, these approaches may prevent the (early) onset of such diseases.

유전자 치료의 주요 개념의 합리적인 근거는 특정 질환의 병리학적 상태와 관련된 손상된(impaired) 유전자 발현의 적절한 조절이다. 병리학적으로 변형된 유전자 발현은 필수적인 유전자 산물의 부족 또는 과생산이 원인이 될 수 있으며, 예를 들어, 호르몬과 같은 신호전달 인자, 하우스키핑(housekeeping) 인자, 대사 효소(metabolic enzyme), 구조 단백질 등이 있다. 변형된 유전자 발현은 전사 및/또는 번역의 오조절(mis-regulation) 때문일 뿐만 아니라, 특정 단백질을 코딩하는 ORF 내의 돌연변이 때문일 수도 있다. 병리학적 돌연변이는 예를 들어, 염색체 이상(chromosomal aberration), 또는 점 돌연변이 또는 구조-이동 돌연변이와 같은 보다 특이적 돌연변이에 의해 발생할 수 있으며, 이들 모두 잠재적으로 제한된 기능 및 유전자 산물의 기능의 총 손실이 발생할 수 있다. 그러나, 전사 및/또는 번역의 오조절은 또한 발생할 수 있고, 돌연변이가 단백질을 코딩하는 유전자에 영향을 준다면, 이는 세포의 전사 또는 번역 기계(machinery)에 포함된다. 이러한 돌연변이는 유전자의 병리학적 상향- 또는 하향-조절로 이어질 수 있다. 이러한 조절하는 기능을 발휘하는 유전자 산물을 코딩하는 유전자는 예를 들어, 전사 인자, 신호 수용체, 전령 단백질 등일 수 있다. 그러나, 이러한 조절 단백질을 코딩하는 유전자의 기능 손실은, 특정 상황에서, 손상된 유전자 산물의 추가적인 다운스트림(downstream)으로 행동하는 다른 인자의 인공적인 도입에 의해 반전된다. 이러한 유전자 결함(defect)은 또한 영향을 받는 유전자 자가의 치환을 통한 유전자 치료에 의해 보상될 수 있다.The rational basis of the main concept of gene therapy is the appropriate regulation of the expression of an impaired gene associated with the pathological condition of a specific disease. Pathologically altered gene expression can be caused by insufficient or overproduction of essential gene products, e.g., signaling factors such as hormones, housekeeping factors, metabolic enzymes, and structural proteins. etc. Altered gene expression may not only be due to mis-regulation of transcription and/or translation, but may also be due to mutations in the ORF encoding a particular protein. Pathological mutations can occur, for example, by chromosomal aberrations, or by more specific mutations such as point mutations or structure-shift mutations, all of which potentially result in limited function and total loss of function of the gene product. can happen However, misregulation of transcription and/or translation can also occur, and if the mutation affects the gene encoding the protein, it is involved in the cell's transcription or translation machinery. Such mutations can lead to pathological up- or down-regulation of genes. Genes encoding gene products that exert such regulatory functions may be, for example, transcription factors, signal receptors, messenger proteins, and the like. However, loss of function of genes encoding these regulatory proteins is, in certain circumstances, reversed by artificial introduction of other factors that act further downstream of the damaged gene product. These genetic defects can also be compensated for by gene therapy through replacement of the affected gene itself.

유전자 치료 및 유전적 백신 접종은 환자에 핵산 분자의 투여 및 이후의 코딩된 유전적 정보의 전사 및/또는 번역에 본질적으로 기초한다. 유전자 치료 또는 유전적 백신 접종에서, RNA 뿐만 아니라 DNA는 투여를 위한 핵산 분자로서 사용될 수 있다. DNA는 상대적으로 안정하고 다루기 쉽다. 그러나, DNA의 사용은 손상된 유전자 기능의 손실이 잠재적으로 발생하는 환자의 유전체 내로 투여된 DNA-절편의 원하지 않은 삽입 위험이 있을 수 있다.Gene therapy and genetic vaccination are essentially based on the administration of nucleic acid molecules to a patient and the subsequent transcription and/or translation of the encoded genetic information. In gene therapy or genetic vaccination, RNA as well as DNA can be used as nucleic acid molecules for administration. DNA is relatively stable and easy to handle. However, the use of DNA may carry the risk of unwanted insertion of the administered DNA-segment into the genome of the patient, potentially resulting in loss of impaired gene function.

추가의 위험으로, 항-DNA 항체의 원하지 않은 생성이 나타나는 것이다. 또 다른 문제점은, DNA 투여 및 이의 이후의 전사/번역에 의해 달성될 수 있는 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 한정된 발현 수준이다. 다른 인자들 중에서, DNA 전사를 조절하는 특정 전사인자의 존재는 투여된 DNA의 발현 수준에 주요한 영향을 준다. 이러한 인자의 부재에서, DNA 전사는 만족스러운 양의 RNA를 산출할 수 없다. 결과적으로, 수득된 번역된 펩타이드 또는 단백질의 수준은 한정된다.An additional risk is the unwanted production of anti-DNA antibodies. Another problem is the limited expression level of the encoded peptide or protein that can be achieved by DNA administration and subsequent transcription/translation. Among other factors, the presence of specific transcription factors that regulate DNA transcription have a major impact on the expression level of the administered DNA. In the absence of these factors, DNA transcription cannot yield satisfactory amounts of RNA. As a result, the level of translated peptide or protein obtained is limited.

유전자 치료 또는 유전적 백신 접종을 위해 DNA 대신 RNA를 이용함으로써, 원하지 않는 유전체 통합(genomic integration) 및 항-DNA 항체의 생성 위험은 최소화되거나 완전히 회피할 수 있다. 그러나, RNA는 다소 불안정한 분자 종류로 간주된다. 한편으로는, 세포 외 공간에서, RNA는 거의 유비쿼터스 RNase에 의해 분해될 수 있다. 다른 한편으로는, 세포질 내 생체 내(in vivo) mRNA 반감기는, mRNA 분자 내 시스-작용 요소에, 적어도 부분적으로 따라 효소 mRNA 붕괴의 속도에 의해 한정된다. 그렇게 함으로써, mRNA의 조절된 분해(degradation)는 진핵생물 유전자 발현의 우수한 조절에 영향을 준다. 따라서, 각각의 자연적으로 발생하는 mRNA는, mRNA가 유래된 유전자에 따라 이의 개별적인 반감기를 갖는다.By using RNA instead of DNA for gene therapy or genetic vaccination, the risk of unwanted genomic integration and generation of anti-DNA antibodies can be minimized or completely avoided. However, RNA is considered to be a rather unstable class of molecules. On the one hand, in the extracellular space, RNA can be degraded by the almost ubiquitous RNases. On the other hand, the in vivo mRNA half-life in the cytoplasm is limited by the rate of enzymatic mRNA decay, which depends, at least in part, on cis-acting elements within the mRNA molecule. In doing so, the regulated degradation of mRNA influences better control of eukaryotic gene expression. Thus, each naturally occurring mRNA has its own individual half-life depending on the gene from which the mRNA is derived.

몇 년 동안, 일반적으로 mRNA는 유전자 치료 관심을 위해 효과적으로 사용되기에는 너무 불안정하다고 받아들여졌다. 그러나 지난 10년간, 형질전환 효율 및 단백질 발현의 지속과 관련된 놀라운 결과를 가진 mRNA-매개 형질전환의 가능성을 증명하였을 뿐만 아니라, pDNA의 사용을 통해 주요한 장점을 증명할 수 있었다. 이들 장점 중 하나는 mRNA가 코딩된 단백질 합성을 위해 핵 장벽(nuclear barrier)을 통과할 필요가 없는 사실이다.For several years, it was generally accepted that mRNA was too unstable to be used effectively for gene therapy interest. However, in the past decade, major advantages have been demonstrated through the use of pDNA, as well as demonstrating the potential of mRNA-mediated transformation with surprising results regarding transformation efficiency and sustained protein expression. One of these advantages is the fact that mRNA does not have to cross the nuclear barrier for synthesis of the encoded protein.

유전자 치료 및 유전적 백신 접종을 위해, 변형되어 안정화된 RNA는 보통 신속하게 붕괴되는 비변형_RNA보다 보통 더욱 적합하다. 또한, RNA-서열에 의해 코딩된 생산물은 생체 내(in vivo)에 축적하기에 유리하다. 다른 한편으로는, RNA는 적절한 투여 형태로 제조될 때, 그리고 투여될 때, 이의 저장 과정에서, 이의 구조적 및 기능적 무결성(integrity)을 유지해야 한다. 그들이 조기 분해 또는 붕괴되는 것을 예방하기 위해서, 유전자 치료 또는 유전적 백신 접종에 안정한 RNA 분자를 제공하기 위해 상당한 노력이 필요하다.For gene therapy and genetic vaccination, modified and stabilized RNA is usually more suitable than unmodified_RNA, which decays rapidly. In addition, products encoded by RNA-sequences are advantageous for accumulation in vivo. On the other hand, RNA must maintain its structural and functional integrity when prepared in an appropriate dosage form and when administered, during its storage. Considerable effort is needed to provide stable RNA molecules for gene therapy or genetic vaccination, in order to prevent them from premature degradation or decay.

세포 내로 도입 이후, (비-안정화) mRNA의 반감기는 제한된다. 결과적으로, 이러한 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 생산은 최대 며칠 동안 유지된다. 따라서, 이 사실은 (비-안정화) mRNA-기반 유전자 치료의 적용을 제한한다. 이는 반복적인 투여를 요구하기 때문에, 예를 들어, 유전 질환을 치료하는데 사용될 수 없다.After introduction into cells, the half-life of (non-stabilized) mRNA is limited. As a result, production of proteins encoded by these mRNAs is maintained for up to several days. Thus, this fact limits the application of (non-stabilizing) mRNA-based gene therapy. Because it requires repeated administration, it cannot be used, for example, to treat genetic disorders.

mRNA는 특히 분해 효소에 노출된 세포질에 도달하면 일반적으로 DNA와 비교하여 상당히 불안정한 것으로 간주된다. 이의 불안정성의 주요 이유는 당 성분의 두 번째 탄소 원자상의 하이드록실기이며, 이는, 입체 장애(sterical hindrance)로 mRNA가 안정한 이중 β-나선 구조를 형성는 것을 방해하나, 이는 RNA 분자를 더 잘 가수 분해되도록 한다. 세포 내 mRNA 전달은 회의적이었고, 이는 mRNA가 매우 불안정하고 형질전환 프로토콜을 견딜 수 없다는 믿음이 주요 원인이었다.mRNA is generally considered quite unstable compared to DNA, especially once it reaches the cytoplasm where it is exposed to degrading enzymes. The main reason for its instability is the hydroxyl group on the second carbon atom of the sugar moiety, which, by sterical hindrance, prevents the mRNA from forming a stable double β-helix, which better hydrolyzes the RNA molecule. Let it be. Intracellular mRNA delivery has been skeptical, a major reason being the belief that mRNA is highly labile and cannot withstand transfection protocols.

RNA의 장점 중 하나는 RNA의 작용은 세포의 세포질로 RNA를 전달하면 세포질에 RNA의 기능을 수행하기에 충분하다(핵막을 통과해야만 하는 DNA와 대조적으로). 그러나, 나출(naked) 핵산 분자는 큰 크기 및 음이온으로 대전된 포스페이트기에 기인하는 친수성 본질 때문에 효과적으로 세포에 들어가지 못 한다. 추가적으로, 그들은 뉴클레아제-매개 분해에 매우 민감하다. 따라서, 유전자 치료를 위한 도전은 세포로 RNA 전달에 효과적이고 안전한 수단을 개발하는 것이다.One of the advantages of RNA is that RNA's ability to transport RNA into the cell's cytoplasm is sufficient to carry out its function in the cytoplasm (as opposed to DNA, which must cross the nuclear membrane). However, naked nucleic acid molecules do not effectively enter cells due to their large size and hydrophilic nature due to anionically charged phosphate groups. Additionally, they are highly susceptible to nuclease-mediated degradation. Thus, the challenge for gene therapy is to develop effective and safe means of RNA delivery into cells.

일반적으로, 바이러스 및 비-바이러스 전달 방법은 개발되어 있다. 안전 및 공정 경제(procis economy)와 관련하여, 비-바이러스 방법이 보통 바람직하다. 이들 방법 중 일부는 세포막 장벽 기능의 물리적 차단에 기초하는 반면에, 다른 것들은 전달된 유전자의 분해없이 관심 세포로 유전자 도입을 용이하게 하기 위해서 양이온성 담체 분자를 이용한다.Generally, viral and non-viral delivery methods have been developed. With regard to safety and procis economy, non-viral methods are usually preferred. Some of these methods are based on physical blocking of cell membrane barrier function, while others use cationic carrier molecules to facilitate gene introduction into cells of interest without degradation of the transferred gene.

백신으로서 RNA를 사용하는 실험으로부터 분명할 뿐만 아니라, 생체 내(in vivo) 이종(heterologous) mRNA의 도입에 매개된 단백질 발현은 일반적으로 가능하고, 검출 가능한 면역 반응을 높이기 위해 충분하다. 그러나, 효과적인 면역 반응을 높이고, 더욱더, mRNA-매개 단백질 공급에 의한 치료 효과를 달성하는 것은 단백질 발현에 필요한 수준의 관점에서 더욱 요구될 수 있다.As is evident from experiments using RNA as a vaccine, protein expression mediated by the incorporation of heterologous mRNA in vivo is generally possible and sufficient to elevate a detectable immune response. However, enhancing an effective immune response and, moreover, achieving a therapeutic effect by mRNA-mediated protein supply may be more demanding in terms of the level required for protein expression.

그러나, 합성 RNA는 세포질에서 지속시간이 2-4일 정도로 짧은 문제점이 있는데, 이는 세포질 내의 각종 핵산분해효소로 인해 RNA가 쉽게 분해되고 세포분열이 일어날 경우에는 RNA의 농도가 희석되기 때문이다. 이러한 짧은 지속성 문제로 인해 합성 RNA를 빈번하게 주입해야 하는 문제점이 발생하고 있을 뿐만 아니라, 긴 반감기를 가지는 관심 단백질을 합성하여 제공하기에는 그 지속성이 짧아서 효율이 매우 저조하다는 한계도 가지고 있으며, 이러한 한계점들은 RNA를 이용한 치료제 개발을 더디게 하고 있다.However, synthetic RNA has a short duration of 2-4 days in the cytoplasm, because RNA is easily degraded by various nucleases in the cytoplasm and the concentration of RNA is diluted when cell division occurs. Due to this short persistence problem, not only the problem of frequently injecting synthetic RNA occurs, but also has the limitation that the efficiency is very low due to the short persistence to synthesize and provide a protein of interest with a long half-life. The development of RNA-based therapeutics is slowing down.

기존의 관심 단백질 합성 지속성을 향상시키려는 노력들은 다양한 전달체를 이용하여 RNA의 탑제 효율을 증가시킴으로써 되도록 많은 양의 RNA를 전달하려는 시도들이 있다. 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 또는 리포좀에 기반한 전달체가 주로 사용되었으나, 양이온성 분자 또는 합성 고분자를 이용한 전달체의 경우 세포 내로의 수송 효율이 낮으며 세포 내로의 유전자 전달과정에서 유발될 수 있는 세포 독성에 대한 문제가 있다. Existing efforts to improve the sustainability of protein synthesis of interest have attempted to deliver as much RNA as possible by increasing the efficiency of RNA loading using various delivery systems. Delivery systems based on lipofectin, lipofectamine, cellpectin, cationic phospholipid nanoparticles, cationic polymers, or liposomes have been mainly used, but delivery systems using cationic molecules or synthetic polymers have low intracellular transport efficiency and There is a problem about cytotoxicity that can be caused in the process of gene delivery into the cell.

또한, 관심 단백질 합성의 지속성이 오랫동안 나타날 수 있는 바이러스 벡터의 경우, 그 우수한 지속성에도 불구하고 바이러스 벡터의 표면 단백질의 면역원성으로 인한 면역 부작용을 일으켜 체내 안정성이 보장되지 못하는 문제가 지적되었다. 무엇보다 외래 유전자가 환자의 게놈(genome)에 삽입될 수 있는 위험성 문제로 인해 바이러스를 이용한 관심 단백질 합성은 인체적용에 제한을 가질 수밖에 없다.In addition, in the case of a viral vector, in which the synthesis of a protein of interest can be sustained for a long time, it has been pointed out that stability in the body is not guaranteed due to immune side effects due to the immunogenicity of the surface protein of the viral vector despite its excellent persistence. Above all, due to the risk of foreign genes being inserted into the patient's genome, the synthesis of a protein of interest using a virus has limitations in its application to the human body.

한편, 관심 단백질 합성 지속성을 향상시키기 위한 노력으로, 핵-의존적 프로모터에 기반한 RNA 발현이 가능한 발현 카세트 DNA 개발이 알려져 있다. 주로 U6 소핵(Small nuclear) RNA, H1 RNA 유전자로부터 유래한 RNA 폴리머라제 Ⅲ(Pol Ⅲ) 프로모터가 가장 많이 활용되고 있으며, 이러한 핵-의존적 프로모터를 이용한 핵에서의 RNA 발현은 효과적으로 핵에서 RNA를 장기간 생산할 수 있는 방법을 제공하고 있다. 그러나, 세포막 투과에 비해 그 효율이 1%에 머무른다고 알려진 핵막 투과에 의존하는 이러한 plasmid DNA 방법은 그 관심단백질 합성 효율이 매우 낮다. 특히 plasmid DNA의 전달효율이 현저히 떨어지는 in vivo 응용에서는 낮은 효율성으로 인하여 적용이 제한을 받고 있다. 또한, 핵에서 발현된 고농도의 RNA의 경우, 세포질로 분출되어야만 관심 단백질 합성에 참여할 수 있는 성숙된 RNA로 변환이 가능하나, 이러한 세포질로의 이동에 관여하는 엑스포틴(exportin)-5 운반체가 고농도의 RNA에 의하여 포화(saturation)되는 문제를 발생시켜서 다른 세포내 기능에 관여하는 RNA의 세포질 분출까지도 방해하는 문제점을 일으키며, 이러한 RNA의 세포질 분출 이상은 심각한 독성문제로 이어진다. 그 밖에 현재 다양한 발현 카세트 DNA를 이용한 핵-의존적 RNA 발현방법이 알려져 있으나, in vivo 모델에서는 아직까지 짧은 지속성이라는 한계점을 여전히 가지고 있다.Meanwhile, in an effort to improve the sustainability of protein synthesis of interest, development of an expression cassette DNA capable of expressing RNA based on a nuclear-dependent promoter is known. The RNA polymerase Ⅲ (Pol Ⅲ) promoter derived mainly from the U6 small nuclear RNA and H1 RNA genes is most frequently used, and RNA expression in the nucleus using these nucleus-dependent promoters effectively increases RNA in the nucleus for a long period of time. We provide a way to produce it. However, this plasmid DNA method that relies on nuclear membrane penetration, which is known to have an efficiency of 1% compared to cell membrane penetration, has very low efficiency in synthesizing the protein of interest. In particular, in in vivo applications where the delivery efficiency of plasmid DNA is remarkably low, the application is limited due to low efficiency. In addition, in the case of high-concentration RNA expressed in the nucleus, it can be converted into mature RNA that can participate in the synthesis of the protein of interest only when it is released into the cytoplasm. Saturation by RNA causes a problem of interfering with the cytoplasmic release of RNA involved in other intracellular functions, and this abnormal cytoplasmic release of RNA leads to serious toxicity problems. In addition, nuclear-dependent RNA expression methods using various expression cassette DNAs are currently known, but they still have a limitation of short persistence in in vivo models.

개체의 세포 내로 RNA 및 DNA를 혼재한 RNA/DNA 발현 시스템을 효과적으로 전달하는 것은 따라서 여전히 이종 핵산에 의해 세포 내로 도입된 단백질의 효과적인 발현에서 핵은 장애물(bottleneck)일 수도 있으나 복제기관으로 중요한 역할을 할 수도 있다. 핵산-기반 약제(medicament)의 치료 효과는, 특히 유전자 치료의 분야에서 치료 핵산 분자에 코딩된 유전자 생산물의 효과적인 발현에 대체적으로 의존한다.Effective delivery of a mixed RNA/DNA expression system into cells of an organism therefore still plays an important role as an organ of replication, although the nucleus may be a bottleneck in the effective expression of proteins introduced into cells by heterologous nucleic acids. You may. The therapeutic effectiveness of nucleic acid-based medicaments is largely dependent on effective expression of gene products encoded in therapeutic nucleic acid molecules, particularly in the field of gene therapy.

본 발명자들은 DNA의 유전정보 저장 및 복제 기능을 유지하면서 세포질 내에서 RNA의 발현을 지속적으로 유지할 수 있는 조성물을 개발하고자 노력한 결과, RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)을 코딩하는 mRNA 카세트, 상기 RdRp에 의해 복제가 가능한 관심 mRNA를 포함하는 레플리콘 카세트 및 이들에 상응하는 DNA 카세트를 포함하는 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 개발하였다.The present inventors have tried to develop a composition capable of continuously maintaining RNA expression in the cytoplasm while maintaining the genetic information storage and replication functions of DNA. As a result, an mRNA cassette encoding RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), the RdRp A self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system comprising a replicon cassette containing the mRNA of interest capable of being replicated by and a DNA cassette corresponding thereto was developed.

본 발명에 의해 해결하고자 하는 목적은 강력한 단백질 합성 능력을 나타내는 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 제공하여, 살아있는 세포 또는 유기체의 세포에 관심 mRNA 및 유전자를 RNA 및 DNA로 도입함으로써 유전자 기능을 연구하고 질환을 퇴치하기 위한 강력한 수단을 구현하고자한다. The object to be solved by the present invention is to provide a self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system exhibiting strong protein synthesis ability, to study gene function by introducing mRNA and gene of interest into RNA and DNA into living cells or cells of organisms We want to implement a powerful means to combat the disease.

본 발명은 관심 단백질을 코딩하는 mRNA 및 DNA를 자가적으로 정확하고 효율적으로 증폭하고 단백질 합성하는 새로운 도구를 개발하기 위해서, 세포 내 적어도 하나의 단백질 합성을 하고 복제가 가능한 구성성분이 있으며, In order to develop a new tool for autonomously amplifying and efficiently amplifying mRNA and DNA encoding a protein of interest and synthesizing proteins, the present invention has components capable of synthesizing and replicating at least one protein in a cell,

(i) RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)을 발현시키기 위한 RNA 카세트(RdRp mRNA 카세트); 및(i) an RNA cassette for expressing RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (RdRp mRNA cassette); and

(ii) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있는 관심 mRNA 레플리콘을 코딩하는 DNA 카세트(레플리콘 DNA 카세트)를 포함하며,(ii) a DNA cassette encoding an mRNA replicon of interest capable of being replicated by the RdRp (replicon DNA cassette);

여기서, 추가적으로 상기 관심 mRNA 레플리콘을 포함하는 RNA 카세트(관심 mRNA 레플리콘 RNA 카세트) 및 상기 RdRp mRNA를 인코팅하는 DNA 카세트(RdRp DNA 카세트)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물에 적합한 신규의 기술을 제공하는 것이다.Here, it additionally includes at least one selected from the group consisting of an RNA cassette containing the mRNA replicon of interest (mRNA replicon RNA cassette of interest) and a DNA cassette encoding the RdRp mRNA (RdRp DNA cassette). It is to provide a novel technology suitable for a self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system characterized in that and a composition thereof.

명확성 및 가독성을 위해 다음의 정의가 제공된다. 이들 정의에 대해 언급된 임의의 기술적 특징은 본 발명의 각각 및 모두에서 이해될 수 있다. 이들에서 추가의 정의 및 설명이 특히 제공될 수 있다. The following definitions are provided for clarity and readability. Any technical feature mentioned for these definitions can be understood in each and every aspect of the present invention. Further definitions and explanations may be provided in particular in these.

본 발명에서 핵산 서열이 보고된 곳에서, 이들 서열은 일반적으로 특정 RNA 또는 DNA 서열뿐만 아니라 이의 상응하는 DNA 또는 RNA 대응물(counterpart) 각각 모두를 포함한다. 예를 들어, DNA 서열이 제공된 곳에서, 통상의 기술자는 상응하는 RNA 서열은 우라실 잔기에 의한 티민 교환에 의해 수득되고 반대로도 같은 것을 알고 있다.Where nucleic acid sequences are reported herein, these sequences generally include both a specific RNA or DNA sequence as well as each of its corresponding DNA or RNA counterparts. For example, where a DNA sequence is provided, the skilled person knows that the corresponding RNA sequence is obtained by thymine exchange by a uracil residue and vice versa.

본 발명은 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 새로운 도구를 개발할 수 있기 위해서, 세포 내 적어도 하나의 단백질 합성을 하고 복제가 가능한 구성성분이 있으며, In order to be able to develop a new tool for a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system, the present invention has a component capable of synthesizing and replicating at least one protein in a cell,

(ii) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있는 관심 mRNA 레플리콘(레플리콘 DNA 카세트)을 코딩하는 DNA 카세트를 포함하며,(ii) a DNA cassette encoding an mRNA replicon of interest (replicon DNA cassette) capable of being replicated by the RdRp;

여기서, 추가적으로 상기 관심 mRNA 레플리콘을 포함하는 RNA 카세트(관심 mRNA 레플리콘 카세트) 및 상기 RdRp mRNA를 인코팅하는 DNA 카세트(RdRp DNA 카세트)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물에 적합한 신규의 기술을 제공하는 것이다.Here, additionally comprising at least one selected from the group consisting of an RNA cassette containing the mRNA replicon of interest (mRNA replicon cassette of interest) and a DNA cassette encoding the RdRp mRNA (RdRp DNA cassette) It is to provide a new technology suitable for a self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system characterized by the above and its composition.

"세포"는 게놈 편집에 적합한 임의의 유기체에서 기원하는 세포를 포함한다. 예시적인 유기체로는, 비-제한적으로, 인간, 마우스, 랫, 원숭이, 개, 돼지, 양, 소, 고양이와 같은 포유류; 닭, 오리, 거위와 같은 가금류; 벼, 옥수수, 밀, 수수, 보리, 대두, 땅콩, 아라비돕시스 등과 같은 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 등의 식물이 있다. "Cell" includes cells from any organism suitable for genome editing. Exemplary organisms include, but are not limited to, mammals such as humans, mice, rats, monkeys, dogs, pigs, sheep, cows, cats; poultry such as chickens, ducks and geese; plants such as rice, corn, wheat, sorghum, barley, soybean, peanut, Arabidopsis and the like monocotyledonous and dicotyledonous plants.

"게놈"은 핵에 존재하는 게놈 DNA 뿐만 아니라 세포 하위 구성 성분 (예, 미토콘드리아, 색소체)에 존재하는 기관 DNA를 포괄한다.“Genome” encompasses genomic DNA present in the nucleus as well as organ DNA present in cellular subcomponents (eg, mitochondria, plastids).

세포의 게놈은 세포 또는 유기체의 유전자 물질을 지칭한다. 세포 또는 유기체의 유전자 물질은 종종 하나 이상의 유전자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자는 하나 이상의 핵산을 포함하거나 이로 구성된다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄를 생성하는데 수반되는 DNA의 절편을 의미하며, 코딩 영역(예: 엑손), 유전자 생성물의 전사/해독 및 전사/해독의 조절에 수반되는 코딩 영역 이전 및 이후의 영역(리더 및 트레일러) 및 개개의 코딩 절편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있다. 유전자는 반드시 펩티드를 생성하는 것은 아닐 수 있거나 유전자 서열에서의 유전적 차이(예컨대, 유전자의 코딩 및 비-코딩 부분에서의 돌연변이)에 기인하여 절두되거나 비-기능적인 단백질을 생성할 수 있다. 예컨대, 비-기능적 유전자는 슈도유전자일 수 있다. 유전자는 기능적 또는 비-기능적이든 간에 종종 참조 게놈의 유전자에 대한 상동성에 의해 확인될 수 있다. 예컨대, 대상체의 임의의 특정 유전자(예: 관심 유전자, 상대 유전자, 슈도유전자 등)는 당업자에 의해 또 다른 대상체 게놈에서 또는 참조 게놈에서 확인될 수 있다. 이배체 대상체에서, 유전자는 종종 대립유전자의 쌍(예: 2개의 대립유전자)을 포함한다. 따라서, 본 발명에서의 방법, 시스템 또는 공정은 유전자의 하나 또는 둘 모두의 대립유전자에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법, 시스템 또는 공정은 유전자의 각각의 대립유전자에 적용된다.The genome of a cell refers to the genetic material of a cell or organism. The genetic material of a cell or organism often contains one or more genes. In certain embodiments, a gene comprises or consists of one or more nucleic acids. The term "gene" refers to the segments of DNA involved in producing a polypeptide chain, including coding regions (e.g., exons), transcription/translation of a gene product, and regions preceding and following coding regions involved in the regulation of transcription/translation ( leader and trailer) and intervening sequences (introns) between individual coding segments (exons). Genes may not necessarily produce peptides or may produce truncated or non-functional proteins due to genetic differences in gene sequence (eg, mutations in coding and non-coding portions of the gene). For example, a non-functional gene may be a pseudogene. Genes, whether functional or non-functional, can often be identified by homology to genes in a reference genome. For example, any particular gene of a subject (eg, gene of interest, relative gene, pseudogene, etc.) can be identified in another subject's genome or in a reference genome by one skilled in the art. In a diploid subject, a gene often contains a pair of alleles (eg, two alleles). Thus, a method, system or process in the present invention may be applied to one or both alleles of a gene. In some embodiments, a method, system or process of the invention is applied to each allele of a gene.

"핵산"은, 예컨대 DNA(예: 상보성 DNA(cDNA), 게놈 DNA(gDNA) 등), RNA(예: 메시지 RNA(mRNA), 짧은 억제성 RNA(siRNA), 리보좀 RNA(rRNA), tRNA, microRNA, 및/또는 DNA 또는 RNA 유사체(예: 염기 유사체, 슈가 유사체 및/또는 비-천연 골격 등 함유), RNA/DNA 하이브리드 및 폴리아미드 핵산(PNA)으로부터의 임의의 조성물 중 하나 이상의 핵산(예: 핵산의 세트 또는 서브세트)를 지칭하며, 이들 모두는 단일- 또는 이중-가닥 형태일 수 있으며, 달리 제한이 없는 한 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA를 지칭한다. 핵산은 RNA를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 핵산은 등가물로서 이의 유도체 또는 변이체, 뉴클레오티드 유사체로부터 합성된 RNA 또는 DNA의 적합한 유사체, 단일-가닥("센스" 또는 "안티센스", "플러스" 가닥 또는 "마이너스" 가닥, "전방" 판독 프레임 또는 "후방" 판독 프레임) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 인접 뉴클레오티드의 임의의 길이의 것일 수 있다. 핵산은 서열(예컨대, 핵산 서열, 예컨대 서열)로서 당업계에 공지된 특정한 5'로부터 3' 순서의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다."Nucleic acid" includes, for example, DNA (eg, complementary DNA (cDNA), genomic DNA (gDNA), etc.), RNA (eg, message RNA (mRNA), short inhibitory RNA (siRNA), ribosomal RNA (rRNA), tRNA, microRNA, and/or DNA or RNA analogs (e.g., containing base analogs, sugar analogs, and/or non-natural backbones, etc.), RNA/DNA hybrids, and nucleic acids of one or more of any composition from polyamide nucleic acids (PNAs) (e.g., : a set or subset of nucleic acids), all of which may be in single- or double-stranded form and, unless otherwise limited, includes known analogues of natural nucleotides that can function in a manner similar to naturally occurring nucleotides. In some embodiments, nucleic acid refers to DNA. Nucleic acid refers to RNA. Unless specifically limited, the term refers to nucleic acids, including deoxyribonucleotides, ribonucleotides, and known analogues of natural nucleotides. Nucleic acids include, as equivalents, derivatives or variants thereof, suitable analogs of RNA or DNA synthesized from nucleotide analogues, single-stranded ("sense" or "antisense", "plus" strand or "minus" strand, "forward" reading frame or "reverse" reading frame) and a double-stranded polynucleotide. A nucleic acid may be single or double stranded. A nucleic acid may comprise two or more, three or more, four or more, or five or more contiguous nucleotides. A nucleic acid may include a particular 5' to 3' sequence of nucleotides known in the art as a sequence (eg, a nucleic acid sequence, such as a sequence).

핵산은 천연 발생일 수 있고/있거나 합성 또는 변경될 수 있다. 예컨대, 핵산은 앰플리콘일 수 있다. 핵산은 핵산 라이브러리, 예컨대 gDNA, cDNA 또는 RNA 라이브러리로 부터의 것일 수 있다. 핵산은 합성(예컨대, 화학적으로 합성)되거나 (예컨대, 시험관내에서 폴리머라제 연장에 의해, 예컨대 증폭에 의해, 예컨대 PCR에 의해) 생성될 수 있다. 핵산은 플라스미드, 파아지, 바이러스, 자가 복재 서열(ARS), 동원체, 인공 게놈, 게놈, 또는 시험관내에서 또는 호스트 세포, 세포, 세포 핵 또는 세포의 세포질에서 복제하거나 복제될 수 있는 다른 핵산이거나 이로부터의 것일 수 있다.Nucleic acids can be naturally occurring and/or can be synthetic or altered. For example, a nucleic acid can be an amplicon. A nucleic acid may be from a nucleic acid library, such as a gDNA, cDNA or RNA library. Nucleic acids can be synthetic (eg, chemically synthesized) or generated (eg, in vitro by polymerase extension, eg, by amplification, eg, by PCR). A nucleic acid is, or is derived from, a plasmid, phage, virus, self-replicating sequence (ARS), centromere, artificial genome, genome, or other nucleic acid that replicates or is capable of being replicated in vitro or in a host cell, cell, cell nucleus, or cytoplasm of a cell. may be of

본 발명에서 기술되는 공정 또는 방법에 대해 제공되는 핵산은 1 내지 1000, 1 내지 500, 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 20 또는 1 내지 10개 샘플로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 비교적 짧은 핵산이다. 올리고뉴클레오티드는 약 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50 또는 2 내지 약 35개 핵산 길이로부터의 것일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 18 내지 30, 20 내지 28 또는 21 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 올리고뉴클레오티드는 프라이머이다. 프라이머는 종종 선택된 상보적 핵산에 하이브리드화하도록 구성되며 하이브리드화후 폴리머라제에 의해 연장되도록 구성된다.Nucleic acids provided for a process or method described herein may include nucleic acids from 1 to 1000, 1 to 500, 1 to 200, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 20 or 1 to 10 samples. there is. Oligonucleotides are relatively short nucleic acids. The oligonucleotide may be from about 2 to 150, 2 to 100, 2 to 50 or 2 to about 35 nucleic acids in length. Oligonucleotides are 18 to 30, 20 to 28 or 21 to 26 nucleotides in length. Oligonucleotides are single stranded. Oligonucleotides are primers. Primers are often configured to hybridize to a selected complementary nucleic acid and to be extended by a polymerase after hybridization.

"RNA" 또는 "RNA 분자"는 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자에 관한 것이고, 바람직하게는 완전히 또는 대체로 리보뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 분자에 관한 것이다. 용어 "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 수산기를 갖는 뉴클레오타이드에 관한 것이다. 용어 "RNA"는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 발생된 RNA, 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연-발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 비-뉴클레오타이드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자의 뉴클레오타이드는 비-표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비-천연 발생 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체, 특히 자연성 발생 RNA의 유사체로 지칭할 수 있다."RNA" or "RNA molecule" refers to molecules comprising ribonucleotide residues, and preferably to molecules consisting entirely or largely of ribonucleotide residues. The term "ribonucleotide" relates to a nucleotide having a hydroxyl group at the 2'-position of the β-D-ribofuranosyl group. The term "RNA" refers to double-stranded RNA, single-stranded RNA, isolated RNA, such as partially or completely purified RNA, essentially pure RNA, synthetic RNA, and recombinantly generated RNA, such as the addition, deletion of one or more nucleotides. , modified RNAs that differ from naturally-occurring RNAs by substitutions and/or alterations. Such alteration may include adding non-nucleotide material, eg, at one or more nucleotides of the RNA, at the end(s) of the RNA or internally. The nucleotides of an RNA molecule may also include non-standard nucleotides, such as non-naturally occurring nucleotides or chemically synthesized nucleotides or deoxynucleotides. These altered RNAs may be referred to as analogues, particularly analogues of naturally occurring RNA.

RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 본 발명에서는, 단일가닥 RNA가바람직하다. 용어 "단일가닥 RNA"는 일반적으로 상보적인 핵산 가닥(전형적으로 상보적인 RNA 가닥; 즉 상보적인 RNA 분자가 없음)이 RNA 분자와 결합되어 있지 않은 실시형태를 지칭한다. 단일가닥 RNA는 마이너스 가닥 [(-) 가닥] 또는 플러스 가닥 [(+) 가닥]으로 존재할 수 있다. (+) 가닥은 유전 정보를 포함하거나 코딩하는 가닥이다. 유전 정보는 예를 들어 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. (+) 가닥 RNA가 단백질을 코딩할 때, (+) 가닥은 번역(단백질 합성)을 위한 주형으로 직접 작용할 수 있다. (-) 가닥은 (+) 가닥의 상보체이다. 이중가닥 RNA의 경우, (+) 가닥 및 (-) 가닥은 2개의 분리된 RNA 분자이며, 이들 두 RNA 분자는 서로 결합하여 이중가닥 RNA("듀플렉스 RNA")를 형성한다.RNA can be single-stranded or double-stranded. In the present invention, single-stranded RNA is preferred. The term "single-stranded RNA" generally refers to embodiments in which a complementary nucleic acid strand (typically a complementary RNA strand; ie, no complementary RNA molecule) is associated with an RNA molecule. Single-stranded RNA can exist as either the minus strand [(-) strand] or the plus strand [(+) strand]. The (+) strand is the strand that contains or codes for genetic information. Genetic information can be, for example, a polynucleotide sequence encoding a protein. When the (+) strand RNA encodes a protein, the (+) strand can directly serve as a template for translation (protein synthesis). The (-) strand is the complement of the (+) strand. In the case of double-stranded RNA, the (+) strand and the (-) strand are two separate RNA molecules, and these two RNA molecules combine to form a double-stranded RNA ("duplex RNA").

핵산 및 아미노산 서열에 관한 용어 "변이체"는 임의의 변이체, 특히 돌연변이체, 바이러스 균주, 스플라이스 변이체, 입체배좌체, 이소형체, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 상동체, 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포함한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열에서의 변경에 관한 것이고, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 동정한다. 핵산 분자와 관련하여, 용어 "변이체"는 축퇴성 핵산 서열을 포함하며, 여기서 본 발명에 따른 축퇴성 핵산은 유전 암호의 축퇴성 때문에 코돈 서열에서 기준 핵산과 상이한 핵산이다. 종 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다. 바이러스 상동체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 바이러스의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다.The term “variant” in relation to nucleic acid and amino acid sequences means any variant, particularly mutants, virus strains, splice variants, conformations, isoforms, allelic variants, species variants and species homologues, especially those that occur naturally. include Allelic variants relate to alterations in the normal sequence of a gene, the significance of which is often unclear. Complete gene sequencing often identifies numerous allelic variants for a given gene. In the context of nucleic acid molecules, the term "variant" includes degenerate nucleic acid sequences, wherein a degenerate nucleic acid according to the present invention is a nucleic acid that differs from a reference nucleic acid in codon sequence because of the degeneracy of the genetic code. A species homolog is a nucleic acid or amino acid sequence that has a different species origin than a given nucleic acid or amino acid sequence. A viral homolog is a nucleic acid or amino acid sequence that has a different viral origin than a given nucleic acid or amino acid sequence.

핵산 변이체는 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 결실, 첨가, 돌연변이, 및/또는 삽입을 포함한다. 결실은 기준 핵산으로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드를 제거하는 것을 포함한다.Nucleic acid variants include single or multiple nucleotide deletions, additions, mutations, and/or insertions compared to a reference nucleic acid. Deletion involves removing one or more nucleotides from a reference nucleic acid.

첨가 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 뉴클레오타이드의 5'- 및/또는 3'-말단 융합체를 포함한다. 돌연변이는 치환을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서 서열 중 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 제거되고 적어도 하나의 다른 뉴클레오타이드가 그 자리에 삽입된다(예컨대 전환 및 전이). 돌연변이는 일염기 부위, 가교 부위, 및 화학적으로 변경되거나 변형된 염기를 포함한다. 삽입은 기준 핵산 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 첨가하는 것을 포함한다.Additive variants include 5'- and/or 3'-end fusions of one or more nucleotides, such as 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 or more nucleotides. A mutation may include, but is not limited to, a substitution, wherein at least one nucleotide in a sequence is removed and at least one other nucleotide is inserted in its place (eg, a transposition and transition). Mutations include monobasic sites, bridging sites, and chemically altered or altered bases. Insertion involves adding one or more nucleotides into a reference nucleic acid.

특정 핵산 서열의 변이체는 바람직하게는 상기 특정 서열의 하나 이상의 기능적 특성을 가지며, 바람직하게는 상기 특정 서열, 예를 들어 특정 핵산 서열과 동일한 또는 유사한 특성을 나타내는 핵산 서열과 기능적으로 동등하다.Variants of a particular nucleic acid sequence preferably have one or more functional properties of the particular sequence, and are preferably functionally equivalent to a nucleic acid sequence exhibiting the same or similar properties as the particular nucleic acid sequence.

바람직하게는 주어진 핵산 서열과 상기 주어진 핵산 서열의 변이체인 핵산 서열 사이의 동일성 정도가 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 동일성 정도는 적어도 약 30, 적어도 약 50, 적어도 약 70, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 150, 적어도 약 200, 적어도 약 250, 적어도 약 300, 또는 적어도 약 400개의 뉴클레오타이드의 영역에 대하여 주어지는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 동일성 정도는 기준 핵산 서열의 전장에 대하여 부여된다.Preferably the degree of identity between a given nucleic acid sequence and a nucleic acid sequence that is a variant of the given nucleic acid sequence is at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, still more preferably preferably at least 90%, or most preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99%. Degrees of identity are given for regions of at least about 30, at least about 50, at least about 70, at least about 90, at least about 100, at least about 150, at least about 200, at least about 250, at least about 300, or at least about 400 nucleotides. it is desirable In a preferred embodiment, the degree of identity is assigned over the full length of the reference nucleic acid sequence.

"유도체(derivative)"라는 용어는 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상에서 핵산의 여하한 화학적 유도화를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드들 및 뉴클레오타이드 유사체들을 함유하는 핵산도 포괄한다. 핵산의 유도체화는 바람직하게는 그의 안정성을 증가시킨다.The term “derivative” includes any chemical derivatization of a nucleic acid onto a nucleotide base, sugar or phosphate. The term “derivative” also encompasses nucleic acids containing nucleotides and nucleotide analogs that do not occur naturally. Derivatization of a nucleic acid preferably increases its stability.

"핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열"은 그것이 유래된 핵산의 변이체인 핵산을 지칭한다. 바람직하게는 RNA 분자 내 특정 서열을 대체하는 경우, 특정 서열에 대한 변이체인 서열은 RNA 안정성 및/또는 번역 효율을 유지한다.A "nucleic acid sequence derived from a nucleic acid sequence" refers to a nucleic acid that is a variant of the nucleic acid from which it is derived. Preferably, when replacing a specific sequence in an RNA molecule, a sequence that is a variant to a specific sequence maintains RNA stability and/or translation efficiency.

"% 동일한" 또는 "% 동일성"은 2개의 아미노산 서열 간의 서열 동일성을 지칭한다. 동일성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교 서열에서 동등 위치가 동일한 아미노산에 의해 차지되는 경우, 이때 분자는 그 위치에서 동일하다. 동등 부위가 동일 또는 유사한 아미노산 잔기(예컨대, 입체 및/또는 전자적 특성이 유사함)에 의해 차지되는 경우, 이때 분자는 그 위치에서 상동(유사)인 것으로 지칭될 수 있다. 상동성, 유사성 또는 동일성의 백분율로의 표현은 비교 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 유사한 아미노산 수의 함수로 지칭된다. 상동성, 유사성 또는 동일성의 백분율로의 표현은 비교 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일하거나 유사한 아미노산 수의 함수로 지칭된다. FASTA, BLAST 또는 ENTREZ를 포함하는 다양한 정렬 알고리즘 및 프로그램이 이용될 수 있다. FASTA 및 BLAST는 GCG 서열 분석 패키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 일부로서 이용가능하며, 예컨대 디폴트 세팅과 함께 이용될 수 있다. ENTREZ는 미국 국립 바이오기술 정보 센터, 미국 국립의학도서관, 미국 국립보건원(Bethesda, Md.)를 통해 이용가능하다."% identical" or "% identity" refers to sequence identity between two amino acid sequences. Identity can be determined by comparing positions in each sequence that can be aligned for comparison purposes. If equivalent positions in the comparison sequences are occupied by identical amino acids, then the molecules are identical at that position. When equivalent sites are occupied by identical or similar amino acid residues (eg, with similar steric and/or electronic properties), then the molecules may be said to be homologous (similar) at that position. Homology, similarity or expressed as a percentage of identity is referred to as a function of the number of identical or similar amino acids at positions shared by the comparison sequences. Homology, similarity or expressed as a percentage of identity is referred to as a function of the number of identical or similar amino acids at positions shared by the comparison sequences. A variety of alignment algorithms and programs may be used, including FASTA, BLAST or ENTREZ. FASTA and BLAST are available as part of the GCG sequence analysis package (University of Wisconsin, Madison, Wis.) and can be used, eg, with default settings. ENTREZ is available through the US National Center for Biotechnology Information, US National Library of Medicine, and US National Institutes of Health (Bethesda, Md.).

"발현 카세트(Expresion Cassette)"는 재조합 벡터와 같이 유기체에서 대상 뉴클레오티드 서열을 발현시키기에 적합한 벡터를 의미한다. "발현"은 기능성 산물의 생성을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 발현은 뉴클레오티드 서열의 전사 (예, 전사하여 mRNA 또는 기능성 RNA를 생성함) 및/또는 RNA를 단백질 전구체 또는 성숙한 단백질로 번역하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 "발현 카세트"는 선형의 핵산 단편, 환형의 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 일부 구현예에서 번역될 수 있는 RNA (예, mRNA)일 수 있다. 본 발명의 "발현 카세트"는 서로 다른 소스로부터 유래될 수 있는 대상 뉴클레오티드 서열 및 조절 서열, 또는 동일한 소스로부터 유래되지만 통상 천연적으로 발견되는 방식과는 다른 방식으로 정렬된 대상 뉴클레오티드 서열 및 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 카세트는 재조합 벡터와 같이 유기체에서 대상 뉴클레오티드 서열을 발현시키기에 적합한 벡터를 의미한다. 발현은 기능성 산물의 생성을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 발현은 뉴클레오티드 서열의 전사 (예, 전사하여 mRNA 또는 기능성 RNA를 생성함) 및/또는 RNA를 단백질 전구체 또는 성숙한 단백질로 번역하는 것을 의미할 수 있다. 발현 카세트는 선형의 핵산 단편, 환형의 plasmid, 바이러스 벡터 또는 번역될 수 있는 RNA (예, mRNA)일 수 있다. 발현 카세트는 서로 다른 소스로부터 유래될 수 있는 대상 뉴클레오티드 서열 및 조절 서열, 또는 동일한 소스로부터 유래되지만 통상 천연적으로 발견되는 방식과는 다른 방식으로 정렬된 대상 뉴클레오티드 서열 및 조절 서열을 포함할 수 있다."Expression Cassette" means a vector suitable for expressing a nucleotide sequence of interest in an organism, such as a recombinant vector. "Expression" means the production of a functional product. For example, expression of a nucleotide sequence may refer to transcription of the nucleotide sequence (eg, transcription to produce mRNA or functional RNA) and/or translation of the RNA into a protein precursor or mature protein. An “expression cassette” of the present invention can be a linear nucleic acid fragment, a circular plasmid, a viral vector or, in some embodiments, a translatable RNA (eg, mRNA). An "expression cassette" of the present invention comprises a subject nucleotide sequence and regulatory sequences that may be derived from different sources, or a subject nucleotide sequence and regulatory sequences derived from the same source but aligned in a manner different from that normally found in nature. can include Expression cassette refers to a vector suitable for expressing a nucleotide sequence of interest in an organism, such as a recombinant vector. Expression refers to the production of a functional product. For example, expression of a nucleotide sequence may refer to transcription of the nucleotide sequence (eg, transcription to produce mRNA or functional RNA) and/or translation of the RNA into a protein precursor or mature protein. An expression cassette can be a linear nucleic acid fragment, a circular plasmid, a viral vector or a translatable RNA (eg mRNA). An expression cassette may comprise a nucleotide sequence of interest and regulatory sequences that may be derived from different sources, or a nucleotide sequence of interest and regulatory sequences derived from the same source but aligned in a manner different from that normally found in nature.

"벡터"는 가장 일반적인 의미로 본원에서 사용되며, 예를 들어 상기 핵산을 원핵 및/또는 진핵 대상세포내로 도입시킬 수 있고, 적절한 경우, 게놈 내로 일체화할 수 있는, 여하한 중간체 운반체이 이에 포괄된다. 이러한 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제 및/또는 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 게놈 및 이들의 분획을 포함한다. 핵산 분자 (예, 플라스미드, 선형의 핵산 단편, RNA 등) 또는 단백질을 유기체에 "도입"하는 것은, 핵산 또는 단백질을 사용해 핵산 또는 단백질이 세포에서 기능하도록 유기체의 세포를 형질전환하는 것을 의미한다. 본 발명에서, "형질전환"은 안정적인 형질전환 및 일시적인 형질전환을 모두 포함한다. "안정적인 형질전환"은 외인성 뉴클레오티드 서열을 게놈에 도입하여, 외래 유전자의 안정적인 유전을 달성하는 것을 의미한다. 안정적으로 형질전환되면, 외인성 핵산 서열이 유기체 및 이의 연속 후속 세대의 게놈에 안정적으로 삽입된다. "일시적인 형질전환"은 핵산 분자 또는 단백질이 세포에 도입되어, 외인성 유전자가 안정적으로 유전되지 않으면서 그 기능을 수행하는 것을 의미한다. 일시적인 형질전환의 경우, 외인성 핵산 서열이 게놈에 삽입되지 않는다. "Vector" is used herein in its most general sense, and is encompassed therein, for example, any intermediate carrier capable of introducing such nucleic acid into prokaryotic and/or eukaryotic cells of interest and, where appropriate, integrating into a genome. Such vectors are preferably replicated and/or expressed intracellularly. Vectors include plasmids, phagemids, viral genomes and fragments thereof. "Introducing" a nucleic acid molecule (eg, plasmid, linear nucleic acid fragment, RNA, etc.) or protein into an organism means using the nucleic acid or protein to transform the cells of the organism so that the nucleic acid or protein functions in the cell. In the present invention, "transformation" includes both stable transformation and transient transformation. "Stable transformation" means the introduction of an exogenous nucleotide sequence into the genome to achieve stable inheritance of the foreign gene. When stably transformed, the exogenous nucleic acid sequence is stably integrated into the genome of the organism and its successive subsequent generations. "Transient transformation" means that a nucleic acid molecule or protein is introduced into a cell and performs its function without stably inheriting the exogenous gene. In the case of transient transformation, no exogenous nucleic acid sequence is inserted into the genome.

"중합효소"는 일반적으로 단량체 빌딩 블록으로부터 중합체 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체를 지칭한다. "RNA 중합효소"는 리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 RNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. "DNA 중합효소"는 데옥시리보뉴클레오타이드 빌딩 블록으로부터 DNA 분자의 합성을 촉매할 수 있는 분자 실체이다. DNA 중합효소 및 RNA 중합효소의 경우, 분자 실체는 전형적으로 단백질 또는 복수의 단백질의 집합체 또는 복합체이다. 전형적으로, DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 분자인 주형 핵산을 기반으로 DNA 분자를 합성한다. 전형적으로, RNA 중합효소는 주형 핵산을 기반으로 RNA 분자를 합성하고, 주형 핵산은 DNA 분자(RNA중합효소가 DNA 의존성 RNA 중합효소, DdRP인 경우)이거나 RNA 분자이다(RNA 중합효소가 RNA 의존성 RNA 중합효소인 RdRP인 경우). "RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA dependt RNA polymerase: RdRP)"는 RNA 주형으로부터 RNA의 전사를 촉매하는 효소이다. 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소의 경우, 게놈 RNA 및 (+) 가닥 게놈 RNA의 (-) 가닥 상보체의 순차적 합성은 RNA 복제로 이어진다. 알파바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소는 "RNA RdRp"와 동의어로 사용된다. 일반적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소는 레트로바이러스를 제외한 모든 RNA 바이러스에 의해 코딩된다. RNA 의존성 RNA 중합효소를 코딩하는 바이러스의 전형적인 대표는 알파바이러스이다."Polymerase" generally refers to a molecular entity capable of catalyzing the synthesis of polymer molecules from monomeric building blocks. An “RNA polymerase” is a molecular entity capable of catalyzing the synthesis of RNA molecules from ribonucleotide building blocks. A "DNA polymerase" is a molecular entity capable of catalyzing the synthesis of a DNA molecule from deoxyribonucleotide building blocks. In the case of DNA polymerases and RNA polymerases, the molecular entity is typically a protein or an assembly or complex of a plurality of proteins. Typically, a DNA polymerase synthesizes a DNA molecule based on a template nucleic acid, typically a DNA molecule. Typically, an RNA polymerase synthesizes an RNA molecule based on a template nucleic acid, and the template nucleic acid is either a DNA molecule (if the RNA polymerase is a DNA-dependent RNA polymerase, DdRP) or an RNA molecule (if the RNA polymerase is an RNA-dependent RNA polymerase). In the case of the polymerase RdRP). "RNA-dependent RNA polymerase (RdRP)" is an enzyme that catalyzes the transcription of RNA from an RNA template. In the case of alphaviral RNA-dependent RNA polymerase, sequential synthesis of genomic RNA and the (-) strand complement of (+) strand genomic RNA leads to RNA replication. Alphaviral RNA-dependent RNA polymerase is used synonymously with "RNA RdRp". In general, RNA-dependent RNA polymerase is encoded by all RNA viruses except retroviruses. A typical representative of a virus encoding an RNA-dependent RNA polymerase is an alphavirus.

"상류"는 핵산 분자의 제 2 요소에 대한 핵산 분자의 제 1 요소의 상대적인 위치를 나타내며, 여기서 두 핵산 분자는 동일한 핵산 분자에 포함되며, 제 1 요소는 핵산 분자의 제 2 요소보다 5' 말단에 위치한다. 그 후 제 2 요소는 해당 핵산 분자의 제 1 요소의 "하류"인 것으로 지칭한다. 제 2 요소의 "상류"에 위치한 요소는 해당 제 2 요소의 "5'"에 있는 것과 동의어라고 할 수 있다. 이중가닥 핵산 분자의 경우, "상류" 및 "하류"와 같은 표시는 (+) 가닥에 대해 부여된다."Upstream" refers to the relative position of a first element of a nucleic acid molecule to a second element of a nucleic acid molecule, wherein both nucleic acid molecules are contained in the same nucleic acid molecule, and the first element is 5'-ender than the second element of the nucleic acid molecule. located in The second element is then said to be "downstream" of the first element of the nucleic acid molecule in question. An element located "upstream" of a second element may be said to be synonymous with being at "5'" of that second element. In the case of double-stranded nucleic acid molecules, designations such as "upstream" and "downstream" are given for the (+) strand.

"조절 서열" 또는 "조절 인자"는 상호 호환적으로 사용되며, 조합된 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 번역에 영향을 미치는, 코딩 서열의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부 또는 하류 (3' 비-코딩 서열)에 위치하는, 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은, 비-제한적으로, 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인지 서열을 포함할 수 있다."Regulatory sequence" or "regulatory factor" are used interchangeably and are upstream (5' non-coding sequences), internal or Refers to a nucleotide sequence, located downstream (3' non-coding sequence). Regulatory sequences may include, but are not limited to, promoters, translation leader sequences, introns, and polyadenylation recognition sequences.

"프로모터"는 다른 핵산 단편의 전사를 통제할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 프로모터는 세포로부터 유래되거나 또는 유래되지 않던 간에 세포에서 유전자의 전사를 통제할 수 있는 프로모터이다. 프로모터는 구성적인 프로모터 (constitutive promoter) 또는 조직-특이적인 프로모터 또는 발생-조절성 프로모터 (developmentally-regulated promoter) 또는 유도성 프로모터일 수 있다."Promoter" refers to a nucleic acid fragment capable of controlling the transcription of another nucleic acid fragment. In some embodiments of the invention, a promoter is a promoter capable of controlling the transcription of a gene in a cell, whether derived from the cell or not. The promoter may be a constitutive promoter or a tissue-specific promoter or a developmentally-regulated promoter or an inducible promoter.

"코어 프로모터"는 프로모터에 포함되는 핵산 서열을 의미한다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사를 적절히 개시하는데 필요한 프로모터의 최소 부분이다. 코어 프로모터는 전형적으로 전사 개시 부위 및 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함한다."Core promoter" means a nucleic acid sequence comprised by a promoter. A core promoter is typically the smallest portion of a promoter required to properly initiate transcription. A core promoter typically contains a transcription initiation site and a binding site for RNA polymerase.

"RNA 복제"는 일반적으로 주어진 RNA 분자(주형 RNA 분자)의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성된 RNA 분자를 지칭한다. 합성되는 RNA 분자는 예를 들어, 주형 RNA 분자에 동일하거나 상보적일 수 있다. 일반적으로, RNA 복제는 DNA 중간체의 합성을 통해 일어날 수 있거나, RNA 의존적 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개되는 RNA 의존적 RNA 복제에 의해 직접적으로 발생할 수 있다. 알파바이러스의 경우 RNA 복제는 DNA 중간체를 통해 일어나지 않지만 RNA 의존적 RNA 중합효소(RdRP)에 의해 매개된다: 주형 RNA 가닥(제 1 RNA 가닥)이 제 1 RNA 가닥 또는 그의 일부에 상보적인 제 2 RNA 가닥의 합성을 위해 주형으로써 작용한다. 제 2 RNA 가닥은 순서대로 선택적으로 제 2 RNA 가닥 또는 그의 일부에 상보적인 제 3 RNA 가닥의 주형으로 작용할 수 있다. 그로 인해, 제 3 RNA 가닥은 제 1 RNA 가닥 또는 그의 일부와 동일하다. 따라서, RNA 의존적 RNA 중합효소는 주형의 상보적인 RNA 가닥을 직접 합성 가능하고, (상보적인 중간체 가닥을 통해) 동일한 RNA 가닥을 간접적으로 합성할 수 있다."RNA replication" generally refers to an RNA molecule synthesized based on the nucleotide sequence of a given RNA molecule (template RNA molecule). The RNA molecule to be synthesized can be identical or complementary to, for example, a template RNA molecule. In general, RNA replication can occur through the synthesis of DNA intermediates or can occur directly by RNA-dependent RNA replication mediated by RNA-dependent RNA polymerase (RdRP). In the case of alphaviruses, RNA replication does not occur via a DNA intermediate, but is mediated by RNA-dependent RNA polymerase (RdRP): the template RNA strand (first RNA strand) is coupled with a second RNA strand complementary to the first RNA strand or part thereof. serves as a template for the synthesis of The second RNA strand may in turn act as a template for a third RNA strand that is optionally complementary to the second RNA strand or a portion thereof. As such, the third RNA strand is identical to the first RNA strand or portion thereof. Thus, an RNA-dependent RNA polymerase can directly synthesize a complementary RNA strand of a template, and can synthesize the same RNA strand indirectly (through a complementary intermediate strand).

"유전자"는 하나 이상의 세포 생성물을 생산하고/하거나 하나 이상의 세포 간 또는 세포 내 기능을 달성하기 위한 특정 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 특정 단백질 또는 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 섹션(전형적으로 DNA이지만, RNA 바이러스의 경우에는 RNA이다)에 관한 것이다. "Gene" refers to a specific nucleic acid sequence for producing one or more cellular products and/or accomplishing one or more intercellular or intracellular functions. More specifically, the term relates to a section of nucleic acid (typically DNA, but in the case of an RNA virus, RNA) comprising nucleic acids encoding a specific protein or functional or structural RNA molecule.

"발현"은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA의 생산 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이것은 또한 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 세포의 리포좀 내에서 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩티드 또는 단백질을 만드는 프로세스에 관한 것이다. "Expression" is used in its most general sense and includes the production of RNA or the production of RNA and proteins. This also includes partial expression of nucleic acids. In addition, expression can be transient or stable. In the context of RNA, the terms "expression" or "translation" relate to the process by which one strand of messenger RNA directs the assembly of an amino acid sequence within a cell's liposome to make a peptide or protein.

"mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하며 전형적으로 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 전사체에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 것이다. 예를 들어, 시험관내 전사 키트가 시중에 다양하게 판매되고 있다. 본 발명에 따르면, mRNA는 변형 및 캡핑을 안정화시킴으로서 변형시킬 수도 있다. "mRNA" means "messenger-RNA" and relates to a transcript that is typically generated using a DNA template and encodes a peptide or protein. Typically, mRNA includes a 5'-UTR, a protein coding region, a 3'-UTR, and a poly(A) sequence. mRNA can be produced by in vitro transcription from a DNA template. In vitro transcription methodologies are well known to those skilled in the art. For example, various in vitro transcription kits are commercially available. According to the present invention, mRNA can also be modified by stabilizing modification and capping.

"폴리(A) 서열" 또는 "폴리(A) 꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 연속되거나 중단된 아데닐레이트 잔기 서열을 지칭한다. 연속적인 서열은 연속적인 아데닐레이트 잔기를 특징으로 한다. 사실상, 연속적인 폴리(A) 서열이 전형적인 것이다. 폴리(A) 서열은 전사 후 주형-독립적 RNA 중합효소에 의해 RNA의 자유 3'-말단에 세포 핵에서 진핵세포 전사 중에 부착되지만, 통상적으로 진핵세포 DNA에서 암호화되지 않은 반면, 본 발명은 DNA에 의해 코딩된 폴리(A) 서열을 포함한다.A “poly(A) sequence” or “poly(A) tail” refers to a sequence of contiguous or interrupted adenylate residues typically located at the 3′-end of an RNA molecule. A contiguous sequence is characterized by consecutive adenylate residues. In fact, contiguous poly(A) sequences are typical. The poly(A) sequence is attached during eukaryotic transcription in the cell nucleus to the free 3'-end of the RNA by post-transcriptional template-independent RNA polymerase, but is not normally encoded in eukaryotic DNA, whereas the present invention relates to DNA It includes a poly(A) sequence encoded by

RNA, 예를 들어 mRNA와 같은 핵산은 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 따라서, 전사 가능한 핵산 서열 또는 그의 전사체는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함할 수 있다.A nucleic acid such as RNA, eg mRNA, may encode a peptide or protein. Thus, a transcribable nucleic acid sequence or transcript thereof may include an open reading frame (ORF) encoding a peptide or protein.

"펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산"이란 용어는 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재한다면 핵산이 아미노산의 어셈블리를 지시하여 번역 과정 동안에 펩티드 또는 단백질을 생산할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 코딩 RNA는 세포 번역 시스템과 상호작용하여 코딩 RNA의 번역을 허용하여 펩티드 또는 단백질을 생성할 수 있다.The term "nucleic acid encoding a peptide or protein" means that a nucleic acid, when present in an appropriate environment, preferably within a cell, is capable of directing the assembly of amino acids to produce a peptide or protein during the translation process. Preferably, the coding RNA according to the present invention can interact with a cellular translation system to allow translation of the coding RNA to produce a peptide or protein.

오픈 리딩 프레임(Open reading frame): 일반적으로 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오타이드 트리플렛(triplets)의 서열일 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 이의 5'말단 및 보통 다중 3개 뉴클레오타이드 길이를 나타내는 후속 영역(subsequent region)에 바람직하게는 시작 코돈, 즉, 보통 아미노산 메티오닌을 코딩하는 이후의 세 뉴클레오타이드의 조합(ATG 또는 AUG)을 함유한다. ORF는 바람직하게는 정지-코돈(예를 들어, TAA, TAG, TGA)에 의하여 종결된다. 일반적으로, 이는 오직 오픈 리딩 프레임의 정지-코돈이다. 따라서, 본 발명에서 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 시작 코돈(예를 들어, ATG 또는 AUG)으로 시작하고 바람직하게는 정지 코돈(예를 들어, TAA, TGA, 또는 TAG 또는 UAA, UAG, UGA, 각각)으로 종결되는 3으로 나뉘어질 수 있는 다수의 뉴클레오타이드로 이루어지는 뉴클레오타이드 서열이다. 오픈 리딩 프레임은 분리될 수 있거나 더 긴 핵산 서열, 예를 들어 벡터 또는 mRNA에 포함될 수 있다. 오픈리딩 프레임은 또한 "단백질 코딩 영역"으로 불리울 수 있다.Open reading frame: Can be a sequence of several nucleotide triplets, which can usually be translated into a peptide or protein. The open reading frame preferably has a start codon at its 5' end and in a subsequent region usually representing multiples of 3 nucleotides in length, i.e. a combination of the next three nucleotides (ATG or AUG) which usually codes for the amino acid methionine. contain The ORF is preferably terminated by a stop-codon (eg TAA, TAG, TGA). Generally, this is only the stop-codon of an open reading frame. Thus, the open reading frame in the present invention preferably starts with a start codon (eg, ATG or AUG) and preferably starts with a stop codon (eg, TAA, TGA, or TAG or UAA, UAG, UGA, respectively ) is a nucleotide sequence consisting of a number of nucleotides divisible by three. The open reading frame can be isolated or can be included in a longer nucleic acid sequence, such as a vector or mRNA. An open reading frame may also be referred to as a “protein coding region”.

바이시스트로닉 RNA, 멀티시스트로닉 RNA(Bicistronic RNA, multicistronic RNA): 바이시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 RNA는 일반적으로 두 개의(바이시스트로닉) 또는 그 이상의(멀티시스트로닉) 오픈 리딩 프레임(ORF)를 가질 수 있는 RNA, 바람직하게는 mRNA 이다. 오픈 리딩 프레임은 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 코돈의 서열이다.Bicistronic RNA, multicistronic RNA: A bicistronic or multicistronic RNA usually contains two (bicistronic) or more (multicistronic) open reading frames (ORFs). It may have RNA, preferably mRNA. An open reading frame is a sequence of codons that can be translated into a peptide or protein.

"분리된 분자"는 다른 분자, 예컨대 다른 세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는 분자를 의미한 다. "분리된 핵산"이라는 용어는 핵산이 (i) 시험관내, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예를 들면 절단 및 겔-전기천공 분획화에 의해 정제되거나, 또는 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성법에 의해 합성된 핵산을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 기술에 의해 조작 가능한 핵산이다. “Isolated molecule” means a molecule that is substantially free of other molecules, such as other cellular material. The term “isolated nucleic acid” refers to a nucleic acid that is (i) amplified in vitro, eg by polymerase chain reaction (PCR), (ii) recombinantly produced by cloning, or (iii) eg cleaved and nucleic acids purified by gel-electroporation fractionation, or (iv) synthesized, for example, by chemical synthesis. An isolated nucleic acid is a nucleic acid capable of being manipulated by recombinant techniques.

"폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호 호환적으로 아미노산 잔기들로 된 폴리머를 지칭하기 위해 사용된다. 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 천연 아미노산의 인공적인 화학 유사체인 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 천연 아미노산 폴리머에도 적용된다. 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "아미노산 서열" 및 "단백질"은 또한 비-제한적인 예로, 당화, 지질 결합, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복시화, 하이드록시화 및 ADP-화라이보실화 (ribosylation) 등의 변형을 포함한다."Polypeptide", "peptide", "amino acid sequence" and "protein" are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues. These terms apply to natural amino acid polymers as well as amino acid polymers, which are artificial chemical analogs of natural amino acids to which one or more amino acid residues are matched. The terms “polypeptide,” “peptide,” “amino acid sequence,” and “protein” also include, but are not limited to, glycosylation, lipid binding, sulfation, gamma-carboxylation of glutamic acid residues, hydroxylation, and ADP-pyramidation. Includes modifications such as ribosylation.

단백질: 일반적으로 단백질은 하나 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로 단백질은 생물학적 기능을 발휘하는 단백질을 위해 요구될 수 있는 3차원 형태로 접힌다.Protein: A protein generally includes one or more peptides or polypeptides. In general, proteins fold into three-dimensional shapes that may be required for proteins to exert biological functions.

펩타이드: 일반적으로 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 폴리머이다. 이는 일반적으로 50 단량체 단위 미만으로 함유한다. 그렇지만, 용어 펩타이드는 50 단량체 단위를 초과하여 갖는 분자를 위한 권리를 포기하는 것은 아니다. 긴 펩타이드는 폴리펩타이드라고도 불리우며, 일반적으로 50 ~ 600 단량체 단위를 갖는다.Peptide: Generally, a peptide or polypeptide is a polymer of amino acid monomers linked by peptide bonds. It generally contains less than 50 monomer units. However, the term peptide is not a disclaimer for molecules having more than 50 monomer units. Long peptides, also called polypeptides, generally have 50 to 600 monomer units.

단백질의 절편 또는 부분: 본 발명에서, 단백질의 절편 또는 부분은 일반적으로 단백질의 아미노산 서열의 연속적인 부분에 상응하는 펩타이드로 이해될 수 있으며, 바람직하게는 약 6 ~ 약 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지고, 예를 들어, MHC 클래스 I 분자에 의하여 가공되고 제시되는 부분, 바람직하게는 약 8 ~ 약 10개 아미노산의 길이를 가지는, 예를 들어, 8, 9, 또는 10개, (또는 11, 또는 12개 아미노산도), 또는 MHC 클래스 II 분자에 의하여 가공 및 제시되는 절편, 바람직하게는 약 13개 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들어, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지며, 여기서 이들 절편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이들 절편은 일반적으로 펩타이드 절편 및 MHC 분자로 이루어지는 복합체의 형태로 T 세포에 의하여 인지될 수 있고, 즉 절편은 일반적으로 그들의 천연 형태로 인지되지 않는다. 본원에 정의된 바와 같은 단백질의 절편 또는 부분은 또한 이들 단백질의 에피토프 또는 기능부(functional site)를 포함할 수 있다. 단백질의 절편 또는 부분은 항원, 특히 면역원, 예를 들어 항원 결정기(또한 '에피토프'로 불리우는)이거나 항원 특성(antigenic characteristics)을 갖고, 적응 면역 반응을 유도한다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드의 절편은 적어도 하나의 이들 단백질 또는 펩타이드의 에피토프를 포함할 수 있다. 게다가 또한, 단백질의 도메인(domain)은, 세포 외 도메인, 세포 내 도메인 또는 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 단백질의 짧거나 절단된 버전(versions)과 같이 단백질의 절편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.Segment or part of protein: In the present invention, a fragment or part of a protein can generally be understood as a peptide corresponding to a continuous part of the amino acid sequence of a protein, preferably from about 6 to about 20 or more amino acids. length, e.g., a portion processed and presented by an MHC class I molecule, preferably from about 8 to about 10 amino acids in length, e.g. , or even 12 amino acids), or fragments processed and presented by MHC class II molecules, preferably about 13 or more amino acids, e.g., 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, It has a length of 20 or more amino acids, wherein these segments can be selected from any part of the amino acid sequence. These fragments can usually be recognized by T cells in the form of a complex consisting of a peptide fragment and an MHC molecule, i.e. the fragments are not generally recognized in their native form. Fragments or portions of proteins as defined herein may also include epitopes or functional sites of these proteins. A segment or portion of a protein is an antigen, in particular an immunogen, eg an antigenic determinant (also called an 'epitope') or has antigenic characteristics and induces an adaptive immune response. Thus, a fragment of a protein or peptide may contain at least one epitope of these proteins or peptides. In addition, a domain of a protein can be understood to include fragments of a protein, such as extracellular domains, intracellular domains or transmembrane domains and short or truncated versions of proteins. .

"알파바이러스"는 광범위하게 이해되어야 하며, 알파바이러스의 특징을 갖는 임의의 바이러스 입자를 포함한다. 알파바이러스의 특성은 RNA 중합효소 활성을 포함하여 대상세포에서의 복제에 적합한 유전 정보를 코딩하는 (+) 가닥 RNA의 존재를 포함한다. 많은 알파바이러스의 추가적인 특성은 예를 들어 문헌[Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562]; [Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124]; [Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp. 2483-2500]에 기재되어 있다."Alphavirus" should be understood broadly and includes any viral particle having the characteristics of an alphavirus. Characteristics of alphaviruses include the presence of positive-strand RNA that encodes genetic information suitable for replication in target cells, including RNA polymerase activity. Additional properties of many alphaviruses are described, for example, in Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 58; 491-562]; [Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 87; 111-124]; [Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, p. 2483-2500].

"알파바이러스"는 자연계에서 발견되는 알파바이러스뿐만 아니라 임의의 변이체 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 또는 유도체는 자연계에서 발견되지 않는다.“Alphavirus” includes an alphavirus found in nature as well as any variant or derivative thereof. In some embodiments, the variant or derivative is not found in nature.

알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스이다. 전형적으로, 자연계에서 발견되는 알파바이러스는 동물(인간과 같은 척추동물 및 곤충과 같은 절지동물을 포함한다)과 같은 임의의 하나 이상의 진핵세포체에 대해 감염성이 있다. 전형적인 실시형태에서, 자연계에서 발견되는 알파바이러스는 동물에게 감염성이다. 자연계에서 발견되는 많은 알파바이러스는 척추동물 및/또는 절지동물에게 감염성이 있다.Alphaviruses are alphaviruses found in nature. Typically, alphaviruses found in nature are infectious to any one or more eukaryotic cell bodies, such as animals (including vertebrates such as humans and arthropods such as insects). In typical embodiments, alphaviruses found in nature are infectious to animals. Many alphaviruses found in nature are infectious to vertebrates and/or arthropods.

자연계에서 발견되는 알파바이러스는 바람직하게는 이하와 같이 이루어진 군으로부터 선택된다: Barmah Forest 바이러스 복합체 (Barmah Forest 바이러스를 포함한다); 동부형 마뇌염(Eastern equine encephalitis) 복합체(동부형 마뇌염 바이러스의 7가지 항원 유형을 포함한다); Middelburg 바이러스 복합체 (Middelburg 바이러스를 포함한다); Ndumu 바이러스 복합체 (Ndumu 바이러스를 포함한다); Semliki Forest 바이러스 복합체 (Bebaru 바이러스, Chikungunya 바이러스, Mayaro 바이러스 및 그 아류형 Una 바이러스, O'Nyong Nyong 바이러스, 및 그 아류형 Igbo-Ora 바이러스, Ross River 바이러스 및 그 아류형 Bebaru 바이러스, Getah 바이러스, Sagiyama 바이러스, Semliki Forest 바이러스 및 그 아류형 Me Tri 바이러스를 포함한다); 베네수엘라 마뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 복합체 (Cabassou 바이러스, Everglades 바이러스, Mosso das Pedras 바이러스, Mucambo 바이러스, Paramana 바이러스, Pixuna 바이러스, Rio Negro 바이러스, Trocara 바이러스 및 그 아류형 Bijou 가교 바이러스, 베네수엘라 마뇌염 바이러스를 포함한다); 서부형 마뇌염(Western equine encephalitis) 복합체(Aura 바이러스, Babanki 바이러스, Kyzylagach 바이러스, Sindbis 바이러스, Ockelbo 바이러스, Whataroa 바이러스, Buggy Creek 바이러스, Fort Morgan 바이러스, Highlands J 바이러스, 서부형 마뇌염 바이러스를 포함한다); 및 연어류 췌장병 바이러스(Salmon pancreas disease virus); 수면 질환 바이러스(Sleeping Disease virus); 남방코끼리바다표범 바이러스(Southern elephant seal virus); Tonate 바이러스를 포함하는 일부 미분류된 바이러스를 들 수 있다. 보다 바람직하게는, 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스 복합체 (Semliki Forest 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 서부형 마뇌염 복합체 (Sindbis 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 동부형 마뇌염 바이러스 (상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다), 베네수엘라 마뇌염 복합체 (베네수엘라 마뇌염 바이러스를 포함하고, 상기한 바와 같은 바이러스 유형을 포함한다)로 이루어진 구능로부터 선택된다.Alphaviruses found in nature are preferably selected from the group consisting of: Barmah Forest Virus Complex (including Barmah Forest Virus); Eastern equine encephalitis complex (comprising 7 antigenic types of Eastern equine encephalitis virus); Middelburg virus complex (including Middelburg virus); Ndumu virus complex (including Ndumu virus); Semliki Forest virus complex (Bebaru virus, Chikungunya virus, Mayaro virus and its subtype Una virus, O'Nyong Nyong virus and its subtype Igbo-Ora virus, Ross River virus and its subtype Bebaru virus, Getah virus, Sagiyama virus , Semliki Forest virus and its subtype Me Tri virus); Venezuelan equine encephalitis complex (including Cabassou virus, Everglades virus, Mosso das Pedras virus, Mucambo virus, Paramana virus, Pixuna virus, Rio Negro virus, Trocara virus and its subtypes Bijou bridging virus, Venezuelan equine encephalitis virus do); Western equine encephalitis complex (including Aura virus, Babanki virus, Kyzylagach virus, Sindbis virus, Ockelbo virus, Whataroa virus, Buggy Creek virus, Fort Morgan virus, Highlands J virus, Western equine encephalitis virus) ; and Salmon pancreas disease virus; Sleeping Disease virus; Southern elephant seal virus; Some unclassified viruses, including the Tonate virus. More preferably, the alphavirus is Semliki Forest virus complex (including Semliki Forest virus, including virus types as described above), western type mannephritis complex (including Sindbis virus, and virus types as described above). (including), eastern type meningitis virus (including virus types as described above), and Venezuelan meningitis complex (including Venezuelan meningitis virus and including virus types as described above). .

보다 바람직하게, 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스는 Sindbis 바이러스이다. 더욱 바람직하게, 알파바이러스는 베네수엘라 마뇌염 바이러스이다.More preferably, the alphavirus is a Semliki Forest virus. In one more preferred embodiment, the alphavirus is a Sindbis virus. More preferably, the alphavirus is Venezuelan encephalitis virus.

본 발명에서, 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스가 아니다. 전형적으로 자연계에 존재하지 않는 알파바이러스는 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 변이체 또는 유도체이며, 뉴클레오타이드 서열, 즉 게놈 RNA에서 적어도 하나의 돌연변이에 의해 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별된다. 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이는 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 치환 또는 결실로부터 선택될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변이는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 단백질에서의 돌연변이와 관련되거나 관련 없을 수 있다. 예를 들어, 자연계에 존재하지 않는 알파바이러스는 약독 알파바이러스일 수 있다. 자연계에 존재하지 않는 약독 알파바이러스는 전형적으로 자연계에서 발견되는 알파바이러스와 구별되어 그 뉴클레오타이드 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 알파바이러스이며, 이는 감염성이 전혀 없거나 감염성이 있지만 질병 발생력이 약화되어 있거나 질병 발생력이 전혀 없는 알파바이러스이다. 일례로서, TC83은 자연계에서 발견되는 베네수엘라 마뇌염 바이러스 (VEEV)와 구별되는 약독 알파바이러스이다.In the present invention, the alphavirus is not an alphavirus found in nature. Alphaviruses that do not typically exist in nature are variants or derivatives of alphaviruses found in nature, and are distinguished from naturally occurring alphaviruses by at least one mutation in their nucleotide sequence, i.e., genomic RNA. Mutations in the nucleotide sequence can be selected from insertions, substitutions or deletions of one or more nucleotides compared to alphaviruses found in nature. A mutation in a nucleotide sequence may or may not be related to a mutation in a polypeptide or protein encoded by the nucleotide sequence. For example, an alphavirus that does not exist in nature may be an attenuated alphavirus. Attenuated alphaviruses that do not exist in nature are typically alphaviruses that have at least one mutation in their nucleotide sequence that distinguishes them from alphaviruses found in nature, which are either non-infectious or infectious but with reduced or disease-causing ability. It is an alpha virus that does not have this at all. As an example, TC83 is an attenuated alphavirus distinct from the Venezuelan encephalitis virus (VEEV) found in nature.

또한, 알파바이러스 속의 구성은 인간에서의 상대적인 임상 특징에 의거하여 분류될 수도 있다: 주로 뇌염과 관련된 알파바이러스, 주로 발열, 발진 및 다발성관절염과 관련된 알파바이러스를 들 수 있다.Members of the alphavirus genus may also be classified based on their relative clinical characteristics in humans: alphaviruses primarily associated with encephalitis, alphaviruses primarily associated with fever, rash and polyarthritis.

"알파바이러스"는 알파바이러스에서 발견되거나 예를 들어 유전공학적 조작에 의해 알파바이러스로부터 유래되거나 알파바이러스로부터 유도된 것을 의미한다.“Alphavirus” means found in an alphavirus or derived from or derived from an alphavirus, eg, by genetic engineering.

"SFV"는 Semliki Forest 바이러스를 나타낸다. "SIN" 또는 "SINV"는 Sindbis 바이러스를 나타낸다. 본 발명에 따르면, "VEE" 또는 "VEEV"는 베네수엘라 마뇌염 바이러스를 나타낸다.“SFV” stands for Semliki Forest Virus. “SIN” or “SINV” refers to Sindbis virus. According to the present invention, “VEE” or “VEEV” stands for Venezuelan encephalitis virus.

"보존서열구성" 또는 "CSE"라는 용어는 알파바이러스 RNA에서 발견되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이종 상동성이 상이한 알파바이러스의 게놈에 존재하고 상이한 알파바이러스의 이종상동한 CSE가 높은 서열 동일성 백분율 및/또는 유사한 2차 또는 3차 구조의 높은 비율을 공유하는 것이 바람직하기 때문에 이들 서열 요소는 "보전된 것"으로 지칭한다. CSE는 CSE 1, CSE 2, CSE 3 및 CSE 4를 포함한다(상세한 내용은 문헌[Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856] 참조).The term "conserved sequence composition" or "CSE" refers to a nucleotide sequence found in alphavirus RNA. Because orthologs exist in the genomes of different alphaviruses and it is desirable for orthologous CSEs of different alphaviruses to share a high percentage of sequence identity and/or a high percentage of similar secondary or tertiary structure, these sequence elements are " referred to as “preserved.” CSEs include CSE 1, CSE 2, CSE 3 and CSE 4 (see Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856 for details).

본 발명에 따르면, "서브게놈 프로모터" 또는 "SGP"는 핵산 서열 (예컨대 코딩 서열)의 핵산 서열 상류(5')를 지칭하며, RNA 중합효소, 전형적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소에 대한 결합 부위 및 인식 부위를 제공함으로써 상기 핵산 서열의 전사를 제어한다. SGP는 추가적인 인자에 대한 추가적인 인식 또는 결합 부위를 포함할 수 있다. 서브게놈 프로모터는 전형적으로 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스의 유전적 요소이다. 알파바이러스의 서브게놈 프로모터는 바이러스 게놈 RNA에 포함된 핵산 서열이다. 서브게놈 프로모터는 일반적으로 RNA 의존성 RNA 중합효소, 예를 들어 알파바이러스 RdRp의 존재 하에서 전사(RNA 합성)의 개시를 허용하는 것을 특징으로 한다. RNA (-) 가닥, 즉 알파바이러스 게놈 RNA의 상보체는 (+) 가닥 서브게놈 RNA 분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하고, 서브게놈 (+) 가닥 합성은 전형적으로 서브게놈 프로모터에서 또는 그 근처에서 개시된다. "서브게놈 프로모터"는 그러한 서브게놈 프로모터를 포함하는 핵산에서 임의의 특정 위치에 국한되지 않는다. 일부 실시형태에서, SGP는 CSE 3과 동일하거나 CSE 3과 중첩되거나 CSE 3을 포함한다.According to the present invention, a "subgenomic promoter" or "SGP" refers to a nucleic acid sequence upstream (5') of a nucleic acid sequence (such as a coding sequence) and is a binding site for RNA polymerase, typically RNA dependent RNA polymerase, and Transcription of the nucleic acid sequence is controlled by providing a recognition site. SGPs may contain additional recognition or binding sites for additional factors. Subgenomic promoters are typically genetic elements of positive-stranded RNA viruses such as alphaviruses. The subgenomic promoter of an alphavirus is a nucleic acid sequence contained in the viral genomic RNA. Subgenomic promoters are generally characterized as allowing initiation of transcription (RNA synthesis) in the presence of an RNA dependent RNA polymerase, such as alphavirus RdRp. The RNA (-) strand, i.e. the complement of the alphavirus genomic RNA, serves as a template for the synthesis of the (+)-strand subgenomic RNA molecule, which is typically synthesized at or near a subgenomic promoter. is initiated A "subgenomic promoter" is not limited to any particular location in a nucleic acid comprising such a subgenomic promoter. In some embodiments, the SGP is the same as, overlaps with, or includes CSE 3.

담체/폴리머 담체: 담체는 일반적으로 또 다른 화합물(화물(cargo))의 수송 또는 복합화를 용이하게 하는 화합물일 수 있다. 폴리머 담체는 일반적으로 폴리머를 형성하는 담체이다. 담체는 이의 화물과 공유 또는 비-공유 상호작용에 의하여 연관될 수 있다. 담체는 관심 세포 내로 핵산, 예를 들어, RNA 또는 DNA를 수송할 수 있다. 담체는 양이온성 성분일 수 있다.Carrier/Polymeric Carrier: A carrier may be a compound that generally facilitates transport or complexation of another compound (cargo). A polymer carrier is a carrier that generally forms a polymer. A carrier may be associated with its cargo by covalent or non-covalent interactions. A carrier can transport a nucleic acid, eg RNA or DNA, into a cell of interest. The carrier may be a cationic component.

양이온성 성분: 용어 "양이온성 성분"은 일반적으로 전하를 띤(charged) 분자를 말하며, 이는 일반적으로 1 ~ 9, 9 미만(예를 들어 5 ~ 9), 또는 8 미만(예를 들어 5 ~ 8), 또는 7 미만(예를 들어, 5 ~ 7)의, 예를 들어 7.3 ~ 7.4의 생리학적 pH 값의 양전하를(양이온) 띤다. 따라서, 양이온성 성분은 임의의 양전하를 띤 화합물 또는 폴리머, 생리학적 조건하에서, 특히 생체 내(in vivo) 생리학적 조건 하에서 양전하를 띤, 양이온성 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. '양이온성 펩타이드 또는 단백질'은 적어도 하나의 양전하를 띤 아미노산 또는 하나 이상의 양전하를 띤 아미노산, 예를 들어 Arg, His, Lys 또는 Orn 로부터 선택된 것을 함유할 수 있다. 따라서, '다중양이온성' 화합물 또한 주어진 조건하에서 하나 이상의 양전하를 보이는 범위 내이다.Cationic Component: The term "cationic component" generally refers to a charged molecule, which is usually 1 to 9, less than 9 (eg 5 to 9), or less than 8 (eg 5 to 9). 8), or a physiological pH value of less than 7 (eg, 5 to 7), eg, 7.3 to 7.4. Thus, the cationic component can be any positively charged compound or polymer, cationic peptide or protein that is positively charged under physiological conditions, particularly under physiological conditions in vivo. A 'cationic peptide or protein' may contain at least one positively charged amino acid or one or more positively charged amino acids, for example selected from Arg, His, Lys or Orn. Thus, 'polycationic' compounds are also within the range of exhibiting more than one positive charge under given conditions.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

도 1은 본 발명의 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 구성 및 기전을 보여주는 흐름도이다. 1 is a flowchart showing the construction and mechanism of the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention.

도 1를 살펴보면, 세포 내 적어도 하나의 단백질 합성을 하고 복제가 가능한 구성성분이 있으며, Referring to Figure 1, there is a component capable of synthesizing and replicating at least one protein in a cell,

(ii) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있는 관심 mRNA 레플리콘을 코딩하는 DNA 카세트(RdRp DNA 카세트)를 포함하며,(ii) a DNA cassette encoding an mRNA replicon of interest capable of being replicated by the RdRp (RdRp DNA cassette);

여기서, 추가적으로 상기 관심 mRNA 레플리콘을 포함하는 RNA 카세트(관심 mRNA 레플리콘 카세트) 및 상기 RdRp mRNA를 인코팅하는 DNA Rd트(RdRp DNA 카세트)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물을 제공한다.Here, at least one selected from the group consisting of an RNA cassette (mRNA replicon cassette of interest) containing the mRNA replicon of interest and a DNA Rd (RdRp DNA cassette) encoding the RdRp mRNA is additionally included. It provides a self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system and a composition thereof, characterized in that.

상기 DNA 카세트는 프로모터 하류부위에 (i) 상기 관심 mRNA 레플리콘 또는 (ii) 상기 RdRp mRNA를 인코팅하는 DNA를 포함하며, 상기 프로모터에 결합하는 DNA-dependent RNA polymerase(DdRp)에 의해 그 하류 부위는 mRNA로 전사된다. The DNA cassette includes DNA encoding (i) the mRNA replicon of interest or (ii) the RdRp mRNA at a region downstream of the promoter, and DNA-dependent RNA polymerase (DdRp) binds to the promoter to the downstream region. is transcribed into mRNA.

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 예를 들어 살아있는 세포 또는 유기체에 관심 mRNA를 도입함으로써 유전자 기능을 연구하고 질환을 퇴치하기 위한 강력한 수단을 위한 유망한 방법이 있다. 현재 사용되는 관심 mRNA은 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 유전체 편집, 및 RNA 침묵로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention is a promising method for a powerful means to study gene function and combat disease, for example by introducing an mRNA of interest into a living cell or organism. The currently used mRNA of interest may be any one selected from the group consisting of antigens, antibodies, therapeutic proteins, peptides, fusion proteins, genome editing, and RNA silencing.

관심 mRNA는 치료 단백질 또는 펩타이드를 암화화하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 병원성 항원, 종양성 항원, 알러지성 항원 또는 자가 면역성 항원과 같은 항원은 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 거기에, 항원을 코딩하는 관심 mRNA의 투여는 상기 항원을 포함하는 질환에 대한 유전적 백신 접종 접근에 사용된다. 항체는 본 발명에 따른 관심 mRNA의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. The mRNA of interest contains at least one open reading frame that encodes a therapeutic protein or peptide. Antigens such as pathogenic antigens, oncogenic antigens, allergenic antigens or autoimmune antigens are encoded by at least one open reading frame. Therein, administration of an mRNA of interest encoding an antigen is used in a genetic vaccination approach against a disease involving the antigen. An antibody is encoded by at least one open reading frame of an mRNA of interest according to the present invention.

본 발명은 일반적으로 살아있는 세포 또는 유기체에 정확하고 효율적으로 관심 mRNA를 도입하기 위한 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 조성물을 포함한다.The present invention generally includes self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression systems and compositions for accurately and efficiently introducing an mRNA of interest into a living cell or organism.

세포 내 적어도 하나의 단백질 합성을 하고 복제가 가능한 구성성분이 있으며, There is a component capable of synthesizing and replicating at least one protein in the cell,

여기서, 추가적으로 상기 관심 mRNA 레플리콘을 포함하는 RNA 카세트(관심 mRNA 레플리콘 RNA 카세트) 및 상기 RdRp mRNA를 인코팅하는 DNA 카세트(RdRp DNA 카세트)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물을 제공한다,Here, it additionally includes at least one selected from the group consisting of an RNA cassette containing the mRNA replicon of interest (mRNA replicon RNA cassette of interest) and a DNA cassette encoding the RdRp mRNA (RdRp DNA cassette). It provides a self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system and a composition thereof, characterized in that

상기 DNA 카세트는 대장균 플라스미드, 박테리오파지(λ, M13, P1), 바이러스(동물 바이러스-레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 등; 곤충 바이러스 - 배큘로 바이러스, 식물 바이러스 - 콜리플라워 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 쌍둥이자리 바이러스 등), 아그로박테리움 투메파시엔스 기반 벡터, 키메라 플라스미드(코스미드, 파지미드, 파스미드 및 포스미드), 인공 염색체(YAC, BAC, PAC, MAC 및 HAC) 및 비 대장균 벡터(예: 바실러스 및 슈도모나스 벡터 등) 기반 벡터를 포함하는 운반체에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물을 제공한다. The DNA cassette is an E. coli plasmid, bacteriophage (λ, M13, P1), virus (animal virus-retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, vaccinia virus, etc.; insect virus-baculovirus, plant virus- Cauliflower Mosaic Virus, Potato Virus X, Gemini Virus, etc.), Agrobacterium tumefaciens based vectors, chimeric plasmids (cosmids, phagemids, phsmids and fosmids), artificial chromosomes (YAC, BAC, PAC, MAC) and HAC) and non-E. coli vectors (eg, Bacillus and Pseudomonas vectors, etc.)-based carriers.

상기 DNA 카세트는 프로모터 하류부위에 상기 (i) RNA 레플리콘 또는 (ii) 상기 RdRp mRNA를 인코팅하는 DNA를 포함하며, 상기 프로모터에 결합하는 DNA-dependent RNA polymerase(DdRp)에 의해 그 하류 부위는 RNA로 전사된다. The DNA cassette includes DNA encoding the (i) RNA replicon or (ii) the RdRp mRNA at a region downstream of the promoter, and the downstream region is formed by DNA-dependent RNA polymerase (DdRp) binding to the promoter. transcribed into RNA.

여기서 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 RdRp의 번역을 유도하기 위한 5'-캡을 포함한다.Here, the RNA construct for expressing RdRp includes a 5'-cap for inducing translation of RdRp.

바람직하게, 5'-캡은 천연 5'-캡 또는 5'-캡 유사체이다. Preferably, the 5'-cap is a natural 5'-cap or a 5'-cap analog.

바람직하게, RdRp는 알파바이러스 RdRp이다.Preferably, RdRp is an alphavirus RdRp.

RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소를 포함하지 않는다. 따라서, RdRp의 변역은 IRES 요소에 의해 유도되지 않는다.RNA constructs for expressing RdRp do not contain internal ribosome entry site (IRES) elements. Thus, translation of RdRp is not induced by the IRES element.

RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다. 또한, 5'-UTR 및/또는 3'-UTR이 존재할 수 있다. RNA constructs for expressing RdRp include an open reading frame (ORF) encoding RdRp. In addition, 5'-UTR and/or 3'-UTR may be present.

바람직하게, RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체는Preferably, the RNA construct for expressing RdRp is

(1) 5'UTR 또는 알파바이러스 5' 복제인식서열(5'CSE);(1) 5'UTR or alphavirus 5' replication recognition sequence (5'CSE);

(2) RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임, 및(2) an open reading frame encoding RdRp, and

(3) 3'UTR 또는 알파바이러스 3' 복제인식서열(3'CSE);을 포함한다.(3) 3'UTR or alphavirus 3' replication recognition sequence (3'CSE);

바람직하게는, 5'UTR 및/또는 3' UTR은 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 대해 이종 또는 고유한 것이 아니다.Preferably, the 5'UTR and/or 3'UTR is not heterologous or unique to the alphavirus that induces RdRp.

바람직하게는, RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 mRNA 복제에 필요한 비구조성 단백질에 대한 코딩영역(들)을 포함한다.Preferably, the open reading frame encoding RdRp includes coding region(s) for non-structural proteins required for mRNA replication.

RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 3' 폴리(A) 서열을 포함한다.RNA constructs for expressing RdRp include a 3' poly(A) sequence.

RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체는 RdRp에 의해 복제될 수 없다.RNA constructs for expressing RdRp cannot be replicated by RdRp.

상기 RdRp에 의해 복제될 수 있는 mRNA 레플리콘은 관심 단백질을 코딩하는 RNA 레플리콘을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 1종 이상이다.The mRNA replicon capable of being replicated by the RdRp is at least one selected from the group containing an RNA replicon encoding a protein of interest.

상기 RNA 레플리콘을 구성하는 관심 단백질을 코딩하는 RNA 레플리콘 각각은Each of the RNA replicons encoding the protein of interest constituting the RNA replicon is

(1) 알파바이러스 5' 복제인식서열; 및(1) an alphavirus 5' replication recognition sequence; and

(2) 알파바이러스 3' 복제인식서열을 포함한다.(2) It contains the alphavirus 3' replication recognition sequence.

알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열은 RdRp의 존재 하에서 관심 mRNA 레플리콘의 복제를 지시할 수 있다. 따라서, RdRp를 발현하기 위한 RNA 구조체 및 RNA 레플리콘이 함께 존재하는 경우에, 이들 복제인식서열은 mRNA의 복제를 지시한다.The alphavirus 5' replication recognition sequence and the alphavirus 3' replication recognition sequence can direct replication of the mRNA replicon of interest in the presence of RdRp. Thus, when an RNA construct and an RNA replicon for expressing RdRp coexist, these replication recognition sequences direct the replication of mRNA.

알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열은 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이다.The alphavirus 5' replication recognition sequence and the alphavirus 3' replication recognition sequence are unique to alphaviruses that induce RdRp.

RNA 레플리콘은 이종 핵산을 포함한다.RNA replicons include heterologous nucleic acids.

RNA 레플리콘은 관심 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.An RNA replicon contains an open reading frame that encodes a protein of interest.

바람직하게는, 관심 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이 아니다. 바람직하게는, 관심 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하지 않는다.Preferably, the open reading frame encoding the protein of interest is not unique to the alphavirus that induces RdRp. Preferably, the open reading frame encoding the protein of interest does not encode an alphavirus structural protein.

상기 관심 단백질은 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 유전체 편집, 및 RNA 침묵으로 이루어진 군에서 선택되어진 1종 이상을 포함한다.The protein of interest includes at least one selected from the group consisting of antigens, antibodies, therapeutic proteins, peptides, fusion proteins, genome editing, and RNA silencing.

바람직하게, RNA 레플리콘은 서브게놈 프로모터를 포함한다.Preferably, the RNA replicon includes a subgenomic promoter.

바람직하게는, 관심 단백질을 코딩하는 유전자 (즉, 목적 RNA)는 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있다. 이것은 관심 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 발현이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있게 한다.Preferably, the gene encoding the protein of interest (ie the RNA of interest) is under the control of a subgenomic promoter. This allows expression of the open reading frame encoding the protein of interest to be under the control of a subgenomic promoter.

바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이다.Preferably, the subgenomic promoter is native to the alphavirus driving RdRp.

바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 구조 단백질에 대한 프로모터이다. 이것은 서브게놈 프로모터가 알파바이러스에 고유한 것이고 상기 알파바이러스에서 하나 이상의 구조 단백질의 유전자 전사를 제어하는 것임을 의미한다.Preferably, the subgenomic promoter is a promoter for a structural protein of an alphavirus. This means that the subgenomic promoter is unique to the alphavirus and controls gene transcription of one or more structural proteins in the alphavirus.

RNA 레플리콘은 3' 폴리(A) 서열을 포함한다.RNA replicons contain a 3' poly(A) sequence.

RNA 레플리콘은 5'-캡을 포함한다.RNA replicons contain a 5'-cap.

알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체 및/또는 RNA 레플리콘은 무손상 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다.The RNA construct and/or RNA replicon for expressing the alphavirus RdRp does not contain an open reading frame encoding an intact alphavirus structural protein.

알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스이다.The alphavirus is the Semliki Forest virus.

여기서, 상기 RNA 구조체 및 상기 RNA 레플리콘은 동일한 RNA 가닥에 존재하면서, 상기 RNA 레플리콘은 RdRp에 의한 시스(cis action)로 복제될 수 있으며, 또는 Here, while the RNA construct and the RNA replicon exist on the same RNA strand, the RNA replicon can be replicated in cis action by RdRp, or

상기 RNA 구조체 및 상기 RNA 레플리콘은 서로 다른 RNA 가닥에 존재하면서, 상기 RNA 레플리콘은 RdRp에 의한 트랜스(trans action)로 복제될 수도 있다.While the RNA construct and the RNA replicon exist on different RNA strands, the RNA replicon may be replicated in trans action by RdRp.

바람직하게, 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있는 RNA 레플리콘은 관심 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 군에서 선택되어진 1종 이상이다.Preferably, the RNA replicon capable of being replicated by RdRp is at least one selected from the group containing mRNA encoding the protein of interest.

여기서, 상기 DNA 구조체는 프로모터 하류부위에 상기 (i) RNA 레플리콘 또는 (ii) 상기 RdRp RNA 구조체와 상기 RNA 레플리콘을 인코팅하는 DNA를 포함하며, 상기 프로모터에 결합하는 DNA-dependent RNA polymerase(DdRp)에 의해 그 하류 부위는 mRNA로 전사된다. Here, the DNA construct includes DNA encoding the (i) RNA replicon or (ii) the RdRp RNA construct and the RNA replicon at a region downstream of the promoter, and a DNA-dependent RNA polymerase that binds to the promoter. Its downstream region is transcribed into mRNA by (DdRp).

상기 프로모터는 유전자의 전사를 조절하는 DNA의 특정 부위를 이른다. 일반적으로 프로모터는 유전자의 전사 개시 주변에 위치하며, 유전자의 앞쪽 수백~수천 개 염기쌍에 위치하고 있다. 유전자 발현을 개시하기 위해서는 유전자 전사를 촉진하는 DdRp가 유전자 주변의 DNA에 부착되어야 한다. 이때, 프로모터에 존재하는 다양한 인식부위에 결합한 전사인자들에 의해 DdRp가 자리를 잡게 된다. 박테리아의 경우, 일반적으로 시그마 요소(sigma factor)가 DdRp와 결합하게 되면서 프로모터를 인식하여 전사가 시작된다. 동물과 식물을 포함한 진핵생물의 경우, 보다 많은 전사인자들이 프로모터에 결합하며, 인핸서(enhancer), 침묵자(silencer) 등의 조절부위와 상호작용을 통해 전사가 개시된다.The promoter refers to a specific region of DNA that regulates transcription of a gene. In general, promoters are located around the start of transcription of genes, and are located hundreds to thousands of base pairs in front of genes. In order to initiate gene expression, DdRp, which promotes gene transcription, must be attached to the DNA surrounding the gene. At this time, DdRp is established by transcription factors bound to various recognition sites present in the promoter. In bacteria, transcription is initiated by recognizing the promoter when a sigma factor binds to DdRp. In the case of eukaryotes, including animals and plants, more transcription factors bind to promoters, and transcription is initiated through interaction with regulatory regions such as enhancers and silencers.

일반적으로 프로모터는 전사를 조절할 대상이 되는 유전자의 유전정보를 지니고 있는 DNA염기서열 앞부분에 위치한다. 진핵생물에서는 전사조절인자(transcription factor)라고 하는 단백질들이 프로모터부분에 결합함으로써 RNA중합효소를 이곳으로 이끌고 오는 일에 관여한다. 프로모터는 이러한 전사조절인자들이 결합하는 모든 DNA염기서열부위를 지칭한다고도 할 수 있다. 그에 비해 원핵생물에서의 프로모터는 대개 DdRp가 결합하는 전사시작지점(Transcription Start Site) 바로 근처의 결합부위로 정의된다. 전사를 조절하는 DNA염기서열은 프로모터 외에도 인핸서(enhancer)가 존재하나 프로모터가 전사시작지점으로부터 바로 앞쪽으로 수백 염기쌍(base pair) 이내에 위치하는데 비해 인핸서는 프로모터로부터 수천 염기쌍 이상 떨어져 있다는 점에서 구별될 수 있다. In general, a promoter is located at the front of a DNA nucleotide sequence that contains the genetic information of a gene to be controlled for transcription. In eukaryotes, proteins called transcription factors are involved in bringing RNA polymerase to this site by binding to the promoter region. A promoter can also refer to all DNA base sequence sites to which these transcriptional regulators bind. In contrast, the promoter in prokaryotes is usually defined as a binding site immediately adjacent to the transcription start site where DdRp binds. DNA nucleotide sequences that regulate transcription include enhancers in addition to promoters, but they can be distinguished in that promoters are located within hundreds of base pairs immediately ahead of the transcription start point, whereas enhancers are more than thousands of base pairs away from promoters. there is.

DdRp는 RNAP(RNA Polymerase, RNA 중합효소)의 동의어이고, 진핵생물의 핵에 있는 DdRp는 RNAP I, RNAP II 및 RNAP III이고 이들은 구조적으로 서로 매우 다르며 각각 다른 유전자 세트를 전사하다 (다른 중합효소는 미토콘드리아와 엽록체에 있다). 그러나 세 가지 모두 서로 관련된 두 개의 큰 서브유닛과 박테리아 RNAP의 가장 큰 두 개의 서브유닛을 가지고 있다. 또한, 이러한 세 가지 효소 모두에서 또는 RNAP I과 RNAP III 사이에서만 공통적으로 발견되는 여러 작은 서브유닛이 있다.DdRp is a synonym for RNAP (RNA Polymerase), and the DdRp in eukaryotic nuclei are RNAP I, RNAP II, and RNAP III, which are structurally very different from each other and each transcribe a different set of genes (other polymerases are in mitochondria and chloroplasts). However, all three have two interrelated large subunits and the two largest subunits of bacterial RNAP. In addition, there are several small subunits found in common in all three enzymes or only between RNAP I and RNAP III.

진핵 DdRp는 박테리아 RNAP와 마찬가지로 전사 개시에 필요한 특수 보조 인자가 필요하다. 그러나 박테리아의 경우와 달리 진핵 개시인자는 프로모터 요소를 중합효소 홀로엔자임의 일부가 아닌 독립적으로 인식한다. 특히 RNAP II에 의해 전사된 유전자에서 많은 다른 개시인자가 관련되며, 일부 개시인자는 그 자가로 매우 복잡한 단백질이다. 정제된 진핵 RNA 중합효소만으로는 프로모터에서 선택적으로 전사를 시작할 수 없다.Eukaryotic DdRp, like bacterial RNAP, requires specialized cofactors for transcriptional initiation. Unlike bacteria, however, eukaryotic initiators recognize the promoter element independently and not as part of the polymerase holoenzyme. Many different initiators are involved, particularly in genes transcribed by RNAP II, and some are themselves very complex proteins. Purified eukaryotic RNA polymerase alone cannot selectively initiate transcription from promoters.

홀로엔자임은 때때로 진핵 RNAP를 지칭하는 데 사용되지만, 이 경우에는 박테리아 '핵심' 효소와 비슷한 것을 의미하며 프로모터에서 전사할 수 없다. 그러나 박테리아 핵심 효소와 달리 진핵 세포 전체 효소는 RNA의 전사 또는 처리와 관련된 많은 다른 단백질을 포함할 수 있다.Holoenzymes are sometimes used to refer to eukaryotic RNAPs, but in this case they mean something similar to bacterial 'core' enzymes and cannot be transcribed from a promoter. However, unlike bacterial core enzymes, eukaryotic whole enzymes may involve many other proteins involved in the transcription or processing of RNA.

본 발명은 본 발명에 따른 RdRp의 번역을 유도하기 위한 5'-캡을 포함하는 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체, 그리고 상기 번역된 RdRp에 의해 관심 단백질을 복제하고 번역을 유도하기 위한 관심 RNA 레플리콘의 복제를 유도하기 위한 RNA 레플리콘을 제공한다.The present invention provides an RNA construct for expressing alphavirus RdRp containing a 5'-cap for inducing translation of RdRp according to the present invention, and an RNA of interest for replicating a protein of interest and inducing translation by the translated RdRp. An RNA replicon for inducing replication of the replicon is provided.

본 발명은 본 발명의 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘, 또는 이들 모두를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.The present invention provides an RNA construct for expressing the RdRp of the present invention, an RNA replicon according to the present invention, or a DNA comprising a nucleic acid sequence encoding both of them.

바람직하게는, DNA는 본 발명에 따른 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 코딩한다.Preferably, the DNA encodes the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system according to the present invention.

본 발명은 이하 단계를 포함하는 세포에서의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 생산 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system in a cell, comprising the following steps.

(a) 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 수득하는 단계, 및(a) obtaining a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system, and

(b) 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 세포 내에 함께 접종하는 단계를 포함하고,(b) co-inoculating the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system into the cells;

상기 방법에서, RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체 및/또는 RNA 레플리콘은 본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템에 대해 상기 정의된 바와 같다.In this method, the RNA construct and/or RNA replicon for expressing RdRp is as defined above for the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention.

본 발명은 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 본 발명에 따른 방법에 따라 접종된다. 세포는 본 발명의 방법에 의해 수득 가능하다.The present invention provides a cell comprising a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system. Cells are inoculated according to the method according to the present invention. Cells are obtainable by the method of the present invention.

세포는 유기체의 일부이다.Cells are part of an organism.

본 발명은 이하 단계를 포함하는 대상체에서의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 생산 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system in a subject comprising the following steps.

(b) 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,(b) administering the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system to the subject;

본 발명에서 해결하고자 하는 목적은 강력한 자가 증폭 능력을 나타내는 특성화된 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 제공하는 것이며, 본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 살아있는 세포 또는 유기체의 관심 유전자를 도입함으로써 유전자 기능을 연구하고 질환을 퇴치하기 위한 강력한 수단이 될 것이다. An object to be solved in the present invention is to provide a characterized self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system exhibiting strong self-amplification ability, and the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention introduces a gene of interest into a living cell or organism. By doing so, it will be a powerful tool for studying gene function and fighting disease.

도 1은 본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 구성요소로 RdRp mRNA 구조체 그리고 RNA 레플리콘로 구성되고,
도 2는 본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 유형을 제시하고 있으며,
도 3은 레플리콘 DNA 구조체를 pUC19 벡터에 클로닝하고 반응용액을 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 ECoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 4는 제조한 RdRp pUC19 벡터를 주형으로 정방향 프라이머 (서열번호 28) 및 역방향 프라이머 (서열번호 29)을 사용하여 증폭하고 체외전사하여 제조한 RdRp RNA 카세트, 캡된 RdRp mRNA이고,
도 5는 레플리콘 DNA 주형으로 체외전사를 수행하여 제조한 레플리콘 RNA 카세트이고,
도 6은 DNA 구조체를 CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector에 클로닝한 후 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 ECoRI/SmaI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 7은 DNA 구조체를 pCI-neo Mammalian Expression Vector에 클로닝한 후 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 ECoRI/SmaI 제한효소를 처리한 후 전기영동한 결과이고,
도 8은 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 기본 유형 A와 B를 실시례 3의 방법으로 각각 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 293T 세포 내 RdRp mRNA를 분석한 결과이고,
도 9는 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 기본 유형 A와 B를 각각 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 표적 RSV-F mRNA의 수준을 분석한 결과이고,
도 10은 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 기본 유형 A와 B의 형질주입체를 293T 세포를 0. 24. 48 및 72 시간이 경과한 후, ELISA를 이용하여 RSV-F의 변형량을 측정한 결과이고,
도 11은 RdRp DNA 카세트 및 EPO DNA 카세트를 293T 세포에 형질주입한 후 0, 24, 48 및 72시간이 경과한 후 총 단백질을 분리하여 EPO 발현량을 분석한 결과이다.1 is composed of an RdRp mRNA construct and an RNA replicon as components of the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention;
Figure 2 shows the type of self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system of the present invention,
Figure 3 shows the result of electrophoresis after cloning the replicon DNA construct into the pUC19 vector, transforming the reaction solution into E. coli, treating the plasmid with ECoRI/BamHI restriction enzymes in the selected strain,
Figure 4 shows an RdRp RNA cassette prepared by amplifying the prepared RdRp pUC19 vector as a template using a forward primer (SEQ ID NO: 28) and a reverse primer (SEQ ID NO: 29) and transcribing in vitro, and capped RdRp mRNA;
5 is a replicon RNA cassette prepared by performing in vitro transcription with a replicon DNA template;
Figure 6 is the result of electrophoresis after cloning the DNA construct into the CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector, transforming E. coli, isolating the plasmid from the selected strain, treating it with ECoRI/SmaI restriction enzymes,
Figure 7 is the result of electrophoresis after cloning the DNA construct into the pCI-neo Mammalian Expression Vector, transforming it into E. coli, isolating the plasmid from the selected strain, treating it with ECoRI/SmaI restriction enzymes,
Figure 8 is the result of analyzing RdRp mRNA in 293T cells at 0, 24, 48 and 72 hours after transfection of the self-amplifying RNA / DNA hybrid expression system basic types A and B into 293T cells by the method of Example 3, respectively. ,
Figure 9 is the result of analyzing the level of target RSV-F mRNA at 0, 24, 48 and 72 hours after transfection of basic types A and B of the self-amplifying RNA / DNA hybrid expression system into 293T cells, respectively,
Figure 10 shows the transfectants of basic types A and B of the self-amplifying RNA / DNA hybrid expression system in 0. 24. After 48 and 72 hours, ELISA was used to measure the amount of transformation of RSV-F. is the result,
FIG. 11 shows the results of analyzing EPO expression levels by isolating total proteins 0, 24, 48, and 72 hours after transfecting 293T cells with the RdRp DNA cassette and the EPO DNA cassette.

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 예를 들어 살아있는 세포 또는 유기체에 관심 유전자를 도입함으로써 유전자 기능을 연구하고 질환을 퇴치하기 위한 강력한 수단을 위한 유망한 방법이 있다. The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention is a promising method for studying gene function and a powerful means to combat disease, for example by introducing a gene of interest into a living cell or organism.

하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 관심 유전자의 도입은 수년 동안 생물 의학 연구의 목표였다. 종래 기술에서는 관심 세포 또는 유기체로 관심 유전자 전달에 대한 접근법을 개시하고 있지만, 핵산 분자 및/또는 전달 시스템의 유형이 다르다. 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 사용과 관련된 안전 문제에 의해 영향을 받으면서, 최근 몇 년간 리보핵산(RNA) 분자가 주목을 받고 있다. 네이키드된 RNA의 형태로, 또는 복합체 또는 포장된 형태로, 예를 들면, 비바이러스성 또는 바이러스성 운반체에 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA의 투여를 포함하는 다양한 접근법이 제안되어왔다. Introduction of genes of interest encoding one or more polypeptides has been a goal of biomedical research for many years. While the prior art discloses approaches to delivery of a gene of interest to a cell or organism of interest, the type of nucleic acid molecule and/or delivery system differs. BACKGROUND OF THE INVENTION Influenced by the safety concerns associated with the use of deoxyribonucleic acid (DNA) molecules, ribonucleic acid (RNA) molecules have received attention in recent years. Various approaches have been proposed involving administration of single-stranded RNA or double-stranded RNA in the form of naked RNA, or in complex or packaged form, eg, in a non-viral or viral vehicle.

바이러스 및 바이러스성 전달 운반체에서, 발현 도구는 전형적으로 단백질 및/또는 지질 (바이러스 입자)에 의해 캡슐화된다. 예를 들어, RNA 바이러스 유래의 조작된 RNA 바이러스 입자는 단백질 발현을 하기 위한 전달 운반체로서 제안되어왔다.In viruses and viral delivery vehicles, expression tools are typically encapsulated by proteins and/or lipids (viral particles). For example, engineered RNA virus particles derived from RNA viruses have been proposed as delivery vehicles for protein expression.

현재 사용되는 관심 유전자, mRNA, 단백질은 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 유전체 편집 및 mRNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 관심 mRNA는 치료 단백질 또는 펩타이드를 암화화하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 병원성 항원, 종양성 항원, 알러지성 항원 또는 자가 면역성 항원과 같은 항원은 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 거기에, 항원을 코딩하는 관심 mRNA의 투여는 상기 항원을 포함하는 질환에 대한 유전적 백신 접종 접근에 사용된다. The currently used gene, mRNA, or protein of interest may be any one selected from the group consisting of antigens, antibodies, therapeutic proteins, peptides, fusion proteins, genome editing, and mRNA interference. The mRNA of interest contains at least one open reading frame that encodes a therapeutic protein or peptide. Antigens such as pathogenic antigens, oncogenic antigens, allergenic antigens or autoimmune antigens are encoded by at least one open reading frame. Therein, administration of an mRNA of interest encoding an antigen is used in a genetic vaccination approach against a disease involving the antigen.

본 발명은 일반적으로 살아있는 세포 또는 유기체에 관심 단백질을 도입하기 위한 효율적인 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 구성하는 적합한 핵산 및 조성물을 포함한다.The present invention generally includes suitable nucleic acids and compositions that constitute an efficient self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system for introducing a protein of interest into a living cell or organism.

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention

본 발명은, 세포 내 적어도 하나의 내인성 단백질 합성을 하고 자가 증폭이 가능한 구성성분이 있는 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템(도 1)으로서, The present invention is a self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system (FIG. 1) having at least one endogenous protein synthesis in a cell and a component capable of self-amplification,

(i) RdRp를 발현시키기 위한 mRNA 카세트와 (ii) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있는 RNA 레플리콘을 포함하는 RNA 카세트; 및 (i) an mRNA cassette for expressing RdRp and (ii) an RNA cassette comprising an RNA replicon capable of being replicated by the RdRp; and

이들에 상응하는 DNA 카세트를 포함하는 시스템을 제공하고,providing a system comprising DNA cassettes corresponding thereto;

여기서, 상기 RNA 레플리콘을 구성하는 관심 mRNA는 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 유전체 편집, mRNA 간섭으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 관심 mRNA는 치료 단백질 또는 펩타이드를 암화화하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 병원성 항원, 종양성 항원, 알러지성 항원 또는 자가 면역성 항원과 같은 항원은 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 거기에, 항원을 코딩하는 관심 mRNA의 투여는 상기 항원을 포함하는 질환에 대한 유전적 백신 접종 접근에 사용된다..Here, the mRNA of interest constituting the RNA replicon may be any one selected from the group consisting of antigens, antibodies, therapeutic proteins, peptides, fusion proteins, genome editing, and mRNA interference. The mRNA of interest contains at least one open reading frame that encodes a therapeutic protein or peptide. Antigens such as pathogenic antigens, oncogenic antigens, allergenic antigens or autoimmune antigens are encoded by at least one open reading frame. Therein, administration of an mRNA of interest encoding an antigen is used in a genetic vaccination approach against diseases involving the antigen.

상기 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 RNA 카세트와 DNA 카세트로 구성되며, 천연 또는 변형 뉴클레오타이드로 제조할 수 있다. DNA 카세트는 상기 RNA 카세트를 인코딩하는 DNA 구조체를 포함한다.The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system consists of an RNA cassette and a DNA cassette, and can be prepared with natural or modified nucleotides. A DNA cassette includes a DNA construct that encodes the RNA cassette.

상기 DNA 카세트는 대장균 플라스미드, 박테리오파지(λ, M13, P1), 바이러스(동물 바이러스-레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 등; 곤충 바이러스 - 배큘로 바이러스, 식물 바이러스 - 콜리플라워 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 쌍둥이자리 바이러스 등), 아그로박테리움 투메파시엔스 기반 벡터, 키메라 플라스미드(코스미드, 파지미드, 파스미드 및 포스미드), 인공 염색체(YAC, BAC, PAC, MAC 및 HAC) 및 비 대장균 벡터(예: 바실러스 및 슈도모나스 벡터 등) 기반 벡터를 포함하는 운반체에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물을 제공한다.The DNA cassette is an E. coli plasmid, bacteriophage (λ, M13, P1), virus (animal virus-retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, vaccinia virus, etc.; insect virus-baculovirus, plant virus- Cauliflower Mosaic Virus, Potato Virus X, Gemini Virus, etc.), Agrobacterium tumefaciens based vectors, chimeric plasmids (cosmids, phagemids, phsmids and fosmids), artificial chromosomes (YAC, BAC, PAC, MAC) and HAC) and non-E. coli vectors (eg, Bacillus and Pseudomonas vectors, etc.)-based carriers.

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 구성도(도 1)는 상기 형태에만 제한하는 것이 아니며 비제한적이다.The configuration diagram of the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention (FIG. 1) is not limited to the above form, but is not limited thereto.

여기서 RdRp를 발현시키기 위한 mRNA 카세트는 5'-캡을 포함한다. 5'-캡은 RdRp의 번역을 유도하는 목적을 제공한다.Here, the mRNA cassette for expressing RdRp includes a 5'-cap. The 5'-cap serves the purpose of inducing translation of RdRp.

본 발명은 1개의 핵산 분자인, RdRp를 발현하기 위한(즉, RdRp를 코딩하는) 제 1 RNA 분자; 및 제 2 RNA 분자 (레플리콘)가 하나로 구성된 RNA 카세트 및 이들을 인코딩하는 DNA 카세트를 포함하는 시스템을 제공한다.The present invention relates to one nucleic acid molecule, a first RNA molecule for expressing RdRp (ie, encoding RdRp); and a system comprising an RNA cassette composed of one second RNA molecule (replicon) and a DNA cassette encoding them.

바람직하게, 본 발명은 2개의 핵산 분자인, RdRp를 발현하기 위한(즉, RdRp를 코딩하는) 제 1 RNA 분자; 및 제 2 RNA 분자 (레플리콘)를 각각 별도로 구성하는 RNA 카세트 및 이들에 상응하는 DNA 카세트를 포함하는 시스템을 제공한다.Preferably, the present invention provides two nucleic acid molecules, a first RNA molecule for expressing RdRp (ie encoding RdRp); and RNA cassettes separately constituting the second RNA molecule (replicon) and DNA cassettes corresponding thereto.

RdRp를 발현하기 위한 RNA 구조체는 본원에서 동의어로 "RdRp mRNA 카세트"라고 지칭한다.RNA constructs for expressing RdRp are synonymously referred to herein as “RdRp mRNA cassettes”.

본 발명의 시스템에서, RdRp의 역할은 RNA 레플리콘을 시스(cis) 또는 트랜스(trans)로 증폭시키는 것이다. 그러므로 상기 RNA 레플리콘은 시스-레플리콘 및 트랜스-레플리콘으로 나누어 조절될 수 있다. 상기 RNA 레플리콘이 발현을 위한 관심 mRNA를 코딩하면, 관심 mRNA의 발현 수준 및/또는 발현 지속 시간은 RdRp의 수준을 변경함으로써 시스 또는 트랜스로 레플리콘을 조절할 수 있다.In the system of the present invention, the role of RdRp is to amplify the RNA replicon in either cis or trans. Therefore, the RNA replicon can be regulated by dividing it into cis-replicon and trans-replicon. If the RNA replicon encodes an mRNA of interest for expression, the expression level and/or duration of expression of the mRNA of interest can be regulated in cis or trans by altering the level of RdRp.

임상 응용을 위한 RNA의 사용은 특히 RNA의 불안정성과 RNA의 짧은 반감기 때문에 제한되고 있다. 본 발명에서 RNA의 짧은 반감기는 대상세포 또는 유기체에서 RNA의 복제과 DNA의 복제를 유도하는 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템에 의해 보상될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명은 RNA 안정성에 유리한 특정 RNA 변형, 제형, 운반체 및 전달 방식을 제공한다. 이에 대해서는 하기 설명할 것이다. 실제로, 본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템가 세포 또는 동물에 도입될 때, 관심 유전자의 효율적인 발현이 달성된다.The use of RNA for clinical applications is particularly limited due to its instability and its short half-life. In the present invention, the short half-life of RNA can be compensated for by a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system that induces RNA replication and DNA replication in a target cell or organism. In addition, the present invention provides certain RNA modifications, formulations, vehicles and delivery modes that benefit RNA stability. This will be explained below. Indeed, when the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention is introduced into a cell or animal, efficient expression of the gene of interest is achieved.

본 발명의 시스템은 대상세포 또는 대상 유기체에서 관심 단백질 생산에 적합하다. 본 발명의 하나의 이점은 시스 복제에 적합한 전장 레플리콘의 경우보다 트랜스 복제가 관심 단백질 발현이 높게 달성될 수 있다는 것이다. The system of the present invention is suitable for producing a protein of interest in a subject cell or organism of interest. One advantage of the present invention is that trans replication can achieve higher expression of the protein of interest than in the case of a full-length replicon suitable for cis replication.

야생형 일차 세포 및 살아있는 동물, 즉 생체 내에서 관심 단백질의 고수준 발현이 달성될 수 있다는 것이 본 발명의 시스템의 또 다른 이점이다. It is another advantage of the system of the present invention that high-level expression of the protein of interest can be achieved in wild-type primary cells and living animals, i.e. in vivo.

본 발명의 시스템은 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 DNA 주형에서 시험관내 전사될 수 있다.The system of the present invention can be easily manufactured. For example, RNA molecules can be transcribed in vitro from a DNA template.

본 발명의 RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이다. 따라서, 본 발명의 시스템은 IVT-RNA를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 시스템의 모든 RNA 분자는 IVT-RNA이다. 시험관내-전사된 RNA (IVT-RNA)는 관심 단백질 합성에 특히 중요하다.RNA of the present invention is in vitro transcribed RNA (IVT-RNA). Thus, the system of the present invention includes IVT-RNA. Preferably, all RNA molecules of the system of the invention are IVT-RNA. In vitro-transcribed RNA (IVT-RNA) is of particular importance for the synthesis of proteins of interest.

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 적어도 1개의 관심 분자를 포함한다. 따라서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 관심 분자를 포함할 수 있다. The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention comprises at least one molecule of interest. Thus, it may contain 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more molecules of interest.

자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 RdRp mRNA 카세트에 더하여, 각각 바람직하게는 적어도 하나의 관심 단백질을 코딩하는 하나 이상의 레플리콘을 포함한다. RdRp mRNA 카세트에 의해 코딩된 RdRp는 각각의 레플리콘에 작용하여 복제 및 서브게놈 전사체의 생산을 유도할 수 있다. 예를 들어, 각각의 레플리콘은 관심 단백질을 코딩할 수 있다. 이는 예를 들어 여러 다른 관심 단백질들의 도입이 필요한 경우에 유리하다.The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system comprises, in addition to the RdRp mRNA cassette, one or more replicons each preferably encoding at least one protein of interest. RdRp encoded by the RdRp mRNA cassette can act on each replicon to induce replication and production of subgenomic transcripts. For example, each replicon can encode a protein of interest. This is advantageous, for example, when the introduction of several different proteins of interest is desired.

바람직하게는, 본 발명의 시스템은 바이러스 입자, 특히 차세대 바이러스 입자를 형성할 수 없다.Preferably, the system of the present invention is incapable of forming viral particles, particularly next-generation viral particles.

바람직하게는, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 관심 세포 또는 관심 유기체에서 자가 증폭이 가능하다.Preferably, the RdRp mRNA cassette of the present invention is capable of self-amplification in a cell or organism of interest.

또는 RNA의 양상 및 이점이 본원에 기재되어 있지만, 본 발명의 시스템은 하나 이상의 DNA 분자를 포함하는 것이 가능하다. 본 발명의 시스템의 임의의 하나 이상의 핵산 분자는, 일부 실시형태에서 DNA 분자일 수 있다. RdRp mRNA 카세트 및/또는 레플리콘이 DNA 분자인 것이 가능하다. DNA 분자의 경우, DNA 의존성 RNA 중합효소의 프로모터가 존재하는 것이 바람직하며, 이에 의해 관심 단백질 도입 도구가 도입 대상세포 또는 대상 유기체에서 복제 및 전사가 가능해진다.Alternatively, although aspects and advantages of RNA are described herein, it is possible for the system of the present invention to include one or more DNA molecules. Any one or more nucleic acid molecules of the system of the invention may, in some embodiments, be a DNA molecule. It is possible that the RdRp mRNA cassette and/or replicon is a DNA molecule. In the case of a DNA molecule, it is preferred that a promoter of a DNA-dependent RNA polymerase is present, whereby the protein transduction tool of interest can be replicated and transcribed in a target cell or organism.

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 다른 실시형태 및 장점이 이하에서 설명된다.Other embodiments and advantages of the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention are described below.

1. RdRp mRNA 카세트1. RdRp mRNA cassette

바람직하게는, 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 카세트 (RdRp mRNA 카세트)는 알파바이러스 RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (Open Reading Frame: ORF)을 포함한다.Preferably, an RNA cassette (RdRp mRNA cassette) for expressing alphavirus RdRp includes an open reading frame (ORF) encoding alphavirus RdRp.

"RdRp"는 RNA 의존성 RNA 중합효소 (RNA dependent RNA polymerase: RdRP)를 의미한다. RdRp는 일반적으로 폴리펩티드 또는 (+) 가닥 RNA 주형에 기반한 (-) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있는, 및/또는 (-) 가닥 RNA 주형에 기반한 (+) 가닥 RNA의 합성을 촉매할 수 있는 둘 이상의 동일한 및/또는 비동일한 단백질의 복합체 또는 결합체를 지칭한다. "RdRp" means RNA dependent RNA polymerase (RdRP). RdRp are generally capable of catalyzing the synthesis of polypeptides or (-)-strand RNA based on (+)-strand RNA templates, and/or those capable of catalyzing the synthesis of (+)-strand RNA based on (-)-strand RNA templates. Refers to a complex or combination of two or more identical and/or non-identical proteins.

RdRp는 추가적으로 하나 이상의 추가 기능, 예컨대 프로테아제 (자가-절단을 위해), 헬리카제, 말단 아데닐릴 전이효소 (폴리(A) 꼬리 추가를 위해), 메틸전달효소 및 구아닐릴 전이효소 (5'-캡을 핵산에 제공하기 위해), 핵 위치화 신호(nuclear localization sites), 트리포스파타아제를 추가로 가질 수 있다.RdRp may additionally have one or more additional functions, such as protease (for self-cleavage), helicase, terminal adenylyltransferase (for poly(A) tail addition), methyltransferase and guanylyltransferase (5'- to provide a cap to the nucleic acid), nuclear localization sites, tryphosphatase.

"알파바이러스 RdRp"는 자연성 발생 알파바이러스로부터의 RNA RdRp 및 약독 알파바이러스와 같은 알파바이러스의 변이체 또는 유도체로부터의 RNA RdRp를 포함하는, 알파바이러스로부터의 RNA RdRp를 지칭한다. 용어 "RdRp" 및 "알파바이러스 RdRp"는 임의의 특정 RdRp가 알파바이러스 RdRp가 아니라고 문맥이 지시하지 않는 한, 상호 교환적으로 사용된다.“Alphavirus RdRp” refers to RNA RdRp from an alphavirus, including RNA RdRp from a naturally occurring alphavirus and RNA RdRp from a variant or derivative of an alphavirus, such as an attenuated alphavirus. The terms "RdRp" and "alphavirus RdRp" are used interchangeably unless the context indicates that any particular RdRp is not an alphavirus RdRp.

"RdRp"라는 용어는 알파바이러스-감염된 세포에 의해 발현되거나 RdRp에 대해 코딩하는 핵산으로 형질 주입된 세포에 의해 발현되는 알파바이러스 RdRp의 모든 변이체, 특히 번역 후 변형된 변이체, 입체배좌체, 이소형체 및 상동체를 포함한다. 또한, 용어 "RdRp"는 재조합 방법에 의해 생성되고 생산될 수 있는 모든 형태의 RdRp를 포함한다. 예를 들어, 실험실에서 RdRp의 검출 및/또는 정제를 용이하게 하는 태그를 포함하는 RdRp, 예를 들어 myc-태그, HA-태그 또는 올리고히스티딘 태그(His-태그)는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.The term "RdRp" refers to all variants of alphavirus RdRp expressed by alphavirus-infected cells or by cells transfected with a nucleic acid encoding for RdRp, in particular post-translational modified variants, conformations, isoforms. and homologues. Also, the term "RdRp" includes all forms of RdRp that are produced and can be produced by recombinant methods. For example, RdRp comprising tags facilitating detection and/or purification of RdRp in the laboratory, eg myc-tag, HA-tag or oligohistidine tag (His-tag) can be prepared by recombinant methods. there is.

선택적으로, RdRp는 추가적으로 임의의 하나 이상의 알파바이러스 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 상보 서열, 보존서열구성 4 (CSE 4) 또는 이의 상보 서열에 대해 결합 능력이 있음을 기능적으로 의미한다. Optionally, the RdRp additionally comprises any one or more of alphavirus conserved sequence 1 (CSE 1) or its complementary sequence, conserved sequence 2 (CSE 2) or its complementary sequence, conserved sequence 3 (CSE 3) or its complementary sequence. , it functionally means that it has the ability to bind to conserved sequence configuration 4 (CSE 4) or its complementary sequence.

바람직하게는, RdRp는 CSE 2 [즉, (+) 가닥에] 및/또는 CSE 4 [즉, (+) 가닥에]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체 [즉, (-) 가닥에] 및/또는 CSE 3의 상보체 [즉, (-) 가닥에]에 결합할 수 있다.Preferably, the RdRp is capable of binding to CSE 2 [i.e., on the (+) strand] and/or CSE 4 [i.e., on the (+) strand], or the complement of CSE 1 [i.e., on the (-) strand]. ] and/or the complement of CSE 3 [ie, on the (-) strand].

RdRp의 기원은 특정 알파바이러스에만 국한되지 않는다. 바람직한 일 실시형태에서, 알파바이러스 RdRp는 자연성 발생 Semliki Forest 바이러스 및 약독 Semliki Forest 바이러스와 같은 Semliki Forest 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는 Semliki Forest 바이러스로부터 유래된 것이다. 또 바람직하게, RdRp는 자연성 발생 Sindbis 바이러스 및 약독 Sindbis 바이러스와 같은 Sindbis 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는 Sindbis 바이러스로부터 유래된 것이다. 또 바람직하게, RdRp는 자연성 발생 VEEV 및 약독 VEEV와 같은 VEEV의 변이체 또는 유도체를 포함하는 베네수엘라 마뇌염 바이러스(VEEV)로부터 유래된 것이다.The origin of RdRp is not limited to a specific alphavirus. In a preferred embodiment, the alphavirus RdRp is derived from a Semliki Forest Virus, including naturally occurring Semliki Forest Virus and variants or derivatives of Semliki Forest Virus, such as attenuated Semliki Forest Virus. Also preferably, the RdRp is derived from Sindbis viruses, including naturally occurring Sindbis viruses and variants or derivatives of Sindbis viruses, such as attenuated Sindbis viruses. Also preferably, the RdRp is derived from Venezuelan encephalitis virus (VEEV), including naturally occurring VEEV and variants or derivatives of VEEV, such as attenuated VEEV.

알파바이러스 RdRp는 전형적으로 알파바이러스 비구조성 단백질 (nsP)을 포함하거나 이로 구성된다. "비구조성 단백질"은 알파바이러스 기원의 임의의 하나 이상의 별개의 비구조성 단백질 (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4)을 지칭하거나, 알파바이러스 기원의 둘 이상의 비구조성 단백질, 예를 들어 nsP1234의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리-단백질을 지칭한다. "비구조성 단백질"은 nsP123을 지칭한다. "비구조성 단백질"은 nsP1234를 지칭한다. "비구조성 단백질"은 nsP123 (동의어로 P123) 및 nsP4의 복합체 또는 결합체를 지칭한다. "비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2 및 nsP3의 복합체 또는 결합체를 나타낸다. "비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4의 복합체 또는 결합체를 나타낸다. "비구조성 단백질"은 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 복합체 또는 결합체를 지칭한다.Alphavirus RdRp typically comprise or consist of an alphaviral non-structural protein (nsP). "Non-structural protein" refers to any one or more distinct non-structural proteins (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) of alphavirus origin, or the polypeptide sequence of two or more non-structural proteins of alphavirus origin, for example nsP1234. refers to a poly-protein comprising "Non-structural protein" refers to nsP123. "Non-structural protein" refers to nsP1234. "Non-structural protein" refers to a complex or complex of nsP123 (synonymously P123) and nsP4. "Non-structural protein" refers to a complex or complex of nsP1, nsP2 and nsP3. "Non-structural protein" refers to a complex or complex of nsP1, nsP2, nsP3 and nsP4. "Non-structural protein" refers to any one or more complexes or complexes selected from the group consisting of nsP1, nsP2, nsP3 and nsP4.

용어 "복합체" 또는 "결합체"는 다수 요소들의 기능적 앙상블이다. 알파바이러스 RdRp와 관련하여, 용어 "복합체 또는 결합체"는 적어도 2개의 다수 단백질 분자를 의미하며, 그 중 적어도 하나는 알파바이러스 비구조성 단백질이고, 여기서 복합체 또는 결합체는 RNA-의존성 RNA 중합효소 (RdRP) 활성을 나타낸다. 복합체 또는 결합체는 다수의 상이한 단백질 (헤테로다합체) 및/또는 하나의 특정 단백질 (호모다합체)의 다수 사본으로 이루어질 수 있다. 다합체 또는 다수와 관련하여, "다수(multi)"는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10개 초과와 같은 둘 이상의 것을 의미한다.The term "composite" or "assembly" is a functional ensemble of multiple elements. In relation to alphavirus RdRp, the term "complex or complex" refers to at least two multiple protein molecules, at least one of which is an alphaviral non-structural protein, wherein the complex or complex is RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) indicates activity. A complex or complex may consist of many different proteins (heteromultimers) and/or multiple copies of one particular protein (homomultimers). With reference to multimers or multiples, “multi” means two or more, such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, more than 10.

또한, 복합체 또는 결합체는 둘 이상의 다른 알파바이러스의 단백질도 포함할 수 있다. 예를 들어, 상이한 알파바이러스 비구조성 단백질을 포함하는 본 발명에 따른 복합체 또는 결합체에서, 모든 비구조성 단백질이 동일한 알파바이러스 유래일 필요는 없다. 이종 복합체 또는 결합체도 본 발명에 동등하게 포함된다. 단지 예시적인 목적으로, 이종 복합체 또는 결합체는 제 1 알파바이러스 (예를 들어, Sindbis 바이러스)로부터의 하나 이상의 비구조성 단백질 (예를 들어, nsP1, nsP2) 및 제 2 알파바이러스 (예를 들어 Semliki Forest 바이러스)로부터의 하나 이상의 비구조성 단백질 (nsP3, nsP4)을 포함할 수 있다.In addition, complexes or complexes may also include proteins from two or more other alphaviruses. For example, in a complex or complex according to the present invention comprising different alphavirus nonstructural proteins, not all nonstructural proteins need be of the same alphavirus origin. Heterogeneous complexes or conjugates are equally included in the present invention. For illustrative purposes only, a heterologous complex or complex may comprise one or more non-structural proteins (eg, nsP1, nsP2) from a first alphavirus (eg, Sindbis virus) and a second alphavirus (eg, Semliki Forest virus) from one or more non-structural proteins (nsP3, nsP4).

"복합체"또는 "결합체"는 공간적으로 근접한 2개 이상의 동일하거나 상이한 단백질 분자를 지칭한다. 복합체의 단백질은 바람직하게는 서로 직접적 또는 간접적인 물리적 또는 물리화학적 접촉을 한다. 복합체 또는 결합체는 다수의 상이한 단백질(헤테로다합체) 및/또는 하나의 특정 단백질(호모다합체)의 다중 사본으로 구성될 수 있다.A "complex" or "assembly" refers to two or more identical or different protein molecules in spatial proximity. The proteins of the complex are preferably in direct or indirect physical or physicochemical contact with each other. A complex or complex may consist of multiple copies of a number of different proteins (heteromultimers) and/or of one particular protein (homomultimers).

"RdRp"는 알파바이러스 비구조성 단백질의 탄수화물-개질된 형태 (예컨대 글리코실화됨) 및 지질-개질된 형태를 포함하여 각각의 동시- 또는 번역-후 변형된 형태를 포함한다. "RdRp"는 알파바이러스 RdRp의 각각 및 모든 기능적 단편을 포함한다. 단편은 RNA 의존성 RNA 중합효소 (RdRP)로서 작용할 때 기능적이다. RdRp는 RdRp가 발현되는 세포에서 막성(membranous) 복제 복합체 및/또는 액포를 형성할 수 있다."RdRp" includes each co- or post-translationally modified form, including carbohydrate-modified (eg glycosylated) and lipid-modified forms of alphavirus non-structural proteins. “RdRp” includes each and every functional fragment of alphavirus RdRp. Fragments are functional when they act as RNA-dependent RNA polymerase (RdRP). RdRp can form membranous replication complexes and/or vacuoles in cells in which RdRp is expressed.

바람직하게는 RdRp mRNA 카세트는 상기 정의된 RdRp에 대한 코딩영역(들)을 포함한다. 코딩영역(들)은 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(들)로 구성될 수 있다. RdRp mRNA 카세트는 알파바이러스 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4 모두를 암호화한다. RdRp mRNA 카세트는 하나의 단일 개방형 해독특에 의해 코딩되어, 하나의 단일이고, 선택적으로 절단 가능한 폴리단백질, nsP1234로서 알파바이러스 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4를 암호화한다. RdRp mRNA 카세트는 하나의 단일 개방형 해독특에 의해 코딩되어, 하나의 단일이고, 선택적으로 절단 가능한 폴리단백질, nsP123으로서 알파바이러스 nsP1, nsP2 및 nsP3을 암호화한다. nsP4는 개별적으로 암호화될 수 있다.Preferably the RdRp mRNA cassette comprises the coding region(s) for RdRp as defined above. Coding region(s) may consist of one or more open reading frame(s). The RdRp mRNA cassette encodes all of the alphaviruses nsP1, nsP2, nsP3 and nsP4. The RdRp mRNA cassette is encoded by a single open translational protein, encoding the alphaviruses nsP1, nsP2, nsP3 and nsP4 as a single, selectively cleavable polyprotein, nsP1234. The RdRp mRNA cassette is encoded by one single open translational protein, encoding the alphaviruses nsP1, nsP2 and nsP3 as one single, selectively cleavable polyprotein, nsP123. nsP4 can be individually encrypted.

바람직하게는, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 알파바이러스 서브게놈 프로모터를 포함하지 않는다.Preferably, the RdRp mRNA cassette of the present invention does not contain an alphavirus subgenomic promoter.

바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 mRNA 분자이다. mRNA 분자는 바람직하게는 CSE 1 및 CSE 4를 포함하지 않는다. 그러한 mRNA는 RdRp의 결합에 대해 레플리콘과 경쟁하지 않아, 레플리콘이 RdRp에 의해 매우 효율적으로 복제될 수 있다고 생각된다.Preferably, the RdRp mRNA cassette is an mRNA molecule. The mRNA molecule preferably does not contain CSE 1 and CSE 4. It is thought that such mRNAs do not compete with the replicon for binding of RdRp, so that the replicon can be replicated very efficiently by RdRp.

RdRp mRNA 카세트의 RNA는 바람직하게는 이중가닥이 아니며, 바람직하게는 단일가닥이고, 보다 바람직하게는 (+) 가닥 RNA이다. RdRp는 RdRp mRNA 카세트 상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다.The RNA of the RdRp mRNA cassette is preferably non-double-stranded, preferably single-stranded, and more preferably positive-stranded RNA. RdRp is encoded by an open reading frame on the RdRp mRNA cassette.

본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 인트론-없는 RNA, 바람직하게는 인트론-없는 mRNA이다. 바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 자연적으로 인트론-없는 RNA (mRNA)이다. 예를 들어, 인트론-없는 RNA (mRNA)는 시험관내에서 합성에 의해, 예를 들어 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. RdRp mRNA 카세트는 인트론을 포함하지 않는 nsP1234를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. RdRp mRNA 카세트는 인트론을 포함하지 않는 nsP123을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 토끼 베타-글로빈 유전자로부터 수득된 인트론을 포함하지 않는다 (WO2008/119827 A1에 기재된 바와 같음).The RdRp mRNA cassette of the present invention is an intron-free RNA, preferably an intron-free mRNA. Preferably, the RdRp mRNA cassette is naturally intron-free RNA (mRNA). For example, intron-free RNA (mRNA) can be obtained by synthesis in vitro, eg by in vitro transcription. The RdRp mRNA cassette contains an open reading frame encoding nsP1234 without an intron. The RdRp mRNA cassette contains an open reading frame encoding nsP123 without an intron. Preferably, the RdRp mRNA cassette does not contain an intron obtained from the rabbit beta-globin gene (as described in WO2008/119827 A1).

"인트론"은 RNA의 코딩 서열을 폴리펩티드로 번역하기 전에 제거되는, 즉 RNA로부터 스플라이싱된 전구체 mRNA (pre-mRNA)의 비-코딩 섹션으로 정의된다. 일단 인트론이 pre-mRNA로부터 스플라이싱되면, 얻어진 mRNA 서열은 폴리펩티드로 번역될 준비가 된 것이다. 즉, 인트론의 뉴클레오타이드 서열은 전형적으로 단백질로 번역되지 않는다. 인트론-없는 mRNA는 폴리펩티드로 번역하기 위한 코돈(염기 삼중항)을 연속적인 순서로 포함하는 mRNA이다. 인트론-없는 mRNA는 자연적으로 인트론이 없거나 (예를 들어 세포 내 또는 시험관내 전사에서 인트론-없는 mRNA로 처음 합성될 수 있음) 인트론-함유 pre-mRNA의 스플라이싱에 의해 인트론-없는 mRNA로 성숙될 수 있다. 자연적으로 인트론-없는 시험관내 전사된 RNA가 본 발명에서 바람직하다.An “intron” is defined as a non-coding section of a precursor mRNA (pre-mRNA) that is removed prior to translation of the coding sequence of RNA into a polypeptide, i.e., spliced from RNA. Once the intron is spliced from the pre-mRNA, the resulting mRNA sequence is ready to be translated into a polypeptide. That is, the nucleotide sequence of an intron is typically not translated into a protein. An intron-free mRNA is an mRNA that contains a contiguous sequence of codons (base triplets) for translation into a polypeptide. An intron-free mRNA either naturally lacks an intron (e.g. can be first synthesized as an intron-free mRNA in a cell or in vitro transcription) or matures into an intron-free mRNA by splicing of an intron-containing pre-mRNA. It can be. Naturally intron-free in vitro transcribed RNAs are preferred in the present invention.

본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 적어도 자가-복제가 가능하지 않는다는 점 및/또는 서브-게놈 프로모터의 제어 하에 오픈 리딩 프레임을 포함하지 않는다는 점에서 알파바이러스 게놈 RNA와 상이하다. 자가 증폭이 불가능한 경우, RdRp mRNA 카세트는 "자살 구성체(suicide construct)"라고도 불릴 수 있다.The RdRp mRNA cassette of the present invention differs from alphavirus genomic RNA at least in that it is not capable of self-replication and/or does not contain an open reading frame under the control of a sub-genomic promoter. Where self-amplification is not possible, the RdRp mRNA cassette may also be referred to as a "suicide construct".

바람직하게는, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 알파바이러스 구조 단백질과 관련이 없다. 바람직하게는 RdRp mRNA 카세트는 알파바이러스 구조 단백질에 의해 포장되지 않는다. 보다 바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 바이러스 입자 내에 포장되지 않는다. 바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 바이러스 단백질과 결합하지 않는다 (바이러스 단백질-없는 시스템). 바이러스 단백질-없는 시스템은 종래 기술, 예를 들어 헬퍼-바이러스 기반 시스템과 비교하여 이점을 제공한다.Preferably, the RdRp mRNA cassette of the present invention is not related to alphavirus structural proteins. Preferably the RdRp mRNA cassette is not packaged by alphaviral structural proteins. More preferably, the RdRp mRNA cassette is not packaged within a viral particle. Preferably, the RdRp mRNA cassette does not associate with viral proteins (viral protein-free system). Viral protein-free systems offer advantages over prior art, eg helper-virus based systems.

바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 (+) 가닥 주형에 기반한 (-) 가닥 합성 및/또는 (-) 가닥 주형에 기반한 (+) 가닥 합성에 필요한 적어도 하나의 보존서열구성 (CSE)이 부족하다. 보다 바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 어떠한 알파바이러스 보존서열구성 (CSE)도 포함하지 않는다. 특히, 알파바이러스의 4개 CSE에서, 하기 CSE 중 임의의 하나 이상이 바람직하게는 RdRp mRNA 카세트 상에 존재하지 않는다.Preferably, the RdRp mRNA cassette lacks at least one conserved sequence configuration (CSE) required for (-) strand synthesis based on a (+) strand template and/or (+) strand synthesis based on a (-) strand template. More preferably, the RdRp mRNA cassette does not contain any alphavirus conserved sequence construct (CSE). In particular, in the four CSEs of alphavirus, any one or more of the following CSEs are preferably not present on the RdRp mRNA cassette.

- 자연계에서 발견되는 알파바이러스에서 (-) 가닥 주형에 기반한 (+) 가닥 합성을 위한 프로모터로서 기능하는 것으로 여겨지는 CSE 1;- CSE 1, which is believed to function as a promoter for synthesis of the (+) strand based on the (-) strand template in alphaviruses found in nature;

- 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 (+) 가닥 게놈 RNA에 기반한 (-) 가닥 합성을 위한 프로모터로서 기능하는 것으로 여겨지는 CSE 2;- CSE 2, which is believed to function as a promoter for negative-strand synthesis based on the positive-strand genomic RNA of alphaviruses found in nature;

- 자연계에서 발견되는 알파바이러스에서 서브게놈 (+) 가닥 RNA의 효율적인 전사에 기여한다고 여겨지는 CSE 3;- CSE 3, believed to contribute to the efficient transcription of subgenomic (+) strand RNA in alphaviruses found in nature;

- 자연계에서 발견되는 알파바이러스에서 (+) 가닥 게놈 RNA에 기반한 (-) 가닥 합성의 개시를 위한 코어-프로모터로 작용한다고 여져지는 CSE 4.- CSE 4, which is believed to act as a core-promoter for the initiation of negative-strand synthesis based on positive-strand genomic RNA in alphaviruses found in nature.

CSE 1, CSE 3 및 CSE 4는 존재하지 않고 CSE 2가 존재할 수도 있거나 존재하지 않을 수도 있다.CSE 1, CSE 3 and CSE 4 do not exist and CSE 2 may or may not exist.

특히, 임의의 하나 이상의 알파바이러스 CSE가 없는 경우, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 알파바이러스 게놈 RNA와 유사한 것보다 전형적인 진핵세포 mRNA와 매우 유사하다.In particular, in the absence of any one or more of the alphavirus CSEs, the RdRp mRNA cassettes of the present invention are more similar to typical eukaryotic mRNA than to alphavirus genomic RNA.

본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 분리된 핵산 분자이다.The RdRp mRNA cassettes of the present invention are isolated nucleic acid molecules.

캡cap

알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체 (RdRp mRNA 카세트)는 5'-캡을 포함한다. The RNA construct for expressing alphavirus RdRp (RdRp mRNA cassette) contains a 5'-cap.

"5'-캡", "캡", ""5'-캡 구조", "캡 구조"는 일부 진핵세포의 1차 전사체, 예컨대 전구체 메신저 RNA의 5' 말단에서 발견되는 디뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 동의어로 사용된다. 5'-캡은 5' 트리포스페이트 결합(또는 특정 캡 유사체의 경우 변형된 트리포스페이트 결합)에서 5'을 통해 mRNA 분자의 첫 번째 뉴클레오타이드에 (임의로 변형된) 구아노신이 결합된 구조이다. 용어는 종래의 캡 또는 캡 유사체를 지칭할 수 있다. "5'-cap", "cap", ""5'-cap structure", "cap structure" refers to a dinucleotide found at the 5' end of some eukaryotic primary transcripts, such as precursor messenger RNA. A 5'-cap is a (optionally modified) guanosine bonded to the first nucleotide of an mRNA molecule via the 5' to the 5' triphosphate linkage (or modified triphosphate linkage in the case of certain cap analogs). Structure The term may refer to a conventional cap or cap analogue.

예를 들어, RNA를 5'-캡과 함께 제공하는 것은 상기 5'-캡의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥에 공동-전사적으로 혼입되거나, RNA는 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있으며, 5'-캡은 캡핑효소, 예를 들어 종두증 바이러스의 캡핑효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다. 캡핑된 RNA에서, (캡핑된) RNA 분자의 제 1 염기의 3' 위치는 인산디에스터 결합을 통해 RNA 분자의 후속 염기("제 2 염기")의 5' 위치에서 연결된다. For example, providing RNA with a 5'-cap can be achieved by in vitro transcription of a DNA template in the presence of the 5'-cap, wherein the 5'-cap co- Either transcriptionally incorporated, the RNA can be generated, for example by in vitro transcription, and the 5'-cap can be attached to the RNA after transcription using a capping enzyme, such as that of the vaccinia virus. In capped RNA, the 3' position of the first base of a (capped) RNA molecule is linked at the 5' position of the subsequent base ("second base") of the RNA molecule via a phosphodiester bond.

"종래의 5'-캡"은 자연성 발생적인 5'-캡을 의미하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡을 의미한다. 7-메틸구아노신 캡에서, 캡의 구아노신은 변형된 구아노신이며, 여기서 변형은 7-위치에서의 메틸화로 이루어진다."Conventional 5'-cap" means a naturally occurring 5'-cap, preferably a 7-methylguanosine cap. In a 7-methylguanosine cap, the guanosine of the cap is a modified guanosine, wherein the modification consists of methylation at the 7-position.

RdRp의 번역이 RdRp mRNA 카세트 상의 5'-캡에 의해 유도된다. RdRp mRNA 카세트 상의 5'-캡이 RdRp의 발현뿐만 아니라 시스템 전체의 성능에 매우 긍정적인 영향을 미친다. 트랜스로 코딩된 목적 RNA의 효율적인 생산을 달성할 수 있다. Translation of RdRp is induced by the 5'-cap on the RdRp mRNA cassette. The 5'-cap on the RdRp mRNA cassette has a very positive effect on the expression of RdRp as well as the overall performance of the system. Efficient production of trans-encoded RNA of interest can be achieved.

본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소를 포함하지 않는다. 일반적으로, 내부 리보솜 진입 부위, 약칭 IRES는 mRNA 서열의 5' 말단과 다른 위치, 예컨대 mRNA 서열의 중앙에서의 위치로부터의 메신저 RNA (mRNA)로부터의 번역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열로 mRNA 서열의 중간에 위치한다. The RdRp mRNA cassettes of the present invention do not contain internal ribosome entry site (IRES) elements. Generally, an internal ribosome entry site, abbreviated IRES, is a nucleotide sequence that allows initiation of translation from a messenger RNA (mRNA) from a position different from the 5' end of the mRNA sequence, such as a position in the middle of the mRNA sequence. located in the middle

본 발명에서 5'-캡으로 IRES의 치환은 RNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않는 RNA 분자의 특정 변형이다(비-폴리펩티드-서열 개질성 변형). 예를 들어, 진핵세포 메신저 RNA의 경우, 비-폴리펩티드-서열 개질성 변형은 특정 비번역된 영역의 선택, 인트론의 도입, 예를 들어 토끼 베타-글로빈 인트론 II 서열), 또는 코딩 서열의 침묵 변형, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드 서열의 변경 없이(침묵 변형) 대상세포 또는 대상 유기체에서 우선 코돈 사용법에 적응하는 것에 의한 것을 포함한다. Substitution of an IRES with a 5'-cap in the present invention is a specific modification of an RNA molecule that does not affect the sequence of the polypeptide encoded by the RNA molecule (non-polypeptide-sequence modifying modification). For example, in the case of eukaryotic messenger RNA, non-polypeptide-sequence modifier modifications include selection of specific untranslated regions, introduction of introns (e.g. rabbit beta-globin intron II sequences), or silent modifications of the coding sequence. , including, for example, by adapting the codon usage preferentially in the subject cell or organism of interest without altering the encoded polypeptide sequence (silent modification).

본 발명에 따른 레플리콘에 의해 코딩되는 관심 단백질의 생산은 캡이 RdRp mRNA 카세트 상에 존재할 때 효율적이다.Production of the protein of interest encoded by the replicon according to the present invention is efficient when the cap is present on the RdRp mRNA cassette.

진핵세포 mRNA에서 5'-캡의 존재는 그 중에서도 특히 mRNA의 핵내 방출 조절과 가공, 특히 5′ 근위부 인트론 절제의 촉진에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 전형적으로 핵으로부터 배출되거나 가공될 필요가 없다. 그럼에도 불구하고, RdRp mRNA 카세트 상에 5'-캡이 존재하는 것이 유리하다.The presence of the 5'-cap in eukaryotic mRNAs is believed to play an important role, among other things, in regulating the release and processing of mRNAs in the nucleus, particularly in facilitating 5' proximal intron excision. The RdRp mRNA cassettes of the invention typically do not need to be exported from the nucleus or processed. Nevertheless, the presence of a 5'-cap on the RdRp mRNA cassette is advantageous.

진핵세포 mRNA의 경우, 5'-캡은 또한 일반적으로 mRNA의 효율적인 번역에 관여한다고 일반적으로 기술되어 있다: 일반적으로 진핵세포에서 번역은 IRES가 없는 한 메신저 RNA (mRNA) 분자의 5' 말단에서만 개시된다. In the case of eukaryotic mRNAs, the 5'-cap is also commonly described as being involved in the efficient translation of mRNAs: generally, translation in eukaryotic cells is initiated only at the 5' end of a messenger RNA (mRNA) molecule unless an IRES is present. do.

진핵세포는 핵 내 전사 중에 5'-캡을 갖는 RNA를 제공할 수 있다. 새로 합성된 mRNA는 통상적으로 전사체가 20 내지 30개의 뉴클레오타이드의 길이에 도달할 때 5'-캡 구조로 변형된다. 먼저, 5'-말단 뉴클레오타이드 pppN(ppp는 트리포스페이트를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오사이드를 나타냄)은 RNA 5'-트리포스파타아제 및 구아닐릴 전이효소 활성을 갖는 캡핑효소에 의해 세포에서 5' GpppN으로 전환된다. 이어서, GpppN은 (구아닌-7)-메틸 전이효소 활성을 갖는 제 2 효소에 의해 세포에서 메틸화되어 모노-메틸화된 m7GpppN 캡을 형성할 수 있다.Eukaryotic cells can present RNA with a 5'-cap during transcription in the nucleus. Newly synthesized mRNA is usually modified into a 5'-cap structure when the transcript reaches a length of 20 to 30 nucleotides. First, the 5'-terminal nucleotide pppN (ppp represents triphosphate and N represents any nucleoside) is synthesized in cells by RNA 5'-triphosphatase and capping enzyme having guanylyl transferase activity. converted to 5' GpppN. GpppN can then be methylated in the cell by a second enzyme with (guanine-7)-methyltransferase activity to form a mono-methylated m7GpppN cap.

본 발명에서 사용된 5'-캡은 자연성 5'-캡이다.The 5'-cap used in the present invention is a natural 5'-cap.

본 발명에서, 자연성 5'-캡 디뉴클레오타이드는 전형적으로 비-메틸화 캡 디뉴클레오타이드 (G(5')ppp(5')N; GpppN이라고도 함) 및 메틸화된 캡 디뉴클레오타이드 ((m7G(5')ppp(5')N; m7GpppN이라고도 함)로 이루어진 군으로부터 선택된다. In the present invention, the natural 5'-cap dinucleotide typically comprises a non-methylated cap dinucleotide (G(5')ppp(5')N; also referred to as GpppN) and a methylated cap dinucleotide ((m7G(5') ppp(5')N; also referred to as m7GpppN).

본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 대상세포 내로 형질주입되는 경우, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 전형적으로 세포 핵, 즉 전형적인 진핵세포에서 캡핑이 일어나는 부위에 국한되지 않는 것으로 여겨진다.The RdRp mRNA cassette of the present invention does not depend on the capping device of the target cell. When transfected into a target cell, the RdRp mRNA cassette of the present invention is typically considered not to be restricted to the cell nucleus, ie the site where capping occurs in typical eukaryotic cells.

종래 기술 구성체에서 IRES와 유사하게, RdRp mRNA 카세트 상의 5'-캡은 RdRp의 번역 개시를 유발하는데 유용하다. 진핵세포 번역 개시 인자 elF4E는 캡핑된 mRNA를 리보솜과 결합시키는 데 관여하는 것으로 생각될 수 있다. 5'-캡의 존재가 성능을 상당히 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 5'-캡을 포함한다.Similar to the IRES in prior art constructs, the 5'-cap on the RdRp mRNA cassette is useful for triggering translational initiation of RdRp. The eukaryotic translation initiation factor elF4E can be thought to be involved in the association of capped mRNA with ribosomes. The presence of the 5'-cap significantly increases performance. Thus, the RdRp mRNA cassette of the present invention includes a 5'-cap.

5'-캡의 존재는 또한 본 발명의 트랜스-복제 시스템에서 예기치 않은 상승적인 효과를 제공한다. 캡핑된 RdRp mRNA 카세트가 레플리콘 RNA에 대해 트랜스로 제공될 때 캡핑된 RdRp mRNA 카세트가 관심 단백질의 생산을 유발하는 것이 보다 효율적이다. 따라서, 트랜스로 5'-캡 및 복제의 상승 효과, 즉 시스로 복제하는 것보다 우수한 효과가 있다.The presence of the 5'-cap also provides an unexpected synergistic effect in the trans-replication system of the present invention. It is more efficient for the capped RdRp mRNA cassette to trigger production of the protein of interest when the capped RdRp mRNA cassette is provided in trans for the replicon RNA. Therefore, the synergistic effect of 5'-cap and replication in trans, that is, there is an effect superior to that of replication in cis.

본 발명의 캡핑된 RNA는 시험관내에서 제조될 수 있으므로 대상세포의 캡핑 장치에 의존하지 않는다. 시험관내에서 캡핑된 RNA를 형성하는데 가장 빈번하게 사용되는 방법은 모든 4개의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 캡 디뉴클레오타이드 예컨대 m7G(5')ppp(5')G (m7GpppG라고도 함)의 존재 하에 박테리아 또는 박테리오파지 RNA 중합효소로 DNA 주형을 전사하는 것이다. The capped RNA of the present invention can be produced in vitro and therefore does not depend on the capping device of the target cell. The method most frequently used to form capped RNA in vitro is the use of all four ribonucleoside triphosphates and cap dinucleotides such as m7G(5')ppp(5')G (also called m7GpppG) in bacteria in the presence of or to transcribe the DNA template with bacteriophage RNA polymerase.

RNA 중합효소는 다음 주형 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (pppN)의 α-포스페이트에서 m7GpppG의 구아노신 부분의 3'-OH에 의한 친핵성 공격으로 전사를 개시하여 중간체 m7GpppGpN (여기서 N은 RNA 분자의 제 2염기이다)를 형성한다. 경쟁하는 GTP-개시된 생성물 pppGpN의 형성은 시험관내 전사 동안 캡 대 GTP의 몰비가 5 내지 10으로 설정함으로써 억제된다.RNA polymerase initiates transcription by nucleophilic attack by the 3'-OH of the guanosine moiety of m7GpppG on the α-phosphate of the next template nucleoside triphosphate (pppN), resulting in the intermediate m7GpppGpN (where N is the second molecule of the RNA molecule). base) is formed. Formation of the competing GTP-initiated product pppGpN is inhibited by setting the molar ratio of cap to GTP between 5 and 10 during in vitro transcription.

5'-캡은 5'-캡 유사체이다. 이들 실시형태는 RNA가 시험관내 전사에 의해 수득되는 경우, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)인 경우에 특히 적합하다. 캡 유사체는 초기에 시험관내 전사에 의해 RNA 전사체의 대규모 합성을 용이하게 하기 위해 기술하였다.A 5'-cap is a 5'-cap analog. These embodiments are particularly suitable when the RNA is obtained by in vitro transcription, eg in vitro transcribed RNA (IVT-RNA). Cap analogs were initially described to facilitate large-scale synthesis of RNA transcripts by in vitro transcription.

이전에 기재된 조작된 알파바이러스 복제 시스템과 대조적으로, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 바람직하게는 캡 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 시스템의 RdRp의 번역은 바람직하게는 캡 유사체에 의해 유도된다. In contrast to previously described engineered alphavirus replication systems, the RdRp mRNA cassette of the present invention preferably includes a cap analog. Thus, translation of RdRp in the system of the present invention is preferably driven by a cap analog.

이상적으로, 보다 높은 번역 효율 및/또는 생체내 분해에 대한 증가된 내성 및/또는 시험관내 분해에 대한 증가된 내성과 관련된 캡 유사체가 선택된다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 임의의 변형된 뉴클레오타이드를 함유하지 않고 천연 캡 (m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG라고도함, 시판된 ScriptCap m7G 캡핑 시스템 (Epicentre Biotechnologies사)에 의해 선택적으로 첨가된다)을 포함하는 알파바이러스 발현 구성체를 기재하고 있는 종래 기술과 현저히 다른 접근법을 제공한다.Ideally, cap analogues associated with higher translational efficiency and/or increased resistance to degradation in vivo and/or increased resistance to degradation in vitro are selected. Therefore, the present invention preferably contains no modified nucleotides and the natural cap (m7G(5′)ppp(5′)G; also referred to as m7GpppG, is selected by the commercially available ScriptCap m7G capping system (Epicentre Biotechnologies)). It provides a markedly different approach from the prior art describing alphavirus expression constructs including).

UTRUTR

"비번역 영역" 또는 "UTR"은 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 영역에 관한 것이거나 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자 내의 상응하는 영역에 관한 것이다. An “untranslated region” or “UTR” refers to a region that is transcribed but not translated into an amino acid sequence or to the corresponding region within an RNA molecule such as an mRNA molecule.

3'-UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 유전자의 3'-말단에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리(A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 폴리(A) 꼬리의 상류, 예를 들어 폴리(A) 꼬리에 직접 인접하여 있다(존재한다면).The 3'-UTR, if present, is located at the 3'-end of the gene, downstream of the stop codon of the protein coding region, but the term "3'-UTR" preferably does not include a poly(A) tail. Thus, the 3'-UTR is upstream of the poly(A) tail, eg directly adjacent to the poly(A) tail (if present).

5'-UTR은 존재하는 경우 단백질 코딩 영역의 시작코돈의 상류에 유전자의 5' 말단에 위치한다. 5'-UTR은 5'-캡의 하류, 예를 들어 5'-캡 바로 옆에 있다(존재한다면).The 5'-UTR, if present, is located at the 5' end of the gene, upstream of the start codon of the protein coding region. The 5'-UTR is downstream of the 5'-cap, eg immediately adjacent to the 5'-cap (if present).

5'- 및/또는 3'-UTR은 오픈 리딩 프레임과 기능적으로 연결될 수 있어서, 이들 영역이 오픈 리딩 프레임과 관련되어 안정성 및/또는 상기 오픈 리딩 프레임을 포함하는 RNA의 번역 효율이 증가된다.The 5'- and/or 3'-UTRs can be functionally linked to the open reading frame, such that these regions are associated with the open reading frame to increase stability and/or translational efficiency of the RNA comprising the open reading frame.

UTR은 RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 5'(상류)(5'-UTR) 및/또는 RdRp를 코딩하는오픈 리딩 프레임의 3'(하류)(3'-UTR)에 존재할 수 있다.The UTR may be present 5' (upstream) (5'-UTR) of the open reading frame encoding RdRp and/or 3' (downstream) (3'-UTR) of the open reading frame encoding RdRp.

알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체 (RdRp mRNA 카세트)는:The RNA construct (RdRp mRNA cassette) for expressing alphavirus RdRp is:

(1) 5' UTR 또는 5' CSE,(1) 5' UTR or 5' CSE;

(3) 3' UTR 또는 3' CSE를 포함한다.(3) 3' UTR or 3' CSE.

구체적으로, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트에서, 용어 "3'-UTR"은 RdRp에 대한 코딩영역의 3'에 위치하는 영역에 관한 것이고, 용어 "5'-UTR" 이는 RdRp에 대한 코딩영역의 5'에 위치하는 영역에 관한 것이다.Specifically, in the RdRp mRNA cassette of the present invention, the term "3'-UTR" refers to a region located 3' of the coding region for RdRp, and the term "5'-UTR" refers to a region located 5' of the coding region for RdRp. It is about the area located in '.

UTR은 RNA 기반 게놈 편집 도구의 운반을 이용한 효과적인 게놈 편집의 전제 조건인 RNA의 안정성 및 번역 효율에 관여한다. 특정 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 선택함으로써, 본원에 기재된 바와 같은 5'-캡 및/또는 3' 폴리(A)-꼬리에 관한 구조적 변형 이외에, 둘 모두 개선될 수 있다. UTRs are involved in RNA stability and translation efficiency, which are prerequisites for effective genome editing using the delivery of RNA-based genome editing tools. By selecting specific 5' and/or 3' untranslated regions (UTRs), both can be improved, in addition to structural modifications regarding the 5'-cap and/or 3' poly(A)-tail as described herein. .

UTR 내의 서열 요소는 일반적으로 번역 효율 (주로 5'-UTR) 및 RNA 안정성 (주로 3'-UTR)에 영향을 미치는 것으로 이해된다. 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'-UTR이 존재하는 것이 바람직하다. 독립적으로 또는 부가적으로, 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 3'-UTR이 존재하는 것이 바람직하다.Sequence elements within the UTR are generally understood to affect translation efficiency (mainly 5′-UTR) and RNA stability (mainly 3′-UTR). It is preferred that an activated 5'-UTR is present to increase translational efficiency and/or stability of the nucleic acid sequence. Independently or additionally, it is preferred that an activated 3'-UTR is present to increase translational efficiency and/or stability of the nucleic acid sequence.

바람직하게는, RdRp mRNA 카세트는 RdRp가 유래된 알파바이러스에 대해 이종 또는 고유하지 않은 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 이것은 원하는 번역 효율 및 RNA 안정성에 따라 비번역 영역을 설계할 수 있게 한다.Preferably, the RdRp mRNA cassette comprises a 5'-UTR and/or a 3'-UTR that is heterologous or non-unique to the alphavirus from which the RdRp is derived. This allows designing untranslated regions according to the desired translational efficiency and RNA stability.

따라서, 이종 또는 고유하지 않은 UTR은 고도의 유연성을 허용하며, 이러한 유연성은 자연성 알파바이러스 UTR에 비해 유리하다. 특히, 알파바이러스(자연성) RNA는 또한 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함하는 것으로 알려져 있지만, 알파바이러스 UTR은 이중 기능, 즉 (ⅰ) RNA 복제를 추진할 뿐만 아니라 (ⅱ) 번역을 추진한다. 알파바이러스 UTR은 번역에 비효율적이라고 보고되어 있지만, 이들은 이들의 이중 기능 때문에 보다 효율적인 UTR로 대체할 수 없다. Thus, heterologous or non-unique UTRs allow for a high degree of flexibility, which is advantageous compared to native alphaviral UTRs. In particular, alphaviral (natural) RNAs are also known to contain 5'-UTRs and/or 3'-UTRs, but alphaviral UTRs have a dual function: (i) drive RNA replication as well as (ii) translate Proceed. Alphaviral UTRs have been reported to be inefficient for translation, but they cannot be replaced with more efficient UTRs because of their dual function.

본 발명에서는 RdRp mRNA 카세트의 5'-UTR 및/또는 3'-UTR은 RNA 복제에 대한 잠재적 영향과 무관하게 선택될 수 있다.In the present invention, the 5'-UTR and/or 3'-UTR of the RdRp mRNA cassette can be selected regardless of their potential effect on RNA replication.

바람직하게는, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 바이러스 기원이 아니며; 특히 알파바이러스 기원이 아닌 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 일 실시형태에서, RdRp mRNA 카세트는 진핵세포 5'-UTR 유래의 5'-UTR 및/또는 진핵세포 3'UTR 유래의 3'UTR로부터 유래된 5'-UTR을 포함한다.Preferably, the RdRp mRNA cassette of the present invention is not of viral origin; In particular, it includes a 5'-UTR and/or a 3'-UTR that is not of alphavirus origin. In one embodiment, the RdRp mRNA cassette comprises a 5'-UTR derived from a 5'-UTR derived from a eukaryotic 5'-UTR and/or a 5'-UTR derived from a 3'UTR derived from a eukaryotic 3'UTR.

본 발명의 5'-UTR은 선택적으로 링커에 의해 분리된 둘 이상의 핵산 서열의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 3'-UTR은 선택적으로 링커에 의해 분리된 둘 이상의 핵산 서열의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.A 5'-UTR of the invention may comprise any combination of two or more nucleic acid sequences, optionally separated by a linker. A 3'-UTR of the invention may comprise any combination of two or more nucleic acid sequences, optionally separated by a linker.

용어 "링커"는 2개의 핵산 서열을 연결하기 위해 상기 2개의 핵산 서열 사이에 첨가된 핵산 서열에 관한 것이다. 링커 서열에 관한 특별한 제한은 없다.The term “linker” relates to a nucleic acid sequence added between two nucleic acid sequences to link the two nucleic acid sequences. There are no particular restrictions on the linker sequence.

본 발명의 3'-UTR은 전형적으로 길이가 200 내지 2000개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 500 내지 1500개의 뉴클레오타이드이다. 면역글로불린 mRNA의 3'-비번역 영역은 비교적 짧은 반면(약 300개 미만의 뉴클레오타이드), 다른 유전자의 3'-비번역 영역은 상대적으로 길다. A 3'-UTR of the present invention is typically 200 to 2000 nucleotides in length, for example 500 to 1500 nucleotides in length. The 3'-untranslated regions of immunoglobulin mRNAs are relatively short (less than about 300 nucleotides), whereas the 3'-untranslated regions of other genes are relatively long.

예를 들어, tPA의 3'-비번역 영역은 길이가 약 800개의 뉴클레오타이드이고, 인자 VIII의 길이는 약 1800개의 뉴클레오타이드이고, 에리스로포이에틴의 길이는 약 560개의 뉴클레오타이드이다. 포유류 mRNA의 3'-비번역 영역은 전형적으로 AAUAAA 헥사뉴클레오타이드 서열로서 공지된 상동성 영역을 갖는다. 이 서열은 아마도 폴리(A) 부착 신호이며, 종종 폴리(A) 부착 부위의 상류에 10 내지 30개의 염기에 위치한다.For example, the 3'-untranslated region of tPA is about 800 nucleotides in length, factor VIII is about 1800 nucleotides in length, and erythropoietin is about 560 nucleotides in length. The 3'-untranslated region of mammalian mRNA typically has a region of homology known as the AAUAAA hexanucleotide sequence. This sequence is probably a poly(A) attachment signal and is often located 10 to 30 bases upstream of the poly(A) attachment site.

본 발명의 3'-비번역 영역은 엑소리보뉴클레아제의 장벽으로 작용하거나 RNA 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 단백질(예컨대 RNA-결합 단백질)과 상호작용하는 스템-루프 구조를 제공하기 위해 폴딩할 수 있는 하나 이상의 역반복을 포함할 수 있다.The 3'-untranslated region of the present invention can be folded to provide a stem-loop structure that acts as a barrier to exoribonucleases or interacts with proteins known to increase RNA stability (e.g., RNA-binding proteins). may contain one or more reverse repetitions.

인간 베타-글로빈 3'-UTR, 특히 인간 베타-글로빈 3'UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본은 높은 전사 안정성 및 번역 효율에 기여한다. Two consecutive identical copies of the human beta-globin 3'-UTR, in particular the human beta-globin 3'UTR, contribute to high transcriptional stability and translational efficiency.

따라서, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본을 포함한다. 따라서, 그것은 5'→3' 방향으로 (a) 선택적으로 5'-UTR; (b) RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임; (c) 3'-UTR; 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 2개의 연속적인 동일한 사본, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'UTR의 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 상기 3'-UTR을 포함한다.Thus, the RdRp mRNA cassette of the present invention contains two consecutive identical copies of the human beta-globin 3'-UTR. Thus, it is (a) optionally 5'-UTR in the 5'→3' direction; (b) an open reading frame encoding RdRp; (c) 3'-UTR; includes two contiguous identical copies of the human beta-globin 3'-UTR, a fragment thereof, or a variant of the human beta-globin 3'UTR or a fragment thereof.

본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 구성체의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화하지만 인간 베타-글로빈 3'-UTR, 이의 단편, 또는 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 변이체 또는 이의 단편이 아닌, 3'-UTR을 포함한다.The RdRp mRNA cassette of the present invention activates to increase the translational efficiency and/or stability of the construct, but is not a human beta-globin 3'-UTR, a fragment thereof, or a variant of human beta-globin 3'-UTR or a fragment thereof, 3'-UTR.

본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 구성체의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성화한 5'-UTR을 포함한다.The RdRp mRNA cassette of the present invention contains an activated 5'-UTR to increase the translational efficiency and/or stability of the construct.

본 발명에 따른 UTR-함유 RNA는 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있다. 이들은 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 갖는 RNA의 전사를 허용하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자(예컨대 DNA)의 발현을 유전적으로 변형시킴으로써 달성될 수 있다.UTR-containing RNAs according to the present invention can be prepared, for example, by in vitro transcription. These can be achieved by genetically modifying the expression of a nucleic acid molecule (eg DNA) of the invention in a manner that permits transcription of RNA having a 5'-UTR and/or a 3'-UTR.

폴리(A) 서열poly(A) sequence

알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 mRNA 구조체 (RdRp mRNA 카세트)는 3' 폴리(A) 서열을 포함한다.The mRNA construct for expressing alphavirus RdRp (RdRp mRNA cassette) contains a 3' poly(A) sequence.

알파바이러스에서, 적어도 11개의 연속 아데닐레이트 잔기, 또는 적어도 25개의 연속 아데닐레이트 잔기의 3' 폴리(A) 서열은 마이너스 가닥의 효율적인 합성에 중요하다고 생각된다. 특히, 알파바이러스에서, 적어도 25개의 연속 아데닐레이트 잔기의 3' 폴리(A) 서열은 보존서열구성 4 (CSE 4)와 함께 작용하여 (-) 가닥의 합성을 촉진하는 것으로 이해된다. In alphaviruses, a 3' poly(A) sequence of at least 11 contiguous adenylate residues, or at least 25 contiguous adenylate residues, is thought to be important for efficient synthesis of the minus strand. In particular, in alphaviruses, a 3' poly(A) sequence of at least 25 contiguous adenylate residues is understood to act in conjunction with conserved sequence configuration 4 (CSE 4) to promote synthesis of the negative strand.

그러나, 본 발명에서, RdRp mRNA 카세트의 (-) 가닥 합성은 전형적으로 바람직하지 않고, 폴리(A) 서열은 주로 형질주입된 진핵세포에서 RNA 안정성 및 단백질 번역에 영향을 주는 기능을 한다. 사실, 약 120개의 A 뉴클레오타이드의 3' 폴리(A) 서열은 형질주입된 진핵세포의 RNA 수준뿐만 아니라 3' 폴리(A) 서열의 상류(5')에 존재하는 오픈 리딩 프레임으로부터 번역된 단백질의 수준에 유익한 영향을 미친다. However, in the present invention, negative strand synthesis of the RdRp mRNA cassette is typically not preferred, and the poly(A) sequence primarily functions to affect RNA stability and protein translation in transfected eukaryotic cells. In fact, a 3' poly(A) sequence of approximately 120 A nucleotides is present at the RNA level in transfected eukaryotic cells as well as in the translation of proteins from the open reading frame present upstream (5') of the 3' poly(A) sequence. It has a beneficial effect on the level.

폴리(A) 서열은 본질적으로 적어도 20, 바람직하게는 적어도 26, 바람직하게는 적어도 40, 바람직하게는 적어도 80, 바람직하게는 적어도 100개이고, 바람직하게는 500개 이하, 바람직하게는 400개 이하, 바람직하게는 300개 이하, 바람직하게는 200개 이하, 특히 150개 이하의 A 뉴클레오타이드이고, 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드로 구성되거나 포함한다. The poly(A) sequence is essentially at least 20, preferably at least 26, preferably at least 40, preferably at least 80, preferably at least 100, preferably no more than 500, preferably no more than 400; preferably no more than 300, preferably no more than 200, in particular no more than 150 A nucleotides, and in particular consist of or comprise about 120 A nucleotides.

본원에서 "본질적으로 구성된다"는 "폴리(A) 서열"에서 뉴클레오타이드 수에 따라 전형적으로 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%의 폴리(A) 서열에서의 대부분의 뉴클레오타이드가 A 뉴클레오타이드이지만, 나머지 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드, 예컨대 U 뉴클레오타이드 (유리딜레이트), G 뉴클레오타이드 (구아닐레이트), C 뉴클레오타이드 (시티딜레이트)인 것을 허용한다. 이 문맥에서 "로 구성된다"는 폴리(A) 서열에서의 모든 뉴클레오타이드, 즉 폴리(A) 서열에서의 뉴클레오타이드의 수에 따라 100%가 A 뉴클레오타이드인 것을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오타이드" 또는 "A"는 아데닐레이트를 지칭한다.As used herein, "consisting essentially of" means that, depending on the number of nucleotides in the "poly(A) sequence", typically at least 50%, preferably at least 75% of the nucleotides in the poly(A) sequence are A nucleotides, but the remainder are A nucleotides. Nucleotides are allowed to be nucleotides other than A nucleotides, such as U nucleotides (uridylates), G nucleotides (guanylates), C nucleotides (cytidylates). “Consisting of” in this context means that all nucleotides in the poly(A) sequence are 100% A nucleotides according to the number of nucleotides in the poly(A) sequence. The term "A nucleotide" or "A" refers to adenylate.

본 발명은 코딩 가닥에 상보적인 가닥에서 반복된 dT 뉴클레오타이드 (데옥시티미딜레이트)를 포함하는 DNA 주형에 기반하여, RNA 전사 동안, 즉 시험관내 전사된 RNA의 제조 중에 부착되는 3' 폴리(A) 서열을 제공한다. 폴리(A) 서열을 코딩하는 DNA 서열(코딩 가닥)은 폴리(A) 카세트로 지칭된다.The present invention is based on a DNA template comprising dT nucleotides (deoxythymidylate) repeated in the strand complementary to the coding strand, to which 3' poly(A ) gives the sequence. A DNA sequence (coding strand) encoding a poly(A) sequence is referred to as a poly(A) cassette.

DNA의 코딩 가닥에 존재하는 3' 폴리(A) 카세트는 본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 30개, 보다 바람직하게는 10 내지 20개일 수 있다. The 3' poly(A) cassette present in the coding strand of DNA consists essentially of dA nucleotides, but is interrupted by a random sequence with an even distribution of four nucleotides (dA, dC, dG, dT). These random sequences may be 5 to 50, preferably 10 to 30, more preferably 10 to 20 in length.

본질적으로 dA 뉴클레오타이드로 이루어지지만, 4개의 뉴클레오타이드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 갖고 길이가 예를 들어 예를 들어 5 내지 50개의 뉴클레오타이드인 무작위 서열에 의해 중단되는 폴리(A) 카세트는 DNA 수준에서 E.coli에서의 플라스미드 DNA의 일정한 증식을 나타내며, RNA 수준에서 RNA 안정성 및 번역 효율을 지지하는 것과 관련하여 유익한 특성과 여전히 연관되어 있다.poly(A) consisting essentially of dA nucleotides, but interrupted by random sequences having an equal distribution of 4 nucleotides (dA, dC, dG, dT) and being eg 5 to 50 nucleotides in length; The cassette exhibits constant propagation of plasmid DNA in E. coli at the DNA level and is still associated with beneficial properties with respect to supporting RNA stability and translation efficiency at the RNA level.

결과적으로, 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 본원에 기술된 RNA 분자에 함유된 3' 폴리(A) 서열은 본질적으로 A 뉴클레오타이드로 구성되지만, 4개의 뉴클레오타이드(A, C, G, U)가 균등한 분포를 갖는 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 길이가 5 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 30개, 보다 바람직하게는 10 내지 20개일 수 있다.Consequently, in one preferred embodiment of the present invention, the 3' poly(A) sequences contained in the RNA molecules described herein consist essentially of A nucleotides, but contain four nucleotides (A, C, G, U). Interrupted by random sequences with an even distribution. These random sequences may be 5 to 50, preferably 10 to 30, more preferably 10 to 20 in length.

코돈 사용법codon usage

일반적으로 유전 암호의 축퇴는 동일한 암호화 능력을 유지하면서 다른 코돈 (염기 삼중항)에 의해 RNA 서열에 존재하는 특정 코돈(아미노산을 코딩하는 염기 삼중항)을 대체할 수 있게 한다(코돈을 대체하는 것은 대체된 코돈과 동일한 아미노산을 암호화한다). In general, degeneracy of the genetic code allows for the replacement of certain codons (base triplets encoding amino acids) present in RNA sequences by other codons (base triplets) while retaining the same coding ability (replacing a codon is encodes the same amino acid as the replaced codon).

본 발명에서, RNA 분자에 포함된 오픈 리딩 프레임의 적어도 하나의 코돈은 오픈 리딩 프레임이 유래한 종에서 각각의 오픈 리딩 프레임의 각각의 코돈과 상이하다. 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열은 "개조된" 것으로 언급된다.In the present invention, at least one codon of an open reading frame included in an RNA molecule is different from each codon of each open reading frame in the species from which the open reading frame is derived. The coding sequence of an open reading frame is referred to as "adapted".

예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, 빈번하게 사용되는 코돈이 선택될 수 있다. WO2009/024567 A1은 더욱 빈번하게 사용되는 희귀 코돈의 치환을 포함하여, 핵산 분자의 코딩 서열의 변형을 기술한다. For example, when the coding sequence of an open reading frame is modified, frequently used codons can be selected. WO2009/024567 A1 describes modifications of the coding sequence of nucleic acid molecules, including substitution of more frequently used rare codons.

코돈 사용의 빈도는 대상세포 또는 대상 유기체에 따라 다르기 때문에, 그러한 유형의 변형은 특정 대상세포 또는 대상 유기체에서의 발현에 핵산 서열을 맞추는 것이 적합하다. 일반적으로 말하면, 보다 빈번하게 사용되는 코돈은 전형적으로 대상세포 또는 대상 유기체에서 보다 효율적으로 번역되지만, 오픈 리딩 프레임의 모든 코돈의 변형이 항상 필요한 것은 아니다.Because the frequency of codon usage varies depending on the cell or organism of interest, such types of modifications are appropriate to tailor the nucleic acid sequence for expression in a particular cell or organism of interest. Generally speaking, codons that are used more frequently are typically translated more efficiently in a target cell or organism, but modification of all codons in an open reading frame is not always necessary.

예를 들어, 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열이 변형되는 경우, G (구아닐레이트) 잔기 및 C (시티딜레이트) 잔기의 함량은 각 아미노산에 대해 가장 풍부한 GC-함량을 갖는 코돈을 선택함으로써 변경될 수 있다. GC가 풍부한 오픈 리딩 프레임을 가진 RNA 분자는 면역 활성을 감소시키고 RNA의 번역 및 반감기를 향상시킬 가능성이 있다고 보고되어 있다.For example, when the coding sequence of the open reading frame is modified, the content of G (guanylate) residues and C (cytidylate) residues can be altered by selecting the codon with the most abundant GC-content for each amino acid. can It has been reported that RNA molecules with GC-rich open reading frames have the potential to reduce immune activity and improve translation and half-life of RNA.

본 발명에 따른 RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 각각 개조될 수 있다.Each open reading frame encoding RdRp according to the present invention can be adapted.

2. 레플리콘 카세트2. Replicon Cassette

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 레플리콘을 포함한다. RdRp, 바람직하게는 알파바이러스 RdRp에 의해 복제될 수 있는 핵산 구성체는 레플리콘으로 불린다. 전형적으로, 본 발명에 따른 레플리콘은 RNA 분자이다.The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention includes a replicon. Nucleic acid constructs capable of being replicated by RdRp, preferably alphavirus RdRp, are called replicons. Typically, a replicon according to the present invention is an RNA molecule.

"레플리콘"은 RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 복제될 수 있는 RNA 분자를 정의하며, DNA 중간체 없이 하나 또는 다수의 동일하거나 본질적으로 동일한 RNA 레플리콘의 복사본을 생성한다. "DNA 중간체 없다"는 것은 RNA 레플리콘의 레플리콘을 형성하는 과정에서 레플리콘의 데옥시리보핵산(DNA) 복사본 또는 레플리콘의 상보체가 RNA 레플리콘의 복사본을 형성하는 과정에서 형성되지 않고, 및/또는 데옥시리보핵산(DNA) 분자가 RNA 레플리콘, 또는 이의 상보체의 복사본을 형성하는 과정에서 주형으로 사용되지 않는 것을 의미한다.A “replicon” defines an RNA molecule capable of being replicated by an RNA-dependent RNA polymerase, producing one or multiple copies of the same or essentially identical RNA replicon without DNA intermediates. "No DNA intermediate" means that in the process of forming a replicon of an RNA replicon, a copy of deoxyribonucleic acid (DNA) of the replicon or the complement of the replicon forms a copy of the RNA replicon. is not formed, and/or the deoxyribonucleic acid (DNA) molecule is not used as a template in the process of forming a copy of the RNA replicon, or its complement.

"복제될 수 있다"는 일반적으로 핵산의 하나 이상의 동일하거나 본질적으로 동일한 복사본이 제조될 수 있음을 설명한다. "RdRp에 의해 복제될 수 있다"에서 용어 "RdRp"와 함께 사용하는 경우, 용어 "복제될 수 있다"는 RdRp에 대한 레플리콘의 기능적 특성을 설명하는 것이다. “Can be duplicated” generally describes that one or more identical or essentially identical copies of a nucleic acid can be made. When used with the term "RdRp" in "capable of being replicated by RdRp", the term "capable of being replicated" describes the functional property of the replicon for RdRp.

이러한 기능적 특성은 (i) RdRp가 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) RdRp가 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRP)로서 작용할 수 있는 것 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게는, RdRp는 (i) 레플리콘을 인식할 수 있고 (ii) RNA 의존성 RNA 중합효소로서 작용할 수 있다. RNA 의존성 RNA 중합효소는 주형으로서 레플리콘, 이의 상보체 또는 그의 일부를 사용할 수 있다.These functional properties include at least one of (i) RdRp can recognize a replicon and (ii) RdRp can act as an RNA dependent RNA polymerase (RdRP). Preferably, the RdRp is capable of (i) recognizing a replicon and (ii) acting as an RNA dependent RNA polymerase. An RNA-dependent RNA polymerase can use a replicon, its complement, or a portion thereof as a template.

"인식할 수 있는"이라는 표현은 RdRp가 레플리콘과 물리적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 RdRp가 전형적으로 비공유 결합으로 레플리콘에 결합할 수 있는 것을 설명한다. "결합"이라는 용어는 RdRp가 임의의 하나 이상의 보존서열구성 1 (CSE 1) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 2 (CSE 2) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 3 (CSE 3) 또는 이의 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우), 보존서열구성 4 (CSE 4) 또는 상보 서열(레플리콘에 포함되는 경우)에 대해 결합 능력이 있음을 의미할 수 있다. 바람직하게는, RdRp는 CSE 2 [즉, (+) 가닥에] 및/또는 CSE 4 [즉, (+) 가닥에]에 결합할 수 있거나, CSE 1의 상보체 [즉, (-) 가닥에] 및/또는 CSE 3의 상보체 [즉, (-) 가닥에]에 결합할 수 있다.The expression "recognizable" describes that RdRp is capable of physically binding to a replicon, and preferably RdRp is capable of binding to a replicon, typically in a non-covalent bond. The term “binding” means that an RdRp is any one or more of conserved sequence 1 (CSE 1) or its complementary sequence (if included in a replicon), conserved sequence 2 (CSE 2) or its complementary sequence (replicon). ), conserved sequence configuration 3 (CSE 3) or its complementary sequence (if included in a replicon), conserved sequence configuration 4 (CSE 4) or its complementary sequence (if included in a replicon) It can mean that there is a binding ability. Preferably, the RdRp is capable of binding to CSE 2 [i.e., on the (+) strand] and/or CSE 4 [i.e., on the (+) strand], or the complement of CSE 1 [i.e., on the (-) strand]. ] and/or the complement of CSE 3 [ie, on the (-) strand].

"RdRP로서 작용할 수 있다"는 표현은 RdRp가 알파바이러스 게놈 (+) 가닥 RNA의 (-) 가닥 상보체의 합성을 촉매할 수 있다는 의미를 포함하고, 여기서 (+) 가닥 RNA는 주형 기능을 가지며, 및/또는 RdRp가 (+) 가닥 알파바이러스 게놈 RNA의 합성을 촉매할 수 잇음을 의미하고, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 갖는다. 일반적으로, "RdRP로서 작용할 수 있는"이라는 표현은 또한 RdRp가 (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성을 촉매할 수 잇음을 의미하고, 여기서 (-) 가닥 RNA는 주형 기능을 가지며, (+) 가닥 서브게놈 전사체의 합성은 전형적으로 알파바이러스 서브게놈 프로모터에서 개시된다.The expression “capable of acting as RdRP” includes the meaning that RdRp is capable of catalyzing the synthesis of the (−) strand complement of alphaviral genomic (+) strand RNA, wherein the (+) strand RNA has a template function and , and/or RdRp can catalyze the synthesis of (+) strand alphavirus genomic RNA, wherein the (-) strand RNA has a template function. In general, the expression "capable of acting as RdRP" also means that the RdRp is capable of catalyzing the synthesis of a positive-strand subgenomic transcript, wherein the negative-strand RNA has a template function and the (+)-strand RNA has a template function. Synthesis of a strand subgenomic transcript is typically initiated at an alphavirus subgenomic promoter.

"결합할 수 있는" 및 "RdRP로 작용할 수 있는"이라는 표현은 정상적인 생리 조건에서의 능력을 지칭한다. 특히, 상기 표현은 알파바이러스 RdRp를 발현하거나 알파바이러스 RdRp를 코딩하는 핵산으로 형질주입된 세포내 조건을 지칭한다. 세포는 바람직하게는 진핵세포이다. 결합 능력 및/또는 RdRP로서 작용하는 능력은 실험적으로 예를 들어 무세포 시험관내 시스템 또는 진핵세포 내에서 시험할 수 있다. 선택적으로, 상기 진핵세포는 RdRp의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염되는 종으로부터 유래된 세포이다. 예를 들어, 사람에게 감염되는 특정 알파바이러스의 알파바이러스 RdRp를 사용하는 경우, 정상적인 생리 조건은 인간 세포에서의 상태이다. 보다 바람직하게는, 진핵세포(일례로 인간 세포)는 RdRp의 기원을 나타내는 특정 알파바이러스가 감염된 동일한 조직 또는 기관에서 유래한 것이다.The expressions "capable of binding" and "capable of acting as RdRP" refer to the ability under normal physiological conditions. In particular, the expression refers to an intracellular condition that expresses alphavirus RdRp or has been transfected with a nucleic acid encoding alphavirus RdRp. The cell is preferably a eukaryotic cell. The binding capacity and/or ability to act as RdRP can be tested experimentally, eg in a cell-free in vitro system or in a eukaryotic cell. Optionally, the eukaryotic cell is a cell derived from a species infected with a particular alphavirus representing the origin of the RdRp. For example, when using the alphavirus RdRp of a particular alphavirus that infects humans, normal physiological conditions are those in human cells. More preferably, the eukaryotic cells (eg human cells) are derived from the same tissue or organ infected with the particular alphavirus representing the origin of the RdRp.

이러한 기능적 특성에 비추어, 본 발명의 레플리콘 및 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 기능적 쌍을 형성한다. 알파바이러스 RdRp는 본 발명에 따른 임의의 알파바이러스 RdRp일 수 있고, 레플리콘은 트랜스로 알파바이러스 RdRp에 의해 복제될 수 있는 한, 레플리콘 RNA의 뉴클레오타이드 서열은 특별히 한정되는 것은 아니다.In light of these functional properties, the replicon of the present invention and the RdRp mRNA cassette of the present invention form a functional pair. The alphavirus RdRp may be any alphavirus RdRp according to the present invention, and the nucleotide sequence of the replicon RNA is not particularly limited as long as the replicon can be replicated by the alphavirus RdRp in trans.

본 발명의 시스템이 세포, 바람직하게는 진핵세포 내에 도입될 때, RdRp mRNA 카세트 상에 코딩된 RdRp는 번역될 수 있고, 그에 의해 RdRp를 생성할 수 있다. 번역 후, RdRp는 RNA 레플리콘을 트랜스로 복제가 가능하다. 따라서, 본 발명은 트랜스로 RNA를 복제하기 위한 시스템을 제공한다. 결과적으로, 본 발명의 시스템은 트랜스-복제 시스템이다. 따라서, 본 발명에 따른 레플리콘은 트랜스-레플리콘이다.When the system of the present invention is introduced into a cell, preferably a eukaryotic cell, the RdRp encoded on the RdRp mRNA cassette can be translated, thereby generating RdRp. After translation, RdRp is capable of replicating the RNA replicon in trans. Accordingly, the present invention provides a system for replicating RNA in trans. Consequently, the system of the present invention is a trans-replication system. Thus, a replicon according to the present invention is a trans-replicon.

여기서, 트랜스(예를 들어, 트랜스-작용, 트랜스-조절과 관련하여)는 일반적으로 "상이한 분자로부터의 작용"(즉, 분자간)을 의미한다. 그것은 일반적으로 "동일한 분자에서 작용"(즉, 분자내)을 의미하는 시스(예를 들어 시스-작용, 시스-조절과 관련하여)의 반대말이다. RNA 합성(전사 및 RNA 복제 포함)과 관련하여, 트랜스-작용요소는 RNA 합성이 가능한 효소(RdRp)를 코딩하는 유전자를 함유하는 핵산 서열을 포함한다. Here, trans (eg, in the context of trans-acting, trans-modulation) generally means "action from a different molecule" (ie, intermolecular). It is the opposite of cis (eg, with respect to cis-acting, cis-regulating), which generally means "acting on the same molecule" (ie, intramolecularly). In the context of RNA synthesis (including transcription and RNA replication), trans-actors include nucleic acid sequences containing genes encoding enzymes capable of RNA synthesis (RdRp).

RdRp는 제 2 핵산 분자, 즉 다른 분자의 합성에서 기능한다. 트랜스-작용 RNA 및 이것이 코딩하는 단백질은 모두 관심 유전자 상에서 "트랜스로 작용한다"고 지칭한다. 본 발명에서, 트랜스-작용 RNA는 알파바이러스 RNA 중합효소를 코딩한다. 따라서, 알파바이러스 RNA 중합효소는 RNA를 복제할 수 있으므로 RdRp라 한다. RdRp functions in the synthesis of a second nucleic acid molecule, i.e. another molecule. Both the trans-acting RNA and the protein it encodes are referred to as "acting in trans" on the gene of interest. In the present invention, the trans-acting RNA encodes an alphaviral RNA polymerase. Therefore, alphavirus RNA polymerase is capable of replicating RNA and is therefore called RdRp.

RdRp는 제 2 RNA 분자 (레플리콘) 상에서 트랜스로 작용한다. 본 발명에 따라 RdRp에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 레플리콘은 본원에서 동의어로 "트랜스-레플리콘" 또는 "본 발명에 따른 레플리콘"라고 지칭한다.RdRp acts in trans on a second RNA molecule (replicon). Replicons capable of being cloned in trans by RdRp according to the present invention are synonymously referred to herein as “trans-replicons” or “replicons according to the present invention”.

종래 기술에서의 제안과는 달리, 본 발명의 트랜스-복제 시스템은 유전자 발현에 매우 적합하다. Contrary to suggestions in the prior art, the trans-replication system of the present invention is well suited for gene expression.

우선, 첫째로, 두개의 분리된 RNA 분자를 포함하는 본 발명의 시스템의 다능성은 레플리콘 및 RdRp mRNA 카세트가 상이한 시간 및/또는 상이한 부위에서 설계 및/또는 제조될 수 있게 한다. RdRp mRNA 카세트는 제 1 시점에서 제조되고, 레플리콘은 추후 시점에서 제조된다. 예를 들어, 그 제조 후, RdRp mRNA 카세트는 추후 시점에 사용하기 위해 저장될 수 있다. 본 발명은 시스-레플리콘에 비해 증가된 유연성을 제공한다. 새로운 특정 게놈 편집 대상 유전자좌(들)이 나타나면, 새로운 게놈 편집 도구에 대한 게놈 편집을 유도하는 가이드 핵산을 제작함으로써, 새로운 게놈 편집을 설계할 수 있다. 미리 준비된 RdRp mRNA 카세트는 보관실에서 회수할 수 있다. 다시 말해, RdRp mRNA 카세트는 임의의 특정 레플리콘과 독립적으로 설계되고 제조될 수 있다. 이것은 RdRp가 없는 레플리콘의 준비가 시스-레플리콘의 준비보다 적은 노력과 자원을 필요로 하기 때문에 새로운 특정 게놈 편집 대상 유전자좌(들)이나 적어도 하나의 새로운 게놈 편집 대상의 선정을 특징으로 하는 특정 게놈 편집 대상 유전자좌(들)의 출현에 신속하게 반응할 수 있게 한다. First of all, the versatility of the system of the present invention comprising two separate RNA molecules allows replicons and RdRp mRNA cassettes to be designed and/or manufactured at different times and/or at different sites. The RdRp mRNA cassette is made at a first time point and the replicon is made at a later time point. For example, after its preparation, the RdRp mRNA cassette can be stored for use at a later time point. The present invention provides increased flexibility compared to cis-replicons. When a new specific genome editing target locus(s) emerges, a new genome editing can be designed by constructing a guide nucleic acid that directs genome editing to the new genome editing tool. A pre-prepared RdRp mRNA cassette can be retrieved from the storage room. In other words, RdRp mRNA cassettes can be designed and produced independently of any particular replicon. This is because preparation of a replicon without RdRp requires less effort and resources than preparation of a cis-replicon, which is characterized by the selection of a new specific genome editing target locus(s) or at least one new genome editing target. Enables rapid response to the emergence of specific genome editing target locus(s).

둘째로, 동물 게놈 편집의 경우 게놈 편집 도구 비용이 수의학 및 농업 공동체에서 성공에 중요한 요인이다. 본 발명의 레플리콘은 기능성 알파바이러스 비구조성 단백질의 존재 하에서, 예를 들어 게놈 편집된 동물의 세포에서 복제될 수 있기 때문에, 상대적으로 적은 양의 복제 게놈 편집 시스템이 투여 되더라도, 목적 게놈 편집 도구의 높은 수준의 발현이 달성될 수 있다. 저용량의 레플리콘 RNA는 대상체당 게놈 편집 비용에 긍정적인 영향을 미친다.Second, for animal genome editing, the cost of genome editing tools is a critical factor for success in the veterinary and agricultural communities. Since the replicon of the present invention can be replicated in the presence of a functional alphavirus non-structural protein, for example, in the cells of a genome-edited animal, even if a relatively small amount of a replicative genome-editing system is administered, it is a target genome-editing tool. A high level of expression can be achieved. Low doses of replicon RNA have a positive impact on genome editing cost per subject.

셋째로, 본 발명에 따른 트랜스-레플리콘은 전형적으로 전형적인 시스-레플리콘보다 짧은 핵산 분자이다. 이것은 게놈 편집 도구를 코딩하는 레플리콘, 예를 들어 게놈 편집 도구의 보다 빠른 클로닝을 가능하게 하고, 게놈 편집 도구의 더 높은 수율을 제공한다.Third, trans-replicons according to the present invention are typically shorter nucleic acid molecules than typical cis-replicons. This allows faster cloning of replicons encoding genome editing tools, eg, genome editing tools, and provides higher yields of genome editing tools.

바람직하게, 레플리콘은 자연성 발생 Semliki Forest 바이러스 및 약독 Semliki Forest 바이러스와 같은 Semliki Forest 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는 Semliki Forest 바이러스로부터의 알파바이러스 RdRp에 의해 복제될 수 있다. Preferably, the replicon can be replicated by alphavirus RdRp from Semliki Forest Virus, including naturally occurring Semliki Forest Virus and variants or derivatives of Semliki Forest Virus, such as attenuated Semliki Forest Virus.

또 바람직하게, 레플리콘은 자연성 발생 Sindbis 바이러스 및 약독 Sindbis 바이러스와 같은 Sindbis 바이러스의 변이체 또는 유도체를 포함하는, Sindbis 바이러스로부터의 알파바이러스 RdRp에 의해 복제될 수 있다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, 레플리콘은 자연성 발생 VEEV 및 약독 VEEV와 같은 VEEV의 변이체 또는 유도체를 포함하는 베네수엘라 마뇌염 바이러스(VEEV)로부터의 알파바이러스 RdRp에 의해 복제될 수 있다.Also preferably, the replicon can be replicated by alphavirus RdRp from Sindbis virus, including naturally occurring Sindbis virus and variants or derivatives of Sindbis virus, such as attenuated Sindbis virus. In another preferred embodiment, the replicon can be replicated by alphavirus RdRp from Venezuelan nephritic virus (VEEV), including naturally occurring VEEV and variants or derivatives of VEEV, such as attenuated VEEV.

본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 바람직하게는 단일가닥 RNA 분자이다. 일반적으로, 단일가닥 코딩 핵산 분자는 핵산 물질의 중량 단위(예를 들어 μg)당 2배 많은 유전 정보를 포함한다. 따라서, 단일가닥의 성질은 예를 들어 본 발명에 의해 채용된 이중가닥 종래 기술 DNA 벡터와 비교하여 추가적인 장점을 나타낸다. 본 발명에 따른 레플리콘은 전형적으로 (+) 가닥 RNA 분자이다.An RNA replicon according to the present invention is preferably a single-stranded RNA molecule. Generally, a single-stranded encoding nucleic acid molecule contains twice as much genetic information per unit of weight (eg μg) of nucleic acid material. Thus, the single-stranded nature represents an additional advantage compared to, for example, the double-stranded prior art DNA vectors employed by the present invention. Replicons according to the present invention are typically positive-stranded RNA molecules.

RNA 레플리콘은 분리된 핵산 분자이다.An RNA replicon is an isolated nucleic acid molecule.

본 발명의 트랜스-복제 시스템은 대상체의 세포의 도입에서 게놈 편집 도구의 발현에 적합하다. 본 발명에서, 트랜스-레플리콘 RNA는 게놈 편집 도구로서 리포터 단백질 (예를 들어, GFP 또는 eGFP와 같은 형광 단백질)을 코딩하는 유전자좌를 포함하며, 각각의 게놈 편집 도구의 발현 효율을 용이하게 결정하도록 한다. 2개의 RNA를 포함하는 트랜스-복제 시스템은 시스-복제와 비교하여 목적 RNA의 발현 효율이 현저히 우수하다.The trans-replication system of the present invention is suitable for expression of genome editing tools in the introduction of cells of a subject. In the present invention, the trans-replicon RNA contains a locus encoding a reporter protein (e.g., a fluorescent protein such as GFP or eGFP) as a genome editing tool, and the expression efficiency of each genome editing tool is easily determined. let it do The trans-replication system comprising two RNAs is significantly superior in expression efficiency of the target RNA compared to cis-replication.

본 발명의 트랜스-복제 시스템은 인간 또는 동물에서 게놈 편집 도구의 효율적인 발현, 예를 들어 높은 수준의 발현에 적합하다. The trans-replication system of the present invention is suitable for efficient expression, eg high level expression, of genome editing tools in humans or animals.

예를 들어, 자연계에서 발견되는 전형적인 알파바이러스에서 RdRp를 코딩하는 약 7400개의 뉴클레오타이드는 전장 레플리콘의 증폭이 필요할 것이기 때문에 세포에 부담을 준다. 이러한 부담의 주요 부분은 비-복제성 RdRp mRNA 카세트가 예를 들어, mRNA의 형태로 RdRp 발현에 사용되는 경우에 제거된다. 이것은 RNA 증폭 및 전이 RNA 발현을 위해 트랜스-레플리콘을 사용할 수 있게 한다. RdRp mRNA 카세트가 세포에서 복제되지 않는다면 (즉, 복제된 유일한 외래 구성체가 본 발명의 트랜스-레플리콘이다), 세포 에너지 및 자원 (뉴클레오타이드 등)의 낭비를 피하고, 이것은 우수한 발현 수준을 설명할 수 있다. 또한, 짧은 레플리콘 RNA는 RNA 합성에 더 적은 시간을 필요로 한다. 따라서 시간, 세포 에너지 및/또는 자원의 절약이 보다 높은 수준의 복제에 기여할 수 있다고 여겨질 수 있다.For example, the approximately 7400 nucleotides encoding RdRp in a typical alphavirus found in nature is burdensome to the cell as amplification of the full-length replicon would be required. A major part of this burden is eliminated if a non-replicative RdRp mRNA cassette is used for expression of RdRp, eg in the form of mRNA. This allows the use of trans-replicons for RNA amplification and transfer RNA expression. If the RdRp mRNA cassette does not replicate in the cell (i.e., the only foreign construct replicated is the trans-replicon of the present invention), waste of cellular energy and resources (such as nucleotides) is avoided, which may explain the superior expression level. there is. Also, short replicon RNAs require less time for RNA synthesis. Thus, it can be considered that savings in time, cellular energy and/or resources can contribute to higher levels of replication.

레플리콘의 보존서열Replicon conserved sequence

레플리콘은 알파바이러스 게놈 RNA이거나 이를 포함하거나 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유래된 것이다. 본 발명에 따른 레플리콘은 하나 이상의 보존서열구성(CSE)을 포함한다. 특히, 레플리콘은 자연계에서 발견되는 알파바이러스의 하나 이상의 보존서열구성(CSE) 또는 이의 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다.A replicon is, comprises, or is derived from alphaviral genomic RNA. A replicon according to the present invention contains one or more Conserved Sequence Configurations (CSEs). In particular, the replicon may include one or more conserved sequence constructs (CSEs) of alphaviruses found in nature or variants or derivatives thereof.

- (-) 가닥 주형으로부터 (+) 가닥 합성을 위한 프로모터로서 기능하는 것으로 여겨지는 CSE 1. 존재한다면, CSE 1은 전형적으로 레플리콘 RNA의 5' 말단에 위치하거나 그 부근에 위치한다.- CSE 1, which is believed to function as a promoter for synthesis of the (+) strand from the (-) strand template. If present, the CSE 1 is typically located at or near the 5' end of the replicon RNA.

- 게놈 (+) 가닥 RNA 주형으로부터 (-) 가닥 합성을 위해 프로모터 또는 인핸서로서 작용하는 것으로 여겨지는 CSE 2. 존재한다면, CSE 2는 전형적으로 CSE 1의 하류에 위치하지만 CSE 3의 상류에 위치한다.- CSE 2, which is believed to act as a promoter or enhancer for the synthesis of the negative strand from the genomic (+) strand RNA template. If present, CSE 2 is typically located downstream of CSE 1 but upstream of CSE 3 .

- 서브게놈 RNA의 효과적인 전사에 기여하는 것으로 여겨지는 CSE 3; 존재한다면, CSE 3는 전형적으로 목적 RNA(존재한다면)의 코딩 서열의 상류에 위치하지만, CSE 2의 하류에 위치한다.- CSE 3, believed to contribute to efficient transcription of subgenomic RNA; If present, CSE 3 is typically located upstream of the coding sequence of the RNA of interest (if present), but downstream of CSE 2.

- (-) 가닥 합성의 개시를 위한 코어 프로모터로서 기능하는 것으로 여겨지는 CSE 4. 존재한다면, CSE 4는 전형적으로 목적 RNA(존재한다면)에 대한 코딩 서열의 하류에 위치한다. 여하튼, CSE 4는 전형적으로 CSE 3의 하류에 존재한다. 다양한 알파바이러스에서 CSE 4(3' CSE라고도 함)의 서열 세부 사항은 문헌에 기술되어 있으며, 본 발명에서, CSE 4의 서열은 예를 들어 그 문서의 교시에 따라 선택될 수 있다.- CSE 4, which is believed to function as a core promoter for initiation of negative strand synthesis. If present, CSE 4 is typically located downstream of the coding sequence for the RNA of interest (if present). In any case, CSE 4 is typically downstream of CSE 3. Sequence details of CSE 4 (also referred to as 3' CSE) in various alphaviruses are described in the literature, and in the present invention, the sequence of CSE 4 can be selected, for example, according to the teachings of that document.

본 발명에 따른 RNA 레플리콘은:An RNA replicon according to the present invention:

(1) 알파바이러스 5' 복제인식서열, 및(1) an alphavirus 5' replication recognition sequence, and

알파바이러스 5' 복제인식서열은 알파바이러스 CSE 1 및/또는 CSE 2를 포함한다. 자연성 발생 알파바이러스에서, CSE 1 및/또는 CSE 2는 전형적으로 5' 복제인식서열에 포함된다.The alphavirus 5' replication recognition sequence includes alphavirus CSE 1 and/or CSE 2. In naturally occurring alphaviruses, CSE 1 and/or CSE 2 are typically included in the 5' replication recognition sequence.

알파바이러스 3' 복제인식서열은 알파바이러스 CSE 4를 포함한다. 자연성 발생 알파바이러스에서, CSE 4는 전형적으로 3' 복제인식서열에 포함된다.The alphavirus 3' replication recognition sequence includes alphavirus CSE 4. In naturally occurring alphaviruses, CSE 4 is typically included in the 3' replication recognition sequence.

알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열은 RdRp의 존재 하에서 본 발명에 따른 RNA 레플리콘의 복제를 지시할 수 있다. 따라서, 단독으로 또는 바람직하게 함께 존재할 때, 이들 인식 서열은 RdRp의 존재 하에 RNA 레플리콘의 복제를 지시한다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, RdRp의 존재 하에 RNA 레플리콘의 복제를 지시하는 알파바이러스 보존서열구성 (CSE) 1, 2 및 4 (인식서열에 포함됨)인 것을 이해할 수 있다. 따라서, 레플리콘은 전형적으로 CSE 1, 2 및 4를 포함할 것이다.The alphavirus 5' replication recognition sequence and the alphavirus 3' replication recognition sequence can direct replication of the RNA replicon according to the present invention in the presence of RdRp. Thus, alone or preferably together, these recognition sequences direct replication of the RNA replicon in the presence of RdRp. Without wishing to be bound by theory, it is understood that alphavirus conserved sequence constructs (CSEs) 1, 2 and 4 (which are included in the recognition sequence) direct replication of the RNA replicon in the presence of RdRp. Thus, a replicon will typically contain CSEs 1, 2 and 4.

RdRp mRNA 카세트에 의해 코딩되는 RdRp는 레플리콘의 알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열 모두를 인식할 수 있는 알파바이러스 RdRp인 것이 바람직하다.The RdRp encoded by the RdRp mRNA cassette is preferably an alphavirus RdRp capable of recognizing both the alphavirus 5' replication recognition sequence and the alphavirus 3' replication recognition sequence of the replicon.

이것은 알파바이러스 5' 복제인식서열 및 알파바이러스 3' 복제인식서열이 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유한 경우에 달성된다. 천연은 이러한 서열의 자연적 기원이 동일한 알파바이러스임을 의미한다. 일 실시형태에서, CSE 1, CSE 2 및 CSE 4는 RdRp가 유도되는 알파바이러스에 고유한 것이다.This is achieved when the alphavirus 5' replication recognition sequence and the alphavirus 3' replication recognition sequence are unique to the alphavirus that induces RdRp. Natural means that these sequences are alphaviruses of the same natural origin. In one embodiment, CSE 1, CSE 2 and CSE 4 are unique to the alphavirus from which RdRp is induced.

알파바이러스 RdRp가 레플리콘의 5' 복제인식서열 (및/또는 CSE 1 및/또는 CSE 2) 및 3' 복제인식서열 (및/또는 CSE 4) 모두를 인식할 수 있다면, 5' 복제인식서열 (및/또는 CSE 1 및/또는 CSE 2) 및/또는 알파바이러스 3' 복제인식서열 (및/또는 CSE 4)은 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고요한 것이 아니다. 바꾸어 말하면, RdRp는 5' 복제인식서열 (및/또는 CSE 1 및/또는 CSE 2) 및 3' 복제인식서열 (및/또는 CSE 4)에 호환성이 있는 것이다. 비-천연 알파바이러스 RdRp가 각각의 서열 또는 서열 요소를 인식할 수 있는 경우, RdRp는 호환성이 있는 것이다(바이러스 간 호환성). 상이한 알파바이러스로부터의 비-천연 RdRp와 각각 (3'/5') 복제인식서열 및 CSE에 관한 바이러스 간 호환성의 예로서는 당업계에 공지되어있다. 바이러스 간 호환성이 존재하는 한, (3'/5') 복제인식서열 및 CSE 각각을 알파바이러스 RdRp와 함께 임의로 조합 가능하다.If the alphavirus RdRp can recognize both the 5' duplicated recognition sequence (and/or CSE 1 and/or CSE 2) and the 3' duplicated recognition sequence (and/or CSE 4) of the replicon, the 5' duplicated recognition sequence (and/or CSE 1 and/or CSE 2) and/or alphavirus 3' replication recognition sequence (and/or CSE 4) are not silent in alphaviruses that induce RdRp. In other words, the RdRp is compatible with the 5' duplicate recognition sequence (and/or CSE 1 and/or CSE 2) and the 3' duplicate recognition sequence (and/or CSE 4). An RdRp is compatible (compatibility between viruses) if the non-native alphavirus RdRp can recognize each sequence or sequence element. Examples of interviral compatibility with non-native RdRp from different alphaviruses for (3'/5') replication recognition sequences and CSEs, respectively, are known in the art. As long as there is compatibility between viruses, each of the (3'/5') replication recognition sequence and CSE can be arbitrarily combined with the alphavirus RdRp.

바이러스 간 호환성은 시험될 RdRp를 RNA와 함께 인큐베이션시킴으로써 본 발명을 수행하는 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있는데, RNA는 RNA 복제에 적합한 조건에서, 예를 들어 적합한 대상세포에 시험될 3'- 및 5' 복제인식서열을 갖는다. 복제가 발생하면, (3'/5') 복제인식서열 및 RdRp이 호환할 수 있는 것으로 결정된다.Compatibility between viruses can be easily tested by those skilled in the art practicing the present invention by incubating the RdRp to be tested with RNA, which RNA is to be tested under conditions suitable for RNA replication, e. It has a 5' duplication recognition sequence. If duplication occurs, it is determined that the (3'/5') duplication recognition sequence and RdRp are compatible.

서브게놈 프로모터subgenomic promoter

본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 발현 제어 서열을 포함한다. 전형적인 발현 제어 서열은 프로모터이거나 이를 포함한다. 본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 서브게놈 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스 서브게놈 프로모터이다. 서브게놈 프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 알파바이러스 중에 고도로 보존되어 있다.The RNA replicon according to the present invention includes an expression control sequence. A typical expression control sequence is or comprises a promoter. An RNA replicon according to the present invention includes a subgenomic promoter. Preferably, the subgenomic promoter is an alphavirus subgenomic promoter. The nucleotide sequence of the subgenomic promoter is highly conserved among alphaviruses.

바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 구조 단백질에 대한 프로모터이다. 이것은 서브게놈 프로모터가 알파바이러스에 고유한 것이고 상기 알파바이러스에서 하나 이상의 구조 단백질 유전자의 전사를 제어하는 것을 의미한다.Preferably, the subgenomic promoter is a promoter for a structural protein of an alphavirus. This means that the subgenomic promoter is unique to the alphavirus and controls the transcription of one or more structural protein genes in the alphavirus.

서브게놈 프로모터는 RdRp mRNA 카세트의 RdRp와 호환할 수 있는 것이 바람직하다. "호환된다"는 것은 알파바이러스 RdRp가 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, RdRp mRNA 카세트에 의해 코딩되는 RdRp는 레플리콘의 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있는 알파바이러스 RdRp인 것이 바람직하다.It is preferred that the subgenomic promoter is compatible with the RdRp of the RdRp mRNA cassette. "Compatible" means that the alphavirus RdRp is capable of recognizing the subgenomic promoter. Therefore, the RdRp encoded by the RdRp mRNA cassette is preferably an alphavirus RdRp capable of recognizing the subgenomic promoter of the replicon.

이것은 서브게놈 프로모터가 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유한 경우에 달성된다. 고유함은 서브게놈 프로모터의 자연적 기원 및 RdRp의 자연적 기원이 동일한 알파바이러스임을 의미한다.This is achieved when the subgenomic promoter is unique to the alphavirus that drives RdRp. Unique means that the natural origin of the subgenomic promoter and the natural origin of the RdRp are the same alphavirus.

서브게놈 프로모터는 알파바이러스 RdRp가 레플리콘의 서브게놈 프로모터를 인식할 수 있는 경우에 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유하지 않다. 즉, RdRp는 서브게놈 프로모터와 호환된다 (바이러스 간 호환성). 바이러스 간 호환성이 존재하는 한, 임의의 서브게놈 프로모터와 RdRp의 조합이 가능한다. 바이러스 간 호환성은 시험되는 RdRp를 RNA와 함께 인큐베이션함으로써 본 발명을 수행하는 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있고, 여기서 RNA는 서브게놈 프로모터로부터의 RNA 합성에 적합한 조건에서 시험될 서브게놈 프로모터를 갖는다. The subgenomic promoter is not unique to the alphavirus inducing RdRp if the alphavirus RdRp can recognize the subgenomic promoter of the replicon. That is, RdRp is compatible with subgenomic promoters (compatibility between viruses). Combinations of any subgenomic promoter with RdRp are possible as long as compatibility between viruses exists. Compatibility between viruses can be readily tested by those skilled in the art practicing the present invention by incubating the RdRp being tested with an RNA, wherein the RNA has a subgenomic promoter to be tested under conditions suitable for RNA synthesis from the subgenomic promoter.

서브게놈 전사체가 준비되면, 서브게놈 프로모터와 RdRp는 호환할 수 있는 것으로 결정된다. 바이러스 간 호환성의 다양한 예가 공지되어 있다: 일부 경우에, 비-천연 서브게놈 프로모터는 천연 서브게놈 프로모터보다 더 효율적인 전사를 유도한다.Once the subgenomic transcripts are prepared, the subgenomic promoter and RdRp are determined to be compatible. Various examples of compatibility between viruses are known: in some cases, non-native subgenomic promoters induce more efficient transcription than native subgenomic promoters.

바람직하게는, 본 발명에 따른 레플리콘은 알파바이러스로부터의 보존서열구성 3 (CSE 3)를 포함한다. CSE 3는 서브게놈 RNA의 효과적인 전사에 기여하는 것으로 여겨진다. 서브게놈 RNA의 전사는 CSE 3가 존재할 때 매우 효율적으로 일어나는 것으로 알려져있다. 전형적으로, CSE 3는 약 24개 뉴클레오타이드의 폴리 뉴클레오타이드 스트레치이다. 알파바이러스 게놈에서, CSE 3는 비구조성 단백질 및 구조 단백질의 코딩 서열 간의 접합 영역에 위치한다. 본 발명의 트랜스-레플리콘에서, CSE 3는 일반적으로 서브게놈 프로모터의 제어 하에 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 상류 (5')에 존재한다. Preferably, the replicon according to the present invention comprises conserved sequence configuration 3 (CSE 3) from alphavirus. CSE 3 is believed to contribute to efficient transcription of subgenomic RNA. Transcription of subgenomic RNA is known to occur very efficiently in the presence of CSE 3. Typically, CSE 3 is a polynucleotide stretch of about 24 nucleotides. In the alphavirus genome, CSE 3 is located in the junction region between the coding sequences of nonstructural and structural proteins. In the trans-replicon of the present invention, CSE 3 is usually upstream (5') of the open reading frame (ORF) under the control of a subgenomic promoter.

본 발명에 따른 레플리콘이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 하나의 ORF를 포함하는 경우, CSE 3는 상기한 하나의 ORF의 5'에 위치한다. 본 발명에 따른 레플리콘이 서브게놈 프로모터의 제어 하에 둘 이상의 ORF를 포함하는 경우, CSE 3는 각각의 그러한 ORF의 5'에 위치할 수 있다. 일 실시형태에서, CSE 3는 RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유한 것이다. 다른 일 실시형태에서, CSE 3는 알파바이러스 RdRp가 레플리콘의 CSE 3를 인식할 수 있으면, RdRp를 유도하는 알파바이러스에 고유하지 않은 것이다.When the replicon according to the present invention includes one ORF under the control of a subgenomic promoter, CSE 3 is located 5' to the above-mentioned one ORF. If a replicon according to the present invention contains two or more ORFs under the control of a subgenomic promoter, CSE 3 may be located 5' to each such ORF. In one embodiment, CSE 3 is unique to the alphavirus that induces RdRp. In another embodiment, CSE 3 is not unique to the alphavirus that induces RdRp if the alphavirus RdRp can recognize the CSE 3 of the replicon.

레플리콘의 임의의 추가 기능Random add-on of the Replicon

본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 3' 폴리(A) 서열을 포함한다. 알파바이러스 RNA의 폴리(A) 서열은 바이러스 비구조성 단백질의 번역 효율 및 RNA 안정성에서 중요한 역할을 하는 것으로 기술되어있다. 본 발명에서, 폴리(A) 서열은 목적 RNA의 번역 효율 및 레플리콘 안정성에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.An RNA replicon according to the present invention comprises a 3' poly(A) sequence. The poly(A) sequence of alphavirus RNA has been described to play an important role in the translational efficiency and RNA stability of viral non-structural proteins. In the present invention, the poly(A) sequence is believed to play an important role in the translation efficiency and replicon stability of the target RNA.

본 발명에 따른 레플리콘의 3' 폴리(A) 서열은 RdRp mRNA 카세트의 3' 폴리(A) 서열에서 선택될 수 있다. 그 외에도, 폴리(A) 서열 (본 발명에 따른 레플리콘 상에 존재한다면)은 알파바이러스 보존서열구성 4 (CSE 4)에 선행된다. 바람직하게는, CSE 4에 직접적으로 인접하여, CSE 4의 가장 3' 뉴클레오타이드가 직접적으로 폴리(A) 꼬리의 가장 5' 뉴클레오타이드에 인접하도록 한 것이 바람직하다.The 3' poly(A) sequence of the replicon according to the present invention may be selected from the 3' poly(A) sequence of the RdRp mRNA cassette. In addition, the poly(A) sequence (if present on the replicon according to the present invention) is preceded by alphavirus conserved sequence configuration 4 (CSE 4). Preferably, it is directly adjacent to CSE 4, such that the most 3' nucleotide of CSE 4 is directly adjacent to the most 5' nucleotide of the poly(A) tail.

본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 5'-캡 (캡 유사체를 포함 함)을 포함한다. 캡 (또는 캡 유도체)은 문자 C로 상징되어있다. 본 발명에 따른 레플리콘의 캡 (또는 유사체)의 양상은 RNA 레플리콘의 경우에 대해 캡이 반드시 필수적으로 존재하여야 하는 것을 제외하고는, 본원에서 RdRp mRNA 카세트의 캡(또는 유사체)에 대해 기재된 양상이 동일하다. 따라서, RNA 레플리콘은 캡을 포함하지 않는다. 이는 자유 5' OH 말단, 또는 임의의 적합한 5' 변형을 포함할 수 있다. RNA 레플리콘이 문자 C로 표시된 캡을 포함하는 다른 실시형태를 개략적으로 도시하고 있다는 사실과 무관하게 본 발명에 의해 동등하게 포함된다.RNA replicons according to the present invention include a 5'-cap (including cap analogs). Cap (or cap derivative) is symbolized by the letter C. Aspects of the cap (or analog) of the replicon according to the present invention apply to the cap (or analog) of the RdRp mRNA cassette herein, except that the cap must necessarily be present for the RNA replicon. The aspects described are the same. Thus, RNA replicons do not contain caps. It may include a free 5' OH end, or any suitable 5' modification. Regardless of the fact that an RNA replicon is schematically depicted in another embodiment comprising a cap denoted by the letter C, it is equally encompassed by the present invention.

본 발명에 따른 레플리콘 상에 존재하는 오픈 리딩 프레임 (들)의 코딩 서열(존재하는 경우)은 개조된다. 레플리콘의 코돈 개조의 실시형태 및 바람직한 실시형태는 RdRp mRNA 카세트의 코돈 개조의 경우에 대해 본원에 개시된 것들 중에서 선택될 수 있다. 오픈 리딩 프레임(들)의 코돈은 대상세포 또는 대상 유기체에서의 발현에 적합할 수 있다.The coding sequence (if present) of the open reading frame(s) present on the replicon according to the present invention is adapted. Embodiments and preferred embodiments of codon alteration of replicons can be selected from among those disclosed herein for the case of codon alteration of RdRp mRNA cassettes. The codons of the open reading frame(s) may be suitable for expression in a target cell or organism of interest.

이종 핵산 서열heterologous nucleic acid sequence

레플리콘은 추가로 바이러스 유래가 아닌 적어도 하나의 핵산 서열, 특히 알파바이러스가 아닌 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 RNA 레플리콘은 이종 핵산 서열을 포함한다.The replicon further comprises at least one nucleic acid sequence that is not of viral origin, in particular a nucleic acid sequence that is not of alphavirus. In a preferred embodiment, an RNA replicon according to the present invention comprises a heterologous nucleic acid sequence.

용어 "이종"은 핵산 서열이 알파바이러스 발현 제어 서열, 특히 알파바이러스 서브게놈 프로모터와 같은 알파바이러스 핵산 서열에 천연 기능적으로 결합되지 않는 상황을 의미한다. 이종 핵산 서열은 레플리콘의 핵산 서열에 포함된다.The term “heterologous” refers to situations in which a nucleic acid sequence is not naturally functionally linked to an alphavirus nucleic acid sequence, such as an alphavirus expression control sequence, particularly an alphavirus subgenomic promoter. A heterologous nucleic acid sequence is included in the nucleic acid sequence of the replicon.

바람직하게는, 이종 핵산 서열은 서브게놈 프로모터, 바람직하게는 알파바이러스 서브게놈 프로모터의 제어 하에 있고, 보다 바람직하게는, 이종 핵산 서열은 서브게놈 프로모터의 하류에 위치한다. 알파바이러스 서브게놈 프로모터는 매우 효율적이어서 높은 수준의 이종 유전자 발현에 적합하다. 바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 이종 핵산 서열 또는 그의 일부의 전사체를 포함하는 서브게놈 RNA의 생산을 제어한다.Preferably, the heterologous nucleic acid sequence is under the control of a subgenomic promoter, preferably an alphavirus subgenomic promoter, more preferably, the heterologous nucleic acid sequence is located downstream of a subgenomic promoter. Alphavirus subgenomic promoters are highly efficient and are suitable for high-level heterologous gene expression. Preferably, a subgenomic promoter controls the production of subgenomic RNA comprising a transcript of a heterologous nucleic acid sequence or portion thereof.

바람직하게는, 서브게놈 프로모터는 알파바이러스의 구조 단백질에 대한 프로모터이다. 이것은 서브게놈 프로모터가 알파바이러스에 고유하고 상기 알파바이러스에서 하나 이상의 구조 단백질의 코딩 서열의 전사를 제어하는 프로모터라는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 이종 핵산 서열은 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 같은 바이러스 핵산 서열을 부분적으로 또는 완전히 대체할 수 있다. 바람직하게는, 이종 핵산 서열은 알파바이러스로부터 유래되지 않으며; 특히, 이종 핵산 서열은 서브게놈 프로모터가 유래된 알파바이러스와 동일한 알파바이러스로부터 유래되지 않는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 레플리콘은 CSE 3을 포함하고, 이종 핵산 서열은 CSE 3에 대해 이종인 것이다.Preferably, the subgenomic promoter is a promoter for a structural protein of an alphavirus. This means that a subgenomic promoter is a promoter that is unique to an alphavirus and controls transcription of the coding sequence of one or more structural proteins in said alphavirus. According to the present invention, a heterologous nucleic acid sequence may partially or completely replace a viral nucleic acid sequence, such as a nucleic acid sequence encoding an alphaviral structural protein. Preferably, the heterologous nucleic acid sequence is not derived from an alphavirus; In particular, it is preferred that the heterologous nucleic acid sequence is not derived from the same alphavirus as the alphavirus from which the subgenomic promoter was derived. In one embodiment, the replicon comprises CSE 3 and the heterologous nucleic acid sequence is heterologous to CSE 3.

3. 관심 단백질3. Protein of Interest

본 발명의 관심 mRNA(mRNAi)는 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 유전체 편집, 및 RNA 침묵으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. mRNAi는 치료 단백질 또는 펩타이드를 암화화하는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 병원성 항원, 종양성 항원, 알러지성 항원 또는 자가 면역성 항원과 같은 항원은 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다. 거기에, 항원을 코딩하는 mRNAi의 투여는 상기 항원을 포함하는 질환에 대한 유전적 백신 접종 접근에 사용된다. 항체는 본 발명에 따른 mRNAi의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된다.The mRNA (mRNAi) of interest of the present invention may be any one selected from the group consisting of antigens, antibodies, therapeutic proteins, peptides, fusion proteins, genome editing, and RNA silencing. An mRNAi contains at least one open reading frame that encodes a therapeutic protein or peptide. Antigens such as pathogenic antigens, oncogenic antigens, allergenic antigens or autoimmune antigens are encoded by at least one open reading frame. Therein, administration of mRNAi encoding an antigen is used in a genetic vaccination approach against diseases involving the antigen. An antibody is encoded by at least one open reading frame of an mRNAi according to the present invention.

융합 단백질fusion protein

융합 단백질은 단일 단위로 전사되고 번역되어 단일 폴리 펩타이드를 생성하도록 결합된 별도의 유전자에 의해 코딩된 적어도 두 개의 도메인 이상으로 구성된 단백질이다. 기본적으로 두 가지 유형의 융합 단백질이 있다. 첫 번째는 종단 간 융합되고 일반적으로 링커에 의해 연결된 두 개의 단백질 또는 단백질 서브 유닛으로 구성되고 두 번째는 두 공여자의 아미노산이 융합 단백질에 산재되어 있다. A fusion protein is a protein composed of at least two or more domains encoded by separate genes that are combined to produce a single polypeptide that is transcribed and translated as a single unit. There are basically two types of fusion proteins. The first consists of two proteins or protein subunits fused end-to-end and usually connected by a linker, and the second has amino acids from two donors interspersed in the fusion protein.

전자는 링커 펩타이드로 융합된 이종 단백질 폴리펩타이드; 및 특수목적 펩타이드와 단백질이 결합한 폴리펩타이드;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나일 수 있다.The former is a heterologous protein polypeptide fused to a linker peptide; It may be any one selected from the group comprising; and a polypeptide in which a special purpose peptide and a protein are bound.

융합 단백질은 통합된 단백질 도메인에 따라 분류될 수 있다. 종종 하나의 융합 파트너는 분자 인식 기능을 가지고 있는 반면 다른 파트너는 안정성 및 반감기 개선, 세포 독성 효과 또는 새로운 관심화 및 전달 경로와 같은 특정 기능이 있을 수 있다. 치료용 융합 단백질은 면역 독소, 사이토카인 융합, 단편 결정화 가능 (Fc) 융합, 알부민 융합 및 이들 부류에 속하지 않는 기타 일 수 있다. 현재 진행중인 대부분의 재조합 단백질 임상 시험은 단클론 항체를 포함하지만, 융합 단백질은 앞으로도 중요한 치료 분자가 될 것으로 예상된다.Fusion proteins can be classified according to the protein domains they have been incorporated into. Often, one fusion partner has molecular recognition functions while the other partner may have specific functions, such as improved stability and half-life, cytotoxic effects, or novel pathways of interest and delivery. Therapeutic fusion proteins can be immunotoxins, cytokine fusions, fragment crystallizable (Fc) fusions, albumin fusions and others not within these classes. Although most clinical trials of recombinant proteins currently in progress involve monoclonal antibodies, fusion proteins are expected to become important therapeutic molecules in the future.

병원성 항원(Pathogenic antigens):Pathogenic antigens:

본 발명에 따른 mRNAi는 병원성 항원 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩할 수 있다. 이와 같은 병원성 항원은 개체, 특히 포유동물 개체, 더욱 특히 인간에서 면역적 반응을 일으키는 병원성 유기체, 특히 박테리아, 바이러스 또는 원생동물(다세포(multicellular)) 병원성 유기체로부터 유래된다. 더욱 구체적으로, 바람직하게 병원성 항원은 표면 항원, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 또는 원생동물 유기체의 표면에 위치한 단백질(또는 단백질의 절편, 예를 들어, 표면 항원의 외부 부분)이다.The mRNAi according to the present invention may encode proteins or peptides including pathogenic antigens or fragments, variants or derivatives thereof. Such pathogenic antigens are derived from pathogenic organisms, in particular bacteria, viruses or protozoan (multicellular) pathogenic organisms that evoke an immune response in a subject, in particular a mammalian subject, more particularly a human. More specifically, preferably the pathogenic antigen is a surface antigen, eg a protein (or a fragment of a protein, eg an external portion of a surface antigen) located on the surface of a viral or bacterial or protozoan organism.

병원성 항원은 바람직하게 감염성 질환과 관련된 병원체로부터 유래된 항원으로부터 선택된다. 특히 바람직한 항원은 인플루엔자 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스(HSV), 인유두종바이러스(HPV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 플라스모디움(Plsmodium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 댕기 바이러스(Dengue virus), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 사이토메갈로바이러스(CMV), B형 간염 바이러스, 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 광견병 바이러스 및 황열병 바이러스로부터 선택된 병원체이다.Pathogenic antigens are preferably selected from antigens derived from pathogens associated with infectious diseases. Particularly preferred antigens are influenza virus, respiratory syncytial virus (RSV), herpes simplex virus (HSV), human papillomavirus (HPV), human immunodeficiency virus (HIV), Plasmodium, Staphylococcus aureus aureus), Dengue virus, Chlamydia trachomatis, cytomegalovirus (CMV), hepatitis B virus, Mycobacterium tuberculosis, rabies virus and yellow fever virus am.

본 발명에 따른 mRNAi는 광견병 바이러스 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 항원성 절편을 코딩한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 mRNAi는 광견병 바이러스의 당단백질 G(RAV-G), 핵단백질 N(RAV-N), 인단백질 P(RAV-P), 매트릭스 단백질 M(RAV-M) 또는 RNA 폴리머라아제 L(RAV-L), 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원성 단백질 또는 펩타이드를 코딩한다.mRNAi according to the present invention encode rabies virus proteins or peptides or antigenic fragments thereof. Preferably, mRNAi according to the present invention is rabies virus glycoprotein G (RAV-G), nucleoprotein N (RAV-N), phosphoprotein P (RAV-P), matrix protein M (RAV-M) or RNA polymer Encodes an antigenic protein or peptide selected from the group consisting of lase L (RAV-L), or fragments, variants or derivatives thereof.

본 발명에 따른 mRNAi는 호흡기 합포체 바이러스(ripiratory syncytial virus)(RSV) 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 항원성 절편을 코딩한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 SM_mRNAi는 호흡기 합포체 바이러스(RSV)의 융합 단백질 F, 당단백질 G, 짧은 소수성 단백질 SH, 매트릭스 단백질 M, 핵단백질 N, 라지 폴리머라아제 L, M2-1 단백질, M2-2 단백질, 인단백질 P, 비-구조 단백질 NS1 또는 비-구조 단백질 NS2, 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 항원성 단백질 또는 펩타이드를 코딩한다.An mRNAi according to the present invention encodes a respiratory syncytial virus (RSV) protein or peptide or an antigenic fragment thereof. Preferably, SM_mRNAi according to the present invention is a respiratory syncytial virus (RSV) fusion protein F, glycoprotein G, short hydrophobic protein SH, matrix protein M, nucleoprotein N, large polymerase L, M2-1 protein, M2 -2 Encodes an antigenic protein or peptide selected from the group consisting of a protein, phosphoprotein P, non-structural protein NS1 or non-structural protein NS2, or a fragment, variant or derivative thereof.

종양 항원:Tumor antigen:

본 발명에 따른 mRNAi는 종양 항원, 상기 종양 항원의 절편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩할 수 있으며, 항원 또는 상기 종양 항원의 절편, 변이체 또는 유도체이다.The mRNAi according to the present invention may encode a tumor antigen, a peptide including a fragment, variant or derivative of the tumor antigen, or a protein or peptide including a protein, and is an antigen or a fragment, variant or derivative of the tumor antigen.

종양유전자(KRAS, p53 등) 돌연변이체의 암항원, 종양 항원 NY-iO-1, 5T4, MAGE-C1, MAGE-C2, 서바이빈(Survivin), Muc-1, PSA, PSMA, PSCA, STEAP 및 PAP는 특히 바람직하다. 투여되는 mRNAi는 치료 단백질 또는 이의 절편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩한다.Cancer antigens of oncogenes (KRAS, p53, etc.) mutants, tumor antigens NY-iO-1, 5T4, MAGE-C1, MAGE-C2, Survivin, Muc-1, PSA, PSMA, PSCA, STEAP and PAP are particularly preferred. The mRNAi to be administered encode proteins or peptides, including therapeutic proteins or fragments, variants or derivatives thereof.

본 발명의 치료 단백질은 임의의 유전성(inherited) 또는 후천성(acquired) 질환의 치료에 유익하거나, 개인(individual)의 상태를 향상시키는 펩타이드 또는 단백질이다. 특히, 치료 단백질은 치료제의 생성에 큰 역할을 하며, 다른 기능 중 유전적 오류를 변형 및 수리, 암세포 또는 병원체 감염된 세포를 파괴, 면역계 장애를 치료, 대사 또는 내분비 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, 에리스로포이에틴(EPO), 단백질 호르몬은 신장 합병증의 일반적인 원인인 적혈구 결핍 환자를 치료하는데 이용될 수 있다. 또한, 어쥬번트 단백질, 치료 항체는 치료 단백질 및 예를 들어, 폐경기 여성의 치료에 이용될 수 있는 호르몬 대체 요법(hormone replacement therapy)에 의해서도 포함된다. 더욱 최근 접근에서, 환자의 체세포는 분쟁(disputed) 줄기세포 요법을 대체하는 다능성 줄기세포로 역분화하는데 사용된다. 또한, 체세포의 역분화에 사용되거나 줄기세포의 분화에 사용되는 이들 단백질은 치료 단백질로서 본원에 정의된다. 또한, 치료 단백질은 예를 들어, 상처 치료, 조직 재생, 신생 혈관 생성 등 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.Therapeutic proteins of the present invention are peptides or proteins that are beneficial in the treatment of any inherited or acquired disease or improve the condition of an individual. In particular, therapeutic proteins play a large role in the creation of therapeutics and, among other functions, can modify and repair genetic errors, destroy cancer cells or pathogen-infected cells, treat immune system disorders, and treat metabolic or endocrine disorders. For example, erythropoietin (EPO), a protein hormone, can be used to treat patients with red blood cell deficiency, a common cause of renal complications. Adjuvant proteins, therapeutic antibodies are also encompassed by therapeutic proteins and hormone replacement therapy, which can be used, for example, in the treatment of postmenopausal women. In a more recent approach, a patient's somatic cells are used to dedifferentiate into pluripotent stem cells replacing disputed stem cell therapy. Also, those proteins used for dedifferentiation of somatic cells or for differentiation of stem cells are defined herein as therapeutic proteins. In addition, therapeutic proteins may be used for other purposes, such as wound healing, tissue regeneration, and angiogenesis.

따라서, 치료 단백질은 예를 들어, 감염성 질환, 신생물(neoplasm)(예를 들어, 암 또는 종양 질환), 혈액 및 혈액-형성 기관 질환, 내분비, 영양성 및 대사 질환, 신경계 질환, 순환계 질환, 호흡계 질환, 소화계 질환, 피부 및 피하 조직 질환, 근골격계 및 결합 조직 질환 및 비뇨생식계(genitourinary system) 질환과 같은 다양한 질환(독립적으로 유전성 또는 후천성인 경우)의 치료를 포함하는 다양한 목적에 사용될 수 있다.Thus, therapeutic proteins may be used, for example, in infectious diseases, neoplasms (eg cancer or tumor diseases), diseases of the blood and blood-forming organs, endocrine, nutritional and metabolic diseases, diseases of the nervous system, diseases of the circulatory system, respiratory system diseases, diseases of the digestive system, diseases of the skin and subcutaneous tissue, diseases of the musculoskeletal system and connective tissue, and diseases of the genitourinary system (if independently inherited or acquired).

그 중에서도 대사 또는 내분비 장애의 치료에 사용될 수 있는 특히 바람직한 치료 단백질은 기능성 단백질의 이의 부족한 내부 생산량을 충분한 양으로 교체하여 개체를 치료하기 위한 것이므로 치료 단백질로 이해된다. 따라서, 이와 같은 치료 단백질은 일반적으로 포유동물, 특히 인간 단백질이다. 혈액 장애, 순환계 질환, 호흡계 질환, 암 또는 종양 질환, 감염성 질환 또는 면역 결핍증의 치료를 위해서는 치료 단백질이 사용될 수 있다: Particularly preferred therapeutic proteins that can be used in the treatment of metabolic or endocrine disorders, among others, are intended to treat a subject by replacing their insufficient endogenous production of a functional protein with a sufficient amount, and are therefore understood as therapeutic proteins. Accordingly, such therapeutic proteins are generally mammalian, particularly human proteins. Therapeutic proteins can be used for the treatment of blood disorders, diseases of the circulatory system, diseases of the respiratory system, cancer or neoplastic diseases, infectious diseases or immunodeficiencies:

더욱이, 어쥬번트(adjuvant) 또는 면역 자극 단백질도 치료 단백질이란 용어에 포함된다. 어쥬번트 또는 면역 자극 단백질은 개체 내 면역 반응을 유도, 변형 또는 개선하여 특정 질환을 치료하거나 개체의 상태를 완화하는데 사용될 수 있다. 어쥬번트 단백질은 예를 들어, TLR에 대한 외부 TLR 리간드의 결합 반응으로서(포유동물에서) 선천적 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 인간 단백질 또는 펩티드를 일반적으로 포함하는 포유동물, 특히 인간 어쥬번트 단백질로부터 선택될 수 있다. 와 같은 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 포유동물, 특히 인간 어쥬번트 단백질은 또한 열 충격 단백질, 또는 이와 같은 인간 어쥬번트 단백질 중 임의의 것의 임의의 종 동족체로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다. 포유동물, 특히 인간 어쥬번트 단백질은 또한 선천적 면역 반응을 유도 또는 강화하는 단백질, 를 포함할 수 있다.Moreover, adjuvants or immune stimulatory proteins are also included in the term therapeutic protein. An adjuvant or immune stimulatory protein can be used to treat a particular disease or alleviate a condition in a subject by inducing, modifying or improving the immune response in the subject. An adjuvant protein is a mammalian, in particular human adjuvant protein, which generally includes any human protein or peptide capable of eliciting an innate immune response (in mammals), for example, as a binding response of a foreign TLR ligand to the TLR. can be selected from. It is selected from the group consisting of proteins such as The mammalian, particularly human adjuvant protein may also be selected from the group consisting of a heat shock protein, or any species homolog of any of such human adjuvant proteins. Mammalian, particularly human adjuvant proteins may also include proteins that induce or enhance the innate immune response.

치료 단백질therapeutic protein

혈액 장애, 순환계 질환, 호흡계 질환, 암 또는 종양 질환, 감염성 질환 또는 면역 결핍증 치료를 위한 치료 단백질 또는 어쥬번트 단백질은 일반적으로 치료되어야 할 동물에 따라서 포유동물 기원, 바람직하게는 인간 기원의 단백질이다. 인간 개체는, 예를 들어, 인간 기원의 치료 단백질에 의해 치료되는 것이 바람직하다.Therapeutic proteins or adjuvant proteins for the treatment of blood disorders, diseases of the circulatory system, diseases of the respiratory system, cancer or tumor diseases, infectious diseases or immunodeficiencies are generally proteins of mammalian origin, preferably of human origin, depending on the animal to be treated. A human subject is preferably treated with a therapeutic protein of human origin, for example.

병원성 어쥬번트 단백질은, 일반적으로 (포유동물에서) 선천적 면역 반응을 유도할 수 있는 병원성 어쥬번트 단백질을 포함하며, 더욱 바람직하게는 박테리아, 원생동물, 바이러스 또는 곰팡이 등으로부터 유래된 병원성 어쥬번트 단백질, 예를 들어, 박테리아 (어쥬번트) 단백질, 원생동물 (어쥬번트) 단백질(예를 들어, 톡소플라즈마곤디(Toxoplasma gondii)의 프로필린 유사 단백질), 바이러스 (어쥬번트) 단백질, 또는 곰팡이 (어쥬번트) 단백질 등으로부터 선택되는 병원성 어쥬번트 단백질을 포함한다.Pathogenic adjuvant proteins generally include pathogenic adjuvant proteins capable of inducing an innate immune response (in mammals), more preferably pathogenic adjuvant proteins derived from bacteria, protozoa, viruses or fungi; For example, a bacterial (adjuvant) protein, a protozoan (adjuvant) protein (e.g., a propylin-like protein of Toxoplasma gondii), a viral (adjuvant) protein, or a fungal (adjuvant) and pathogenic adjuvant proteins selected from proteins and the like.

박테리아 (어쥬번트) 단백질은 또한 박테리아 플라젤린(flagellin)을 포함할 수 있다. 원생동물 (어쥬번트) 단백질은 병원성 어쥬번트 단백질의 추가 예이다. 원생동물 (어쥬번트) 단백질은 어쥬번트 특성을 나타내는 임의의 원생동물 단백질로부터 선택될 수 있으며, 바이러스 (어쥬번트) 단백질은 병원성 어쥬번트 단백질의 또 다른 예이다. 바이러스 (어쥬번트) 단백질은 어쥬번트 특성을 나타내는 임의의 바이러스 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 호흡기 합포체 바이러스(Ripiratory Syncytial Virus) 융합 당단백질(F-단백질), MMT 바이러스 유래 외피 단백질(envelope protein), 마우스 백혈병 바이러스 단백질, 야생형 홍역 바이러스의 헤마글루티닌(Hemagglutinin) 단백질 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 곰팡이 (어쥬번트) 단백질도 병원성 어쥬번트 단백질의 추가의 예이다. 본 발명에서, 곰팡이 (어쥬번트) 단백질은 어쥬번트 특성을 나타내는 임의의 곰팡이 단백질로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 곰팡이 면역 조절 단백질(fungal immunomodulatory protein)(FIP; LZ-8) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 마지막으로, 어쥬번트 단백질은 추가로 키홀-림펫 헤모시아닌(keyhole-limpet hemocyanin)(KLH), OspA 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다.Bacterial (adjuvant) proteins may also include bacterial flagellin. Protozoan (adjuvant) proteins are further examples of pathogenic adjuvant proteins. Protozoan (adjuvant) proteins can be selected from any protozoan protein that exhibits adjuvant properties, and viral (adjuvant) proteins are another example of pathogenic adjuvant proteins. The viral (adjuvant) protein can be selected from any viral protein exhibiting adjuvant properties, more preferably, but not limited to, a Respiratory Syncytial Virus Fusion Glycoprotein (F-protein) , MMT virus-derived envelope protein, mouse leukemia virus protein, wild-type measles virus hemagglutinin protein, and the like. Fungal (adjuvant) proteins are further examples of pathogenic adjuvant proteins. In the present invention, the fungal (adjuvant) protein can be selected from any fungal protein exhibiting adjuvant properties, more preferably consisting of fungal immunomodulatory protein (FIP; LZ-8) and the like. can be selected from the group. Finally, the adjuvant protein may further be selected from the group consisting of keyhole-limpet hemocyanin (KLH), OspA and the like.

치료 단백질은 호르몬 대체 치료법, 특히 폐경기 여성의 치료에 사용될 수 있다. 이들 치료 단백질은 오에스테로겐(oitrogens), 프로게스테론 또는 프로게스틴(progitins), 및 종종 테스토스테론으로부터 선택되는 것이 바람직하다.Therapeutic proteins may be used in hormone replacement therapy, particularly in the treatment of postmenopausal women. These therapeutic proteins are preferably selected from oitrogens, progesterone or progitins, and often testosterone.

더욱이, 치료 단백질은 체세포를 다능성(pluripotent) 또는 전능성(omnipotent) 줄기세포로 역분화하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 여러 인자 특히, Oct-3/4, Sox 유전자 군(Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15), Klf 군(Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 군(c-myc, L-myc 및 N-myc), Nanog 및 LIN28이 설명되어 있다.Moreover, therapeutic proteins can be used to dedifferentiate somatic cells into pluripotent or omnipotent stem cells. For this purpose, several factors, in particular Oct-3/4, Sox gene family (Sox1, Sox2, Sox3 and Sox15), Klf family (Klf1, Klf2, Klf4 and Klf5), Myc family (c-myc, L-myc and N-myc), Nanog and LIN28 are described.

치료 항체도 치료 단백질로서 본원에 정의되어 있다. 이들 치료 항체는 그 중에서도 암 또는 종양 질환의 치료에 사용되는 항체, 그 중에서도 혈액 장애의 치료에 사용되는 항체, 그 중에서도 면역 조절에 사용되는 항체, 당뇨병 치료에 사용되는 항체, 알츠하이머 질환 치료에 사용되는 항체, 천식 치료에 사용되는 항체를 포함할 수 있다, A therapeutic antibody is also defined herein as a therapeutic protein. These therapeutic antibodies include, inter alia, antibodies used in the treatment of cancer or neoplastic diseases, inter alia antibodies used in the treatment of hematological disorders, inter alia antibodies used in immunomodulation, antibodies used in the treatment of diabetes, antibodies used in the treatment of Alzheimer's disease, among others. antibodies, antibodies used to treat asthma,

본 발명에 따른 mRNAi의 코딩 영역은 모노-, 디-, 또는 심지어 멀티시스트론 RNA, 즉, 1, 2 또는 그 이상의 단백질 또는 펩타이드의 코딩 서열을 운반하는 RNA로서 발생할 수 있다. 이와 같은 디-, 또는 심지어 멀티시스트론 RNA 내 코딩 서열은 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 적어도 하나의 내부 리보솜 도입 위치(IRES) 또는 여러 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드의 절단을 유도하는 신호 펩타이드에 의해 분리될 수 있다.The coding region of an mRNAi according to the present invention may occur as a mono-, di-, or even multicistronic RNA, i.e. an RNA carrying the coding sequence of one, two or more proteins or peptides. Coding sequences in such di-, or even multicistronic RNAs, can induce cleavage of a polypeptide comprising, for example, at least one internal ribosome entry site (IRES) or several proteins or peptides as described herein. can be separated by a signal peptide.

유전체 편집genome editing

유전체 편집(Genome editing) 또는 조작된 핵산분해효소를 이용한 유전체 편집(Genome editing with engineered nuclease)은 인공적으로 조작된 핵산분해효소 혹은 유전자 가위를 이용해 유전체로부터 DNA가 삽입, 대체 혹은 결실되는 유전 공학의 일종이다. 핵산분해효소는 유전체 상의 원하는 위치에 특정한 이중가닥절단(Double-stranded break, DSB)을 일으키게 되고, 그 절단은 세포의 자체적인 기작에 의해 상동재조합(Homologous Recombination, HR) 또는 비상동말단연결(Non-homologous end joining, NHEJ)의 방식으로 수선된다. 최근 주로 이용되고 있는 조작된 핵산분해효소는 ZFNs (Zinc Finger Nucleases), TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases), CRISPR/Cas system, 그리고 메가핵산분해효소(meganucleases) 등 크게 4가지가 있다. Genome editing or genome editing with engineered nuclease is a type of genetic engineering in which DNA is inserted, replaced, or deleted from the genome using an artificially engineered nuclease or gene scissors. am. The nuclease causes a specific double-stranded break (DSB) at a desired location on the genome, and the break is homologous recombination (HR) or non-homologous end connection (Non -Homologous end joining (NHEJ) method. There are four types of engineered nucleases that have been mainly used recently: ZFNs (Zinc Finger Nucleases), TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases), CRISPR/Cas system, and meganucleases.

효율적인 유전체 편집은 때로는 임상적 흥미를 넘어서 식물에서 동물에 이르기까지 다양한 범위에서 발전하고 있다. 유전체 편집은 연구실에서의 표준 실험 전략으로 자리 잡고 있다. 최근 만들어진 ZFN-매개의 쥐 (Rat), 제브라 다니오 (Zebrafish), 옥수수 그리고 담배 (Tobacco) 유래 변이체들은 그 중요성이 입증되고 있고, 관련한 연구가 빠르게 이루어지고 있다.Efficient genome editing is advancing in a diverse range from plants to animals, sometimes beyond clinical interest. Genome editing is becoming a standard experimental strategy in the laboratory. Recently created ZFN-mediated rat, zebrafish, corn and tobacco (Tobacco) variants are demonstrating their importance, and related studies are being rapidly conducted.

조작된 핵산분해효소를 이용한 유전체 편집은 식물이나 동물의 유전자 기능 연구에서 인간의 유전자 치료에 이르기까지 생명과학의 많은 분야에 기여할 것으로 기대된다. 예를 들어, 고유 기능을 하도록 세포나 유기체를 조작하는 것을 목적으로 하는 합성 생물학 (synthetic biology) 분야에서 조작된 핵산분해효소는 유전인자의 첨가나 제거에 이용될 수 있다. 이는 나아가 복잡한 시스템을 만드는 데 기여할 수 있다. 더불어, 조작된 핵산분해효소를 이용하여 줄기세포를 이용한 유전자 기능 연구도 가능하다.Genome editing using engineered nucleases is expected to contribute to many fields of life science, from research on gene function in plants and animals to gene therapy in humans. For example, in the field of synthetic biology, where the goal is to engineer cells or organisms to perform their own functions, engineered nucleases can be used to add or remove genetic elements. This can further contribute to creating complex systems. In addition, it is possible to study gene function using stem cells using engineered nucleases.

미래에는 유전체 편집에 있어서 핵산분해효소의 안전성과 특이성을 높이기 위한 노력이 주를 이룰 것이다. 예를 들어, 원하지 않는 부분에 교정이 일어나는 Off-target 현상을 확인할 수 있는 능력이 높아진다면, 우리는 그것을 막을 수 있는 방법을 고안해낼 수 있을 것이다. 뿐만 아니라, ZFNs에 이용되는 zinc-fingers는 특이성이 높지 않기 때문에 세포 독성이 있을 수 있다. 그러나, 절단을 위한 서열을 일부 변형하여 특이성을 높여줌으로서 독성을 줄일 수 있다. 미래에는, 2차 타겟을 구별해낼 수 있는 방식이 개발되어 ZFNs를 발현하는 세포로부터 부서진 말단을 인식해내고, 고해상도 염기서열분석을 이용해 그 주변 DNA 서열을 분석해낼 수 있게 될 것으로 전망한다.In the future, efforts will be made to increase the safety and specificity of nucleases in genome editing. For example, if the ability to identify the off-target phenomenon where correction occurs in an unwanted part increases, we will be able to devise a way to prevent it. In addition, zinc-fingers used for ZFNs may be cytotoxic because they do not have high specificity. However, toxicity can be reduced by partially modifying the sequence for cleavage to increase specificity. In the future, it is envisaged that methods capable of discriminating secondary targets may be developed to recognize broken ends from cells expressing ZFNs and analyze the DNA sequences surrounding them using high-resolution sequencing.

유전체 편집은 인위적인 유전자 조작 뿐만 아니라 자연스러운 과정으로서도 일어난다. 바이러스 또는 바이러스의 일부를 이루는 RNA 매개체는 유전암호를 편집할 수 있는 능력이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, 원하는 변이를 얻을 수 있는 확률은 매우 낮다는 것을 염두에 두어야 한다. 예를 들어, 누군가 세포가 NHEJ에 의한 변이를 만들고자 계획 하였을지라도, 세포는 이중가닥절단을 수선하기 위해 HR을 채택할 수 있는 것이다.Genome editing occurs as a natural process as well as artificial gene manipulation. Viruses, or RNA vectors that form part of viruses, are known to have the ability to edit the genetic code. However, it should be borne in mind that the probability of obtaining the desired mutation is very low. For example, even if someone planned for a cell to make a mutation by NHEJ, the cell could adopt HR to repair the double-strand break.

본 발명의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 유전체 폅집에 적용할 수 있다. 즉, 레플리콘 카세트에 CRISPR/Cas system를 탑재하여 유전체 편집을 구현할 수도 있다. The self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention can be applied to genomic replication. That is, genome editing can be implemented by loading the CRISPR/Cas system on the replicon cassette.

RNA 간섭RNA interference

siRNA(small interfering RNA, siRNA)는 RNA 간섭(RNAi;RNA interference)에 관여한다. siRNA는 특정 단백질의 생산을 억제함으로써 유전자 발현을 방해한다. 21 ~ 23개의 뉴클레오티드로 구성된 siRNA는 특정 전령 RNA(mRNA)가 이중가닥 RNA(double-stranded RNA)를 형성하도록 mRNA의 상보적인 순서에 맞춰 염기쌍을 형성한다. 그 다음 이러한 이중가닥RNA는 세포로부터 전령 RNA를 제거함과 동시에 특수하게 분해된다.Small interfering RNA (siRNA) is involved in RNA interference (RNAi). siRNAs interfere with gene expression by inhibiting the production of specific proteins. siRNA consisting of 21 to 23 nucleotides forms base pairs in the complementary sequence of mRNA to form a specific messenger RNA (mRNA) to form a double-stranded RNA. These double-stranded RNAs are then specifically degraded, simultaneously removing the messenger RNA from the cell.

shRNA(short hairpin RNA)는 단단한 헤어핀 턴 RNA에 의해 침묵 표적 유전자 발현을 할 수 있는 RNA 간섭 (RNAi)이다. 세포에서 shRNA의 발현은 일반적으로 플라스미드의 전달 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 수행된다. shRNA는 상대적으로 분해 및 회전율이 낮다는 점에서 RNAi의 유리한 매개체이다. 그러나 의약 응용 분야에서 부작용을 일으킬 가능성이 있는 발현 벡터의 사용이 필요하다. Short hairpin RNA (shRNA) is an RNA interference (RNAi) capable of silencing target gene expression by tight hairpin turn RNA. Expression of shRNAs in cells is usually accomplished through delivery of plasmids or viral or bacterial vectors. shRNAs are advantageous mediators of RNAi due to their relatively low rates of degradation and turnover. However, pharmaceutical applications require the use of expression vectors that have the potential to cause side effects.

프로모터의 선택은 강력한 shRNA를 발현을 달성하기 위해 필수적이다. 처음에는 U6 및 H1과 같은 중합효소 III 프로모터가 사용되었다. 그러나 이러한 프로모터는 공간 및 시간 제어가 부족하다. 이와 같이 shRNA 발현을 조절하기 위해 중합효소 II 프로모터를 사용하는 방향으로 변화하고 있다.Promoter selection is essential to achieve robust shRNA expression. Initially, polymerase III promoters such as U6 and H1 were used. However, these promoters lack spatial and temporal control. As such, there is a shift toward using the polymerase II promoter to control shRNA expression.

세포에서 shRNA의 발현은 플라스미드의 전달 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터를 통해 얻을 수 있다. shRNA 발현을 얻기 위해 형질감염을 통해 세포에 플라스미드를 전달하는 것은 시험관 내에서 시판되는 시약을 사용하여 수행할 수 있다. 그러나 이 방법은 생체 내에서 적용할 수 없어 유용성이 제한된다.Expression of shRNAs in cells can be achieved through delivery of plasmids or viral or bacterial vectors. Delivery of plasmids to cells via transfection to obtain shRNA expression can be performed in vitro using commercially available reagents. However, this method cannot be applied in vivo, limiting its usefulness.

shRNA 기반 치료제는 몇 가지 문제에 직면하였다. 가장 중요한 과제는 운반이다. shRNA는 일반적으로 벡터를 사용하여 전달되며 일반적으로 효율적이지만 상당한 안전성 문제가 있다. 특히, 바이러스 기반 유전자 치료 접근법은 과거 임상 시험에서 위험한 것으로 판명되었다. 레트로 바이러스 유전자 요법의 1세대에서 Wiskott-Aldrich 증후군에 대한 바이러스 벡터로 치료받은 일부 환자에서 급성 T 세포 백혈병이 발생하였다. 이는 바이러스 벡터 삽입 위치에 의한 것으로 판단된다. RISC의 잠재적인 과포화도 문제도 있다. shRNA가 너무 높은 수준으로 발현되면 세포가 내인성 RNA를 올바르게 처리하지 못해 심각한 문제를 일으킬 수 있다. 또 다른 문제는 환자가 치료에 대한 면역 반응을 일으킬 가능성이 있다. 마지막으로, OFF-Target 효과가 있을 수 있어 shRNA를 다른 의도하지 않은 유전자를 침묵 수 있다. 성공적인 새로운 shRNA 기반 치료제를 개발하려면 이러한 모든 문제를 고려해야 한다.shRNA-based therapeutics face several challenges. The most important task is transport. shRNAs are usually delivered using vectors and are generally efficient but present significant safety concerns. In particular, virus-based gene therapy approaches have proven risky in past clinical trials. In the first generation of retroviral gene therapy, some patients treated with viral vectors for Wiskott-Aldrich syndrome developed acute T-cell leukemia. This is determined to be due to the location of viral vector insertion. Potential oversaturation of RISCs is also an issue. When shRNAs are expressed at too high a level, cells cannot properly process the endogenous RNA, which can cause serious problems. Another problem is the possibility that the patient will develop an immune response to the treatment. Finally, there may be an OFF-target effect, allowing shRNAs to silence other unintended genes. All of these issues must be considered to develop successful new shRNA-based therapeutics.

본 발명의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 이러 문제점을 극복할 수단으로 RNA 간섭을 적용할 수 있다. 즉, 레플리콘 카세트에 shRNA를 탑재하여 구현하는 것이다. The self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention can apply RNA interference as a means to overcome these problems. That is, it is implemented by loading shRNA on a replicon cassette.

4. DNA 카세트 운반체4. DNA Cassette Carrier

본 발명에서 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 DNA 카세트 운반체를 위한 기본 요건은 적절한 클로닝 벡터, 즉 운반될 때 DNA 카세트를 운반하는 매개체 역할을 하고 일반적으로 박테리아인 숙주 세포에서 증폭 및 숙주세포인 관심세포로 수송 및 증폭하는 DNA 분자의 선택이다. 다양한 천연 레플리콘은 복제 벡터로 작용할 수 있는 특성을 나타내지만, 벡터는 또한 DNA 카세트의 전달, 유지 및 증폭을 위한 효율적인 에이전트로 기능하기 위한 특정 최소 자격을 갖도록 설계해야 한다.In the present invention, the basic requirement for the DNA cassette carrier of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system is an appropriate cloning vector, i.e., which serves as a vehicle for transporting the DNA cassette when transported and amplifies in a host cell, which is usually a bacteria, and which is the host cell of interest. It is a selection of DNA molecules that are transported into cells and amplified. A variety of natural replicons exhibit properties that allow them to act as replication vectors, but vectors must also be designed to have certain minimum qualifications to function as efficient agents for the delivery, maintenance, and amplification of DNA cassettes.

이상적인 DNA 카세트 운반체는 다음 네 가지 속성을 보유해야 한다.An ideal DNA cassette carrier should possess the following four properties.

(1) 저분자량(1) low molecular weight

(2) 숙주 세포에 쉽게 선택 가능한 표현형 형질을 부여하는 능력(2) the ability to confer readily selectable phenotypic traits to host cells;

(3) 바람직한 관심 단백질을 갖는 유전자들의 클로닝을 위한 다수의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 있는 Multicloning site (3) Multicloning site with multiple restriction endonuclease cleavage sites for cloning of genes with desired proteins of interest

(4) 숙주 세포 내에서 복제하는 능력으로 DNA 카세트의 수많은 사본이 생성되어 딸 세포로 전달될 수 있어야 한다.(4) the ability to replicate within the host cell so that numerous copies of the DNA cassette can be generated and passed on to daughter cells;

본 발명에서 사용 가능한 DNA 카세트 운반체로 자연 발생 또는 인공적으로 구축된 벡터의 예는 대장균 플라스미드, 박테리오파지(λ, M13, P1), 바이러스(동물 바이러스-레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 등; 곤충 바이러스 - 배큘로 바이러스, 식물 바이러스 - 콜리플라워 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 쌍둥이자리 바이러스 등), 아그로박테리움 투메파시엔스 기반 벡터, 키메라 플라스미드(코스미드, 파지미드, 파스미드 및 포스미드), 인공 염색체(YAC, BAC, PAC, MAC 및 HAC) 및 비 대장균 벡터(예: 바실러스 및 슈도모나스 벡터 등) 기반 벡터가 포함될 수 있다. Examples of naturally occurring or artificially constructed vectors as DNA cassette carriers usable in the present invention include Escherichia coli plasmids, bacteriophages (λ, M13, P1), viruses (animal virus-retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus , vaccinia virus, etc.; insect viruses - baculovirus, plant viruses - cauliflower mosaic virus, potato virus X, Gemini virus, etc.), Agrobacterium tumefaciens-based vectors, chimeric plasmids (cosmids, phagemids, phasmids, etc.) mids and fosmids), vectors based on artificial chromosomes (YAC, BAC, PAC, MAC and HAC) and non-E. coli vectors (eg, Bacillus and Pseudomonas vectors, etc.).

표 1은 다양한 유형의 벡터에서 가능한 삽입 크기를 제시하고 있다.Table 1 presents possible insert sizes for different types of vectors.

다양한 클로닝 벡터에서 최대 삽입 DNA 크기Maximum insert DNA size in various cloning vectors VectorVector HostHost Insert sizeInsert size PlasmidPlasmid E.coliE. coli 5-25 kb5-25 kb λ phageλ phages E.coliE. coli 35-45 kb35-45 kb P1 phageP1 phages E.coliE. coli 70-100 kb70-100 kb PAC_s PAC _s E.coliE. coli 100-300kb100-300 kb BAC_s BAC _s E.coliE. coli <300 kb<300 kb YAC_s YAC _s Saccharomyces cerevisaeSaccharomyces cerevisae 200-2000kb200-2000 kb Human Artificial Chromosomes (HACs)Human Artificial Chromosomes (HACs) Cultured Human CellsCultured Human Cells >2000kb>2000kb

본 발명에서 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 DNA 카세트 운반체를 위한 벡터 선택을 결정하려면 다음과 같은 다양한 요인을 고려해야 한다.To determine the vector selection for the DNA cassette carrier of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system in the present invention, the following various factors should be considered.

(1) DNA 카세트 크기: DNA 카세트 크기는 플라스미드 벡터의 경우 5~25kb에서 HAC의 경우 >2,000kb까지 다양한 벡터 유형에 따라 다를 수 있다.(1) DNA cassette size: DNA cassette size can vary for different vector types, from 5-25 kb for plasmid vectors to >2,000 kb for HACs.

(2) 벡터 크기: 벡터 크기 범위는 5kb 플라스미드 벡터에서 6-10 메가베이스 HAC 고용량 벡터까지 다양하다.(2) Vector size: Vector sizes range from 5 kb plasmid vectors to 6-10 megabase HAC high-capacity vectors.

(3) 제한효소의 절단부위: 벡터에서 발견되는 제한효소 절단부위의 수는 매우 다양하다. 작은 플라스미드 벡터에는 절단부위가 몇 개 있을 수 있지만 벡터에 여러 복제 부위를 삽입하면 제한효소의 절단부위가 증가할 수 있다.(3) Restriction enzyme cleavage sites: The number of restriction enzyme cleavage sites found in vectors varies greatly. Small plasmid vectors may have a few cleavage sites, but inserting multiple replication sites into the vector can increase the cleavage sites of the restriction enzyme.

(4) Copy number: 클로닝 벡터는 플라스미드의 레플리콘에 따라 다른 카피 수로 유지된다. 높은 복사 수 벡터가 바람직하다. 낮은 복제 수의 플라스미드 pBR322에서 파생된 복제의 기점을 갖는 발현 벡터는 25-50 복제/세포 또는 고카피 수 플라스미드 pUC에서 유래된 경우 150 내지 200개/세포범위에 있을 수 있는 벡터 복제 수를 결정한다.(4) Copy number: Cloning vectors are maintained at different copy numbers depending on the replicon of the plasmid. High copy number vectors are preferred. Expression vectors with an origin of replication derived from the low copy number plasmid pBR322 determine the vector copy number which can range from 25-50 copies/cell or 150 to 200 copies/cell if derived from the high copy number plasmid pUC. .

(5) 클로닝 효율: 벡터에 삽입된 DNA 카세트를 클로닝하는 능력을 벡터의 클로닝 효율에 의해 결정된다.(5) Cloning efficiency: The ability to clone a DNA cassette inserted into a vector is determined by the vector's cloning efficiency.

(6) DNA 카세트의 관심 단백질 스크리닝 능력: 재조합체 선택의 경우, 비재조합체와 구별하기 위해 특정 선택 가능한 마커가 벡터에 존재해야 한다.(6) Ability of the DNA cassette to screen the protein of interest: In the case of recombinant selection, a specific selectable marker must be present in the vector to distinguish it from non-recombinant.

(7) 관심단백질의 평가 등의 다운스트림 실험의 유형을 고려해야 한다.(7) The type of downstream experiments, such as evaluation of the protein of interest, should be considered.

본 발명에서 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 DNA 카세트의 효율적인 보유 및 장기 발현은 *?**?*주요 목표이지만 많은 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 가장 큰 장애물이다. 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템에 사용할 벡터의 선택은 시간이 지남에 따라 유전자 발현 및 유지 수준에 크게 영향을 미치기 때문에 매우 중요하다. 벡터는 숙주 게놈에 통합되거나 염색체외 개체로 핵에 지속되는 능력으로 두 가지 범주로 나눌 수 있다. Efficient retention and long-term expression of the DNA cassette of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system in the present invention is a major goal, but the biggest obstacle for many self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression systems. The choice of vector to use in a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system is very important as it greatly affects the level of gene expression and maintenance over time. Vectors can be divided into two categories by their ability to integrate into the host genome or to persist in the nucleus as extrachromosomal entities.

외래 관심유전자의 통합은 관심유전자와 숙주 게놈 모두에 중요한 결과를 초래할 수 있다. 통합 벡터는 선택이 없는 상태에서 장기간 유지를 보장하기 때문에 유전자 치료에 널리 사용되었다. 그러나 관심 유전자의 통제되지 않은 통합은 삽입이 응축된 상태에서 발생하는 경우 관심유전자 침묵의 원치 않는 효과를 유발할 수 있다. 이질염색질, 또는 성장 촉진 유전자 근처에서 통합 이벤트가 발생할 때 숙주 유전자 파괴 및 삽입 돌연변이 유발, 이는 종양 발생으로 이어질 수 있다. Integration of a foreign gene of interest can have important consequences for both the gene of interest and the host genome. Integrative vectors have been widely used in gene therapy because they ensure long-term maintenance in the absence of selection. However, uncontrolled integration of the gene of interest can lead to unwanted effects of silencing the gene of interest if the insertion occurs in a condensed state. When integration events occur in heterochromatin, or near growth-promoting genes, they cause host gene disruption and insertional mutagenesis, which can lead to oncogenesis.

에피솜 벡터는 염색체외 상태로 핵에 유지함으로써 벡터를 통합하는 것보다 몇 가지 이점을 제공한다. 첫째, 삽입된 관심 유전자는 방해를 받거나 규제적 제약을 받지 않는다. 둘째, 벡터 통합에 의한 게놈의 물리적 파괴가 방지되기 때문에 에피솜 벡터의 사용은 세포 형질전환으로 이어지지 않을 것이다. 또한, 에피솜 벡터는 세포당 여러 사본으로 유지되어 관심 유전자의 높은 발현을 할 수 있다. 안정된 형질 전환 절차에서, 에피솜 벡터의 사용은 종래 nonepisomal 플라스미드 벡터보다 높은 형질 전환 효율로 일어나며 매우 낮은 빈도로 숙주 게놈 내로 통합된다. 마지막으로, extrachromosomal 벡터의 높은 삽입 용량은 전체 게놈 DNA 유전자좌의 전달을 허용하며, 이는 생리학적 수준의 이식유전자 발현을 달성하는 탁월한 방법으로 입증되었다. 염색체외 구조의 장점으로 인해 유전자 치료 모델 및 전임상 연구를 위한 이러한 벡터에 대한 인식이 높아졌다.Episomal vectors offer several advantages over integrating vectors by retaining them in the nucleus in an extrachromosomal state. First, the inserted gene of interest is not hindered or subjected to regulatory constraints. Second, the use of episomal vectors will not lead to cell transformation because physical destruction of the genome by vector integration is prevented. Additionally, episomal vectors can be maintained in multiple copies per cell to allow for high expression of the gene of interest. In a stable transformation procedure, the use of episomal vectors results in higher transformation efficiencies than conventional nonepisomal plasmid vectors and integrates into the host genome at a very low frequency. Finally, the high insertion capacity of extrachromosomal vectors allows delivery of the whole genomic DNA locus, which has proven to be an excellent method to achieve physiological levels of transgene expression. The advantages of extrachromosomal structures have increased awareness of these vectors for gene therapy models and preclinical studies.

자가 복제 바이러스 기반 벡터는 포유동물 세포에서 장기간 에피솜 지속성을 가질 수 있다. 이 벡터는 (1) Epstein-Barr 바이러스(EBV; oriP/EBNA1 바이러스 요소); (2) 소 유두종 바이러스(BPV-1; ori 요소); (3) 효모(YAC) 또는 인간 염색체(HAC)의 게놈 구성요소; 및 (4) oriP/EBNA1 기반 pLIB 또는 포유동물 인공 에피솜 염색체(MAEC)에서 조작된 키메라 바이러스/게놈 시스템 등이다. 그러나 에피솜 벡터는 인간 유전자 치료에 사용하는 것이 고려되고 있다. 이 중에서 EBV 기반 벡터는 몇 가지 뚜렷한 장점을 가질 수 있다.Self-replicating virus-based vectors are capable of long-term episomal persistence in mammalian cells. These vectors include (1) Epstein-Barr virus (EBV; oriP/EBNA1 viral element); (2) bovine papillomavirus (BPV-1; ori element); (3) genomic components of yeast (YAC) or human chromosomes (HAC); and (4) oriP/EBNA1-based pLIBs or chimeric virus/genomic systems engineered in mammalian artificial episomal chromosomes (MAECs). However, episomal vectors are being considered for use in human gene therapy. Among these, EBV-based vectors can have several distinct advantages.

DNA 카세트 벡터을 위해 고려 중인 다양한 비복제 및 자가 복제 바이러스 기반 벡터 전달 시스템이 있다. 비복제 벡터는 염색체 통합이 필요하지만 자가 복제 벡터는 염색체 외에서 유지된다. 현재 유전자치료 임상시험에 사용되는 벡터는 대부분 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노관련바이러스의 필수성분에서 생성된 non-replicating type이다. 이러한 벡터는 큰 가능성을 보여주지만 한계가 있다. There are a variety of non-replicating and self-replicating virus-based vector delivery systems under consideration for DNA cassette vectors. Non-replicating vectors require chromosomal integration whereas self-replicating vectors are maintained extrachromosomally. Most of the vectors currently used in gene therapy clinical trials are non-replicating types created from essential components of retroviruses, adenoviruses, or adeno-associated viruses. These vectors show great promise, but have limitations.

EBV는 172kb 이중 가닥 DNA 게놈을 가진 인간 감마헤르페스바이러스로, 다른 조직에서 검출되었지만 B-림프구와 일부 상피 세포를 우선적으로 감염시킨다. EBV의 확립에는 두 가지 바이러스 암호화 구성 요소, 즉 복제의 잠재 기점(oriP)과 트랜스 활성화 단백질(EBNA1)이 필요하다. 세계 성인 인구의 약 90%가 무증상 EBV 감염에 감염된 것으로 추정된다. EBV is a human gamma herpesvirus with a 172 kb double-stranded DNA genome that preferentially infects B-lymphocytes and some epithelial cells, although it has been detected in other tissues. Establishment of EBV requires two viral coding components: a latent origin of replication (oriP) and a transactivation protein (EBNA1). It is estimated that about 90% of the world's adult population is infected with asymptomatic EBV infection.

EBV 복제는 완전히 이해되지 않은 일부 숙주 및 바이러스 요인의 제어 하에 있다. EBNA1은 딸 세포에 대한 EBV DNA 에피솜의 복제 및 유사분열 분리에서 핵심적인 역할을 한다. EBNA1-매개 S-상 에피솜 복제는 EBV 게놈 복제 기원(oriP)에 대한 EBNA1의 결합에 의존한다. 바이러스는 절대 세포 내 기생충이며 복제 주기는 일부 숙주 세포 요인에 따라 다르다. 예를 들어, 일부 연구에서는 세포 기원 인식 복합체(ORC)와 미니염색체 유지(MCM) 복합체가 oriP의 DS 요소와 관련이 있다고 제안했으며, 이는 EBV DNA 복제의 시작에 관련되어 있다.EBV replication is under the control of several host and viral factors that are not fully understood. EBNA1 plays a key role in replication and mitotic segregation of EBV DNA episomes to daughter cells. EBNA1-mediated S-phase episomal replication is dependent on binding of EBNA1 to the EBV genome origin of replication (oriP). Viruses are obligate intracellular parasites and their cycle of replication depends on some host cell factors. For example, some studies have suggested that the cell origin recognition complex (ORC) and minichromosome maintenance (MCM) complexes are related to the DS element of oriP, which is implicated in the initiation of EBV DNA replication.

조작된 EBV 기반 oriP/EBNA1 벡터는 다중 복사 에피솜으로 표적 세포의 핵에 지속된다. 그들은 중단될 수 없거나 염색체 통합으로 인해 발생하는 규제적 제약을 받을 수 없는 관심 유전자를 삽입할 수 있다. 또한 돌연변이율이 10 미만이다. 재배열하지 않는 경향이 있다. EBV 기반 벡터를 사용하면 염색체 통합 플라스미드를 사용하는 것보다 형질감염 효율이 더 높은 것으로 나타났다. 마지막으로, EBV 기반 벡터는 진핵 세포와 원핵 세포 사이를 왕복하도록 설계되어 DNA의 매우 큰 게놈 단편을 전달할 수 있다. 역사적으로 EBV 감염은 햄스터와 마우스 세포에서 복제에 실패한 영장류 세포에만 국한된 것으로 나타난다. The engineered EBV-based oriP/EBNA1 vector persists in the nucleus of target cells as a multicopy episome. They can insert genes of interest that cannot be disrupted or cannot be subject to the regulatory constraints that arise due to chromosomal integration. Also, the mutation rate is less than 10. They tend not to rearrange. The use of EBV-based vectors showed higher transfection efficiency than the use of chromosome-integrating plasmids. Finally, EBV-based vectors are designed to shuttle between eukaryotic and prokaryotic cells and can deliver very large genomic fragments of DNA. Historically, EBV infection appears to be confined to primate cells where it fails to replicate in hamster and mouse cells.

DNA 카세트 벡터의 개발은 주로 유전자 치료 벡터의 안전성 문제, 특히 삽입 돌연변이 유발 문제를 해결할 필요성에 의해 주도되었으며 자가 복제 안정 에피솜, 항생제가 없는 pFAR 플라스미드와 같은 벡터와 저항 마커 및 박테리아 백본이 없는 미니서클 DNA 플라스미드 유도체를 포함한다. 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR)의 존재는 또한 통합-결핍 렌티바이러스, 에피솜 벡터에 장기간 유사분열 안정성을 부여한다. The development of DNA cassette vectors has been primarily driven by the need to address the safety issues of gene therapy vectors, especially insertional mutagenesis, and vectors such as self-replicating stable episomes, antibiotic-free pFAR plasmids, and minicircles without resistance markers and bacterial backbones have been developed. Includes DNA plasmid derivatives. The presence of a scaffold/matrix attachment region (S/MAR) also confers long-term mitotic stability to integration-deficient lentiviral, episomal vectors.

에피솜 벡터 개발의 주요 문제는 현재 숙주 핵, 관심유전자 발현 및 전구 세포에서의 전달이다. 프로토타입 에피솜 벡터 pEPI-1는 바이러스 단백질을 코딩하지 않으며 벡터의 핵 보유를 촉진하는 요소인 인간 β-인터페론 유전자의 5' 말단에서 S/MAR을 포함한다.A major challenge in developing episomal vectors is present delivery in the host nucleus, expression of the gene of interest, and progenitor cells. The prototype episomal vector pEPI-1 does not encode a viral protein and contains a S/MAR at the 5' end of the human β-interferon gene, an element that facilitates nuclear retention of the vector.

S/MAR(Scaffold/matrix-associated regions)은 염색질 경계 형성에서 역할을 하고 SAF-A 단백질에 결합하는 AT가 풍부한 염색체 요소로서 pEPI-1 플라스미드가 핵 기질에 묶이는 것을 매개한다. 그 기능을 발휘하기 위해 S/MAR을 위한 전제 조건은 전사되어야한다. pEPI-1의 S/MAR은 pCMV-GFP-S/MAR 전사 카세트의 일부로, GFP 리포터 유전자가 포함된 pCMV(사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터)에 의해 구동되어 전사가 S/MAR로 진행된다. pEPI-1은 세포당 2~12개의 에피솜으로 낮은 복제 수로 유지된다. SV40 기원이 없는 경우에도 DNA을 따라 많은, 아마도 무작위의 사이트에서 복제 기계의 요소를 조립하여 세포 DNA와 동기적으로 세포 주기당 한 번 복제한다.Scaffold/matrix-associated regions (S/MARs) are AT-rich chromosomal elements that play a role in chromatin boundary formation and bind to the SAF-A protein, mediating pEPI-1 plasmid binding to the nuclear matrix. Prerequisites for S/MAR to exert its function must be transcribed. The S/MAR of pEPI-1 is part of the pCMV-GFP-S/MAR transcription cassette, driven by pCMV (cytomegalovirus immediate early promoter) containing a GFP reporter gene, leading to transcription to S/MAR. pEPI-1 is maintained at a low copy number with 2-12 episomes per cell. Even in the absence of an SV40 origin, it replicates once per cell cycle synchronously with cellular DNA by assembling elements of the replication machinery at many, presumably random sites along the DNA.

본 발명의 DNA 카세트는 DNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 인식될 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 이것은 생체내 또는 시험관내에서 코딩된 RNA, 예를 들어 본 발명의 RNA의 전사를 허용한다. The DNA cassette of the present invention may include a promoter that can be recognized by DNA-dependent RNA polymerase. This allows transcription of the encoded RNA, eg the RNA of the invention, either in vivo or in vitro.

일반적으로 프로모터는 전사를 조절할 대상이 되는 유전자의 유전정보를 지니고 있는 DNA염기서열 앞부분에 위치한다. 진핵생물에서는 전사조절인자(transcription factor)라고 하는 단백질들이 프로모터부분에 결합함으로써 RNA중합효소를 이곳으로 이끌고 오는 일에 관여한다. 프로모터는 이러한 전사조절인자들이 결합하는 모든 DNA염기서열부위를 지칭한다고도 할 수 있다. 그에 비해 원핵생물에서의 프로모터는 대개 DdRp가 결합하는 전사시작지점(Transcription Start Site) 바로 근처의 결합부위로 정의된다. 전사를 조절하는 DNA염기서열은 프로모터 외에도 인핸서(enhancer)가 존재하나 프로모터가 전사시작지점으로부터 바로 앞쪽으로 수백 염기쌍(base pair) 이내에 위치하는데 비해 인핸서는 프로모터로부터 수천 염기쌍 이상 떨어져 있다는 점에서 구별될 수 있다.In general, a promoter is located at the front of a DNA nucleotide sequence that contains the genetic information of a gene to be controlled for transcription. In eukaryotes, proteins called transcription factors are involved in bringing RNA polymerase to this site by binding to the promoter region. A promoter can also refer to all DNA base sequence sites to which these transcriptional regulators bind. In contrast, the promoter in prokaryotes is usually defined as a binding site immediately adjacent to the transcription start site where DdRp binds. DNA nucleotide sequences that regulate transcription include enhancers in addition to promoters, but they can be distinguished in that promoters are located within hundreds of base pairs immediately ahead of the transcription start point, whereas enhancers are more than thousands of base pairs away from promoters. there is.

홀로엔자임은 때때로 진핵 RNAP를 지칭하는 데 사용되지만, 이 경우에는 박테리아 '핵심' 효소와 비슷한 것을 의미하며 프로모터에서 전사할 수 없다. 그러나 박테리아 핵심 효소와 달리 진핵 세포 전체 효소는 RNA의 전사 또는 처리와 관련된 많은 다른 단백질을 포함할 수 있다. Holoenzymes are sometimes used to refer to eukaryotic RNAPs, but in this case they mean something similar to bacterial 'core' enzymes and cannot be transcribed from a promoter. However, unlike bacterial core enzymes, eukaryotic whole enzymes may involve many other proteins involved in the transcription or processing of RNA.

상기 프로모터의 예로는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터, SV40 프로모터, EF-1α 프로모터 등과 같이 동물 세포에서 발현이 확인된 여러 종류의 바이러스 프로모터들을 사용할 수 있다. 바람직하게는, CMV 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터로 식물세포를 형질전환하고자 하는 경우에는 식물 세포에서 강력한 활성을 나타내는 프로모터를 사용할 수 있다. 상기 프로모터의 예로는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(Cauliflower mosaic virus 35S promoter) 등이 있다.As examples of the promoter, various types of viral promoters whose expression has been confirmed in animal cells, such as a cytomegalovirus (CMV) promoter, a SV40 promoter, and an EF-1α promoter, may be used. Preferably, the CMV promoter can be used. In addition, when plant cells are to be transformed with the vector of the present invention, a promoter showing strong activity in plant cells can be used. Examples of the promoter include a cauliflower mosaic virus 35S promoter and the like.

5. 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템5. Self-amplifying mRNA/DNA Hybrid Expression System

본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 또 다른 이점은 핵 전사로부터의 독립성 및 전례없는 자유로운 설계를 제공하는 별개의 RNA와 DNA 분자의 조합으로 중요한 자가 증폭 및 단백질 합성 도구의 존재를 제조할 수 있다. 서로 조합할 수 있는 다목적 요소를 고려하여, 본 발명자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 원하는 수준의 RNA 증폭과 원하는 수준의 관심 단백질 생산 등에 대한 RdRp 발현을 최적화할 수 있게 한다. RdRp에 의해 트랜스로 복제될 수 있는 레플리콘 카세트는 독립적으로 설계될 수 있다.Another advantage of the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention is the independence from nuclear transcription and the combination of distinct RNA and DNA molecules that provide unprecedented design freedom, making the existence of an important self-amplifying and protein synthesis tool possible. can Considering the versatile elements that can be combined with each other, the present inventors' amplification mRNA/DNA hybrid expression system enables the optimization of RdRp expression for desired levels of RNA amplification and desired levels of protein of interest production, etc. Replicon cassettes that can be cloned in trans by RdRp can be independently designed.

예를 들어, 하기 요소는 본원의 개시 내용에 기초하여 개별적으로 선택, 설계 및/또는 개조될 수 있다: RdRp mRNA 카세트의 캡핑 (특히 특정 캡의 선택); RdRp mRNA 카세트의 5'-UTR; RdRp를 코딩하는 ORF의 코딩 서열(코돈-최적화); RdRp mRNA 카세트의 3'-UTR; RdRp mRNA 카세트의 폴리(A) 꼬리; (레플리콘이 알파바이러스 RdRp에 대한 5' 복제인식서열을 포함하는 한) 레플리콘 카세트의 5'-UTR; 서브게놈 프로모터 서열; 레플리콘으로부터 생성된 서브게놈 전사체의 5'-UTR; 목적 RNA를 코딩하는 ORF의 코딩 서열 (코돈-최적화); (레플리콘이 알파바이러스 RdRp에 대한 3' 복제인식서열을 포함하는 한) 레플리콘 카세트 및/또는 레플리콘 카세트로부터 생성된 서브게놈 전사체의 3'-UTR; 레플리콘 카세트의 폴리(A) 꼬리 및/또는 레플리콘으로부터 생성된 서브게놈 전사체; DNA 카세트의 복제시점; DNA 카세트의 프로모터를 포함한다.For example, the following elements may be individually selected, designed and/or adapted based on the disclosure herein: capping of the RdRp mRNA cassette (particularly selection of specific caps); 5'-UTR of RdRp mRNA cassette; the coding sequence of the ORF encoding RdRp (codon-optimized); 3'-UTR of RdRp mRNA cassette; poly(A) tail of the RdRp mRNA cassette; 5'-UTR of the replicon cassette (as long as the replicon contains the 5' replication recognition sequence for alphavirus RdRp); subgenomic promoter sequences; 5'-UTR of subgenomic transcripts generated from the replicon; the coding sequence of the ORF encoding the RNA of interest (codon-optimized); a 3'-UTR of a replicon cassette and/or a subgenomic transcript generated from a replicon cassette (as long as the replicon contains a 3' replication recognition sequence for alphavirus RdRp); poly(A) tails of replicon cassettes and/or subgenomic transcripts generated from replicons; the point of replication of the DNA cassette; Contains the promoter of the DNA cassette.

또한, 본 발명은 시험관내 또는 생체내에서 휴지기 또는 세포주기인 임의의 주어진 세포 유형에 대해 RdRp mRNA 카세트, 레플리콘 카세트 및 DNA 카세트의 최적량을 형질주입시킬 수 있다.In addition, the present invention can transfect optimal amounts of RdRp mRNA cassettes, replicon cassettes and DNA cassettes for any given cell type that is either resting or cell cycle in vitro or in vivo.

본 발명의 실시형태의 안전적 특징Safety Features of Embodiments of the Invention

하기 특징은 본 발명에서 단독으로 또는 임의의 적합한 조합으로 바람직하다:The following features are preferred in the present invention, alone or in any suitable combination:

바람직하게는, 본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 외피 단백질 P62, 및/또는 외피 단백질 E1과 같은 임의의 알파바이러스 구조 단백질을 포함하지 않는다.Preferably, the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention does not include any alphaviral structural proteins such as core nucleocapsid protein C, envelope protein P62, and/or envelope protein E1.

바람직하게는, 본 발명의 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 입자-형성 시스템이 아니다. 이것은, 본 발명의 시스템에 의해 대상세포의 접종 후에, 대상세포는 차세대 바이러스 입자와 같은 바이러스 입자를 생성하지 않는다는 것을 의미한다. 시스템은 코어 뉴클레오캡시드 단백질 C, 외피 단백질 P62, 및/또는 외피 단백질 E1과 같은 임의의 알파바이러스 구조 단백질을 코딩하는 유전 정보가 전혀 없다. 본 발명의 이러한 양상은 구조적 단백질이 트랜스-복제 헬퍼 RNA에 대해 코딩되는 종래 기술 시스템에 비해 안전면에서 부가적 가치를 제공한다.Preferably, the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention is not a particle-forming system. This means that, after inoculation of the target cells by the system of the present invention, the target cells do not produce virus particles such as next-generation virus particles. The system is completely devoid of genetic information encoding any alphaviral structural proteins, such as core nucleocapsid protein C, envelope protein P62, and/or envelope protein E1. This aspect of the invention provides added value in terms of safety compared to prior art systems in which structural proteins are encoded for trans-replication helper RNAs.

바람직하게는, 레플리콘 및 RdRp mRNA 카세트, DNA 카세트는 자가적 복제, 즉 시스-복제를 유도할 수 없다. 레플리콘 카세트는 기능성 알파바이러스 RdRp를 코딩하지 않는다. RdRp mRNA 카세트는 (+) 가닥 주형에 기반한 (-) 가닥 합성 및/또는 (-) 가닥 주형에 기반한 (+) 가닥 합성을 위해 요구되는 적어도 하나의 서열 요소 (바람직하게는 적어도 하나의 CSE)가 부족하다. 일 실시형태에서, RdRp mRNA 카세트는 CSE 1 및/또는 CSE 4를 포함하지 않는다.Preferably, the replicon and RdRp mRNA cassette, DNA cassette are not capable of inducing autonomous replication, i.e., cis-replication. The replicon cassette does not encode functional alphavirus RdRp. The RdRp mRNA cassette has at least one sequence element (preferably at least one CSE) required for (-) strand synthesis based on a (+) strand template and/or (+) strand synthesis based on a (-) strand template. lack. In one embodiment, the RdRp mRNA cassette does not include CSE 1 and/or CSE 4.

바람직하게는, 본 발명에 따른 레플리콘 카세트 또는 본 발명에 따른 RdRp mRNA 카세트, DNA 카세트는 알파바이러스 패키징 신호를 포함하지 않는다. 예를 들어, SFV의 nsP2의 코딩 영역에 포함된 알파바이러스 패키징 신호는 예를 들어, 결실 또는 돌연변이에 의해 제거될 수 있다. 알파바이러스 패키징 신호를 제거하는 적절한 방법은 nsP2의 코딩 영역의 코돈 사용법의 변형을 포함한다. 유전 암호의 축퇴는 코딩된 nsP2의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 패키징 신호의 기능을 제거하도록 허용할 수 있다.Preferably, the replicon cassette according to the present invention or the RdRp mRNA cassette or DNA cassette according to the present invention does not contain an alphavirus packaging signal. For example, the alphavirus packaging signal contained in the coding region of SFV's nsP2 can be removed, for example, by deletion or mutation. A suitable method to remove the alphavirus packaging signal involves modification of the codon usage of the coding region of nsP2. Degeneracy of the genetic code may allow the function of the packaging signal to be removed without affecting the amino acid sequence of the encoded nsP2.

본 발명의 시스템은 분리된 시스템이다. 시스템은 포유류 세포 내부와 같은 세포 내부에 존재하지 않거나, 알파바이러스 구조 단백질을 포함하는 외피 내부와 같은 바이러스 캡시드 내부에 존재하지 않는다. 본 발명의 시스템은 시험관내에 존재한다.The system of the present invention is a separate system. The system is not present inside a cell, such as inside a mammalian cell, or inside a viral capsid, such as inside an envelope containing alphavirus structural proteins. The system of the present invention exists in vitro.

RNA 카세트 및 DNA 카세트RNA Cassettes and DNA Cassettes

본 발명에서, 본 발명은 RdRp의 번역을 유도하기 위한 5'-캡을 포함하는 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 카세트 (RdRp mRNA 카세트)를 제공한다. 본 발명에서, 본 발명에 따른 알파바이러스 레플리콘이 존재하지 않는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에 있어서, 본 발명의 RdRp mRNA 카세트는 본 발명의 레플리콘 카세트와는 독립적으로 제공될 수 있다. 본 발명에서, RdRp mRNA 카세트는 본 발명의 RdRp mRNA 카세트의 임의의 하나 이상의 특성에 의해 독립적으로 특징화될 수 있다. 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 카세트는 분리된 핵산 분자이다. 이는 다른 핵산 분자로부터 분리된, 즉 본질적으로 없는 실시형태를 포함한다.In the present invention, the present invention provides an RNA cassette (RdRp mRNA cassette) for expressing alphavirus RdRp comprising a 5'-cap for inducing translation of RdRp. In the present invention, it is possible that no alphavirus replicon is present according to the present invention. That is, in the present invention, the RdRp mRNA cassette of the present invention can be provided independently of the replicon cassette of the present invention. In the present invention, RdRp mRNA cassettes can be independently characterized by any one or more properties of the RdRp mRNA cassettes of the present invention. The RNA cassette for expressing alphavirus RdRp is an isolated nucleic acid molecule. This includes embodiments that are separate from, or essentially free from, other nucleic acid molecules.

본 발명에 따른 RNA 카세트는 예를 들어 시스템 또는 키트의 형태로 적합한 레플리콘 카세트와 조합하기에 적합하다.The RNA cassette according to the present invention is suitable for combination with a suitable replicon cassette, for example in the form of a system or kit.

본 발명에서, 본 발명은 본 발명에 따른 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 카세트(RdRp mRNA 카세트) 및/또는 본 발명에 따른 RNA 레플리콘을 포함하는 RNA 카세트 및 둘 각각 또는 모두를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.In the present invention, an RNA cassette for expressing the alphavirus RdRp according to the present invention (RdRp mRNA cassette) and/or an RNA cassette comprising an RNA replicon according to the present invention and a nucleic acid encoding each or both of them DNA comprising the sequence is provided.

본 발명에 따른 DNA는 프로모터 하류부위에 상기 RdRp mRNA 및/또는 RNA 레플리콘을 인코딩하는 DNA가 위치한다. 상기 프로모터를 인지하는 DdRp에 의해 하류부위에 있는 DNA는 전사하여 상응하는 RNA를 제공한다.In the DNA according to the present invention, DNA encoding the RdRp mRNA and/or RNA replicon is located downstream of the promoter. DNA located downstream by DdRp recognizing the promoter is transcribed to provide the corresponding RNA.

바람직하게는, DNA는 이중가닥이다.Preferably, the DNA is double-stranded.

바람직하게, 본 발명에 따른 DNA는 플라스미드이다. 본원에 사용된 용어 "플라스미드"는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외 유전 물질, 대체로 원형 DNA 듀플렉스의 구성체에 관한 것이다.Preferably, the DNA according to the present invention is a plasmid. As used herein, the term “plasmid” generally relates to a construct of extrachromosomal genetic material, usually a circular DNA duplex, capable of replicating independently of chromosomal DNA.

IVT 벡터는 시험관내 전사를 위한 주형으로 표준화된 방식을 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 바람직한 프로모터의 예로서는 SP6, T3 또는 T7 중합효소에 대한 프로모터이다.IVT vectors can be used in a standardized manner as templates for in vitro transcription. Examples of promoters preferred according to the present invention are promoters for SP6, T3 or T7 polymerase.

본 발명의 DNA는 분리된 핵산 분자이다.DNA of the present invention is an isolated nucleic acid molecule.

본 발명의 시스템의 부분일 수 있거나 또는 아닌, 본 발명에 따른 임의의 RNA 분자는 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)는 본 발명에서 특히 중요하다. IVT-RNA는 핵산 분자 (특히 DNA 분자)로부터의 전사에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 DNA 분자(들)는 이러한 목적에 적합한데, 특히 DNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 인식될 수 있는 프로모터를 포함하는 경우에 적합하다.Any RNA molecule according to the present invention, which may or may not be part of a system of the present invention, may be obtained by in vitro transcription. In vitro transcribed RNA (IVT-RNA) is of particular interest in the present invention. IVT-RNA can be obtained by transcription from a nucleic acid molecule (particularly a DNA molecule). The DNA molecule(s) of the present invention are suitable for this purpose, particularly if they contain a promoter that can be recognized by DNA-dependent RNA polymerase.

본 발명에 따른 RNA 카세트는 시험관내에서 합성될 수 있다. 이것은 시험관내 전사 반응에 캡-유사체를 추가하도록 할 수 있다. 전형적으로, 폴리(A) 꼬리는 DNA 주형상의 폴리-(dT) 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로, 캡핑 및 폴리(A) 꼬리 첨가는 전사 후에 효소로 달성될 수 있다.RNA cassettes according to the present invention can be synthesized in vitro. This may allow adding cap-analogs to in vitro transcription reactions. Typically, the poly(A) tail is encoded by a poly-(dT) sequence on the DNA template. Alternatively, capping and poly(A) tail addition can be accomplished enzymatically after transcription.

본 발명의 DNA 카세트는 숙주세포의 복제 기전을 사용할 수 있어 DNA 카세트의 안정적인 공급이 가능하다. 추가적으로 숙주세포에서 작동하는 프로모터를 보유하고 있어 안정적인 RNA 카세트를 제공할 수 있어 지속적으로 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 복제 시스템을 유지할 수 있도록 한다. Since the DNA cassette of the present invention can use the replication mechanism of the host cell, stable supply of the DNA cassette is possible. In addition, it has a promoter that operates in the host cell, so it can provide a stable RNA cassette, so that it can continuously maintain a self-amplifying RNA / DNA hybrid replication system.

추가적으로 DNA 운반체는 운반할 수 있는 유전정보 양이 RNA 카세트보다 상대적으로 커 더 많은 관심 단백질들을 동시에 운반할 수 있는 장점이 있다.In addition, DNA carriers have the advantage of being able to simultaneously deliver more proteins of interest because the amount of genetic information that can be delivered is relatively greater than that of RNA cassettes.

시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있는 것이다. 예를 들어, 다양한 시험관내 전사 키트가 상업적으로 이용 가능하다.In vitro transcription methodologies are known to those skilled in the art. For example, various in vitro transcription kits are commercially available.

키트kit

본 발명은 또한 본 발명에 따른 시스템 또는 본 발명에 따른 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 구조체를 포함하는 키트를 제공한다.The present invention also provides a system according to the present invention or a kit comprising an RNA construct for expressing the alphavirus RdRp according to the present invention.

키트의 구성은 별개의 실체로 존재한다. 예를 들어, 키트의 하나의 핵산 분자는 하나의 실체에 존재할 수 있고, 키트의 다른 핵산은 별도의 실체에 존재할 수 있다. 예를 들어, 개방형 용기 또는 밀폐형 용기가 적합한 실체이다. 밀폐된 용기가 바람직하다. 사용된 용기는 바람직하게는 RNase가 없거나 본질적으로 RNase가 없어야 한다.The composition of the kit exists as a separate entity. For example, one nucleic acid molecule of the kit can be present in one entity and the other nucleic acids in the kit can be present in separate entities. For example, open containers or closed containers are suitable entities. Closed containers are preferred. The vessel used should preferably be RNase free or essentially RNase free.

본 발명의 키트는 세포 접종용 및/또는 인간이나 동물 대상체에 투여용 RNA를 포함한다.The kits of the present invention include RNA for cell inoculation and/or administration to a human or animal subject.

본 발명에 따른 키트는 임의로 라벨 또는 다른 형태의 정보 요소, 예를 들면, 전자 데이터 이동매체를 포함한다. 라벨 또는 정보 요소는 바람직하게는 취급설명서, 예를 들어, 인쇄된 서면 취급설명서 또는 임의로 인쇄 가능한 전자 양식으로 된 취급설명서를 포함한다. 취급설명서는 적합하고 가능한 적어도 하나의 키트 사용법을 지칭할 수 있다.A kit according to the present invention optionally comprises a label or other form of information element, for example an electronic data carrier. The label or information element preferably includes instructions, eg, printed, written instructions or instructions in an optionally printable electronic form. Instructions for use may indicate suitable and possible use of at least one kit.

6. 약학 조성물6. Pharmaceutical composition

본원에 기재된 알파바이러스 RdRp를 발현하기 위한 구성체 및/또는 레플리콘은 약학 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자, 바람직하게는 RNA 및 DNA를 포함할 수 있다. The constructs and/or replicons for expressing the alphavirus RdRp described herein may be in the form of a pharmaceutical composition. A pharmaceutical composition according to the present invention may comprise one or more nucleic acid molecules according to the present invention, preferably RNA and DNA.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제약상 허용 가능한 희석제 및/또는 제약상 허용 가능한 부형제 및/또는 제약상 허용 가능한 담체 및/또는 제약상 허용 가능한 운반체를 포함한다. 제약상 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제 또는 희석제의 선택은 특별히 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 제약상 허용 가능한 담체, 운반체, 부형제 또는 희석제가 사용될 수 있다.A pharmaceutical composition according to the present invention comprises a pharmaceutically acceptable diluent and/or a pharmaceutically acceptable excipient and/or a pharmaceutically acceptable carrier and/or a pharmaceutically acceptable carrier. The selection of pharmaceutically acceptable carriers, vehicles, excipients or diluents is not particularly limited. Any suitable pharmaceutically acceptable carrier, vehicle, excipient or diluent known in the art may be used.

본 발명에서, 약학 조성물은 용매, 예컨대 수성 용매 또는 RNA의 무결성을 보존할 수 있게 하는 임의의 용매를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 약학 조성물은 핵산을 포함하는 수용액이다.In the present invention, the pharmaceutical composition may further comprise a solvent, such as an aqueous solvent or any solvent capable of preserving the integrity of RNA. In one preferred embodiment, the pharmaceutical composition is an aqueous solution comprising a nucleic acid.

수용액은 선택적으로 용질, 예를 들면, 생리식염수를 포함할 수 있다.The aqueous solution may optionally contain a solute, such as physiological saline.

본 발명에서, 약학 조성물은 동결 건조된 조성물의 형태이다. 동결 건조된 조성물은 각각의 수성 조성물을 동결 건조시킴으로써 얻을 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition is in the form of a lyophilized composition. A freeze-dried composition can be obtained by freeze-drying the respective aqueous composition.

약학 조성물은 적어도 하나의 양이온성 실체를 포함한다. 일반적으로, 양이온성 지질, 양이온성 중합체 및 양전하를 갖는 다른 물질은 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 폴리양이온성 펩티드 또는 단백질과 같은 폴리양이온성 화합물과의 복합체화에 의해 본 발명에 따른 핵산을 안정화시키는 것이 가능하다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 프로타민, 폴리에틸렌 이민, 폴리-L-리신, 폴리-L-아르기닌, 히스톤 또는 양이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 양이온성 분자를 포함한다.A pharmaceutical composition includes at least one cationic entity. In general, cationic lipids, cationic polymers and other substances that have a positive charge can form complexes with negatively charged nucleic acids. It is possible to stabilize a nucleic acid according to the invention by complexation with a cationic compound, preferably a polycationic compound such as a cationic or polycationic peptide or protein. In one embodiment, the pharmaceutical composition according to the present invention comprises at least one cationic molecule selected from the group consisting of protamine, polyethylenimine, poly-L-lysine, poly-L-arginine, histones or cationic lipids.

본 발명에 따르면, 양이온성 지질은 양이온성 양친매성 분자, 예를 들어 하나 이상의 친수성 및 친유성 잔기를 포함하는 분자이다. 양이온성 지질은 모노양이온성 또는 폴리양이온성일 수 있다. 양이온성 지질은 전형적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 잔기를 가지며, 전반적인 순 양전하를 갖는다. 지질의 헤드기는 일반적으로 양전하를 띠고 있다. 양이온성 지질은 바람직하게는 1 내지 10가의 양전하, 보다 바람직하게는 1 내지 3 가의 양전하, 및 더욱 바람직하게는 1가의 양전하를 갖는다. 양이온성 지질의 예로는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA); 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판s; 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 디옥타데실디메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디미리스토일옥시프로필-1,3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 (DMRIE), 및 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스페르민 카복사미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나뮴 트리플루오로아세테이트 (DOSPA)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 양이온성 지질은 또한 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLinDMA)을 포함하는 삼차 아민기를 갖는 지질을 포함한다.According to the present invention, a cationic lipid is a cationic amphiphilic molecule, eg a molecule comprising one or more hydrophilic and lipophilic moieties. Cationic lipids can be monocationic or polycationic. Cationic lipids typically have lipophilic moieties such as sterols, acyl or diacyl chains, and have an overall net positive charge. The head group of a lipid is usually positively charged. The cationic lipid preferably has a positive charge of 1 to 10, more preferably a positive charge of 1 to 3, and more preferably a positive charge of 1. Examples of cationic lipids include 1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (DOTMA); dimethyldioctadecylammonium (DDAB); 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP); 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane (DODAP); 1,2-diacyloxy-3-dimethylammonium propanes; 1,2-dialkyloxy-3-dimethylammonium propane; Dioctadecyldimethyl ammonium chloride (DODAC), 1,2-dimyristoyloxypropyl-1,3-dimethylhydroxyethyl ammonium (DMRIE), and 2,3-dioleoyloxy-N-[2(s) fermin carboxamide)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanamium trifluoroacetate (DOSPA); Cationic lipids also include lipids with tertiary amine groups including 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropane (DLinDMA).

양이온성 지질은 본원에 기재된 바와 같이, 리포좀, 에멀젼 및 리포플렉스와 같은 지질 제형에서 핵산을 제형화하는데 적합하다. 전형적으로 양전하는 적어도 하나의 양이온성 지질에 의해 기여되고 음전하는 핵산에 의해 기여된다. 일 실시형태에서, 약학 조성물은 양이온성 지질 이외에 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 헬퍼 지질은 중성 또는 음이온성 지질일 수 있다. 헬퍼 지질은 자연성 지질, 예컨대 인지질, 또는 자연성 지질의 유사체, 또는 자연성 지질과 유사하지 않은 완전 합성 지질, 또는 지질 유사 분자일 수 있다. 약학 조성물이 양이온성 지질 및 헬퍼 지질을 모두 포함하는 경우, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 제형의 안정성 등의 관점에서 적절하게 결정될 수 있다.Cationic lipids are suitable for formulating nucleic acids in lipid formulations such as liposomes, emulsions and lipoplexes, as described herein. Typically the positive charge is contributed by at least one cationic lipid and the negative charge is contributed by the nucleic acid. In one embodiment, the pharmaceutical composition includes at least one helper lipid in addition to the cationic lipid. Helper lipids can be neutral or anionic lipids. Helper lipids can be natural lipids such as phospholipids, or analogs of natural lipids, or completely synthetic lipids that do not resemble natural lipids, or lipid-like molecules. When the pharmaceutical composition contains both a cationic lipid and a helper lipid, the molar ratio of cationic lipid to neutral lipid can be appropriately determined from the viewpoint of formulation stability and the like.

본 발명에 따른 약학 조성물은 프로타민을 포함한다. 본 발명에 따르면, 프로타민은 양이온 담체 제제로서 유용하다. 용어 "프로타민"은 아르기닌이 풍부하고 어류와 같은 동물의 정자 세포에서 체세포 히스톤 대신 DNA와 특히 관련이 있다고 발혀진 비교적 저분자량의 다양한 강염기성 단백질을 지칭한다. 특히, "프로타민"이라는 용어는 어류 정자에서 발견되는 단백질로, 강염기성이며 물에 용해되고 열로 응고되지 않으며 다수의 아르기닌 단량체를 포함하는 단백질을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 본원에서 사용되는 "프로타민"이라는 용어는 자연성 또는 생물학적 원천으로부터 수득되거나 유도된 임의의 프로타민 아미노산 서열을 포함하는 것으로, 상기 아미노산 서열 또는 이의 단편의 다합체 형태 및 이의 단편을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 이 용어는 인공적이고 특정 목적을 위해 특별히 설계된 것으로, 자연성 또는 생물학적 원천으부터 분리될 수 없는 (합성된) 폴리펩티드를 포함한다.The pharmaceutical composition according to the present invention contains protamine. According to the present invention, protamine is useful as a cation carrier agent. The term "protamine" refers to a variety of relatively low molecular weight, strongly basic proteins that are rich in arginine and have been found to be particularly associated with DNA instead of somatic histones in sperm cells of animals such as fish. In particular, the term "protamine" refers to a protein found in fish sperm that is strongly basic, soluble in water, does not coagulate with heat, and contains a large number of arginine monomers. According to the present invention, the term "protamine" as used herein includes any protamine amino acid sequence obtained or derived from natural or biological sources, including multimeric forms of the amino acid sequence or fragments thereof and fragments thereof. means that The term also includes (synthesized) polypeptides that are artificial and specifically designed for a specific purpose and cannot be isolated from natural or biological sources.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다.Compositions of the present invention may include one or more adjuvants.

본 발명에 따른 약학 조성물은 완충될 수 있다(예를 들어, 아세트산염 완충액, 구연산염 완충액, 숙신산염 완충액, 트리스 완충액, 인산염 완충액으로 완충한다).The pharmaceutical composition according to the present invention may be buffered (eg, buffered with acetate buffer, citrate buffer, succinate buffer, Tris buffer, or phosphate buffer).

핵산-함유 입자Nucleic Acid-Containing Particles

비보호된 핵산의 불안정성 때문에, 본 발명의 핵산 분자를 복합체 형태 또는 캡슐화된 형태로 제공하는 것이 유리하다. 각각의 약학 조성물이 본 발명에 제공된다. Because of the instability of unprotected nucleic acids, it is advantageous to provide the nucleic acid molecules of the invention in complex or encapsulated form. Each pharmaceutical composition is provided herein.

특히, 본 발명의 약학 조성물은 핵산-함유 입자, 바람직하게는 핵산-함유 입자를 포함한다. 각각의 약학 조성물은 미립자 제형으로 지칭된다. 본 발명에 따른 미립자 제형에서, 입자는 본 발명에 따른 핵산 및 핵산 전달에 적합한 제약상 허용 가능한 담체 또는 제약상 허용 가능한 운반체를 포함한다. In particular, the pharmaceutical composition of the present invention comprises nucleic acid-containing particles, preferably nucleic acid-containing particles. Each pharmaceutical composition is referred to as a particulate dosage form. In particulate formulations according to the present invention, the particles comprise a nucleic acid according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier or pharmaceutically acceptable carrier suitable for delivery of the nucleic acid.

핵산-함유 입자는 예를 들어 단백성 입자 형태 또는 지질-함유 입자 형태일 수 있다. 적합한 단백질 또는 지질은 입자 형성 제제로 지칭된다. 단백성 입자 및 지질-함유 입자는 종래에 미립자 형태로 알파바이러스 RNA를 전달하기에 적합한 것으로 기술되어 있다. 특히, 알파바이러스 구조 단백질 (예를 들어, 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다)은 단백성 입자의 형태로 RNA를 전달하기 위한 적합한 담체이다.Nucleic acid-containing particles may be in the form of, for example, proteinaceous particles or lipid-containing particles. Suitable proteins or lipids are referred to as particle forming agents. Proteinaceous particles and lipid-containing particles have previously been described as being suitable for delivering alphaviral RNA in particulate form. In particular, alphaviral structural proteins (e.g., provided by helper viruses) are suitable carriers for the delivery of RNA in the form of proteinaceous particles.

본 발명에 따른 시스템이 미립자 제형으로 제형화되는 경우, 각 핵산(예를 들어, RdRp mRNA 카세트 및 관심 단백질을 코딩하는 레플리콘 RNA 그리고 이들에 상응하는 DNA 카세트와 같은 임의의 부가적인 핵산)을 개별 미립자 제형으로서 별도로 제형화할 수 있다. 이 경우, 각각의 개별 미립자 제형은 하나의 핵산을 포함할 것이다. When the system according to the present invention is formulated in a particulate formulation, each nucleic acid (e.g., the RdRp mRNA cassette and any additional nucleic acids, such as replicon RNA encoding the protein of interest and their corresponding DNA cassettes) It can be separately formulated as an individual particulate formulation. In this case, each individual particulate formulation will contain one nucleic acid.

개별 미립자 제형은 별개의 실체로서, 예를 들어 별도의 용기에서 존재할 수 있다. 이러한 제형은 각각의 핵산 종을 개별적으로 (전형적으로 각각 핵산 함유 용액의 형태로) 입자 형성 제제와 함께 제공하여, 입자의 형성을 가능하게 함으로써 수득할 수 있다. 각각의 입자는 입자가 형성될 때 제공되는 특정 핵산을 독점적으로 함유할 것이다 (개별 미립자 제형).Individual particulate formulations may exist as separate entities, eg in separate containers. Such formulations can be obtained by providing each nucleic acid species separately (typically in the form of a solution containing each nucleic acid) together with a particle forming agent to allow formation of particles. Each particle will exclusively contain a particular nucleic acid provided when the particle is formed (individual particulate formulation).

본 발명에 따른 약학 조성물은 둘 이상의 개별적인 입자 제형을 포함한다. 각각의 약학 조성물은 혼합된 미립자 제형으로 지칭된다. 본 발명에 따른 혼합된 미립자 제형은 개별적인 미립자 제형을 혼합한 후에 상기한 바와 같이 개별 미립자 제형을 따로 따로 형성하여 얻을 수 있다. A pharmaceutical composition according to the present invention comprises two or more separate particle dosage forms. Each pharmaceutical composition is referred to as a mixed particulate formulation. A blended particulate formulation according to the present invention can be obtained by mixing the individual particulate formulations and then separately forming the individual particulate formulations as described above.

혼합 단계에 의해, 핵산-함유 입자가 혼합된 집단을 포함하는 하나의 제형이 수득 가능하다 (예컨대 입자의 제 1 집단은 본 발명에 따른 레플리콘을 함유할 수 있고, 입자는 본 발명에 따른 RdRp mRNA 카세트 및/또는 이들에 상응하는 DNA를 함유할 수 있다). 개별 미립자 집단은 개별 미립자 제형의 혼합된 집단을 포함한 하나의 용기 내에 함께 있을 수 있다.By the mixing step, one formulation comprising a mixed population of nucleic acid-containing particles is obtainable (e.g., a first population of particles may contain a replicon according to the present invention, and the particles may contain a replicon according to the present invention). RdRp mRNA cassettes and/or DNA corresponding to them). The individual particulate populations may be together in one container containing a mixed population of individual particulate formulations.

대안적으로, 약학 조성물의 모든 핵산 (예를 들어, RdRp mRNA 카세트, 및 관심 단백질을 코딩하는 레플리콘 RNA 그리고 이들에 상응하는 DNA)이 조합된 미립자 제형으로서 함께 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 모든 핵산의 조합된 제형 (전형적으로 조합된 용액)를 입자-형성 제제와 함께 제공하여, 입자의 형성을 가능하게 함으로써 수득할 수 있다. Alternatively, all nucleic acids of the pharmaceutical composition (eg, the RdRp mRNA cassette and the replicon RNA encoding the protein of interest and their corresponding DNA) may be formulated together as a combined particulate formulation. Such formulations can be obtained by providing a combined formulation (typically a combined solution) of all nucleic acids together with a particle-forming agent to allow formation of particles.

혼합된 미립자 제형과는 대조적으로, 조합된 미립자 제형은 전형적으로 둘 이상의 핵산을 포함하는 입자를 포함할 것이다. 조합된 미립자 조성물에서, 상이한 핵산이 전형적으로 단일 입자 내에 함께 존재한다.In contrast to a mixed particulate formulation, a combined particulate formulation will typically include particles comprising two or more nucleic acids. In combined particulate compositions, different nucleic acids are typically present together in a single particle.

본 발명의 미립자 제형은 나노미립자 제형이다. 본 발명에 따른 조성물은 나노입자의 형태로 본 발명에 따른 핵산을 포함한다. 나노미립자 제형은 다양한 프로토콜과 다양한 복합 화합물로 얻을 수 있다. 지질, 중합체, 올리고머 또는 양친매체는 나노미립자 제형의 전형적인 성분이다.The particulate formulation of the present invention is a nanoparticulate formulation. A composition according to the present invention comprises a nucleic acid according to the present invention in the form of nanoparticles. Nanoparticulate formulations can be obtained with a variety of protocols and with a variety of complex compounds. Lipids, polymers, oligomers or amphiphiles are typical components of nanoparticulate formulations.

"나노입자"는 일반적으로 직경이 1000 나노미터(nm) 이하인 핵산의 전신투여, 특히 비경구 투여에 적합한 입자를 형성하는 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다. 일 실시형태에서, 나노입자는 평균 직경이 약 50 nm 내지 약 1000 nm, 바람직하게는 약 50 nm 내지 약 400 nm, 바람직하게는 약 100 nm 내지 약 300 nm, 예컨대 약 150 nm 내지 약 200 nm의 범위를 갖는다. 일 실시형태에서, 나노입자는 직경이 약 200 내지 약 700 nm, 약 200 내지 약 600 nm, 바람직하게는 약 250 내지 약 550 nm, 특히 약 300 내지 약 500 nm 또는 약 200 내지 약 400 nm의 범위를 갖는다."Nanoparticle" refers to any particle having a diameter that forms a particle suitable for systemic administration, particularly parenteral administration, of nucleic acids, generally less than 1000 nanometers (nm) in diameter. In one embodiment, the nanoparticles have an average diameter of about 50 nm to about 1000 nm, preferably about 50 nm to about 400 nm, preferably about 100 nm to about 300 nm, such as about 150 nm to about 200 nm. have a range In one embodiment, the nanoparticles range in diameter from about 200 to about 700 nm, from about 200 to about 600 nm, preferably from about 250 to about 550 nm, particularly from about 300 to about 500 nm or from about 200 to about 400 nm. have

동적 광산란에 의해 측정된 바와 같이, 본원에 기재된 나노입자의 다분산지수(PI)는 0.5이하, 바람직하게는 0.4 이하 또는 더더욱 바람직하게는 0.3 이하이다. "다분산지수"(PI)는 입자 혼합물에서 개별 입자 (예컨대 리포좀)의 균질 또는 불균질적 크기 분포를 측정한 것으로, 혼합물 내의 입자 분포의 폭을 나타낸다. PI는 공지된 기술로 결정될 수 있다.As measured by dynamic light scattering, the polydispersity index (PI) of the nanoparticles described herein is less than 0.5, preferably less than 0.4 or even more preferably less than 0.3. "Polydispersity index" (PI) is a measure of the homogeneous or heterogeneous size distribution of individual particles (eg liposomes) in a particle mixture, and indicates the breadth of particle distribution within the mixture. PI can be determined by known techniques.

"나노미립자 제형" 또는 유사한 용어는 적어도 하나의 나노입자를 함유하는 임의의 미립자 제형를 지칭한다. 나노미립자 조성물은 나노입자의 균일한 집합체이다. 나노미립자 조성물은 리포좀 제형과 같은 지질-함유 약학 제형 또는 에멀젼이다.“Nanoparticulate formulation” or similar term refers to any particulate formulation containing at least one nanoparticle. A nanoparticulate composition is a uniform aggregate of nanoparticles. Nanoparticulate compositions are lipid-containing pharmaceutical formulations such as liposomal formulations or emulsions.

지질-함유 약학 조성물Lipid-Containing Pharmaceutical Composition

본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나의 지질을 포함한다. 바람직하게는, 적어도 하나의 지질은 양이온성 지질이다. 상기 지질-함유 약학 조성물은 본 발명에 따른 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 소포, 예를 들어 리포좀에 캡슐화된 핵산을 포함한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 에멀젼의 형태로 핵산을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 양이온성 화합물과의 복합체 중에 핵산을 포함함으로써, 예를 들어, 소위 리포플렉스 또는 폴리플렉스를 형성한다. 리포좀과 같은 소포 내 핵산의 캡슐화는 예를 들어 지질/핵산 복합체와는 다르다. 예를 들어, 지질/핵산 복합체는 핵산이 예를 들어 미리 형성된 리포좀과 혼합된 경우에 수득된다.A pharmaceutical composition of the present invention includes at least one lipid. Preferably, at least one lipid is a cationic lipid. The lipid-containing pharmaceutical composition comprises a nucleic acid according to the present invention. In one embodiment, a pharmaceutical composition according to the present invention comprises nucleic acids encapsulated in vesicles, eg liposomes. The pharmaceutical composition according to the present invention contains nucleic acids in the form of an emulsion. In one embodiment, the pharmaceutical composition according to the present invention comprises a nucleic acid in a complex with a cationic compound, eg forming a so-called lipoplex or polyplex. Encapsulation of nucleic acids in vesicles such as liposomes differs from, for example, lipid/nucleic acid complexes. For example, lipid/nucleic acid complexes are obtained when nucleic acids are mixed with, for example, pre-formed liposomes.

본 발명에 따른 약학 조성물은 소포에 캡슐화된 핵산을 포함한다. 이러한 제형은 본 발명에 따른 특정 미립자 제형이다. 소포는 구형의 껍데기로 감싸진 지질 이중층으로, 작은 공간을 둘러싸고 그 공간을 소포 외부의 공간과 분리한다. 전형적으로, 소포 내의 공간은 수성 공간, 즉 물을 포함한다. A pharmaceutical composition according to the present invention comprises nucleic acids encapsulated in vesicles. These formulations are specific particulate formulations according to the present invention. A vesicle is a lipid bilayer enclosed in a spherical shell, which encloses a small cavity and separates it from the space outside the vesicle. Typically, the space within the vesicle contains an aqueous space, ie water.

전형적으로, 소포외부의 공간은 수성 공간, 즉 물을 포함한다. 지질 이중층은 하나 이상의 지질(소포-형성 지질)에 의해 형성된다. 소포를 둘러싸고 있는 막은 원형질막과 유사한 라멜라 형상이다. Typically, the space outside the vesicle contains an aqueous space, ie water. A lipid bilayer is formed by one or more lipids (vesicle-forming lipids). The membrane surrounding the vesicle has a lamellar shape similar to the plasma membrane.

본 발명에 따른 소포는 다중 라멜라 소포, 단일 라멜라 소포 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 소포 내에 캡슐화될 때, RNA는 전형적으로 임의의 외부 매질로부터 분리된다. 따라서 그것은 자연성 알파바이러스의 보호된 형태와 기능적으로 동등한 보호된 형태로 존재한다. 적합한 소포는 본원에 기재된 바와 같은 입자, 특히 나노입자이다.Vesicles according to the present invention may be multilamellar vesicles, unilamellar vesicles or mixtures thereof. When encapsulated within vesicles, RNA is typically isolated from any external medium. Therefore, it exists in a protected form that is functionally equivalent to the protected form of the natural alphavirus. Suitable vesicles are particles, particularly nanoparticles, as described herein.

예를 들어, 핵산는 리포좀에 캡슐화될 수 있다. 이 실시형태에서, 약학 조성물은 리포좀 제형이거나 이를 포함한다. 리포좀 내의 캡슐화는 전형적으로 핵산 분해효소로부터 핵산을 보호할 것이다. 리포좀은 일부 외부 핵산을 포함할 수 있지만, 핵산의 적어도 절반(이상적으로는 모두)은 리포좀의 코어 내에 캡슐화된다.For example, nucleic acids can be encapsulated in liposomes. In this embodiment, the pharmaceutical composition is or comprises a liposomal formulation. Encapsulation in liposomes will typically protect nucleic acids from nucleases. Liposomes may contain some extraneous nucleic acids, but at least half (ideally all) of the nucleic acids are encapsulated within the core of the liposome.

리포좀은 종종 인지질과 같은 소포-형성 지질의 하나 이상의 이중층을 가진 미세한 지질 소포이고 약물, 예를 들어 핵산을 캡슐화 할 수 있다. 본 발명의 문맥 상에서, 다중 라멜라 소포 (MLV), 소형 단일 라멜라 소포(SUV), 대형 단일 라멜라 소포 (LUV), 입체적으로 안정화된 리포좀 (SSL), 다포체 소포 (MV) 및 대형 다포체 소포 (LMV)뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 이중층 형태를 포함하는 리포좀의 다른 유형을 채용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리포좀의 크기 및 층상도는 제조 방법에 따라 달라질 것이다. 지질이 라멜라 형상, 육방정 및 역상 육방정 형상, 입방 형상, 미셀, 단층으로 구성된 역 미셀을 포함하는, 수성 매질에서 존재할 수 있는 다른 여러 형태의 초분자성 구성이 있다. 또한, 이들 형상들은 DNA 또는 RNA와의 조합으로 수득될 수 있으며, RNA 및 DNA와의 상호작용은 실질적으로 형상 상태에 영향을 줄 수 있다. 이러한 형상은 본 발명의 나노미립자 핵산 제형에 존재할 수 있다.Liposomes are often microscopic lipid vesicles with one or more bilayers of vesicle-forming lipids, such as phospholipids, and may encapsulate drugs, such as nucleic acids. In the context of the present invention, multilamellar vesicles (MLV), small unilamellar vesicles (SUV), large unilamellar vesicles (LUV), sterically stabilized liposomes (SSL), multivesicular vesicles (MV) and large multivesicular vesicles ( Other types of liposomes may be employed including, but not limited to, LMV) as well as other bilayer configurations known in the art. The size and layering of the liposomes will depend on the method of preparation. There are several other types of supramolecular configurations that lipids can exist in aqueous media, including lamellar shapes, hexagonal and inverted hexagonal shapes, cubic shapes, micelles, and reverse micelles composed of monolayers. Also, these shapes can be obtained in combination with DNA or RNA, and the interaction of RNA and DNA can substantially affect the shape state. Such configurations may be present in the nanoparticulate nucleic acid formulations of the present invention.

리포좀은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 형성할 수 있다. 각각의 방법은 역 증발 방법, 에탄올 주입 방법, 탈수-재수화 방법, 초음파 처리 또는 다른 적절한 방법을 포함한다. 리포좀 형성 후, 실질적으로 균질한 크기 범위를 갖는 리포좀 집단을 얻도록 리포좀의 크기를 바꿀 수 있다.Liposomes can be formed using standard methods known to those skilled in the art. Each method includes a reverse evaporation method, an ethanol injection method, a dehydration-rehydration method, sonication or other suitable method. After liposome formation, the size of the liposomes can be varied to obtain a population of liposomes with a substantially homogeneous size range.

본 발명에서, 핵산은 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는 리포좀에 존재한다. 각각의 리포좀은 적어도 하나의 양이온성 지질이 사용하는 경우, 단일 지질 또는 지질의 혼합물로부터 형성될 수 있다. 바람직한 양이온성 지질은 양성자화될 수 있는 질소 원자를 가지며; 바람직하게는, 이러한 양이온성 지질은 삼차 아민기를 갖는 지질이다. 삼차 아민기를 갖는 특히 적합한 지질은 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLinDMA)이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산은 리포좀 제형으로 존재한다: 핵산을 포함하는 수성 코어를 캡슐화하는 지질 이중층을 갖는 리포좀으로서, 지질 이중층은 pKa가 5.0 내지 7.6의 범위인 바람직하게는 삼차 아민기를 갖는 지질을 포함한다. 삼차 아민기를 갖는 바람직한 양이온성 지질은 DLinDMA (pKa 5.8)를 포함한다. In the present invention, the nucleic acid is present in a liposome comprising at least one cationic lipid. Each liposome can be formed from a single lipid or a mixture of lipids when at least one cationic lipid is used. Preferred cationic lipids have a nitrogen atom that can be protonated; Preferably, such cationic lipids are lipids with tertiary amine groups. A particularly suitable lipid with tertiary amine groups is 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropane (DLinDMA). In one embodiment, the nucleic acids according to the invention are in liposomal formulation: liposomes having a lipid bilayer encapsulating an aqueous core comprising the nucleic acid, wherein the lipid bilayer has a pKa ranging from 5.0 to 7.6, preferably containing tertiary amine groups. Contains lipids with Preferred cationic lipids with tertiary amine groups include DLinDMA (pKa 5.8).

각각의 화합물을 포함하는 리포좀은 특히 핵산의 캡슐화에 적합하여 핵산의 리포좀 전달에 적합하다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산은 리포좀 제형 내에 존재하며, 여기서 리포좀은 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하며, 그 헤드기는 양성자화될 수 있는 적어도 하나의 질소원자(N)를 포함하며, 리포좀 및 RNA는 N:P 비율이 1:1 내지 20:1이다. 본 발명에 따르면, "N:P 비율"은 지질-함유 입자 (예컨대 리포좀)에 포함된 RNA에서의 인원자(P)에 대한 양이온성 지질 중의 질소원자(N)의 몰비를 지칭한다. 1:1과 20:1 사이의 N:P 비율은 리포좀의 순 전하와 척추 세포로의 RNA 전달 효율에 연관됨을 시사하는 것이다.Liposomes comprising the respective compounds are particularly suitable for encapsulation of nucleic acids and thus for liposomal delivery of nucleic acids. In one embodiment, the nucleic acid according to the invention is in a liposomal formulation, wherein the liposome comprises at least one cationic lipid, the head group comprising at least one nitrogen atom (N) capable of being protonated, Liposomes and RNA have an N:P ratio of 1:1 to 20:1. According to the present invention, "N:P ratio" refers to the molar ratio of nitrogen atoms (N) in cationic lipids to phosphorus atoms (P) in RNA contained in lipid-containing particles (eg liposomes). N:P ratios between 1:1 and 20:1 suggest a relationship between the net charge of the liposome and the efficiency of RNA delivery to vertebrate cells.

본 발명에 따른 핵산은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분을 포함하는 적어도 하나의 지질을 포함하는 리포좀 제형에 존재하며, 여기서 RNA가 PEG화된 리포좀 내에 캡슐화되어 PEG 부분이 리포좀의 외부에 존재한다.A nucleic acid according to the present invention is present in a liposomal formulation comprising at least one lipid comprising a polyethylene glycol (PEG) moiety, wherein the RNA is encapsulated within a PEGylated liposome such that the PEG moiety is external to the liposome.

본 발명에 따른 핵산은 리포좀 제형 내에 존재하고,리포좀은 직경이 60-180 nm 범위를 갖는다.The nucleic acids according to the present invention are present in a liposomal formulation, and the liposomes have a diameter in the range of 60-180 nm.

본 발명에 따른 핵산은 리포좀 제형 내에 존재하고, 핵산-함유 리포좀이 0 또는 음성에 가까운 순 전하를 갖는다.A nucleic acid according to the present invention is present in a liposomal formulation, and the nucleic acid-containing liposome has a net charge of zero or close to negative.

본 발명에 따른 핵산은 에멀젼의 형태로 존재한다. 에멀젼은 종래에 핵산 분자를 세포에 전달하는 데 사용되는 것으로 기재되어 있다. 본 발명에서 바람직한 것은 수중유형 에멀젼이다. 각각의 에멀젼 입자는 오일 코어 및 양이온성 지질을 포함한다. 보다 바람직한 것은 본 발명에 따른 핵산이 에멀젼 입자와 복합체화된 양이온성 수중유형 에멀젼이다. 에멀젼 입자는 오일 코어 및 양이온성 지질을 포함한다.Nucleic acids according to the invention are in the form of emulsions. Emulsions have previously been described as being used to deliver nucleic acid molecules into cells. Preferred in the present invention is an oil-in-water emulsion. Each emulsion particle contains an oil core and a cationic lipid. More preferred is a cationic oil-in-water emulsion in which the nucleic acid according to the present invention is complexed with emulsion particles. Emulsion particles include an oil core and cationic lipids.

양이온성 지질은 음으로 하전된 핵산과 상호작용하여 에멀젼 입자에 핵산을 고정시킨다. 수중유형 에멀젼에서, 에멀젼 입자는 수성 연속 상에 분산된다. 예를 들어, 에멀젼 입자의 평균 직경은 전형적으로 약 80 nm 내지 180nm일 수 있다. Cationic lipids interact with negatively charged nucleic acids to anchor them to the emulsion particles. In an oil-in-water emulsion, the emulsion particles are dispersed in an aqueous continuous phase. For example, the average diameter of the emulsion particles may typically be between about 80 nm and 180 nm.

본 발명의 약학 조성물은 양이온성 수중유형 에멀젼이고, 여기서 에멀젼 입자는 공지된 바와 같이 오일 코어 및 양이온성 지질을 포함한다. 본 발명에 따른 핵산은 양이온성 지질을 포함하는 에멀젼의 형태로 존재할 수 있고, 에멀젼의 N:P 비율은 공지된 바와 같이 적어도 4:1이다. The pharmaceutical composition of the present invention is a cationic oil-in-water emulsion, wherein the emulsion particles contain an oil core and a cationic lipid as known. Nucleic acids according to the present invention may be present in the form of emulsions comprising cationic lipids, and the N:P ratio of the emulsion is at least 4:1 as is known.

본 발명에 따른 핵산은 공지된 바와 같이 양이온성 지질 에멀젼의 형태로 존재할 수 있다. 특히, 조성물은 양이온성 수중유형 에멀젼의 입자와 복합체화된 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서 오일/지질의 비율은 적어도 약 8:1 (몰:몰)이다.Nucleic acids according to the present invention may be present in the form of cationic lipid emulsions, as is known. In particular, the composition may include nucleic acids complexed with particles of a cationic oil-in-water emulsion, wherein the oil/lipid ratio is at least about 8:1 (molar:molar).

본 발명에 따른 약학 조성물은 리포플렉스의 형태로 핵산을 포함한다. "리포플렉스" 또는 "핵산 리포플렉스"라는 용어는 지질 및 핵산의 복합체를 지칭한다. 리포플렉스는 양이온성 (양성 하전된) 리포좀과 음이온성 (음성 하전된) 핵산으로 형성될 수 있다. 양이온성 리포좀은 또한 중성 "헬퍼" 지질을 포함할 수 있다. 가장 간단한 경우에, 리포플렉스는 핵산을 특정 혼합 프로토콜로 리포좀과 혼합함으로써 자발적으로 형성되지만, 다양한 다른 프로토콜이 적용될 수 있다. 양성 하전된 리포좀과 음성 하전된 핵산 사이의 정전기적 상호작용이 리포플렉스 형성의 원동력임을 이해할 수 있다. 본 발명에서, 핵산 리포플렉스 입자의 순 전하는 0에 가깝거나 음성이다. 핵산 및 리포좀의 전기적-중성 또는 음성 하전된 리포플렉스는 전신 투여 후 비장 수지상세포(DC)에서 실질적인 핵산 발현을 유도하고 양성 하전된 리포좀 및 리포플렉스에 대해 보고된 증가된 독성과 관련이없는 것으로 알려져있다. The pharmaceutical composition according to the present invention comprises nucleic acids in the form of lipoplexes. The term "lipoplex" or "nucleic acid lipoplex" refers to a complex of lipids and nucleic acids. Lipoplexes can be formed from cationic (positively charged) liposomes and anionic (negatively charged) nucleic acids. Cationic liposomes may also include neutral “helper” lipids. In the simplest case, lipoplexes form spontaneously by mixing nucleic acids with liposomes in a specific mixing protocol, but a variety of other protocols can be applied. It can be understood that the electrostatic interaction between positively charged liposomes and negatively charged nucleic acids is the driving force behind lipoplex formation. In the present invention, the net charge of the nucleic acid lipoplex particle is close to zero or negative. It is known that electrically-neutral or negatively charged lipoplexes of nucleic acids and liposomes induce substantial nucleic acid expression in splenic dendritic cells (DC) after systemic administration and are not associated with the increased toxicity reported for positively charged liposomes and lipoplexes. there is.

따라서, 본 발명에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 나노입자, 바람직하게는 리포플렉스 나노입자의 형태로 핵산을 포함하며, 여기서 (i) 나노입자 내의 양전하의 수가 나노입자 내의 음전하의 수를 초과하지 않고 및/또는 (ii) 나노입자가 중성 또는 순 음전하를 띠며, 및/또는 (iii) 나노입자에서 음전하에 대한 양전하의 전하 비율이 1.4:1 이하이며, 및/또는 (iv) 나노입자의 제타전위는 0 이하이다. Thus, in the present invention, the pharmaceutical composition according to the present invention comprises nucleic acids in the form of nanoparticles, preferably lipoplex nanoparticles, wherein (i) the number of positive charges in the nanoparticles does not exceed the number of negative charges in the nanoparticles. and/or (ii) the nanoparticle has a neutral or net negative charge, and/or (iii) the charge ratio of positive to negative charges in the nanoparticle is less than or equal to 1.4:1, and/or (iv) zeta of the nanoparticle potential is less than zero.

제타전위는 콜로이드성 시스템에서 전기역학적 전위에 대한 과학 용어이다. 본 발명에서, (a) 제타전위 및 (b) 나노입자 내의 RNA에 대한 양이온성 지질의 전하 비율은 공지된 바와 같이 계산될 수 있다. 요약하면, 공지된 바와 같이, 입자의 순 전하가 0 또는 음에 가깝거나 음성인, 정의된 입자 크기를 갖는 나노미립자 리포플렉스 제형인 약학 조성물은 본 발명과 관련하여 바람직한 약학 조성물이다.Zeta potential is the scientific term for the electrodynamic potential in colloidal systems. In the present invention, (a) the zeta potential and (b) the charge ratio of cationic lipid to RNA in nanoparticles can be calculated as known. In summary, as is known, a pharmaceutical composition that is a nanoparticulate lipoplex formulation with a defined particle size, wherein the net charge of the particles is zero, close to negative, or negative, is a preferred pharmaceutical composition in the context of the present invention.

7. 전사체 및 단백질 생산 방법7. Transcript and protein production methods

본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포에서 전사체 및 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing transcripts and proteins in cells comprising the following steps.

도 2는 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 여러 유형이다.Figure 2 is several types of self-amplifying RNA/DNA hybrid expression systems.

도2를 살펴보면, 본 발명의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템는 상기 RdRp mRNA를 포함하는 RdRp RNA 카세트와 상기 관심 DNA 레플리콘을 포함하는 레플리콘 DNA 카세트를 기본으로 추가적으로 상기 RdRp DNA를 포함하는 RdRp DNA 카세트와 상기 관심 mRNA 레플리콘을 포함하는 레플리콘 RNA 카세트를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 추가하는 유형이 있을 수 있다. Referring to FIG. 2, the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention additionally contains the RdRp DNA based on the RdRp RNA cassette containing the RdRp mRNA and the replicon DNA cassette containing the DNA replicon of interest. There may be a type in which one or more selected from the group containing the RdRp DNA cassette and the replicon RNA cassette containing the mRNA replicon of interest are added.

또한, 본 발명의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템는 상기 레플리콘 RNA 카세트와 상기 RdRp DNA 카세트를 기본으로 추가적으로 상기 RdRp RNA 카세트와 상기 레플리콘 DNA 카세트를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 추가하는 유형이 있을 수 있다. In addition, the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention additionally contains at least one selected from the group including the RdRp RNA cassette and the replicon DNA cassette based on the replicon RNA cassette and the RdRp DNA cassette. There may be additional types.

(a) 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 수득하는 단계, 및(a) obtaining a self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system, and

(b) 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 세포 내에 함께 접종하는 단계를 포함하고,(b) co-inoculating the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system into the cells;

여기서 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 카세트는 RdRp의 번역을 유도하기 위한 5'-캡을 포함한다.Here, the RNA cassette for expressing the alphavirus RdRp includes a 5'-cap for inducing translation of RdRp.

자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 RNA 카세트는 본 발명에 따른 시스템에 포함된 RdRp mRNA 카세트의 하나 이상의 특징 및 레플리콘의 임의의 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 상기 RNA 카세트는 세포질에서 관심 mRNA의 자가 증폭 및 관심 단백질 합성을 효율적으로 일어나서 안정적으로 관심 단백질을 공급할 수 있다.The RNA cassette of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system may have one or more features of the RdRp mRNA cassette and any one or more features of the replicon included in the system according to the present invention. The RNA cassette can efficiently self-amplify the mRNA of interest and synthesize the protein of interest in the cytoplasm to stably supply the protein of interest.

본 발명에서 따른 DNA 카세트 운반체로 자연 발생 또는 인공적으로 구축된 벡터의 예는 대장균 플라스미드, 박테리오파지(λ, M13, P1), 바이러스(동물 바이러스-레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 등; 곤충 바이러스 - 배큘로 바이러스, 식물 바이러스 - 콜리플라워 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 쌍둥이자리 바이러스 등), 아그로박테리움 투메파시엔스 기반 벡터, 키메라 플라스미드(코스미드, 파지미드, 파스미드 및 포스미드), 인공 염색체(YAC, BAC, PAC, MAC 및 HAC) 및 비 대장균 벡터(예: 바실러스 및 슈도모나스 벡터 등) 기반 벡터가 포함한다. Examples of vectors naturally occurring or artificially constructed as DNA cassette carriers according to the present invention include Escherichia coli plasmids, bacteriophages (λ, M13, P1), viruses (animal virus-retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, Vaccinia virus, etc.; Insect viruses - Baculovirus, Plant viruses - Cauliflower mosaic virus, Potato virus X, Gemini virus, etc.), Agrobacterium tumefaciens based vectors, chimeric plasmids (cosmids, phagemids, phasmids) and fosmids), vectors based on artificial chromosomes (YAC, BAC, PAC, MAC and HAC) and non-E. coli vectors (eg, Bacillus and Pseudomonas vectors, etc.).

자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 DNA 카세트는 본 발명에 따른 시스템에 포함된 RdRp mRNA 카세트의 하나 이상의 특징 및 레플리콘의 임의의 하나 이상의 특징을 가질 수 있다. 상기 DNA 카세트는 핵에서 복제 및 전사가 장기간 지속적으로 일어나서 세포질로 안정적으로 RNA 카세트를 공급할 수 있다.The DNA cassette of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system may have one or more features of the RdRp mRNA cassette and any one or more features of the replicon included in the system according to the present invention. The DNA cassette can be continuously replicated and transcribed in the nucleus for a long period of time to stably supply the RNA cassette to the cytoplasm.

세포 내 단백질 생산 방법에서 사용되는 알파바이러스 RdRp를 발현시키기 위한 RNA 카세트 및 이에 상응하는 DNA 카세트 그리고 RNA 레플리콘 및 이에 상응하는 DNA 카세트는 본 발명에 따른 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 구성 요소이다.An RNA cassette and a corresponding DNA cassette and an RNA replicon and a corresponding DNA cassette for expressing the alphavirus RdRp used in the intracellular protein production method are components of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system according to the present invention. am.

하나 이상의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템이 접종될 수 있는 세포는 "대상세포"라고 지칭할 수 있다. 본 발명에 따라, 용어 "대상세포"는 복제 게놈 편집 시스템으로 형질전환되거나 형질주입될 수 있는 임의의 세포를 말한다. A cell into which one or more self-amplifying RNA/DNA hybrid expression systems can be inoculated may be referred to as a “subject cell”. According to the present invention, the term "subject cell" refers to any cell that can be transformed or transfected with a replicative genome editing system.

"세포"는 바람직하게는 무손상 세포, 즉 효소, 세포소기관 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 무손상 막을 갖는 세포이다. 무손상 세포는 바람직하게는 생존 가능한 세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. A “cell” is preferably an intact cell, i.e. a cell with an intact membrane that has not released normal intracellular components such as enzymes, organelles or genetic material. Intact cells are preferably viable cells, ie living cells capable of carrying out normal metabolic functions.

본 발명에 따르면, "대상세포"는 원핵세포(예를 들면, E.coli) 또는 진핵세포(예를 들어 인간 및 동물 세포, 및 곤충 세포)를 포함한다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 말, 소, 양 및 염소를 비롯한 가축뿐만 아니라 영장류로부터의 세포와 같은 포유류 세포가 특히 바람직하다. According to the present invention, a "subject cell" includes prokaryotic cells (eg E.coli) or eukaryotic cells (eg human and animal cells, and insect cells). Mammalian cells, such as cells from primates as well as livestock including humans, mice, hamsters, pigs, horses, cows, sheep and goats, are particularly preferred.

세포는 다수의 조직 유형으로부터 유도될 수 있고, 일차 세포 및 세포주를 포함할 수 있다. 각질, 말초 혈액성 백혈구, 골수 줄기세포 및 배아 줄기세포를 포함한다. 대상세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상세포, 단핵구 또는 대식세포이다. 핵산은 단일 또는 수개의 사본으로 대상세포에 존재할 수 있으며, 일 실시형태에서는 대상세포에서 발현된다.Cells may be derived from a number of tissue types and may include primary cells and cell lines. It includes keratin, peripheral blood leukocytes, bone marrow stem cells and embryonic stem cells. Target cells are antigen presenting cells, in particular dendritic cells, monocytes or macrophages. A nucleic acid can be present in a target cell in single or several copies, and in one embodiment is expressed in a target cell.

세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 원핵세포는 예를 들어 본 발명에 따른 DNA의 증식을 위해 본원에 적합하고, 진핵세포는 예를 들어 레플리콘의 오픈 리딩 프레임의 발현을 위해 본원에 적합하다.Cells may be prokaryotic or eukaryotic. Prokaryotic cells are suitable herein, eg for propagation of the DNA according to the present invention, and eukaryotic cells are suitable here, eg for expression of the open reading frame of a replicon.

본 발명의 방법에서, 본 발명에 따른 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템, 또는 본 발명에 따른 키트, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 약학 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 세포 내 핵산을 포함하는 조성물의 접종은 종래에 기재되어있다..In the method of the present invention, any of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system according to the present invention, or the kit according to the present invention, or the pharmaceutical composition according to the present invention may be used. Self-amplifying RNA/DNA hybrid expression systems can be used in the form of pharmaceutical compositions. Inoculation of compositions containing nucleic acids into cells has been previously described.

본 발명의 방법에 따르면, 대상세포에서 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 효율적으로 발현시킬 수 있다.According to the method of the present invention, the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system can be efficiently expressed in target cells.

본 발명에 따른 세포 내 단백질 생산 방법에서, 본 발명에 따른 상이한 RNA 카세트 (레플리콘 및 RdRp mRNA 카세트)와 DNA 카세트는 동일한 시점에 접종될 수 있거나 대안적으로 다른 시점에 접종될 수 있다. In the intracellular protein production method according to the present invention, different RNA cassettes (replicon and RdRp mRNA cassette) and DNA cassettes according to the present invention may be inoculated at the same time point or alternatively may be inoculated at different time points.

세포에서 단백질을 생산하는 방법은 시험관내 방법이다. 세포에서 단백질을 생산하는 방법은 수술 또는 치료에 의해 인간 또는 동물 대상체로부터 세포를 제거하는 것을 포함하지 않는다.Methods of producing proteins in cells are in vitro methods. A method of producing a protein in a cell does not include removing the cell from a human or animal subject by surgery or treatment.

본 발명에 따라 접종된 세포는 대상체에서 단백질을 생성시키고 대상체에게 단백질을 제공하도록 대상체에게 투여될 수 있다. Cells inoculated according to the invention can be administered to a subject to produce a protein in the subject and provide protein to the subject.

세포에서 단백질을 생산하는 방법에서의 그 세포는 환자와 같은 대상체에 존재할 수 있다. 세포에서 단백질을 생산하는 방법은 대상체에 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 투여하는 것을 포함하는 생체내 방법이다.In a method of producing a protein in a cell, the cell may be present in a subject such as a patient. A method of producing a protein in a cell is an in vivo method comprising administering a self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system to a subject.

본 발명에 따른 대상체에서 단백질 생산 방법은 특히 세포에서 단백질 합성에 적합하다. 바람직하게는, 대상체에서의 단백질 생산방법에서, RNA 레플리콘은 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 목적 RNA로서 코딩한다.The method for producing a protein in a subject according to the present invention is particularly suitable for protein synthesis in a cell. Preferably, in the method for producing a protein in a subject, the RNA replicon encodes the protein or polypeptide of interest as the target RNA.

바람직하게는, 레플리콘 및 RdRp mRNA 카세트가 동일한 관심 조직 또는 세포에 도달할 가망을 증가시키기 위해, RdRp mRNA 카세트의 투여와 동일한 부위에서 동일한 투여 경로를 통해 수행된다. "부위"는 대상체의 신체의 위치를 지칭한다. 적당한 부위는 예를 들면, 왼팔, 오른팔 등이다.Preferably, the replicon and the RdRp mRNA cassette are performed at the same site and via the same route of administration as the administration of the RdRp mRNA cassette to increase the likelihood of reaching the same tissue or cell of interest. "Location" refers to a location on a subject's body. Appropriate parts are, for example, the left arm, the right arm, and the like.

부가적인 RNA 분자, 바람직하게는 mRNA 분자가 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 부가적인 RNA 분자는 본 발명에 따른 레플리콘 또는 RdRp mRNA 카세트 또는 시스템의 투여 전에 투여될 수 있다.Additional RNA molecules, preferably mRNA molecules, may be administered to the subject. Optionally, additional RNA molecules can be administered prior to administration of the replicon or RdRp mRNA cassette or system according to the present invention.

본 발명에 따른 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템, 또는 본 발명에 따른 키트 또는 본 발명에 따른 약학 조성물 중 임의의 것이 본 발명에 따른 대상체에서 단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, RNA는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 약학 조성물의 형태로 사용될 수 있다. RNA를 포함하는 약학 조성물의 투여는 종래에 기재되어 있다.Any of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression systems according to the present invention, or kits according to the present invention, or pharmaceutical compositions according to the present invention, can be used in the methods of producing proteins in a subject according to the present invention. For example, in the methods of the invention, RNA may be used in the form of a pharmaceutical composition, eg as described herein. Administration of pharmaceutical compositions comprising RNA has been previously described.

대상체에게 투여될 수 있는 용량의 관점에서, 본 발명에 따른 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템, 또는 본 발명에 따른 키트, 또는 본 발명에 따른 약학 조성물 각각은 "의약품" 또는 이와 유사한 것으로 지칭될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 시스템, 키트 및/또는 약학 조성물이 의약품의 용도로 제공할 것이라 예견한다. In terms of the dose that can be administered to a subject, each of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system according to the present invention, or the kit according to the present invention, or the pharmaceutical composition according to the present invention can be referred to as a "medicine" or the like. there is. The present invention foresees that the system, kit and/or pharmaceutical composition of the present invention will provide for pharmaceutical use.

의약품은 대상체를 치료하는 데 사용할 수 있다. "치료"에 대해서는 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물 또는 다른 실체를 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 이 용어는 치료법에 의한 인간 또는 동물의 신체를 치료하는 방법을 포함한다.A pharmaceutical may be used to treat a subject. By "treatment" is meant administering to a subject a compound or composition or other entity as described herein. The term includes methods of treating the human or animal body by means of therapy.

본 발명에 따른 또 다른 의학적 용도는 본 발명에 따른 세포에서 단백질을 생산하는 방법을 포함하며, 상기 세포는 모든 세포일 수 있고, 이어서 상기 세포를 대상체에 도입한다. 예를 들어, 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템에 사용되는 관심 단백질을 코딩하는 레플리콘을 포함하는 시스템은 세포, 예를 들어 대상체로부터 수득된 세포 내에 도입(형질주입)시킬 수 있고, 선택적으로 생체외에서 클론 증식된 세포를 동일한 또는 다른 대상체에 재도입시킬 수 있다. 형질주입된 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 대상체에 재도입시킬 수 있다.Another medical use according to the present invention includes a method for producing a protein in a cell according to the present invention, which cell may be any cell, and then introducing the cell into a subject. For example, a system comprising a replicon encoding a protein of interest used in a self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system can be introduced (transfected) into a cell, e.g., a cell obtained from a subject, and optionally Cells cloned ex vivo can be reintroduced into the same or different subject. Transfected cells can be reintroduced into a subject using any means known in the art.

본 발명에 따른 의약품은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 의약품은 대상체의 예방뿐만 아니라 치료 방법에 사용될 수 있다.A medicament according to the present invention can be administered to a subject in need thereof. The pharmaceuticals of the present invention can be used in methods of treatment as well as prophylaxis of subjects.

본 발명에 따른 의약품은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 반응을 일으키거나 원하는 효과를 일으키기 위해 단독으로 또는 다른 투여와 함께 충분한 양을 의미한다. 대상체의 특정 질병 또는 특정 상태를 치료하는 경우, 원하는 효과는 질병 진행의 억제이다. 여기에는 질병 진행의 감속, 특히 질병 진행의 중단이 포함된다. 또한, 질병 또는 상태의 치료에서 원하는 효과는 질병 발병의 지연 또는 질병 발병의 억제일 수 있다.A medicament according to the present invention is administered in an effective amount. "Effective amount" means an amount sufficient, alone or in combination with other administrations, to elicit a response or produce a desired effect. When treating a particular disease or condition of a subject, the desired effect is inhibition of disease progression. This includes deceleration of disease progression, in particular halting of disease progression. Additionally, a desired effect in the treatment of a disease or condition may be delay in onset of a disease or inhibition of onset of a disease.

유효량은 치료되는 상태, 질병의 중증도, 나이, 생리 조건, 사이즈 및 체중을 포함하는 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, 동반 요법의 유형(있는 경우), 특정 투여 방식 및 기타 요인에 따라 달라질 수 있을 것이다.The effective amount may vary depending on the condition being treated, the severity of the disease, the patient's individual parameters including age, physiological condition, size and weight, duration of treatment, type of concomitant therapy (if any), specific mode of administration, and other factors. will be.

실시예Example

실시례 1, 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 주형 DNA Example 1, template DNA of self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system

본 발명에서 제안하는 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 제조하기 위해서, RdRp를 코딩하는 mRNA 및 관심 단백질을 코딩하는 mRNA 레플리콘을 제조하였다. To prepare the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system proposed in the present invention, an mRNA encoding RdRp and an mRNA replicon encoding a protein of interest were prepared.

1.1. RdRp mRNA를 포함하는 RNA 카세트의 주형 DNA 설계 1.1. Template DNA design of RNA cassettes containing RdRp mRNA

실시예에서 사용된 Semliki Forest 바이러스(SFV) RdRp mRNA를 포함하는 RNA 카세트의 주형 DNA는 시험관내 전사에 적합한 주형 DNA로 이를 제조하였다.The template DNA of the RNA cassette containing the Semliki Forest Virus (SFV) RdRp mRNA used in the examples was prepared as a template DNA suitable for in vitro transcription.

먼저, 기준 Semliki Forest 바이러스 레플리콘 플라스미드(pSFV1; Invitrogen #18448-019)는 ThermoFisher 사(미국)에서 구입하였다. 개시코돈이 제외된 알파바이러스 RdRp(RdRp ORF의 뉴클레오타이드 222-6321개)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임를 증폭하여 산물을 확보하였다.First, the reference Semliki Forest virus replicon plasmid (pSFV1; Invitrogen #18448-019) was purchased from ThermoFisher (USA). The product was obtained by amplifying the open reading frame encoding the alphavirus RdRp (nucleotides 222-6321 of the RdRp ORF) excluding the initiation codon.

상기 RdRp mRNA 카세트를 생성하기 위해, <T7 promoter - 5'UTR - RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(RdRp ORF의 뉴클레오타이드 222-6321개) DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>를 순서대로 라이게이션하여 재조합 DNA를 제조하였으며 상기 재조합 DNA 5'말단에 T7 프로모터 DNA를 라이게이션하였다. 이를 "RdRp RNA 카세트의 주형 DNA"이라고 지칭하였다.To generate the RdRp mRNA cassette, <T7 promoter - 5'UTR - open reading frame encoding RdRp (nucleotides 222-6321 of RdRp ORF) DNA - muag - A64 - C30 - histone-SL> were sequentially written. Recombinant DNA was prepared by gating, and T7 promoter DNA was ligated to the 5' end of the recombinant DNA. This was referred to as "template DNA of the RdRp RNA cassette".

본 발명의 T7 promoter는 T7 RNA Polymerase가 인지하여 하류 부위를 RNA로 전사시키며, 그 염기서열은 서열번호 1이다.The T7 promoter of the present invention is recognized by T7 RNA Polymerase and the downstream region is transcribed into RNA, and its nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1.

T7 promoter : TAATACGACT CACTATAGGG (서열번호 1)T7 promoter: TAATACGACT CACTATAGGG (SEQ ID NO: 1)

바람직하게, 상기 5'UTR는 hAg-Kozak로 서열번호 2이다Preferably, the 5'UTR is SEQ ID NO: 2 as hAg-Kozak

hAg-Kozak: ATTCTTCTGG TCCCCACAGA CTCAGAGAGA ACCCGCCACC(서열번호 2)hAg-Kozak: ATTCTTCTGG TCCCCACAGA CTCAGAGAGA ACCCGCCACC (SEQ ID NO: 2)

상기 5'UTR는 Kozak 컨센서스를 포함할 수도 있으며 그 염기서열은 서열번호 3이다. RdRp를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(RdRp ORF의 뉴클레오타이드 222-6321개)에 번역의 개시코돈이 결여를 고려해야 한다.The 5'UTR may include the Kozak consensus, and its nucleotide sequence is SEQ ID NO: 3. The lack of a translational initiation codon in the open reading frame encoding RdRp (nucleotides 222-6321 of the RdRp ORF) should be taken into account.

Kozak 컨센서스 서열: ACCAUGG (서열번호 3) Kozak Consensus Sequence: ACCAUGG (SEQ ID NO: 3)

3'UTR는 muag - A64 - C30 - 히스톤-SL 및 2 BgUTR-A30LA70을 포함하는 구조에서 선택되어진 어느 하나일 수 있다. The 3'UTR may be any one selected from structures including muag-A64-C30-histone-SL and 2 BgUTR-A30LA70.

바람직하게, 3'UTR은 muag<(알파-)글로빈의 돌연변이된 UTR, 염기서열 4>, 폴리(A) 꼬리는 64개의 아데닌 뉴클레오타이드(서열번호 5), 폴리(C) 서열은 30개의 사이토신 뉴클레오타이드(서열번호 6), 히스톤 스템-루프(서열번호 7)로 이루어진 RNA 서열이다. Preferably, the 3'UTR is muag<mutated UTR of (alpha-)globin, base sequence 4>, the poly (A) tail is 64 adenine nucleotides (SEQ ID NO: 5), and the poly (C) sequence is 30 cytosines It is an RNA sequence consisting of a nucleotide (SEQ ID NO: 6) and a histone stem-loop (SEQ ID NO: 7).

muag<(알파-)글로빈의 돌연변이된 UTR>; 5'-GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG-3'(서열번호 4; 밑줄 친 뉴클레오타이드는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이임)muag<mutated UTR of (alpha-)globin>; 5′-GCCCG a TGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG-3′ (SEQ ID NO: 4; underlined nucleotides are mutations compared to the wild-type sequence)

A64: GGACTAGTAG ATCTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA (서열번호 5) A64: GGACTAGTAG ATCTAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAA (SEQ ID NO: 5)

C30: TGCATCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCTCTA G (서열번호 6) C30: TGCATCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCTCTA G (SEQ ID NO: 6)

히스톤 스템-루프: 5'-CAAAGGCUCU UUUCAGAGCC ACCA-3' (서열번호 7)Histone stem-loop: 5'-CAAAGGCUCU UUUCAGAGCC ACCA-3' (SEQ ID NO: 7)

2 BgUTR; CCGAGAGCTC GUCGGCCAAC AAAAGGTTCU TGCCCAAGTC CAACA CAAAC TGGGGGATAT TATGAAGGGC CTTGAGCATC TGGATTCTGC CTAATAAAAA ACATTTACAT TGCTGCGTCG AGAGCTCGCT TCTTGCTGTC CAATTTCTAT TAAAGGTTCC TTTGTTCCCT AAGTCCAACT ACTAAACTGG GGGATATTAT GAAGGGCCTT GAGCATCTGG ATTCTGCCTA ATAAAAAACA TTTACATTGC TGCGTC (서열번호 8) 2 BgUTR; CCGAGAGCTC GUCGGCCAAC AAAAGGTTCU TGCCCAAGTC CAACA CAAAC TGGGGGATAT TATGAAGGGC CTTGAGCATC TGGATTCTGC CTAATAAAAA ACATTTACAT TGCTGCGTCG AGAGCTCGCT TCTTGCTGTC CAATTTCTAT TAAAGGTTCC TTTGTTCCCT AAGTCCAACT ACTAAACTGG GGGATATTAT GAAGGGCCTT GAGCATCTGG ATTCTGCCTA TCAACCTAGCTT8

A30LA70; GAGACCTGGT CCAGAGTCGC TAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCATAT GACTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA(서열번호 9) A30LA70; GAGACCTGGT CCAGAGTCGC TAGCAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAGCATAT GACTAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA

관심 단백질이 융합단백질인 경우는 링커는 (G4S)3-linker(서열번호 10 및 11) 그리고. 표적단백질을 세포외부로 분비하는 목적으로 Sec(서열번호 12 및 13)을 사용할 수 있다.If the protein of interest is a fusion protein, the linker is a (G4S)3-linker (SEQ ID NOs: 10 and 11) and. Sec (SEQ ID NOs: 12 and 13) can be used for the purpose of secreting the target protein to the outside of the cell.

(G4S)3-linker; GGAGGCGGTG GTAGTGGAGG TGGCGGGTCC GGTGGAGGTG GAAGC(서열번호 10) (G4S)3-linker; GGAGGCGGTG GTAGTGGAGG TGGCGGGTCC GGTGGAGGTG GAAGC (SEQ ID NO: 10)

(G G G G S G G G G S G G G G S; 서열번호 11) (G G G G S G G G G S G G G G S; SEQ ID NO: 11)

Sec: ATGAGAGTGA CCGCCCCCAG AACCCTGATC CTGCTGCTGT CTGGCGCCCT GGCCCTGACA GAGACATGGG CCGGAAGCGG ATCC (서열번호 12)Sec: ATGAGAGTGA CCGCCCCCAG AACCCTGATC CTGCTGCTGT CTGGCGCCCT GGCCCTGACA GAGACATGGG CCGGAAGCGG ATCC (SEQ ID NO: 12)

(M R V T A P R T L I L L L S G A L A L T E T W A G S G S; 서열번호 13)(M R V T A P R T L I L L L S G A L A L T E T W A G S G S; SEQ ID NO: 13)

1.2. 관심 단백질 mRNA를 포함하는 레플리콘 RNA 카세트의 주형 DNA 설계1.2. Template DNA design of a replicon RNA cassette containing the protein mRNA of interest

본 발명의 관심 단백질 mRNA를 포함하는 레플리콘 RNA 카세트는 SFV RdRp에 의해 복제될 수 있으며 관심 단백질 mRNA를 포함한다.A replicon RNA cassette comprising the mRNA of the protein of interest of the present invention can be replicated by SFV RdRp and contains the mRNA of the protein of interest.

관심 단백질 mRNA 레플리콘 RNA 카세트를 생성하기 위해서, 관심 단백질 mRNA 레플리콘 DNA 주형은 <T7 promoter - 5' 복제인식서열 DNA - SGP DNA - POI orf- 3' 복제인식서열 DNA - A64 - C30 - 히스톤-SL>를 순서대로 라이게이션하여 재조합 DNA를 제조하였으며 상기 재조합 DNA에 T7 프로모터 DNA를 라이게이션하였다. 이를 "관심 단백질 mRNA 레플리콘 주형 DNA"이라고 하였다.To generate a protein mRNA replicon RNA cassette of interest, the protein mRNA replicon DNA template of interest is <T7 promoter - 5' cloned recognition sequence DNA - SGP DNA - POI orf - 3' cloned recognition sequence DNA - A64 - C30 - Histone-SL> were sequentially ligated to prepare recombinant DNA, and T7 promoter DNA was ligated to the recombinant DNA. This was called "protein mRNA replicon template DNA of interest".

상기 5' 복제인식서열(CSE 1&2 DNA)는 ThermoFisher 사(미국)에서 구입한 Semliki Forest 바이러스 레플리콘 플라스미드(pSFV1, Invitrogen #18448-019)에서 상응하는 염기서열을 증폭하여 제조하거나 유기 합성하였으며, SGP(CSE3 DNA) 및 3' 복제인식서열 (CSE 4 DNA)는 유기 합성하였다.The 5' replication recognition sequence (CSE 1 & 2 DNA) was prepared by amplifying the corresponding nucleotide sequence from the Semliki Forest virus replicon plasmid (pSFV1, Invitrogen # 18448-019) purchased from ThermoFisher (USA) or organically synthesized, SGP (CSE3 DNA) and 3' replication recognition sequence (CSE 4 DNA) were organically synthesized.

관심 단백질 mRNA 레플리콘의 구성요소Components of the mRNA replicon for the protein of interest 이름name 염기서열base sequence 길이(nt)Length (nt) 5' 복제인식서열
(CSE 1&2)5' cloned recognition sequence
(CSE 1&2) ATGGCGGATG TGTGACATAC ACGACGCCAA AAGATTTTGT TCCAGCTCCT GCCACCTCCG CTACGCGAGA GATTAACCAC CCACGATGGC CGCCAAAGTG CATGTTGATA TTGAGGCTGA CAGCCCATTC ATCAAGTCTT TGCAGAAGGC ATTTCCGTCG TTCGAGGTGG AGTCATTGCA GGTCACACCA AATGACCATG CAAATGCCAG AGCATTTTCG CACCTGGCTA CCAAATTGA (서열번호 14)ATGGCGGATG TGTGACATAC ACGACGCCAA AAGATTTTGT TCCAGCTCCT GCCACCTCCG CTACGCGAGA GATTAACCAC CCACGATGGC CGCCAAAGTG CATGTTGATA TTGAGGCTGA CAGCCCATTC ATCAAGTCTT TGCAGAAGGC ATTTCCGTCG TTCGAGGTGG AGTCATTGCA GGTCACACCA AATGACCATG CAAATGCCAG CAAATGCCAG AGCATTTTCG CAAATT4 239239 GATGGCGGAT GTGTGACATA CAAGACGCCA AAAGATTTTG TTCCAGCTCC TGCCACCTCC GCTACGCGAG AGATTAACCA CCCACGACGG CCGCCAAAGT GCTTGTTGAT ATTGAGGCTG ACAGCCCATT CATCAAGTCT TAGCAGAAGG CATTTCCGTC GTTCGAGGTG GAGTCATTGG AGGTGACACC AAATCACCAT CCAAATCCCA GAGCATTTTC GCACCTGGGT ACCAAATTGA TCGAGCAGGA GACTGACAAA GACACACTCA TCTTGGATAT C (서열번호 15) GATGGCGGAT GTGTGACATA CAAGACGCCA AAAGATTTTG TTCCAGCTCC TGCCACCTCC GCTACGCGAG AGATTAACCA CCCACGACGG CCGCCAAAGT GCTTGTTGAT ATTGAGGCTG ACAGCCCATT CATCAAGTCT TAGCAGAAGG CATTTCCGTC GTTCGAGGTG GAGTCATTGG AGGTGACACC AAATCACCAT CCAAATCCCA GAGCATTTTC GCACCTGGGT ACCAAATTGA TCGAGCAGGA GACTGACAAA GACACACTCA TCTTGGATAT C (서열번호 15) 281281 Kozak sequenceKozak sequence GCC(A/G)CCATGG (서열번호 16)GCC(A/G)CCATGG (SEQ ID NO: 16) 1010 3'복제인식서열
(CSE 4)3' cloned recognition sequence
(CSE 4) ATTTTGTTTT TAATATTTC (서열번호 17)ATTTTGTTTT TAATATTTC (SEQ ID NO: 17) 1919 SGP(CSE 3)SGP (CSE 3) ACCTCTACGG CGGTCCTAAA TAGG (서열번호 18)ACCTCTACGG CGGTCCTAAA TAGG (SEQ ID NO: 18) 2323 NLSNLS PKKKRKV
(N-말단)PKKKRKV
(N-terminus) CCCAAGAAGA AGAGGAAGGT G (서열번호(19)CCCAAGAAGA AGAGGAAGGT G (SEQ ID NO: (19) 2121 CCAAAGAAGA AGAGGAAGGT T (서열번호 20)CCAAAGAAGA AGAGGAAGGT T (SEQ ID NO: 20) 2121 SGGSPKKKRKV
(C-말단)SGGSPKKKRKV
(C-terminus) TCGGGGGGGA GCCCAAAGAA GAAGCGGAAG GTG (서열번호 21)TCGGGGGGGA GCCCAAAGAA GAAGCGGAAG GTG (SEQ ID NO: 21) 3333

본 발명에서 사용한 관심 단백질을 구체적으로 살펴보면,Looking specifically at the protein of interest used in the present invention,

본 실시례에서 사용된 mRNAi는 TNFR2 단백질, GM-CSF, 및 EPO, 광견병 바이러스의 G 단백질(RAV-G) 및 호흡기세포융합바이러스 (Ripiratory Syncytial Virus, RSV) 롱(long) 균주의 RSV-F 단백질 등을 코딩하는 mRNA이며 이에만 제한된 것은 아니다.The mRNAi used in this example are TNFR2 protein, GM-CSF, and EPO, rabies virus G protein (RAV-G) and respiratory syncytial virus (RSV) long strain RSV-F protein It is an mRNA encoding the etc., but is not limited thereto.

본 발명에 사용된 mRNAi의 구성 순서는 아래와 같다.The order of construction of mRNAi used in the present invention is as follows.

<치료용 단백질><Therapeutic protein>

sTNFR2sTNFR2

본 발명의 치료 단백질은, TNFR2 단백질 또는 이의 세포외 영역 단편이다. 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현 사이토카인으로, 특히 TNF-α는 염증성 반응 및 면역 체계에서 중요한 역할을 담당한다. TNF 에 결합하는 수용체로서 TNFR1(분자량, 55 kD; TNF-R55) 및 TNFR2(분자량,75 kD; TNF-R75)가 알려져 있으며, 이 때 TNFR2에 대한 TNF-α의 친화도는 TNFR1에 대한 친화도보다 몇 배 더높다고 알려져 있다.The therapeutic protein of the present invention is a TNFR2 protein or an extracellular domain fragment thereof. Tumor necrosis factor (TNF) is a pleiotropic cytokine, especially TNF-α, which plays an important role in the inflammatory response and immune system. As receptors that bind to TNF, TNFR1 (molecular weight, 55 kD; TNF-R55) and TNFR2 (molecular weight, 75 kD; TNF-R75) are known, and the affinity of TNF-α for TNFR2 is the affinity for TNFR1. It is known to be several times higher than

본 발명에서 TNFR2 단백질은 1386 bp DNA(NM_001066.3에 코딩되었으며, 이 단백질 또는 이의 세포외 영역 단편(sTNFR2)은 TNF-α에 대하여 높은 결합 친화도를 가지며 TNF-α의 작용을 억제함으로써 자가 면역 질환의 치료에 특히 우수한 효과를 나타낼 수 있다. In the present invention, the TNFR2 protein is encoded in 1386 bp DNA (NM_001066.3), and this protein or its extracellular domain fragment (sTNFR2) has a high binding affinity to TNF-α and inhibits the action of TNF-α, thereby preventing autoimmunity. It can show a particularly excellent effect in the treatment of diseases.

바람직하게, 상기 sTNFR2는 TNFR2 단백질 중 N말단으로부터 1번 내지 256번을 포함하는 서열번호 23의 아미노산 서열 폴리펩타이드일 수 있다.Preferably, the sTNFR2 may be an amino acid sequence polypeptide of SEQ ID NO: 23 including positions 1 to 256 from the N-terminus of the TNFR2 protein.

또한 바람직하게, 상기 sTNFR2 cDNA는 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.Also preferably, the sTNFR2 cDNA may be a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.

sTNFR2: TNFR2의 1 ~ 256 아미노산으로 이루어진 transmembrane sequence 단편 sTNFR2 : Transmembrane sequence fragment consisting of 1 to 256 amino acids of TNFR2

MAPVAVWAAL AVGLELWAAA HALPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQLWNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTETSDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR PHQICNVVAI PGNASMDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STRSQHTQPT PEPSTAPSTS FLLPMGPSPP AEGSTG (서열번호 22)MAPVAVWAAL AVGLELWAAA HALPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQLWNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTETSDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR PHQICNVVAI PGNASMDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STRSQHTQPT PEPSTAPSTS FLLPMGPSPP AEGSTG (서열번호 22)

sTNFR2 cDNA; sTNFR2에 상응하는 cDNA(768bp) sTNFR2 cDNA ; cDNA corresponding to sTNFR2 (768 bp)

ATGGCGCCC GTCGCCGTCT GGGCCGCGCT GGCCGTCGGA CTGGAGCTCT GGGCTGCGGC GCACGCCTTG CCCGCCCAGG TGGCATTTAC ACCCTACGCC CCGGAGCCCG GGAGCACATG CCGGCTCAGA GAATACTATG ACCAGACAGC TCAGATGTGC TGCAGCAAAT GCTCGCCGGG CCAACATGCA AAAGTCTTCT GTACCAAGAC CTCGGACACC GTGTGTGACT CCTGTGAGGA CAGCACATAC ACCCAGCTCT GGAACTGGGT TCCCGAGTGC TTGAGCTGTG GCTCCCGCTG TAGCTCTGAC CAGGTGGAAA CTCAAGCCTG CACTCGGGAA CAGAACCGCA TCTGCACCTG CAGGCCCGGC TGGTACTGCG CGCTGAGCAA GCAGGAGGGG TGCCGGCTGT GCGCGCCGCT GCGCAAGTGC CGCCCGGGCT TCGGCGTGGC CAGACCAGGA ACTGAAACAT CAGACGTGGT GTGCAAGCCC TGTGCCCCGG GGACGTTCTC CAACACGACT TCATCCACGG ATATTTGCAG GCCCCACCAG ATCTGTAACG TGGTGGCCAT CCCTGGGAAT GCAAGCATGG ATGCAGTCTG CACGTCCACG TCCCCCACCC GGAGTATGGC CCCAGGGGCA GTACACTTAC CCCAGCCAGT GTCCACACGA TCCCAACACA CGCAGCCAAC TCCAGAACCC AGCACTGCTC CAAGCACCTC CTTCCTGCTC CCAATGGGCC CCAGCCCCCC AGCTGAAGGG AGCACTGGC (서열번호 23)ATGGCGCCC GTCGCCGTCT GGGCCGCGCT GGCCGTCGGA CTGGAGCTCT GGGCTGCGGC GCACGCCTTG CCCGCCCAGG TGGCATTTAC ACCCTACGCC CCGGAGCCCG GGAGCACATG CCGGCTCAGA GAATACTATG ACCAGACAGC TCAGATGTGC TGCAGCAAAT GCTCGCCGGG CCAACATGCA AAAGTCTTCT GTACCAAGAC CTCGGACACC GTGTGTGACT CCTGTGAGGA CAGCACATAC ACCCAGCTCT GGAACTGGGT TCCCGAGTGC TTGAGCTGTG GCTCCCGCTG TAGCTCTGAC CAGGTGGAAA CTCAAGCCTG CACTCGGGAA CAGAACCGCA TCTGCACCTG CAGGCCCGGC TGGTACTGCG CGCTGAGCAA GCAGGAGGGG TGCCGGCTGT GCGCGCCGCT GCGCAAGTGC CGCCCGGGCT TCGGCGTGGC CAGACCAGGA ACTGAAACAT CAGACGTGGT GTGCAAGCCC TGTGCCCCGG GGACGTTCTC CAACACGACT TCATCCACGG ATATTTGCAG GCCCCACCAG ATCTGTAACG TGGTGGCCAT CCCTGGGAAT GCAAGCATGG ATGCAGTCTG CACGTCCACG TCCCCCACCC GGAGTATGGC CCCAGGGGCA GTACACTTAC CCCAGCCAGT GTCCACACGA TCCCAACACA CGCAGCCAAC TCCAGAACCC AGCACTGCTC CAAGCACCTC CTTCCTGCTC CCAATGGGCC CCAGCCCCCC AGCTGAAGGG AGCACTGGC (서열번호 23)

EPOEPO

본 발명의 EPO RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 쥣과의(murine) EPO cDNA의 염기서열은 다음과 같다. For the preparation of the EPO RNA expression cassette of the present invention, the nucleotide sequence of the murine EPO cDNA is as follows.

EPO cDNAEPO cDNA

ATGGGCGTGC CCGAGCGGCC GACCCTGCTC CTGCTGCTCA GCCTGCTGCT CATCCCCCTG GGGCTGCCCG TCCTCTGCGC CCCCCCGCGC CTGATCTGCG ACTCCCGGGT GCTGGAGCGC TACATCCTCG AGGCCAAGGA GGCGGAGAAC GTGACCATGG GCTGCGCCGA GGGGCCCCGG CTGAGCGAGA ACATCACGGT CCCCGACACC AAGGTGAACT TCTACGCCTG GAAGCGCATG GAGGTGGAGG AGCAGGCCAT CGAGGTCTGG CAGGGCCTGT CCCTCCTGAG CGAGGCCATC CTGCAGGCGC AGGCCCTCCT GGCCAACTCC AGCCAGCCCC CGGAGACACT GCAGCTCCAC ATCGACAAGG CCATCTCCGG GCTGCGGAGC CTGACCTCCC TCCTGCGCGT GCTGGGCGCG CAGAAGGAGC TCATGAGCCC GCCCGACACG ACCCCCCCGG CCCCGCTGCG GACCCTGACC GTGGACACGT TCTGCAAGCT CTTCCGCGTC TACGCCAACT TCCTGCGGGG CAAGCTGAAG CTCTACACCG GGGAGGTGTG CCGCCGGGGC GACCGCTGA (서열번호 24) ATGGGCGTGC CCGAGCGGCC GACCCTGCTC CTGCTGCTCA GCCTGCTGCT CATCCCCCTG GGGCTGCCCG TCCTCTGCGC CCCCCCGCGC CTGATCTGCG ACTCCCGGGT GCTGGAGCGC TACATCCTCG AGGCCAAGGA GGCGGAGAAC GTGACCATGG GCTGCGCCGA GGGGCCCCGG CTGAGCGAGA ACATCACGGT CCCCGACACC AAGGTGAACT TCTACGCCTG GAAGCGCATG GAGGTGGAGG AGCAGGCCAT CGAGGTCTGG CAGGGCCTGT CCCTCCTGAG CGAGGCCATC CTGCAGGCGC AGGCCCTCCT GGCCAACTCC AGCCAGCCCC CGGAGACACT GCAGCTCCAC ATCGACAAGG CCATCTCCGG GCTGCGGAGC CTGACCTCCC TCCTGCGCGT GCTGGGCGCG CAGAAGGAGC TCATGAGCCC GCCCGACACG ACCCCCCCGG CCCCGCTGCG GACCCTGACC GTGGACACGT TCTGCAAGCT CTTCCGCGTC TACGCCAACT TCCTGCGGGG CAAGCTGAAG CTCTACACCG GGGAGGTGTG CCGCCGGGGC GACCGCTGA (SEQ ID NO: 24)

GM CSFGM CSF

본 발명의 GM CSF RNA 발현카세트의 제조를 위하여, GM CSF (CSF2) (NM_000758)의 염기서열은 다음과 같다. For the preparation of the GM CSF RNA expression cassette of the present invention, the nucleotide sequence of GM CSF (CSF2) (NM_000758) is as follows.

GM CSF (CSF2) cDNA (NM_000758) GM CSF (CSF2) cDNA (NM_000758)

ATGTGGCTGC AGAGCCTGCT GCTCTTGGGC ACTGTGGCCT GCAGCATCTC TGCACCCGCC CGCTCGCCCA GCCCCAGCAC GCAGCCCTGG GAGCATGTGA ATGCCATCCA GGAGGCCCGG CGTCTCCTGA ACCTGAGTAG AGACACTGCT GCTGAGATGA ATGAAACAGT AGAAGTCATC TCAGAAATGT TTGACCTCCA GGAGCCGACC TGCCTACAGA CCCGCCTGGA GCTGTACAAG CAGGGCCTGC GGGGCAGCCT CACCAAGCTC AAGGGCCCCT TGACCATGAT GGCCAGCCAC TACAAGCAGC ACTGCCCTCC AACCCCGGAA ACTTCCTGTG CAACCCAGAT TATCACCTTT GAAAGTTTCA AAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTCA TCCCCTTTGA CTGCTGGGAG CCAGTCCAGG AGTGA (서열번호 25)ATGTGGCTGC AGAGCCTGCT GCTCTTGGGC ACTGTGGCCT GCAGCATCTC TGCACCCGCC CGCTCGCCCA GCCCCAGCAC GCAGCCCTGG GAGCATGTGA ATGCCATCCA GGAGGCCCGG CGTCTCCTGA ACCTGAGTAG AGACACTGCT GCTGAGATGA ATGAAACAGT AGAAGTCATC TCAGAAATGT TTGACCTCCA GGAGCCGACC TGCCTACAGA CCCGCCTGGA GCTGTACAAG CAGGGCCTGC GGGGCAGCCT CACCAAGCTC AAGGGCCCCT TGACCATGAT GGCCAGCCAC TACAAGCAGC ACTGCCCTCC AACCCCGGAA ACTTCCTGTG CAACCCAGAT TATCACCTTT GAAAGTTTCA AAGAGAACCT GAAGGACTTT CTGCTTGTCA TCCCCTTTGA CTGCTGGGAG CCAGTCCAGG AGTGA (서열번호 25)

<백신 접종 단백질><Vaccinating protein>

광견병 바이러스의 G 단백질(RAV-G)G protein of rabies virus (RAV-G)

본 발명의 RAV-G RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 광견병 바이러스의 G 단백질(RAV-G)의 염기서열은 다음과 같다. For the preparation of the RAV-G RNA expression cassette of the present invention, the nucleotide sequence of the rabies virus G protein (RAV-G) is as follows.

RAV-G cDNARAV-G cDNA

ATGGTGCCCC AGGCCCTGCT CTTCGTCCCG CTGCTGGTGT TCCCCCTCTG CTTCGGCAAG TTCCCCATCT ACACCATCCC CGACAAGCTG GGGCCGTGGA GCCCCATCGA CATCCACCAC CTGTCCTGCC CCAACAACCT CGTGGTCGAG GACGAGGGCT GCACCAACCT GAGCGGGTTC TCCTACATGG AGCTGAAGGT GGGCTACATC AGCGCCATCA AGATGAACGG GTTCACGTGC ACCGGCGTGG TCACCGAGGC GGAGACCTAC ACGAACTTCG TGGGCTACGT GACCACCACC TTCAAGCGGA AGCACTTCCG CCCCACGCCG GACGCCTGCC GGGCCGCCTA CAACTGGAAG ATGGCCGGGG ACCCCCGCTA CGAGGAGTCC CTCCACAACC CCTACCCCGA CTACCACTGG CTGCGGACCG TCAAGACCAC CAAGGAGAGC CTGGTGATCA TCTCCCCGAG CGTGGCGGAC CTCGACCCCT ACGACCGCTC CCTGCACAGC CGGGTCTTCC CCGGCGGGAA CTGCTCCGGC GTGGCCGTGA GCTCCACGTA CTGCAGCACC AACCACGACT ACACCATCTG GATGCCCGAG AACCCGCGCC TGGGGATGTC CTGCGACATC TTCACCAACA GCCGGGGCAA GCGCGCCTCC AAGGGCAGCG AGACGTGCGG GTTCGTCGAC GAGCGGGGCC TCTACAAGTC CCTGAAGGGG GCCTGCAAGC TGAAGCTCTG CGGCGTGCTG GGCCTGCGCC TCATGGACGG GACCTGGGTG GCGATGCAGA CCAGCAACGA GACCAAGTGG TGCCCCCCCG GCCAGCTGGT CAACCTGCAC GACTTCCGGA GCGACGAGAT CGAGCACCTC GTGGTGGAGG AGCTGGTCAA GAAGCGCGAG GAGTGCCTGG ACGCCCTCGA GTCCATCATG ACGACCAAGA GCGTGTCCTT CCGGCGCCTG AGCCACCTGC GGAAGCTCGT GCCCGGGTTC GGCAAGGCCT ACACCATCTT CAACAAGACC CTGATGGAGG CCGACGCCCA CTACAAGTCC GTCCGCACGT GGAACGAGAT CATCCCGAGC AAGGGGTGCC TGCGGGTGGG CGGCCGCTGC CACCCCCACG TCAACGGGGT GTTCTTCAAC GGCATCATCC TCGGGCCCGA CGGCAACGTG CTGATCCCCG AGATGCAGTC CAGCCTGCTC CAGCAGCACA TGGAGCTGCT GGTCTCCAGC GTGATCCCGC TCATGCACCC CCTGGCGGAC CCCTCCACCG TGTTCAAGAA CGGGGACGAG GCCGAGGACT TCGTCGAGGT GCACCTGCCC GACGTGCACG AGCGGATCAG CGGCGTCGAC CTCGGCCTGC CGAACTGGGG GAAGTACGTG CTGCTCTCCG CCGGCGCCCT GACCGCCCTG ATGCTGATCA TCTTCCTCAT GACCTGCTGG CGCCGGGTGA ACCGGAGCGA GCCCACGCAG CACAACCTGC GCGGGACCGG CCGGGAGGTC TCCGTGACCC CGCAGAGCGG GAAGATCATC TCCAGCTGGG AGTCCTACAA GAGCGGCGGC GAGACCGGGC TGTGAGGACT AGTTATAAGA CTGACTATGA (서열번호 26) ATGGTGCCCC AGGCCCTGCT CTTCGTCCCG CTGCTGGTGT TCCCCCTCTG CTTCGGCAAG TTCCCCATCT ACACCATCCC CGACAAGCTG GGGCCGTGGA GCCCCATCGA CATCCACCAC CTGTCCTGCC CCAACAACCT CGTGGTCGAG GACGAGGGCT GCACCAACCT GAGCGGGTTC TCCTACATGG AGCTGAAGGT GGGCTACATC AGCGCCATCA AGATGAACGG GTTCACGTGC ACCGGCGTGG TCACCGAGGC GGAGACCTAC ACGAACTTCG TGGGCTACGT GACCACCACC TTCAAGCGGA AGCACTTCCG CCCCACGCCG GACGCCTGCC GGGCCGCCTA CAACTGGAAG ATGGCCGGGG ACCCCCGCTA CGAGGAGTCC CTCCACAACC CCTACCCCGA CTACCACTGG CTGCGGACCG TCAAGACCAC CAAGGAGAGC CTGGTGATCA TCTCCCCGAG CGTGGCGGAC CTCGACCCCT ACGACCGCTC CCTGCACAGC CGGGTCTTCC CCGGCGGGAA CTGCTCCGGC GTGGCCGTGA GCTCCACGTA CTGCAGCACC AACCACGACT ACACCATCTG GATGCCCGAG AACCCGCGCC TGGGGATGTC CTGCGACATC TTCACCAACA GCCGGGGCAA GCGCGCCTCC AAGGGCAGCG AGACGTGCGG GTTCGTCGAC GAGCGGGGCC TCTACAAGTC CCTGAAGGGG GCCTGCAAGC TGAAGCTCTG CGGCGTGCTG GGCCTGCGCC TCATGGACGG GACCTGGGTG GCGATGCAGA CCAGCAACGA GACCAAGTGG TGCCCCCCCG GCCAGCTGGT CAACCTGCAC GACTTCCGGA GCGACGAGAT CGAGCACCTC GTGGTGGAGG AGCTGGTCAA GAAGCGCGAG GAGTGCCTGG ACGCCCTCGA GTCCATCATG ACGACCAAGA GCGTGTCCTT CCGGCGCCTG AGCCACCTGC GGAAGCTCGT GCCCGGGTTC GGCAAGGCCT ACACCATCTT CAACAAGACC CTGATGGAGG CCGACGCCCA CTACAAGTCC GTCCGCACGT GGAACGAGAT CATCCCGAGC AAGGGGTGCC TGCGGGTGGG CGGCCGCTGC CACCCCCACG TCAACGGGGT GTTCTTCAAC GGCATCATCC TCGGGCCCGA CGGCAACGTG CTGATCCCCG AGATGCAGTC CAGCCTGCTC CAGCAGCACA TGGAGCTGCT GGTCTCCAGC GTGATCCCGC TCATGCACCC CCTGGCGGAC CCCTCCACCG TGTTCAAGAA CGGGGACGAG GCCGAGGACT TCGTCGAGGT GCACCTGCCC GACGTGCACG AGCGGATCAG CGGCGTCGAC CTCGGCCTGC CGAACTGGGG GAAGTACGTG CTGCTCTCCG CCGGCGCCCT GACCGCCCTG ATGCTGATCA TCTTCCTCAT GACCTGCTGG CGCCGGGTGA ACCGGAGCGA GCCCACGCAG CACAACCTGC GCGGGACCGG CCGGGAGGTC (SEQ ID NO: 26)

RSV 롱(long) 균주의 RSV-F 단백질RSV-F protein from RSV long strains

본 발명의 RSV-F RNA 발현카세트의 제조를 위하여, 호흡기세포융합바이러스 (Ripiratory SynCytial Virus, RSV) 롱(long) 균주의 RSV-F 단백질의 염기서열은 다음과 같다. For the preparation of the RSV-F RNA expression cassette of the present invention, the nucleotide sequence of the RSV-F protein of the long strain of respiratory syncytial virus (RSV) is as follows.

RSV-F long(GC) cDNARSV-F long (GC) cDNA

ATGGAGCTGC CCATCCTCAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGGCGGC CGTGACGTTC TGCTTCGCCA GCTCCCAGAA CATCACCGAG GAGTTCTACC AGAGCACCTG CTCCGCCGTC AGCAAGGGCT ACCTGTCCGC CCTCCGGACC GGGTGGTACA CGAGCGTGAT CACCATCGAG CTGTCCAACA TCAAGGAGAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CGAAGGTGAA GCTGATCAAC CAGGAGCTCG ACAAGTACAA GAACGCCGTC ACCGAGCTGC AGCTGCTCAT GCAGAGCACG ACCGCCGCCA ACAACCGCGC GCGGCGCGAG CTGCCGCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC AACACCAAGA AGACGAACGT GACCCTCTCC AAGAAGCGCA AGCGGCGCTT CCTGGGGTTC CTGCTCGGCG TGGGGAGCGC CATCGCCTCC GGCATCGCCG TCAGCAAGGT GCTGCACCTG GAGGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTCCTGAGCA CCAACAAGGC GGTCGTGTCC CTGAGCAACG GGGTGTCCGT CCTCACCAGC AAGGTGCTGG ACCTGAAGAA CTACATCGAC AAGCAGCTCC TGCCCATCGT GAACAAGCAG TCCTGCCGGA TCAGCAACAT CGAGACGGTC ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGCCTG CTCGAGATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC GCCGGCGTGA CCACCCCCGT CTCCACGTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTCTCCCTG ATCAACGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAGAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC GTGCGCCAGC AGTCCTACAG CATCATGTCC ATCATCAAGG AGGAGGTCCT CGCCTACGTG GTGCAGCTGC CGCTGTACGG GGTCATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTCCA CACGAGCCCC CTGTGCACCA CCAACACCAA GGAGGGCTCC AACATCTGCC TGACGCGGAC CGACCGCGGG TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGTCC TTCTTCCCCC AGGCCGAGAC CTGCAAGGTC CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACTCCCTCA CGCTGCCGAG CGAGGTGAAC CTGTGCAACG TCGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC GACGTGAGCT CCAGCGTGAT CACCTCCCTC GGCGCGATCG TCAGCTGCTA CGGGAAGACG AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGCGGC ATCATCAAGA CCTTCTCCAA CGGGTGCGAC TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTC TCCGTGGGCA ACACCCTGTA CTACGTGAAC AAGCAGGAGG GGAAGAGCCT GTACGTCAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC CTCGTGTTCC CGTCCGACGA GTTCGACGCC AGCATCTCCC AGGTGAACGA GAAGATCAAC CAGAGCCTGG CCTTCATCCG GAAGTCCGAC GAGCTGCTGC ACCACGTCAA CGCCGGGAAG AGCACGACCA ACATCATGAT CACCACCATC ATCATCGTGA TCATCGTGAT CCTCCTGTCC CTGATCGCGG TCGGCCTCCT GCTGTACTGC AAGGCCCGCA GCACGCCCGT GACCCTCTCC AAGGACCAGC TGA (서열번호 27)ATGGAGCTGC CCATCCTCAA GGCCAACGCC ATCACCACCA TCCTGGCGGC CGTGACGTTC TGCTTCGCCA GCTCCCAGAA CATCACCGAG GAGTTCTACC AGAGCACCTG CTCCGCCGTC AGCAAGGGCT ACCTGTCCGC CCTCCGGACC GGGTGGTACA CGAGCGTGAT CACCATCGAG CTGTCCAACA TCAAGGAGAA CAAGTGCAAC GGCACCGACG CGAAGGTGAA GCTGATCAAC CAGGAGCTCG ACAAGTACAA GAACGCCGTC ACCGAGCTGC AGCTGCTCAT GCAGAGCACG ACCGCCGCCA ACAACCGCGC GCGGCGCGAG CTGCCGCGGT TCATGAACTA CACCCTGAAC AACACCAAGA AGACGAACGT GACCCTCTCC AAGAAGCGCA AGCGGCGCTT CCTGGGGTTC CTGCTCGGCG TGGGGAGCGC CATCGCCTCC GGCATCGCCG TCAGCAAGGT GCTGCACCTG GAGGGCGAGG TGAACAAGAT CAAGTCCGCC CTCCTGAGCA CCAACAAGGC GGTCGTGTCC CTGAGCAACG GGGTGTCCGT CCTCACCAGC AAGGTGCTGG ACCTGAAGAA CTACATCGAC AAGCAGCTCC TGCCCATCGT GAACAAGCAG TCCTGCCGGA TCAGCAACAT CGAGACGGTC ATCGAGTTCC AGCAGAAGAA CAACCGCCTG CTCGAGATCA CCCGGGAGTT CAGCGTGAAC GCCGGCGTGA CCACCCCCGT CTCCACGTAC ATGCTGACCA ACAGCGAGCT GCTCTCCCTG ATCAACGACA TGCCCATCAC CAACGACCAG AAGAAGCTGA TGAGCAACAA CGTGCAGATC GTGCGCCAGC AGTCCTACAG CATCATGTCC ATCATCAAGG AGGAGGTCCT CGCCTACGTG GTGCAGCTGC CGCTGTACGG GGTCATCGAC ACCCCCTGCT GGAAGCTCCA CACGAGCCCC CTGTGCACCA CCAACACCAA GGAGGGCTCC AACATCTGCC TGACGCGGAC CGACCGCGGG TGGTACTGCG ACAACGCCGG CAGCGTGTCC TTCTTCCCCC AGGCCGAGAC CTGCAAGGTC CAGAGCAACC GGGTGTTCTG CGACACCATG AACTCCCTCA CGCTGCCGAG CGAGGTGAAC CTGTGCAACG TCGACATCTT CAACCCCAAG TACGACTGCA AGATCATGAC CTCCAAGACC GACGTGAGCT CCAGCGTGAT CACCTCCCTC GGCGCGATCG TCAGCTGCTA CGGGAAGACG AAGTGCACCG CCAGCAACAA GAACCGCGGC ATCATCAAGA CCTTCTCCAA CGGGTGCGAC TACGTGAGCA ACAAGGGCGT GGACACCGTC TCCGTGGGCA ACACCCTGTA CTACGTGAAC AAGCAGGAGG GGAAGAGCCT GTACGTCAAG GGCGAGCCCA TCATCAACTT CTACGACCCC CTCGTGTTCC CGTCCGACGA GTTCGACGCC AGCATCTCCC AGGTGAACGA GAAGATCAAC (SEQ ID NO: 27)

1.3. RNA 카세트 주형 DNA의 제조1.3. Preparation of RNA cassette template DNA

본 발명에서 사용되는 RNA 카세트 DNA 주형은 RdDp 카세트 DNA 주형 및 관심 mRNA 레플리콘 카세트 DNA 주형이 있다. The RNA cassette DNA template used in the present invention includes an RdDp cassette DNA template and an mRNA replicon cassette DNA template of interest.

먼저, RdRp 카세트 DNA는 <T7 promoter - 5'UTR - RdRp ORF DNA - muag - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서이고, 관심 mRNA 레프리콘 카세트 DNA는 <T7 promoter - 5' 복제인식서열 DNA - SGP DNA - POI orf- 3' 복제인식서열 DNA - A64 - C30 - 히스톤-SL> 순서이다. First, the RdRp cassette DNA is in the order <T7 promoter - 5'UTR - RdRp ORF DNA - muag - A64 - C30 - Histone-SL>, and the mRNA leprechaun cassette DNA of interest is <T7 promoter - 5' cloned recognition sequence DNA - SGP DNA - POI orf - 3' replication recognition sequence DNA - A64 - C30 - Histone-SL> sequence.

이들 카세트 DNA를 주형으로 정방향 플라이머 5'-GAATTC TAAT ACGACTCACT ATAGGG-3' (서열번호 28) 및 역방향 프라이머 5'-GGATCCTGGTG GCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (서열번호 29)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. 사용된 프라이머의 양 말단은 ECoRI/BamHI 인식서열이 포함되어 있다. These cassette DNAs were amplified using forward primer 5'- GAATTC TAAT ACGACTCACT ATAGGG -3' (SEQ ID NO: 28) and reverse primer 5'- GGATCC TGGTG GCTCTAAAA GAGCCTTTGG-3' (SEQ ID NO: 29) as template. Here the target sequence of T7pol is underlined. Both ends of the primers used contain ECoRI/BamHI recognition sequences.

증폭된 PCR 산물을 EcoRI/BamHI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/BamHI 효소로 선형화된 pUC19 벡터와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 ECoRI/BamHI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 3).The amplified PCR product was digested using EcoRI/BamHI enzyme, and then cloned using pUC19 vector linearized with EcoRI/BamHI enzyme and T4 DNA ligase. The reaction solution was transformed into Escherichia coli, and plasmids were isolated from the selected strain, treated with ECoRI/BamHI restriction enzymes, and subjected to electrophoresis (FIG. 3).

실시레 2. 자가 증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 제조Example 2. Preparation of self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system

2.1. RNA 카세트 2.1. RNA cassette

본 발명의 RdRp RNA 카세트 및 레플리콘 RNA 카세트를 제조하기 위해, 상기 실시례에서 <T7 promoter - 5'UTR - RdRp orf- muag - A64 - C30 - 히스톤-SL>를 포함하는 RdRp DNA 및 <T7 promoter - 5' 복제인식서열 DNA - SGP DNA - POI orf- 3' 복제인식서열 DNA - A64 - C30 - 히스톤-SL>를 포함하는 레플리콘 DNA를 각각 제작하여 pUC19 클로닝 벡터에 재조합하고, 재조합 pUC19 벡터에서 얻은 T7 프로모터가 있는 RdRp DNA 및 레플리콘 DNA를 주형으로 체외전사와, 5′Cap 구조 부가 반응을 HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioScience, 미국)로 실시하여 캡핑이된 mRNA를 제조하였다.To prepare the RdRp RNA cassette and replicon RNA cassette of the present invention, in the above example, RdRp DNA containing <T7 promoter-5'UTR-RdRp orf-muag-A64-C30-histone-SL> and <T7 Replicon DNA containing promoter - 5' replication recognition sequence DNA - SGP DNA - POI orf- 3' replication recognition sequence DNA - A64 - C30 - histone-SL> was prepared and recombined into the pUC19 cloning vector, and the recombinant pUC19 RdRp DNA and replicon DNA with T7 promoter obtained from the vector were used as templates for in vitro transcription and 5′Cap structure addition reaction was performed with the HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioScience, USA). Capped mRNA was prepared.

RdRp RNA 카세트, 캡된 RdRp mRNA을 합성하기 위하여, 먼저 상기 실시례에서 제조한 RdRp pUC19 벡터를 주형으로 정방향 프라이머 (서열번호 28) 및 역방향 프라이머 (서열번호 29)을 사용하여 증폭하였다. 여기서 T7pol의 표적 서열에 밑줄이 그어져 있다. PCR 산물을 주형으로 체외전사하였다(도 4).To synthesize the RdRp RNA cassette and capped RdRp mRNA, first, the RdRp pUC19 vector prepared in the above example was amplified using a forward primer (SEQ ID NO: 28) and a reverse primer (SEQ ID NO: 29) as a template. Here the target sequence of T7pol is underlined. The PCR product was transcribed in vitro as a template (FIG. 4).

이러한 T7 promoter-RdRp DNA 주형으로 HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioScience, 미국)를 이용하여 캡된 RdRp mRNA를 포함하는 RdRp RNA 발현 카세트를 시험관 내에서 합성하였다. An RdRp RNA expression cassette containing capped RdRp mRNA was synthesized in vitro using the T7 promoter-RdRp DNA template using the HighYield T7 ARCA mRNA Synthesis Kit (m5CTP/Ψ-UTP) (Jena BioScience, USA).

구체적으로 살펴보면, anti-reverse cap analog [(ARCA) (3′-O-Me-7mG(5′)ppp(5′)G cap analog라고도 부름)] 및 화학적 변형된 뉴클레오타이드 포함하는 반응용액 (6 mM ARCA, 1.5 mM GTP, 7.5 mM 5-Methyl-CTP, 7.5 mM Pseudo-UTP, 7.5 mM ATP)에서 체외전사를 실시하였다. dsDNA 주형을를 제거하기 위해서 DNA nuclease를 첨가하였고, 남아있는 캡된 cDdRp mRNA는 LiCl 추출법과 에탄올 침전법을 이용하여 정제하였다. Specifically, a reaction solution (6 mM ARCA, 1.5 mM GTP, 7.5 mM 5-Methyl-CTP, 7.5 mM Pseudo-UTP, 7.5 mM ATP). DNA nuclease was added to remove the dsDNA template, and the remaining capped cDdRp mRNA was purified using LiCl extraction and ethanol precipitation.

대조군으로 RdRp 벡터에서 Native RNA 전사체에 5′cap 구조를 부가한 캡된 RdRp mRNA 합성은 HiScribe^™ T7 ARCA mRNA Kit(NEB, 미국)를 이용하여 실시하였다. As a control, synthesis of capped RdRp mRNA by adding a 5'cap structure to the native RNA transcript in the RdRp vector was performed using the HiScribe ^™ T7 ARCA mRNA Kit (NEB, USA).

캡된 RdRp mRNA는 IVT 산물을 ScriptCap m7G 캡핑 시스템 (Epicentre Biotechnologii사, 미국)으로 천연 캡(m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG)을 부가할 수도 있다.The capped RdRp mRNA can also be added with a natural cap (m7G(5')ppp(5')G; m7GpppG) to the IVT product with the ScriptCap m7G capping system (Epicentre Biotechnologii, USA).

본 발명의 레플리콘 RNA 카세트, 캡된 레플리콘 RNA도 레플리콘 DNA 주형에 대한 상기와 동일하게 체외전사를 수행하여 제조하였다(도 5).The replicon RNA cassette and capped replicon RNA of the present invention were also prepared by in vitro transcription in the same manner as described above for the replicon DNA template (FIG. 5).

변형된 mRNA를 MEGAClear RNA^TM정제 키트(Ambion/Applied Biosystems, 미국)를 사용하여 정제하였다. PCR은 PURELINK^TM PCR 정제 키트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. The modified mRNA was purified using the MEGAClear RNA ^TM purification kit (Ambion/Applied Biosystems, USA). For PCR, PURELINK ^TM PCR Purification Kit (Invitrogen, USA) was used.

생성물을 Nanodrop^TM UV 흡광도(ThermoFisher, 미국)에서 정량화하였다. 생성물의 품질, UV 흡광도 품질 및 가시화를 1.2% 아가로스 겔 상에서 수행하였다. 생성물을 TE 완충액 중에 재현탁시켰다.The product was quantified on a Nanodrop ^TM UV absorbance (ThermoFisher, USA). Product quality, UV absorbance quality and visualization were performed on a 1.2% agarose gel. The product was resuspended in TE buffer.

상기와 같이 본 발명의 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 구성요소인 RdRp mRNA 구조체 및 관심단백질 mRNA 레플리콘 구조체를 제조하였다. As described above, the RdRp mRNA construct and the protein-of-interest mRNA replicon construct, which are components of the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system of the present invention, were prepared.

2.2. DNA 카세트2.2. DNA Cassette

본 발명에서 DNA 카세트는 RNA 카세트를 제조할 목적인 실시례 1.3항의 주형 DNA의 T7 프로모터를 대신하여 진핵세포에서 작용하는 CAG promoter[cytomegalovirus (CMV) enhancer fused to the chicken beta*?*actin promoter]를 포함하는 CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector (EEV)(System Biosciences, USA) 또는 human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer/promoter region를 포함하는 pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega 사, 미국)를 사용하여 제조하였다.In the present invention, the DNA cassette includes a CAG promoter [cytomegalovirus (CMV) enhancer fused to the chicken beta*?*actin promoter] acting in eukaryotic cells instead of the T7 promoter of the template DNA of Example 1.3 for the purpose of preparing an RNA cassette. was prepared using the CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector (EEV) (System Biosciences, USA) or the pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega, USA) containing the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer/promoter region.

EEV는 바이러스 형질도입 시스템의 문제를 피하기 위해 Epstein-Barr Nuclear Antigen1(oriP-EBNA1)을 기반으로 한 비바이러스, 비통합 플라스미드 발현 시스템이다. 바이러스 또는 기타 플라스미드 기반 접근 방식과 EBNA 시스템의 주요 구별 기능은 숙주 염색질에 부착하고 각 세포 주기 분열과 함께 복제함으로써 숙주 게놈과 동기화하여 복제하는 능력이다. EEV is a non-viral, non-integrating plasmid expression system based on Epstein-Barr Nuclear Antigen1 (oriP-EBNA1) to avoid problems with viral transduction systems. A key distinguishing feature of the EBNA system from viral or other plasmid-based approaches is its ability to replicate in sync with the host genome by attaching to host chromatin and replicating with each cell cycle division.

EEV는 시간이 지남에 따라 이러한 에피솜 플라스미드는 플라스미드 희석, 프로모터 침묵 및 벡터 복제 오류로 인해 세포 주기 분열당 5%의 비율로 자연적으로 손실된다. 대부분의 플라스미드가 시간이 지남에 따라 손실되기 때문에 게놈 통합 또는 변경의 위험 없이 세포주가 확립될 수 있다. Over time, EEVs naturally lose these episomal plasmids at a rate of 5% per cell cycle division due to plasmid dilution, promoter silencing and vector duplication errors. Since most plasmids are lost over time, cell lines can be established without risk of genomic integration or alteration.

EEV 벡터는 세포에서 지속적인 외래 유전자 발현을 위한 비바이러스 및 비통합 시스템로 oriP-EBNA1 유전자는 이러한 플라스미드가 복제되고 딸 세포로 분할되도록 한다. 결과적으로 이 EEV 시스템은 최대 6주 동안 세포 배양 및 생체 내 동물 모델에서 발현되도록 최적화되었다. 외래 DNA를 쉽게 삽입할 수 있도록 여러 cloning site가 있다.The EEV vector is a non-viral and non-integrating system for sustained foreign gene expression in cells, and the oriP-EBNA1 gene allows these plasmids to replicate and divide into daughter cells. Consequently, this EEV system has been optimized for expression in cell culture and in vivo animal models for up to 6 weeks. Several cloning sites are available to facilitate insertion of foreign DNA.

먼저, 상기 RNA 카세트를 제조할 목적으로 제조된 실시례 1.3항의 DNA 구조체를 주형으로 5‘말단에 EcoRI과 3’말단에 XhoI 인지부위가 있는 PCR 프라어머 쌍으로 PCR하여 그 증폭된 PCR 산물을 EcoRI/XhoI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/XhoI 효소로 선형화된 CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector (EEV)(Catalog Number # EEV600A-1, System Biosciences, USA)와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝을 하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 ECoRI/XhoI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 6).First, the DNA construct of Example 1.3, prepared for the purpose of preparing the RNA cassette, was used as a template and PCR was performed with a PCR primer pair having an EcoRI at the 5' end and an XhoI recognition site at the 3' end, and the amplified PCR product was EcoRI After digestion with /XhoI enzyme, CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector (EEV) (Catalog Number # EEV600A-1, System Biosciences, USA) linearized with EcoRI/XhoI enzyme and cloned using T4 DNA ligase. The reaction solution was transformed into Escherichia coli, and plasmids were isolated from the selected strain, treated with ECoRI/XhoI restriction enzymes, and subjected to electrophoresis (FIG. 6).

pCI-neo Mammalian Expression Vector(Promega 사, 미국)는 human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer/promoter region을 포함하여 포유동물 세포에서 복제된 클로닝된 DNA 절편의 강력하고 항시적인 발현을 촉진한다. enhancer/promoter region의 하류에 위치한 β-globin/IgG chimeric intron은 발현을 더욱 증가시킬 수 있다. 벡터는 SV40 large T antigen을 발현하는 세포에서 에피솜으로 유지되어 훨씬 더 높은 수준의 발현을 유도한다.The pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega, USA) promotes robust and constitutive expression of cloned DNA fragments in mammalian cells, including the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer/promoter region. The β-globin/IgG chimeric intron located downstream of the enhancer/promoter region can further increase expression. The vector is maintained episomally in cells expressing the SV40 large T antigen, leading to much higher levels of expression.

이 벡터는 또한 포유류 세포의 안정적인 형질감염을 위한 선택 가능한 마커인 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함한다. pCI-neo Vector는 항생제 G-418로 형질감염된 세포를 선택하여 일시적 또는 안정적인 발현에 사용할 수 있다. 외래 DNA 절편을 쉽게 삽입할 수 있도록 여러 cloning site가 있다.This vector also contains a neomycin phosphotransferase gene that is a selectable marker for stable transfection of mammalian cells. The pCI-neo Vector can be used for transient or stable expression by selecting cells transfected with the antibiotic G-418. Several cloning sites are available to facilitate insertion of foreign DNA fragments.

먼저, 상기 RNA 카세트를 제조할 목적으로 실시례 1.3항의 DNA 구조체를 주형으로 5‘말단에 EcoRI과 3’말단에 SmaI 인지부위가 있는 PCR 프라어머 쌍으로 PCR을 하여 그 증폭된 PCR 산물을 EcoRI/SmaI 효소를 사용하여 절단한 다음, EcoRI/SmaI 효소로 선형화된 pCI-neo Mammalian Expression Vector(Promega 사, 미국)와 T4 DNA ligase를 이용하여 클로닝을 하였다. 상기 반응용액을 대장균에 형질전환하고 선정된 균주에서 플라스미드를 분리하여 ECoRI/SmaI 제한효소를 처리한 후 전기영동을 하였다(도 7).First, for the purpose of preparing the RNA cassette, PCR was performed with a PCR primer pair having EcoRI at the 5' end and a SmaI recognition site at the 3' end using the DNA structure of Example 1.3 as a template, and the amplified PCR product was EcoRI/ After digestion using SmaI enzyme, cloning was performed using pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega, USA) linearized with EcoRI/SmaI enzyme and T4 DNA ligase. The reaction solution was transformed into Escherichia coli, and a plasmid was isolated from the selected strain, treated with ECoRI/SmaI restriction enzymes, and subjected to electrophoresis (FIG. 7).

실시례 3. RNA/DNA 시스템의 형질주입Example 3. Transfection of RNA/DNA systems

본 발명의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 유형은 도 2와 같다. 도 2를 살펴보면, 본 발명의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템에서 기본 유형 A는 상기 RdRp mRNA를 포함하는 RdRp RNA 카세트와 상기 관심 DNA 레플리콘을 포함하는 레플리콘 DNA 카세트를 포함하며, 추가적으로 기본 유형 A에 상기 RdRp DNA를 포함하는 RdRp DNA 카세트와 상기 관심 mRNA 레플리콘을 포함하는 레플리콘 RNA 카세트를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 추가할 수 있다. 본 실시례에서 평가한 DNA 운반체는 CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector를 사용하였다.The type of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention is shown in FIG. 2. Referring to FIG. 2, in the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention, basic type A includes an RdRp RNA cassette including the RdRp mRNA and a replicon DNA cassette including the DNA replicon of interest, and additionally At least one selected from the group consisting of the RdRp DNA cassette containing the RdRp DNA and the replicon RNA cassette containing the mRNA replicon of interest may be added to the basic type A. As the DNA transporter evaluated in this example, CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector was used.

또한, 본 발명의 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템에서 기본 유형 B는 상기 레플리콘 RNA 카세트와 상기 RdRp DNA 카세트를 포함하며, 추가적으로 기본 유형B에 상기 RdRp RNA 카세트와 상기 레플리콘 DNA 카세트를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 추가할 수 있다. In addition, in the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention, base type B includes the replicon RNA cassette and the RdRp DNA cassette, and additionally base type B includes the RdRp RNA cassette and the replicon DNA cassette. Any one or more selected from the group containing may be added.

본 실시례는 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 평가를 위해 2종류의 기본 유형을 사용하였으며 자가 증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 이에만 제한하는 것은 아니다.This example uses two basic types for evaluation of self-amplifying RNA/DNA hybrid expression systems, but the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system is not limited thereto.

본 발명의 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템은 RNA 카세트와 DNA 카세트로 구성되며, 이들의 운반체는 선형의 핵산절편, 환형의 플라스미드 및 바이러스 등 다양하게 할 수 있으며, 이들의 조합일 수도 있다. 제작된 자가증폭 RNA/DNA 시스템의 운반체는 비바이러스성인 경우 다양한 방법을 선택할 수 있다. 본 실시례에서는 운반체는 리포좀 유형을 선택하였으나, 이에 제한하는 것은 아니다. The self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention is composed of an RNA cassette and a DNA cassette, and their carriers may be various, such as linear nucleic acid fragments, circular plasmids, and viruses, or a combination thereof. If the carrier of the self-amplifying RNA/DNA system produced is non-viral, various methods can be selected. In this embodiment, the liposome type was selected as the carrier, but is not limited thereto.

본 발명의 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 RNA 카세트와 DNA 카세트를 함께 제작된 리포좀 전달체로 표적세포에 형질주입할 수도 있으며 이들을 나누어 각각 리포좀을 제작하여 각각 형질주입할 수도 있다.The RNA cassette and DNA cassette of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention may be transfected into target cells using a liposome delivery system prepared together, or liposomes may be prepared and transfected separately.

본 발명의 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템의 표적 세포에 형질주입은 안정화된 형질전환 세포를 원활하게 얻기 위해 동시에 형질전환을 할 수도 있다. Transfection of the target cells of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention may be performed simultaneously with transformation to smoothly obtain stable transformed cells.

형질주입은 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템을 구성하는 RNA 카세트와 DNA 카세트를 형질주입하여 형질전환 세포에서 RdRp mRNA와 관심 mRNA 및 이들이 코딩하는 단백질을 발현하도록 하는 단계이다.Transfection is a step in which the RNA and DNA cassettes constituting the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system are transfected to express the RdRp mRNA and the mRNA of interest and the protein they encode in the transformed cell.

상기 제조된 RNA 카세트 및 DNA 카세트를 동일한 몰비로 혼합하고 Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent(ThermoFisher, 미국)의 지침서에 따라 형질주입을 실시하였다. 표적 세포를 준비하여 1x10⁵개의 세포를 96-웰에 분주하였다. 다음날 준비한 리포좀 NA 카세트 및 DNA 카세트를 포함하는 리포좀을 세포 배양 배지로 총 부피 100㎕로 만든 후 각 웰에 처리하였다. 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 1X PBS로 세포를 세척하고, 트립신(trypsin)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 100mm 배양 접시로 옮겨 배양하였다. The prepared RNA cassette and DNA cassette were mixed at the same molar ratio and transfection was performed according to the instructions of Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent (ThermoFisher, USA). Target cells were prepared and 1x10 ⁵ cells were dispensed into 96-well. The next day, liposomes containing the prepared liposome NA cassette and DNA cassette were prepared in a cell culture medium to a total volume of 100 μl, and then treated in each well. After culturing for 24 hours in an incubator at 37° C., 5% CO ₂ , the cells were washed with 1X PBS, treated with trypsin to detach the cells, and then transferred to a 100 mm culture dish and cultured.

실시례 4. RdRp 발현 지속성 실험Example 4. RdRp expression persistence test

본 발명의 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 기본 유형 A와 B를 실시례 3의 방법으로 각각 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 293T 세포 내 RdRp mRNA 및 단백질을 분석하였다. After transfection of the self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system basic types A and B of the present invention into 293T cells by the method of Example 3, respectively, RdRp mRNA and protein in 293T cells were analyzed at 0, 24, 48, and 72 hours. .

- RdRp mRNA 분석- RdRp mRNA analysis

상기 형질전환 293T 세포의 RdRp mRNA 분석은 형질주입한 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 293T 세포에서 총 RNA를 분리하여 quantitative PCR (qPCR) with SYBR Green로 분석하였다. For RdRp mRNA analysis of the transfected 293T cells, total RNA was isolated from 293T cells at 0, 24, 48 and 72 hours after transfection and analyzed by quantitative PCR (qPCR) with SYBR Green.

구체적으로, 형질주입된 293T 세포에서 RNeAsy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출했다. 총 150ng의 총 RNA를 SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen, 미국)으로 cDNA로 역전사하고, 상기 cDNA를 이용하여 KAPA SYBR® FAST qPCR Kits(Sigma aldrich, 미국)를 사용하여 분석하였다.Specifically, total RNA was extracted from transfected 293T cells using the RNeAsy mini kit (Qiagen). A total of 150 ng of total RNA was reverse transcribed into cDNA with SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA), and the cDNA was analyzed using KAPA SYBR® FAST qPCR Kits (Sigma aldrich, USA).

qPCR 반응을 준비하기 전에 KAPA PROBE FAST Bio-Rad iCycler ™ qPCR 마스터 믹스 (2X), 템플릿 DNA, 프라이머 및 프로브를 <표 3>에 제시 내용으로 철저히 혼합하였다. Before preparing the qPCR reaction, KAPA PROBE FAST Bio-Rad iCycler ™ qPCR Master Mix (2X), template DNA, primers and probes were thoroughly mixed as shown in Table 3.

qPCR의 구성 시약Component reagents of qPCR *?**?* Final ConcentrationFinal Concentration 20 μl rxn20 μl rxn PCR grade water up to 20 μlPCR grade water up to 20 μl *?**?* 7.2 μl7.2 μl qPCR Master Mix (2X)qPCR Master Mix (2X) 1X1X 10 μl10 μl Forward Primer (10 μM)Forward Primer (10 µM) 200 nM200 nM 0.4 μl0.4 μl Reverse Primer (10 μM)Reverse Primer (10 µM) 200 nM200nM 0.4 μl0.4 μl Template DNA(10 ng/1 μl)Template DNA (10 ng/1 μl) 1 ng/μl1 ng/μl 2.0 μl2.0 μl

Sequence ID: DQ189086.1에서 nsP2 유전자(1612~4008)을 대상으로 정방향 프라이머(5‘-ATAGGCTGGTGTGGAAAACG-3’, 염기서열 30)와 역방향 프라이머(5‘-GTCAATCTGATTCCGGCAGT-3’, 염기서열 31)를 제조하였다. 그 PCR산물의 크기는 229bp이다.Sequence ID: Prepare forward primer (5'-ATAGGCTGGTGTGGAAAACG-3', nucleotide sequence 30) and reverse primer (5'-GTCAATCTGATTCCGGCAGT-3', nucleotide sequence 31) targeting nsP2 gene (1612-4008) in DQ189086.1 did The size of the PCR product is 229 bp.

qPCR 프로토콜은 1단계는 3분 동안 95℃에서 효소 활성화 (1주기), 2단계로40 사이클 (변성: 95℃, 15초, 어닐링/연장: 60℃, 1분)은 Bio-Rad iCycler(Bio-Rad, 미국)를 사용하여 수행하여 사용하는 장비의 제조사의 지침에 따라 데이터를 분석하였다. 기본유형 A 및 B가 형질주입된 293T 세포들 각각에서 최고 발현치를 100%으로 하여 그에 비례하여 그 수치를 백분율로 표시한 결과는 <도 8>와 같으며, 5회 실험하여 평균값을 표기하였다.The qPCR protocol consists of enzyme activation at 95 °C for 3 min in step 1 (1 cycle), and 40 cycles in step 2 (denaturation: 95 °C for 15 sec, annealing/extension: 60 °C for 1 min) using a Bio-Rad iCycler (Bio-Rad iCycler). -Rad, USA) was used to analyze the data according to the manufacturer's instructions for the equipment used. The highest expression value in each of the 293T cells transfected with basic types A and B was set to 100%, and the value was expressed as a percentage in proportion to it. The results are shown in <Fig.

<도 8>에서처럼, 기본 유형 A는 24시간에서 가장 높은 값이고 시간이 경과하면서 감소하여 72시간에는 거의 확인할 수 없었다. 기본 유형 B의 결과는 24시간에서 가장 높은 값, 48시간에 가장 중간 값이고 72시간은 가장 적은 값이었다. As shown in <Fig. 8>, the basic type A was the highest value at 24 hours and decreased over time, so it could hardly be confirmed at 72 hours. Base type B results were the highest at 24 hours, the median at 48 hours, and the lowest at 72 hours.

기본유형 B가 형질주입된 293T 세포를 계대 배양한 경우도 형질주입된 293T 세포에 RdRp mRNA가 존재하였다.When subcultured 293T cells transfected with basic type B, RdRp mRNA was present in the transfected 293T cells.

이 결과는 기본 유형 A에서 형질주입된 RdRp mRNA 카세트가 세포질에서 분해되는 결과로 존재 양이 감소하는 것으로 생각이 되었다. 기본 유형 B의 경우 형질주입된 RdRp DNA 카세트의 운반체, CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector는 episomal plasmid로 세포의 염색질에 부착하여 자율적인 복제를 하고 전사를 한 결과로 생각이 된다.This result was thought to be due to the reduced abundance of the transfected RdRp mRNA cassette in basal type A as a result of degradation in the cytoplasm. In the case of basic type B, the carrier of the transfected RdRp DNA cassette, the CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector, is thought to be the result of autonomous replication and transcription by attaching to the chromatin of the cell as an episomal plasmid.

실시예 5. RSV-F mRNA를 포함하는 자가증폭 RNA/DNA 시스템Example 5. Self-amplifying RNA/DNA system comprising RSV-F mRNA

본 발명의 자가증폭 RNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 기본 유형 A와 B를 을 실시례 3에 기술한 내용으로 각각 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 표적 RSV-F mRNA 및 단백질 발현의 수준을 분석하였다. The self-amplifying RNA/DNA hybrid expression system of the present invention, as described in Example 3, was transfected into 293T cells, respectively, at 0, 24, 48 and 72 hours to target RSV-F mRNA and protein. The level of expression was analyzed.

- 세포에서 RSV-F mRNA 발현의 변환 조사- Investigation of conversion of RSV-F mRNA expression in cells

상기 형질전환체에서 0, 24, 48 및 72시간에 총 RNA를 분리하여 SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen, 미국)으로 cDNA로 역전사하고, 상기 cDNA를 대상으로 KAPA SYBR® FAST qPCR Kits(Sigma aldrich, 미국)를 사용하여 분석하였다.Total RNA was isolated from the transformants at 0, 24, 48, and 72 hours, reverse transcribed into cDNA with SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA), and KAPA SYBR® FAST qPCR Kits (Sigma aldrich, USA) were used for the cDNA. ) was analyzed using.

qPCR 반응을 준비하기 전에 KAPA PROBE FAST Bio-Rad iCycler ™ qPCR 마스터 믹스 (2X), 템플릿 DNA, 프라이머 및 프로브를 <표 3>에 제시 내용으로 철저히 혼합하여 RSV-F mRNA를 qPCR로 조사하였다.Before preparing the qPCR reaction, RSV-F mRNA was investigated by qPCR by thoroughly mixing KAPA PROBE FAST Bio-Rad iCycler ™ qPCR Master Mix (2X), template DNA, primers and probes as shown in Table 3.

구체적으로, 형질 감염된 293T 세포에서 RNeAsy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출했다. 총 150 ng의 총 RNA를 무작위 6량체 프라이머 및 다중 스크라이브 역전사 효소를 사용하여 48℃에서 30분 동안 cDNA로 역전사하였다. Specifically, total RNA was extracted using the RNeAsy mini kit (Qiagen) from transfected 293T cells. A total of 150 ng of total RNA was reverse transcribed into cDNA using random hexamer primers and multiple scribe reverse transcriptase at 48°C for 30 minutes.

RSV-F mRNAi에 매칭될 수 있는 정방향 프라이머 5'- GCGTGATGAACTTCGAGGA-3' (서열번호 32) 및 역방향 프라이머 5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3' (서열번호 33)를 사용하였다.Forward primer 5'-GCGTGATGAACTTCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 32) and reverse primer 5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3' (SEQ ID NO: 33), which can be matched to RSV-F mRNAi, were used.

qPCR 프로토콜은 1단계는 3분 동안 95℃에서 효소 활성화 (1주기), 2단계로40 사이클 (변성: 95℃, 15초, 어닐링/연장: 60℃, 1분)은 Bio-Rad iCycler(Bio-Rad, 미국)를 사용하여 수행하여 사용하는 장비의 제조사의 지침에 따라 데이터를 분석하였다. 기본유형 A 및 B의 형질주입된 293T 세포들에서 각각에서 최고 발현치를 100%으로 하여 그에 비례하여 그 수치를 백분율로 표시한 결과는 <도 9>와 같다. 5회 실험하여 평균값을 표기하였다.The qPCR protocol consists of enzyme activation at 95 °C for 3 min in step 1 (1 cycle), and 40 cycles in step 2 (denaturation: 95 °C for 15 sec, annealing/extension: 60 °C for 1 min) using a Bio-Rad iCycler (Bio-Rad iCycler). -Rad, USA) was used to analyze the data according to the manufacturer's instructions for the equipment used. In the 293T cells transfected with basic types A and B, the highest expression value was set as 100%, and the value was expressed as a percentage in proportion thereto. Five experiments were performed and the average value was indicated.

<도 9>에서처럼, 기본 유형 A의 결과는 24시간에서 가장 높은 값, 48시간에 가장 중간 값이고 72시간은 가장 적은 값이었다. 기본 유형 B는 24시간에서 가장 높은 값이고 시간이 경과하면서 감소하여 72시간에는 거의 확인할 수 없었다. As shown in <Fig. 9>, the result of basic type A was the highest value at 24 hours, the middle value at 48 hours, and the lowest value at 72 hours. Basic type B was the highest value at 24 hours and decreased over time, so it could hardly be confirmed at 72 hours.

기본유형 A가 형질주입된 293T 세포를 계대 배양한 경우도 형질주입된 293T 세포에서 RSV-F mRNA가 존재하였다.When subcultured 293T cells transfected with basic type A, RSV-F mRNA was present in the transfected 293T cells.

이 결과는 기본 유형 A의 결과는 24시간은 형질주입된 RSV-F 레플리콘 DNA 카세트의 운반체, CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector는 episomal plasmid는 형질주입된 운반체에서 직접 전사된 양이 대부분을 차지하고 72시간의 결과는 형질주입된 운반체가 핵으로 이동하여 염색질에 부착하여 자율 복제한 DNA 카세트에서 전사된 mRNA에 의한 결과로 생각이 된다. 기본 유형 B에서 형질주입된 RdRp mRNA 카세트가 세포질에서 분해되는 결과로 존재 양이 감소하는 것으로 생각이 되었다. This result shows that the result of basic type A is the carrier of the transfected RSV-F replicon DNA cassette for 24 hours, and the CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector is the episomal plasmid, which accounts for most of the amount directly transcribed from the transfected carrier. 72 The result of time is thought to be the result of mRNA transcribed from the DNA cassette where the transfected transporter migrates to the nucleus, attaches to chromatin, and replicates autonomously. It was thought that the abundance of the transfected RdRp mRNA cassette in basal type B was reduced as a result of degradation in the cytoplasm.

이러한 결과들은 본 발명의 기본유형 A의 형질전환 세포에서 RSV-F를 코팅하는 레플리콘 DNA 카세트가 핵에서 자율복제하고 전사한 mRNA가 안정적으로 유지되고 있음을 보여준다.These results show that the RSV-F-coated replicon DNA cassette autonomously replicated in the nucleus and the transcribed mRNA was stably maintained in the transformed cell of the basic type A of the present invention.

- 세포에서 RSV-F 단백질 변화 조사- Investigation of RSV-F protein changes in cells

본 발명의 기본 유형 A와 B를 실시례 3에 기술한 내용으로 각각 293 T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간 경과한 후 관심 RSV-F 단백질의 변형량을 측정하였다. After transfection of basic types A and B of the present invention into 293 T cells, respectively, as described in Example 3, the amount of modification of the RSV-F protein of interest was measured after 0, 24, 48, and 72 hours had elapsed.

본 발명의 기본 유형 A와 B의 형질주입체 를 293T 세포를 0. 24. 48 및 72 시간이 경과한 후, 항-RSV-F 항체(ab94968, abcam사, 미국)로 ELISA를 이용하여 RSV-F의 변형량을 측정하였다. 본 발명의 기본유형 A와 B가 형질주입된 293T 세포들을 비교하여 단백질합성 증가 효과 지속기간이 얼마나 차이가 나는지를 비교한 결과를 보여준다. 구체적으로, 기본유형 A 및 B가 형질주입된 293T 세포들에서 각각의 최고 발현치를 100%으로 하여 그에 비례하여 그 수치를 백분율로 표시한 결과는 <도 10>와 같으며, 5회 실험하여 평균값을 표기하였다.Transfectants of basic types A and B of the present invention were inoculated into 293T cells for 0. 24. After 48 and 72 hours, RSV- The deformation amount of F was measured. 293T cells transfected with the basic types A and B of the present invention are compared to show the difference in the duration of the effect of increasing protein synthesis. Specifically, in 293T cells transfected with basic types A and B, each highest expression value was set as 100%, and the value was expressed as a percentage in proportion to it as shown in <Fig. 10>. marked.

<도 10>에서처럼, 기본 유형 A의 결과는 24시간에서 가장 높은 값, 48시간은 중간 값이고 72시간은 48시간과 거의 유사한 값이나 그 보다는 적은 값이었다. 기본 유형 B는 24시간에서 가장 높은 값이고 시간이 경과하면서 감소하여 48시간은 중간 값이고, 72시간에는 가장 적은 값을 확인하였다. As shown in <Fig. 10>, the result of basic type A was the highest value at 24 hours, the middle value at 48 hours, and the value at 72 hours was almost similar to that of 48 hours, but less than that. Basic type B has the highest value at 24 hours and decreases over time, so the average value at 48 hours and the lowest value at 72 hours were confirmed.

기본유형 A가 형질주입된 293T 세포를 계대 배양한 경우도 형질주입된 293T 세포에서 RSV-F가 존재하였다.When 293T cells transfected with basic type A were subcultured, RSV-F was also present in the transfected 293T cells.

이 결과는 기본 유형 A의 결과는 24시간에서 형질주입된 RSV-F 레플리콘 DNA 카세트의 운반체, CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector는 episomal plasmid에서 직접 전사된 mRNA에서 합성된 단백질의 양이 대부분을 차지하고 72시간의 결과는 형질주입된 운반체가 핵으로 이동하여 염색질에 부착하여 자율 복제한 DNA 카세트에서 전사된 mRNA에서 합성된 단백질에 의한 결과로 생각이 된다. 기본 유형 B에서 형질주입된 RdRp mRNA 카세트가 세포질에서 분해되는 결과로 존재 양이 감소하는 것으로 생각이 되었다. This result shows that the primary type A is the carrier of the RSV-F replicon DNA cassette transfected at 24 hours, and the CAGs-MCS Enhanced Episomal Vector accounts for the majority of the amount of protein synthesized from mRNA directly transcribed from the episomal plasmid. The result of 72 hours is thought to be the result of proteins synthesized from mRNA transcribed from the DNA cassette where the transfected transporter migrates to the nucleus, attaches to chromatin, and replicates autonomously. It was thought that the abundance of the transfected RdRp mRNA cassette in basal type B was reduced as a result of degradation in the cytoplasm.

이러한 결과들은 본 발명의 기본유형 A의 형질전환 세포에서 세포질 내 RSV-F의 발현이 장기간에 걸쳐서 이루어지고 있으며, 형질전환 세포에서 RSV-F를 코팅하는 레플리콘 DNA 카세트가 핵에서 자율복제하고 전사한 mRNA를 세포질로 안정적으로 공듭되어 세포질 내 mRNA가 안정적으로 유지되고 있음을 보여준다.These results show that the expression of RSV-F in the cytoplasm in the transformed cells of the basic type A of the present invention is achieved over a long period of time, and the replicon DNA cassette coating RSV-F in the transformed cells replicates autonomously in the nucleus and The transcribed mRNA is stably incorporated into the cytoplasm, showing that the mRNA in the cytoplasm is stably maintained.

실시례 6. RdRp DNA 카세트와 EPO DNA 카세트Example 6. RdRp DNA Cassette and EPO DNA Cassette

본 발명의 RdRp DNA 카세트 및 EPO DNA 카세트를 실시례 3에 기술한 내용으로 함께 293T 세포에 형질주입 후, 0, 24, 48 및 72시간에서 EPO 단백질 발현의 수준을 분석하였다. After transfection of the RdRp DNA cassette and the EPO DNA cassette of the present invention into 293T cells together as described in Example 3, the level of EPO protein expression was analyzed at 0, 24, 48 and 72 hours.

상기 RdRp DNA 카세트 및 EPO DNA 카세트를 293T 세포에 형질주입한 후 0, 24, 48 및 72시간이 경과한 후 총 단백질을 분리하여 EPO 수준은 EPO QuAntikine ELISA 키트(R&D Systems, 미국)에 의해 결정하였으며, 그 결과는 <도 11>과 같으며, 5회 실험하여 평균값을 표기하였다.After 0, 24, 48 and 72 hours after transfection of the RdRp DNA cassette and EPO DNA cassette into 293T cells, total protein was isolated and EPO levels were determined by EPO QuAntikine ELISA kit (R&D Systems, USA) , The results are shown in <Fig. 11>, and the average value was indicated by performing the experiment 5 times.

도 11를 살펴보면, 24시간이 가장 적은 값, 그 값은 시간이 지남에 따라 증가하여 72시간에서 가장 높은 값이 되었다.Referring to FIG. 11, 24 hours was the lowest value, and the value increased over time to become the highest value at 72 hours.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변형하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변형 또는 화학적 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be embodied in other specific forms without modifying its technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed as including all modifications or chemically modified forms derived from the meaning and scope of the claims to be described later and equivalent concepts rather than the detailed description above are included in the scope of the present invention.

Claims

세포 내 적어도 하나의 단백질 합성을 하고 복제가 가능한 구성성분이 있으며,
(i) RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)을 발현시키기 위한 RNA 카세트(RdRp RNA 카세트); 및
(ii) 상기 RdRp에 의해 복제될 수 있는 관심 mRNA 레플리콘을 코딩하는 DNA 카세트(레플리콘 DNA 카세트)를 포함하며,
여기서, 추가적으로 상기 관심 mRNA를 포함하는 레플리콘 RNA 카세트 및 상기 RdRp mRNA를 인코팅하는 DNA 카세트(RdRp DNA 카세트)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.There is a component capable of synthesizing and replicating at least one protein in the cell,
(i) an RNA cassette for expressing RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (RdRp RNA cassette); and
(ii) a DNA cassette encoding an mRNA replicon of interest capable of being replicated by the RdRp (replicon DNA cassette);
Here, the self-amplifying mRNA / characterized in that it further comprises at least one selected from the group consisting of a replicon RNA cassette containing the mRNA of interest and a DNA cassette (RdRp DNA cassette) encoding the RdRp mRNA. DNA hybrid expression systems and compositions thereof.

세포 내 적어도 하나의 단백질 합성을 하고 복제가 가능한 구성성분이 있으며,
(i) RdRp에 의해 복제될 수 있는 관심 mRNA를 포함하는 레플리콘 RNA 카세트(레플리콘 RNA 카세트); 및
(ii) RdRp을 발현시키기 위한 mRNA를 인코팅하는 DNA 카세트(RdRp DNA 카세트)를 포함하며,
여기서, 추가적으로 상기 RdRp RNA 카세트 및 상기 관심 mRNA를 인코팅하는 레플리콘 DNA 카세트를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.There is a component capable of synthesizing and replicating at least one protein in the cell,
(i) a replicon RNA cassette comprising the mRNA of interest capable of being replicated by RdRp (replicon RNA cassette); and
(ii) a DNA cassette encoding mRNA for expressing RdRp (RdRp DNA cassette);
Here, the self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system and composition thereof, further comprising at least one selected from the group comprising the RdRp RNA cassette and the replicon DNA cassette encoding the mRNA of interest.

상기 RdRp DNA 카세트; 및
상기 레플리콘 DNA 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.the RdRp DNA cassette; and
A self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system comprising the replicon DNA cassette and a composition thereof.

제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 세포는 원핵생물 세포, 식물 세포, 진핵생물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 1종을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.The method of claim 1 to claim 3, wherein the cell is a self-amplifying mRNA / DNA characterized by any one selected from the group consisting of prokaryotic cells, plant cells, eukaryotic cells, mammalian cells and human cells. Hybrid expression systems and compositions thereof.

제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 RdRp는
알파바이러스에서 기원하며,
상기 알파바이러스는 Semliki Forest 바이러스를 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.The method of claim 1 to 3, wherein the RdRp is
Originated from alphavirus,
The alpha virus is a self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system characterized by Semliki Forest virus and a composition thereof.

제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 RdRp mRNA 카세트는
(a) 상기 RdRp 폴리펩타이드를 코딩하는 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF):
(b) 5'UTR 또는 알파바이러스 5' 복제인식서열(5'CSE);
(c) 3'UTR 또는 알파바이러스 3' 복제인식서열(3'CSE); 및
(d) 5' 캡 구조(cap structure);를 포함하는, RdRp 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.The method of claim 1 to 3, wherein the RdRp mRNA cassette
(a) an open reading frame (ORF) encoding the RdRp polypeptide:
(b) 5'UTR or alphavirus 5' replication recognition sequence (5'CSE);
(c) 3'UTR or alphavirus 3' replication recognition sequence (3'CSE); and
(d) a 5' cap structure; A self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system comprising mRNA encoding an RdRp polypeptide and a composition thereof.

제6항에 있어서, 상기 RdRp mRNA 카세트는
폴리-A 테일(tail)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.The method of claim 6, wherein the RdRp mRNA cassette
A self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system and composition thereof, further comprising a poly-A tail.

제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 RNA 레플리콘은
(a) 알파바이러스 5' 복제인식서열(5'CSE); 및
(b) 알파바이러스 3' 복제인식서열(3'CSE);을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.The RNA replicon according to claims 1 to 3
(a) alphavirus 5' replication recognition sequence (5'CSE); and
(b) an alphavirus 3' replication recognition sequence (3'CSE); a self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system and a composition thereof, comprising:

제9항에 있어서, 상기 RNA 레플리콘은
상기 관심 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.10. The method of claim 9, wherein the RNA replicon is
A self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system comprising mRNA encoding the protein of interest and a composition thereof.

제9항에 있어서, 상기 RNA 레플리콘은 서브게놈 프로모터(SGP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.10. The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system and composition of claim 9, wherein the RNA replicon includes a subgenomic promoter (SGP).

제8항에 있어서, 상기 RNA 레플리콘은 3' 폴리(A) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.9. The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system and composition of claim 8, wherein the RNA replicon comprises a 3' poly(A) sequence.

제8항에 있어서, RNA 레플리콘은 5'-캡을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.9. The self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression system and composition thereof according to claim 8, wherein the RNA replicon includes a 5'-cap.

제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 관심 mRNA는 항원, 항체, 치료용 단백질, 펩타이드, 융합 단백질, 유전체 편집, 및 RNA 침묵을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.The method of claim 1 to claim 3, wherein the mRNA of interest is a self-amplifying mRNA characterized by any one or more selected from the group consisting of antigens, antibodies, therapeutic proteins, peptides, fusion proteins, genome editing, and RNA silencing. /DNA hybrid expression systems and compositions thereof.

제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 RdRp mRNA 및 상기 관심 mRNA 레플리콘가 동일한 RNA 가닥에 존재하는 경우, 상기 관심 mRNA 레플리콘은 상기 RdRp로 시스(cis action)로 복제되거나,
또는 상기 RdRp mRNA 및 상기 관심 mRNA 레플리콘은 서로 다른 RNA 가닥에 존재하는 경우, 상기 관심 mRNA 레플리콘은 RdRp에 의한 트랜스(trans action)로 복제되는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.According to claims 1 to 3,
When the RdRp mRNA and the mRNA replicon of interest are present on the same RNA strand, the mRNA replicon of interest is replicated with the RdRp in cis action;
Alternatively, when the RdRp mRNA and the mRNA replicon of interest are present on different RNA strands, the mRNA replicon of interest is replicated in trans action by RdRp. Self-amplifying mRNA/DNA hybrid expression. systems and compositions thereof.

제14항에 있어서, 상기 RdRp mRNA 구조체 및 관심 mRNA 레플리콘은 각각 상이한 두 개의 RNA에 있거나, 또는
동일한 한 개의 RNA에 있는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.15. The method of claim 14, wherein the RdRp mRNA construct and the mRNA replicon of interest are in two different RNAs, or
Self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system and composition thereof, characterized in that in the same single RNA.

제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 DNA 카세트는 대장균 플라스미드, 박테리오파지(λ, M13, P1), 바이러스(동물 바이러스-레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 등; 곤충 바이러스 - 배큘로 바이러스, 식물 바이러스 - 콜리플라워 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 쌍둥이자리 바이러스 등), 아그로박테리움 투메파시엔스 기반 벡터, 키메라 플라스미드(코스미드, 파지미드, 파스미드 및 포스미드), 인공 염색체(YAC, BAC, PAC, MAC 및 HAC) 및 비 대장균 벡터(예: 바실러스 및 슈도모나스 벡터 등) 기반 벡터를 포함하는 운반체에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물. The method of claim 1 to claim 3, wherein the DNA cassette is E. coli plasmid, bacteriophage (λ, M13, P1), virus (animal virus-retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, vaccinia virus, etc.; Insect viruses - baculovirus, plant viruses - cauliflower mosaic virus, potato virus X, Gemini virus, etc.), Agrobacterium tumefaciens-based vectors, chimeric plasmids (cosmids, phagemids, phasmids and fosmids), Self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system characterized by any one selected from carriers including vectors based on artificial chromosomes (YAC, BAC, PAC, MAC and HAC) and non-E. coli vectors (eg, Bacillus and Pseudomonas vectors, etc.) and its composition.

제16항에 있어서, 상기 DNA 카세트는 표적 상기 세포에서 작동하는 프로모터 군에서 선택되어진 어느 하나의 하류 부위에
상기 RdRp를 인코딩하는 DNA; 또는
상기 관심 mRNA를 인코딩하는 DNA를 위치하는 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가증폭 mRNA/DNA 하이브리드 발현 시스템 및 이의 조성물.
The method of claim 16, wherein the DNA cassette is located at any one downstream site selected from a group of promoters operating in the target cell.
DNA encoding the RdRp; or
Self-amplifying mRNA / DNA hybrid expression system and composition thereof, characterized in that it comprises an array in which the DNA encoding the mRNA of interest is located.