KR20230020593A - Sncg를 표적으로 하는 퇴행성 관절염 치료 또는 진단용 조성물 - Google Patents

Sncg를 표적으로 하는 퇴행성 관절염 치료 또는 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SNCG (Synuclein Gamma) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 퇴행성 관절염 발병시 SNCG 발현 및 활성이 증가하고, 이에 따라 연골 파괴를 유도하는 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 발현 증가를 확인하였으며, SNCG 발현 억제에 의해 상기 유전자들의 발현이 억제되는 것을 확인함에 따라, SNCG를 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커로 제공하고, SNCG 발현을 결핍시킨 결과, 퇴행성 관절염이 개선되는 효과를 확인함에 따라, 상기 SNCG 발현 또는 활성 억제제를 퇴행성 관절염 치료제로 제공하고자 한다.

Description

SNCG를 표적으로 하는 퇴행성 관절염 치료 또는 진단용 조성물{Composition for treating or diagnosing osteoarthritis targeting SNCG}
본 발명은 SNCG (Synuclein Gamma)를 표적으로 하는 퇴행성 관절염 치료 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 관절염 (osteoarthritis, OA)은 주로 연골 형성 (cartilage ECM synthesis) 억제 및 연골조직 파괴 (cartilage destruction) 촉진으로 오는 퇴행성관절 질환이다. 노화와 관련된 많은 병인학적 위험 인자들과 병리생리학적 과정들이 퇴행성관절염의 진행에 기여한다. 관절 불안정성과 손상을 포함한 기계적 스트레스 및 퇴행성관절염에 걸리기 쉽게 하는 노화 관련 인자들이 잠재적인 퇴행성관절염 야기 기작들이다. 이러한 인자들은 다양한 이화 및 동화 인자들을 생산하는 독특한 세포 타입인 연골세포 내 생화학적 경로들의 활성화로 인해 Mmp (Matrix metalloproteinase)에 의한 ECM (extracellular matrix)의 분해, 그리고 연골세포의 탈분화 (dedifferentiation) 및 아팝토시스 (apoptosis)를 통한 ECM 합성의 중단을 초래한다. 특히, 관절을 이루고 있는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다.
반면, 류마티스관절염 (rheumatoid arthritis, RA)의 경우, 연골세포 및 연골조직 파괴로 인해 유발되는 퇴행성 관절염과는 달리, 자가면역반응에 의한 질환의 진행이 중요한 원인 인자로 알려져 있다. 류마티스 관절염은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로 하는, 만성 자가면역 질환 (autoimmune diseases)으로서, 퇴행성관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막 (synovial membrane)의 염증이 관절막 (joint capsule)과 인대 (ligament), 건 (tendon)으로 퍼지고, 뼈로 침범하여 진행되게 된다. 따라서, 퇴행성관절염과 류미티스 관절염은 그 발명 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.
지금까지 알려진 류마티스관절염 치료제로는 염증 기전을 차단하기 위해 적당한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs), 페니실라민, 스테로이드성 호르몬, TNF 억제제, 인터류킨 억제제, JAK 억제제, 항-CD 관련 억제제 등이 이에 해당한다. 관절 통증 및 염증 완화 목적으로 NSAID 약물 및 스테로이드성 호르몬이 퇴행성관절염 환자에 사용되고 있지만, 이는 질병 자체를 치료하기 보다는 증상만을 완화시키므로 실질적인 퇴행성관절염 치료제로서의 역할은 될 수 없다. 뿐만 아니라, 연골세포 및 연골조직 파괴에 의해 주로 발생하는 퇴행성관절염은 그 발병 원인과 현상이 염증성 관절염인, 류마티스관절염과는 엄연히 다르기 때문에, 퇴행성관절염 치료방법 역시 류마티스관절염 치료방법과는 다를 수밖에 없다.
따라서, 퇴행성 관절염의 진행을 막거나 늦추기 위해서는 퇴행성관절염을 조기에 진단할 필요가 있으나, 현재까지는 퇴행성관절염을 진단하는 방법으로 정형외과의 병원내진 또는 X-ray와 같은 방법 등 만이 알려져 있는 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0104905호 (2016.09.06. 공개)
본 발명은 SNCG의 발현 또는 활성 수준 변화를 확인하여 퇴행성 관절염을 조기에 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 상기 바이오마커를 발현 수준을 측정할 수 있는 진단키트를 제공하며, 상기 바이오마커를 이용한 퇴행성 관절염 진단방법, 퇴행성 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
또한, SNCG 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 SNCG (Synuclein Gamma) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 검체로부터 분리된 시료로부터 SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 관절염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 퇴행성 관절염 환자로부터 분리된 연골세포에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 연골세포로부터 SNCG 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 SNCG 발현 수준이 후보물질 비처리군과 비교하여 감소된 후보물질을 퇴행성 관절염 치료제로 제공하는 퇴행성 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 SNCG 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 SNCG 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 SNCG 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유하는 SNCG 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 퇴행성 관절염 발병시 SNCG 발현 및 활성이 증가하고, 이에 따라 연골 파괴를 유도하는 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 발현 증가를 확인하였으며, SNCG 발현 억제에 의해 상기 유전자들의 발현이 억제되는 것을 확인함에 따라, SNCG를 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커로 제공하며, SNCG를 결핍시킨 결과, 퇴행성 관절염이 완화되는 효과를 확인함에 따라, 상기 SNCG 발현 또는 활성 억제제를 퇴행성 관절염 치료제로 제공하고자 한다.
도 1은 SNCG 발현이 퇴행성관절염 환자 및 퇴행성관절염 유발 마우스 관절 조직에서 SNCG 발현을 확인한 결과로, 도 1A는 사람 관절에서 확인한 결과이며, 도 1B는 마우스 관절에서 확인한 결과이다.
도 2는 SNCG 발현의 변화(modulation)와 퇴행성 관절염과의 상관관계를 확인한 결과로, 도 2A는 재조합 SNCG를 농도별로 연골세포에 처리하였을 때 Mmp3, Mmp13 및 Cox2와 같은 catabolic factor가 증가됨을 확인 할 수 있었으며, 동시에 Col2 및 Sox9과 같은 anabolic factor의 발현이 감소되는 것을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 도 2B는 연골세포에 Ad-C 또는 Ad-SNCG로 감염된 연골 세포에서 SNCG, MMP3, MMP13 및 COX2 발현이 증가하고 동시에 Col2 및 Sox9의 발현이 감소되는 것을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 도 2C 및 도 2D는 사프라닌-O 염색, OARSI 등급, 골극 형성 및 연골하 골판 두께로 평가된 Ad-C 및 Ad-SNCG가 관절 내로 주입된 마우스 무릎 관절의 연골 파괴 및 퇴행성 관절염 발달을 확인한 결과로, SNCG가 과발현 되었을 때 연골파괴가 촉진되는 것을 확인한 결과이다.
도 3은 SNCG 녹아웃 마우스에서 퇴행성 관절염 병인이 감소되는 것을 확인한 결과로, 도 3A는 WT 및 SNCG 녹아웃 마우스에 수술 DMM을 적용하여 퇴행성 관절염을 유도한 후 연골 파괴를 확인한 사프라닌-O 염색결과이며, 도 3B는 OARSI 등급, 골극 형성 및 연골하 골판 두께로 연골 파괴를 확인한 결과로, 값은 표시된 수의 독립된 실험의 표준 ± 표준편차로 표시되었으며, 통계 분석은 one-way ANOVA with Bonferroni's test, a non-parametric Mann-Whitney U test (A, OARSI 등급 지정, 골극 형성), 또는 two-tailed t-test (A, 연골하 골판 두께)로 수행되었다 (스케일 바 : 100 μm).
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 퇴행성 관절염 발병 초기에 SNCG 발현 및 활성이 증가하고, 이에 따라 연골 파괴를 유도하는 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 발현 증가를 확인하였으며, SNCG 발현 억제에 의해 상기 유전자들의 발현이 억제되는 것을 확인함에 따라, SNCG를 퇴행성 관절염 바이오마커로 제공하여 퇴행성 관절염을 조기에 진단하며, SNCG의 발현 또는 활성을 조절하여 퇴행성 관절염 치료효과를 향상시키고자 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 SNCG (Synuclein Gamma) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.
상기 SNCG (Synuclein Gamma)는 UniGene ID Mm.41063일 수 있다.
본 발명은 SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 진단용 키트를 제공할 수 있다.
상기 제제는 SNCG 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, SNCG 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머또는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 검체로부터 분리된 시료로부터 SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 관절염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제고할 수 있다.
상기 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 뇨 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 퇴행성 관절염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상대조군보다 증가한 경우 퇴행성 관절염으로 진단하는 것일 수 있다.
본 발명은 퇴행성 관절염 환자로부터 분리된 연골세포에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 연골세포로부터 SNCG 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 SNCG 발현 수준이 후보물질 비처리군과 비교하여 감소된 후보물질을 퇴행성 관절염 치료제로 제공하는 퇴행성 관절염 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 "바이오마커"는 퇴행성 관절염이 의심되는 대상체의 조직 또는 세포를 정상 대조군의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 대상체의 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 발명의 "진단 (diagnosis)"은 넓은 의미는 환자의 병의 실태를 모든면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태 및 합병증의 유무 등이다.
본 발명은 SNCG (Synuclein Gamma) 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 SNCG 발현 억제제는 SNCG 유전자 또는 SNCG의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.
상기 SNCG 활성 억제제는 SNCG 활성을 촉진하는 단백질 또는 SNCG 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 단백질, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, SNCG 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 SNCG 발현 또는 활성 억제제의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 SNCG 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.
상기 건강식품은 상기 SNCG 발현 또는 활성 억제제 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 SNCG 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유하는 SNCG 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 인간 퇴행성 관절염 샘플 및 실험 퇴행성 관절염 마우스 모델의 제작
인간 연골 샘플은 무릎 관절 전체 치환술(total knee arthroplasty)을 받은 63 ~ 80 세의 개인에게서 얻었다 (표 1). 모든 환자는 서면 동의서를 제출하였고, 샘플 수집은 가톨릭대학교의 IRB에 의해 승인되었다(UC14CNSI0150).
수컷 C57BL/6 및 SNCG-/-마우스 (008843-B6.129P2-SNCG tm1vlb/J, Jackson laboratory, USA)는 아주 대학교 실험실 동물 연구 센터에서 모든 동물 절차를 승인한 Institutional Animal Care and Use Committee의 가이드라인에 따라 유지하였다.
Figure pat00001
실험 퇴행성 관절염 모델을 생산하기 위해, 12 주령 수컷 마우스를 수술 DMM (Destabilization of the medial meniscus)에 적용하고 수술 후 10 주에 희생시켰다. 암컷 마우스는 퇴행성 관절염 병인에 대한 여성 호르몬의 영향 때문에 사용에서 배제하였다. 관절 내 주사를 위한 아데노바이러스는 Vector Biolabs (Malvern, USA)에서 구입하였다: Ad-C (1060), Ad-SNCG (ADV-223826). 야생형 마우스에 아데노바이러스 (1 x 109 PFUs/10 μL)를 매주 2 회 무릎 관절에 주사하고 첫 번째 아데노 바이러스 주사 후 3 주 후에 희생시켰다.
2. 일차 마우스 관절 연골 세포의 분리 및 세포 배양
마우스 관절 연골세포는 출생 후 5일 째 ICR 마우스의 연골에서 분리하고, 단백질 분해 효소와 콜라게나제로 효소적으로 분해한 후, 10 % FBS, 100 units/mL의 페니실린 및 100ug/mL의 스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Capricorn science GmbH; Hessen, Germany)에서 유지시켰다. 3일째, 세포 (4.25 × 105 세포/웰)를 아데노 바이러스로 감염시키거나 재조합 단백질로 처리하였다. Mlkl+/+ 및 Mlkl-/- MEF는 10 % FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지시켰다.
3. 시약
항체는 Abcam (Cambridge, UK; SNCG, COX2, MMP3, MMP13), Col2a1 (Merck, USA), Sox9 (Novus, Littleton, USA) 및 Erk (610408, Beckton Dickinson, New Jersey, USA) 로부터 구입하였다. Recombinant SNCG는 Abcam에서 구입하였다.
4. 웨스턴 블로팅
세포를 M2 완충액에 용해하고, 마우스 조직은 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 50mM NaF, 1 % Tween 20, 0.2 % NP-40 및 프로테아제 저해제로 구성된 용해 완충액에 용해하였다. 동일한 양의 세포 추출물을 SDS-PAGE (6 % 스태킹 겔 및 10 % 러닝 겔)로 분리하고 면역 블롯팅으로 분석하였다.
5. 조직학 및 면역 조직 화학
인간 퇴행성 관절염 연골과 마우스 무릎 관절을 4 % 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 마우스 무릎 관절은 0.5 M EDTA (pH 7.4)에서 2 주 동안 석회화하였다. 파라핀 포매 샘플은 사프라닌-O (Safranin-O), 알리시안 블루 (Alcian blue) 또는 면역 염색으로 염색하였다. 연골 파괴는 실험 그룹핑에 대해 알지 못하는 세 명의 관찰자에 의해 실험 퇴행성 관절염 마우스 모델에서 평가되었으며, OARSI (국제 퇴행성 관절염 연구 학회) 등급 시스템 (등급 0-6)에 따라 점수가 매겨졌다. OARSI 점수는 각 마우스에 대한 평균 최대 점수로 제시되었다. 대표적인 사프라닌-O 염색 이미지는 각 섹션의 최고 고도 병변(advanced lesions)에서 선택되었으며 이전에 설명한대로 골극 성숙도(osteophyte maturity)를 정량화하였다. 연골하 골 경화증(Subchondral bone sclerosis)은 연골하 골판 두께를 측정하여 결정하였다.
6. 통계분석
모든 실험은 4 회 이상 독립적으로 수행되었다. Shapiro-Wilk normality test, Levene's homogeneity of variance test, 및 two-tailed independent t-test를 사용하여 두 개의 독립 그룹을 비교하였다. Shapiro-Wilk test, Levene's test, 및 one-way analysis of variance with Bonferroni's post-hoc test를 이용하여 다수의 비교를 수행하였다. non-parametric Mann-Whitney U tests를 이용하여 서수 등급 시스템(ordinal grading system)을 기반으로 한 데이터를 분석하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
<실시예 1> SNCG 과발현에 의한 유전자 발현 양상 변화와 퇴행성 관절염과의 연관성 확인
골관절에서 SNCG의 가능한 역할을 확인하기 위해, 인간 및 마우스 퇴행성 관절염 비손상 및 손상된 연골 샘플에서 SNCG 발현을 조사하였다. 손상된 퇴행성 관절염 연골에서는 비손상된 샘플에 비해 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 발현이 증가함을 확인하였고 동시에 SNCG 발현이 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였다 (도 1A; human, 1B; mouse).
<실시예 2> SNCG에 의한 퇴행성 관절염 발병의 조절 확인
MMP3 및 MMP13은 퇴행성 관절염 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, Cox2는 주로 염증에 관여하며 콜라게나제(collagenas) 및 아그레카나제(aggrecanase) 활성화에 의해 연골 기질 분해를 유발한다. 이에 따라, 상승된 SNCG 발현과 퇴행성 관절염 병인 사이의 연관성을 확인하기 위해 도 2A와 같이 관절 연골 세포에 재조합 (Recombinant) SNCG를 연골세포에 처리하거나, 도 2B와 같이 Adenovirus SNCG를 활용하여 연골세포에 형질주입한 결과, 상향 조절된 이화 인자 (MMP3, MMP13, 및 COX2) 및 하향 조절 된 동화 인자 (Col2 및 Sox9)의 발현을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2C 및 도 2D와 같이 연골 세포에서 확인된 결과와 일치하게, Ad-SNCG는 Ad-C에 비해 WT 마우스에서 심각한 연골 파괴 및 퇴행성 관절염 증상이 유발되는 것이 확인되었다.
<실시예 3> SNCG 발현 억제에 의한 퇴행성관절염 억제 효과 확인
SNCG 결핍 마우스는 미국 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME USA)에서 구입하였으며, SNCG 결핍 마우스에서 인간 퇴행성 관절염 개발에 가장 적합한 방법인 DMM를 처리하여 퇴행성 관절염 모델을 유도하였다.
그 결과, 도 3A 및 도 3B와 같이 연골 파괴, 퇴행성 관절염 발현(manifestation) 및 이화 인자 발현은 WT 마우스에 비해 이들 마우스에서 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 인간 퇴행성 관절염 연골에서 SNCG 상향 조절되는 것과 일치하게, SNCG 결핍은 DMM 유발 마우스 모델에서 퇴행성 관절염을 약화(attenuate)시키는 것이 확인되었으며, 상기 결과로부터 SNCG가 퇴행성 관절염 발병에서 중요한 역할을 한다는 것이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. SNCG (Synuclein Gamma) 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커 조성물.
  2. SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 진단용 키트.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 제제는 SNCG 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, SNCG 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머또는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 진단용 키트.
  4. 검체로부터 분리된 시료로부터 SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준을 확인하는 단계를 포함하는 퇴행성 관절염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 뇨 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 퇴행성 관절염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 SNCG 유전자 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상대조군보다 증가한 경우 퇴행성 관절염으로 진단하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 퇴행성 관절염 환자로부터 분리된 연골세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 후보물질이 처리된 연골세포로부터 SNCG 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    상기 SNCG 발현 수준이 후보물질 비처리군과 비교하여 감소된 후보물질을 퇴행성 관절염 치료제로 제공하는 퇴행성 관절염 치료제 스크리닝 방법.
  8. SNCG (Synuclein Gamma) 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 SNCG 발현 억제제는 SNCG 유전자 또는 SNCG의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA, microRNA 및 리보자임으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 SNCG 활성 억제제는 SNCG 활성을 촉진하는 단백질 또는 SNCG 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 단백질, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
  11. SNCG 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 건강식품.
  12. SNCG 발현 또는 활성 조절제를 유효성분으로 함유하는 SNCG 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
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