KR20230021743A - 이형접합 cenh3 외떡잎식물 및 반수체 유도 및 동시 게놈 편집을 위한 이의 사용 방법 - Google Patents

이형접합 cenh3 외떡잎식물 및 반수체 유도 및 동시 게놈 편집을 위한 이의 사용 방법 Download PDF

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알. 켈리 다웨
데이비드 잭슨
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유니버시티 오브 조지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
콜드스프링하버러보러토리
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Abstract

동원체 히스톤 3(CenH3)에 대해 이형접합이고 임의로 유전자 편집 작제물을 발현하는, 외떡잎 표적 식물의 반수체 유도 및 임의로 통과 유전자 편집 시 사용하기 위한 외떡잎 식물이 제공된다. 외떡잎 반수체 유도자 식물은 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자만을 갖는 이배체 식물 세포로 전형적으로 구성된다. 이배체 식물 세포는, 예를 들어, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 CenH3 대립유전자를 또한 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 대립유전자는 프레임시프트 돌연변이, 단백질 비대립유전자, RNA 비대립유전자, 또는 이의 조합물이다. 외떡잎 반수체 유도자 식물은 또한 외떡잎 식물의 세포에 의해 안정하게 발현되는 유전자 편집 기구, 예컨대 부위-지정 뉴클레아제 및 임의로 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 임의로 동시에 표적 외떡잎식물의 표적 게놈을 변형시키면서 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 방법이 또한 제공된다.

Description

이형접합 CENH3 외떡잎식물 및 반수체 유도 및 동시 게놈 편집을 위한 이의 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2020년 6월 9일 U.S.S.N. 63/036,902, 및 2020년 6월 9일 제출된 U.S.S.N. 63/036,910의 이익 및 이에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 통합된다.
연방 정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 국립 과학 재단(National Science Foundation)에 의해 수여된 1444514 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정한 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
2021년 6월 7일 생성된, 20,835 바이트의 크기를 갖는, "UGA_2020_139_03_PCT_ST25.txt,"로 명명된 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록이 이로써 37 C.F.R § 1.52(e)(5)에 따라 참조로 통합된다.
기술분야
본 발명의 분야는 일반적으로 반수체 유도자 식물 계통, 및 유전적으로 변형된 배가된 반수체 식물을 생성하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
수만 개의 옥수수 반수체 계통이 매년 전 세계의 육종 회사에 의해 새로운 근교종을 만들기 위한 전제조건으로서 생성되며, 이들은 궁극적으로 판매를 위한 잡종을 생성하기 위해 사용된다. 유도된 반수체는 화학적 처리에 의해 배가되어 농업 성능에 대해 즉시 시험된다. 가능하게 하는 기술은 수컷으로 교배되었을 때 반수체를 유도하는 스톡 6(Stock 6)으로 불리는 옥수수 근교종의 발견이었다(Coe,e t al., The American Naturalist, 93 (873): 381-82 (1959)). 이 교배로부터의 자손의 약 3%는 모체 게놈에 대해 반수체이다. 이 계통은 현재 개선되어 3-20%의 범위일 수 있는 개선된 반수체 형성을 위해 선택되었다(Hu et al., Genetics, 202 (4): 1267-76 (2016); Prigge et al., Genetics, 190 (2): 781-93 (2012)). 모든 옥수수 반수체-유도 적용법은 이 최초의 발견 및 이로부터 유래된 육종 계통으로 거슬러 올라간다. 이 주제에 대한 관련 문헌이 많이 검토되었다(Chaikam et al., TAG. Theoretical and Applied Genetics. Theoretische Und Angewandte Genetik, 132 (12): 3227-43 (2019); Comai 및 Tan, Trends in Genetics. doi:10.1016/j.tig.2019.07.005 (2019); Kalinowska et al., TAG. Theoretical and Applied Genetics. Theoretische Und Angewandte Genetik, 132 (3): 593-605 (2019)). 스톡-6 기반 반수체 유도를 책임지는 유전자(매트릴리닐(Matrilineal), 또는 matl)는 주로 꽃가루에서 발현되는 파타틴-유사 포스포리파아제이다(Kelliher et al., Nature, 542 (7639): 105-9 (2017); Liu et al., Molecular Plant, 10 (3): 520-22 (2017); Gilles et al., The EMBO Journal, 36 (6): 707-17 (2017)). 이의 작용의 메커니즘은 이해되지 않지만, 부계 유전자형의 갑작스러운 상실로 이어지는 수정 동안의 막 특성의 변화를 수반할 수 있다. Matl의 돌연변이는 벼에서의 반수체를 또한 유도하는데(Yao et al., Nature Plants, 4 (8): 530-33 (2018)), 이는 이 반수체의 유도 방법이 외떡잎식물 작물 종에 대해 광범위하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
반수체 유도 그 자체는 광범위한 관심 대상이다. 또한 중요한 것은 matl이 CRISPR/Cas9 카세트를 임의의 근교 백그라운드(background) 내로 "보이지 않게" 전달하고(Kelliher et al., Nature Biotechnology, 37 (3):287-92 (2019)) 반수체 자손의 3% 초과로 유전자를 편집하기 위해 사용될 수 있다는 후속 입증이었다. 결과적인 반수체는 그후에 배가되어 빠르고 GMO-무함유 방식으로 동형접합 돌연변이가 있는 근교종을 생성할 수 있다. 유전자를 편집하는 임의의 다른 방식은 매우 유전자형-의존적인 과정인; 형질전환 및 재생을 필요로 한다. 유전자형-독립적인 반수체 유도자를 사용함으로써, 이 병목 현상을 피할 수 있다. 그러나, 방법은, 이것이 또 다른 부위에서 유전자 편집을 개시하기 전에 matl에서 돌연변이를 생성할 필요성이 있기 때문에 번거롭다. matl 돌연변이를 함유하는 계통은 또한 건강하지 않고 번식하기 어렵다. 추가로, matl 작용의 메커니즘은 공지되어 있지 않으므로, Cas9이 모계의 게놈에 어떻게 접근할 수 있는지도 명확하지 않다. 메커니즘이 공지되어 있지 않으므로, 기술을 개선하는 것은 어렵다.
반수체를 유도하는 또다른 방법은, cenh3-/- 애기장대 널(null) 돌연변이체가, "GFP-tailswap"으로 불리는 CENH3의 변형된 버전으로 보완될 때 부계 반수체를 높은 빈도(~25%)로 유도할 수 있다는 사실이 발견된 동원체-매개 반수체 유도(Ravi 및 Chan (Ravi, et al., Genetics, 186 (2): 461-71 (2010), Ravi, et al., PLoS Genet., 7(6):e1002121 (2011) doi: 10.1371/journal.pgen.1002121, Ravi et al., Nature, 464 (7288): 615-18 (2011))이다. GFP-tailswap은 N 말단에 추가된 히스톤 꼬리 및 큰 GFP 모이어티 내에 치환이 있는 복합 전이유전자이다. GFP가 있거나 없는 상이한 종으로부터의 CENH3 유전자를 수반하는 테일스왑의 다른 형태(Britt 및 Kuppu, Frontiers in Plant Science, 7 (April): 357, (2016)), 및 CENH3의 단일 아미노산 변화를 부여하는 점 돌연변이 또한 보다 낮은 빈도로 반수체를 유도할 수 있다(Karimi-Ashtiyani et al., PNAS, 112 (36): 11211-16 (2015); Kuppu et al., PLoS Genetics, 11 (9): e1005494 (2015), Kalinowska et al., TAG. Theoretical and Applied Genetics. Theoretische Und Angewandte Genetik, 132 (3): 593-605 (2019)).
동원체 매개 반수체 유도는 또한 여러가지 다른 쌍떡잎식물 종에서도 성공적이었다(Kalinowska et al., TAG. Theoretical and Applied Genetics. Theoretische Und Angewandte Genetik, 132 (3): 593-605 (2019)). 외떡잎 식물에서의 결과는 제한적이며 신뢰할 수 없어(Kelliher et al., Frontiers in Plant Science, 7 (March): 414 (2016)), 외떡잎식물의 경우, 매트릴리닐 시스템이 사용될 것이고, 쌍떡잎식물의 경우, 동원체-매개 반수체 유도가 사용될 것이라는 일반적인 견해로 이어진다(Kalinowska et al., TAG. Theoretical and Applied Genetics. Theoretische Und Angewandte Genetik, 132 (3): 593-605 (2019)).
이에 따라, 임의로 백그라운드 게놈에 대해 하나 이상의 돌연변이의 유도를 위한 동시 유전자 편집과 조합하여, 외떡잎식물 및 그로부터 형성된 반수체에서의 반수체 유도를 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아있다.
동원체 히스톤 3(CenH3)에 대해 이형접합인 외떡잎 식물 및 표적 식물에서 효율적인 동원체-매개된 반수체 유도를 위한 방법에서의 이의 용도가 제공된다. 외떡잎 반수체 유도자 식물은 완전히 기능성인 하나의 CENH3 대립유전자만을 갖는 이배체 식물 세포로 전형적으로 구성된다. 이배체 식물 세포는, 예를 들어, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 CenH3 대립유전자를 또한 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 대립유전자는 단백질 비대립유전자(protein null allele), RNA 비대립유전자, 또는 이들의 조합물이다. 일부 구현예에서, 제1 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 돌연변이되거나, 부분적으로 또는 완전히 결실된다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 정지 코돈을 도입하여, 유전자가 절단된, 비-기능성 단백질을 발현하는 것을 야기하는 프레임시프트(frameshift) 돌연변이이다. 전형적으로, 제2(즉, 다른) 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 온전하다. 기능성 CENH3 단백질은 야생형 CENH3 단백질일 수 있다.
전형적으로, 식물은 야생형 CenH3, CENH3 단백질 변이체, 및 융합 단백질을 인코딩하는 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여되어 있다. 이에 따라, 전형적으로, 식물은 CENH3-녹색 형광 단백질(GFP) 융합 단백질, 예컨대 GFP-tailswap을 인코딩하는 작제물이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, cenh3 널은 단독으로 또는 반수체의 사용을 만드는 다른 기술, 예컨대 합성 아포믹시스(apomixis), 또는 한 계통에서 또 다른 계통으로의 조작된 염색체를 전달하는 것과 조합하여 사용된다.
외떡잎 반수체 유도자 식물은 또한 임의로 유전자 편집 기구, 예컨대 부위-지정 뉴클레아제 및 임의로 외떡잎 식물의 세포에 의해 안정하게 발현되는 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 전형적으로 유전자 편집 기구(예를 들어, 뉴클레아제 및 임의로 가이드 RNA)를 발현하는 작제물은 외떡잎 식물에 의해 안정하게 발현된다. 일부 구현예에서, 부위 지정 뉴클레아제는 CRISPR-기반 시스템, 전사-활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)이며, 이들은 시티딘 데아미나제 또는 아데닌 데아미나제 융합 단백질로서 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 이종의 핵산 작제물은 반수체 유도자 식물의 게놈 내로 통합된다.
일부 구현예에서, 외떡잎 반수체 유도자 식물의 게놈은 뉴클레아제에 의한 절단에 이은 상동성-지향 복구(homology-directed repair; HDR)에 의해 표적 식물의 게놈 내로 도입될 공여체 핵산 서열을 포함한다.
또한 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고, 유전자 편집 기구를 발현하는, 반수체 유도자 식물에 의해 형성된 난자 및 정자 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 난자 세포는 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 12.5% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 갖는다. 일부 구현예에서, 정자 세포는 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 정자 세포에 비해 약 25% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 갖는다.
표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 방법이 또한 제공된다. 방법은 전형적으로 부모 외떡잎 표적 식물을 외떡잎 반수체 유도자 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계 또는 외떡잎 반수체 유도자 식물을 부모 외떡잎 표적 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계를 포함한다. 희석된 양의 CENH3을 갖는, cenh3(즉, 널) 대립유전자를 운반하고 있는 난자 또는 꽃가루가 야생형 계통으로부터의 꽃가루와 수정될 때 반수체가 유도된다. 다음으로, 수분에 의해 생산된 반수체 자손이 선택된다.
외떡잎 표적 식물의 게놈을 변형하는 방법이 또한 제공된다. 방법은 전형적으로 유전자 편집 기구를 발현하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 단계, 외떡잎 반수체 유도자 식물이 아닌 외떡잎 표적 식물의 게놈이 있는 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 반수체 자손의 게놈은 외떡잎 반수체 유도자 식물에 의해 전달되는 부위 지정 뉴클레아제 및 임의로 적어도 하나의 가이드 RNA에 의해 변형되어있다.
방법 중 임의의 것이 추가로 추가적인 단계, 예를 들어, 선택된 반수체 자손의 염색체 배가를 포함할 수 있다. 염색체 배가는 자발적이거나, 예를 들어, 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또다른 항-미소관제로부터 임의로 선택되는 염색체 배가제에 의해 유도될 수 있다.
외떡잎 반수체 유도자 식물은, 예를 들어, 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 반수체 유도자 식물은 옥수수이다.
도 1a-1c는 CRISPR/Cas9에 의한 옥수수 cenh3 널 돌연변이의 생성을 예시한다. 도 1a는 옥수수에서의 게놈 편집을 위한 벡터의 작제를 나타내는 개략도이다. Ubi-Cas9는 옥수수 폴리유비퀴틴 프로모터에 의해 작동되는 코돈-최적화된 Cas9을 포함한다. gRNA-ImmuneCENH3는 2.1 kb의 Cenh3 네이티브(native) 프로모터에 의해 작동되는 Cenh3의 네 번째 엑손을 표적화하는 gRNA 및 절단불가능한 ImmuneCenH3 유전자를 포함한다. TailswapCENH3는 ImmuneCENH3에 기반하지만 변형된 N-말단 꼬리 및 GFP 태그를 포함한다. 도 1b는 CENH3 유전자의 게놈 구조의 표시의 개략도이다. 엑손이 박스 형태로 나타난다. sgRNA의 프로토스페이서 인근 모티프(protospacer adjacent motif; PAM) 및 20 bp 표적 서열(서열번호 16)이 또한 sgRNA의 상보적인 서열/혼성화 세그먼트(서열번호 17)와 정렬되어 또한 나타난다. 도 1c는 cenh3 널 돌연변이 내의 프레임시프트를 나타내는 이형접합 계통으로부터의 서열(서열번호 18-19)의 크로마토그램이다. PAM, 결실, 및 정지 코돈이 예시되어 있다.
도 2a-2f는 식물이 반수체임을 입증하는 검정의 결과를 예시한다. 도 2a 및 2b는 이배체 및 반수체의 유세포분석을 나타내는 플롯이다. 이배체 식물(2a)은 2N 및 4N에서 피크를 나타내며, 여기서 4N은 분화된 조직에서의 내재복제의 결과이다. 반수체 식물은 1N 및 2N 피크를 갖는다(2b). 도 2c 및 2d는 염색체 스프레드(spread)의 이미지이다. 옥수수 이배체는 20개 염색체를 갖고(2c), 반면에 반수체는 10개를 갖는다(2d). 도 2e 및 2f는 식물의 이미지이며: 반수체 식물은 보다 짧은 높이를 갖고(2e), 발휘된 꽃밥 없이는 불임이다(2f).
도 3a 및 3b는 이수체의 분자 핵형을 예시하는 플롯이다. 두 패널의 경우에, 염색체는 최상단을 가로질러 한줄로 나타난다. 도 3a는 gl8 교배로부터 생산된 이수체를 나타낸다. 이수체_1은 3번 염색체에 대해 삼염색체적이고, 이수체_2는 2번 및 4번 염색체에 대해 일염색체적이고 10번 염색체에 대해 삼역색체적이다. 도 3b는 gl1 교배로부터 생산된 이수체를 나타낸다. 이수체_3 및 이수체_4는 7번 염색체에 대해 일염색체적이고, 이수체_5는 3번, 6번 및 7번 염색체에 대해 일염색체적이고, 이수체_6은 1번 염색체를 제외한 모든 염색체에 대해 일염색체적이며, 이수체_7은 9번 염색체에 대해 일염색체적이다. 각각의 시료의 적용범위는 각각의 교배로부터의 관련된 이배체의 적용범위로 정규화되었다.
도 4a는 옥수수에서의 테일스왑-CENH3 유도자 계통을 생성하기에 실패한 전략을 나타내는 흐름도이다. 계통이 반수체를 유도할 것인지 여부를 보기 위해, ImmuneCenH3을 GFP-tailswap 작제물의 옥수수 버전 및 Cenh3의 여러가지 다른 변이체로 바꾸었다. 이러한 CenH3 변이체 중 어느 것도 널을 보완하지 못했다("실패"). 도 4b는 암컷 생식세포 발달 동안 CENH3의 분포를 나타내는 흐름도이다. 암컷 배우체에서 난자의 형성에 선행하는 3회의 세포 분열이 있다. cenh3 널을 운반하고 있는 난자는 12.5% 이하의 CENH3 단백질을 가질 수 있다.
도 5a-5d는 동시 반수체 유도 및 유전자 편집에서의 cenh3 널의 적용을 예시한다. 도 5a는 동시 반수체 유도 및 유전자 편집을 위해 사용되는 CRISPR 작제물의 플라스미드 맵이다. 작제물 성분이 나타나있다. 도 5b 및 5c는 야생형(WT)(5b) 및 영(Young) 이삭 표현형(fea2)(5c) 표현형(Taguchi-Shiobara, et al., Genes Dev. 15: 2755-2766 (2001)으로부터 조정됨, 여기서 fea2 돌연변이 표현형이 처음 기재되었음)의 사진이다. 도 5d는 cenh3 반수체 유도자를 사용하여 수득된 fea2 편집된 반수체 식물에서의 영 이삭 표현형의 사진이다.
정의
용어 "약"은 명시된 값의 위 또는 아래 중 어느 하나의 값을 대략 +/- 10%의 범위로 기재하기 위해 의도된다. 범위는 문맥에 의해 명확해지도록 의도되며, 추가의 제한은 내포되지 않는다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 상세한 설명을 보다 잘 설명하도록 의도되며 달리 청구되지 않는 한 상세한 설명의 범주에 제한을 갖지 않는다.
용어 "식물"은 이의 가장 넓은 범위로 사용된다. 이것은, 이에 제한되지는 않으나, 목본, 관상용 또는 장식용 작물 또는 곡류, 및 과일 또는 채소 식물의 임의의 종을 포함한다. 이것은 또한 식물의 발달의 임의의 단계에 존재하는 구조로 크게 분화되는 복수의 식물 세포를 지칭한다. 이러한 구조는, 이에 제한되지는 않으나, 과일, 싹, 줄기, 잎, 꽃잎 등을 포함한다.
용어 "식물 조직"은, 뿌리, 싹, 잎, 꽃가루, 종자 및 종양에 존재하는 것들, 뿐만 아니라 배양 중인 세포(예를 들어, 단일 세포, 원형질체, 배아, 캘러스 등)을 포함하는 식물의 분화되고 미분화된 조직을 포함한다. 식물 조직은 초목(planta)에, 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양에 있을 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "식물 부분"은 식물 구조, 식물 기관, 또는 식물 조직을 지칭한다.
용어 "식물 재료"는 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 과일, 꽃가루, 난자 세포, 접합자, 종자, 삽수(cutting), 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 임의의 다른 부분 또는 생산물을 지칭한다.
용어 "식물 기관"은 식물의 뚜렷하고 눈에 띄게 구조화되고 분화된 부분, 예컨대 뿌리, 줄기, 잎, 꽃봉오리, 또는 배아를 지칭한다.
용어 "식물 세포"는 원형질체 및 세포벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 지칭한다. 식물 세포는 단리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태로, 또는 보다 상위의 조직된 단위의 일부, 예컨대, 예를 들어, 식물 조직, 식물 기관, 또는 전체 식물로서 있을 수 있다.
용어 "식물 세포 배양물"은 식물 단위의 배양물, 예컨대, 예를 들어, 다양한 발달 단계의 배아, 원형질체, 세포 배양 세포, 식물 조직의 세포, 꽃가루, 꽃가루 관, 밑씨(ovule), 배낭 및 접합체를 지칭한다.
용어 "트랜스제닉(transgenic) 식물"은 이 유형의 식물 또는 나무에서 일반적으로 발견되지 않고 인간 조작에 의해 문제의 식물 내로(또는 식물의 전구체 내로) 도입된 재조합 유전 물질을 함유하는 식물 또는 나무를 지칭한다. 이에 따라, 재조합 DNA가 형질전환에 의해 도입된 식물 세포로부터 성장한 식물은 도입된 전이유전자(유성 또는 무성으로 생산된)를 함유하는 식물의 모든 자손과 마찬가지로 트랜스제닉 식물이다. 용어 트랜스제닉 식물은 전체 식물 또는 나무 및 식물 또는 나무의 부분, 예를 들어 곡물, 종자, 꽃, 잎, 뿌리, 과일, 꽃가루, 줄기 등을 아우르는 것으로 이해된다.
용어 "작제물"은 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 유전적 분자를 지칭한다. 숙주 유기체에서의 전이유전자 발현을 위해 사용된 유전적 작제물은 5'-3' 방향으로, 프로모터 서열; 관심 유전자를 인코딩하는 서열; 및 종결 서열을 포함한다. 작제물은 또한 선택가능한 마커 유전자(들) 및 다른 발현을 위한 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 이의 주형 또는 메신저 RNA를 통해 특이적 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질에 특징적인 아미노산의 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. 용어 "유전자"는 또한 RNA 생산물을 인코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. 게놈 DNA와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 유전자는 개재, 비암호화 영역 뿐만 아니라 조절 영역을 포함하고 5' 및 3' 단부를 포함할 수 있다.
용어 "이종상동성 유전자" 또는 "이종상동성"은 이들이 종분화 사건에 의해 분리되었기 때문에 유사한 핵산 서열을 갖는 유전자를 지칭한다.
용어 "폴리펩티드"는 약 10개 초과의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 일반적으로 지칭한다. 폴리펩티드는 "외인성"일 수 있는데, 이는 이들이 "이종성", 즉, 박테리아 세포에 의해 생산된 인간 폴리펩티드와 같이 이용된 숙주 세포에 이질적임을 의미한다.
용어 "단리된"은 화합물이 자연적으로 발생하는 것과 상이한 환경에 있는, 예를 들어, 예컨대 펩티드를 자연에서 발견되지 않는 농도로 농축함으로써 이의 자연 환경으로부터 분리된 관심 화합물(예를 들어, 핵산)을 기재하는 것을 의미한다. "단리된"은 관심 화합물로 실질적으로 풍부하고/하거나 관심 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 샘플 내에 있는 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 단리된 핵산은 다른 연관된 성분으로부터 적어도 60% 무함유, 바람직하게는 75% 무함유, 및 가장 바람직하게는 90% 무함유이다. "단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 대개는 천연 공급원과 연관된 적어도 하나의 오염물 핵산 분자로부터 식별되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산은, 예를 들어, 자연적으로 연관된 모든 성분과의 연관이 없을 수 있다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태나 환경이 아니다.
용어 "유전자좌"는 염색체 또는 DNA 서열을 따른 특이적인 위치를 지칭한다. 맥락에 의존하여, 유전자좌는 유전자, 마커, 염색체 띠 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 특이적 서열일 수 있다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 2개 이상의 대안적인 형태 중 하나를 지칭한다.
용어 "벡터"는 삽입된 세그먼트(segment)의 복제를 발생시키기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 또는 코스미드를 지칭한다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다.
용어 "발현 제어 서열"은 또다른 DNA의 전사 및/또는 번역을 제어하고 조절하는 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 작동유전자 서열, 리보솜 결합 부위 등을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
용어 "프로모터"는, 다양한 요소와 함께, 유전자 또는 단백질 코딩 서열의 발현을 조절하는 역할을 하는 유전자 또는 단백질 코딩 서열의 상류(5')에 전형적으로 위치한 조절 핵산 서열을 지칭한다. 본 개시내용의 작제물에서 사용하기에 적합한 프로모터는 개시된 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 사용되는 식물에서 및 숙주 유기체에서 기능성이다. 많은 식물 프로모터가 공공연히 공지되어 있다. 이들은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직- 및 세포-특이적 프로모터 및 발달을 조절하는 프로모터를 포함한다. 예시적인 프로모터 및 융합 단백질은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,717,034에 기재되어 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 통합된다.
핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드는 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우, 인접하고 판독 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 성취될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 링커가 관행에 따라 사용된다.
용어 "형질전환된”,"트랜스제닉", "형질감염된" 및 "재조합"은 이종의 핵산 분자가 도입된 숙주 유기체, 예컨대 박테리아 또는 식물을 지칭한다. 핵산 분자는 숙주의 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있거나 핵산 분자는 염색체외 분자로서 또한 존재할 수 있다. 이러한 염색체외 분자는 자가-복제될 수 있다. 형질전환된 세포, 조직, 또는 식물은 형질전환 과정의 최종 생산물 뿐만 아니라, 이의 트랜스제닉 자손을 아우르는 것으로 이해된다. "비-형질전환된","비-트랜스제닉" 또는 "비-재조합" 숙주는 이종의 핵산 분자를 함유하지 않는 야생형 유기체, 예컨대 박테리아 또는 식물을 지칭한다.
핵산과 관해 용어 "내인성"은 숙주 내에 일반적으로 존재하는 핵산을 지칭한다.
용어 "이종"은 그들이 일반적으로 발견되지 않는 곳에서 발생하는 요소를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 이종의 핵산 서열, 예를 들어, 일반적으로 프로모터에 작동가능한 것으로 발견되지 않는 서열에 연결될 수 있다. 프로모터 요소를 기재하기 위해 본원에서 사용될 때, 이종은 서열, 종, 또는 수 중 어느 하나에서 네이티브 프로모터에서 정상적으로 발견되는 것과 상이한 프로모터 요소를 의미한다. 예를 들어, 프로모터 서열 내의 이종의 제어 요소는 프로모터 제어를 강화하기 위해 추가된 상이한 프로모터의 제어/조절 요소, 또는 동일한 프로모터의 추가적인 제어 요소일 수 있다. 이에 따라 용어 "이종"은 또한 "외인성" 및 "비-네이티브" 요소를 아우를 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동"은 동일한 종으로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 상동의 형질은 공통의 조상으로부터 유래된 유기체의 임의의 특징이다. 상동 서열은 이종상동성 또는 직렬상동성(paralogous)일 수 있다. 상동 서열은 그들이 종분화 사건에 의해 분리된 경우 이종상동성이고: 종이 2개의 분리된 종으로 갈라질 때, 결과적인 종에서 단일 유전자의 갈린 사본을 이종상동성이라고 한다. 이종상동성, 또는 이종상동성 유전자는, 그들이 공통 조상으로부터 유래했기 때문에 서로 유사한 다른 종에서의 유전자이다. 상동 서열은 그들이 유전자 복제 사건에 의해 분리된 경우 직렬상동성이고; 유기체 내의 유전자가 동일한 게놈 내의 2가지 상이한 위치를 차지하도록 복제된 경우, 그러면 2개의 사본은 직렬상동성이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드"는 약 10개 초과의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 일반적으로 지칭한다. 폴리펩티드는 "외인성", 예컨대 박테리아 세포에 의해 생산된 인간 폴리펩티드일 수 있는데, 이는 이들이 "이종", 즉, 이용된 숙주 세포에 이질적임을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "품종"은 재배된 변종을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생식질"은 세대 간에 유전될 수 있는 하나 이상의 표현형 특징, 또는 상기 하나 이상의 표현형 특징을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조상"은 식물이 유래된 종, 변종, 품종, 또는 생식질 중 임의의 어느 하나를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "파생 종, 생식질 또는 변종"은 표준 유성 교잡, 재조합 DNA 기술, 조직 배양, 돌연변이유발 또는 임의의 하나 이상의 상기 절차의 조합을 사용하여, 언급된 종, 변종, 품종, 또는 생식질을 사용하여 생산된 임의의 식물 종, 생식질 또는 변종을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자이입(introgression)", "유전자이입된" 및 "유전자 이입하는 것"은 하나의 종, 변종 또는 품종의 하나의 유전자가 이들 종을 교배시킴으로써 또다른 종, 변종 또는 품종의 게놈 내로 움직이는 자연적 및 인공적 과정 둘 다를 지칭한다. 과정은 임의로 반복친과 역교배시킴으로써 완료될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "식물 부분" 또는 "식물의 부분"은, 이에 제한되지는 않으나, 삽수, 세포, 원형질체, 세포 조직 배양물, 캘러스(캘러스들), 세포 덩어리, 배아, 수술, 꽃가루, 꽃밥, 암술, 난자, 꽃, 종자, 꽃잎, 잎, 줄기, 및 뿌리를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "잡종"은 전형적으로 단일 종 내의 상이한 변종, 생식질, 개체군, 육종 또는 품종 사이의, 종 내의 상이한 아종 사이의, 또는 속 내의 상이한 종 사이의 1회 이상의 교배로부터 유래된다. 전형적으로, 아종 사이의 잡종은 "종내 잡종"으로 지칭되고 속 내의 상이한 종 사이의 잡종은 "종간 잡종"으로 지칭된다.
본원에서 값의 범위의 열거는 단지, 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 분리된 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 역할을 하도록 의도된 것이며, 각각의 분리된 값은 이들이 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다.
용어 "약"의 사용은 명시된 값의 위 또는 아래 중 어느 하나의 값을 대략 +/- 10%의 범위로 기재하기 위해 의도되며; 다른 형태에서 값은 언급된 값의 대략 +/- 5%의 범위의 위 또는 아래 중 어느 하나의 값의 범위일 수 있고; 다른 형태에서 값은 언급된 값의 대략 +/- 2%의 범위의 위 또는 아래 중 어느 하나의 값의 범위일 수 있으며; 다른 형태에서 값은 언급된 값의 대략 +/- 1%의 범위의 위 또는 아래 중 어느 하나의 값의 범위일 수 있다. 선행하는 범위는 문맥에 의해 명확해지도록 의도되며, 추가의 제한은 내포되지 않는다.
개시된 방법 및 조성물의 생산물을 위해 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이의 제조 시 사용될 수 있거나, 또는 이의 생산물인 재료, 조성물, 및 성분이 개시된다. 이들 및 기타 재료가 본원에 개시되어 있고, 이들 재료의 조합, 하위집합, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합물 및 순열의 특정한 참조가 명시적으로 개시되지 않을 수 있는 동시에, 각각은 구체적으로 본원에서 고려되고 기재된다는 사실이 이해된다. 예를 들어, 리간드가 개시되고 논의되고 리간드를 포함하는 많은 분자에 이루어질 수 있는 많은 변형이 논의되는 경우, 구체적으로 반대로 나타내지 않는 한, 리간드의 각각의 및 모든 조합 및 순열 및 가능한 변형이 특이적으로 고려된다. 이에 따라, 분자 A, B, 및 C의 부류가 개시될 뿐만 아니라, 분자 D, E, 및 F 및 조합 분자 A-D의예가 개시된 경우, 그러면 각각이 개별적으로 나열되지 않더라도, 각각은 개별적으로 및 집합적으로 고려된다. 이에 따라, 이 예에서, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F의 각각은 특이적으로 고려되며 A, B, 및 C; D, E 및 F; 및 예시 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시된다고 간주되어야 한다. 마찬가지로, 임의의 이들의 하위집합 또는 조합이 또한 특이적으로 고려되고 개시된다. 이에 따라, 예를 들어, A-E, B-F, 및 C-E의 하위-그룹은 특이적으로 고려되며 A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 예시 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시된다고 간주되어야 한다. 추가로, 상기와 같이 고려되고 개시된 각각의 재료, 조성물, 성분 등은 또한 이러한 재료의 임의의 그룹, 하위그룹, 목록, 세트 등으로부터 특이적으로 및 독립적으로 포함되거나 배제될 수 있다.
이들 개념은, 이에 제한되지는 않으나, 개시된 조성물의 제조 및 사용 방법의 단계를 포함하여 본 출원의 모든 양태에 적용된다. 이에 따라, 수행될 수 있는 다양한 추가적인 단계가 있는 경우, 이들 추가적인 단계의 각각은 개시된 방법의 임의의 특정한 구현예 또는 구현예의 조합으로 수행될 수 있고, 이러한 각각의 조합은 특이적으로 고려되며 개시된 것으로 간주되어야 한다는 사실이 이해된다.
본원에 기재된 모든 방법은 달리 나타나거나 문맥에 의해 달리 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 구현예를 보다 잘 설명하도록 의도되며 달리 청구되지 않는 한 구현예의 범주에 제한을 갖지 않는다. 명세서 내의 어떤 언어도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
II. 식물
반수체 식물은 새로운 근교 계통의 생산을 가속화하기 위해 널리 사용된다. 반수체 유도는 기여하는 게놈 중 하나의 상실에 따르는 일시적인 이배체 상태를 수반한다. 이 메커니즘은 또한 유전자 편집 기구를 유전자형-독립적인 방식으로 표적 계통의 안정한 형질전환 없이 도입하는 것을 가능하게 만든다.
개시된 방법은 동원체 히스톤 H3 유전자의 단순한 널 돌연변이를 이용한다. 하기의 실시예에서 제시된 결과는 이형접합 cenh3 널 식물이, 암컷으로서 교배될 때 5%의 빈도로 및 수컷으로서 교배될 때 0.5%의 빈도로 반수체를 형성함을 나타낸다. 반수체 유도의 메커니즘은 접합자에서 염색체의 순차적인 상실을 수반한다. 개시된 식물 및 이의 사용 방법은 또한 유전자 편집 기구를 간단하고, 신속하고, GMO-없는 방식으로 임의의 계통에 도입하는 것을 가능하게 만든다.
옥수수 유전자 명명법은, 돌연변이 대립유전자는 첫 글자가 소문자인 일반 또는 이탤릭체 작은 글꼴로 표현되고(예를 들어, cenh3), 야생형 유전자는 첫 글자가 대문자인 일반 또는 이탤릭체 글꼴(예를 들어, CenH3)로 표현되며, 발현된 단백질 생산품은 모두 대문자로 작성(CENH3)된다는 사실을 제공한다. 하기에 기재된 실험이 옥수수에서 수행되었으므로, 본원에서는 옥수수 명명법을 일반적으로 따른다. 그러나, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 다른 외떡잎 식물의 상응하는 유전자에서도 또한 적용가능하고 또한 이에 따라 이에 대해 개시되며, 이에 따라 이 명명법의 사용은 개시된 조성물 및 방법을 옥수수 단독으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 됨이 인식될 것이다.
개시된 반수체 유도 방법은 전형적으로 반수체 유도자 계통과 반수체를 생성하도록 유도될 표적 계통 사이의 교배를 포함한다.
개시된 유전자 편집 방법은 전형적으로 유전자 편집 기구를 포함하는 반수체 유도자 계통과 또한 유전자 변형의 표적이기도 한 반수체를 생성하도록 유도될 표적 계통 사이의 교배를 포함한다. 생체 내 반수체 유도 과정은 편집 기구를 반수체 유도자 부모에 이것을 포함시킴으로써 표적 생식질 내로 도입하도록 끌어들여진다. 전형적으로 편집 기구는 전이유전자로서 안정하게 혼입된다. 동시 편집 더하기 반수체 유도는 원연 교배(wide cross) 또는 처음부터(de novo)의 반수체 유도를 통해 다양한 외떡잎식물에서 수행될 수 있다.
전형적으로, 본원에 개시된 교배에서 이용된 하나 이상의 식물, 및/또는 이로부터 생성된 자손은 비-자연발생적 식물이다. "비-자연발생적 식물"은 인간의 개입 없이는 자연에서 일어나지 않는 식물을 지칭한다. 비-자연발생적 식물은 트랜스제닉 식물 뿐만 아니라 비-트랜스제닉 수단, 예컨대 식물 육종에 의해 생산된 식물을 포함한다.
A. 표적 계통
유도될 표적 계통은 전형적으로 외떡잎식물이다. 외떡잎식물은 속씨식물(혈관 내에서 종자가 보호되는 꽃이 피는 식물)의 큰 부문 중 하나를 포함한다. 그들은 평행맥의 잎이 있는 초본 식물이며 두 개의 떡잎이 있는 배아를 갖는 쌍떡잎 식물(쌍자엽식물)과 달리, 단일의 떡잎이 있는 배아를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 계통은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마로부터 선택되는 외떡잎식물이다.
표적 계통은 전형적으로 새로운 근교 계통의 생산을 전형적으로 가속하기 위해 반수체 식물을 갖는 것이 바람직한 것이다. 일부 구현예에서, 표적 계통은 광범위한 육종이 이미 수행된 엘리트 근교 계통이지만, 예를 들어, 질병 또는 해충 문제에 저항성이 있거나 다른 환경에 더 잘 적응하도록 계통을 개선하기 위해 유전적 변형이 필요하다.
B. 유도자 계통
임의로 유전자 편집 기구를 발현하는 유도자 식물 계통이 제공된다. 유도자 계통은 또한 외떡잎식물, 예를 들어, 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마이다.
표적 및 유도자 계통은 전형적으로 유성으로 생식하는 2개의 식물 계통 둘 다일 수 있다. 다른 구현예에서, 교배는 정상적으로 서로 유성으로 생식하지 않는 관련된 종 또는 속 사이의 종간 및 속간 잡종 교배이다. 이들 교배는 또한 원연 교배로 지칭될 수 있다. 밀, 벼, 보리, 배추속 식물, 및 기타 작물에서, 반수체 유도에의 경로는 원연 교배를 통해 반수체를 유도하는 꽃가루 공여체를 사용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 밀에 옥수수 꽃가루를, 밀에 기장 꽃가루를, 다른 보리 종에 보리 꽃가루를, 또는 임의의 다른 원연 교배 방법을 사용할 수 있다.
하기에서 보다 상세히 논의될 바와 같이, 유도자 식물은 이형접합 cenh3 널이며 임의로 유전자 편집 기구를 포함한다.
1. cenh3 널
유도자 식물은 이형접합 cenh3 널이다.
다양한 외떡잎 식물에서 CenH3에 대한 유전자 위치 및 서열을 제공하는 예시적인 진뱅크(GenBank) 수탁 번호는: 옥수수, AF519807.2; 벼, AY438639.1; 밀, JF969287.1; 보리, JF419329.1; 바나나 KP878235.1을 포함하며, 각각은 그 전문이 참조로 통합되고, CENH3에 대해 다음의 아미노산 및 핵산(mRNA/cDNA) 서열을 제공한다:
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Cenh3 유전자는 일부 곤충 계통에서의 약간의 예외와 함께 모든 식물, 진균, 및 동물에 걸쳐 보존되어 있다. 이것은 기능성 동원체의 경계를 정의하고, 키네토코어(kinetochore)를 개시하고 구성하는 근본적으로 중요한 역할을 한다(Cheeseman 및 Desai, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 9:33-46 (2008). CENH3 야생형은 외떡잎식물 유도자 식물, 예를 들어, 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마의 CENH3일 수 있다. 일부 구현예에서, 야생형 CENH3은 서열번호 20, 22, 24, 26, 또는 28 중 임의의 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; 서열번호 21, 23, 25, 27, 또는 29 중 임의의 어느 하나의 핵산, 이에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 인코딩되며; 상동체, 예컨대 앞서 말한 서열의 이종상동체 또는 직렬상동체; 또는 이들의 임의의 조합이다.
널 대립유전자는 유전적 돌연변이에 의해 야기되는 비기능성 대립유전자이다. 이러한 돌연변이는 연관된 유전자 생산물의 생산의 완전한 결여 또는 적절하게 기능하지 않는 생산물을 야기할 수 있고; 둘 중 어느 하나의 경우에서, 대립 유전자는 비기능성인 것으로 간주된다. 예를 들어, CENH3 단백질은 DNA에 결합하여 식물 세포에서 염색체 분리를 매개하는 키네토코어를 형성하는 모든 상위 단백질을 모집한다. 비-기능성 CENH3은 식물 세포에서 동원체의 형성, 키네토코어 형성, 및/또는 염색체 분리에 공여하지 않을 것이다. 비 기능성 단백질을 인코딩하는 널은 CENH3 변이체, 예컨대 GFP-tailswap 또는 변경되거나 부분적으로 결실된 CENH3 단백질을 생산하는 변이체와 구별된다. 예를 들어, Kuppu, et al., "A Variety of Changes, Including CRISPR/Cas9-mediated Deletions, in CENH3 Lead to Haploid Induction on Outcrossing", Plant Biotechnol J, 2020, doi: 10.1111/Pbi.13365를 참조하며, 이의 전문은 특이적으로 본원에 참조로 통합된다. GFP-tailswap 및 변이체 형태는 네이티브 CENH3을 치환할 수 있으며 불완전하지만, 키네토코어를 조직하는 충분한 기능을 유지할 수 있다. 널 대립유전자는 기능의 모든 상실을 야기하는 돌연변이의 특별한 카테고리이다.
어떤 RNA 전사체도 생산하지 않는 돌연변이 대립유전자는 RNA 널이라고 불리며(노던 블롯팅, 총 RNA 시퀀싱에 의해, 또는 결실 대립유전자의 DNA 시퀀싱에 의해 나타남), 어떤 단백질도 생산하지 않는 것은 단백질 널이라고 불린다(웨스턴 블롯팅에 의해 나타남). 널은 프레임시프트 돌연변이에 의해 자주 야기된다. 임의의 서열이 3개의 프레임에서 판독될 수 있도록 유전자 코드가 뉴클레오티드의 삼중항으로 판독되며, 단지 하나만 정확하다. 뉴클레오티드의 작은 결실 또는 부가를 야기하는 돌연변이는 무의미한 단백질로 판독 프레임을 이동시킬 수 있고 종종 단백질 번역이 조기에 중단되는 것을 야기할 수 있다. 특히 예측된 단백질의 대부분이 부재할 때, 조기 중단을 야기하는 프레임시프트 돌연변이는 일반적으로 비대립유전자로서 해석된다. 예를 들어, CENH3의 N-말단 꼬리 중에 정지 코돈을 야기하는 프레임시프트 돌연변이는 DNA 또는 다른 히스톤에 결합할 수 있는 능력이 결여된 심하게 절단된 단백질을 인코딩한다(도 1c). 유전적 널 또는 무정형 널은 동형접합일 때, 문제의 유전자좌를 파괴하는 결함이 있는 이형접합일 때와 같은 표현형을 갖는다. 유전적 비대립유전자는 단백질 널 및 RNA 널 둘 다일 수 있지만, 또한 돌연변이로 인해 비기능성인 유전자 생산물의 정상적인 수준을 발현할 수 있다. cenh3 비대립유전자는 cenh3 유전자 생산물의 생산의 결여 또는 적절히 기능하지 않는 생산물로 이어지는, 전체 유전자좌의 결실 또는 그들 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이일 수 있다. cenh3 비대립유전자는 RNA 널, 단백질 널, 또는 둘 다일 수 있다.
개시된 cenh3 널의 비대립유전자는 GFP-tailswap 작제물 및 Cenh3의 여러가지 변이체, 예컨대 미국 특허 번호 8,618,354, 미국 공개 출원 번호 2018/0116141, 미국 공개 출원 번호 2019/0343060, 및 WO 2017/004375에 기재된 것들과 전형적으로 구별가능하며, 이들은 야생형 cenh3 대립유전자에 비해 기능이나 수준이 감소되거나 변경되기는 하지만 기능성인 CENH3 변이체 단백질을 생성한다.
일부 구현예에서, cenh3 널을 운반하는 정자는 기능성(예를 들어, 야생형) CENH3 단백질의 정상적인 양의 25% 이하를 갖고 cenh3 널을 운반하는 난자는 기능성(예를 들어, 야생형) CENH3 단백질의 12.5% 초과를 갖는다.
일부 구현예에서, 이형접합 cenh3 널 유도자 계통은 재조합 유전자 발현 돌연변이 또는 변이체 CENH3을 포함하지 않는다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 널은 비-내인성 CENH3 발현에 의해 보완되지 않는다. 일부 구현예에서, CENH3 단독의 정량적인 감소는 동원체-매개 반수체 유도를 유도한다.
일부 구현예에서, 이형접합 cenh3 널 유도자 계통에서 기능성 CENH3만이 이형접합 cenh3 널의 내인성 야생형 대립유전자로부터 발현된다.
cenh3 널을 만들기 위한 비-제한적인 방법은 하기에 기재된다. 요약하면, Cas9을 함유하는 트랜스제닉 계통을 CenH3의 첫 번째 엑손을 표적하는 가이드 RNA 뿐만 아니라, 가이드 RNA 부위에 대해 5개의 침묵 뉴클레오티드 변화를 함유하는 CenH3의 온전한 전-장 게놈 클론을 함유하는 또다른 트랜스제닉 계통과 교배시킨다(도 1a-1c; 절단불가능한 유전자는 ImmuneCenH3으로 지칭된다). 이들 작제물을 함유하는 계통이 함께 교배되었을 때, Cas9은 네이티브 cenh3를 돌연변이시켰고, 동시에 CenH3 기능은 ImmuneCenH3 유전자에 의해 커버되었다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 비대립유전자는 비대립유전자로부터 기능성 단백질의 발현을 폐지하는 첫 번째 엑손에서 하나 이상의 돌연변이(들)을 갖는다. 일부 구현예에서, 널은 DNA 또는 다른 히스톤과 상호작용하는 모든 CENH3 단백질 서열을 제거하는 N-말단 꼬리를 인코딩하는 서열 내의 돌연변이에 의해 야기된다.
각각의 세포 분열에서, CENH3은 S기에서 복제된 DNA 가닥 사이에서 자연적으로 균등하게 분할되고 나중에 G2에서 보충된다(Lermontova et al., The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology, 68 (1): 40-50 (2006)). 이것은 cenh3에 대해 널인 반수체 세포에서는 일어날 수 없으며, 세포 주기는 정상적으로 존재하는 것보다 절반의 CENH3으로 진행되어야만 한다. 수컷 배우체(꽃가루)에서 정자의 형성에 선행하여 2회의 세포 분열이 있고, 암컷 배우체에서 난자의 형성에 선행하여 3회의 세포 분열이 있다. cenh3 널을 운반하는 정자는 CENH3의 정상적인 양의 25% 이하를 가질 수 있고 cenh3 널을 운반하는 난자는 12.5% 이하를 가질 수 있다(도 4b). 결과는 또한 cenh3 널을 운반하는 수컷으로부터의 자손의 0.5%가 반수체이고, 암컷으로부터의 자손의 5.0%가 반수체임을 나타낸다. 이에 따라, 유도자는 교배의 수컷 또는 암컷 중 어느 하나로서 사용될 수 있다. 암컷 유도자가 보다 높은 백분율의 반수체를 생성하며, 이에 따라, 일부 구현예에서, 반수체 유도자는 바람직하게는 암컷이지만, 대안적으로, 방법은 수컷으로서 반수체 유도자를 사용하여 수행될 수 있다.
2. 마커
반수체 유도자는 반수체인 종자를 식별하는 데에 도움을 줄 수 있는 마커를 가질 수 있다. 예를 들어, 반수체 유도자는 우성 보라색 색소 유전자(예를 들어, R1-nj)을 가질 수 있다. 반수체 개체의 종자는 보라색 호분을 갖지만, 배유(배반) 중에 보라색 색소가 결여되어 있는데, 이는 생식세포계열이 반수체 유도자 염색체를 함유하지 않음을 나타낸다. 노란색 배유 및 보라색 호분을 갖는 종자를 심어 묘목이 되도록 성장시킨다. 이들 묘목은 콜히친 또는 하기에 보다 상세히 논의될 다른 방법을 사용하여 그들의 배가된 염색체 수를 갖는다. 염색체 배가된 반수체는 온실에서 성장하고 하거나 밭에 옮겨심겨지며, 염색체 배가된 식물은 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이 자가-수분하여 배가된 반수체 종자를 생산한다.
3. 유전자 편집 기구
유도자 계통은 또한 임의로 유전자 편집 기구를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유도자 식물은 표적 식물의 게놈에서 편집을 성취하기 위해 필요한 기구를 이의 DNA 내로 인코딩할 수 있다.
표적화된 돌연변이유발(또한 유전자 편집으로도 공지됨)은 작물 육종에 매우 중요한 기술이다. 현재 CRISPR, TALEN, 메가뉴클레아제, 및 징크 핑거를 포함하여 특이적인 유전자 표적을 편집하는 수많은 방법이 있다. 엔도뉴클레아제는 거의 모든 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다. 엔도뉴클레아제(들)은 방법, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, Svitashev, et al., Plant Physiology, 169: 931-945 (2015), Lee, et al., Plant Biotechnology, 17(2):362-372 (2019)), Sander et al., Nature Met, 8(1):67-69, (2011), Cermak et al., Nucl Acids Res, 39(17):7879 (2011); Nucl Acids Res, 39:e82. doi: 10.1093/nar/gkr218, 2011에서 교정됨), 및 Liang et al., et al., J Genet Genom, 41(2):63-68, (2014)에 의해 기재된 것을 사용하여 작제될 수 있다. 엔도뉴클레아제의 발현을 작동시시키 위해 사용되는 프로모터는 발생 전반에 걸쳐 또는 구체적으로 난자 세포에서 또는 초기 배아 발생 동안 발현되는 것일 수 있고, 내인성 또는 외인성일 수 있다. 프로모터 35S(CaMV d35S) 또는 유도자(예를 들어 이중 35S)의 예 ZmUb1(옥수수) APX(벼) OsCc1(벼) EIF5(벼) R1G1B(벼) PGD1(벼) Act1(벼) SCP1(벼).
유전자 편집 기구 작제물(들)은 선택가능한 마커(예를 들어, 제초제 저항성)을 포함하여 전체 식물 형질전환 및 후속의 역교배 동안 전이유전자를 회복하는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의(예를 들어, 2개 이상의, 또는 3개 이상의) 엔도뉴클레아제 및/또는 CRISPR 가이드 RNA가 하나의 DNA 또는 이의 서열을 표적화하도록 단일 작제물 내로 조합될 수 있다.
편집 기구를 식물 내로 도입하는 하나의 방법은 식물 조직 상에서의 아그로박테리움-기반 방법(예컨대 Ishida et al., Nature Biotechnol, 146:745-750 (1996)에 의해 기재된 방법) 또는 유전자총(예컨대 Gordon-Kamm et al., Plant Cell Online, 2(7):603-618 (1990)에 의해 기재된 방법)을 사용하는 것이다. 발달 조절자 유전자를 포함하는 새로운 방법이 고안되어 광범위한 조직 배양 없이 식물을 형질전환시키는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, Lowe, et al., The Plant Cell, 28: 1998-2015 (2016)을 참조한다. 형질전환에서, 편집 기구(예를 들어, CAS9 및 가이드 RNA)를 암호화하는 DNA가 식물 캘러스, 종자 또는 배아 조직 내로 도입된다. 안정하게-형질전환된 식물(사건)은 임의로 선택가능한 마커의 도움으로 그후에 회복된다.
대안적으로, 형질전환이 가능한 계통이 먼저 유전자 편집 기구로 형질전환되고, 결과적인 계통이 그후에 반수체 유도자 계통과 교배된다. cenh3에 대해 이형접합인 결과적인 F1은 그 자체가 반수체 유도자가 된다. 추가적인 역교배는 필요하지 않다. 이 경우에, F1 반수체 유도자 계통은 엔도뉴클레아제 전이유전자를 함유한다. 다음으로, 유전자 편집 기구를 운반하는(예를 들어, 인코딩하는, 발현하는 등) 유도자 계통은 편집될 제2 식물에 의해 수분될 수 있다. 이 수분 사건으로부터, 자손(예를 들어, 배아 또는 종자)이 생산되고; 이 중 적어도 하나는 반수체 종자가 될 것이다. 이 반수체 종자는 제2 식물의 염색체만을 함유할 것이며; 유도자 식물의 염색체는 사라졌지만(제거, 상실 또는 분해됨), 그렇게 하기 전에, 유도자 식물의 염색체는 유전자 편집 기구가 발현되도록 허용하였다.
대안적으로, 및 이론에 구속되지 않고, 유도자 식물은 이미-발현된 편집 기구를 수분 시에 꽃가루 관을 통해 전달한다. 또는, 반수체 유도자 계통이 교배 시 암컷인 경우, "야생형" 또는 비-반수체 유도 화분립과의 수정 시 반수체 유도 식물의 난자 세포는 존재하고 아마도 이미 발현되었을 편집 기구를 함유한다. 이들 경로 중 임의의 것을 통해, 교배에 의해 수득된 반수체 자손 또한 이의 게놈이 편집되어 있을 것이다. 많은 교배가 단일 수컷 식물과 이루어질 수 있는 옥수수의 경우, cenh3 널 및 유전자 편집 기구를 함유하는 F1은 다수의 분리된 교배를 만듦으로써 다수의 계통을 편집하기 위해 사용될 수 있다.
유전자 편집 기구는 전형적으로 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 요소 또는 요소들을 포함한다. 에를 들어, 편집 기구는 임의의 DNA 변형 효소일 수 있지만, 바람직하게는 부위-지정 뉴클레아제이다. 부위-지정 뉴클레아제는 바람직하게는 CRISPR-기반의 것이지만, 메가뉴클레아제, 전사-활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 뉴클레아제일 수 있다. 뉴클레아제는, 예를 들어, Cas9 또는 Cfp1/Cas12a일 수 있다. 일 양태에서, 뉴클레아제는 표적 부위에서 작은 결실 또는 복제를 생성할 목적으로 DNA를 절단하도록 설계된다. 결과적인 작은 결실 및 복제는 유전자 기능을 넉아웃(knock out)시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, DNA 변형 효소는 부위-지정 기반 편집 효소, 예컨대 Cas9-시티딘 디아미나아제 또는 Cas9-아데닌 디아미나아제이며, 여기서 Cas9은 불활성화된 이의 뉴클레아제 활성 중 하나 또는 둘 다, 즉, dCas9을 가질 수 있다.
여전히 또 다른 구현예에서, 유전자 편집 기구는 절단 후 상동성-지향 복구(HDR)이 이어져, 표적 부위에서 DNA의 변형 또는 대체를 초래하도록, 추가적인 복구 주형과 조합될 수 있다. 이 맥락에서 반수체 유도자의 목표는 조직 배양 단계 또는 반복된 역교배를 통과하지 않고 형질전환가능한 계통에서 임의의 다른 계통 내로 유전자 편집 기구를 신속하게 전달하는 수단으로서이다.
사용될 수 있는 유전자 편집 기구는 하기에서 보다 상세히 논의된다.
a. 가닥 절단 유도 요소
i. CRISPR/Cas
바람직한 구현예에서, 표적 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 요소는 CRISPR/Cas 시스템이다. 다른 동물 모델 시스템에서처럼, 표적화된 세포 내에서의 Cas9 및 sgRNA 발현은 식물 게놈을 변형시키기에 충분하다(Deepa, et al., Front. Plant Sci., 9:985 (2018), doi:10.3389/fpls.2018.00985. Cas9이 일반적으로 사용되는 반면, 임의의 CRISPR/Cas-기반 시스템, 예를 들어, Cfp1/Cas12a가 유사한 방식으로 사용될 수 있다(Tang, et al., Genome Biology, 19(84) (2018), doi/10.1186/s13059-018-1458-5). 매우 유용한 RNA 폴리머라아제 II 프로모터(예컨대 35S 또는 ZmUb1)는 종종 Cas 유전자를 발현하기 위해 사용되지만, 난자 세포에서 발현하는 프로모터는 현재의 적용법에 보다 적용가능할 수 있다. 식물-특이적 RNA 폴리머라아제 III 프로모터[AtU6(애기장대); TaU6(밀); OsU6 또는 OsU3(벼)]가 식물 시스템에서 sgRNA를 발현하기 위해 사용되어 왔다. 다른 구현예는 다른 프로모터에 의해 작동되는 다중화 가이드 RNA 시스템을 수반할 수 있다(Lowder, et al., Plant Physiol., 169(2): 971-985 (2015), He, et al., J Genet Genomics, 20; 44(9): 469-472 (2017)). Cas 유전자는 완전히 기능성일 수 있고 비-상동 말단 봉합(non-homologous end joining; NHEJ)에 의해 복구되는 이중 가닥의 절단을 생성하도록 설계되어 유전자 기능을 넉아웃시키는 돌연변이를 초래할 수 있다. 대안적으로 Cas는 단일 가닥의 닉(nick)을 야기하도록 부분적으로 불활성화될 수 있거나(예를 들어, nCas9), 또는 완전히 불활성화되어(예를 들어, dCas9) 결합하고 절단되지 않고, 단순히 또 다른 효소, 예컨대 아데닌 또는 시티딘 디아미나아제를 바람직한 부위로 지시할 수 있다(Eid, et al., Biochem J, 475 (11): 1955-1964 (2018)). 식물 시스템에서 Cas9 또는 Cas9 변이체 및 gRNA를 발현하기 위한 여러가지 상업적으로 이용가능한 벡터가 있으며, 식물 RNA 폴리머라아제 III 프로모터를 갖는 빈 gRNA 백본(backbone) 및 수행자가 관심있는 gRNA를 삽입할 수 있는 gRNA 스캐폴드(scaffold)를 포함한다. CRISPR-기반 시스템은 또한 하기에 기재된 바와 같이, 상동성-지향 복구에 의해 유전자를 변경하기 위해 조정될 수 있다. 한 가지 제약은 CRISPR 적용법이 짧은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM 부위)를 포함하는 서열을 이용한다는 것이다.
유도자 식물의 게놈은 CRISPR 시스템의 성분으로서 Cas 효소 및 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 유도자 식물의 게놈은 임의로 공여체 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하여 표적 세포의 게놈 내로 또는 표적 부위에 인접하여(예를 들어, Cas9에 의해 유도된 단일 또는 이중 가닥 절단의 부위) 재조합될 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템을 사용한 게놈 편집에서의 사용을 위한 조성물을 제조하는 방법은 예를 들어, WO 2013/176772, WO 2014/018423, Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013), 및 Jinek, et al., Science, 337(6096):816-21 (2012)에 상세히 기재되어 있다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 단백질 또는 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분의 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복서열" 및 tracrRNA 처리된 부분의 직접 반복서열을 아우름), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로 또한 지칭됨), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하여, CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 지시하는 것에 수반된 전사체 및 다른 요소를 집합척으로 지칭한다. 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 tracr 메이트 서열(예를 들어, 직접 반복서열-스페이서-직접 반복서열)은 뉴클레아제에 의한 처리 전 프리(pre)-crRNA (프리-CRISPR RNA)로 또는 처리 후 crRNA로 또한 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, Cong, Science, 15:339(6121):819-823 (2013) 및 Jinek, et al., Science, 337(6096):816-21 (2012))에 기재된 바와 같이, tracrRNA 및 crRNA는 연결되어 키메라 crRNA-tracrRNA 잡종을 형성하는데, 여기서 성숙 crRNA는 천연의 crRNA:tracrRNA 듀플렉스(duplex)를 모방하는 합성 스템 루프(stem loop)를 통해 부분적인 tracrRNA에 융합된다. 단일 융합된 crRNA-tracrRNA 작제물은 또한 본원에서 가이드 RNA 또는 gRNA(또는 단일-가이드 RNA(sgRNA))로 지칭된다. sgRNA 내에서, crRNA 일부는 '표적 서열'로서 식별될 수 있고 tracrRNA는 종종 "스캐폴드"로 지칭된다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I 유형, II 유형, 또는 III 유형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정한 유기체, 예컨대 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된다.
일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소에 의해 특징지어진다(내인성 CRISPR 시스템의 문맥에서 프로토스페이서로 또한 지칭됨). CRISPR 복합체의 형성의 문맥에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질 내에 위치한다.
표적 핵산에서, 각각의 프로토스페이서는 인식이 개별적인 CRISPR 시스템에 특이적인 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)과 회합된다. 스트렙토코커스 파이오게네스 CRISPR/Cas 시스템에서, PAM은 뉴클레오티드 서열 NGG이다. 스트렙토코커스 써모필레스(thermophiles) CRISPR/Cas 시스템에서, PAM은 뉴클레오티드 서열 NNAGAAW이다. tracrRNA 듀플렉스는 Cas를 crRNA의 스페이서 영역과 프로토스페이서 DNA 사이의 헤테로듀플렉스 형성을 통해 프로토스페이서 및 필요한 PAM으로 이루어진 DNA 표적으로 지시한다.
바람직한 DNA 표적 서열이 식별되면 수행자가 적합한 표적 부위를 결정하는 것을 돕기에 이용가능한 많은 재료가 있다. 예를 들어, 과학자들이 광범위한 종에서 CRISPR 표적 부위를 찾고 적절한 crRNA 서열을 생성하도록 돕기 위해 설계된 도구인 crispr.u-psud.fr/을 참조한다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 작동시키는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는, CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 유도자 식물의 게놈 내로 도입된다. 예를 들어, Cas 효소, 및 tract-메이트 서열에 연결된 하나 이상의 가이드 서열, 및 tracr 서열은 분리된 발현 작제물(예를 들어, sgRNA) 상의 분리된 조절 요소에 각각이 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 같거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소는 단일 작제물 내에서 조합될 수 있으며, CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공하는 하나 이상의 추가적인 작제물은 제1 작제물에 포함되지 않는다. 단일 작제물 내에서 조합된 CRISPR 시스템 요소는 임의의 적합한 방향으로, 예컨대 제2 요소에 대해(의 상류에) 5' 위치되거나 또는 이에 대해(의 하류에) 3'에 위치된 한 요소로 정렬될 수 있다. 하나의 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열의 같거나 반대 가닥 상에 위치할 수 있고, 같거나 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 CRISPR 효소 및 하나 이상의 가이드 서열을 인코딩하는 전사체, tracr 메이트 서열(임의로 가이드 서열에 작동가능하게 연결됨), 및 하나 이상의 인트론 서열(예를 들어, 상이한 인트론 각각의 내, 적어도 하나의 인트론 내의 2개 이상, 또는 단일 인트론 내의 전체에)에 끼워진 tracr 서열의 발현을 작동시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열, 및 tracr 서열은 같은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며 이로부터 발현된다.
일부 구현예에서, 작제물은 CRISPR 효소, 예컨대 Cas 단백질을 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다.
Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csnl 및 Csxl2로 또한 공지됨), CaslO, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csxl6, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 상동체, 또는 이들의 변형된 버전을 포함한다. 일부 구현예에서, 비변형된 CRISPR 효소, 예컨대 Cas9은 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치, 예컨대 표적 서열의 내 및/또는 표적 서열의 상보가닥 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시한다.
일부 구현예에서, 작제물은 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 인코딩한다. 예를 들어, 에스. 파이오게네스(S. Pyogenes)로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매적 도메인 내의 아스파르트산-에서-알라닌으로의 치환(D10A)은 Cas9를 두 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 닉카아제(단일 가닥을 절단함)로 전환시킨다. Cas9을 닉카아제로 만드는 돌연변이의 다른 예는, 제한 없이, H840A, N854A 및 N863A를 포함한다. 추가의 예로서, Cas9의 두개 이상의 촉매적 도메인(RuvC I, RuvC II, 및 RuvC III)은 돌연변이되어 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 Cas9을 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, D10A 돌연변이는 H840A, N854A, 또는 N863A 돌연변이 중 어느 하나와 조합하여 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 Cas9 효소를 생산한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는, 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 이의 비-돌연변이화된 형태에 대해 약 25%, 10%, 5%>, 1%>, 0.1 %>, 0.01% 이하일 때 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 특정한 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 다양한 종이 특정한 아미노산의 특정한 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 사이의 코돈 사용에서의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역의 효율성과 상호관련이 있는데, 이는 결국 무엇보다도 번역되는 코돈의 특성 및 특정한 전달 RNA(tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 여겨진다.
세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 자주 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기반하여 주어진 유기체에서 최적 유전자 발현을 위해 맞춰질 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어, "코돈 사용 데이터베이스"에서 용이하게 이용가능하며, 이 표는 많은 방식으로 적용될 수 있다. Nakamura, Y., et al., Nucl. Acids Res., 28:292 (2000)을 참조한다. 특정한 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정한 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 진 포지(Gene Forge)(압타진(Aptagen); 자코부스(Jacobus), PA)가 또한 이용가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 서열 중 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상, 또는 모든 코돈)은 특정한 아미노산에 대해 가장 자주 사용되는 코돈에 상응한다.
세부 사항은 상이한 조작된 CRISPR 시스템마다 다를 수 있지만 전반적인 방법론은 유사하다. (많은 이용가능한 온라인 도구 중 하나를 사용하여 식별된) DNA 서열을 표적화하기 위해 CRISPR 기술을 사용하는 것에 관심있는 수행자는 표적 서열을 함유하는 짧은 DNA 단편을 가이드 RNA 발현 작제물 내로 삽입할 수 있다. sgRNA 발현 작제물은 표적 서열(약 20개 뉴클레오티드), tracrRNA 서열의 형태(스캐폴드) 뿐만 아니라 적합한 프로모터 및 표적 세포에서의 적절한 처리를 위한 필요한 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, 다수의 가이드 RNA가, RNA 폴리머라아제 III 프로모터로 다수의 발현 카세트를 함께 연결함으로써, 또는 하나 또는 여러 가지 유전자를 표적화하는 다수의 기능성 sgRNA를 유리시키는 tRNA 또는 리보자임 자체-절단 부위를 포함하는 긴 RNA를 조작함으로써, 하나의 작제물로부터 발현된다(Cermak, et al., Plant Cell, 29(6): 1196-1217 (2017), He, et al., J Genet Genomics, 44(9): 469-472 (2017)). 벡터는 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, 매드진(Addgene)을 참조한다). 많은 시스템은, 어닐링(annealing)되어 이중 가닥 DNA를 형성하고 그후에 sgRNA 발현 플라스미드 내로 클로닝(cloning)되는 맞춤형, 상보적 올리고(oligo)에 의존한다. 세포 내에서 같거나 분리된 작제물로부터 sgRNA 및 적절한 Cas 효소의 동시-발현은 바람직한 표적 부위에서 단일 또는 이중 가닥 절단(Cas 효소의 활성에 따라)을 초래한다. CRISPR/Cas 유전자 편집 접근법은 cenh3 반수체 유도자 시스템과 완전히 양립가능하며, 두 기술은 유용하게 조합되어 유전자형-독립적인 유전자 편집을 용이하게 한다.
ii. 징크 핑거 뉴클레아제
일부 구현예에서, 표적 식물의 게놈 내에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 요소는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 인코딩하는 핵산 작제물 또는 작제물들이다. ZFN은 전형적으로 절단 도메인, 예컨대 IIS 유형 효소 Fok I에 연결된 징크-핑거 단백질로부터 유래된 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다(Miller, et al., Nature Biotechnology, 25:778-785(2007)). Fok I은 하나의 가닥 상에서 이의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드에서 및 다른 가닥 상에서 이의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 또한, 미국 특허 번호 5,356,802; 5,436, 150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 Li et al. Proc., Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992):4275-4279; Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2764-2768 (1993); Kim et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:883-887 (1994a); Kim et al. J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982 (1994b)를 참조한다. 이들 효소(또는 이들의 효소적으로 기능성인 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인의 원천으로서 사용될 수 있다.
예시적인 IIS 유형 제한 효소는 국제 공보 WO 07/014275에 기재되어 있다. 추가적인 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유한다. 예를 들어, Roberts et al. Nucleic Acids Res., 31:418-420 (2003)을 참조한다. 특정한 구현예에서, 절단 도메인은, 예를 들어, 미국 공개 출원 번호 2005/0064474, 2006/0188987, 및 2008/0131962에 기재된 바와 같이, 동종이량체화를 최소화하거나 예방하는 하나 이상의 조작된 절단 하프-도메인(half-domain)(또한 이량체화 도메인 돌연변이로 또한 지칭됨)을 포함한다. 특정한 구현예에서 절단 하프 도메인은 야생형 Fok I 절단 하프 도메인의 돌연변이이다. 일부 구현예에서 절단 하프 도메인은 핵 또는 다른 국부화 신호, 펩티드 태그, 또는 다른 결합 도메인을 포함하도록 변형된다.
원칙적으로 관심있는 임의의 게놈 위치를 표적화하도록 설계될 수 있는 DNA-결합 도메인은 Cys2His2 징크 핑거의 직렬 배열일 수 있으며, 이들의 각각은 일반적으로 표적 DNA 서열에서 3개 내지 4개의 뉴클레오티드를 인식한다. 다수의 핑거(숫자는 다양함: 공개된 연구에서 단량체 당 3개 내지 6개의 핑거가 사용됨)를 함께 연결함으로써, ZFN 쌍(pair)이 게놈 서열 18-36개 뉴클레오티드 길이에 결합하도록 설계될 수 있다.
Cys2Cys2 징크 핑거라고 불리는 징크 핑거의 또 다른 유형은 다양한 DNA 결합 단백질에서 발견된 시스테인의 2쌍 사이에서 징크에 결합한다.
ZFN의 DNA-결합 도메인은 2개 내지 6개의 징크 핑거로 구성될 수 있다. 각각의 징크 핑거 모티프는 전형적으로 3개의 염기쌍 서열을 인식하고 이에 결합하는 것으로 간주되며, 이에 따라 더 많은 징크 핑거를 포함하는 단백질은 보다 긴 서열을 표적화하고 그러므로 표적 부위에 대해 보다 큰 특이성과 친화성을 가질 수 있다. 징크 핑거 결합 도메인은 예정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 예를 들어, Beerli et al. Nature Biotechnol. 20: 135-141 (2002); Pabo et al. Ann. Rev. Biochem. 70:313-340 (2001); Isalan et al., Nature Biotechnol. 19:656-660 (2001); Segal et al. Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637 (2001); Choo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 10:41 1-416 (2000)을 참조한다.
표준 ZFN은 각각의 징크 핑거 도메인의 C-말단에 절단 도메인을 융합한다. 2개의 절단 도메인이 이량체화되고 DNA를 절단하는 것을 허용하기 위해, 2개의 개별적인 ZFN이, 그들의 C-말단으로 특정한 거리, 일반적으로 5 내지 7 bp 떨어져 DNA의 반대 가닥에 결합해야만 한다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 둘 다 가능하며, 이중-가닥 절단은 2개의 구별되는 단일-가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. 징크 핑거-유도된 이중 가닥 절단의 복구는 일반적으로 비-상동 말단 봉합(NHEJ)에 의해 일어나며 유전자 기능이 넉아웃된 돌연변이를 초래한다. 징크 핑커 뉴클레아제 시스템은 또한 하기에 기재된 바와 같이 상동성-지향 복구에 의해 새로운 DNA 서열을 삽입하기 위한 공여체 분자를 함유하는 제2 작제물과 조합될 수 있다. 또한 Shukla, et al., Nature, 459, 437-441(2009)을 참조한다.
또한, 추가의 설계 고려사항을 위해, 미국 특허 번호 6, 140,081; 6,453,242; 6,534,261; 6,610,512; 6,746,838; 6,866,997; 7,067,617; 미국 공개 출원 번호 2002/0165356; 2004/0197892; 2007/0154989; 2007/0213269; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/53059 및 WO 2003/016496을 참조한다.
징크-핑거 뉴클레아제의 강점은 임의의 부위가 표적화될 수 있으며, 이는 Cas9 표적화에 필요한 PAM 부위에 제한되지 않는다는 점이다. 징크 핑거 뉴클레아제 접근법은 cenh3 반수체 유도자 시스템과 완전히 양립가능하며, 두 기술은 유용하게 조합되어 유전자형-독립적인 유전자 편집을 용이하게 한다.
iii. 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제
일부 구현예에서, 표적 식물의 게놈 내에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 요소는 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 인코딩하는 핵산 작제물 또는 작제물들이다. TALEN은 DNA-결합 도메인이 식물 병원성 박테리아의 전사 인자인 TAL 이펙터 단백질에서 유래한다는 주요 차이를 제외하면 ZFN의 것과 유사한 전반적인 구조를 갖는다. TALEN의 DNA-결합 도메인은 각각 약 34개 잔기 길이의 아미노산 반복서열의 직렬 배열이다. 반복서열은 서로 매우 유사하며; 전형적으로 그들은 주로 두 위치(반복 가변 이잔기(repeat variable diresidue) 또는 RVD라고 하는 12번 및 13번 아미노산)에서 다르다. 각각의 RVD는 4개의 가능한 뉴클레오티드 중 하나에 대한 우선적 결합을 지정하는데, 이는 NN RVD는 구아닌에 더하여 아데닌에 결합하는 것으로 공지되어 있지만, 각각의 TALEN 반복서열은 단일 염기쌍에 결합함을 의미한다. 징크 핑거 시스템과 같이, RVD는 함께 연결되어 고유한 표적 부위에의 특이성을 부여하고, 절단 도메인, 예컨대 FokI에 융합된다(Cermak, et al., Nucleic Acids Research, 39(12) (2011), Page e82, doi/10.1093/nar/gkr218).
TALEN-유도된 이중 가닥 절단의 복구는 일반적으로 비-상동 말단 봉합(NHEJ)에 의해 일어나며 유전자 기능을 넉아웃시킨 돌연변이를 초래한다. TALEN은 또한 하기에 기재된 바와 같이 HDR을 위한 공여체 주형과 조합될 수 있다. TALEN 접근법의 강점은 임의의 부위가 표적화될 수 있으며, 이는 Cas 표적화에 필요한 PAM 부위에 제한되지 않는다는 점이다. TALEN 접근법은 cenh3 반수체 유도자 시스템과 완전히 양립가능하며, 두 기술은 유용하게 조합되어 유전자형-독립적인 유전자 편집을 용이하게 할 수 있다.
또한, 추가의 TALEN 설계 고려사항을 위해, Cermak, et al, Nucl. Acids Res. 1-11 (2011), 미국 공개 출원 번호 2011/0145940, Miller et al., Nature Biotechnol 29: 143 (2011)을 참조한다.
b. DNA 서열을 변경하는 유전자
본원에 기재된 게놈 편집 시스템의 뉴클레아제 활성은 표적 DNA를 절단하여 표적 DNA 내에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 생산한다. 이중 가닥 절단은 적어도 두가지 방식 중 하나로 세포에 의해 복구될 수 있다: 비-상동 말단 봉합(NHEJ), 및 상동성-지향 복구(HDR). 비-상동 말단 봉합에서, 이중-가닥 절단은 절단 단부의 또다른 것으로의 직접적인 결찰(ligation)에 의해 복구된다. 이에 따라, 일부 핵산 재료가 복구 과정 동안 상실되거나 얻어져 이는 유전자 기능을 넉아웃시킬 수 있는 작은 결실 또는 삽입을 초래할 수 있지만, 어떤 새로운 핵산 재료도 부위 내로 삽입되지 않는다. 상동성-지향 복구에서, 절단된 표적 DNA 서열에 상동성인 공여체 폴리뉴클레오티드가 절단된 표적 DNA 서열의 복구를 위해 주형으로서 사용되며, 이는 공여체 폴리뉴클레오티드로부터 표적 DNA에의 유전적 정보의 전달을 초래한다. 이에 따라, 새로운 핵산 재료가 부위 내로 삽입/복사될 수 있다.
그러므로, 일부 구현예에서, 유도자 식물은 임의로 공여체 폴리뉴클레오티드를, 예를 들어 유도자 식물의 게놈의 세그먼트로서 포함할 수 있다. 상동성-지향 복구로 인한 표적 식물의 DNA의 변형은 유전자 교정, 유전자 대체, 유전자 태깅(tagging), 전이유전자 삽입, 뉴클레오티드 결실, 유전자 파괴, 유전자 돌연변이 등을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에서, 공여체 폴리뉴클레오티드 서열은 일반적으로 상동성 아암(arm)으로 공지된 표적 DNA 서열에 대한 서열 상동성의 영역을 포함한다. 상동성 아암 사이의 서열은 새로운 특징, 예컨대 태그, 프로모터 모티프, 발현된 단백질 모티프, 또는 다른 관심있는 서열을 도입하는 천연 또는 조작된 서열일 수 있다. HDR 동안, 상동성 아암은 이중 가닥 절단의 복구를 가이드하기 위해 사용되어, 표적 부위 내로 새로운 서열의 삽입을 초래한다.
폴리뉴클레오티드 서열을 표적 DNA 서열 내로 삽입하는 것이 바람직한 적용법에서, 삽입될 공여체 서열은 또한 유도자 식물의 게놈에 의해 제공된다. 상동성 아암이 있는 공여체 서열은 제2 DNA 작제물 또는 작제물 성분(Shi, et al., Plant Biotechnology Journal, 15:207-216 (2017)), 또는 복구를 위한 공여체 주형으로서 사용될 수 있는 RNA를 발현하는 작제물(Li, et al., Nature Biotechnology, 37:445-450 (2019))의 형태일 수 있다.
표적 식물의 게놈 서열을 변경하려는 목적을 위한 공여체 서열의 삽입 시, 공여체 서열은 그것이 대체하는 게놈 서열과 전형적으로 동일하지 않다. 오히려, 공여체 서열은 상동성-지향 복구를 뒷받침하기에 충분한 상동성이 존재하는 한, 게놈 서열에 대해 적어도 하나 이상의 단일 염기 변화, 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 공여체 서열은 표적 DNA 영역 및 2개의 플랭킹(flanking)된 서열 사이의 상동성-지향 복구가 표적 영역에서 비-상동 서열의 삽입을 초래하도록 2개의 상동성 영역에 의해 플랭킹(flanking)된 비-상동 서열을 포함한다.
공여체 서열은 절단 부위에 공여체 서열의 성공적인 삽입을 평가하기 위해 사용될 수 있는 게놈 서열에 대해 또는 다른 목적을 위해 사용될 수 있는 일부 경우에(예를 들어, 표적화된 게놈 유전자좌에서의 발현을 보이기 위해) 제한 부위, 뉴클레오티드 다형성, 선택가능한 마커(예를 들어, 약물 내성 유전자, 형광 단백질, 효소 등) 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 암호화 영역 내에 위치하는 경우, 이러한 뉴클레오티드 서열 차이는 아미노산 서열을 바꾸지 않을 것이고, 또는 침묵 아미노산 변화(즉, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변화)를 만들 것이다. 대안적으로, 이들 서열 차이는 마커 서열의 제거를 위해 나중에 활성화될 수 있는 플랭킹 재조합 서열, 예컨대 FLP, loxP 서열 등을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas9, 징크 핑거, TALEN, 그들의 염기 편집자와의 조합을 포함하여 현재 이용된 유전자 편집 방법의 전체, 및 HDR에 의해 변경된 DNA 서열의 삽입을 지시하기 위한 그들의 용도는 cenh3 반수체 유도자 시스템과 양립가능하다. 본 맥락에서 cenh3 반수체 유도자의 가치는 신속하고 효율적인 방식으로 용이하게 형질전환가능한 계통으로부터 엘리트 생식질 내로의 유전자 편집 기구의 전달을 용이하게 하는 것이다.
III. 사용 방법
A. 반수체 유도
반수체 유도의 방법이 제공된다. 개시된 반수체 유도 방법은 전형적으로 유도될 계통 및 반수체 유도자 계통 사이의 교배를 포함한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 반수체 유도자는 전형적으로 이형접합 cenh3 널 식물이다.
반수체 식물은 반수체 유도자 및 사실상 임의의 근교종, 잡종, 또는 기타 관심있는 생식질 사이에서 교배를 함으로써 생산된다. 반수체는 반수체 유도자 식물로부터의 염색체가 배아의 제1 세포 분열을 통해 유지되지 않을 때 생산된다. 결과적인 표현형은 반수체 배아를 함유하는 일부 난자, 및 이배체 배아, 이수체 배아, 키메라 배아, 또는 발육하지 못한(aborted) 배아를 함유하는 다른 것과 함께 완전한 침투물이 아니다. 반수체 유도 후, 반수체 배아 또는 종자는 전형적으로 이배체 및 이수체 형제로부터 표현형 또는 유전 마커 스크린을 사용하여 분리되고 반수체 식물로 성장한다. 그후에 이들 식물은 화학적 조작(예를 들어, 항-미소관제, 예컨대 콜히친을 사용함)을 통해 그후에 근교 종자를 생산하는 배가된 반수체("DH") 식물로 전환된다.
식물 육종은 배가된 반수체(DH) 식물의 사용에 의해 매우 용이해진다. DH 식물의 생산은 식물 육종가가 다세대 근교 없이 근교 계통을 수득할 수 있게 하여, 그에 따라 동형접합 식물을 생산하는 데 필요한 시간을 감소시킨다.
반수체 유도자는 (수컷 또는 암컷으로서) 반수체 자손을 생성하기 위해 표적화된 계통으로 교배된다. 결과는 오직 비-유도자 부모로부터의 염색체 세트를 함유하는 반수체 배아 또는 식물 또는 종자이다.
유도자가 수컷으로서 사용되는 경우, 회복된 자손은 표적화된 계통의 세포질을 가질 것이다. 유도자의 세포질이 바람직한 경우(예를 들어 수컷 불임 세포질을 수득하기 위해), 반수체 유도자는 암컷으로서 사용될 수 있다.
추가적인 단계는 반수체 식별 기술, 및 후속의 염색체 배가 기술, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 프리기 및 멜칭거(Prigge and Melchinger)에 의해 기재된 것("Production of Haploids and Doubled Haploids," in Maize Plant Cell Culture Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 877, pp. 161-172, 2012), 및 예를 들어, 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또다른 공지된 항-미소관제 또는 다른 유사분열 억제제의 사용을 포함하는 다른 것을 포함할 수 있다. 이 계통은 그후에 다운스트림 육종 프로그램에서 직접 사용될 수 있다.
사용의 용이성은 이것을 반수체를 기반으로 하는 다른 기술과 결합할 때 특히 다용도로 만들어야 한다. 하나의 이러한 적용법은 식물이 감수분열을 건너뛰고 이배체 배우자를 생산하도록 조작되는 합성 아포믹시스이며; 이들 계통이 반수체 유도자와 교배될 때, 결과적인 자손은 유전자형이 부모와 동일하다(Marimuthu, et al., Science, 331(6019):876 (2011)). 또 다른 적용법은 반수체 유도자가 작은, 조작된, 또는 완전히 합성된 염색체를 한 계통에서 또다른 것으로 빠르게 이동시키는 데 활용되는 염색체 조작의 분야이다(Birchler, et al., Current Opinion in Plant Biology, 19:76-80 (2014)).
B. 외떡잎식물에서의 유전자 편집
1. 유전자 편집의 방법
동시 반수체 유도 및 유전자 편집 방법이 또한 제공된다. 개시된 방법은 전형적으로 유도될 계통 및 반수체 유도자 계통 사이의 교배를 포함한다. 상기에 소개된 바와 같이, 반수체 유도자는 전형적으로 이형접합 cenh3 널 식물이며, 또한 CRISPR/Cas9, 징크 핑거, TALEN 유형의 유전자 편집 기구를 단독으로 또는 염기 편집 효소 및/또는 HDR 및 유전자 대체 또는 변형을 허용하는 공여체 분자와 조합하여 인코딩한다.
동시 편집 더하기 반수체 유도에서, 조직 배양 없이 편집된 작물 및 엘리트 계통의 신속하고 비용-효율적인 생산이 가능하다. 편집을 받는 계통은 엘리트 생식질일 수 있으며, 편집 기구 그 자체는 반수체 유도 과정 동안 제거될 것이다. 동시에, 편집된 배가된 반수체 계통이 생산된다.
유전자 편집 기구는 유도자 계통을 통해 전달된다. 유전자 편집 기구를 이루는 DNA, RNA, 및 단백질은 유도자 계통에 의해 인코딩되며 유도자 계통 안에 존재한다. 전형적으로, 유전자 편집 기구는 유도자 안에, 예를 들어 총 또는 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 안정하게 삽입된다. 편집 기구를 발현하는 트랜스제닉 반수체 유도자 계통은 반수체 유도 및 동시 게놈 편집을 위한 종간 또는 속간 원연 교배에서 꽃가루 공여체 또는 수여체로서 사용될 수 있다.
반수체 유도자는 반수체 자손을 생성하기 위해 (수컷 또는 암컷으로서) 표적화된 계통과 교배된다. 수정 후, 편집은 비-유도자 표적 유전자에서 유도자 염색체의 제거에 앞서 또는 그동안 편집 기구에 의해 이루어진다. 결과는 오직 비-유도자 부모로부터의 염색체 세트를 함유하는 반수체 배아 또는 식물 또는 종자이며, 여기서 이 염색체 세트는 편집된 DNA 서열을 함유한다.
엔도뉴클레아제 작제물 내에서 사용되는 프로모터(들)은 전형적으로 수정 전에, 처음 몇 회의 세포 분열 동안, 또는 이의 조합에서 엔도뉴클레아제 발현을 초래한다. 암컷으로서 반수체 유도자를 사용함으로써, 엔도뉴클레아제가 난자에서 발현되는 경우에 수분 전 또는 세포 분열의 첫 번째 단계 동안, 엔도뉴클레아제는 즉시 시작하여 수분 시 표적 서열을 돌연변이화시키고 반수체 유도자 게놈이 세포로부터 상실되기 전에 표적 서열을 돌연변이화시키는 것을 지속한다. 유사분열의 첫 번째 단계에서, 반수체 유도자 게놈이 제거되기 전에, 표적화된 엔도뉴클레아제는 표적 계통의 DNA에서 표적화된 DNA 가닥 절단(들)을 유도한다. 이들 절단은 유전자 편집 적용법에 의존하여, NJEH에 의해 복구되어 작은 삽입 또는 결실을 생성하거나, 또는 HDR에 의해 교정된다.
반수체 자손 게놈은, 자손이 돌연변이(들)에 대해 스크리닝되기 전에 또는 후에 배가될 수 있다. 이들 반수체 개체의 게놈이 배가되면, 개체는 성장하고 자가-수분하여 배가된 반수체 종자를 생산할 수 있다. 상이한 돌연변이가 생산될 수 있으며, 돌연변이 사건은 수득된 돌연변이(들)이 바람직한 결과를 갖는지 여부를 결정하기 위해 평가될 수 있다. 개시된 방법은 육종가가 육종을 위해 부모로서 사용할 계획인 모든 (또는 많은) 외떡잎식물 계통 상에서 수행될 수 있다. 육종가가 모든 표적화된 유전자좌에서 바람직한 돌연변이(들)을 갖는 계통을 사용하여 개체군을 발달시키는 경우, 개체군은 바람직한 돌연변이(들)에 대해 구분되지 않는다. 이에 따라, 바람직한 돌연변이(들)의 존재를 선택할 필요가 없기 때문에 육종 노력이 단순화된다.
방법은 바람직한 표적화된 돌연변이에서 표적화된 계통으로의 역교배의 시간 및 비용 없이 표적화된 돌연변이(들)를 갖는 배가된 반수체 개체를 생산할 수 있다. cenh3 반수체 유도자는 유전적으로 우성이다. cenh3 널이 임의의 계통과 교배될 때, 결과적인 F1 그 자체는 반수체 유도자가 된다. cenh3 널 및 유전자 편집 기구를 함유하는 F1 개체는 특히 유도자 스톡(stock) 계통이 수컷으로서 사용되는 경우에 수백 또는 심지어 수천 개의 엘리트 계통과 교배될 수 있다. 일부 구현예에서, 모두 표적화된 돌연변이(들)이 있는 다수의 엘리트 계통으로부터의 배가된 반수체 개체는 1년 미만 안에 생산된다.
일부 구현예에서, 유도자 계통은, 예를 들어, 다수의 엔도뉴클레아제 전이유전자, 및/또는 gRNA, 및/또는 공여체 서열 등을 포함함으로써 2, 3, 4, 5개 이상의 돌연변이를 표적할 수 있다.
회복된 배가된 반수체 개체는 모든 바람직한 돌연변이를 포함하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 돌연변이가 바람직한 경우에, 단일 돌연변이가 있는 배가된 반수체 자손은 함께 교배될 수 있고, F2 자손이 모든 바람직한 돌연변이에 대해 동형접합인 개체에 대해 스크리닝될 수 있다.
유도자가 수컷으로서 사용되는 경우, 회복된 자손은 표적화된 계통의 세포질을 가질 것이다. 유도자의 세포질이 바람직한 경우(예를 들어 수컷 불임 세포질을 수득하기 위해), 반수체 유도자는 암컷으로서 사용될 수 있다. 표적화된 계통의 세포질이 바람직한 경우, 비-돌연변이화된 버전의 표적화된 계통(암컷으로서) 및 돌연변이화된 버전의 표적화된 계통(수컷으로서) 사이에 교배가 이루어질 수 있다.
2. 유전자 편집의 유형
상기에 소개된 바와 같이, 적합한 유전자 편집 시스템은, 이에 제한되지는 않으나 돌연변이 또는 염기 편집을 야기하는 것, 및 HDR에 의한 표적화된 서열 삽입을 포함한다. CRISPR/Cas9, 징크 핑거, 또는 TALEN 중 어느 것을 통하든, 안정한 유전자 편집 과정의 임의의 형태가, cenh3 널과 조합되어 표적 계통의 게놈을 변형시킬 수 있다고 여겨진다. 하나의 Cas9 뉴클레아제 및 다수의 gRNa를 사용함으로써, 하나 이상의 부위가 표적화되고 동시에 변경된다.
활성 Cas 단백질이 유전자좌에 대해 표적화되고 어떤 공여체 주형도 제공되지 않을 때, 하나의 가능한 결과는 NHEJ 복구 과정 동안 생성되는 작은 결실 또는 삽입이다. 표적화된 위치가 적절히 선택된 경우, 돌연변이는 코딩 서열에서의 프레임시프트를 생성할 수 있고 유전자의 기능을 폐지하거나, 발현 패턴을 바꾸기 위해 프로모터를 변경할 수 있다. 의도가 발현을 넉아웃시키는 것이라면, 다수의 gRNA가 자주 코딩 서열의 여러 가지 영역에 대해 표적화된다. 다수의 gRNA가 프로모터에 대해 표적화되는 경우, 유전자 발현에서의 극적이고 유용한 변화가 생길 수 있다(Rodriguez, et al., Cell, 171(2):470-80 (2017)).
DNA 서열의 표적화된 돌연변이유발은 이중 가닥 절단(DSB)의 요구 없이 하나의 DNA 염기의 또다른 것으로의 직접 전환을 통해 또한 달성될 수 있다. 예를 들어, 시티딘 데아미나제 APOBEC1, 아데닌 데아미나제, 및 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)와 같은 다른 강화 성분이 Cas9(A840H) 닉카아제 또는 뉴클레아제-불활성화 데드 Cas9(dCa9)에 융합되어 이중 가닥 DNA 절단의 도입 없이 DNA 서열의 직접 편집을 지시할 수 있다(Komor et al., Nature, 533:420-424 (2016) doi:10.1038/nature17946; Gaudelli et al., Nature, 551:464-471 (2017) doi:10.1038/nature24644; Komor et al., Science Advances, 3(8) eaao4774 (2017), DOI: 10.1126/sciadv.aao4774). 이 종류의 염기 편집자 기구는 반수체 유도 계통을 통해 또한 전달되어 다른 변종에서 직접적으로 표적 서열에서의 염기 편집을 유도할 수 있다.
염색체에서 DSB를 복구하는 대안적인 수단인 HDR은 DNA 교정, 표적화된 넉-(knock-in) 또는 대체, 또는 임의의 유형의 바람직한 돌연변이를 포함하여, 보다 절묘한 DNA 서열 변형을 용이하게 하는 식물 게놈을 조작하기 위한 메커니즘이다. HDR은 세포 분열 동안 일어나며(Ceccaldi, et al., Trends Cell Biol, 26(1):52-64 (2016). doi: 10.1016/j.tcb.2015.07.009) 특히 어린 배아의 신속한 세포 분열 동안 활성화될 수 있다. 이를 뒷받침하기 위해, 하기에 제시된 데이터는 HDR이 실시예 2의 동시 반수체 유도 및 통과 유전자 편집에 의해 생산된 식물의 돌연변이를 책임질 수 있음을 나타낸다.
이에 따라, 생체 내 반수체 유도 시스템은 표적 서열의 절단 또는 전환을 위해 단백질, RNA 또는 DNA를 도입하기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 적절한 복구 주형과 함께, 정확한 서열 변화를 유전자 편집을 위해 표적화된 영역에 도입하기 위해서도 사용될 수 있다고 여겨진다.
주형 DNA는 게놈 편집 기구, 예컨대 CRISPR-Cas9 시스템을 운반하는 유도자 계통 게놈 내로 같은 트랜스제닉 유전자좌 또는 상이한 유전자좌 안에 삽입될 수 있다. Cas9-sgRNA 및 주형 DNA 둘 다 유도된 반수체 배아 내에 존재할 때, 표적 서열의 절단은 주형으로서 상동 트랜스제닉 DNA 서열과 함께 염색체 절단의 복구를 초래할 것이다.
전이유전자는, 제공된 주형이 DSB의 다른 측면 상의 서열에 상동인 서열에 의해 플랭킹된 전이유전자를 함유하는 경우 DSB 내로 도입될 수 있다(상동성 아암, Shukla et al., Nature, 459:437-441, (2009) 참조). 트랜스제닉 사건(예를 들어, 관심있는 유전자의 삽입)은 반수체 유도자 계통 내로 교배된다. 엔도뉴클레아제 유전자는 비-트랜스제닉 계통에서 전이유전자의 상대적인 위치를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 삽입될 트랜스제닉 사건은 표적 서열을 플랭킹하는 DNA에 상동인 DNA 서열에 의해 양 측면에서 플랭킹될 필요가 있다. 반수체 유도자가 표적화된 계통과 교배될 때, 엔도뉴클레아제는 표적 부위에서 이중 가닥 절단을 야기할 것이다. 표적화된 계통의 DNA가 반수체 유도자 스톡 계통의 DNA(및 전이유전자)를 주형으로서 사용하여 HDR에 의해 복구되는 경우, 표적화된 계통 DNA는 이중 가닥 절단 부위에서 전이유전자 서열을 배치함으로써 이중 가닥 절단을 "복구"한다. 이에 따라, 개시된 방법은 역교배를 하지 않고 표적화된 계통 내로 전이유전자를 놓기 위해 사용될 수 있다.
개시된 조성물 및 방법은 다음의 번호화된 단락을 통해 추가로 이해될 것이다.
1. 기능성 동원체 히스톤 3(CENH3) 단백질을 인코딩하는 단지 하나의 대립유전자를 포함하는 이배체 식물 세포를 포함하는, CenH3에 대해 이형접합인 외떡잎 반수체 유도자 식물.
2. 제1단락에 있어서, 상기 이배체 식물 세포는 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 CenH3 대립유전자를 포함하는, 외떡잎 식물.
3. 제2단락에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 단백질 비대립유전자인, 외떡잎 식물.
4. 제2 또는 제3단락에 있어서, 상기 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 대립유전자는 RNA 비대립유전자인, 외떡잎 식물.
5. 제1 내지 제4단락 중 어느 하나에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 기능을 폐지하는 정지 코돈을 생성하는 프레임시프트 돌연변이에 의해 야기되는, 외떡잎 식물.
6. 제1 내지 제5단락 중 어느 하나에 있어서, 제1 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 결실된, 외떡잎 식물.
7. 제1 내지 제6단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 이배체 염색체 상의 상기 내인성 CenH3 유전자좌는 온전한, 외떡잎 식물.
8. 제1 내지 제7단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 기능성 CENH3 단백질은 야생형 CENH3 단백질인, 외떡잎 식물.
9. 제1 내지 제8단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물은 야생형 CenH3을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
10. 제1 내지 제9단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물은 CENH3 변이체 또는 융합 단백질을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
11. 제10단락에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 녹색 형광 단백질을 포함하는, 외떡잎식물.
12. 제10 또는 제11단락에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 GFP-tailswap인, 외떡잎 식물.
13. 제1 내지 제12단락 중 어느 하나에 있어서, 정자 또는 난자는 CENH3 동형접합 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 적은 CENH3를 가지며, 임의로 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 50% 미만의 CENH3을 갖고, 바람직하게는, 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 약 50% 내지 10%, 예를 들어, 50%, 25%, 또는 12.5%의 CENH3을 갖는, 외떡잎 식물.
14. 제1 내지 제13단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마인, 외떡잎 식물.
15. 제14단락에 있어서, 상기 식물은 옥수수인, 외떡잎 식물.
16. 제1 내지 제15단락 중 어느 하나에 있어서, 외떡잎 식물의 세포에 의해 발현되는 외인성 부위-지정 뉴클레아제를 추가로 포함하는, 외떡잎 식물.
17. 제16단락에 있어서, 이배체 식물 세포는 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 CenH3 대립유전자를 포함하는, 외떡잎 식물.
18. 제17단락에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 단백질 비대립유전자인, 외떡잎 식물.
19. 제17 또는 제18단락에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 RNA 비대립유전자인, 외떡잎 식물.
20. 제16 내지 제19단락 중 어느 하나에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 기능을 폐지하는 정지 코돈을 생성하는 프레임시프트 돌연변이에 의해 야기되는, 외떡잎 식물.
21. 제16 내지 제20 단락 중 어느 하나에 있어서, 제1 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 결실된, 외떡잎 식물.
22. 제16 내지 제21단락 중 어느 하나에 있어서, 제2 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 온전한, 외떡잎 식물.
23. 제16 내지 제22 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 기능성 CENH3 단백질은 야생형 CENH3 단백질인, 외떡잎 식물.
24. 제16 내지 제23단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물은 야생형 CenH3을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
25. 제16 내지 제24단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물은 CENH3 변이체 또는 융합 단백질을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
26. 제25단락에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 녹색 형광 단백질을 포함하는, 외떡잎 식물.
27. 제25 또는 제26단락에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 GFP-tailswap인, 외떡잎 식물.
28. 제16 내지 제27단락 중 어느 하나에 있어서, 정자 또는 난자는 CENH3 동형접합 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 적은 CENH3를 가지며, 임의로 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 50% 미만의 CENH3을 갖고, 바람직하게는, 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 약 50% 내지 10%, 예를 들어, 50%, 25%, 또는 12.5%의 CENH3을 갖는, 외떡잎 식물.
29. 제26 내지 제28단락 중 어느 하나에 있어서, 부위-지정 뉴클레아제는 외떡잎식물의 세포에 의해 안정하게 발현되는, 외떡잎 식물.
30. 제29단락에 있어서, 상기 부위 지정 뉴클레아제는 메가뉴클레아제(MN), 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 CRISPR-기반 뉴클레아제이며, 임의로 상기 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, Cfp1 뉴클레아제, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, 키메라 Cas9-시티딘 데아미나아제, 키메라 Cas9-아데닌 데아미나제, 키메라 FEN1-FokI, 및 Mega-TAL, 닉카아제 Cas9(nCas9), 키메라 dCas9 비-FokI 뉴클레아제, dCpf1 비-FokI 뉴클레아제, 키메라 Cpf1-시티딘 데아미나아제, 및 Cpf1-아데닌 데아미나아제로부터 선택되는, 외떡잎 식물.
31. 제29 또는 제30단락에 있어서, 상기 식물의 게놈은 뉴클레아제를 인코딩하는 이종의 핵산 작제물을 포함하는, 외떡잎 식물.
32. 제16 내지 제31단락 중 어느 하나에 있어서, 외떡잎 식물의 세포에 의해 발현되는 가이드 RNA를 추가로 포함하는, 외떡잎 식물.
33. 제29 또는 제30단락에 있어서, 상기 식물의 게놈은 gRNA를 인코딩하는 이종의 핵산 작제물을 포함하는, 외떡잎 식물.
34. 제16 내지 제33단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물의 게놈은 뉴클레아제에 의해 유도된 절단 부위에서 재조합에 의해 도입될 공여체 핵산 서열을 포함하는, 외떡잎 식물.
35. 제16 내지 제34단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마인, 외떡잎 식물.
36. 제1 내지 제15단락 중 어느 하나에 따른 식물에 의해 형성된 난자 세포로서, 난자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 12.5% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 난자 세포.
37. 제1 내지 제15단락 중 어느 하나에 따른 식물에 의해 형성된 정자 세포로서, 정자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 25% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 정자 세포.
38. 제16 내지 제35단락 중 어느 하나에 따른 식물에 의해 형성된 난자 세포로서, 난자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 12.5% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 난자 세포.
39. 제16 내지 제35단락 중 어느 하나에 따른 식물에 의해 형성된 정자 세포로서, 정자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 25% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 정자 세포.
40. 부모 외떡잎 표적 식물을 제1 내지 제15단락 중 어느 하나의 외떡잎 반수체 유도자 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계; 및 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 방법.
41. 제1 내지 제15단락 중 어느 하나의 외떡잎 반수체 유도자 식물을 부모 외떡잎 표적 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계; 및 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 방법.
42. 제40 또는 제41단락에 있어서, 선택된 반수체 자손의 염색체 배가 단계를 추가로 포함하는 방법.
43. 제42단락에 있어서, 염색체 배가 단계는 자발적이거나 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또 다른 항-미소관제로부터 임의로 선택되는 염색체 배가제에 의해 유도되는, 방법.
44. 제40 내지 제43단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 외떡잎 표적 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마로부터 선택되는, 방법.
45. 외떡잎 표적 식물의 게놈을 변형하는 방법으로서
부모 외떡잎 표적 식물을 제16 내지 제35단락 중 어느 하나의 외떡잎 반수체 유도자 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 단계, 및
수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하고,
상기 반수체 자손은 외떡잎 반수체 유도자 식물이 아닌 외떡잎 표적 식물의 게놈을 포함하고, 반수체 자손의 게놈은 외떡잎 반수체 유도자 식물에 의해 전달되는 부위 지정 뉴클레아제 및 임의로 적어도 하나의 가이드 RNA에 의해 변형된, 방법.
46. 외떡잎 표적 식물의 게놈을 변형하는 방법으로서
제16 내지 제35단락 중 어느 하나의 외떡잎 반수체 유도자 식물을 부모 외떡잎 표적 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 단계, 및
수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하고,
상기 반수체 자손은 외떡잎 반수체 유도자 식물이 아닌 외떡잎 표적 식물의 게놈을 포함하고, 반수체 자손의 게놈은 외떡잎 반수체 유도자 식물에 의해 전달되는 부위 지정 뉴클레아제 및 임의로 적어도 하나의 가이드 RNA에 의해 변형된, 방법.
47. 제45 또는 46 단락에 있어서, 선택된 반수체 자손의 염색체 배가 단계를 추가로 포함하는 방법.
48. 제47 단락에 있어서, 상기 염색체 배가 단계는 자발적이거나 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또다른 항-미소관제로부터 임의로 선택되는 염색체 배가제에 의해 유도되는, 방법.
49. 제45 내지 48 단락 중 어느 하나에 있어서, 상기 외떡잎 표적 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마로부터 선택되는, 방법.
실시예
실시예 1: 옥수수 cenh3 널 돌연변이의 제조, 및 반수체 유도를 위한 이의 용도
재료 및 방법
식물 재료
gl1, gl8, 및 cenh3-mu1015598 트랜스포존 삽입 계통이 일리노이주, 어배너의 메이즈 제네틱스 코오퍼레이션 스톡 센터(Maize Genetics Cooperation Stock Center)로부터 수득되었다. cenh3-mu1015598 대립유전자는 UFMu-01386 스톡 계통 중의 여러 가지 돌연변이 중 하나이다. 모든 식물을 조지아 대학교 식물 생물학 온실에서 성장시켰다.
작제물 제조 및 형질전환
Ubi-Cas9 작제물은 Nos 종결자에 의해 종결되는 Cas9의 옥수수 코돈-최적화된 버전을 작동시키는 1991 bp의 옥수수 폴리유비퀴틴 프로모터(진뱅크: S94464.1)를 함유한다.
gRNA-ImmuneCENH3 작제물은 2개의 성분, 가이드 RNA 모듈 및 ImmuneCENH3 유전자를 함유한다. 가이드 RNA 부분은 PolIII 종결자 TTTTTTTT에 의해 종결되는 가이드 RNA(TCCCGCAGCGCTACAGTCCC)(서열번호 1)을 작동시키는 옥수수 U6 프로모터(Svitashev, et al., Plant Physiol. 169, 931-945 (2015))를 함유한다. ImmuneCENH3 부분은 6455 bp의 네이티브 CENH3 유전자(좌표 Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0 상의 Chr6:166705239-166711693)를 함유하지만 gRNA 표적 영역 내에 5개의 침묵 코돈 변화를 갖는다(CCAGGTACGGTCGCCCTGCGCGA)(서열번호 2). 프로모터는 2184 bp의 ATG의 상류 서열을 포함한다.
gRNA-TailswapCENH3 작제물을 생성하기 위해, CENH3의 천연 5' UTR을 유지하고 코돈-최적화 GFP 서열을 ImmuneCENH3의 ATG에 삽입하였다. 이것에 링커 서열 ATGGATGAACTATACAAGGGCGGAGGCGGTGGAGGCGTCGAC(서열번호 3) 및 이의 인트론을 포함하는 옥수수 H3.3 유전자(진뱅크 NM_001294303.2)의 꼬리 서열이 이어졌으며 이는 가이드 RNA 표적 영역의 네이티브 CENH3 유전자 3 bp 상류에 융합되었다. 애기장대 GFP-tailswap 전이유전자는 또한 H3.3 부분을 포함한다. 작제물은 코마이(Comai) 실험실로부터 수득된 애기장대 GFP-tailswap의 서열에 기반하였다.
3개의 작제물이 진스트립트(GenScript)(www.genscript.com)에 의해 합성되고 이원 벡터 pTF101.1 내로 클로닝되었다(Paz, et al., Euphytica 136, 167-179 (2004)). cenh3 돌연변이를 생성하기 위해, Ubi-Cas9을 운반하는 트랜스제닉 게통을 gRNA-ImmuneCENH3을 운반하는 계통과 교배하였다.
DNA 추출, 유전형분석 및 서열 분석
표준 잎 유전형분석을 위해, 게놈 DNA를 CTAB 프로토콜(Clarke, Cold Spring Harbor Protocols vol. 2009 db.prot5177-pdb.prot5177 (2009))을 사용하여 제조하였다. 배유 조직을 낱알이 발아하고 광택이 나는 표현형을 구별할 수 있게 된 후에 수집하였다. 배아와 과피를 집게로 제거하고, 배유를 막자사발과 유봉을 이용해 분말로 만들었다. 배유 DNA는 IBI 플랜트 게노믹 DNA 미니 키트(Plant Genomic DNA Mini Kit)(IBI 사이언티픽(Scientific) IB47231)로 추출하였다.
트랜스제닉 계통에서의 ImmuneCENH3 및 Cas9의 존재를 식별하기 위해, 프라이머 CENH3-F2 및 CENH3-R3를 ImmuneCENH3을 증폭하기 위해 사용하였고, 프라이머 Cas9-F1 및 Cas9-R1을 Cas9을 증폭하기 위해 사용하였다(표 1). Cas9 식물에서 본래의 cenh3 돌연변이를 식별하기 위해, 푸젼 하이-피델리티(Phusion High-Fidelity) PCR 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 입스위치 Ma)를 사용하여 표 1의 프라이머 CENH3-F1 및 CENH3-R1(서열번호 4-14, 이들이 표에 나타난 대로 내림차순으로)과 함께 수행하였다.
표 1: 사용된 프라이머.
Figure pct00011
PCR 생성물을 직접적으로 생거 시퀀싱을 하거나 TOPO TA 클로닝 키트(써모 피셔(Thermo Fisher) #K457501)를 사용하여 클로닝하고 그후에 생거 시퀀싱을 하였다.
ImmuneCENH3가 결여된 계통에서, cenh3 비대립유전자는 PCR 및 제한 효소 소화에 의해 네이티브 CENH3 대립유전자와 구별되었다. PCR은 프라이머 CENH3-F2 및 CENH3-R2을 사용하여 496 bp PCR 생성물을 증폭한다. 이 생성물이 제한 엔도뉴클레아제 AlwNI(뉴 잉글랜드 바이오랩스)으로 소화될 때, 야생형 대립유전자는 284 bp 및 212 bp 크기의 2개의 조각으로 절단되는 반면 돌연변이 cenh3 대립유전자는 절단되지 않는다.
cenh3-mu1015598 대립유전자는 프라이머 CENH3-F4, CENH3-R4 및 뮤믹스(Mumix)(표 1의 2개의 프라이머 Mu1 및 Mu2의 1:1 혼합물)을 사용하여 기록되었다. 야생형 대립유전자는 CENH3-F4 및 CENH3-R4로 증폭되는 반면 Mu 대립유전자는 CENH3-F4 및 뮤믹스로 증폭된다.
배수성 평가
+/cenh3 교배로부터의 자손을 10-13일 동안 성장 조명 아래 실내에서 성장시키고 광택이 나는 표현형을 식별하기 위해 묘목에 물을 뿌렸다. 모든 광택이 나는 식물을 후속으로 유세포 분류에 의해 검정하였다. 각각의 개체에 대해, 약 1g의 순간-동결된 잎 또는 뿌리를 수집하고 1.5 ml의 미리-냉각된 핵 추출 완충액(2 mM EDTA, 15 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM NaCl, 80 mM KCl, 0.5 mM 스페르민, 15 mM 2-머캅토에탄올, 0.1mM PMSF, 0.1% 트리톤 X-100) 중으로 잘게 썰어넣었다. 잘게 썰어넣은 후, 혼합물을 40 μm 세포 체로 2회 여과하였다. 핵은 4,6-디아미디노-2-페닐인돌로 염색하였고 조지아 대학교의 CTEGD 세포측정법 공유 자원 연구소(CTEGD Cytometry Shared Resource Lab)에서 주관하는 유세포 분류기에 로딩되었다.
염색체 스프레드
염색체 분석을 (Dawe, et al., Cell 173, 839-850.e18 (2018))에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 반수체 및 이배체 식물로부터 뿌리 끝을 수집하고, 아산화질소가 있는 챔버에서 3시간 동안 배양하고, 90% 아세트산으로 고정하였다. 뿌리 끝을 면도칼로 자르고 효소 용액(1% 펙토리아제 Y-23, 2% 셀룰로오스 오노즈카(cellulase Onozuka) R-10)에서 37℃에서 50분 동안 소화시켰다. 뿌리 구획을 에탄올 중에 세척하고 그후에 90% 아세트산 중에 담갔다. 금속 곡괭이를 뿌리 끝을 부수기 위해 사용하였고 10 μl의 세포 현탁액을 현미경 슬라이드 상에 떨어뜨렸다. 슬라이드를 건조시키고 DAPI(써모 피셔 Cat# P36931)와 함께 프로롱 골드(ProLong Gold)를 사용하여 유리 커버슬립으로 장착하였다. 슬라이드를 63X 플랜-APO 크로맷(Plan-APO Chromat) 오일 대물렌즈와 함께 자이스 악시오 이미저.M1(Zeiss Axio Imager.M1) 형광 현미경 상에서 이미지화하였고 슬라이드북 소프트웨어(인텔리전스 이미징 이노베이션(Intelligent Imaging Innovations), 덴버, CO, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
반수체 및 이수체의 스킴(skim) 시퀀싱
각각의 시료에 대해, 12 ng/μl DNA를 100 μl 부피에서 30초 온-오프 간격으로 디아지노드 바이오럽터(Diagenode Bioruptor)로 높은 설정에서 7분 동안 초음파 처리하여 평균 약 500 bp 길이의 단편을 수득하였다. DNA 시퀀싱 라이브러리를 KAPA 단일-색인 어댑터(single-indexed adapters)(KK8700)와 함께 KAPA 하이퍼프??(Hyperprep) 키트(KK8502)를 사용하여 제조하였다. 초음파 처리된 DNA의 600 ng을 각각의 시료에 대한 투입물로서 사용하였고, 3회 주기의 PCR을 라이브러리를 증폭시키기 위해 사용하였다. 150-nt 일루미나 시퀀싱 판독은 다음의 패러미터와 함께 큐타댑트(Cutadapt) 버전 1.9.1(Martin, et al., EMBnet.journal vol. 17 10 (2011))을 사용하여 어댑터-트리밍(trimming) 및 품질 필터링되었다: "-q 20 -a AGATCGGAAGAGC -e .05 -O 1 -m 50"(서열번호 15). 판독은 기본 패러미터가 있는 싱글-엔드 모드에서 BWA-mem 버전 0.7.15를 사용하여 Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0에 정렬하였다(Li, & Durbin, Bioinformatics vol. 25 1754-1760 (2009)). 판독 적용범위는 25 Mb 간격으로 계산된 적용범위와 함께 IGV툴스 버전 2.3.98(Thorvaldsd
Figure pct00012
ttir, et al., Brief. Bioinform. 14, 178-192 (2013))을 사용하여 시각화하였다.
결과
배가된 반수체 육종은 새로운 근교 계통의 생산을 가속화하기 위해 널리 사용된다(Kalinowska, et al., Theor.Appl.Genet. 132, 593-605 (2019)). 옥수수 육종 산업 전반에 걸쳐 사용되는 하나의 일반적인 접근법은, 수정을 방해하는 돌연변이가 있는 반수체를 생성하는 것을 수반한다(Kelliher, et al., Nature 542, 105-109 (2017), Liu, et al., Mol. Plant 10, 520-522 (2017), Gilles, et al., EMBO J. 36, 707-717 (2017), Yao, et al., Nat Plants 4, 530-533 (2018), Zhong, et al., Nat Plants 6, 466-472 (2020)). 반수체를 유도하는 완전히 상이한 방법은 시몬 챈(Simon Chan)과 동료들에 의해 개척되었는데, 이들은 구조적으로 변경된 동원체 히스톤 H3(CENH3) 단백질이 있는 애기장대 계통을 교배하는 것이 25-45% 만큼 높은 빈도로 반수체 및 이수체를 수득할 수 있음을 나타내었다(Ravi 및 Chan, Nature 464, 615-618 (2010)). CENH3는 동원체 위치를 정의하고 상위의 키네토코어 단백질을 모집하는 히스톤 변이체이다(Cheeseman & Desai, Nat. Rev. Mol.Cell Biol. 9, 33-46 (2008), Black & Bassett, Curr. Opin. Cell Biol. 20, 91-100 (2008)). 본래의 연구는 CENH3의 N-말단 꼬리가 GFP 태그로 변형된 GFP-tailswap이라고 불리는 작제물을 수반하였지만, CENH3의 점 돌연변이 및 작은 결실도 또한 유사한 빈도로 반수체를 유도할 수 있다(Karimi-Ashtiyani, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 11211-11216 (2015), Kuppu, et al., PLoS Genet. 11, e1005494 (2015), Kuppu, et al., Plant Biotechnol. J. (2020) doi:10.1111/pbi.13365). 애기장대 이외에서, 동원체-매개 반수체 유도는 덜 효과적인 것으로 증명되었으며, 일반적으로 <1% 반수체를 생산한다(Kalinowska, et al., Theor.Appl.Genet. 132, 593-605 (2019)).
현재 연구는 초기에 GFP-tailswap 방법을 사용하여, 옥수수에서 동원체-매개 반수체 유도의 메커니즘을 조사하도록 설계되었다. 그러나, 이 접근법은, 네이티브 cenh3의 돌연변이 및 돌연변이를 보완하는 기능성 GFP-tailswap 전이유전자 둘 다 필요하다는 사실에 의해 복잡해진다. 또 다른 그룹은 유전자의 5' UTR에 로버트슨 뮤테이터(Robertsons Mutator; Mu) 삽입에 의해 야기되는 기존의 옥수수 돌연변이(cenh3-mu1015598)를 사용하여 이미 일부의 성공을 나타내었다(Kelliher, et al., Front. Plant Sci. 7, 414 (2016), Feng, et al., Plant J. (2019) doi:10.1111/tpj.14606)). 그들은 GFP-tailswap을 cenh3-mu1015598 백그라운드 내로 교배시켰고 수컷으로서 교배했을 때 평균 0.86%의 반수체를 관찰하였으며 암컷으로서 교배했을 때 반수체를 관찰하지 못했다(Kelliher, et al., Front. Plant Sci. 7, 414 (2016)). cenh3-mu1015598을 수득하였고 3개의 이형접합 식물을 자가-교배시켰다. 유전형분석은 2개의 이삭이 다양한 성숙 상태로 성장한 낮은 빈도의 동형접합 돌연변이를 분리한다는 점을 드러냈다(표 2).
표 2: cenh3-mu1015598 돌연변이는 널이 아님 * .
Figure pct00013
*WT은 야생형을 나타내고, het은 +/cenh3-mu1015598 이형접합체를 나타내며, hom은 cenh3-mu1015598/cenh3-mu1015598 동형접합체를 나타낸다. 처음 2개의 식물이 동형접합 cenh3-mu1015598 자손을 수득하였음에 유의한다.
동형접합 돌연변이의 회복은 cenh3-mu1015598이 널이 아니라는 점, 및 앞선 결과가 낮은 수준의 야생형 CENH3 발현에 의해 혼동되었을 수 있음을 나타낸다. cenh3-mu1015598 대립유전자의 가변적인 침투성은 Mu 요소가 5' UTR 영역 내로 삽입되었을 때 낮은 수준의 발현을 촉진시킬 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다(Barkan & Martienssen, Proc.Natl.Acad.Sci. U. S. A. 88, 3502-3506 (1991)).
진정한 널 cenh3 대립유전자에 대한 선택을 극복하기 위해, cenh3 널을 2개-작제물 CRIPSR/Cas9 접근법을 사용하여 생성하였다. 한 계통을 유비퀴틴 프로모터에 의해 작동되는 Cas9을 발현하는 단순한 작제물로 형질전환하였다. 두 번째는 네이티브 CENH3 유전자의 네 번째 영역을 표적화하는 gRNA 및 gRNA 표적 영역 내에 5개의 침묵 뉴클레오티드 변화가 있는 전-장 네이티브 CENH3 유전자를 함유하는 "ImmuneCENH3" 유전자를 발현하는 작제물로 형질전환하였다(도 1a, 1b). 2개의 계통이 서로 교배된 후, Cas9은 네이티브 CENH3 유전자에서 돌연변이를 생성하였지만, 전이유전자는 영향을 받지 않았다. CENH3의 N-말단 꼬리에서 즉시 정지 코돈을 야기하는 단일 뉴클레오티드 결실이 있는 cenh3 대립유전자가가 선택되었다(도 1c). ImmuneCENH3의 존재 시, cenh3 돌연변이는 단순한 멘델 열성 형질로서 분리된다(표 3).
표 3: ImmuneCENH3 및 TailswapCENH3 백그라운드에서의 cenh3 의 분리 * .
Figure pct00014
*괄호 안의 숫자는 각각의 유전자형의 식물의 수를 나타낸다.
그후에 애기장대 GFP-tailswap 작제물의 가까운 복제본인 TailswapCENH3으로 트랜스제닉을 생성하였고, 이를 cenh3 돌연변이와 교배시켰다. TailswapCENH3을 함유하고 cenh3에 동형접합인 식물(표 3)은 수득되지 않았는데, 이는 전이유전자가 진정한 널을 보완하지 않음을 나타낸다(도 4a).
이들 연구의 진행 동안, cenh3은 ImmuneCENH3의 부재 시 때때로 유전된다는 사실이 발견되었다. 야생형 계통을 교배시킴으로써, 본래의 전이유전자 둘 다가 결여된 단순한 분리 cenh3 계통이 수득되었다. +/cenh3 계통으로부터의 자가 자손 중에는 163개 +/+ 야생형 개체, 55개 +/cenh3 이형접합체, 및 0개 cenh3/cenh3 동형 접합체가 있었는데, 이는 돌연변이가 동형접합체에 치명적이며 배우체를 통해 잘 유전되지 않음을 나타낸다. +/cenh3 이형접합체와 야생형 식물 사이의 상반 교배가 또한 수행되었다. 멘델 형질은 정상적으로 시험교배 자손의 50%에게 유전되지만, 자손의 12.1%만이 수컷을 통해 교배되었을 때 cenh3를 받았고 암컷을 통해 교배되었을 때 25%임이 관찰되었다(표 4).
표 4: 수컷 및 암컷 교배를 통한 cenh3 의 유전 * .
Figure pct00015
*WT은 야생형을 나타내고, het은 +/cenh3 이형접합체를 나타내며, hom은 cenh3/cenh3 동형접합체를 나타낸다.
유전의 감소는 정자 및 난자가 다세포의 반수체 배우체 내에서 운반되기 때문에 설명될 수 있다. 2회의 반수체 세포 분열이 정자의 형성에 선행하고 3회의 반수체 세포 분열이 난자의 형성에 선행한다. cenh3 대립 유전자가 있는 배우체는 CENH3이 각각의 세포 주기에서 자연적으로 희석되는 동안 포자체 단계로부터 운반된 CENH3를 사용해야만 한다(Lermontova, et al., Plant Cell 18, 2443-2451 (2006)). 이 모델 하에서, cenh3 정자는 CENH3의 정상적인 양의 약 ¼을 가질 것이며 cenh3을 운반하는 난자는 cenh3 이형접합 부모에 비해 약 ⅛을 가질 것이다(도 4b). 유전자량 보전이 없다고 가정하면, 이 값은 정상적인 동형접합 야생형 부모에 비해 추가적으로 ½만큼 감소할 것이다. 결과적으로, cenh3을 운반하는 정자 및 난자는 보다 작은 동원체를 가질 수 있다.
+/cenh3 이형접합 돌연변이가 반수체를 유도할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, cenh3 이형접합체를 두 방향으로 시험자 계통과 교배하였다. 첫 번째 시험에서 야생형과 +/cenh3 식물을, 묘목 잎이 빛나는 외관을 갖는 것을 야기하는 5번 염색체 상의 열성 glossy8(gl8) 돌연변이에 대해 동형접합인 계통으로 교배하였다(Xu, et al., Plant Physiology vol. 115 501-510 (1997)). +/cenh3 이형접합체가 수컷으로서 교배되었을 때, 자손의 0.5%가 광택이 났고, +/cenh3 식물이 암컷으로서 교배되었을 때 자손의 5.0%가 반수체인 것으로 관찰되었다(표 5).
표 5: +/cenh3 이형접합체에 의한 반수체 및 이수체 유도.
Figure pct00016
유세포 분류 분석 광택이 나는 모든 식물이 반수체라는 사실을 드러냈으며(도 2a-2b), 이의 해석은 3개 식물의 뿌리 끝 세포에서 염색체를 계수함으로써 입증되었다(도 2c-2d). 성숙기까지 성장했을 때 반수체 식물은 키가 작고 불임이었다(Chase, Bot. Rev. 35, 117-168 (1969)) (도 2e-2f). 또한 이수체라고 여겨진, 성장을 저해당한 표현형의 2개의 광택이 나지 않는 식물이 관찰되었다. 이들 두 식물을 6개의 반수체와 함께 스킴 시퀀싱하였다. 반수체는 균일한 서열 적용범위를 나타냈지만, 성장을 저해당한 식물은 그렇지 않았으며; 하나는 3번 염색체에 대해 삼염색체적이고 다른 하나는 2번 및 4번 염색체에 대해 일염색체적이고 10번 염색체에 대해 삼염색체적이었다(도 3a-3b).
두 번째 세트의 시험은 glossy1(gl1)을 사용하여 수행하였는데, 이는 유사한 표현형을 갖지만 7번 염색체 상에 돌연변이를 갖는다(Sturaro, et al., Plant Physiol. 138, 478-489 (2005)). 이 교배에서 발아율이 또한 기록되었는데, 이는 애기장대 반수체 유도자의 효능을 기록하기 위해 일반적으로 사용되는 핵형 이상(karyotypic abnormality)의 간접적인 척도이다(Kuppu, et al., PLoS Genet. 11, e1005494 (2015), Ravi, et al., Nature Communications vol. 5 (2014), Maheshwari, et al., PLoS Genet. 11, e1004970 (2015)). +/cenh3 이형접합체가 암컷인 교배에서, 자손의 5.2%가 광택이 나는 표현형을 나타내었고 유세포 분류 측정에 의해 반수체였다. 자손의 또 다른 3.3%도 광택이 나는 표현형을 나타냈지만 반수체에 대해 기대되는 것보다 높은 DNA 함량을 가졌으며 이수체로서 기록되었다(표 6).
표 6: +/ cenh3 식물 및 gl1 시험자 사이의 개별적인 교배의 결과.
Figure pct00017
상이한 교배는 발아율(65-91%), 반수체의 빈도(1.2-8.9%) 및 이수체(2.1-5.1%)에서 상당히 상이하였다(표 6). 5개의 이수체 식물로부터의 서열 데이터는 1개를 제외한 모든 식물이, 때로는 다른 염색체의 상실과 함께 7번 염색체가 결손되어 있음을 입증하였다. 7번 염색체의 2개의 완전한 사본을 갖는 것으로 보이는 1개의 광택이 나는 식물은 스킴 시퀀싱으로 검출이 가능하지 않은 작은 중간 결실을 가질 것이다(분절 이수체는 애기장대 GFP-tailswap 교배에서 일반적임(Tan, et al., Elife 4, (2015))). gl1 시험으로부터의 결과는 애기장대에서 관찰된 것과 보다 일치하며, 여기서 GFP-tailswap과의 임의의 주어진 교배는 일반적으로 유사한 비율로 반수체 및 이수체를 수득한다(Ravi 및 Chan, Nature 464, 615-618 (2010), Ravi, et al., Nature Communications vol. 5 (2014), Maheshwari, et al., PLoS Genet. 11, e1004970 (2015)).
CENH3 희석이 반수체 유도의 기본 메커니즘인 경우, 그러면 +/cenh3 부모로부터 cenh3 돌연변이를 운반하는 배우자만이 반수체를 유도해야한다. 불행하게도 반수체 유도자의 게놈은 상실되기 때문에 cenh3 대립유전자의 존재에 대해 묘목을 기록하는 것은 불가능하다. 그러나, 애기장대 GFP-tailswap 교배로부터의 데이터는 묘목이 반수체일 때 배유가 완전한 단친성 게놈 제거를 거의 나타내지 않음을 나타낸다(Ravi, et al., Nature Communications vol. 5 (2014)). 옥수수에서도 사실이라면, 배유의 유전자형이 묘목의 본래의 유전자형을 결정하기 위해 사용될 수 있다. +/cenh3 X gl8 교배로부터생산된 11개의 반수체 식물의 세트로부터의 나머지 배유를 유전형분석하였다. 결과는 11개 모두가 cenh3 대립유전자에 대해 이형접합인 것을 드러냈으며, 이는 반수체 유도가 cenh3 배우자에서의 낮은 CENH3 수준의 결과라는 해석을 강력하게 뒷받침한다.
동원체-매개 반수체 유도의 눈에 띄는 요소 중 하나는 이것이 자손의 하위집합에서만 효과적이라는 것이다. 일부 개체에서, 반수체 유도자 식물로부터의 모든 염색체는 상실되고, 또다른 훨씬 더 큰 하위집합에서는 어떤 염색체 상실도 발생하지 않는다. 상대적으로 작은 이수체 부류가 "부분적 반수체 유도" 사건을 제시하는데, 여기서 일부 염색체는 상실되지만 다른 것은 생존한다. gl8 교배가 gl1 교배보다 더 많은 진정한 반수체를 수득했다는 사실은, 전자가 여름에 수행된 반면 후자는 겨울에 수행되었다는 사실과 관련이 있을 수 있다. 또한 선택 계획이 일조했을 가능성도 있다. 높은 빈도로 일염색체성을 생성하는 옥수수 r-X1 결실 계통을 사용한 연구는 다른 것들보다 높은 빈도로 일염색체성으로서 일부 염색체를 회복시킴을 입증하였다28. (gl8이 있는) 5번 염색체에 대한 일염색체성은 거의 회복되지 않는 반면에 (gl1이 있는) 7번 염색체에 대한 일염색체성은 훨씬 더 일반적이다(17배 더 일반적임(Weber, Use of Maize Monosomics for Gene Localization and Dosage Studies. in The Maize Handbook (eds. Freeling, M. & Walbot, V.) 350-358 (Springer New York, 1994))). 실제로, gl1 교배로부터의 5개의 시퀀싱된 이수체 중 2개는 7번 염색체에 대해서만 일염색체적이었다(표 6). 이들 데이터는 gl8 시험자가 반수체의 회복을 선호하는 반면 gl1 시험자는 더 넓은 범위의 배수체를 회복한다는 것을 나타낼 수 있다.
동원체 매개 반수체 유도에 관한 모든 앞선 문헌은 CENH3의 변이체 또는 CENH3의 변경된 또는 부분적으로 결실된 형태를 생산하는 대립유전자를 이용한 비대립유전자의 보완을 기재한다(Ravi 및 Chan, Nature 464, 615-618 (2010), Karimi-Ashtiyani, et al., Proc. Natl.Acad.Sci. U. S. A. 112, 11211-11216 (2015), Kuppu, et al., Plant Biotechnol. J. (2020) doi:10.1111/pbi.13365, Maheshwari, et al., PLoS Genet. 11, e1004970 (2015), Ishii, et al., Annu. Rev. Plant Biol. 67, 421-438 (2016)). 이들 데이터는, 다른 가능한 메커니즘과 비교하여(Wang & Dawe, Molecular Plant vol. 11 398-406 (2018), Karimi-Ashtiyani, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 11211-11216 (2015), Ravi, et al., PLoS Genet. 7, e1002121 (2011), Wang, et al., Plant Methods 15, 42 (2019), Sanei, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, E498-505 (2011), Tan, et al., Elife 4, (2015)), 반수체 유도가 두 개의 구조적으로 상이한 형태의 CENH3 사이의 경쟁, 및 부적절한 조립에 대한 감시 메커니즘에 의해 변경된 동원체의 궁극적인 거부에 의해서 야기된다는 본래의 해석을 유지하는 데 도움이 되었다(Ravi and Chan, Nature 464, 615-618 (2010), Britt and Kuppu, Front. Plant Sci. 7, 357 (2016), Kalinowska, et al., Theor. Appl. Genet. 132, 593-605 (2019), Kuppu, et al., Plant Biotechnol. J. (2020) doi:10.1111/pbi.13365, Maheshwari, et al., PLoS Genet. 11, e1004970 (2015), Copenhaver, & Preuss, Nat. Biotechnol. 28, 423-424 (2010)).
대조적으로, 본원의 데이터는 DNA 또는 다른 히스톤과 상호작용하는 모든 서열을 제거하는 N-말단 꼬리 내의 cenh3 돌연변이를 사용하여 높은 수준의 반수체 유도를 달성하였다. 그러므로, CENH3 단독의 정량적인 감소는 동원체-매개 반수체 유도를 유도할 수 있다. cenh3 널 접근법의 주요 이점은 식물이 건강하고 과정이 간단하다는 점이다. cenh3과 교배되는 임의의 계통이 반수체 유도자가 된다. 사용의 용이성은 반수체를 기반으로 하는 다른 기술, 예컨대 합성 아포믹시스(Marimuthu, et al., Science, 331(6019):876 (2011), Wang, et al., aBIOTECH, 1:15-20(2020)), 한 계통에서 또 다른 것으로의 조작된 염색체의 전달((Birchler, et al., Current Opinion in Plant Biology, 19:76-80 (2014)), 및 유전자형-독립적인 유전자 편집(Kelliher, et al., Nat. Biotechnol. 37, 287-292 (2019))와 결합할 때 특히 다용도로 만들어야 한다.
실시예 2: 동시 유전자 편집과 반수체 유도
재료 및 방법
cenh3 반수체 유도자의 사용은 동시 반수체 유도 및 유전자 편집을 수반한다. 이 사용의 실시예에서, cenh3 널을 CRISPR 작제물(Cas9 및 하나 이상의 가이드 RNA 둘 다를 발현함)을 함유하는 계통과 먼저 교배된다. cenh3 및 CRISPR 성분 둘 다 있는 이 잡종 계통은 그후에 암컷으로서 수컷 야생형 옥수수 계통과 교배된다. 수정 시, 거의 5%의 자손이 반수체일 것이고, 이들 중에서 대략 절반이 Cas9 및 가이드 RNA(들)을 발현하는 CRISPR 작제물을 받았을 것으로 여겨진다. CRISPR 성분은 초기 접합 분열 시 발현되며 부계 게놈의 게놈 상에서 유전자 편집을 촉매할 수 있다. 암컷 부모의 게놈은 반수체 유도 동안 신속하게 상실되어, CRISPR 성분을 제거하고 부계 게놈만을 남기며, 이의 분획은 지속적인 유전자 편집을 가질 것이다.
동시 유전자 편집과의 반수체 유도를 시험하기 위해, 유비퀴틴 프로모터로부터 Cas9를, 및 식물 발달을 제어하는 4개의 유전자를 표적화하는 8개의 가이드 RNA를 발현하는 CRISPR 작제물과 cenh3 널을 교배하도록 실험을 설계하였다: 대화(fasciated) 이삭-2(fea2), 대화 이삭-3(fea3), 소형 식물-2(ct2), 및 두꺼운 수염 난쟁이-1(thick tassel dwarf1; td1). CRISPR 작제물은 먼저 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 B104로 불리우는 근교종 내로 도입되었다. 트랜스제닉 B104 계통은 그후에 이형접합 cenh3 널 식물과 교배되었다. 이 교배의 자손으로부터, CRISPR 작제물 및 cenh3 둘 다가 있는 식물을, 반수체를 식별하기 위해 luteus-1이라고 불리는 열성 돌연변이에 대해 동형접합인 옥수수 계통과 교배하였다.
결과
총 192개의 식물 중, 7개가 반수체인 것으로 증명되었다. 총 40개의 이배체 식물 및 모든 7개의 반수체 식물을 각각의 가이드 RNA 부위에서 편집에 대해 (앰플리콘 생거 시퀀싱에 의해) 유전형검사하였다. 전반적인 편집 빈도는 낮았는데, 40개 이배체 식물 중 총 5개 편집을 수득하였다. 그러나, 중요하게도, 반수체 식물 중 하나는 fea2 유전자에서 편집되었다. 반수체 식물에서의 편집은 이 돌연변이의 공지된 열성 표현형과 일치하는 대화 이삭 표현형을 부여하였다(Taguchi-Shiobara, et al., Genes Dev. 15: 2755-2766 (2001)). 반수체에서 1/7의 편집 빈도는 이배체에서의 5/40의 편집 빈도와 거의 일치하는데, 이는 이 작은 초기 시도 실험에서, 편집이 반수체 및 이배체에서 거의 효율적임을 나타낸다.
추가로 주목해야 할 점은 단일 편집이 비-표준 유형이라는 사실이다. 이배체에서의 편집이 비-상동 말단 접합(NHEJ)에 의한 절단 및 복구와 일치하는 동시에, 반수체 식물은 또다른 측면 상의 상동성의 짧은 영역에 의해 플랭킹된 삽입을 함유하였다. 이 유형의 편집은 잘못된 상동성-지향 복구(HDR)을 나타낼 수 있다(Xue and Greene, Trends in Genetics, DOI:10.1016/j.tig.2021.02.008. (2021)). 이들 데이터는 HDR이 반수체 유도자 계통으로부터의 염색체의 상실에 앞서, 초기 접합 분열 동안 활성화되고, 절단 및 복구가 두 게놈이 모두 존재하는 짧은 시간 동안 일어날 수 있다는 사실을 믿도록 하는 이유를 제공한다. HDR은 프로모터 또는 새로운 서열이 있는 유전자의 대체를 수반하는 많은 CRISPR 적용법의 경우에 중요한 형태의 복구이다(Zhang et al., Nat Plants, 5: 778-794 (2019)).
이들 실험의 결과는 도 5a-5d 및 표 7 및 8에 예시되어 있다. 도 5a는 동시 반수체 유도 및 유전자 편집을 위해 사용되는 CRISPR 작제물의 플라스미드 맵이다. 작제물 성분이 나타나있다.
표 7: Cas9 및 8개의 gRNA(서열번호 30-37, 이들이 표에 나타난 대로 내림차순으로)를 운반하는 cenh3 이형접합 식물의 이배체 및 반수체 자손으로부터의 편집의 빈도.
Figure pct00018
표 8: 편집의 예시/정렬(서열번호 38-47, 이들이 표에 나타난 대로 내림차순으로)
Figure pct00019
이배체 식물에서의 편집은 gRNA 영역 내에 있었으며, 이는 NHEJ에 의한 절단 및 복구와 일치한다. 반수체 식물에서의 편집은 잘못된 HDR에 의한 복구를 암시하는 81 bp 삽입이며, 아마도 이는 마이크로상동성의 플랭킹 영역에 의해 매개된다. 주석은 다음의 특성을 나타낸다: 가이드 RNA 표적 영역, PAM 부위; 결실된 염기(파선); 이중 영역; 상동성 플랭킹 중복. WT = 야생형.
(ZmGB1에 지시된) 상이한 작제물을 이용한 매우 작은 실험은 반수체에서의 어떤 검출가능한 편집도 수득하지 않았고 이배체에서는 근소한 편집만을 수득하였다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 개시된 발명이 속한 당해 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 인용된 간행물 및 이들이 인용된 자료는 구체적으로 참조로 통합된다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 발명의 구체적인 실시예에 대한 많은 등가물을 인식할 것이거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 의해 아울러지는 것으로 의도된다.
<110> UNIVERSITY OF GEORGIA RESEARCH FOUNDATION, INC. COLD SPRING HARBOR LABORATORY DAWE, R. KELLY JACKSON, DAVID <120> HETEROZYGOUS CENH3 MONOCOTS AND METHODS OF USE THEREOF FOR HAPLOID INDUCTION AND SIMULTANEOUS GENOME EDITING <130> UGA 2020-139-03 <150> U.S.S.N. 63/036,902 <151> 2020-06-09 <150> U.S.S.N. 63/036,910 <151> 2020-06-09 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 1 tcccgcagcg ctacagtccc 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 2 ccaggtacgg tcgccctgcg cga 23 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 3 atggatgaac tatacaaggg cggaggcggt ggaggcgtcg ac 42 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 4 tgcaagatga gggcgaatgt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 5 tacttcctga tctcccgcag c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (55)

  1. 기능성 동원체 히스톤 3(CENH3) 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자만을 포함하는 이배체 식물 세포를 포함하는, CenH3에 대해 이형접합인 외떡잎 반수체 유도자 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이배체 식물 세포는 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 CenH3 대립유전자를 포함하는, 외떡잎 식물.
  3. 제2항에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 단백질 비대립유전자(protein null allele)인, 외떡잎 식물.
  4. 제3항에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 RNA 비대립유전자인, 외떡잎 식물.
  5. 제1항에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 기능을 폐지하는 정지 코돈을 생성하는 프레임시프트 돌연변이에 의해 야기되는, 외떡잎 식물.
  6. 제1항에 있어서, 제1 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 결실된, 외떡잎 식물.
  7. 제3항에 있어서, 제2 이배체 염색체 상의 상기 내인성 CenH3 유전자좌는 온전한, 외떡잎 식물.
  8. 제7항에 있어서, 기능성 CENH3 단백질은 야생형 CENH3 단백질인, 외떡잎 식물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물은 야생형 CenH3을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물은 CENH3 변이체 또는 융합 단백질을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
  11. 제10항에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 녹색 형광 단백질을 포함하는, 외떡잎 식물.
  12. 제11항에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 GFP-tailswap인, 외떡잎 식물.
  13. 제12항에 있어서, 정자 또는 난자는 CENH3 동형접합 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 적은 CENH3를 가지며, 임의로 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 50% 미만의 CENH3을 갖고, 바람직하게는, 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 약 50% 내지 10%, 예를 들어, 50%, 25%, 또는 12.5%의 CENH3을 갖는, 외떡잎 식물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마인, 외떡잎 식물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 식물은 옥수수인, 외떡잎 식물.
  16. 제1항에 있어서, 외떡잎 식물의 세포에 의해 발현되는 외인성 부위-지정 뉴클레아제를 추가로 포함하는, 외떡잎 식물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 이배체 식물 세포는 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 CenH3 대립유전자를 포함하는, 외떡잎 식물.
  18. 제17항에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 단백질 비대립유전자인, 외떡잎 식물.
  19. 제18항에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 상기 대립유전자는 RNA 비대립유전자인, 외떡잎 식물.
  20. 제16항에 있어서, 비-기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 대립유전자는 기능을 폐지하는 정지 코돈을 생성하는 프레임시프트 돌연변이에 의해 야기되는, 외떡잎 식물.
  21. 제18항에 있어서, 제1 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 결실된, 외떡잎 식물.
  22. 제18항에 있어서, 제2 이배체 염색체 상의 내인성 CenH3 유전자좌는 온전한, 외떡잎 식물.
  23. 제22항에 있어서, 기능성 CENH3 단백질은 야생형 CENH3 단백질인, 외떡잎 식물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 식물은 야생형 CenH3을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 식물은 CENH3 변이체 또는 융합 단백질을 인코딩하는, 염색체적으로 통합된 또는 염색체외의 전이유전자가 결여된, 외떡잎 식물.
  26. 제25항에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 녹색 형광 단백질을 포함하는, 외떡잎 식물.
  27. 제26항에 있어서, 식물로부터 결여된 상기 융합 단백질은 GFP-tailswap인, 외떡잎 식물.
  28. 제27항에 있어서, 정자 또는 난자는 CENH3 동형접합 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 적은 CENH3를 가지며, 임의로 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 50% 미만의 CENH3을 갖고, 바람직하게는, 상기 정자 또는 난자는 야생형 식물의 정자 또는 난자보다 약 50% 내지 10%, 예를 들어, 50%, 25%, 또는 12.5%의 CENH3을 갖는, 외떡잎 식물.
  29. 제28항에 있어서, 부위-지정 뉴클레아제는 외떡잎 식물의 세포에 의해 안정하게 발현되는, 외떡잎식물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 부위 지정 뉴클레아제는 메가뉴클레아제(MN), 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 CRISPR-기반 뉴클레아제이며, 임의로 상기 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, Cfp1 뉴클레아제, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, 키메라 Cas9-시티딘 데아미나아제, 키메라 Cas9-아데닌 데아미나제, 키메라 FEN1-FokI, 및 Mega-TAL, 닉카아제 Cas9(nCas9), 키메라 dCas9 비-FokI 뉴클레아제, dCpf1 비-FokI 뉴클레아제, 키메라 Cpf1-시티딘 데아미나아제, 및 Cpf1-아데닌 데아미나아제로부터 선택되는, 외떡잎 식물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 식물의 게놈은 뉴클레아제를 인코딩하는 이종의 핵산 작제물을 포함하는, 외떡잎 식물.
  32. 제30항에 있어서, 외떡잎 식물의 세포에 의해 발현되는 가이드 RNA를 추가로 포함하는, 외떡잎 식물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 식물의 게놈은 gRNA를 인코딩하는 이종의 핵산 작제물을 포함하는, 외떡잎 식물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 식물의 게놈은 뉴클레아제에 의해 유도된 절단 부위에서 재조합에 의해 도입될 공여체 핵산 서열을 포함하는, 외떡잎식물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마인, 외떡잎 식물.
  36. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 식물에 의해 형성된 난자 세포로서, 난자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 12.5% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 난자 세포.
  37. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 식물에 의해 형성된 정자 세포로서, 정자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 25% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 정자 세포.
  38. 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 식물에 의해 형성된 난자 세포로서, 난자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 12.5% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 난자 세포.
  39. 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 식물에 의해 형성된 정자 세포로서, 정자 세포는 기능성 CENH3 단백질을 인코딩하는 하나의 대립유전자가 결여되어 있고 CenH3 동형접합 식물에 의해 형성된 상응하는 난자 세포에 비해 약 25% 이하의 기능성 CENH3 단백질을 포함하는, 정자 세포.
  40. 부모 외떡잎 표적 식물을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 외떡잎 반수체 유도자 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계; 및 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 선택된 반수체 자손의 염색체 배가 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 염색체 배가 단계는 자발적이거나 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또 다른 항-미소관제로부터 임의로 선택되는 염색체 배가제에 의해 유도되는, 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 외떡잎 표적 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마로부터 선택되는, 방법.
  44. 제1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 외떡잎 반수체 유도자 식물을 부모 외떡잎 표적 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계; 및 수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 선택된 반수체 자손의 염색체 배가 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 염색체 배가 단계는 자발적이거나 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또 다른 항-미소관제로부터 임의로 선택되는 염색체 배가제에 의해 유도되는, 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 외떡잎 표적 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마로부터 선택되는, 방법.
  48. 외떡잎 표적 식물의 게놈을 변형하는 방법으로서,
    부모 외떡잎 표적 식물을 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항의 외떡잎 반수체 유도자 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 단계, 및
    수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하고,
    상기 반수체 자손은 외떡잎 반수체 유도자 식물이 아닌 외떡잎 표적 식물의 게놈을 포함하고, 반수체 자손의 게놈은 외떡잎 반수체 유도자 식물에 의해 전달되는 부위 지정 뉴클레아제 및 임의로 적어도 하나의 가이드 RNA에 의해 변형된, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 선택된 반수체 자손의 염색체 배가 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 염색체 배가 단계는 자발적이거나 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또 다른 항-미소관제로부터 임의로 선택되는 염색체 배가제에 의해 유도되는, 방법.
  51. 제48항에 있어서, 상기 외떡잎 표적 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마로부터 선택되는, 방법.
  52. 외떡잎 표적 식물의 게놈을 변형하는 방법으로서,
    제16항 내지 제35항 중 어느 한 항의 외떡잎 반수체 유도자 식물을 부모 외떡잎 표적 식물로부터의 꽃가루와 수분시키는 단계를 포함하는 표적 반수체 외떡잎 식물의 형성을 유도하는 단계, 및
    수분에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계를 포함하고,
    상기 반수체 자손은 외떡잎 반수체 유도자 식물이 아닌 외떡잎 표적 식물의 게놈을 포함하고, 반수체 자손의 게놈은 외떡잎 반수체 유도자 식물에 의해 전달되는 부위 지정 뉴클레아제 및 임의로 적어도 하나의 가이드 RNA에 의해 변형된, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 선택된 반수체 자손의 염색체 배가 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 염색체 배가 단계는 자발적이거나 콜히친, 프로나미드, 디티피르, 트리플루랄린, 또는 또 다른 항-미소관제로부터 임의로 선택되는 염색체 배가제에 의해 유도되는, 방법.
  55. 제52항에 있어서, 상기 외떡잎 표적 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 보리, 귀리, 라이밀, 호밀, 펄 밀렛, 손가락 조, 기장, 조, 바나나, 대나무, 사탕수수, 스위치그래스, 억새, 아스파라거스, 양파, 마늘, 쪽파, 또는 참마로부터 선택되는, 방법.
KR1020237000949A 2020-06-09 2021-06-09 이형접합 cenh3 외떡잎식물 및 반수체 유도 및 동시 게놈 편집을 위한 이의 사용 방법 KR20230021743A (ko)

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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240060081A1 (en) * 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
CN116463348B (zh) * 2023-05-26 2024-05-14 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9***编辑玉米ZmCENH3基因的sg RNA及其应用
CN117305326B (zh) * 2023-11-29 2024-02-09 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 青花菜BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009137135A2 (en) * 2008-02-15 2009-11-12 Zgi, Inc. On-orbit procedures for adapting plants and animals to hostile environments
CA3175800A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-14 The Regents Of The University Of California Generation of haploid plants and improved plant breeding
EP2697377A1 (en) * 2011-04-15 2014-02-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Self-reproducing hybrid plants
BR112015002664B1 (pt) * 2012-08-06 2022-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Método de aumento da produção de sementes hibridas de milho em um campo
UA124293C2 (uk) * 2014-08-28 2021-08-25 Квс Саат Се Рослина, яка має біологічну активність гаплоїдного індуктора, і спосіб її застосування
BR112018008109A2 (pt) * 2015-10-20 2018-11-06 Pioneer Hi Bred Int métodos para modificar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula vegetal, produzir uma planta, produzir tecido de calo de planta que tem uma sequência de nucleotídeos modificada em seu genoma sem o uso de um marcador selecionável, e planta de progênie da planta
NL2015753B1 (en) * 2015-11-09 2017-05-26 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel Bv Non-transgenic haploid inducer lines in cucurbits.
JP2019516373A (ja) * 2016-05-20 2019-06-20 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法
US20190376075A1 (en) * 2016-12-02 2019-12-12 Syngenta Participations Ag Simultaneous gene editing and haploid induction
US10519456B2 (en) * 2016-12-02 2019-12-31 Syngenta Participations Ag Simultaneous gene editing and haploid induction
CN111394386A (zh) * 2018-04-12 2020-07-10 中国水稻研究所 一种利用植物杂种优势的方法
WO2019234129A1 (en) * 2018-06-05 2019-12-12 KWS SAAT SE & Co. KGaA Haploid induction with modified dna-repair
CN113631715A (zh) * 2018-10-12 2021-11-09 先正达农作物保护股份公司 新的小麦cenh3等位基因

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