KR20230038590A - 면역 장애의 치료 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 안지오포이에틴-1(Ang1)의 높은 수치를 발현하는 줄기 세포 및 M1 유형 대식세포 생성을 저해하고 염증성 질환, 예컨대 당뇨병을 치료하는 데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

면역 장애의 치료{TREATMENT OF IMMUNE DISORDERS}
본 개시내용은 안지오포이에틴-1(Angeopoetin-1: Ang1)의 높은 수치를 발현하는 줄기 세포 및 TNF-알파 및/또는 IL-6 방출을 저해하고 염증성 질환, 예컨대 당뇨병을 치료하는 데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
안지오포이에틴은 배아 및 출생후 혈관신생에서 역할을 하는 혈관 성장 인자의 패밀리의 일부이다. Ang1은 내피 및 몇몇 비내피 세포, 예컨대 평활근 세포의 이동을 촉진시킨다. Ang1은 또한 세관으로의 내피 세포의 스프라우팅(sprouting) 및 재체계화를 유도한다. Ang1은 내피 세포에서 강력한 항염증성 효과를 나타내어, E-설렉틴, ICAM-1 및 VCAM-1의 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF) 유도 상향조절을 억제하고, VEGF 및 TNF-α에 반응하여 백혈구 유착 및 이동을 저해한다(Kim et al. Circ Res., 89(6), 477-479, 2001).
대부분의 제1형 당뇨병 환자에 대한 현재의 치료는 속효성 및 지효성 인슐린 제제의 혼합물의 정기적인 피하 주사에 기초한다. 더 지속적인 작용 프로필을 가지는 중간 작용 및 장기 작용 성분을 생성하는 상이한 크기의 가용성 인슐린 입자의 현탁액은 일정한 기준 호르몬 수치를 달성하도록 투여된다(Heine et al. Br Med J (Clin Res Ed) 290:204-205, 1985).
이 현재의 치료의 단점은 지연 작용 제제가 인슐린의 평탄한 기초 수치를 일반적으로 생성하지 않아서, 고혈당증 또는 고혈당증 중 어느 하나를 생성시킨다는 것이다. 고혈당증은 당뇨병 환자에서 추가의 합병증을 발생시킨다는 점에서 문제가 된다. 예를 들어, 만성 고혈당증은 심각한 미세혈관(망막병증 및 신장병증), 거대혈관(뇌졸중, 심근경색), 및 신경학적 합병증을 발생시킨다. 이 파괴적인 합병증은 혈당 수치의 정상화에 의해 예방될 수 있다.
줄기 세포 기반 기술은 당뇨병을 치료하기 위한 가능한 접근법으로서 최근에 나타났다. 그러나, 평생 면역억제를 요할 수 있는 기초하는 자가면역 질환에 관련한 쟁점 이외에, 이 기술은 실행 가능한 치료학적 옵션으로 아직 나타나지 않고 있다.
따라서, 필요한 새로운 치료 옵션으로 당뇨병 및/또는 이의 연관 병태 또는 증상을 가지는 환자에서 충족되지 않은 치료학적 수요가 남아 있다.
본원에서의 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 이러한 문헌이 본 개시내용에 대한 선행 기술로서 이용 가능하다는 인정이 아니다.
본 발명자들은 핵산 발현 Ang1에 의한 세포의 형질감염에 대한 필요 없이 높은 수치에서 Ang1을 발현하는 유전자 비변형 줄기 세포(genetically unmodified stem cell)를 사용하여 인간 대상체에서 항염증성 세포의 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다.
본 발명자들은 이것이 인간 대상체에서 TNF-알파를 감소시키고/시키거나, IL-6을 감소시키고/시키거나, IL-10 수치를 증가시킬 수 있다는 것을 또한 밝혀냈다. 이 발견은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 이러한 유전자 비변형 줄기 세포는 염증성 장애, 예컨대 당뇨병 및 이의 연관 병태 및 증상을 치료하도록 적합할 수 있다는 것을 제안한다.
실제로, 본 발명자들은 이것이 핵산 발현 Ang1에 의한 세포의 형질감염에 대한 필요 없이 높은 수치에서 Ang1을 발현하는 유전자 비변형 줄기 세포를 사용하여 당뇨병을 가지는 인간 대상체에서 HbA1c를 감소시키고/시키거나, 공복 인슐린 수치를 감소시키고/시키거나 아디포넥틴 수치를 증가시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다.
다른 예에서, 본 발명자들은 이것이 핵산 발현 Ang1에 의한 세포의 형질감염에 대한 필요 없이 높은 수치에서 Ang1을 발현하는 유전자 비변형 줄기 세포를 사용하여 인간 대상체에서 류마티스성 관절염 및 당뇨병성 신병증의 증상을 개선할 수 있다는 것을 또한 밝혀냈다.
따라서, 일례에서, 본 개시내용은 항염증성 세포의 생성 및/또는 기능의 증가를 필요로 하는 대상체에서 항염증성 세포의 생성 및/또는 기능을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 적어도 0.1㎍/106개의 세포의 양으로 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1: Ang1)을 발현한다.
일례에서, 항염증성 세포는 Th2 세포, TReg 세포 또는 M2 유형 대식세포이다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 the 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 증가시킨다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 10%까지 증가시킨다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 20%까지 증가시킨다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 40%까지 증가시킨다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 80%까지 증가시킨다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 90%까지 증가시킨다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14+CD16+이다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14+CD16+CD163+이다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14+CD16+CD206+이다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14+CD16+CD163+CD206+이다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14++CD16+이다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14++CD16+CD163+이다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14++CD16+CD206+이다.
또 다른 예에서, M2 유형 대식세포는 CD14++CD16+CD163+CD206+이다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 대식세포의 분극을 M1로부터 M2 표현형으로 촉진시킨다.
또 다른 예에서, 상기 방법은 Th2 또는 TReg 세포로의 전염증성 T 헬퍼 세포의 분화를 촉진시킨다.
일례에서, 전염증성 T 헬퍼 세포는 Th17 세포이다.
일례에서, 대상체에서의 항염증성 세포의 생성 및/또는 기능의 증가는
- 대상체에서의 IL-6 수치의 감소;
- 대상체에서의 TNF-알파 수치의 감소; 및/또는,
- 대상체에서의 IL-10 수치의 증가를 발생시킨다.
일례에서, 상기 방법은 대상체에서 항염증성 사이토카인의 수치를 증가시킨다.
일례에서, 상기 방법은 대상체에서 IL-10의 수치를 증가시킨다.
일례에서, 상기 방법은 대상체에서 전염증성 사이토카인의 수치를 감소시킨다.
일례에서, 상기 방법은 대상체에서 IL-6, TNF-알파 및/또는 IL-17 중 어느 하나의 수치를 감소시킨다.
일례에서, 상기 방법은 전염증성 세포의 생성 및/또는 기능을 또한 저해한다.
일례에서, 전염증성 세포는 Th17 세포 또는 M1 유형 대식세포이다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 M1 유형 대식세포 분극을 저해하는 방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 대식세포의 분극을 M1로부터 M2 표현형으로 촉진시키는 방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 M1 유형 대식세포 유래 사이토카인 방출을 저해하는 방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 저해된 M1 유형 대식세포 유래 사이토카인이 TNF-알파 및/또는 IL-6인 방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 적어도 0.1㎍/106개의 세포의 양으로 안지오포이에틴-1(Ang1)을 발현한다.
또 다른 예에서, 염증성 질환은 당뇨병 또는 비정상 상처 치유, 심장마비의 증상, 뇌졸중의 증상, 말초 혈관 질환의 증상, 절단, 신장 질환, 신부전, 실명, 신경병증, 신장병증, 망막병증, 염증, 무기력 또는 비알콜성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis: NASH)의 증상으로 이루어진 군으로부터 선택된 당뇨병의 연관 병태 또는 증상이다.
예를 들어, 본 개시내용은 류마티스성 관절염을 치료하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 개시내용은 당뇨병성 망막병증을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 적어도 0.1㎍/106개의 세포의 양으로 안지오포이에틴-1(Ang1)을 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 0.5㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 0.7㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 1㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현한다.
또 다른 예에서, 줄기 세포는 약 0.1㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 약 0.05㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 약 0.04㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 약 0.03㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 약 0.02㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 약 0.01㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다.
또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 약 2:1의 비율로 Ang1:VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 약 10:1의 비율로 Ang1:VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 약 20:1의 비율로 Ang1:VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 약 30:1의 비율로 Ang1:VEGF를 발현한다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 적어도 약 50:1의 비율로 Ang1:VEGF를 발현한다.
또 다른 예에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 중간엽 전구체 세포이다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPS 세포)이다.
또 다른 예에서, 상기 조성물은 허용되는 약제학적 담체를 추가로 포함한다.
또 다른 예에서, 상기 조성물은 하기 기재된 시험관내 방법에 따라 유전자 비변형 줄기 세포를 배양함으로써 생성된다.
일례에서, 줄기 세포는 임의의 포유류로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 원시류, 소, 양, 말, 개, 고양이 또는 염소로부터 유래할 수 있다. 또 다른 예에서, 줄기 세포는 인간 줄기 세포이다.
또 다른 예에서, 염증성 질환은 제2형 당뇨병이다.
일례에서, 제2형 당뇨병을 치료하는 방법은 대상체에게 ㎏당 약 0.1x106개 내지 약 3x106개의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 제2형 당뇨병을 치료하는 방법은 대상체에게 ㎏당 약 0.3x106개 내지 약 2x106개의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 제2형 당뇨병을 치료하는 방법은 대상체에게 ㎏당 약 1x106개 내지 약 2x106개의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 제2형 당뇨병을 치료하는 방법은 대상체에게 ㎏당 약 약 2x106개의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 하기 중 어느 하나는 당뇨병, 또는 당뇨병의 연관 병태 또는 증상이 대상체에서 치료되었다는 것을 나타낸다:
- HbA1c 값의 감소(전체 헤모글로빈의 %);
- 공복 인슐린 수치의 감소;
- IL-6 수치의 감소;
- TNF-α 수치의 감소; 및/또는
- 아디포넥틴 수치의 증가.
일례에서, 대상체는 제2형 당뇨병을 가지고, 대상체 포도당 수치는 부적절하게 조절된다.
일례에서, 대상체 포도당 수치는 메트폴민에 의해 부적절하게 조절된다.
일례에서, 대상체는 7.5% 초과의 기준치 HbA1c 값을 가진다.
일례에서, 대상체는 8% 이상의 기준치 HbA1c 값을 가진다.
일례에서, 염증성 질환은 류마티스성 관절염이다.
일례에서, 류마티스성 관절염을 치료하는 방법은 대상체에게 ㎏당 약 0.5x106개 내지 약 3.0x106개의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 류마티스성 관절염을 치료하는 방법은 대상체에게 ㎏당 약 1.0x106개 내지 약 2.0x106개의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 하기 중 어느 하나는 류마티스성 관절염이 치료되었다는 것을 나타낸다:
- ACR20;
- ACR50
- ACR70
- IL-6 수치의 감소; 및/또는
- 질환 활성 점수의 감소.
또 다른 예에서, 염증성 질환은 당뇨병성 신경병증이다.
일례에서, 류마티스성 관절염을 치료하는 방법은 대상체에게 약 1.0x108개 내지 약 4.0x108개의 줄기 세포의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 류마티스성 관절염을 치료하는 방법은 대상체에게 약 1.5x108개 내지 약 3.0x108개의 줄기 세포의 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일례에서, 일례에서, 하기 중 어느 하나는 당뇨병성 신병증이 치료되었다는 것을 나타낸다:
- eGFR 및/또는 mGFR의 감소의 저해;
- eGFR 및/또는 mGFR의 개선; 및/또는
- IL-6 수치의 감소.
일례에서, 대상체 기준치 eGFR은 약 35㎖/분/1.73㎡ 초과이다.
일례에서, 대상체 기준치 eGFR은 30㎖/분/1.73㎡ 초과이다.
일례에서, 대상체 기준치 eGFR은 28㎖/분/1.73㎡ 초과이다.
일례에서, 대상체 기준치 eGFR은 25㎖/분/1.73㎡ 초과이다.
일례에서, 줄기 세포는 전신으로 투여된다.
일례에서, 줄기 세포는 정맥내로 투여된다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은, 염증성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의, 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 상승한 수치의 안지오포이에틴-1(Ang1)을 발현한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은, 염증성 질환의 치료에서 사용하기 위한, 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 상승한 수치의 안지오포이에틴-1(Ang1)을 발현한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은, 염증성 질환의 치료를 위해 사용될 때, 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 상승한 수치의 안지오포이에틴-1(Ang1)을 발현한다.
도 1: 현재의 배지(공정 A) 및 재조제 배양 배지(reformulated culture media)(공정 B)에 의한 MPC 성장. Y 축은 세포 수를 나타내고; X 축은 일 단위의 시간이다. 조절 배지는 공정 A에서 사용된 배양 배지이고, 재조제 배지는 공정 B에서 사용된 배양 배지이다.
도 2: 현재의 배지(공정 A) 및 재조제 배지(공정 B)에서의 MPC 배가 시간. MPC는 현재의 알파 MEM 배양(공정 A)에서 성장하거나 변형 알파 MEM(공정 B)에서 재조제된다. 세포를 P3으로부터 P5로 계대배양한다.
도 3: MPC의 집단 배가 시간(Population Doubling Time: PDL). MPC는 재조제 알파 MEM(공정 B)에 대해 현재의 알파 MEM 배양 배지(공정 A)에서 P3으로부터 P5로 성장한다. 현재의 배지(공정 A)에서 성장한 MPC는 8 PDL을 겪고, 재조제 배양 배지(공정 B)에서 성장한 MPC는 7.33 PDL을 겪는다.
도 4: CD14+ 면역선택 단핵구의 MPC와의 동시배양은 M2 대식세포의 표현형 특성을 나타내는 CD14+16+ 대식세포를 생성시킨다.
도 5: MPC와의 동시배양은 대식세포에 의한 TNFα의 염증 유래 (LPS) 분비를 방지한다.
도 6: 대식세포에 의한 항염증성 사이토카인 IL-10의 생성은 LPS의 존재 하에 MPC와의 동시배양에 의해 증대된다.
도 7: MPC는 대식세포 분극을 조절하는 데 역할을 한다.
도 8: PGE2의 분비: IL-1β 및 TNFα의 상가 효과.
도 9: MPC 투여 이후 전염증성 및 항염증성 사이토카인의 수치의 변화.
도 10: 확립된 후기 질환(d.42)의 시간에 MPC 투여는 관절에서 염증성 사이토카인의 수치를 감소시킨다.
도 11: 코호트 1-3에 대한 MPC의 투약.
도 12: 12주에 아디포넥틴 수치(기준치로부터의 변화).
도 13: 12주에 TNF-알파 수치(기준치로부터의 변화).
도 14: 12주에 IL-6 수치(기준치로부터의 변화).
도 15: 기준치 HbA1c < 8% 또는 ≥ 8%의 하위그룹에 의한 HbA1c 변화
도 16: 12주에 표적 HbA1c(< 7.0%)에서의 대상체
도 17: 시간에 따른 평균 IL-6 변화
도 18: ACR 20 반응 생물학적 불응성 RA: 1M MPC/㎏
도 19: ACR 50 반응 생물학적 불응성 RA: 1M MPC/㎏
도 20: ACR 70 반응 생물학적 불응성 RA: 1M MPC/㎏
도 21: 성분에 의한 시간에 따른 ACR 반응; 주에 압통 관절 수(TJC; 왼쪽) 및 부종 관절 수(SJC; 오른쪽)
도 22: 성분에 의한 시간에 따른 ACR 반응; 주마다 질환 활성의 대상체 전체 평가(SGADA)(왼쪽); 주마다 질환 활성의 조사자 전체 평가(IGADA)(오른쪽)
도 23: 12주에 DASCRP 반응자 분석
도 24: 건강 평가 질의 질환 지수(HAQ-DI): MCID(-0.22)에 도달하는 비율
도 25: 12주 mGFR[99Tc DTPA] 및 eGFR[MDRD], 기준치로부터의 변화(㎖/분/1.73㎡).
도 26: 12주에 기준치로부터의 IL-6 평균 변화
도 27: MPC 치료된 환자에서 12주에 개선된 혈청 크레아티닌과 상관된 기준치 IL-6
도 28: 기준치 eGFR > 30㎖/분/1.73㎡를 가지는 mGFR 및 eGFR 대상체에서의 12주에 기준치로부터의 변화
일반 기법 및 정의
본 명세서에 걸쳐, 달리 구체적으로 표시되지 않은 한 또는 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹의 언급은 하나 및 복수(즉, 하나 이상)의 이들 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹을 포함하도록 취해져야 한다.
당해 분야의 당업자는 본 명세서에 기재된 본 개시내용이 구체적으로 기재된 것 이외의 변경 및 변형에 처리된다는 것을 이해할 것이다. 본 개시내용이 모든 이러한 변경 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용은, 개별적으로 또는 총체적으로, 본 명세서에서 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상의 상기 단계 또는 특징을 또한 포함한다.
본 개시내용은 오직 예시의 목적을 위해 의도되는 본 명세서에 기재된 구체적인 실시형태에 의해 범위에 의해 제한되지 않는다. 기능상 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 바대로 본 개시내용의 범위 내에 명확하다.
본 명세서에 개시된 임의의 예는, 달리 구체적으로 표시되지 않은 한, 임의의 다른 예에 필요 부분만 수정하여 적용되도록 취해져야 한다.
달리 구체적으로 정의되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 (예를 들어 세포 배양, 분자 유전학, 줄기 세포 분화, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학에서) 당해 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가지도록 취해져야 한다.
달리 표시되지 않은 한, 본 개시내용에서 사용된 줄기 세포, 세포 배양 및 면역 기법은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 표준 절차이다. 이러한 기법은 소소에서의 문헌, 예컨대 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지 모든 업데이트 포함)]에 걸쳐 기재되고 설명되어 있다.
용어 "및/또는" 예를 들어 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 의미 둘 다 또는 의미 중 어느 하나에 대한 분명한 지지를 제공하도록 취해져야 한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "약"은, 반대로 표시되지 않은 한, 지정된 값의 ±10%, 더 바람직하게는 ±5%를 의미한다.
용적 백분율(v/v%)은 [(용질의 용적)/(용액의 용적)] x 100%를 정의한다. 용적 백분율은 용액의 용적에 대한 것이다. 예를 들어, 5%(v/v)의 FCS가 보충된 세포 배양 배지는 매 100㎖의 세포 배양 배지에 대해 약 5㎖의 FCS가 존재한다는 것을 의미한다.
본 명세서에 걸쳐, 단어 "포함한다" 또는 변형어, 예컨대 "포함" 또는 "포함하는"은, 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 배제가 아니라, 기재된 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 시사하도록 의미할 것이다.
줄기 세포
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "줄기 세포"는 표현형으로 및 유전자적으로 동일한 딸세포를 생성시킬 수 있는 자가 재생 세포, 및 적어도 하나의 다른 최종 세포 유형(예를 들어, 말단 분화 세포)를 의미한다. 용어 "줄기 세포"는 전능성, 다능성 및 다잠재성 세포, 및 이의 분화로부터 유래한 선조 및/또는 전구체 세포를 포함한다. 줄기 세포는 성인 또는 배아 줄기 세포일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "전능 세포" 또는 "전능성 세포"는 완전한 배아(예를 들어, 배반포)를 형성할 수 있는 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "다능 세포" 또는 "다능성 세포"는 완전한 분화 다양성, 즉 임의의 포유류 신체의 대략 260개의 세포 유형으로 성장하는 능력을 가지는 세포를 의미한다. 다능 세포는 자가 재생하고, 조직 내에 휴먼 또는 정지로 있을 수 있다.
"다잠재성 세포" 또는 "다잠재 세포"란 임의의 몇몇 성숙 세포 유형을 생성시킬 수 있는 세포를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 이 구절은 이들 세포의 성인 선조 세포 및 다잠재성 자손을 포함한다. 다잠재성 세포와 달리, 다능성 세포는 모든 세포 유형을 형성하는 능력을 가지지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "중간엽 계열 전구체 또는 줄기 세포"는 중간엽 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 예를 들어, 중간엽 계열 전구체 세포 및 중간엽 전구체 세포는 골, 연골, 근육 세포, 지방 세포 및 섬유성 연결 조직으로 분화할 수 있다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 STRO-1+ 중간엽 전구체 세포이다.
STRO-1+ 다잠재성 세포는 골수, 혈액, 치수, 지방조직 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모공, 장, 폐, 림프절, 흉선, 골, 인대, 힘줄, 골격근, 진피 및 골막에서 발견되는 세포이다. 따라서, STRO-1+ 다잠재성 세포는 지방조직, 골성, 연골성, 탄성 및 섬유성 연결 조직(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다. 이들 세포가 진입하는 특정한 계열 구속 및 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내인성 생물활성 인자, 예컨대 성장 인자, 사이토카인 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건으로부터의 다양한 영향에 의해 달라진다. 일 실시형태에서, STRO-1+ 다잠재성 세포는 표현형 세포를 생성하기 위해 시간에 맞춰 비가역적으로 분화하는 전구체 세포 또는 줄기 세포인 딸세포를 생성하도록 분화하는 비조혈 선조 세포이다.
일례에서, STRO-1+ 세포는 (동일한 또는 상이한 종이든) 대상체, 예를 들어 치료되는 대상체 또는 관련 대상체 또는 비관련 대상체로부터 얻어진 샘플로부터 농후하다. 용어 "농후한", "농후" 또는 이의 변형어는 본 명세서에서 하나의 특정한 세포 유형의 비율 또는 다수의 특정한 세포 유형의 비율이 세포의 비치료 집단(예를 들어, 이의 네이티브 환경에서의 세포)과 비교할 때 증가하는 세포의 집단을 기술하도록 사용된다. 일례에서, STRO-1+ 세포에 농후화된 집단은 적어도 약 0.1% 또는 0.5% 또는 1% 또는 2% 또는 5% 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 또는 50% 또는 75% 또는 85% 또는 95% 또는 99%의 STRO-1+ 세포를 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "STRO-1+ 세포에 농후화된 세포의 집단"은 용어 "X%의 STRO-1+ 세포를 포함하는 세포의 집단"에 대한 명확한 지원을 제공하기 위해 취해질 것이고, 여기서 X%는 본 명세서에서 언급된 바대로 백분율이다. STRO-1+ 세포는 몇몇 예에서 클론형성 콜로니를 형성할 수 있고, 예를 들어 CFU-F(섬유아세포) 또는 이의 하위세트(예를 들어, 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 95%)는 이의 활성을 가질 수 있다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 선택 가능한 형태로 STRO-1+ 세포를 포함하는 세포 제제로부터 농후화된다. 이와 관련하여, 용어 "선택 가능한 형태"는 세포가 STRO-1+ 세포의 선택을 허용하는 마커(예를 들어, 세포 표면 마커)를 발현한다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 마커는 STRO-1일 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 본 명세서에서 기재되고/되거나 예시된 것처럼, STRO-2 및/또는 STRO-3(TNAP) 및/또는 STRO-4 및/또는 VCAM-1 및/또는 CD146 및/또는 3G5를 발현하는 세포(예를 들어, MPC)는 또한 STRO-1을 발현한다(그리고 STRO-1bright일 수 있다). 따라서, 세포가 STRO-1+이라는 표시는 세포가 STRO-1 발현에 의해 선택된다는 것을 의미하지 않는다. 일례에서, 세포는 적어도 STRO-3 발현에 기초하여 선택되고, 예를 들어 이것은 STRO-3+(TNAP+)이다. 또 다른 예에서, 세포는 적어도 STRO-4 발현에 기초하여 선택되고, 예를 들어 이것은 STRO-4+이다.
세포 또는 이의 집단의 선택의 언급은 반드시 특정한 조직 공급원으로부터의 선택을 요하지 않는다. 본 명세서에 기재된 바대로, STRO-1+ 세포는 매우 다양한 공급원으로부터 선택되거나 단리되거나 농후화될 수 있다. 그렇긴 하지만, 몇몇 예에서, 이들 용어는 STRO-1+ 세포(예를 들어, MPC)를 포함하는 임의의 조직, 또는 혈관화 조직, 또는 주피세포(예를 들어, STRO-1+ 주피세포)를 포함하는 조직, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 조직으로부터의 선택에 대한 지지를 제공한다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 STRO-1+, TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+(HSP-90β), CD45+, CD146+, 3G5+, CC9 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 개별적으로 또는 총체적으로 발현한다.
"개별적으로"란 본 개시내용이 별개로 언급된 마커 또는 마커의 집단을 포함하고, 개별 마커 또는 마커의 그룹은 본 명세서에서 별개로 기재되지 않을 수 있더라도, 수반된 청구항은 각각으로부터 별개로 그리고 분할하여 이러한 마커 또는 마커의 그룹을 한정할 수 있는 것을 의미한다.
"총체적으로"란 본 개시내용이 언급된 마커 또는 펩타이드의 그룹의 임의의 수 또는 조합을 포함하고, 마커 또는 마커의 그룹의 이러한 수 또는 조합이 본 명세서에서 구체적으로 기재되지 않을 수 있더라도, 수반된 청구항은 마커 또는 마커의 그룹의 임의의 다른 조합으로부터 별개로 그리고 분할하여 이러한 조합 또는 하위조합을 한정할 수 있는 것을 의미한다.
일례에서, STRO-1+ 세포는 STRO-1bright(syn. STRO-1bri)이다. 일례에서, STRO-1bri 세포는 STRO-1dim 또는 STRO-1intermediate 세포에 대해 우선적으로 농후화된다.
일례에서, STRO-1bright 세포는 추가적으로 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+(HSP-90β) 및/또는 CD146+ 중 하나 이상이다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 상기 마커에 선택되고/되거나, 하나 이상의 상기 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 이와 관련하여, 이전에 농후화된 또는 단리된 세포보다는, 구체적으로 시험될 필요가 없는 마커를 발현하는 것으로 나타난 세포는 시험될 수 있고, 후속하여 사용되거나, 단리되거나, 농후화된 세포는 또한 동일한 마커를 발현하는 것으로 합당하게 추정될 수 있다.
일례에서, STRO-1bright는 면역선택에 의해 단리된다. 일례에서, STRO-1bright 세포는 TNAP를 발현하는 세포의 면역선택에 의해 단리된다. 본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "TNAP"는 조직 비특이적 알칼리 포스파타제의 모든 아이소폼을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 상기 용어는 간 아이소폼(liver isoform: LAP), 골 아이소폼(bone isoform: BAP) 및 신장 아이소폼(kidney isoform: KAP)을 포함한다. 일례에서, TNAP는 BAP이다. 일례에서, TNAP는 본 명세서에 사용되는 바대로 수탁 번호 PTA-7282 하에 부다페스트 조약의 조항 하에 2005년 12월 19일에 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 의미한다.
일례에서, 중간엽 전구체 또는 줄기 세포는 CD29+, CD54+, CD73+, CD90+, CD102+, CD105+, CD106+, CD166+, MHC1+ 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 레메스템셀(remestemcel)-L)이다.
일례에서, 중간엽 전구체 세포는 WO 2004/85630에 기재된 바대로 혈관주위 중간엽 전구체 세포이다. 예를 들어, 중간엽 전구체 세포는 혈관주위 세포의 마커를 발현하고, 예를 들어 세포는 STRO-1+ 또는 STRO-1bright 및/또는 3G5+이다. 일례에서, 세포는 혈관화 조직 또는 장기 또는 이의 일부로부터 단리된 세포이거나 이전에 세포이었거나 이의 자손이다.
소정의 마커가 세포 표면에 존재하는 정도에 따라 마커의 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 수치를 발현할 수 있는, 마커에 대해 세포는 "양성"이라고 말해지고, 여기서 이 용어는 세포의 분류 과정에서 사용된 형광 또는 다른 마커의 강도에 관한 것이다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 분류되는 특정한 세포 집단에 사용된 마커의 맥락에서 이해될 것이다. 소정의 마커에 대해 "음성"이라고 말해지는 세포는 반드시 그 세포로부터 완전히 부재하지는 않는다. 이 용어는 마커가 그 세포에 의해 비교적 매우 낮은 수치에서 발현되고, 이것이 검출 가능하게 표지될 때 매우 낮은 신호를 생성하고 배경 수치, 예를 들어 아이소타입 대조군 항체를 사용하여 검출된 수치 초과로 검출 불가능하다는 것을 의미하다.
용어 "bright"는, 본 명세서에서 사용될 때, 검출 가능하게 표지될 때 비교적 높은 신호를 생성하는 세포 표면 상의 마커를 의미한다. 이론에 구속되고자 하지 않으면서, "bright" 세포가 샘플에서의 다른 세포보다 더 많은 표적 마커 단백질(예를 들어, STRO-1에 의해 인식된 항원)을 발현한다는 것을 제안한다. 예를 들면, STRO-1bri 세포는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS) 분석에 의해 결정될 때 FITC 접합 STRO-1 항체에 의해 표지될 때 비-bright 세포(STRO-1dull/dim)보다 더 높은 형광 신호를 생성한다. 일례에서, "bright" 세포는 시작 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포의 적어도 약 0.1%를 구성한다. 다른 예에서, "bright" 세포는 시작 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포의 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 또는 적어도 약 2%를 구성한다. 예에서, STRO-1bright 세포는 "배경", 즉 STRO-1-인 세포에 비해 STRO-1 표면 발현의 2 log 규모의 더 높은 발현을 가진다. 비교하면, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 STRO-1 표면 발현의 2 log 미만 규모의 더 높은 발현, 통상적으로 약 1 log 또는 "배경" 미만을 가진다.
일례에서, 상당한 비율의 STRO-1+ 다잠재성 세포는 적어도 2개의 상이한 생식계열로 분화할 수 있다. 다잠재성 세포가 구속될 수 있는 계열의 비제한적인 예는 골 전구체 세포; 담관 상피 세포 및 간세포에 다능성인 간세포 선조; 희돌기교세포 및 성상교세포로 진행하는 신경교 세포 전구체를 생성할 수 있는 신경 제한 세포; 뉴런으로 진행하는 뉴런 전구체; 심장 근육 및 심근세포에 대한 전구체, 글루코스 반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주를 포함한다. 다른 계열은 상아아세포, 상아질 생성 세포 및 연골세포, 및 하기의 전구체 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 망막 색소 상피 세포, 섬유아세포, 피부 세포, 예컨대 각질세포, 수지상 세포, 모공 세포, 신장관 상피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 선조, 혈관 내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 기질, 심장 근육, 평활근, 골격근, 주피세포, 혈관, 상피, 신경교, 뉴런, 성상교세포 및 희돌기교세포 세포.
또 다른 예에서, STRO-1+ 세포는 배양 시 조혈 세포를 생성시킬 수 없다.
일례에서, 현재 기재된 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)는 균일한 조성물일 수 있거나, MSC에서 농후화된 혼합 세포 집단일 수 있다. 균일한 중간엽 줄기 세포 조성물은 유착 골수 또는 골막 세포를 배양함으로써 얻어질 수 있고, 중간엽 줄기 세포는 독특한 단일클론 항체에 의해 확인된 특이적 세포 표면 마커에 의해 확인될 수 있다. 중간엽 줄기 세포에서 농후화된 세포 집단을 얻는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,486,359호에 기재되어 있다. 중간엽 줄기 세포에 대안적인 공급원은 혈액, 피부, 제대혈, 근육, 지방, 골 및 연골막을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
상기 기재된 세포 표면 마커를 보유하는 줄기 세포의 인식, 선택 및 정제는 다수의 상이한 방법에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 관여한 마커에 대한 결합제의 적용, 이어서 높은 수준 결합, 또는 낮은 수준 결합 또는 비결합인, 결합을 나타내는, 이들 세포의 분리.
예를 들어, 결합제는 항체, 예컨대 단일클론 항체 또는 항체 기반 분자를 포함할 수 있다.
항체 및 다른 결합 분자는 특정한 세포 표면 마커를 발현하는 줄기 세포를 선택하고 정제하기 위해 다양한 기법에서 사용될 수 있다.
선택 및 정제를 위한 기법은 항체 코팅된 자기 비드를 이용한 자기 분리, 친화도 크로마토그래피 및 고체 매트릭스에 부착된 항체에 의한 "패닝(panning)", 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정한 마커를 발현하는 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 양성 면역선택을 통해 세포 집단으로부터 선택되거나 정제될 수 있다. 예를 들어, 중간엽 전구체 세포는 STRO-1 항체의 세포 표면 발현에 기초하여 세포 집단으로부터 단리되고 농후화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gronthos and Simmons 1995] 참조).
본 개시내용에 따른 단리된 줄기 세포를 배양에 의해 시험관내 증식시킬 수 있다. 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것처럼, 줄기 세포를 저온보존하고, 해동하고, 후속적으로 배양에 의해 시험관내 증식시킬 수 있다. 일례에서, 줄기 세포를 성장 배지에서 시딩하고, 밤새 37℃, 20% O2에서 배양 용기에 부착되게 하였다. 성장 배지를 후속적으로 대체하고, 세포를 37℃, 5% O2에서 추가로 68 내지 72시간 동안 배양한다.
예에서, 단리된 줄기 세포를 혈청 보충 성장 배지에서 50,000개의 세포/㎠로 시딩하고, 밤새 37℃, 20% O2에서 배양 용기에 부착되게 하였다. 성장 배지를 0.5%의 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 연골원 기본 배지(CBM; Lonza, Walkersville, MD)에 의해 후속적으로 대체하고, 세포를 37℃, 5% O2에서 추가로 68 내지 72시간 동안 배양한다.
1차 줄기 세포 배양의 다양한 다른 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 1차 줄기 세포 배양은 문헌[Gronthos and Simmons 1995]에 기재된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
배양된 줄기 세포는 생체내 세포에 표현형으로 상이하다. 이것은 예를 들어 CD44를 발현할 수 있다.
일 실시형태에서, 배양된 줄기 세포는 생체내 세포에 생물학적으로 상이하여서, 더 높은 비율의 재생을 가진다.
배양된 줄기 세포는 대상체에게 투여 전 저온보존될 수 있다. 예를 들어, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 대상체에게 투여 전 저온보존될 수 있다.
유전자 비변형 세포
본 명세서에 사용되는 바대로, 용어 "유전자 비변형"은 Ang1을 발현하거나 코딩하는 핵산에 의한 형질감염에 의해 변형되지 않은 세포를 의미한다. 의심을 피하기 위해, 본 개시내용의 맥락에서, Ang1을 코딩하는 핵산에 의해 형질감염된 줄기 세포는 유전자 변형된 것으로 생각될 것이다. 본 개시내용의 맥락에서, "유전자 비변형" 세포는 약간의 정도로 Ang1을 천연으로 발현한다.
Ang1 및/또는 VEGF의 발현
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 유전자 비변형되고 적어도 0.1㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현한다. 그러나, 다양한 실시형태에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포가 적어도 0.2㎍/106개의 세포, 0.3㎍/106개의 세포, 0.4㎍/106개의 세포, 0.5㎍/106개의 세포, 0.6㎍/106개의 세포, 0.7㎍/106개의 세포, 0.8㎍/106개의 세포, 0.9㎍/106개의 세포, 1㎍/106개의 세포, 1.1㎍/106개의 세포, 1.2㎍/106개의 세포, 1.3㎍/106개의 세포, 1.4㎍/106개의 세포, 1.5㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현할 수 있는 것으로 고안된다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.2㎍/106개의 세포 내지 약 1.5㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.3㎍/106개의 세포 내지 약 1.4㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.4㎍/106개의 세포 내지 약 1.3㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.5㎍/106개의 세포 내지 약 1.2㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.55㎍/106개의 세포 내지 약 1.1㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.6㎍/106개의 세포 내지 약 1.0㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.65㎍/106개의 세포 내지 약 0.9㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.7㎍/106개의 세포 내지 약 0.8㎍/106개의 세포의 양으로 Ang1을 발현하다.
또 다른 양태에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 유전자 비변형 줄기 세포는 약 0.01㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다.
또 다른 양태에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 유전자 비변형 줄기 세포는 약 0.05㎍/106개 미만의 세포의 양으로 VEGF를 발현한다. 그러나, 다양한 실시형태에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 약 0.05㎍/106개 미만의 세포, 0.04㎍/106개의 세포, 0.03㎍/106개의 세포, 0.02㎍/106개의 세포, 0.01㎍/106개의 세포, 0.009㎍/106개의 세포, 0.008㎍/106개의 세포, 0.007㎍/106개의 세포, 0.006㎍/106개의 세포, 0.005㎍/106개의 세포, 0.004㎍/106개의 세포, 0.003㎍/106개의 세포, 0.002㎍/106개의 세포, 0.001㎍/106개의 세포의 양으로 VEGF를 발현할 수 있는 것으로 고안된다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.001㎍/106개의 세포 내지 약 0.1㎍/106개의 세포의 양으로 VEGF를 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.0025㎍/106개의 세포 내지 약 0.09㎍/106개의 세포의 양으로 VEGF를 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.0075㎍/106개의 세포 내지 약 0.08㎍/106개의 세포의 양으로 VEGF를 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.01㎍/106개의 세포 내지 약 0.07㎍/106개의 세포의 양으로 VEGF를 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.02㎍/106개의 세포 내지 약 0.06㎍/106개의 세포의 양으로 VEGF를 발현하다.
일 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 적어도 0.02㎍/106개의 세포 내지 약 0.05㎍/106개의 세포의 양으로 VEGF를 발현하다.
조성물 또는 줄기 세포의 배양물에서 발현되는 세포 Ang1 및/또는 VEGF의 양은 당해 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 정량적 검정, 예를 들어 정량적 ELISA 검정 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 그러나, 본 개시내용의 범위가 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포에서 발현된 Ang1 또는 VEGF의 양 또는 수치를 결정하기 위한 임의의 특정한 방법으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
일례에서, 조성물 또는 줄기 세포의 배양에서 발현되는 Ang1 또는 VEGF의 수치는 ELISA 검정에 의해 결정된다. 이러한 검정에서, 줄기 세포의 배양물로부터의 세포 용해물을 ELISA 플레이트의 웰에 첨가한다. 웰을 Ang1 또는 VEGF에 대해, 단일클론 또는 다중클론 항체(들)인, 1차 항체에 의해 코팅할 수 있다. 이후, 웰을 세척하고, 이후 1차 항체에 대해, 단일클론 또는 다중클론 항체(들)인, 2차 항체와 접촉시킨다. 2차 항체를 예를 들어 적절한 효소, 예컨대 겨자무 과산화효소에 접합한다. 이후, 웰을 항온처리할 수 있고, 이후 항온처리 기간 후 세척한다. 이후, 웰을 하나 이상의 발색체와 같은 2차 항체에 접합된 효소에 대한 적절한 기질과 접촉시킨다. 사용될 수 있는 발색체는 과산화수소 및 테트라메틸벤지딘을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 기질(들)을 첨가한 후, 웰을 적절한 기간 동안 항온처리한다. 항온처리의 완료 시, "중지" 용액을 웰에 첨가하여 효소와 기질(들)과의 반응을 중지시킨다. 이후, 샘플의 광학 밀도(OD)를 측정한다. 샘플의 광학 밀도를 공지된 양의 Ang1 또는 VEGF를 함유하는 샘플의 광학 밀도와 상관시켜서 시험되는 줄기 세포의 배양에 의해 발현된 Ang1 또는 VEGF의 양을 결정한다.
또 다른 양태에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 유전자 비변형 줄기 세포는 적어도 약 2:1의 비율로 Ang1:VEGF를 발현한다. 그러나, 다양한 실시형태에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포가 적어도 약 10:1, 15:1, 20:1, 21:1, 22:1, 23:1, 24:1, 25:1, 26:1, 27:1, 28:1, 29:1, 30:1, 31:1, 32:1, 33:1, 34:1, 35:1, 50:1의 비유로 Ang1:VEGF를 발현할 수 있는 것으로 고안된다.
Ang1:VEGF 발현 비율을 결정하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. Ang1 및 VEGF 발현의 비율을 결정하기 위한 방법의 예에서, Ang1 및 VEGF 발현 수치는 상기 기재된 바대로 정량적 ELISA를 통해 정량화된다. 이러한 예에서, Ang1 및 VEGF의 수치를 정량화한 후, Ang1 및 VEGF의 정량화된 수치에 기초한 비율은 (Ang1의 수치/VEGF의 수치) = Ang1:VEGF 비율로서 표시될 수 있다.
세포 조성물
본 개시내용의 일례에서, 줄기 세포는 조성물의 형태로 투여된다. 일례에서, 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "담체" 및 "부형제"는 활성 화합물의 저장, 투여 및/또는 생물학적 활성을 수월하게 하도록 당해 분야에서 관습적으로 사용되는 물질의 조성물을 의미한다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)] 참조). 담체는 활성 화합물의 임의의 원치않는 부작용을 또한 감소시킬 수 있다. 적합한 담체는 예를 들어 안정하고, 예를 들어 담체에서의 다른 성분과 반응할 수 없다. 일례에서, 담체는 치료에 사용되는 투약량 및 농도에서 수혜자에서 상당한 국소 또는 전신 부작용을 생성하지 않는다.
본 개시내용에 적합한 담체는 관습적으로 사용되는 것을 포함하고, 예를 들어 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 락토스, 링거액, 완충 용액, 히알우로난 및 글리콜은 특히 (등장성일 때) 용액에 대한 예시적인 액체 담체이다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제는 전분, 셀룰로스, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 옥수수, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산마그네슘, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
또 다른 예에서, 담체는 예를 들어 세포가 성장하거나 현탁되는 배지 조성물이다. 예를 들어, 이러한 배지 조성물은 투여되는 대상체에서 어떠한 부작용도 유도하지 않는다.
예시적인 담체 및 부형제는 세포의 생존능력 및/또는 대사 증후군 및/또는 비만을 감소시키거나 예방하거나 지연시키는 세포의 능력에 불리하게 영향을 미치지 않는다.
일례에서, 담체 또는 부형제는 적합한 pH에서 세포 및/또는 가용성 인자를 유지시켜서 생물학적 활성을 발휘하는 완충 활성을 제공하고, 예를 들어 담체 또는 부형제는 인산 염 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)이다. PBS는 세포 및 인자와 최소로 상호작용하고 세포 및 인자의 신속한 방출을 허용하므로 매력적인 담체 또는 부형제를 나타내고, 이러한 경우에, 본 개시내용의 조성물은 예를 들어 주사에 의해 혈류로 또는 조직 또는 조직을 둘러싸거나 이에 인접한 구역으로 직접 적용하기 위한 액체로서 생성될 수 있다.
줄기 세포 및/또는 이의 자손 세포는 또한 수혜자에게 적합하고 수혜자에게 해롭지 않은 생성물로 분해되는 스캐폴드 내에 혼입되거나 포합될 수 있다. 이 스캐폴드는 수혜자 대상체로 이식되는 세포에 대한 지지 및 보호를 제공한다. 천연 및/또는 합성 생분해성 스캐폴드는 이러한 스캐폴드의 예이다.
다양한 상이한 스캐폴드는 본 개시내용의 실행에서 성공적으로 사용될 수 있다. 예시적인 스캐폴드는 생물학적, 분해성 스캐폴드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 천연 생분해성 스캐폴드는 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌 스캐폴드를 포함한다. 세포 이식 스캐폴드에 적합한 합성 물질은 광범위한 세포 성장 및 세포 기능을 지지할 수 있어야 한다. 이러한 스캐폴드는 또한 재흡수성일 수 있다. 적합한 스캐폴드는 예를 들어 문헌[Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 1991]에 기재된 바와 같은 폴리글리콜산 스캐폴드; 또는 합성 중합체, 예컨대 폴리언하이드라이드, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 포함한다.
또 다른 예에서, 세포는 겔 스캐폴드(예컨대, 업죤 컴퍼니(Upjohn Company)사의 Gelfoam)에서 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 세포와의 혼합물로서 투여될 수 있다. 상이한 유형의 세포는 투여 바로 직전에 본 개시내용의 조성물과 혼합될 수 있거나, 이것은 투여에 대한 시간의 기간에 걸쳐 함께 동시배양될 수 있다.
일례에서, 조성물은 세포의 유효량 또는 치료학적 또는 예방학적 유효량을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 1x105개의 상승한 Ang1 수치를 가지는 줄기 세포 내지 약 1x107개의 상승한 Ang1 수치를 가지는 줄기 세포 또는 약 1x106개의 상승한 Ang1을 가지는 줄기 세포 내지 약 5x106개의 상승한 Ang1을 가지는 줄기 세포/㎏를 포함한다.
투여되는 줄기 세포의 정확한 투약량은 환자의 나이, 체중 및 성별, 치료되는 질환(들) 또는 장애(들), 및 이의 정도 및 중증도(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다.
일례에서, 세포의 낮은 용량은 대상체에게 투여된다. 예시적인 투약량은 ㎏당 약 0.1x104개 내지 약 0.5x106개의 세포, 예를 들어 ㎏당 약 0.1x105개 내지 약 0.5x106개의 세포, 예컨대 ㎏당 약 0.5x105개 내지 약 0.5x106개의 세포, 예를 들어 ㎏당 약 0.1x106개 내지 약 0.5x106개의 세포, 예를 들어 ㎏당 약 0.2x106개 또는 0.3x106개 또는 0.4x106개의 세포를 포함한다.
예를 들어, ㎏당 약 0.1x106개, 약 0.2x106개, 약 0.3x106개, 약 0.4x106개, 약 0.5x106개의 세포가 대상체에게 투여될 수 있다.
다른 예에서, ㎏당 약 0.6x106개, 약 0.7x106개, 약 0.8x106개, 약 0.9 x 106개, 약 1.0x106개, 약 1.1x106개, 약 1.2x106개, 약 1.3x106개, 약 1.4x106개의 세포가 대상체에게 투여될 수 있다.
일례에서, 세포의 높은 용량은 대상체에게 투여된다. 예시적인 투약량은 적어도 약 1.5x106개의 세포/㎏를 포함한다. 예를 들어, 높은 용량은 약 1.5x106개 내지 약 6x106개의 세포/㎏, 예컨대 약 1.5x106개 내지 약 5x106개의 세포/㎏, 예를 들어 약 1.5x106개 내지 약 4x106개의 세포/㎏, 예를 들어 약 1.5x106개 내지 약 3 x 106개의 세포/㎏를 포함한다. 예를 들어, 높은 용량은 약 1.5x106개 또는 약 2x106개의 세포/㎏를 포함한다. 예를 들어, 높은 용량은 약 1.5x106개의 세포/㎏를 포함한다. 예를 들어, 높은 용량은 약 2x106개의 세포/㎏를 포함한다. 예를 들어, 높은 용량은 약 3x106개의 세포/㎏를 포함한다.
다른 예에서, ㎏당 약 1.5x106개, 약 1.6x106개, 약 1.7x106개, 약 1.8x106개, 약 1.9x106개, 약 2.0x106개, 약 2.1x106개, 약 2.2x106개, 약 2.3x106개, 약 2.4x106개, 약 2.5x106개, 약 2.6x106개, 약 2.7x106개, 약 2.8x106개, 약 2.9x106개, 약 3.0x106개, 약 3.1x106개, 약 3.2x106개, 약 3.3x106개, 약 3.4x106개, 약 3.5x106개, 약 3.6x106개, 약 3.7x106개, 약 3.8x106개, 약 3.9x106개, 약 4.0x106개의 세포가 대상체에게 투여된다.
다른 예에서, 약 1.0x108개, 약 1.1x108개, 약 1.2x108개, 약 1.3x108개, 약 1.4x108개, 약 1.5x108개, 약 1.6x108개, 약 1.7x108개, 약 1.8x108개, 약 1.9x108개, 약 2.0x108개, 약 2.1x108개, 약 2.2x108개, 약 2.3x108개, 약 2.4x108개, 약 2.5x108개, 약 2.6x108개, 약 2.7x108개, 약 2.8x108개, 약 2.9x108개의 세포, 약 3.0x108개, 약 3.1x108개, 약 3.2x108개, 약 3.3x108개, 약 3.4x108개, 약 3.5x108개, 약 3.6x108개, 약 3.7x108개, 약 3.8x108개, 약 3.9x108개, 약 4.0x108개의 세포가 대상체에게 투여된다.
중간엽 계열 전구체 또는 줄기 세포는 조성물의 세포 집단의 적어도 약 5%를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중간엽 계열 전구체 또는 줄기 세포는 조성물의 세포 집단의 can comprise 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%를 포함할 수 있다.
CD44를 발현하는 줄기 세포는 조성물의 세포 집단의 적어도 약 5%를 포함할 수 있다. 다른 예에서, CD44를 발현하는 줄기 세포는 세포 집단의 적어도 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%를 포함할 수 있다.
몇몇 예에서, 세포는, 세포가 대상체의 순환으로 배출되는 것을 허용하지 않지만, 세포에 의해 분비된 인자가 순환으로 진입하는 것을 허용하는 챔버 내에 함유된다. 이러한 방식으로, 가용성 인자는 대상체의 순환으로 세포가 인자를 분비하도록 허용함으로써 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 챔버는 가용성 인자의 국소 수치를 증가시키기 위해 대상체에서의 부위에 동등하게 이식될 수 있다.
줄기 세포는 전신으로, 예를 들어 정맥내, 동맥내 또는 복강내 투여 등으로 투여될 수 있다.
중간엽 계열 전구체 또는 줄기 세포는 또한 비강내, 근육내, 관절내 또는 심장내 투여에 의해 투여될 수 있다.
예를 들어, 중간엽 계열 전구체 또는 줄기 세포는 아프거나 부은 관절에 직접적으로 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 관상동맥 점적주사를 통해 투여된다. 예를 들어, 중간엽 계열 전구체 또는 줄기 세포는 좌전하행(left anterior descending: LAD) 동맥으로 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 신장내 점적주사를 통해 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 단일 용량으로 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 다수의 용량에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10 용량.
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 조성물은 저온보존될 수 있다. 줄기 세포의 저온보존은 당해 분야에 공지된 저속 냉각 방법 또는 '빠른' 동결 프로토콜을 이용하여 수행될 수 있다. 일례에서, 저온보존의 방법은 비동결 세포와 비교하여 유사한 표현형, 세포 표면 마커 및 저온보존된 세포의 성장 속도를 유지시킨다.
저온보존된 조성물은 저온보존 용액을 포함할 수 있다. 저온보존 용액의 pH는 통상적으로 약 6.5 내지 8이다.
일례에서, 저온보존 용액의 pH는 약 7.4이다.
저온보존 용액은 무균, 비발열원 등장성 용액, 예를 들어 플라스말라이트 A(PlasmaLyte A)(등록상표) 등을 포함할 수 있다. 100㎖의 플라스말라이트 A(등록상표)는 526㎎의 염화나트륨, USP(NaCl); 502㎎의 글루콘산나트륨(C6H11NaO7); 368㎎의 아세트산나트륨 3수화물, USP(C2H3NaO2
Figure pat00001
3H2O); 37㎎의 염화칼륨, USP(KCl); 및 30㎎의 염화마그네슘, USP(MgCl2
Figure pat00002
6H2O)을 포함한다. 이것은 항균제를 함유하지 않는다. pH는 수산화나트륨에 의해 조정된다. pH는 7.4(6.5 내지 8.0)이다.
동결을 수월하게 하기 위해, 저온보호제, 예를 들어 다이메틸설폭사이드(DMSO) 등을 보통 저온보존 용액에 첨가한다. 이상적으로는, 저온보호제는 세포 및 환자에게 비독성이고, 비항원성이고, 화학적으로 불활성이고, 해동 후 높은 생존율을 제공하고, 세척 없이 이식을 허용해야 한다. 그러나, 대부분의 흔히 사용되는 저온보호제인 DMSO는 약간의 세포독성을 나타낸다. 하이드록실에틸 전분(HES)은 치환물로서 또는 DMSO와 조합되어 사용되어 저온보존 용액의 세포독성을 감소시킬 수 있다.
저온보존 용액은 DMSO, 하이드록시에틸 전분, 인간 혈청 성분 및 다른 단백질 벌크화제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일례에서, 저온보존된 용액은 약 5%의 인간 혈청 알부민(HSA) 및 약 10%의 DMSO를 포함한다. 저온보존 용액은 메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 및 트레할로스 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
저온보존된 조성물을 해동하고 대상체에게 직접적으로 투여할 수 있다. 대안적으로, 저온보존된 조성물을 해동하고, 중간엽 계열 전구체 또는 줄기 세포는 투여 전에 교대 용액 중에 재현탁시킬 수 있다.
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 동물에서 질환 또는 장애를 치료하기에 효과적인 양으로 동물에게 투여된다. 동물은 포유류일 있고, 포유류는 인간 및 비인간 원시류를 포함하는 원시류일 수 있다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 인간에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 인간에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 당뇨병을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 II형 당뇨병을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 약 7% 초과의 기준치 HbA1c 값을 가지는 II형 당뇨병을 가지는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 약 7.1% 초과, 약 7.2%, 약 7.3%, 약 7.4%, 약 7.5%, 약 7.6%, 약 7.7%, 약 7.8%, 약 7.9%, 약 8.0%, 약 8.1%, 약 8.2%, 약 8.3%, 약 8.4%, 약 8.5%, 약 8.6%, 약 8.7%, 약 8.8%, 약 8.9%, 약 9.0%의 기준치 HbA1c 값을 가지는 II형 당뇨병을 가지는 대상체에게 투여될 수 있다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 약 8.0% 이상의 기준치 HbA1c 값을 가지는 II형 당뇨병을 가지는 대상체에게 투여될 수 있다.
HbA1c 값(전체 헤모글로빈의 %)을 결정하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. HbA1c 값(전체 헤모글로빈의 %)을 결정하기 위해 사용된 방법의 예는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 면역검정을 포함한다. 당해 분야의 당업자는 HbA1c 값이 다른 값, 예를 들어 m㏖/㏖로서 표현될 수 있다는 것을 또한 알 것이다.
일례에서, 대상체 HbA1c 값은 HPLC에 의해 결정된다.
일례에서, 대상체 HbA1c 값은 면역검정에 의해 결정된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 제2형 당뇨병을 가지는 대상체에게 투여되고, 대상체 포도당 수치는 부적절하게 조절된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 제2형 당뇨병을 가지는 대상체에게 투여되고, 대상체 포도당 수치는 메트폴민 또는 메트폴민과 또 다른 경구 치료제에 의해 부적절하게 조절된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 만성 신장 질환을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 당뇨병성 신병증을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 제2형 당뇨병 및 만성 신장 질환을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 제2형 당뇨병 및 당뇨병성 신병증을 가지는 대상체에게 투여된다.
예측 사구체 여과율(eGFR)은 조기 신장 손상을 스크리닝하고 검출하고 신장 상태를 모니터링하기 위해 사용된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 약 35㎖/분/1.73㎡ 초과, 약 34㎖/분/1.73㎡, 약 44㎖/분/1.73㎡, 약 32㎖/분/1.73㎡, 약 31㎖/분/1.73㎡, 약 30㎖/분/1.73㎡, 약 29㎖/분/1.73㎡, 약 28㎖/분/1.73㎡, 약 27㎖/분/1.73㎡, 약 26㎖/분/1.73㎡, 약 25㎖/분/1.73㎡의 기준치 eGFR을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 신장 기능 단계 3A, 3B, 4 또는 5를 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 신장 기능 단계 3B를 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 30㎖/분/1.73㎡ 이상의 기준치 eGFR을 가지는 대상체에게 투여된다.
GFR을 예측하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이고 하기 예시된다. eGFR은 크레아티닌 및/또는 시스타틴 C 수치를 사용하여 결정될 수 있다.
예를 들어, eGFR는 MDRD 식을 이용하여 계산될 수 있다:
Figure pat00003
Figure pat00004
다른 예에서, eGFR은 CKD-EPI 식을 이용하여 계산될 수 있다(Levey et al. Ann Intern. Med. 150(9), 604-12, 2009):
Figure pat00005
Figure pat00006
식 중,
Scr는 ㎎/㎗ 단위의 혈청 크레아티닌이고,
κ는 여성의 경우 0.7이고, 남성의 경우 0.9이고,
α는 여성의 경우 -0.329이고, 남성의 경우 -0.411이고,
최소는 Scr/κ의 최소 또는 1을 나타내고,
최대는 Scr/κ의 최대 또는 1을 나타낸다.
eGFR은 또한 eGFR이 감소하거나 개선되는지를 결정하기 위해 시간이 지남에 따라 계속해서 계산되고 모니터링될 수 있다. eGFR은 eGFR의 감소가 치료군에서 저해되는지를 확인하기 위해 대조군과 치료군 사이에 비교될 수 있다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 관절염을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 류마티스성 관절염을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 불완전 항-TNFα 반응자로 분류된 류마티스성 관절염을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 류마티스성 관절염에 대한 생물학적 치료가 실패한 류마티스성 관절염을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 류마티스성 관절염에 대한 2개의 생물학적 치료가 실패한 류마티스성 관절염을 가지는 대상체에게 투여된다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는 류마티스성 관절염에 대한 3개의 생물학적 치료가 실패한 류마티스성 관절염을 가지는 대상체에게 투여된다.
TNF-알파, IL-6, IL-17의 저해
TNF-알파, IL-6 및 IL-17은 사이토카인으로서 공지된 화학 메신저이다. 이 분자는 다양한 신호에 반응하여 세포로부터 방출된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 '저해한다' 또는 '저해하는'은 물질, 예컨대 단백질(예를 들어, 사이토카인) 또는 과정(예를 들어, 세포 분화 또는 세포 분극)의 측정 가능한 수치의 감소 또는 억제를 의미한다.
따라서, 일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 세포의 투여가 대상체에서 TNF-알파, IL-17 및/또는 IL-6의 측정 가능한 수치를 감소시킬 것이라는 것이 고안된다. 이 예에서, 세포로부터의 TNF-알파, IL-17 및/또는 IL-6 방출은 저해된다.
일례에서, 본 개시내용은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포의 투여에 반응하는 대상체를 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 이 예에서, 사이토카인과 같은 전염증성 및/또는 항염증성 마커의 수치는 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포의 투여 후 일정 기간 동안 모니터링될 수 있다.
일례에서, 본 개시내용은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포의 투여에 반응하는 대상체를 모니터링하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포가 투여된 대상체로부터 얻은 샘플, 예컨대 전혈 샘플에서의 염증성 및/또는 항염증성 마커의 수치를 평가하는 단계 및 대상체가, 전염증성 및/또는 항염증성 마커의 수치에 기초하여, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포의 투여에 반응하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
일례에서, 항염증성 마커의 수치의 증가 및/또는 염증성 마커의 수치의 감소는 대상체가 줄기 세포의 투여에 반응한다는 것을 나타낸다.
일례에서, 염증성 및/또는 항염증성 마커는 세포 또는 세포 집단이다.
일례에서, 항염증성 세포의 수의 증가 및/또는 염증성 세포의 수의 감소는 대상체가 줄기 세포의 투여에 반응한다는 것을 나타낸다.
일례에서, 항염증성 세포는 Th2 세포, Treg 세포 및/또는 M2 유형 대식세포이다.
일례에서, 염증성 세포는 Th17 세포 및/또는 M1 유형 대식세포이다.
염증성 세포의 수가 감소하고/하거나, 항염증성 세포의 수가 증가하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있는 다양한 검정이 당해 분야의 당업자에게 이용 가능하다.
예를 들어, 전혈 샘플로부터 단리된 세포 집단은 유세포분석법 기반 기법, 예컨대 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS)을 이용하여 세포 표면 마커의 발현에 대해 평가될 수 있다.
일례에서, CD14+ 단핵구는 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포가 투여된 대상체로부터 얻은 전혈 샘플로부터 정제될 수 있다. 단핵구는 M1 및 M2 유형 대식세포의 비율을 확인하기 위해 CD16, CD163 및 CD206 발현에 대해 평가될 수 있다. 다수의 샘플은 M1 유형 대식세포 수가 감소했거나 감소하는지 및/또는 M2 유형 대식세포 수치가 증가했거나 증가하는지를 결정하기 위해 시간에 따라 평가될 수 있다. 일례에서, M1 및/또는 M2 유형 대식세포 수는 줄기 세포의 투여 전에 대상체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 기준치 또는 전처리 기준 샘플)에서의 M1 및/또는 M2 유형 대식세포 수에 대해 평가된다.
또 다른 예에서, 평가된 염증성 및/또는 항염증성 마커는 사이토카인이다.
일례에서, 염증성 마커는 TNF-알파, IL-17 및/또는 IL-6이다.
일례에서, 항염증성 마커는 IL-10이다.
TNF-알파, IL-17 및/또는 IL-6 수치가 감소하거나 IL-10 수치가 증가하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있는 다양한 검정이 당해 분야의 당업자에게 이용 가능하다. 일례에서, TNF-알파, IL-17, IL-10 및/또는 IL-6 농도 수치는 분광광도법 기법, 예컨대 임뮬리트(Immulite) 화학발광 면역측정 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 또 다른 예에서, TNF-알파, IL-17, IL-10 및/또는 IL-6 농도 수치는 상업적으로 구입 가능한 키트(Millipore)를 사용하여 루미넥스(Luminex) 플랫폼을 이용하여 측정될 수 있다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 세포 조성물의 투여는 대식세포에 의한 TNF-알파 및/또는 IL-6의 방출을 저해할 것이다. 대식세포로부터의 TNF-알파 및/또는 IL-6 방출이 감소하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 당해 분야의 당업자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 대식세포는 시험관내 배양되고 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 조성물 또는 적합한 대조군에 노출될 수 있다. 일정 기간 후, TNF-알파 및/또는 IL-6 방출은 이후 상기 예시된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 세포 조성물에 노출된 세포에서의 TNF-알파 및/또는 IL-6 수치는 이후 TNF-알파 및/또는 IL-6 수치가 감소하는지를 결정하기 위해 대조군 세포에서의 TNF-알파 및/또는 IL-6 수치와 비교될 수 있다.
대식세포에 대한 분극의 2개의 명확한 상태가 정의된다: 전통적으로 활성화된 (M1) 대식세포 표현형 또는 "M1 유형 대식세포" 및 대안적으로 활성화된 (M2) 대식세포 표현형 또는 M2 유형 대식세포"(Gordon and Taylor., Nat. Rev. Immunol. 5: 953-964, 2005; Mantovani et al., Trends Immunol. 23: 549-555, 2002). M1 유형 대식세포는 "전염증성" 사이토카인 프로필(예를 들어, TNF-알파, IL-6, IL-1-베타, IL-12, IL-23)을 가진다. 반면에, M2 유형 대식세포는 "항염증성" 사이토카인 프로필(예를 들어, IL-10)을 가진다. 일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 세포 조성물의 투여는 M1 유형 대식세포에 의한 사이토카인의 방출을 저해할 것이라는 것이 고안된다. 또 다른 예에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 세포 조성물의 투여는 M1 유형 대식세포에 의한 TNF-알파 및/또는 IL-6의 방출을 저해할 것이라는 것이 고안된다. M1 유형 대식세포에 의한 TNF-알파, IL-6 및/또는 다른 사이토카인 방출이 감소하는지를 결정할 수 있는 다양한 검정이 당해 분야의 당업자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 상기 기재된 실험관내 검정에서 M1 유형 대식세포를 사용한다. 이 예에서, CD14+ 단핵구는 전혈 샘플로부터 면역선택에 의해 정제될 수 있다.
항염증성 세포 생성 및/또는 기능의 증가
일례에서, 본 개시내용은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 투여함으로써 대상체에서 항염증성 세포의 생성 및/또는 기능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
용어 "항염증성 세포"는 본 개시내용의 맥락에서 대상체에서 항염증성 반응을 발생시키거나 매개하는 세포를 의미하도록 사용된다. "항염증성 세포"는 항염증성 반응을 지시하도록 세포 집단 또는 표적에 직접적으로 작용할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용에 의해 포함된 항염증성 세포는 항염증성 반응을 지시하도록 특정한 세포 집단 또는 표적에 작용하는 사이토카인과 같은 인자를 발현하거나 분비할 수 있다.
항염증성 세포의 예는 Th2 세포, Treg 세포 및 M2 유형 대식세포를 포함한다.
일례에서, 본 개시내용은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 투여함으로써 대상체에서 Th2 세포, Treg 및/또는 M2 유형 대식세포의 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
일례에서, 본 개시내용은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 투여함으로써 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
일례에서, 본 개시내용의 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%까지 증가시킨다.
일례에서, 본 개시내용의 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 약 10%까지 증가시킨다.
일례에서, 본 개시내용의 방법은 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%까지 증가시킨다.
당해 분야의 당업자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 대상체 전체 단핵구 집단에 대해 M2-대식세포의 %를 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, M2-대식세포는 CD14 및 CD16, 및 다른 마커, 예컨대 CD163 및 CD206의 이의 발현에 기초하여 확인될 수 있다.
이 예에서, 전혈 샘플은 대상체로부터 얻어질 수 있고, 세포는 CD14의 이의 발현에 기초하여 FACS를 통해 면역선택될 수 있다. CD14+ 세포는 이후 CD16, CD163 및 CD206의 발현에 대해 평가될 수 있다. CD14+CD16+CD163+CD206+의 집단은 샘플에서 전체 CD14+ 세포 집단에 대해 계산될 수 있다.
일례에서, 대상체에서의 항염증성 세포의 생성 및/또는 기능의 증가는
- 대상체에서의 IL-6 수치의 감소;
- 대상체에서의 TNF-알파 수치의 감소; 및/또는
- 대상체에서의 IL-10의 증가를 발생시킨다.
또 다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 또 다른 예에서, 상기 방법은 대식세포의 분극을 M1로부터 M2 표현형으로 촉진시킨다.
예를 들어, 본 개시내용은 하기의 분극을 필요로 하는 대상체에서 M2 유형 대식세포로의 M1 유형 대식세포의 분극을 촉진시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 적어도 0.1㎍/106개의 세포의 양으로 안지오포이에틴-1(Ang1)을 발현한다.
이 예에서, CD14+CD16+ 세포, CD14++CD16+ 세포, CD14+CD16+CD163+ 세포, CD14++CD16+CD163+ 세포, CD14+CD16+CD206+ 세포, CD14++CD16+CD206+ 세포, CD14+CD16+CD163+CD206+ 세포, CD14++CD16+CD163+CD206+ 세포, CD14+CD163+ 세포, CD14++CD163+ 세포, CD14+CD206+ 세포, CD14++CD206+ 세포, CD14+CD163+206+ 세포, CD14++CD163+CD206+ 세포의 생성 또는 수의 증가, IL-6 수치의 감소, TNF-알파 수치의 감소 및/또는 IL-10 수치의 증가는 M2 유형 대식세포로의 M1 유형 대식세포의 분극이 촉진된다는 것을 나타낼 수 있다.
반대로, 또 다른 예에서, 본 개시내용은 M1 유형 대식세포로의 M2 유형 대식세포의 분극을 저해하는 방법을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 M1 유형 대식세포 생성 및/또는 기능의 저해를 필요로 하는 대상체에서 M1 유형 대식세포 생성 및/또는 기능을 저해하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 유전자 비변형 줄기 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 유전자 비변형 줄기 세포는 증가한 수치의 안지오포이에틴-1(Ang1)을 발현한다.
치료 방법
본 개시내용은 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "염증성 질환"은 소양증, 피부 염증, 건선, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 전신 홍반 루푸스, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, I형 또는 II형 당뇨병, 당뇨병성 신병증, 천식, 염증성 폐 손상, 염증성 간 손상, 염증성 사구체 손상, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 자극성 접촉 피부염, 지루성 피부염, 쇼그렌 증후군, 각결막염, 포도막염, 염증성 장 질환, 크론씨병, 궤양성 대장염, 관절, 피부 또는 근육의 염증성 질환, 급성 또는 만성 특발성 염증성 관절염, 근염, 탈수초성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환, 간질성 폐 질환, 간질성 신염 및 만성 활성 간염(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 질환을 포함하도록 취해져야 한다.
일례에서, 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 염증성 질환은 당뇨병이다. 또 다른 예에서, 염증성 질환은 당뇨병의 연관 병태 또는 증상이다. 이 예에서, 치료될 수 있는 증상은 비정상 상처 치유, 심장마비를 가지는 것과 관련된 증상, 예컨대 가슴 통증, 뇌졸중을 가지는 것과 관련된 증상, 말초 혈관 질환, 절단, 신장 질환, 신부전, 실명, 신경병증, 염증, 무기력 또는 비알콜성 지방간염(NASH)을 포함한다.
예를 들어, 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 염증성 질환은 류마티스성 관절염이다.
예를 들어, 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 염증성 질환은 당뇨병성 망막병증이다.
일례에서, 본 개시내용은 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일례에서, 본 개시내용은 제2형 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일례에서, 본 개시내용은 당뇨병성 신병증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일례에서, 본 개시내용은 류마티스성 관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "치료한다" 또는 "치료" 또는 "치료하는"은 치료학적 유효량의 세포를 투여하는 것을 의미하도록 이해되어야 한다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "치료학적 유효량의 세포"는 염증성 질환 또는 장애를 예방하거나 경감시키거나 치료하기에 효과적인 세포의 양을 의미한다. 이러한 유효량은 일반적으로 염증성 질환 또는 장애의 징후, 증상 및/또는 다른 표시자를 개선시킬 것이다. 예를 들어, 당뇨병에서, 유효량의 세포는 HbA1c 값의 감소, 사이토카인, 예컨대 IL-6 및/또는 TNF-α 수치의 감소, 공복 인슐린의 감소 및/또는 아디포넥틴 수치의 증가를 발생시킬 수 있다.
예를 들어, 류마티스성 관절염에서, 유효량의 세포는 ACR20, ACR 50 및/또는 ACR70의 달성, 사이토카인, 예컨대 IL-6 수치의 감소 및/또는 질환 활성 점수의 감소를 발생시킬 수 있다.
예를 들어, 당뇨병성 신병증에서, 유효량의 세포는 eGFR 또는 mGFR의 감소의 저해, eGFR 또는 mGFR의 개선 및/또는 사이토카인, 예컨대 IL-6의 수치의 감소를 발생시킬 수 있다.
당뇨병 또는 이의 연관 병태 또는 증상의 맥락에서, HbA1c 값의 감소, 공복 인슐린의 감소 및/또는 아디포넥틴 수치의 증가를 결정하기 위해 사용될 수 있는 다양한 일상적인 임상 검정이 당해 분야의 당업자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 혈액 샘플은 일반적으로 대상체로부터 얻어지고 이후 HbA1c, 인슐린 및 아디포넥틴 수치를 검출하기 위해 면역검정으로 처리될 것이다.
세포 배양 방법
실시형태에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 제조하는 방법은 세포 배양 배지에서 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하고, 세포 배양 배지는 속효성 L-아스코르브산 유도체를 함유하지만, 실질적인 양의 지효성 L-아스코르브산 유도체를 함유하지 않고/않거나, 10% v/v 미만의 소 태아 혈청이 보충된다.
용어 "배지" 또는 "배지들"은, 세포 배양의 언급에서 사용되는 바대로, 세포를 둘러싸는 환경의 성분을 포함한다. 배지가 Ang1 발현의 발현을 유도하기에 충분한 조건에 기여하고/하거나 이를 제공하는 것으로 고안된다. 배지는 고체, 액체, 가스 또는 상 및 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 성장 배지, 및 세포 성장을 지속시키지 않는 액체 배지를 함유할 수 있다. 배지는 또한 젤라틴성 배지 예컨대 한천, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 예시적인 가스 배지는 페트리 접시에서 성장하는 세포 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체가 노출되는 가스 상을 포함한다. 용어 "배지"는 또한 이것이 세포와 아직 접촉하지 않더라도 세포 배양에서 사용되도록 의도되는 물질을 의미한다.
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 제조하는 방법에서 사용된 배양 배지는 기준 배양 배지로서 줄기 세포의 배양에 사용된 배양 배지를 사용함으로써 제조될 수 있다. 기준 배양 배지는 예를 들어 이글 최소 필수(Eagle minimal essential: MEM) 배양 배지, 알파 변형된 MEM 배양 배지, 및 이들의 혼합 배양 배지를 포함하고, 이것이 줄기 세포의 배양에 사용될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
추가로, 배양 배지는 임의의 성분, 예컨대 지방산 또는 지질, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 완충제, 무기염 등을 함유할 수 있다.
세포 배양 배지는 또한 모든 필수 아미노산을 함유할 수 있고, 비필수 아미노산을 또한 함유할 수 있다. 일반적으로, 아미노산은 필수 아미노산(Thr, Met, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Lys, His) 및 비필수 아미노산(Gly, Ala, Ser, Cys, Gln, Asn, Asp, Tyr, Arg, Pro)으로 분류된다.
아스코르브산은 배양에서 다양한 종류의 세포의 성장 및 분화를 위한 필수 보충제이다. 특정한 아스코르브산 유도체는 특히 중성 pH 및 37℃의 일반 세포 배양 조건 하에 용액 중에 안정하지 않으므로 "속효성"인 것으로 이제 이해된다. 이 속효성 유도체는 옥살산 또는 트레온산으로 신속히 산화된다. 37℃에서의 배양 배지(pH 7)에서, 산화는 이 속효성 아스코르브산 유도체의 수치를 24시간에 대략 80 - 90%로 감소시킨다. 따라서, 속효성 아스코르브산 유도체는 다양한 세포 유형의 관습적인 세포 배양에서 더 안정한 "지효성" 아스코르브산 유도체로 대체된다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "속효성"은 중성 pH 및 37℃의 배양 조건 하에 세포 배양의 24시간 후 대략 80% 내지 90%로 산화되는 아스코르브산 유도체를 포함한다. 일례에서, 속효성 L-아스코르브산 유도체는 L-아스코르브산 염이다. 예를 들어, 본 개시내용의 맥락에서, L-아스코르브산 나트륨염은 "속효성" 아스코르브산 유도체이다.
반대로, 용어 "지효성"은 중성 pH 및 37℃의 배양 조건 하에 세포 배양의 24시간 후 대략 80% 내지 90%로 산화되지 않는 아스코르브산 유도체를 포함한다. 일례에서, 본 개시내용의 맥락에서, L-아스코르브산-2-포스페이트는 "지효성" 아스코르브산 유도체이다. 지효성 아스코르브산 유도체의 다른 예는 테트라헥실데실 아스코르베이트 마그네슘 아스코르빌 포스페이트 및 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산을 포함한다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 제조하는 방법에서 사용된 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체이 보충된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.005g/ℓ의 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.01g/ℓ의 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.02g/ℓ의 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.03g/ℓ의 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.04g/ℓ의 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.05g/ℓ의 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.06g/ℓ의 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있다. 이 실시형태의 일례에서, 세포 배양 배지는 L-아스코르베이트의 나트륨염이 보충된다.
또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체를 함유하지만, 실질적인 양의 지효성 아스코르브산 유도체를 함유하지 않는다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있지만, 0.04g/ℓ 초과의 지효성 아스코르브산 유도체가 아니다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있지만, 0.03g/ℓ 초과의 지효성 아스코르브산 유도체가 아니다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있지만, 0.02g/ℓ 초과의 지효성 아스코르브산 유도체가 아니다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있지만, 0.01g/ℓ 초과의 지효성 아스코르브산 유도체가 아니다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있지만, 0.005g/ℓ 초과의 지효성 아스코르브산 유도체가 아니다. 또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 속효성 아스코르브산 유도체를 함유할 수 있지만, 지효성 아스코르브산 유도체가 아니다.
또 다른 예에서, 세포 배양 배지는 L-아스코르베이트 나트륨염을 함유하지만, 실질적인 양의 L-아스코르브산-2-포스페이트를 함유하지 않는다.
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 제조하는 방법에서 사용된 세포 배양 배지는 혈청 함유 배양 배지 또는 혈청 비함유 배양 배지일 수 있다.
배양 배지는 혈청 대체물을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들어 알부민(예를 들어, 지질 농후 알부민), 트랜스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'-티올 글리세롤, 또는 혈청 등가물을 적절하게 함유하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어 국제 공보 WO 93/30679에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있고, 상업적으로 이용 가능한 생성물을 또한 사용할 수 있다.
일례에서, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 제조하는 방법에서 사용된 세포 배양 배지는 적어도 약 9% v/v, 적어도 약 8% v/v, 적어도 약 7% v/v, 적어도 약 6% v/v, 적어도 약 5% v/v, 적어도 약 4% v/v, 적어도 약 3% v/v, 적어도 약 2% v/v, 적어도 약 1% v/v의 FCS가 보충된다. 용어 소 태아 혈청(FCS) 및 소 태아 혈청(FBS)이 본 개시내용의 맥락에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 것으로 또한 고안된다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 비태아 혈청이 보충된다. 배양 배지가 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%(v/v)의 비태아 혈청이 보충될 수 있는 것으로 고안된다.
예를 들어, 배양 배지는 포유류 비태아 혈청이 보충될 수 있다.
예를 들어, 배양 배지는 인간 비태아 혈청이 보충될 수 있다.
예를 들어, 배양 배지는 신생아 혈청이 보충될 수 있다. 배양 배지가 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%(v/v)의 신생아 혈청이 보충될 수 있는 것으로 고안된다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 포유류 신생아 혈청이 보충된다.
예를 들어, 배양 배지는 신생 소 혈청(NBCS)이 보충될 수 있다. 배양 배지가 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%(v/v)의 NBCS가 보충될 수 있는 것으로 고안된다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 인간 신생아 혈청이 보충된다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%(v/v)의 인간 신생아 혈청이 보충될 수 있다. 예를 들어, 인간 신생아 혈청은 제대혈 "제대혈"로부터 얻어진다.
일 실시형태에서, 배양 배지는 성인 혈청이 보충된다. 배양 배지는 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%(v/v)의 성인 혈청이 보충될 수 있는 것으로 고안된다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 포유류 성인 혈청이 보충된다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%(v/v)의 포유류 성인 혈청이 보충될 수 있다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%(v/v)의 성인 소 혈청이 보충될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 인간 성인 혈청이 보충된다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%(v/v)의 인간 성인 혈청이 보충될 수 있다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%(v/v)의 인간 AB 혈청이 보충될 수 있다.
예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 3%의 인간 AB 혈청이 보충된다.
일 실시형태에서, 배양 배지는 FCS와 NBCS의 혼합물이 보충된다.
예를 들어, 배양 배지는, FCS:NBCS 비율이 적어도 약 0.4:1, 적어도 약 0.5:1, 적어도 약 0.6:1, 적어도 약 0.7:1, 적어도 약 0.8:1, 적어도 약 0.9:1, 적어도 약 1:1, 적어도 약 1.5:1, 적어도 약 2:1이도록 FCS와 NBCS의 혼합물이 보충될 수 있다.
예를 들어, FCS와 NBCS의 혼합물이 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25%(v/v)의 세포 배양 배지를 포함할 수 있는 것이 고안된다. 그러나, 이 예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 1%(v/v), 적어도 약 2%(v/v), 적어도 약 3%(v/v), 적어도 약 4%(v/v), 적어도 약 5%(v/v), 적어도 약 6%(v/v), 적어도 약 7%(v/v), 적어도 약 8%(v/v), 적어도 약 9%(v/v), 그러나 10%(v/v) 미만의 FCS가 보충된다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 FCS 혈청 비함유이다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 태아 혈청 비함유이다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 비태아 혈청이 보충된다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 태아 혈청 비함유이고, 비태아 혈청이 보충된다.
또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 1α,25-다이하이이드록시비타민 D3(1,25D), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터류킨-1β(IL-1β) 및 기질 유래 인자 1α(SDF-1α)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 자극 인자가 보충된다. 또 다른 실시형태에서, 세포를 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양으로 적어도 하나의 사이토카인의 존재 하에 또한 배양할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 세포를 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양으로 혈소판 세포 용해물의 존재 하에 배양한다. 예를 들어, 세포를 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양으로 인간 혈소판 세포 용해물 중에 배양할 수 있다.
예에서, 세포를 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양으로 인간 AB 혈청 및 인간 혈소판 세포 용해물과 배양한다.
당해 분야의 당업자는 하기 예시된 방법을 이용하여 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 또한 제조할 수 있다.
세포의 치료학적/예방학적 가능성의 평가
장애를 치료하거나 예방하거나 이의 발생 또는 진행을 지연시키기 위한 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포의 능력을 결정하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 예를 들어, 줄기 세포는 Ang1 수치를 증가시키는 이의 능력에 대해 평가될 수 있다.
일례에서, 적어도 0.1㎍/106개의 세포의 양으로 유전자 비변형 Ang1을 발현하는 줄기 세포를, 시험관내 및/또는 생체내 Ang1 발현을 증가시키는 이의 능력에 대해 시험한다. 이 예에서, 세포 또는 조직은 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포의 투여 후 Ang1의 발현의 전개에 대해 평가된다.
본 개시내용이 장애의 치료, 예방 또는 지연을 위해 세포를 확인하거나 단리하는 방법을 또한 제공한다는 것이 상기로부터 당업자에게 명확할 것이고, 상기 방법은,
(i) 연관된 장애를 겪는 시험 대상체에게 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 투여하고 대상체에서 장애의 증상을 평가하는 단계;
(ii) (i)에서의 대상체의 장애의 증상을, 줄기 세포가 투여되지 않은 장애를 겪는 대조군 대상체의 장애의 증상 또는 활성과 비교하는 단계를 포함하되, 여기서 대조군 대상체와 비교하여 시험 대상체에서의 증상의 개선은 줄기 세포가 장애를 치료한다는 것을 나타낸다. 세포는 임의의 예에 따른 본 명세서에 기재된 임의의 세포일 수 있다.
실시예
실시예 1: STRO-3 + 세포의 선택에 의한 MPC의 면역선택
골수(BM)를 건강한 정상 성인 지원자(20-35세)로부터 수확하였다. 간단히 말하면, 40㎖의 BM을 뒤장골능선(posterior iliac crest)으로부터 리튬-헤파린 항응고제 함유 관으로 흡입시켰다.
골수 단핵 세포(BMMNC)를 이전에 기재된 바대로(Zannettino et al. Blood, 92: 2613-2628, 1998) 림포르렙(Lymphoprep)(상표명)(Nycomed Pharma(노르웨이 오슬로))을 사용하여 밀도 구배 분리에 의해 제조하였다. 4℃에서 30분 동안 400 x g에서 원심분리 후, 버피 층(buffy layer)을 이동 피펫에 의해 제거하고, 5% 소 태아 혈청(FCS, CSL Limited(호주 빅토리아))을 함유하는 행크 균형 염 용액(HBSS; Life Technologies(메릴랜드주 게이터스부르그))으로 이루어진 "HHF" 중에 3회 세척하였다.
STRO-3+(또는 TNAP+) 세포를 후속하여 이전에 기재된 바대로(Gronthos et al., Journal of Cell Science 116: 1827-1835, 2003; Gronthos and Simmons, Blood, 85, 929-940, 1995) 자기 활성화 세포 분류에 의해 단리하였다. 간단히 말하면, 대략 1-3 x 108개의 BMMNC를 20분 동안 얼음에서 HHF 중의 10%(v/v)의 정상 토끼 혈청으로 이루어진 차단 완충제 중에 항온처리하였다. 세포를 1시간 동안 얼음에서 차단 완충제 중의 10㎍/㎖의 STRO-3 mAb의 용액의 200㎕와 항온처리하였다. 세포를 후속하여 400 x g에서 원심분리에 의해 HHF 중에 2회 세척하였다. HHF 완충제 중의 염소 항마우스 g-비오틴(Southern Biotechnology Associates(영국 버밍엄))의 1/50 희석액을 첨가하고, 세포를 1시간 동안 얼음에서 항온처리하였다. 세포를 상기한 바대로 MACS 완충제(1% BSA, 5mM EDTA 및 0.01% 아지드화나트륨이 보충된 Ca2+ - 및 Mn2+ - 무 PBS) 중에 2회 세척하고, 0.9㎖의 MACS 완충제의 최종 용적 중에 재현탁시켰다.
100㎕의 스트렙타비딘 마이크로비드(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach(독일))를 세포 현탁액에 첨가하고, 15분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 세포 현탁액을 2회 세척하고, 0.5㎖의 MACS 완충제 중에 재현탁시키고, 후속하여 미니 MACS 칼럼(MS Columns, Miltenyi Biotec)에 로딩하고, 0.5㎖의 MACS 완충제에 의해 3회 세척하여 STRO-3 mAb에 결합하지 않는 세포를 검색하였다(수탁 번호 PTA-7282 하에 미국 균주 은행(American Type Culture Collection: ATCC)에 의해 2005년 12월 19일에 기탁 - 국제 특허 WO 2006/108229 참조). 추가의 1㎖의 MACS 완충제의 첨가 후, 칼럼을 자석으로부터 제거하고, TNAP+ 세포를 양압에 의해 단리하였다. 각각의 분획으로부터의 세포의 액적을 스트렙타비딘-FITC에 의해 염색하고, 순도를 유세포분석법에 의해 평가할 수 있다.
이러한 방식으로 단리된 MPC는 STRO-1bright MPC이다.
실시예 2: 시작 배양 배지 - 과정 A
이글 알파 MEM이라 흔히 말해지는 이글 균형 염을 가지는 이글 최소 필수 배지(MEM)의 알파 변형은 비필수 아미노산, 피루브산나트륨, 및 추가적인 비타민을 함유한다. 이 변형은 우선 하이브리드 마우스 및 햄스터 세포를 성장시키는 데 있어서의 사용에 대해 기재되어 있다(Stanners et al., Nat New Biol., 230, 52-54, 1971).
1차 줄기 세포를 배양하기에 적합한 이글 알파 MEM 배지는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 및 시그마(Sigma)를 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있다.
예시된 공정에서 사용된 필요한 성장 인자를 포함하여 1차 줄기 세포 배양을 확립하기 위한 상세한 방법은 문헌[Gronthos and Simmons, Blood, 85, 929-940, 1995]에 기재되어 있다.
과정 A에서, 10% 소 태아 혈청, L-아스코르베이트-2-포스페이트(100μM), 덱사메타손(10-7 M) 및/또는 무기 인산 염(3mM)이 보충된 이글 알파 MEM 배지를 줄기 세포를 배양하는 데 사용하였다.
실시예 3: 변형된 배양 배지 - 과정 B
과정 B에서, 과정 A에서 사용된 이글 알파 MEM 배양 배지를 하기에 의해 변형시켰다(변형된 알파 MEM):
- 속효성 아스코르브산 유도체 나트륨 L-아스코르베이트(50㎎/ℓ)에 의한 지효성 아스코르브산 유도체 L-아스코르브산-2-포스페이트의 대체;
- 10%(v/v)로부터 5%(v/v)로의 FCS의 감소;
- 비태아 혈청(5%(v/v))에 의한 보충.
Figure pat00007
실시예 4: 세포 배양
중간엽 전구체 세포(MPC)를 단일 공여자로부터 얻고, 저온보존 후 저장하였다.
일반적인 조건에서, 세포 배양은 하기 단계를 포함한다:
저온보존된 MPC를 해동하고, 10,000개의 세포/㎠로 시딩하고, 시작 배양 배지(과정 A; n=3) 또는 변형된 배양 배지(과정 B; n=3) 중에 20% O2, 37℃에서 90% 포화도(confluence)까지 성장시켰다.
조정 배지를 생성하기 위해, 성장 배지를 200㎕의 배지/㎠의 용적에서 FCS가 보충된 EBM-2 기본 배지(Lonza)에 의해 대체하였다. 세포를 배지가 수집된 후 추가적인 3일 동안 배양하고 원심분리하여 임의의 세포를 제거하고, 생성된 상청액을 수집하고 -80℃에서 저장하였다.
성장 인자 농도를 상업적으로 이용 가능한 키트(Millipore)를 사용하여 루미넥스(Luminex) 플랫폼을 사용하여 측정하였다.
세포 배양 후, MPC 성장 동역학을 평가하였다(도 1 내지 도 3 참조). 세포 성장, MPC 배가 시간 또는 집단 배가 시간의 상당한 변화가 세포 배양 과정 A 및 B 후 관찰되지 않았다.
MPC를 세포 마커 STRO-1, CC9 및 STRO-4, 및 전혈관형성 성장 인자 Ang1 및 VEGF의 이의 발현 수치의 면에서 또한 규명하였다.
STRO-1, CC9 및 STRO-4 수치는 세포 배양 과정 A 및 B 후 MPC에서 필적하였다.
그러나, 배양 과정 B는
- Ang1 수치를 증가시키고;
- VEGF 수치를 감소시키고;
- 혈관화를 증대시키는 데 있어서 특히 효과적인 것으로 이전에 나타난 Ang1:VEGF 비율과 일치하는 Ang1:VEGF의 비율을 제공한다.
과정 A 또는 B에서 배양된 MPC의 조정 배지에서의 Ang1 및 VEGF의 수치(㎍/106개의 세포)의 측정이 표 2에 기재되어 있다.
Figure pat00008
실시예 5: 변형된 배양 조건 - 과정 C 및 D
속효성 아스코르브산 유도체 나트륨 L-아스코르베이트에 의한 지효성 아스코르브산 유도체 L-아스코르브산-2-포스페이트의 대체를 조절하기 위해, 3개의 상이한 공여자로부터의 MPC를 연속하여 알파-MEM + 10%의 FCS + 50㎎/ℓ의 나트륨 L-아스코르베이트(과정 C) 또는 알파-MEM + 3%의 인간 AB 혈청 + 50㎎/ℓ의 나트륨 L-아스코르베이트(과정 D) + 성장 인자, 예컨대 PDGF 및 EGF에서 전파시켰다.
Ang1 및 VEGF 수치를 과정 C 및 D에서의 세포 배양 후 평가하였다. 과정 C 또는 D에서 배양된 MPC의 조정 배지에서의 Ang1 및 VEGF의 수치(㎍/106개 세포)이 표 3에 기재되어 있다.
과정 C와 비교하여, 배양 과정 D는
- Ang1 수치를 증가시키고;
- VEGF 수치를 감소시키고;
- Ang1:VEGF의 비율을 증가시킨다.
과정 A와 비교하여, 과정 C 및 D는 Ang1의 발현 수치를 점진적으로 증가시킨다. 이는 속효성 아스코르브산 유도체 및 비태아 혈청의 존재가 각각 독립적으로 Ang1 발현을 증가시키고 Ang1 발현을 증가시키는 데 있어서 함께 상승 효과를 나타낸다는 것을 제시한다.
Figure pat00009
실시예 6: M2 표현형으로의 전염증성 M1 단핵구의 분극
CD14+ 단핵구를 전혈로부터 면역선택하였다. 단핵구 집단은 CD16 발현에 기초하여 규명되었다. 세포의 5.2%가 M2 유형 대식세포(CD14+CD16+)의 표현형 특성을 발현하였다(도 4).
CD14+ 단핵구를 7일 동안 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 MPC와 동시배양하였다. MPC를 2개의 별개의 도너(#023 및 #009)로부터 얻었다.
동시배양의 3일 후, 세포를
- CD14, CD16 발현; 및
- 리포폴리사카라이드(LPS)에 반응한 TNF-α의 선택에 대해 평가하였다. LPS를 24시간(+ 최종 5시간 동안 수송 저해제) 동안 1ng/㎖ 첨가하였다.
동시배양은
- M2 유형 대식세포(CD14+CD16+ CD163+CD206+)의 표현형 특성을 발현하는 대식세포의 생성(도 4);
- 대식세포에 의한 TNFα의 염증 유래 (LPS) 선택의 방지(도 5)를 발생시켰다.
동시배양의 7일 후, 세포를 LPS에 반응한 IL-10의 분비에 대해 평가하였다. LPS를 24시간(+ 최종 5시간 동안 수송 저해제) 동안 1ng/㎖ 첨가하였다. IL-10 발현을 세포내 유세포분석법에 의해 분석하였다. 대식세포에 의한 IL-10 생성은 LPS의 존재 하의 MPC와의 동시배양에 의해 증대되었다(도 6).
이 데이터는 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 MPC가 M2 유형 대식세포 생성을 촉진시킨다는 것을 나타낸다(도 7).
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를, PGE2의 분비의 이 사이토카인의 효과를 평가하기 위해, 단독으로 또는 TNF-α와의 조합으로 증가하는 수치의 IL-1β와 배양하였다.
PGE2 발현에 대한 IL-1β 및 TNF-α의 상가 효과가 관찰되었다(도 8).
PGE2는 Th2 및 TReg 세포로의 Th17 세포의 분화, 및 M2 유형 대식세포로의 M1 유형 대식세포의 분극을 촉진시킨다(도 7). 상승한 IL-1 및 TNF-α 수치는 염증성 질환, 예컨대 제2형 당뇨병을 가지는 대상체에서 관찰되었다.
따라서, TNFα 및 IL1β에 대해 반응한 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포로부터의 증가한 PGE2 분비는 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포가 염증성 질환을 가지는 대상체에서 항염증성 세포 생성을 증가시킬 수 있다는 것을 제안한다. 특히, 상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포는,
- M2 유형 대식세포로의 M1 유형 대식세포의 분극을 촉진함으로서 M2 유형 대식세포 생성을 증가시키고/시키거나;
- Th17 세포의 분화를 촉진함으로써 Th2 및 Treg 생성을 증가시킬 수 있다.
실시예 7: 콜라겐 유도 관절염의 양 모델
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 류마티스성 관절염의 양 모델에서 투여하였다(Thorpe et al. Clinical & Exp. Rheumatology, 10:143-150 (1992)). 모델은 류마티스성 관절염의 전신 및 관절 염증성 징후 둘 다를 특징으로 한다.
15000만개의 저온보존된 양 MPC를 경정맥을 통해 정맥내로 투여하였다.
IL-17 및 IL-10 수치를 주에 걸쳐 평가하였다. 전염증성 및 항염증성 사이토카인의 수치의 변화가 (도 9)에 도시되어 있다.
상승한 수치의 Ang1을 발현하는 줄기 세포를 늦은 질환의 확립 시(42일) 또한 투여하였다. 줄기 세포의 투여는 관절에서의 염증성 사이토카인의 수치를 감소시켰다(도 10).
실시예 8: 당뇨병에서의 줄기 세포 투여
3회 용량의 중간엽 전구체 세포(MPC)의 단일 정맥내 점적주사를 메트폴민 또는 메트폴민과 또 다른 경구제에 의해 부적절하게 조절되는 제2형 당뇨병을 가지는 위약 대조군 주사된 인간 대상체와 비교하였다. 기준치 HbA1c, IL-6, TNF-알파, 공복 인슐린, 아디포넥틴, 오스테오칼신 및 hsCRP의 변화를 12주에 걸쳐 평가하였다.
대상체를 3개의 코호트로 분리하였다(도 11):
코호트 1: MPC 용량 1(30만개의 세포/㎏)[n=15] 또는 위약[n=5]
코호트 2: MPC 용량 1(100만개의 세포/㎏)[n=15] 또는 위약[n=5]
코호트 3: MPC 용량 1(200만개의 세포/㎏)[n=15] 또는 위약[n=5].
MPC 치료된 대상체에서 HbA1c의 약간의 감소가 위약 대조군 대상체의 약간의 증가와 비교하여 관찰되었다(표 4). 8주에 위약에 비해 코호트 2에서 더 높은 HbA1c 감소가 관찰되었다(표 4). 더 높은 HbA1c 감소에 대한 경향은 기준치 HbA1c 값≥8%를 가지는 대상체에서 관찰되었다(도 15). 45명 중 8명(17.8%)의 대상체가 12주에 표적 HbA1c(<7.0%)를 달성하였다(도 16).
MPC 치료된 대상체에서 공복 인슐린 및 아디포넥틴 수치의 개선에 대한 경향(도 12)이 위약 대조군 대상체와 비교하여 관찰되었다. 위약 대조군 대상체와 비교하여 MPC 치료된 대상체에서 TNF-알파 및 IL-6 수치가 감소하였고, 가장 상당한 감소는 코호트 3에서 관찰되었다(도 13). 코호트 3에서, 기준치로부터의 TNF-알파(도 13) 및 IL-6(도 14)의 변화는 각각 -0.26pg/㎖ 및 -0.47pg/㎖이었다(도 13).
Figure pat00010
실시예 9: 류마티스성 관절염에서의 줄기 세포 투여
2회 용량의 중간엽 전구체 세포(MPC)의 단일 정맥내 점적주사를 불완전 항-TNFα 반응자 또는 2회 이하의 추가적인 생물치료제에 실패한 대상체로서 분류되는 류마티스성 관절염을 가지는 위약 대조군 주사된 인간 대상체와 비교하였다.
실험에 포함된 48명의 대상체는 +RF/항-CCP; > 4 부종/압통 관절; ESR/CRP > ULN이었다.
대상체를 2개의 코호트로 분리하였다:
코호트 1: MPC 용량(100만개의 세포/㎏)[n=16] 또는 위약[n=8]
코호트 2: MPC 용량(200만개의 세포/㎏)[n=16] 또는 위약[n=8]
점적주사 3개월 후 평가된 종점은 하기를 포함하였다:
- TNFα; IL-6(도 17), IL-17; RANKL; MMP-1,3,9; TIMP-1, 2, 4 및 오스테오칼신 수치. 수치를 또한 0주, 1주, 2주, 4주, 6주, 8주 및 10주에 평가하였다;
- ACR 20(도 18)/50(도 19)/70(도 20);
- ACR 코어 세트(도 21; 도 22);
- 관해(질환 활성 점수(DAS28(CRP)) < 2.6)(도 23);
- 기준치로부터의 질환 활성 점수(DAS28)의 변화; ESR/CRP;HAQ-DI(도 24); SF-36(관해 DAS28(CRP) < 2.6); 반응 DAS28(CRP) < 3.2; 도 23);
- 6개월 및 12개월에 손/손목 x선.
코호트 1과 연관된 치료 관련된 심각한 부작용(SAE)이 없었다. 초기 및 지속적인 효율이 3개월에 걸쳐 관찰되었다.
IL-6 수치는 1-12주에 걸쳐 위약과 비교하여 코호트 1에서 기준치로부터 감소하였다(도 17).
데이터는 다른 생물치료제보다 높을 수 있는 약 20%의 잠재적인 관해 속도의 제안을 제시한다(도 23).
코호트 1에 대한 12주 1차 종점은 위약에 비해 개선된 반응의 일관된 경향을 나타냈다.
추적관찰 중간 분석은 시간에 따른 반응자에서의 효과의 지속성을 입증한다.
코호트 2는 더 높은 단일 용량의 시험을 겪었다.
실시예 10: 당뇨병성 신병증에서의 줄기 세포 투여
2회 용량의 중간엽 전구체 세포(MPC)의 단일 정맥내 점적주사를 ACEi의 안정한 섭생 또는 당뇨병성 신병증에 대한 ARB 치료에 대한 제2형 당뇨병 및 중등도 내지 중증의 만성 신장 질환을 가지는 위약 대조군 주사된 인간 대상체와 비교하였다.
대상체를 2개의 코호트로 분리하였다:
코호트 1: MPC 용량 1(15000만개의 세포)[n=10] 또는 위약[n=5]
코호트 2: MPC 용량 1(30000만개의 세포)[n=10] 또는 위약[n=5]
점적주사 3개월 및 6개월 후 평가된 종점:
- 측정된 GFR(mGFR [99Tc DTPA])(도 25), 예상된 GFR(eGFR [MDRD])(도 25), IL-6(도 26); 및 혈청 크레아티닌 수치;
- IL-6과 혈청 크레아티닌 수치 사이의 상관관계(도 27).
초기 24주 연구 기간 동안, 위약에 비해 MPC 치료된 대상체에서의 측정된 및 예상된 GFR 둘 다에 의한 신장 기능의 보존 또는 개선의 경향이 관찰되었다:
- 치료 효과는 MPC 용량 둘 다와 유사하였다;
- MPC에 의한 더 뚜렷한 치료 효과가 기준치 eGFR > 30㎖/분/1.73㎡을 가지는 대상체에서 있었다(도 28);
- 평균 초과의 기준치 IL-6 수치를 가지는 대상체에서 MPC에 의한 더 뚜렷한 MPC 치료 효과;
- 기준치 IL-6 수치와 혈청 크레아티닌의 MPC 관련 개선 사이의 상당한 상관관계(도 27);
- 위약에 비해 MPC 그룹에서 12주에 혈청 IL-6 수치의 용량 의존적 변화가 있었다(도 26).
광범위하게 기재되면서, 본 개시내용의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 구체적인 실시형태에 기재된 바대로, 본 개시내용에 다양한 변경 및/또는 변형이 이루어질 수 있는 것으로 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 실시형태는 따라서 모든 관점에서 예시적이고 제한이 아닌 것으로 고려되어야 한다.
본원은 2014년 6월 10일에 출원된 AU 2014902194 및 2014년 6월 13일에 출원된 AU 2014902257(이의 개시내용은 본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)로부터의 우선권을 주장한다.
본 명세서에 기재되고/되거나 언급된 모든 공보는 본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
본 명세서에 포함된 문헌, 법률, 자료, 장치, 논문 등의 임의의 토의는 오직 본 개시내용의 상황을 제공할 목적이다. 임의의 또는 모든 이들 자료가 선행 기술 기본의 일부를 형성하거나, 본원의 각각의 청구항의 우선일 전에 존재하면서 본 개시내용과 관련한 분야에서 보통의 일반 지식인 것으로 취해져서는 안 된다.

Claims (26)

  1. 대상체에서 염증성 질환을 치료하기 위한 유전자 비변형 줄기세포(genetically unmodified stem cell)를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 유전자 비변형 줄기세포는 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1: Ang1) 및 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)를 2:1 내지 30:1의 비율([Ang1:VEGF])로 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 대상체에서 항염증성 세포의 생성 및/또는 기능을 증가시키는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Th2 세포, TReg 세포 또는 M2 유형 대식세포의 생성 및/또는 기능을 증가시키는 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 증가시키는 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은:
    - 상기 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 적어도 10%까지 증가;
    - 상기 대식세포의 분극을 M1로부터 M2 표현형으로 촉진;
    - Th2 또는 TReg 세포로의 전염증성(pro-inflammatory) T 헬퍼세포의 분화를 촉진;
    - 상기 대상체에서 항염증성 사이토카인의 수치를 증가;
    - 상기 대상체에서 IL-10의 수치를 증가;
    - 상기 대상체에서 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 수치를 감소;
    - 상기 대상체에서 IL-6, TNF-알파 및/또는 IL-17 중 어느 하나의 수치를 감소;
    - 상기 대상체에서 전염증성 세포의 생성 및/또는 기능을 저해; 또는
    - 상기 대상체에서 Th17 세포 또는 M1 유형 대식세포의 생성 및/또는 기능을 저해하는 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 상기 대상체에서 M2 유형 대식세포의 수를 전체 단핵구 집단의 20% 내지 80%로 증가시키는 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    - 상기 M2 유형 대식세포는 CD14++CD16+이고; 또는
    - 상기 전염증성(pro-inflammatory) T 헬퍼세포는 Th17 세포인 약학 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 대상체에서 항염증성 세포의 생성 및/또는 기능 증가는
    - 상기 대상체에서 IL-6 수치를 감소;
    - 상기 대상체에서 TNF-알파 수치를 감소; 및/또는
    - 상기 대상체에서 IL-10 수치를 증가시키는 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유전자 비변형 줄기세포는:
    - 적어도 0.5㎍/106 cells의 양의 Ang1;
    - 0.05㎍/106cells 미만의 양의 VEGF; 또는
    - 적어도 20:1 비율의 Ang1:VEGF를 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 유전자 비변형 중기세포는 Ang1을 적어도 0.7㎍/106 cells의 양으로 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 유전자 비변형 줄기세포는 중간엽 전구체세포(mesenchymal precursor cells)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 유전자 비변형 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 당뇨병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 당뇨병성 신병증인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 1억 5천만 개의 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상체의 ㎏당 0.1x106개 내지 3x106개의 줄기세포를 포함하는 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 대상체의 kg당 0.3x106개 내지 2x106개의 줄기세포를 포함하는 약학 조성물.
  20. 제13항, 제14항, 또는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 하기 중 어느 하나는 당뇨병 또는 제2형 당뇨병이 상기 대상체에서 치료되었다는 것을 나타내고:
    - HbA1c 값의 감소(전체 헤모글로빈의 %);
    - 공복 인슐린 수치의 감소;
    - IL-6 수치의 감소;
    - TNF-α 수치의 감소; 및/또는
    - 아디포넥틴(adiponectin) 수치의 증가;
    - 하기 중 어느 하나는 상기 류마티스성 관절염이 치료되었다는 것을 나타내고:
    - ACR20;
    - ACR50;
    - ACR70; 및/또는
    - 질환 활성 점수의 감소;
    - 하기 중 어느 하나는 상기 당뇨병성 신병증이 치료되었다는 것을 나타내는 약학 조성물:
    - eGFR 및/또는 mGFR의 감소의 저해; 및/또는
    - eGFR 및/또는 mGFR의 개선.
  21. 제1항에 있어서,
    - 상기 대상체는
    - 메트폴민(metformin)에 의해 부적절하게 조절되는 글루코스 수치;
    - 7.5% 초과의 기준치(baseline) HbA1c 값; 및/또는,
    - 상기 대상체 기준치(baseline) eGFR은
    - 약 25㎖/분/1.73㎡ 초과인 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 대상체는 8% 이상의 기준선 HbA1c 값을 갖는 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 대상체의 기준선 eGFR은 28㎖/분/1.73m2 내지 35㎖/분/1.73m2 인 약학 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 전신 또는 정맥 내 투여용으로 제형화된 약학 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 다회 복용량(multiple doses)에 걸친 투여용으로 제형화된 약학 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 상기 유전자 비변형 줄기세포는 Ang1 및 VEGF를 5:1 내지 20:1의 비율([Ang1:VEGF])로 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

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