KR20230025062A - Long-acting injectable suspension of crystalline montelukast and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 결정형 몬테루카스트를 포함하는 지속성 현탁 주사제 및 이의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a long-acting suspension injection containing crystalline montelukast and a method for preparing the same.
알츠하이머병은 신경계 퇴화 (neurodegeneration)로 인해 발생하는 질병이며, 점진적으로 인지능력의 저하와 독립적인 일상생활 능력의 상실이 나타난다. 한 연구결과에 따르면 2010년에 치매환자는 약 3,560만 명에 달하며 이 수치는 매 20년마다 두 배 가까이 상승하여 2030년엔 6,570만명, 2050년엔 1억 1,154만명에 도달할 것으로 예상된다고 한다.Alzheimer's disease is a disease that occurs due to neurodegeneration, and gradually causes cognitive decline and loss of independent daily living skills. According to one study, there were about 35.6 million people with dementia in 2010, and this number is expected to double every 20 years, reaching 65.7 million in 2030 and 111.54 million in 2050.
알츠하이머병의 원인으로는 몇 가지가 꼽히는데, 1) 아밀로이드 연쇄작용과 타우 단백질 합성, 2) 신경세포 사망, 3) 신경 염증 반응, 4)신경 재생, 5) 뇌혈관 장벽 (Blood brain barrier, BBB)의 기능장애 문제 등이 있다. 현재 각 요인에 대한 해결방안이 여러 가지 논의되고 있으나, 이 중 몬테루카스트를 이용해 신경 염증 반응 감소 및 뇌혈관 장벽의 기능장애를 해결하고자 한 연구가 임상실험을 통해 효과가 있음이 확인이 되고 있다.Several causes of Alzheimer's disease are listed: 1) amyloid cascade and tau protein synthesis, 2) neuronal cell death, 3) neuroinflammatory response, 4) nerve regeneration, 5) Blood brain barrier (BBB) ) and dysfunctional problems. Currently, various solutions for each factor are being discussed, but among them, studies using montelukast to reduce neuroinflammatory responses and address dysfunction of the blood-brain barrier have been confirmed to be effective through clinical trials.
몬테루카스트는 cysteinyl leukotriene 수용체에 선택적 길항제로 결합하여 천식과 알레르기성 비염에 효과적인 약물이다. 최근 몬테루카스트는 천식과 알레르기성 비염 뿐 만 아니라 알츠하이머 치매 등 다양한 뇌신경 질환에 효과적인 것으로 보고되어 있다. 동물 모델에서 그 효능이 입증된 후 현재 뇌질환 치료제로의 개발을 위한 임상 시험이 진행되고 있다. Montelukast binds to the cysteinyl leukotriene receptor as a selective antagonist and is effective for asthma and allergic rhinitis. Recently, montelukast has been reported to be effective not only for asthma and allergic rhinitis, but also for various cranial nerve diseases such as Alzheimer's disease. After its efficacy was demonstrated in animal models, clinical trials for development as a treatment for brain diseases are currently underway.
몬테루카스트는 그 자체로는 지용성이 매우 높고 용해도가 낮아 경구 복용 시 낮은 생체이용률을 보인다. 이를 해결하기 위해 용출 속도 (dissolution rate)가 빠른 무정형 (amorphous) 상태의 몬테루카스트 나트륨염 (Montelukast sodium)을 이용하여 경구 제형 (정제, 추정 및 과립 제형 등)을 설계, 투약하게 된다. 이 경우 3 내지 4시간만에 최고혈중농도 (Cmax)에 도달하고 이후 약 2.7 ~ 5.5 시간 정도의 반감기를 나타내며 소실되고 된다. 이러한 경구 요법은 통상 1일 1회 투여가 이루어지게 된다.Montelukast itself has very high fat solubility and low solubility, resulting in low bioavailability when taken orally. To solve this problem, oral formulations (tablets, tablets and granular formulations, etc.) are designed and administered using Montelukast sodium in an amorphous state with a fast dissolution rate. In this case, the maximum blood concentration (Cmax) is reached in 3 to 4 hours, and then disappears with a half-life of about 2.7 to 5.5 hours. Such oral therapy is usually administered once a day.
하지만 알츠하이머병 등과 같은 만성의 뇌신경질환의 경우 몬테루카스트의 1일 1회 투여의 경구 요법이 환자의 복약순응도가 낮은 문제가 있다. 실제, 만성 정신질환 환자에게 있어 경구로의 잦은 약물 투여는 환자의 복약 순응도를 감소시키고, 이로 인한 병원으로의 재방문은 정신질환 치료에 있어 큰 난관이 된다. However, in the case of chronic cranial nerve diseases such as Alzheimer's disease, oral therapy of montelukast administered once a day has a problem of low patient compliance. In fact, in patients with chronic mental illness, frequent oral drug administration reduces the patient's medication compliance, and thus revisiting the hospital becomes a major obstacle in the treatment of mental illness.
그러나 제제를 지속성 주사제제로 설계할 경우, 단회 투여 후 1주 이상의 기간 동안 혈중농도를 유지, 지속적으로 약효를 제공함으로서 경구 용법에 비해 앞서 설명한 환자의 불편함이 감소하며, 경제적인 관점에서도 큰 이점이 있어, 최근 이러한 만성 질환에 대해 나노 결정화 기술을 활용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.However, when the formulation is designed as a long-acting injection formulation, the patient's discomfort as described above is reduced compared to oral administration by maintaining the blood concentration for a period of one week or longer after single administration and continuously providing the medicinal effect, and there is a great advantage from an economic point of view. In recent years, studies to utilize nano-crystallization technology for these chronic diseases have been actively conducted.
본 발명의 목적은 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast; MTK) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과, 안정화제를 포함하는 지속성 현탁 주사제를 제공하는 데에 있다.An object of the present invention is to provide a long-acting suspension injection containing crystalline montelukast (MTK) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a stabilizing agent.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 지속성 현탁 주사제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of degenerative brain diseases comprising the long-acting suspension injection.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 증류수, 젖산 (lactic acid) 및 젖산나트륨 (sodium lactate)을 혼합하여 산성 완충액을 제조하는 단계; (b) 무정형 (amorphous)의 몬테루카스트를 상기 (a) 단계에서 제조된 산성 완충액과 혼합시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 혼합한 혼합물을 밀봉하여 50 내지 70 ℃에서 3 내지 5일간 보관하여 현탁시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 현탁물을 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; (e) 상기 (d) 단계 후, 남은 침전물에 증류수를 첨가하여 현탁시킨 후, 다시 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계 후, 남은 침전물을 암실에 건조하는 단계;를 포함하는 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 제조방법을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is (a) preparing an acidic buffer by mixing distilled water, lactic acid (lactic acid) and sodium lactate (sodium lactate); (b) mixing amorphous montelukast with the acidic buffer prepared in step (a); (c) sealing the mixture mixed in step (b) and storing it at 50 to 70 ° C. for 3 to 5 days to suspend; (d) removing the supernatant by centrifuging the suspension of step (c); (e) adding distilled water to the remaining precipitate after step (d) to suspend the precipitate, and centrifuging again to remove the supernatant; And (f) drying the remaining precipitate in a dark room after step (e).
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 증류수, 아세트산나트륨 (sodium acetate) 및 아세트산 (acetic acid) 등을 혼합하여 산성의 완충액을 제조하는 단계; (ii) 상기 (i) 단계에 의해 제조된 산성 완충액에 안정화제를 첨가하여 교반하여 혼합하는 단계; 및 (iii) 청구항 1에 따른 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 상기 (ii) 단계의 혼합물을 혼합하고, 밀링 (milling)하는 단계;를 포함하는 지속성 현탁 주사제 제조방법을 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is (i) preparing an acidic buffer solution by mixing distilled water, sodium acetate and acetic acid; (ii) mixing by adding a stabilizer to the acidic buffer prepared in step (i) and stirring; and (iii) mixing the crystalline montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast; MTK) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과, 안정화제를 포함하는 지속성 현탁 주사제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a long-acting suspension injection containing crystalline montelukast (MTK) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a stabilizer.
또한, 본 발명은 상기 지속성 현탁 주사제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of degenerative brain disease comprising the long-acting suspension injection.
또한, 본 발명은 (a) 증류수, 젖산 (lactic acid) 및 젖산나트륨 (sodium lactate)을 혼합하여 산성 완충액을 제조하는 단계; (b) 무정형 (amorphous)의 몬테루카스트를 상기 (a) 단계에서 제조된 산성 완충액과 혼합시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 혼합한 혼합물을 밀봉하여 50 내지 70 ℃에서 3 내지 5일간 보관하여 현탁시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 현탁물을 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; (e) 상기 (d) 단계 후, 남은 침전물에 증류수를 첨가하여 현탁시킨 후, 다시 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계 후, 남은 침전물을 암실에 건조하는 단계;를 포함하는 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) preparing an acidic buffer by mixing distilled water, lactic acid (lactic acid) and sodium lactate (sodium lactate); (b) mixing amorphous montelukast with the acidic buffer prepared in step (a); (c) sealing the mixture mixed in step (b) and storing it at 50 to 70 ° C. for 3 to 5 days to suspend; (d) removing the supernatant by centrifuging the suspension of step (c); (e) adding distilled water to the remaining precipitate after step (d) to suspend the precipitate, and centrifuging again to remove the supernatant; And (f) after step (e), drying the remaining precipitate in a dark room; provides a method for producing crystalline montelukast comprising a.
또한, 본 발명은 (i) 증류수, 아세트산나트륨 (sodium acetate) 및 아세트산 (acetic acid) 등을 혼합하여 산성 완충액을 제조하는 단계; (ii) 상기 (i) 단계에 의해 제조된 산성 완충액에 안정화제를 첨가하여 교반하여 혼합하는 단계; 및 (iii) 청구항 1에 따른 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 상기 (ii) 단계의 혼합물을 혼합하고, 밀링 (milling)하는 단계;를 포함하는 지속성 현탁 주사제 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (i) preparing an acidic buffer by mixing distilled water, sodium acetate and acetic acid; (ii) mixing by adding a stabilizer to the acidic buffer prepared in step (i) and stirring; and (iii) mixing the crystalline montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to
본 발명에 따르면, 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 원료는 무정형 (amorphous)의 몬테루카스트 원료에 비해 낮은 용해도를 가짐을 확인하였다. 낮은 용해도와 용출 속도를 가진 결정형의 몬테루카스트 원료를 이용하여 나노 결정화 기술 기반 현탁 주사제를 설계하여 주사할 경우 2주 이상의 기간 동안 혈중 약물 농도를 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 지속성 나노 결정화 기술에 기반한 몬테루카스트 현탁 주사제는 알츠하이머병과 같은 만성 퇴행성 뇌질환 치료에 있어 환자의 복약 순응도를 획기적으로 개선할 수 있는 제형으로 기대된다. According to the present invention, it was confirmed that the crystalline montelukast raw material has lower solubility than the amorphous montelukast raw material. It was confirmed that the drug concentration in the blood could be maintained for a period of 2 weeks or longer when a nano-crystallization technology-based suspension injection was designed and injected using a crystalline montelukast raw material with low solubility and dissolution rate. The montelukast suspension injection based on this long-lasting nano-crystallization technology is expected to be a formulation that can dramatically improve patient compliance in the treatment of chronic degenerative brain diseases such as Alzheimer's disease.
도 1은 무정형 (amorphous) 및 결정형 (crystalline) 몬테루카스트의 형태학적 특성을 나타낸다.
도 2는 무정형 (amorphous) 및 결정형 (crystalline) 몬테루카스트의 물리적 화학적 특성을 나타낸다.
도 3은 안정화제의 농도 및 밀링 (milling) 조건에 따른 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 현탁 주사제제의 입도 양상을 나타낸다.
도 4는 입자 크기에 따른 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 현탁 주사제의 형태학적, 물리적 특성을 나타낸다.
도 5는 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 현탁 주사제의 입도에 의한 용출 양상의 차이를 평가한 것을 나타낸다.
도 6은 결정형 (crystalline) 흰쥐에서 몬테루카스트 현탁 주사제의 입도에 의한 약동학적 양상을 평가하기 위해 28일 간 약물 혈중 농도 양상을 나타낸다.
도 7은 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 현탁 주사제를 피하 주사 (Subcutaneous, SC)한 후, 4주 동안 투여 부위를 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 8은 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 현탁 주사제를 피하 주사 (Subcutaneous, SC)한 후, 주사 부위의 염증정도를 조직염색 (H&E staining) 후 관찰한 이미지이다.
도 9는 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 현탁 주사제에 대한 조직에서의 염증 병변의 정도를 수치화 하여 비교하기 위해 Caseviewer 프로그램을 통해 염증의 면적을 분석한 자료이다.Figure 1 shows the morphological characteristics of amorphous and crystalline montelukast.
Figure 2 shows the physical and chemical properties of amorphous and crystalline montelukast.
Figure 3 shows the particle size patterns of crystalline montelukast suspension injection preparations according to the concentration of stabilizer and milling conditions.
Figure 4 shows the morphological and physical properties of a crystalline montelukast suspension injection according to particle size.
Figure 5 shows the evaluation of the difference in dissolution patterns according to the particle size of the crystalline montelukast suspension injection.
Figure 6 shows the drug blood concentration pattern for 28 days to evaluate the pharmacokinetics of the montelukast suspension injection according to the particle size in crystalline rats.
7 shows images of the administration site observed for 4 weeks after subcutaneous (SC) injection of a crystalline montelukast suspension injection.
8 is an image observed after tissue staining (H&E staining) of the degree of inflammation at the injection site after subcutaneous (SC) injection of a crystalline montelukast suspension injection.
9 is data obtained by analyzing the area of inflammation through the Caseviewer program in order to quantify and compare the degree of inflammatory lesions in tissues with respect to a crystalline montelukast suspension injection.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
시판 중인 몬테루카스트 (montelukast; MTK) 제제들은 생체 이용률을 높이기 위해 무정형의 경구 투여제로 판매되고 있으며, 이를 통해 알츠하이머병에 대한 치료 효과를 얻기 위해선 1일 1회 경구 투여해야 하지만, 알츠하이머병과 같은 만성 퇴행성 뇌질환의 경우 환자의 복약순응도가 떨어질 수 있어서, 약물의 지속성 (long-acting)이 있는 결정형 (crystalline) 현탁 주사제로 설계하여 환자의 복약순응도를 높이고자 약물의 지속시간을 증진시킬 수 있는 방안으로 본 발명을 완성하였다.Commercially available montelukast (MTK) preparations are sold as an amorphous oral dosage form to increase bioavailability, and through this, to obtain a therapeutic effect for Alzheimer's disease, it must be administered orally once a day. In the case of a disease, the patient's medication compliance may decrease, so it is designed as a long-acting crystalline suspension injection to improve the patient's medication compliance and increase the duration of the drug. The invention was completed.
본 발명은 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과, 안정화제를 포함하는 지속성 현탁 주사제를 제공한다.The present invention provides a long-acting suspension injection containing crystalline montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a stabilizing agent.
상기 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 200 nm 내지 20 ㎛의 평균 입자경을 가질 수 있다.The crystalline form of montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof may have an average particle diameter of 200 nm to 20 μm.
상기 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 무정형 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 pH 3.5 내지 4.5 및 50 내지 70 ℃의 조건 하에서 3 내지 5일 동안 보관하여 얻을 수 있다.The crystalline form of montelukast (montelukast) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is amorphous montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof for 3 to 5 days under conditions of pH 3.5 to 4.5 and 50 to 70 ° C. can be stored and obtained.
상기 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 X-선 분말 회절 (X-ray powder diffraction) 스펙트럼에서 2θ 수치가 9.9 °, 15.4 °, 20.3 ° 및 24.5 °의 회절 피크를 가질 수 있다.The crystalline form of montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof has diffraction values of 9.9 °, 15.4 °, 20.3 ° and 24.5 ° in 2 θ values in an X-ray powder diffraction spectrum. can have peaks.
상기 안정화제는 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 폴리옥실 35 피마자유, 폴리옥실 40 하이드로제네이티드 피마자유, 틸록사폴 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군에서 선택된 하나로, 바람직하게는 폴리소르베이트 80일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The stabilizer is one selected from the group consisting of
상기 지속성 현탁 주사제는 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 2 내지 20 중량% 및 안정화제 0.1 내지 10 중량%를 포함할 수 있다. 몬테루카스트의 분량이 2 중량% 미만일 경우 투여 부피가 커 투여에 어려움이 있으며, 몬테루카스트의 분량이 20 중량%를 초과할 경우 제형의 점도가 증가하여 투여에 어려움이 있다. 또한 안정화제의 분량이 0.1 중량% 미만일 경우 결정형의 몬테루카스트를 매질 중에 고르게 현탁시키기 어려움이 발생하며, 분량이 10 중량%를 초과할 경우 상당량의 몬테루카스트가 용해되며, 또한 주사부위에 분산화제에 의한 국소 독성이 발생할 위험이 있다. The long-acting suspension injection may include 2 to 20% by weight of crystalline montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 0.1 to 10% by weight of a stabilizer. When the amount of montelukast is less than 2% by weight, the administration volume is large, and administration is difficult, and when the amount of montelukast exceeds 20% by weight, the viscosity of the formulation increases, making administration difficult. In addition, if the amount of the stabilizer is less than 0.1% by weight, it is difficult to evenly suspend the crystalline form of montelukast in the medium, and if the amount exceeds 10% by weight, a significant amount of montelukast is dissolved, and in addition, a dispersing agent is applied to the injection site. There is a risk of toxicity.
상기 지속성 현탁 주사제는 7 내지 30일 동안 지속성 (long-acting)을 제공할 수 있다.The long-acting suspension injection may provide long-acting for 7 to 30 days.
본 발명은 상기 지속성 현탁 주사제를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for treating degenerative brain disease comprising the long-acting suspension injection.
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 전측두치매(Frontotemporal dementia), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 근위축성측색경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 진행성핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 피크병(Pick's disease), 경도인지장애 및 치매로 이루어진 군에서 선택된 것으로 바람직하게는 알츠하이머병일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The degenerative brain disease is Alzheimer's disease, frontotemporal dementia, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration ( Corticobasal degeneration), Pick's disease, selected from the group consisting of mild cognitive impairment and dementia, preferably Alzheimer's disease, but is not limited thereto.
본 발명은 (a) 증류수, 젖산 (lactic acid) 및 젖산나트륨 (sodium lactate)을 혼합하여 산성 완충액을 제조하는 단계; (b) 무정형 (amorphous)의 몬테루카스트를 상기 (a) 단계에서 제조된 산성 완충액과 혼합시키는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 혼합한 혼합물을 밀봉하여 50 내지 70 ℃에서 3 내지 5일간 보관하여 현탁시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 현탁물을 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; (e) 상기 (d) 단계 후, 남은 침전물에 증류수를 첨가하여 현탁시킨 후, 다시 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계 후, 남은 침전물을 암실에 건조하는 단계;를 포함하는 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 제조방법을 제공할 수 있으며, 상기 (e) 단계는 1 내지 5회 반복할 수 있다.The present invention comprises the steps of (a) preparing an acidic buffer by mixing distilled water, lactic acid (lactic acid) and sodium lactate (sodium lactate); (b) mixing amorphous montelukast with the acidic buffer prepared in step (a); (c) sealing the mixture mixed in step (b) and storing it at 50 to 70 ° C. for 3 to 5 days to suspend; (d) removing the supernatant by centrifuging the suspension of step (c); (e) adding distilled water to the remaining precipitate after step (d) to suspend the precipitate, and centrifuging again to remove the supernatant; And (f) drying the remaining precipitate in a dark room after step (e). can be repeated
본 발명은 (i) 증류수, 아세트산나트륨 (sodium acetate) 및 아세트산 (acetic acid) 등을 혼합하여 산성 완충액을 제조하는 단계; (ii) 상기 (i) 단계에 의해 제조된 산성 완충액에 안정화제를 첨가하여 교반하여 혼합하는 단계; 및 (iii) 청구항 1에 따른 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 상기 (ii) 단계의 혼합물을 혼합하고, 밀링 (milling)하는 단계;를 포함하는 지속성 현탁 주사제 제조방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of (i) preparing an acidic buffer solution by mixing distilled water, sodium acetate and acetic acid; (ii) mixing by adding a stabilizer to the acidic buffer prepared in step (i) and stirring; and (iii) mixing the crystalline montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to
상기 안정화제는 산성 완충액 중 0.1 내지 10 %(w/v)의 농도로 포함할 수 있다.The stabilizer may be included at a concentration of 0.1 to 10% (w/v) in the acidic buffer.
상기 밀링 (milling)은 -15 내지 -5 ℃ 및 400 내지 2000 rpm의 조건 하에서 1 내지 3시간 동안 밀링할 수 있으나, 상기 밀링 조건은 제조 스케일, 사용 기기에 따라 달라질 수 있다.The milling (milling) may be milled for 1 to 3 hours under conditions of -15 to -5 ° C and 400 to 2000 rpm, but the milling conditions may vary depending on the manufacturing scale and equipment used.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, the present invention is not limited by the following examples.
[[ 준비예preparation example 1] 시약 및 재료 1] Reagents and Materials
몬테루카스트 소듐 (montelukast sodium)은 경보제약(Asan, South Korea)에서 구매하였다. LC-MS/MS의 내부 표준물질(Internal Standard, IS)로 이용된 자필루카스트 (Zafirlukast)와 안정화제로 사용된 폴리소르베이트 80 (polysorbate 80(TWEEN 80); 이하, TW 80이라 함), 틸록사폴 (tyloxapol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol 4000 (PEG 4000)), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (sodium carboxymethylcellulose (sodium CMC)), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone (PVP K17)), 아세트산 (acetic acid), 아세트산 나트륨 (sodium acetate), 젖산 (lactic acid) 및 젖산 나트륨 (sodium lactate)은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 솔루톨 HS15 (solutol HS15), 폴리옥실 35 피마자유 (Polyoxyl 35 castor oil (cremophor EL)), 폴리옥실 40 하이드로제네이티드 피마자유 (Polyoxyl 40 hydrogenatede castor oil (cremophor RH40))는 BASF(Ludwigshafen, Germany)에서 제공받았다. 아세토나이트릴 (acetonitrile)과 메탄올 (methanol)은 삼전순약공업(Gyeonggi-do, Korea)에서 구매하였다.Montelukast sodium was purchased from Kyongbo Pharmaceutical (Asan, South Korea). Zafirlukast used as an internal standard (IS) of LC-MS/MS and polysorbate 80 (TWEEN 80) used as a stabilizer; hereinafter referred to as TW 80), tyloc tyloxapol, polyethyleneglycol 4000 (PEG 4000), sodium carboxymethylcellulose (sodium CMC), polyvinylpyrrolidone (PVP K17), acetic acid, sodium acetate (sodium acetate), lactic acid and sodium lactate were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Solutol HS15, Polyoxyl 35 castor oil (cremophor EL), and
[[ 실시예Example 1] 결정형 (crystalline) 1] crystalline 몬테루카스트montelukast 원료 (raw) 제조 raw material manufacturing
무정형 (amorphous) 몬테루카스트 원료를 결정형 (crystalline)으로 만들기 위하여 유리병에 2 L의 증류수를 넣고 젖산 (lactic acid) 1.5 g, 젖산 나트륨 (sodium Lactate) 2.6 g을 첨가하여 20 mM의 pH4 버퍼를 제조하였다. 여기에 무정형 몬테루카스트 10 g을 넣고 24시간 동안 교반하였다. 이 유리병은 밀봉하여 60 ℃ 챔버에서 4일간 보관했다. 그 후, 젖산 (lactic acid)과 젖산 나트륨 (sodium lactate)를 씻어내기 위해 현탁액을 50 ml 코니칼 튜브 (conical tube)에 나눠 담아 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전물은 증류수를 25 ml 첨가 후 20초 간 볼텍싱하여 젖산 (lactic acid)를 최대한 세척한 후 다시 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이 과정을 세 번 반복하여 얻어진 침전물은 웨잉 디쉬 (weighing dish)에 보관 후 암실에서 건조하였다. 건조가 끝난 샘플은 알루미늄 유발, 유봉으로 갈아 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 원료 (raw) 를 제조했다.To make the amorphous montelukast raw material crystalline, 2 L of distilled water was put in a glass bottle, and 1.5 g of lactic acid and 2.6 g of sodium lactate were added to prepare a 20 mM pH4 buffer. . 10 g of amorphous montelukast was added thereto and stirred for 24 hours. The vial was sealed and stored in a 60° C. chamber for 4 days. Thereafter, the suspension was divided into 50 ml conical tubes and centrifuged to remove the supernatant in order to wash away lactic acid and sodium lactate. The precipitate was vortexed for 20 seconds after adding 25 ml of distilled water to wash lactic acid as much as possible, and then centrifuged again to remove the supernatant. The precipitate obtained by repeating this process three times was stored in a weighing dish and then dried in a dark room. The dried sample was ground in an aluminum mortar and pestle to prepare crystalline montelukast raw material.
[[ 실시예Example 2 내지 10] 결정형 (crystalline) 2 to 10] crystalline 몬테루카스트montelukast 제제 제조 formulation manufacturing
결정형 (crystalline) 몬테루카스트 제제는 듀얼 원심분리 (dual centrifugation) 기술을 통해 제조했다. 또한, 제조에 필요한 안정화제의 적합성을 평가하기 위해 다양한 안정화제를 사용하였다. 250 ml 비커에 증류수 (DW) 200 ml와 아세트산 나트륨 (sodium acetate) 221 mg, 아세트산 (acetic acid) 74.7 ml을 넣고 충분히 섞일 때까지 교반하여 pH 5 아세트산 버퍼 (acetate buffer)를 제조하였다. 이 버퍼를 10 ml 취하여 15 ml 코니칼 튜브 (conical tube)에 넣은 뒤 폴리소르베이트 80 (polysorbate 80 (Tween 80 (TW 80)); 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 2라고 함), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌블록 공중합체 (Poloxamer 188; 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 3이라고 함), 폴리에틸렌 글리콜 (15)-하이드록시스테아레이트 (Polyethylene glycol (15)-hydroxystearate (Solutol HS15); 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 4라고 함), 폴리옥실 35 피마자유 (Polyoxyl 35 castor oil (cremophor EL); 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 5라고 함), 폴리옥실 40 하이드로제네이티드 피마자유 (Polyoxyl 40 hydrogenatede castor oil (cremophor RH40); 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 6이라고 함), 틸록사폴(Tyloxapol; 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 7이라고 함), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 4000; 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 8이라고 함), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (Sodium CMC; 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 9라고 함) 및 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinylpyrrolidone (PVP K17); 이하, 이를 통해 만들어진 제제를 실시예 10이라고 함) 중 하나를 1.25 %(w/v)가 되도록 첨가하여 다 녹을 때까지 교반하였다. 그 후 밀링용 튜브에 지르코늄 비드 (zirconium bead) 1 g, 결정형 몬테루카스트 원료 100 mg를 넣고 앞서 제조한 각 안정화제가 포함된 버퍼를 1 ml씩 넣었다. 그 후 튜브를 닫고 10초간 볼텍싱하여 사전 습윤 (pre-wetting)시켰다. 그 후 젠트리믹서(Andreas HettichGmbH und Co KG, Tuttlingen, Germany)에 넣고 -10 ℃, 1500 rpm으로 설정한 뒤 2시간 동안 밀링 (milling)하여 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 제제 실시예 2 내지 10을 제조했다. A crystalline montelukast formulation was prepared using a dual centrifugation technique. In addition, various stabilizers were used to evaluate the suitability of the stabilizers required for manufacturing. 200 ml of distilled water (DW), 221 mg of sodium acetate, and 74.7 ml of acetic acid were added to a 250 ml beaker, and stirred until sufficiently mixed to prepare a
[[ 실험예Experimental example 1] 결정형 (crystalline) 1] crystalline 몬테루카스트montelukast 원료의 형태학적 특징 Morphological characteristics of raw materials
실시예 1에 의해 제조된 몬테루카스트가 결정형 (crystalline)이 되었다는 것을 확인하기 위해, 형태학적 특성은 주사전자현미경(SEM, Model JSM-6510, JEOL, Japan; 이하, SEM이라고 함 )을 통해 평가하였다. 각 샘플은 양면테이프가 붙은 알루미늄 격자에 올려 sputter coater (Model 108AUTO, Cressington, UK)를 통해 15 mA로 코팅하였다. 또한 입자의 마이크로 입자 사진은 15 kV에서 촬영되었다. In order to confirm that the montelukast prepared in Example 1 became crystalline, the morphological characteristics were evaluated through a scanning electron microscope (SEM, Model JSM-6510, JEOL, Japan; hereinafter referred to as SEM). Each sample was placed on an aluminum grid with double-sided tape and coated with 15 mA through a sputter coater (Model 108AUTO, Cressington, UK). Also, microparticle pictures of the particles were taken at 15 kV.
그 결과, 도 1에 의할 때, SEM 이미지에서 무정형의 성상을 가지던 입자가 각진 형태를 갖게 되었으며, 편광 필터를 통해 그 원료의 입자가 관찰되었다. As a result, according to FIG. 1, the particles having an amorphous appearance in the SEM image had an angular shape, and the particles of the raw material were observed through a polarizing filter.
[[ 실험예Experimental example 2] 결정형 (crystalline) 2] crystalline 몬테루카스트montelukast 원료의 물리적 화학적 특징 Physical and chemical characteristics of raw materials
실시예 1에 의해 제조된 몬테루카스트 원료가 결정형이 되었다는 것을 확인하기 위해, (A) 시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry; 이하, DSC라고 함), (B) X-선 회절분석법 (X-ray diffraction; 이하, XRD라고 함), (C) 겉보기 용해도 및 (D) 고성능 액체 크로마토그래피 (high-performance liquid chromatography; 이하, HPLC라고 함)를 통한 겉보기 유연물질 함량을 평가했다. In order to confirm that the montelukast raw material prepared in Example 1 was in crystalline form, (A) differential scanning calorimetry (hereinafter referred to as DSC), (B) X-ray diffraction analysis (X-ray diffraction (hereinafter referred to as XRD), (C) apparent solubility, and (D) apparent content of related substances through high-performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) were evaluated.
결정형 (crystalline) 몬테루카스트 원료의 열분석은 DSC 50 (Shimadzu scientific Instruments, MD)을 사용하여 진행하였다. 상기 원료는 60 ℃ 오븐에서 반나절 간 건조하여 사용하였다. 각 샘플 약 2 mg을 알루미늄 팬에 넣고 0 ℃에서 300 ℃까지 10 ℃/min의 속도로 점진적으로 가열하였다. 인듐은 온도 스케일과 엔탈피 반응을 보정하는데 사용되었다. DSC의 작동을 위해 질소 유속은 20 ml/min으로 사용하였다. 그 결과, 도 2의 (A)에 의할 때, 무정형 (amorphous) 몬테루카스트 원료의 경우 75 ℃ 부근에서 아주 작은 피크가 관찰된 반면, 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 원료의 경우 150 ℃에서 피크가 나타난 것으로 보아 입자의 녹는점 부근에서 많은 열량이 필요하였으며, 이 지점이 녹는점인 것을 확인할 수 있었다.Thermal analysis of the crystalline montelukast raw material was performed using a DSC 50 (Shimadzu scientific Instruments, MD). The raw material was dried in an oven at 60 ° C for half a day before use. About 2 mg of each sample was placed in an aluminum pan and gradually heated from 0 °C to 300 °C at a rate of 10 °C/min. Indium was used to calibrate the temperature scale and enthalpy response. For the operation of the DSC, a nitrogen flow rate of 20 ml/min was used. As a result, according to (A) of FIG. 2, in the case of the amorphous montelukast raw material, a very small peak was observed around 75 ° C., whereas in the case of the crystalline montelukast raw material, the peak appeared at 150 ° C. A large amount of heat was required near the melting point of the particles, and it was confirmed that this point was the melting point.
XRD는 X선 회절 현상을 통해 입자의 결정성을 파악하는 것으로, 결정형 몬테루카스트의 결정성 분석은 X-ray diffractometer(Ultima IV, Rigaku corporation, USA)를 사용하여 결정형 상태를 확인하였다. 약물 파우더 (powder)를 플레이트 (plate)에 담아 넘치지 않게 평평하게 담아 분석하였다. 회절 패턴 (Diffraction pattern)은 0.02 °의 스탭 사이즈 (step size)와 2 s/step의 스캐닝 속도 (scanning speed)를 사용하여 5 °에서 60 ° 범위에서 평가하였다. 그 결과, 도 2 (B)에 의할 때, 무정형 몬테루카스트의 경우 피크가 관찰되지 않은 반면, 결정형 몬테루카스트의 경우, 9.9 °, 15.4 °, 20.3 ° 및 24.5 °의 회절 피크에서 피크가 관찰되어 결정형이라는 것을 확인할 수 있었다.XRD is to determine the crystallinity of the particles through X-ray diffraction, and the crystallinity analysis of crystalline montelukast was confirmed using an X-ray diffractometer (Ultima IV, Rigaku corporation, USA). The drug powder (powder) was put in a plate (plate) and put flat so as not to overflow and analyzed. Diffraction patterns were evaluated in the range of 5 ° to 60 ° using a step size of 0.02 ° and a scanning speed of 2 s/step. As a result, according to FIG. 2 (B), no peaks were observed in the case of amorphous montelukast, whereas peaks were observed at diffraction peaks at 9.9 °, 15.4 °, 20.3 ° and 24.5 ° in the case of crystalline montelukast, indicating that it was crystalline. could confirm that
결정형 입자는 무정형 입자에 비해 더 낮은 용해도를 나타내는데, 이를 겉보기 용해도라고 한다. 이를 토대로, 도 2 (C)에 의할 때, 겉보기 용해도의 경우 무정형 (amorphous) 몬테루카스트의 경우 8시간차에 32.3 μg/ml까지 증가했다 24시간차에 4.3 μg/ml까지 감소한 반면, 결정형 (crystalline) 몬테루카스트의 경우 8시간차에 6.3 μg/ml까지 증가했다 24시간차에 1.9 μg/ml까지 감소하여 용해도에 큰 차이를 보였다. 이러한 결과들을 종합해본 결과, 실시예 1에 의할 때, 무정형 (amorphous) 몬테루카스트가 결정형 (crystalline)으로 전환되어, 용해 속도가 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다.Crystalline particles exhibit lower solubility than amorphous particles, which is called apparent solubility. Based on this, according to FIG. 2 (C), the apparent solubility of amorphous montelukast increased to 32.3 μg/ml at 8 hours and decreased to 4.3 μg/ml at 24 hours, while crystalline montelukast In the case of , it increased to 6.3 μg/ml at 8 hours and decreased to 1.9 μg/ml at 24 hours, showing a great difference in solubility. As a result of synthesizing these results, it was confirmed that in Example 1, amorphous montelukast was converted to crystalline form, and the dissolution rate was significantly reduced.
몬테루카스트는 빛에 매우 민감한 물질로 변성 여부의 파악이 중요하여 결정형 (crystalline) 몬테루카스 원료의 유연물질 함량을 파악하였다. 결정형 몬테루카스트 원료의 함량평가는 몬테루카스트 10 mg를 10 ml volumetric 플라스크에 넣고 메탄올로 표선을 맞추어 저장 용액 (stock solution)을 제조하였다. 그 후, 상기 저장 용액을 메탄올로 10배 희석하여 시마즈 HPLC로 분석하였다. 시마즈 HPLC는 펌프(LC-20AD XR), 오토샘플러 (SIL-20AC XR), UV-VIS detector(SPD-M20A), 그리고 시스템 컨트롤러 (CBM-20A)가 부착되어있다. 몬테루카스트를 검출하기 위해 역상 C18 컬럼 (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 μm, waters, USA)을 탑재하여 아이소크라틱 (isocratic) 분석하였으며, 이동상은 증류수 (DW), 아세토나이트릴 (Acetonitrile)을 3:2의 비율 혼합물에 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid; TFA)를 1.5 %를 첨가하여 제조하였다. 유속 (Flow rate)은 1.0 ml/min으로 하였고, 오븐의 온도는 30 ℃로 설정하였다. 용출액은 230 nm에서 4.3 min에 피크를 확인하였다. 그 결과, 도 2 (D)에 의할 때, 무정형 (amorphous)에서 결정형 (crystalline)으로의 전환 과정에서 메틸스티렌 불순물 (methylstyrene impurity)이 0.11 % 생성되었음을 확인하였으나 함량이 문제가 없었고, 유연물질 또한 기준치인 0.2 % 이하로 나타남을 확인했다.Montelukast is a very sensitive material to light, and it is important to determine whether or not it is denatured, so the content of related substances in crystalline montelukast was identified. To evaluate the content of the crystalline montelukast raw material, a stock solution was prepared by putting 10 mg of montelukast in a 10 ml volumetric flask and adjusting the mark with methanol. Then, the stock solution was diluted 10-fold with methanol and analyzed by Shimadzu HPLC. Shimadzu HPLC is equipped with a pump (LC-20AD XR), an autosampler (SIL-20AC XR), a UV-VIS detector (SPD-M20A), and a system controller (CBM-20A). To detect montelukast, isocratic analysis was performed with a reversed-phase C18 column (4.6 mm I.D. × 250 mm, 5 μm, waters, USA) mounted, and distilled water (DW) and acetonitrile were used as the mobile phase. It was prepared by adding 1.5% of trifluoroacetic acid (TFA) to a mixture in a ratio of:2. The flow rate was 1.0 ml/min, and the temperature of the oven was set to 30 °C. The eluate confirmed a peak at 230 nm at 4.3 min. As a result, according to FIG. 2 (D), it was confirmed that 0.11% of methylstyrene impurity was generated during the conversion from amorphous to crystalline, but there was no problem with the content, and related substances It was confirmed that it appeared below the standard value of 0.2%.
[[ 실험예Experimental example 3] 안정화제 종류에 따른 결정형 (crystalline) 3] Crystalline according to the type of stabilizer 몬테루카스트montelukast 현탁suspension 주사제의 성상 및 입도 평가 Evaluation of properties and particle size of injections
다양한 종류의 계면활성제 및 활택제로 제제를 제조하여 제제의주사 가능성 및 결정의 크기를 확인하였다. 주사 가능성은 22 G 시린지 통과 용이성을 평가하였다. 결정형 몬테루카스트 현탁 주사제의 입도 분포는 Hydro 2000 S 자동 분산기가 장착된 Mastersizer MS 2000 (Malvern Instruments Ltd., UK)을 통해 분석했다. 각 샘플은 분산기에 가림 범위 (obscuration range)는 20 내지 30 %가 되도록 샘플을 떨어뜨렸다. 다섯 번씩 분석하였으며, d50의 값을 ±표준편차로 나타내었다. d50은 누적샘플의 표준편차 중 샘플의 50 ％에 해당하는 입도를 나타내며 같은 방식으로 d10은 10 %, d90은 90 %에 해당하는 값을 의미한다. 그리고 입자의 균일성 (Homogeneity)은 SPAN값으로 나타내며, d90에서 d10을 뺀 값을 d50으로 나눠서 산출된다.Preparations were prepared with various types of surfactants and lubricants, and the injectability and crystal size of the preparations were confirmed. Injectability was evaluated for ease of passage through a 22 G syringe. The particle size distribution of the crystalline montelukast suspension injection was analyzed using a Mastersizer MS 2000 (Malvern Instruments Ltd., UK) equipped with a Hydro 2000 S automatic disperser. Each sample was dropped into the disperser so that the obscuration range was 20 to 30%. It was analyzed five times, and the value of d 50 was expressed as ± standard deviation. d 50 denotes a particle size corresponding to 50% of the standard deviation of the cumulative sample, and in the same way, d 10 denotes 10% and d 90 denotes a value corresponding to 90%. And the uniformity of the particles (Homogeneity) is represented by the SPAN value, calculated by dividing the value obtained by subtracting d 10 from d 90 by d 50 .
그 결과, 표 1에 의할 때, TW 80 (폴리소르베이트 80)을 사용한 실시예 2의 제제는 260 nm 정도의 입도를 가지면서 점도가 낮고 투여 용이한 흐름성을 보였다. 또한, 실시예 2, 3, 5, 6, 7 및 10 역시 입도가 균일하였으며 주사 가능한 점성과 흐름성을 나타내었다. 반면, 4, 8 및 9는 균일성이 낮으며 점성이 높아 투여에 어려움이 발생하였다. 특히 실시예 8에 사용된 폴리에틸렌 글리콜 4000 (PEG 4000) 및 실시예 9에 사용된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (Sodium CMC)와 같은 분산화제를 사용한 경우 10 μm 이상의 높은 입도를 나타내었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 실시예 2, 3, 5, 6, 7 및 10 에 사용된 안정화제들이 몬테루카스트 현탁 주사제 설계에 적합하다고 판단되었다. As a result, according to Table 1, the formulation of Example 2 using TW 80 (polysorbate 80) had a particle size of about 260 nm, low viscosity, and easy administration flowability. In addition, Examples 2, 3, 5, 6, 7, and 10 also had uniform particle sizes and exhibited injectable viscosity and flowability. On the other hand, 4, 8, and 9 had low uniformity and high viscosity, causing difficulty in administration. In particular, when dispersing agents such as polyethylene glycol 4000 (PEG 4000) used in Example 8 and sodium carboxymethyl cellulose (Sodium CMC) used in Example 9 were used, a high particle size of 10 μm or more was exhibited. In view of these results, it was determined that the stabilizers used in Examples 2, 3, 5, 6, 7, and 10 were suitable for the design of montelukast suspension injection.
[[ 실험예Experimental example 4] 안정화제 농도 및 4] stabilizer concentration and 밀링milling (milling) 세기에 따른 결정형 (crystalline) (Crystalline) according to (milling) intensity 몬테루카스트montelukast 현탁suspension 주사제 입도 평가 Injection particle size evaluation
결정형 (crystalline) 몬테루카스트의 현탁 주사제의 결정 크기에 안정화제의 농도와 밀링 (milling) 세기가 미치는 영향을 평가하였다. 안정화제의 농도는 입자 간에 물리적인 장벽을 형성하며, 입자 계면장력에 영향을 미쳐 입자의 크기와 입자의 뭉침 등에 영향을 미치게 되며, 밀링 RPM은 분쇄 강도를 결정하여 입자의 크기에 영향을 미치게 된다. 영 입도 분석 방법은 실험예 3과 동일하며, 안정화제로는 TW 80 (폴리소르베이트 80)을 사용하였다.The effects of the concentration of the stabilizer and the milling intensity on the crystal size of the crystalline montelukast suspension injection were evaluated. The concentration of the stabilizer forms a physical barrier between the particles, affects the interfacial tension of the particles, affects the particle size and particle agglomeration, and the milling RPM determines the grinding strength and affects the particle size. . The zero particle size analysis method was the same as in Experimental Example 3, and TW 80 (polysorbate 80) was used as a stabilizer.
그 결과, 도 3과 같이 몬테루카스트 제제는 안정화제가 0.7 내지 2 %(w/v)까지 증가할 때 거의 5000 nm에서 200 nm까지 급격한 감소를 나타내었다. 또한 500 rpm에서 대체로 낮은 입도를 보였으나, 1000 rpm에서 안정화제가 1 %(w/v) 이하일 때 입도가 급격하게 커졌고 rpm을 늘려 1,500 rpm이 되었을 때 조금 더 작아지는 양상을 보였다. 모든 rpm에서 안정화제의 농도가 높아질수록 입도가 작아지는 것을 보아, 밀링 (milling)된 입자를 계면활성제가 감싸며 서로 간 응집하는 것을 억제하는 것으로 판단했다. 또한, 어느 정도 이상의 rpm에서 오히려 입도가 커지는 현상이 관찰되었다. 이는 입자가 힘을 강하게 받아 입자가 작아졌고, 이로 인해 비표면적이 커지며 입자 간 반데르발스 인력을 상 쇄해줄 만큼 충분한 계면활성제가 없었기 때문으로 판단되었다.As a result, as shown in FIG. 3, the montelukast formulation showed a rapid decrease from almost 5000 nm to 200 nm when the stabilizer was increased from 0.7 to 2% (w/v). In addition, the particle size was generally low at 500 rpm, but the particle size rapidly increased when the stabilizer was 1% (w / v) or less at 1000 rpm, and decreased slightly when the rpm was increased to 1,500 rpm. Seeing that the particle size decreased as the concentration of the stabilizer increased at all rpm, it was determined that the milled particles were surrounded by the surfactant and suppressed from aggregating with each other. In addition, it was observed that the particle size rather increased at a certain rpm or more. This was determined to be because the particles became smaller as the particles received a strong force, resulting in a larger specific surface area and insufficient surfactant to offset the van der Waals attraction between the particles.
[[ 실험예Experimental example 5] 결정형 (crystalline) 5] crystalline 몬테루카스트montelukast 현탁suspension 주사제의 물리화학적 특성 평가 Evaluation of physicochemical properties of injections
실험예 4의 결과를 참고하여, 안정화제 농도 및 밀링의 세기를 조절하여 입도크기에 따른 3가지 제형을 설계하였다. 입도크기가 200 nm 대, 500 nm 대 및 3 μm 대의 제제(이하, 각각의 명칭은 200 nm NC, 500 nm NC 및 3 μm MC라고 함)를 제조하고, 그 차이를 확인하기 위해 도 4 및 표 2에 따라, 성상, XRD값, DSC값, 함량 (Drug conc.), 입도 (Particle size), 삼투압 (Osmolarity) 및 pH 등을 측정하여, 평가하였다. 공통적으로 실험방법은 실험예 1 내지 3과 동일하게 실험하였고, 안정화제로는 TW 80 (폴리소르베이트 80)을 사용하였다.Referring to the results of Experimental Example 4, three formulations were designed according to the particle size by adjusting the concentration of the stabilizer and the intensity of milling. Preparations of 200 nm, 500 nm, and 3 μm particle size (hereinafter, each name is referred to as 200 nm NC, 500 nm NC, and 3 μm MC) were prepared, and FIG. 4 and Table 4 were prepared to confirm the difference. 2, the properties, XRD value, DSC value, content (Drug conc.), particle size (Particle size), osmolarity and pH were measured and evaluated. In common, the experimental method was tested in the same way as in Experimental Examples 1 to 3, and TW 80 (polysorbate 80) was used as a stabilizer.
광학 현미경 관찰을 통해 마이크로 제제인 3 μm MC의 입자를 확인할 수 있었으나, 나노 제제인 200 nm NC 및 500 nm NC는 관찰할 수 없어서, 도 4의 (A) 및 (B)와 같이, SEM 이미지 관찰을 통해 나노 결정형 제제들을 관찰했으며, 그 결과, 500 nm NC에서 약물이 각진 모양을 가진 채 입도가 작아진 것을 확인하였고, 200 nm NC의 경우 그 크기가 작아 결정형을 확인하지 못하였지만, 목표한 입도의 입자를 확인할 수 있었다. Through optical microscopic observation, it was possible to confirm the particles of 3 μm MC, which is a micro formulation, but 200 nm NC and 500 nm NC, which are nano formulations, could not be observed, so as shown in (A) and (B) of FIG. 4, SEM image observation Nanocrystalline formulations were observed through, and as a result, it was confirmed that the drug had an angular shape and the particle size decreased in the 500 nm NC. particles could be identified.
XRD 회절 스펙트럼을 확인해 보았을 때, 도 4의 (C)에 의하면, 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 원료 (raw)는 9.9 °, 15.4 °, 20.3 ° 및 24.5 °에서 피크가 관찰되었고, vehicle의 경우, 31.6 °, 45.4 °에서 피크가 관찰되었는데, 이는 젖산나트륨파우더 (sodium lactate powder)의 회절 패턴임을 확인했다. 그리고 200 nm NC, 500 nm NC 및 3 um MC는 9.9 °, 15.4 °, 20.3 °, 24.5 °, 31.6 °, 45.4 °에서 피크가 관찰되어 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 원료의 피크 및 아세트산 (acetic acid)의 피크를 모두 가짐을 보였고, 이를 통해 밀링 (milling) 후에도 약물 본연의 결정형을 유지함을 확인하였다.When checking the XRD diffraction spectrum, according to (C) of FIG. 4, peaks were observed at 9.9 °, 15.4 °, 20.3 ° and 24.5 ° for the crystalline montelukast raw material (raw), and in the case of the vehicle, 31.6 ° , a peak was observed at 45.4 °, which was confirmed to be the diffraction pattern of sodium lactate powder. And peaks were observed at 9.9 °, 15.4 °, 20.3 °, 24.5 °, 31.6 °, and 45.4 ° for 200 nm NC, 500 nm NC, and 3 um MC, indicating peaks of crystalline montelukast raw material and acetic acid. It was shown to have all peaks, and through this, it was confirmed that the original crystalline form of the drug was maintained even after milling.
DSC를 확인하였을 때, 도 4의 (D)에 의하면, 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 원료 (raw)의 경우 150 ℃에서 피크, 즉 녹는점이 관찰되었고 vehicle의 경우 120 ℃에서 피크가 관찰되는데, 이는 아세트산 (acetic acid)과 TW 80 (폴리소르베이트 80)의 복합체의 피크가 겹쳐져 뭉툭하게 나타난 피크임을 확인했다. 200 nm NC, 500 nm NC 및 3 μm MC의 DSC는 피크의 샤프니스가 감소하였고 결정형 몬테루카스트 원료의 피크보다 약간 앞에서 피크가 확인되었다. 이는 제제가 결정형 원료의 결정성이 거의 유지되고 있으나 입자도 감소 등으로 인하여 결정성이 다소 감소한진 것으로 해석되었다. 이러한 데이터들을 종합하였을 때, 상기 결정형 (crystalline) 몬테루카스트 현탁 주사제 중 약물은 결정형 원료 본연의 결정형을 간직한 채 현탁되어 있음을 확인할 수 있었다.When confirming DSC, according to (D) of FIG. 4, a peak, that is, a melting point, was observed at 150 ° C. in the case of crystalline montelukast raw material (raw), and a peak was observed at 120 ° C. in the case of vehicle, which is acetic acid ( It was confirmed that the peaks of the complex of acetic acid) and TW 80 (polysorbate 80) overlapped and appeared blunt. In the DSC of 200 nm NC, 500 nm NC, and 3 μm MC, the sharpness of the peak decreased, and the peak was confirmed slightly before the peak of the raw material crystalline montelukast. This was interpreted as the fact that the crystallinity of the crystalline raw material was almost maintained, but the crystallinity was slightly reduced due to the decrease in particle size. When these data were put together, it was confirmed that the drug in the crystalline montelukast suspension injection was suspended while retaining the original crystalline form of the crystalline raw material.
[[ 실험예Experimental example 6] In vitro에서 용출 평가 6] In vitro dissolution evaluation
결정형 (crystalline) 몬테루카스트 제제의 입도 크기에 따른 성질 파악을 위해, 200 nm NC, 500 nm NC 및 3 μm MC에 대한 용출 평가가 sink-condition에서 진행하였는바, 상기 각 제제를 용출 용매에 직접 적가하여 평가하였다. sink-condition은 용출액을 1 % TW 80 (폴리소르베이트 80) pH 7.4 PBS (phosphate bufferd saline) 버퍼를 사용했고, 진탕 배양기 (Shaking incubator)에서 평가하였으며, 37 ℃로 온도를 유지하고 110 rpm으로 교반하는 200 ml 용출액이 들어있는 것으로, 여기에 제제를 100 μl를 가하였다. 용출 용매는 정해진 시간에 1 ml 취하였다. 이 용매는 13,000 rpm으로 10분 간 원심분리하여 상층액 250 μl만을 취하였다. 상층액은 메탄올로 4배 희석하여 HPLC로 분석하였다. 상층액을 취하고 남은 침전액에 온도를 유지하고 있는 새로운 용출액을 250 μl 가하고 교반하여 유리용기에 다시 넣어주었다.In order to understand the properties of crystalline montelukast formulations according to their particle size, dissolution evaluations for 200 nm NC, 500 nm NC, and 3 μm MC were conducted under sink-condition. evaluated. For sink-condition, 1% TW 80 (polysorbate 80) pH 7.4 PBS (phosphate buffered saline) buffer was used for the eluate, and evaluated in a shaking incubator, maintaining the temperature at 37 ° C and stirring at 110 rpm. 200 ml of the elution solution to which 100 μl of the preparation was added. 1 ml of the elution solvent was taken at a fixed time. This solvent was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes, and only 250 μl of the supernatant was taken. The supernatant was diluted 4 times with methanol and analyzed by HPLC. After taking the supernatant, 250 μl of a fresh elution solution maintained at temperature was added to the remaining precipitation solution, stirred, and put back into the glass container.
용출 평가한 결과, 도 5에 의할 때, 입도가 작아질수록 용출이 빨라지는 것을 확인할 수 있었다. 마이크로 제제인 3 μm MC는 4시간이 지난 시점에서 약 60 %, 24시간이 지난 시점에서 70 % 이상 용출 되었으며 48시간이 지난 시점에서 90 %이상 용출되었다. 이에 비해 나노 제제인 200 nm NC 및 500 nm NC는 마이크로 제제에 비해 급격히 용출 되었으며, 나노 제제 간 용출 양상은 크게 차이 나지 않았다. 두 나노 제제는 용출 1시간이 지난 시점에 70 % 이상 용출되었고, 12시간이 지난 시점에 90 % 이상 용출되어 24시간이 지난 시점에 거의 100 % 용출되었다.As a result of the elution evaluation, it was confirmed according to FIG. 5 that the elution increased as the particle size decreased. About 60% of 3 μm MC, a micro formulation, was eluted after 4 hours, over 70% after 24 hours, and over 90% after 48 hours. In contrast, the nano-
Noyes-Whitney 식에 따르면 sink-condition에서의 용출속도 dC/dt은 DSC/Vh으로 구할 수 있는데, 이 때 D는 확산계수, S는 고체의 표면적, C는 시간 t에서의 용질의 농도, V는 용매의 부피, h는 정지 용매층을 나타낸다. 확산계수는 용출용매에 영향을 받는 상수이기 때문에 제외하였을 때, 용출속도는 용질의 표면적에 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이것을 바탕으로 용출 결과를 보았을 때, 마이크로 제제인 3 μm MC는 이틀에 걸쳐 용출이 진행된 반면, 나노 제제인 200 nm NC 및 500 nm NC는 하루 만에 용출이 거의 끝난 것을 확인할 수 있다. 또한 나노 제제들 간에도 입도가 작을 때 조금이나마 용출이 더 빨리 일어난 것 역시 확인되었다.According to the Noyes-Whitney equation, the dissolution rate dC/dt in the sink-condition can be obtained by DSC/Vh, where D is the diffusion coefficient, S is the surface area of the solid, C is the solute concentration at time t, and V is The volume of solvent, h, represents the stationary solvent layer. Since the diffusion coefficient is a constant that is affected by the elution solvent, it can be confirmed that the elution rate increases in proportion to the surface area of the solute when excluded. Based on this, when looking at the dissolution results, it can be seen that the dissolution of 3 μm MC, which is a micro formulation, progressed over two days, while the dissolution of 200 nm NC and 500 nm NC, which are nano formulations, was almost completed in one day. In addition, it was also confirmed that the dissolution occurred slightly faster when the particle size was small between the nano-formulations.
[[ 실험예Experimental example 7] in 7] in vivo에서in vivo 약동학적 양상 평가 Pharmacokinetic profile evaluation
in vivo에서 약동학적 양상을 평가하기 위해 우선 투여 제제의 양 (volume)을 우선 설정하였다. 정상인 체중 60 kg를 기준으로 몬테루카스트의 용량은 0.33 mg/kg가 되는데, 여기서 쥐 (rat)와 인간 (human)의 체표면적은 6배 차이가 나기 때문에 쥐에서의 용량으로 환산하면 투여량은 2.07 mg/kg가 되고, 2주 간 혈중 농도를 유지하는 것을 목표로 하기 위해 2.07*14로 계산하면 투여 용량은 28.93 mg/kg로 계산되어, 상기 200 nm NC, 500 nm NC 및 3 μm MC는 100 mg/ml임을 근거로 쥐의 무게 250 g을 기준으로 하여 계산하면 72 μl가 되며, 약물 소실량 등을 감안하여 최종적으로 75 μl (30.0 mg/kg)로 선정하였다.In order to evaluate the pharmacokinetics in vivo, the volume of the administration agent was first set. Based on a normal body weight of 60 kg, the dose of montelukast is 0.33 mg/kg. Here, since the body surface area of a rat and a human has a 6-fold difference, the dose is 2.07 mg when converted to the dose in a rat. /kg, and calculated as 2.07*14 to maintain the blood concentration for 2 weeks, the administered dose is calculated as 28.93 mg/kg, and the 200 nm NC, 500 nm NC, and 3 μm MC are 100 mg Based on /ml, when calculated based on the weight of a rat of 250 g, it becomes 72 μl, and 75 μl (30.0 mg/kg) was finally selected in consideration of the amount of drug loss.
in vivo에서 약동학적 평가는 6주령 수컷 Sprague-Dawley rats(250 g ± 20 g)를 통해 진행되었다. 쥐들은 상온에서 45 내지 60%의 습도에서 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 공급하였다. 이렇게 하루 간 적응시간을 가진 쥐들은 제제의 입도에 따라 세 그룹 (200 nm NC, 500 nm NC, 3 μm MC)으로 나누었고, 상기 세 그룹의 결정형 몬테루카스트 제제를 30 mg/kg의 용량으로 31 G 인슐린 시린지를 통해 투여하였다. 혈액샘플은 약물 투여 3, 6, 10, 24, 48, 96, 168, 240, 336, 604, 772시간에 헤파린 처리된 26 G 시린지를 통해 600 μl를 채취하였다. 채취한 혈액은 원심분리 하여 상층의 혈장만을 취하고 분석 전까지 -60 ℃로 유지하였다.In vivo pharmacokinetic evaluation was conducted in 6-week-old male Sprague-Dawley rats (250 g ± 20 g). Mice were supplied with food and water ad libitum at room temperature and humidity of 45 to 60%. The rats with this one-day adaptation time were divided into three groups (200 nm NC, 500 nm NC, and 3 μm MC) according to the particle size of the formulation, and the three groups of crystalline montelukast formulations were administered with 31 G insulin at a dose of 30 mg/kg. Administered via syringe. 600 μl of blood samples were collected through a heparinized 26 G syringe at 3, 6, 10, 24, 48, 96, 168, 240, 336, 604, and 772 hours after drug administration. The collected blood was centrifuged to take only the upper layer plasma and maintained at -60 ℃ until analysis.
혈장의 몬테루카스트 농도는 Shimadzu Triple Quadrupole LCMS-8050 system을 이용하여 분석하였다. 샘플 분석을 위한 분석 컬럼은 Phenomenex Luna C18 (2.0 mm x 150 mm, 5 μm)를 사용하였고, 그래디언트 (gradient) 조건 하에서 분석을 진행하였다. 이동상 A는 10 mM 포름산암모늄 (ammonium formate), 이동상 B는 아세토나이트릴 (acetonitrile)을 사용하였고, 그래디언트 (gradient) 조건은 다음과 같다. 0-2분 : 이동상 A(90%), 2-5.5분 : 이동상 A(50%), 5.5-7분 : 이동상 A (1%), 7.01-10분 : 이동상 A(90%). 이동상의 유속은 0.3 ml/min, 컬럼 오븐 온도는 40℃, 샘플 주입량은 10 μl였다. MS (Mass spectrometry)는 전자 분무 이온화 (ESI)가 사용되었다. 분석조건은 분무 가스 (Nebulizing gas) : 3 L/min, 건조 가스 (drying gas) : 10 L/min, DL 온도 (DL temperature) : 250 ℃ 및 히팅블럭 온도 (heat block temperature) : 400℃이며, MS (Mass spectrometry)를 위한 스캔 방법은 MRM (multiple reaction monitoring)을 선택하였다.The concentration of montelukast in plasma was analyzed using a Shimadzu Triple Quadrupole LCMS-8050 system. Phenomenex Luna C18 (2.0 mm x 150 mm, 5 μm) was used as an analysis column for sample analysis, and analysis was performed under gradient conditions. The mobile phase A was 10 mM ammonium formate, and the mobile phase B was acetonitrile, and the gradient conditions were as follows. 0-2 min: mobile phase A (90%), 2-5.5 min: mobile phase A (50%), 5.5-7 min: mobile phase A (1%), 7.01-10 min: mobile phase A (90%). The flow rate of the mobile phase was 0.3 ml/min, the column oven temperature was 40°C, and the sample injection amount was 10 μl. Electrospray ionization (ESI) was used for mass spectrometry (MS). The analysis conditions are nebulizing gas: 3 L/min, drying gas: 10 L/min, DL temperature: 250 ℃ and heat block temperature: 400 ℃, MRM (multiple reaction monitoring) was selected as the scan method for MS (Mass Spectrometry).
최고 혈중 농도(Cmax)와 최고 혈중 농도 도달 시간 (Tmax)은 평균 혈액 농도 - 시간 곡선으로 나타내었다. 결정형 몬테루카스트 제제의 혈액 농도 곡선하 면적 (AUC0-24h)은 BA Calc 2007 약동학 분석 프로그램 (식약처, 오송)의 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 추정하였다. 데이터를 평균 ± 표준 편차로 나타내었다.The peak blood concentration (Cmax) and the time to reach the peak blood concentration (Tmax) were expressed as mean blood concentration-time curves. The area under the blood concentration curve (AUC0-24h) of the crystalline montelukast preparation was estimated using the linear trapezoidal rule of BA Calc 2007 pharmacokinetic analysis program (Ministry of Food and Drug Safety, Osong). Data are presented as mean±standard deviation.
그 결과, 도 6에 의할 때, 혈중 농도 양상에서 입도 간 큰 차이를 관찰할 수 있었다. 나노 제제인 200 nm NC 및 500 nm NC는 투여 후 3시간 만에 급격히 용출되어 2일차까지 급격하게 떨어진 후, 2일차부터 28일차까지 혈중농도가 완만하게 감소하는 이상 (二相; Biphasic)한 혈중농도 양상을 보였다. 이에 비해 마이크로 제제인 3 μm MC는 10시간차까지 완만하게 혈중농도가 상승하다가 28일차까지 완만하게 혈중농도가 감소하는 용출 양상을 보였다. 이는 앞서 In vitro 용출 평가에서 서술한 바와 같이 제제의 입도가 작은 나노 제제는 더 큰 비표면적을 가지고, Noyes-Whitney 식에 따라 더 빠른 속도로 조직에서의 용출이 나타난 것이다.As a result, according to FIG. 6, it was possible to observe a large difference between the particle sizes in the blood concentration pattern. 200 nm NC and 500 nm NC, which are nanopharmaceuticals, are rapidly eluted 3 hours after administration, drop rapidly until the 2nd day, and then the blood concentration gradually decreases from the 2nd day to the 28th day. concentration pattern was observed. In contrast, 3 μm MC, a micro-preparation, showed an elution pattern in which the blood concentration gradually increased until the 10th hour and gradually decreased until the 28th day. This is because, as described in the in vitro dissolution evaluation, the nano-preparation with a small particle size has a larger specific surface area and dissolution in the tissue at a faster rate according to the Noyes-Whitney equation.
또한, 입도 차이에 따른 약동학적 파라미터를 계산한 결과, 표 3에 의할 때, 나노 제제인 200 nm NC 및 500 nm NC은 Cmax가 마이크로 제제인 3 μm MC에 비해 2배 정도 더 높았으며 Tmax의 경우 반대로 마이크로 제제에서 유의적으로 늦어 졌다. AUC의 경우 세 가지 제제에서 큰 차이가 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이는 앞서 Hixon-Crowell 식에서 얘기한 바에 의해 나타난 현상으로, 입도가 작을수록 비표면적이 넓어져 초기 급방출이 일어났지만, 모든 제제는 주사 부위에서 용해되어 혈액으로 방출되어 최종적으로 AUC는 같게 나타난 것으로 생각된다. 혈중농도 및 각종 지표들을 최초 제제 설계 당시 목표 방출기간은 14일이었지만, 28일까지도 혈장에서 결정형 몬테루카스트 제제가 관찰된 것을 보아 약물의 지속됨을 확인할 수 있었다.In addition, as a result of calculating the pharmacokinetic parameters according to the difference in particle size, according to Table 3, the Cmax of 200 nm NC and 500 nm NC, which are nano formulations, was about 2 times higher than that of 3 μm MC, which is a micro formulation, and the Tmax of Conversely, it was significantly delayed in micro-formulations. In the case of AUC, it was confirmed that there was no significant difference among the three formulations. This is a phenomenon shown by the previously discussed Hixon-Crowell equation. The smaller the particle size, the wider the specific surface area, resulting in rapid release at the initial stage. do. Although the target release period was 14 days at the time of designing the blood concentration and various indicators, it was confirmed that the drug persisted as the crystalline montelukast preparation was observed in plasma up to the 28th day.
[실험예 8] 조직병리학적 평가[Experimental Example 8] Histopathological evaluation
약물의 조직에서의 퍼짐성 및 반응 등을 파악하기 위해 조직의 병리학적 평가를 진행하였다.Pathological evaluation of the tissue was performed to determine the spreadability and response of the drug in the tissue.
조직 병리학적 평가는 6주령 수컷 Sprague-Dawley rats(250 g ± 20 g)를 통해 진행되었다. 쥐들은 상온에서 45 내지 60 %의 습도에서 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 공급하였다. 하루 간 적응시간을 가진 쥐들은 제제의 입도에 따라 그룹 (200 nm NC, 500 nm NC, 3 μm MC, control)을 나누었고, 상기 200 nm NC, 500 nm NC 및 3 μm MC를 실험예 7을 근거로 하여 30 mg/kg의 용량으로 31 G 인슐린 시린지를 통해 투여하였다. 이 쥐들은 2, 7, 14, 28일에 이산화탄소로 죽인 뒤, 투여부위 근처 조직을 최대한 넓게 취하였다. 취한 피하 조직은 스티로폼에 올린 뒤, 침핀을 꽂아 말리는 것을 방지한 후, 10 % 중성완충포르말린 (neutral bufferd formalin)으로 4 ℃서 3일 간 고정하였다. 고정이 끝난 샘플은 파라핀에 임베딩하고 슬라이스한 후 H&E 염색 (H&E staining) 하였다. H&E 염색은 헤마톡실린과 에오신이라는 두 가지 염색 시약을 통해 염증정도를 파악하는 방법으로 이 때 SC 투여된 조직에서는 염증 반응이 나타나는데, 이 양상을 분석하여 염증 정도를 파악하였다. 이렇게 얻어진 슬라이스는 Caseviewer 프로그램(3D Histech, 부다페스트, 헝가리)을 통해 염증의 생김새, 면적을 비교하였다.Histopathological evaluation was performed in 6-week-old male Sprague-Dawley rats (250 g ± 20 g). Mice were supplied with food and water ad libitum at room temperature and humidity of 45 to 60%. Rats with a one-day adaptation time were divided into groups (200 nm NC, 500 nm NC, 3 μm MC, control) according to the particle size of the formulation, and the 200 nm NC, 500 nm NC and 3 μm MC were classified according to Experimental Example 7. was administered through a 31 G insulin syringe at a dose of 30 mg/kg. These mice were killed with carbon dioxide on
그 결과, 도 7에 의할 때, 상기 200 nm NC, 500 nm NC 및 3 μm MC 모두에서 2일이 지난 시점과 7일이 지난 시점까지 육안으로 약물이 남아있는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 14일이 지난 시점에서 약물이 거의 사라졌고, 28일이 지난 시점에서는 완전히 사라짐을 확인했다.As a result, according to FIG. 7 , it was confirmed that the drug remained with the naked eye until 2 days and 7 days in all of the 200 nm NC, 500 nm NC, and 3 μm MC. And it was confirmed that the drug almost disappeared after 14 days, and completely disappeared after 28 days.
또한, 도 8에 의하면, control인 PBS 투여 샘플과 비교해 보았을 때, 제제가 투여된 샘플은 보라색을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 보라색으로 염색된 영역은 2일차 7일차에서 넓은 영역에서 염색되어 있으며, 14일차의 샘플에서는 앞 시간대에 비해 푸른빛을 띄는 영역이 많이 감소하였다.In addition, according to FIG. 8, when compared with the control PBS administration sample, it was confirmed that the sample administered with the agent had a purple color. The area stained with purple was stained in a wide area on the 2nd and 7th day, and in the sample on the 14th day, the bluish area was greatly reduced compared to the previous time period.
또한, 도 9에 의하면, Caseviewer 프로그램을 통해 염증의 면적을 분석한 결과, 나노 제제인 200 nm NC 및 500 nm NC은 2일차에 서로 비슷한 양상을 보이며 넓은 면적을 나타냈지만, 마이크로 제제인 3 μm MC의 경우 두 제제에 비해 면적이 좁게 나타났다. 7일차에서는 200 nm NC 및 500 nm NC은 염증의 면적이 점점 줄어들었으며 이에 비해 3 μm MC는 오히려 면적이 넓어진 것을 확인할 수 있다. 14일차에서는 200 nm NC의 경우 면적이 급격하게 작아졌으며, 3 μm MC와 500 nm NC는 이에 비해 면적이 서서히 감소함을 확인할 수 있었다. 28일차에 이르러서는 세 가지 제제 모두 염증반응이 관찰되지 않았다. 이는 앞서 in vivo 용출평가 결과와 비슷한 양상이다. in vivo 평가에서 200 nm NC 및 500 nm NC는 초기에 급방출을 보이고 혈중 농도가 급격히 감소하여 나중엔 아주 완만한 혈중농도 감소를 나타내는 이상 (二相; Biphasic)한 양상을 가졌다. 반대로 3 μm MC는 혈중 농도가 서서히 올라가 서서히 감소하는 양상을 보였다. 이와 비슷하게 200 nm NC 및 500 nm NC는 염증의 넓이에서도 이러한 이상 (二相; Biphasic)한 양상이 나타났으며, 이와는 반대로 3 μm MC는 혈중농도가 서서히 올라가 서서히 감소하는 양상을 보였다. 이는 투여 초기에 제제의 입도 차이에 의한 흐름성의 차이로 인해, 약물이 조직에서 더 빨리 이동할 수 있어 염증의 크기가 더 크게 나타나는 것으로 보인다. 또한 14일이 지난 시점에서 200 nm NC 제제는 염증 영역이 크게 감소한 것을 확인할 수 있는데, 이는 in vivo 평가에서와 같이 넓은 비표면적으로 인해 조직에서 약물이 빨리 용출된 것이 원인으로 보인다. 나노 입자에서 더 이러한 결과를 통해 제제의 입자크기와 같은 물성이 용출 양상에만 차이를 주는 것이 아닌, 염증의 정도에도 영향을 끼침을 확인할 수 있었다.In addition, according to FIG. 9, as a result of analyzing the area of inflammation through the Caseviewer program, 200 nm NC and 500 nm NC, which are nano-agents, showed similar patterns on the second day and showed a large area, but 3 μm MC, which is a micro-agent. In the case of , the area was narrower than the two formulations. On the 7th day, the 200 nm NC and 500 nm NC gradually decreased the area of inflammation, whereas the 3 μm MC rather widened the area. On the 14th day, it was confirmed that the area of 200 nm NC decreased rapidly, and the area of 3 μm MC and 500 nm NC gradually decreased. On the 28th day, no inflammatory response was observed for all three agents. This is similar to the previous in vivo dissolution evaluation results. In the in vivo evaluation, 200 nm NC and 500 nm NC exhibited a biphasic pattern with rapid release at the beginning, rapid decrease in blood concentration, and a very gentle decrease in blood concentration later. Conversely, the blood concentration of 3 μm MC gradually increased and gradually decreased. Similarly, 200 nm NC and 500 nm NC showed biphasic patterns in the area of inflammation, whereas 3 μm MC showed a gradual increase in blood concentration and a gradual decrease. This seems to be due to the difference in flowability due to the difference in the particle size of the formulation at the beginning of administration, so that the drug can move faster in the tissue, resulting in a larger inflammation. Also, after 14 days, the inflammatory area of the 200 nm NC formulation was significantly reduced, which seems to be due to the rapid dissolution of the drug from the tissue due to the large specific surface area as in the in vivo evaluation. Through these results in nanoparticles, it was confirmed that physical properties such as the particle size of the formulation not only make a difference in the dissolution pattern, but also affect the degree of inflammation.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not limiting.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the following claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and equivalent concepts should be interpreted as being included in the scope of the present invention.
Claims (14)
The method according to claim 1, wherein the crystalline form (montelukast) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is amorphous montelukast (montelukast) or a pharmaceutically acceptable salt thereof under conditions of pH 3.5 to 4.5, 50 to 70 ° C. Long-acting suspension injection, characterized in that obtained by storage for 3 to 5 days.
(b) 무정형 (amorphous)의 몬테루카스트를 상기 (a) 단계에서 제조된 산성 완충액과 혼합시키는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 혼합한 혼합물을 밀봉하여 50 내지 70 ℃에서 3 내지 5일간 보관하여 현탁시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 현탁물을 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계 후, 남은 침전물에 증류수를 첨가하여 현탁시킨 후, 다시 원심 분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계 후, 남은 침전물을 암실에 건조하는 단계;를 포함하는 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 제조방법.(a) preparing an acidic buffer solution by mixing distilled water, lactic acid and sodium lactate;
(b) mixing amorphous montelukast with the acidic buffer prepared in step (a);
(c) sealing the mixture mixed in step (b) and storing it at 50 to 70 ° C. for 3 to 5 days to suspend;
(d) removing the supernatant by centrifuging the suspension of step (c);
(e) adding distilled water to the remaining precipitate after step (d) to suspend the precipitate, and centrifuging again to remove the supernatant; and
(f) after step (e), drying the remaining precipitate in a dark room; method for producing crystalline montelukast (montelukast) comprising.
(ii) 상기 (i) 단계에 의해 제조된 산성 완충액에 안정화제를 첨가하여 교반하여 혼합하는 단계; 및
(iii) 청구항 1에 따른 결정형 (crystalline)의 몬테루카스트 (montelukast) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 상기 (ii) 단계의 혼합물을 혼합하고, 밀링 (milling)하는 단계;를 포함하는 지속성 현탁 주사제 제조방법.(i) preparing an acidic buffer solution by mixing distilled water, sodium acetate and acetic acid;
(ii) mixing by adding a stabilizer to the acidic buffer prepared in step (i) and stirring; and
(iii) mixing the crystalline montelukast or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1 with the mixture of step (ii) and milling; preparation of a long-acting suspension injection containing method.
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