KR20230019056A

KR20230019056A - 연속적인 매질에서 세포간 구획화를 하지 않는 방식의 단일세포 전사체 분석방법

Info

Publication number: KR20230019056A
Application number: KR1020220094685A
Authority: KR
Inventors: 방두희; 신동주; 최정원
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2022-07-29
Publication date: 2023-02-07

Abstract

본 발명은 연속적인 매질에서 세포간 구획화를 하지 않는 방식의 단일세포 전사체 분석방법에 관한 것으로 복잡한 장치 없이 단일 세포 전사체를 하나의 위치에서 포착할 수 있고, 복잡하고 손이 많이 가는 단일 세포 RNA 염기서열 분석 과정이 크게 간소화된다. 본 발명은 기존의 단일세포 분석방법과 유사한 성능을 가지며 단일세포 RNA 염기서열 분석이 활용되는 영역에서 광범위하게 적용 가능하다.

Description

연속적인 매질에서 세포간 구획화를 하지 않는 방식의 단일세포 전사체 분석방법 {single cell RNA-seq analysis in continuous medium without compartmentalization}

본 발명은 연속적인 매질에서 세포간 구획화를 하지 않는 방식의 단일세포 전사체 분석방법에 관한 것이다.

단일세포 RNA 서열 분석 (scRNA-seq)는 생물학적 이질성을 확인하는 주요한 수단이었으며, 지난 10년 동안 뚜렷한 세포 상태, 유형 및 표현형을 정의하기 위한 주요한 기준으로 인식되었다. 개별 세포의 전사 프로파일링(Transcriptional profiling)은 이종 모집단의 기능 상태 변화에 대한 정보를 제공한다. scRNA-seq의 범용성은 많은 수의 단일 세포 전사체를 쉽게 얻을 수 있는 새로운 전략에 활용되었다. 그러나 대규모의 병렬적 접근법의 개발에도 불구하고 종래 기술은 큰 샘플의 크기, 번거로운 실험방법 및 고비용의 장치를 필요로 한다.

이어지는 세포 용해를 위해 개별적으로 바코드가 지정되도록 외부와의 상호작용을 차단하도록 각 세포가 서로 분리되고 개별 반응 챔버에서 위치하여야 하기 때문에 단일세포의 구획화는 단일세포 전사체를 포착하는데 필수적이다. 손수 세포를 나누거나 형광-활성화 세포 분류 (Fluorescence-activated cell sorting (FACS))와 같은 종래의 방법은 각 세포에 대해 하나의 웰을 반응 구역으로 할당하여 단일세포의 병렬적 프로파일링을 위한 확장성 (scalability)을 제한한다. 최근 개발된 대규모 병렬적 접근법 (massively parallel approaches)도 단일세포의 구획화를 포함한다. 마이크로웰 기반 기술이 단일세포의 물리적인 세포를 구별하는데 비하여 미세유체 기반 (Droplet microfluidics)는 물방울로 분리한다. 또 다른 기술인 조합 인덱싱 (combinatorial indexing) 은 단일 세포의 개별 라벨링을 위하여 핵산의 스플릿-풀 바코딩 (split-pool barcoding) 을 활용하고 이는 각 웰에서 세포들의 분리를 필요로 한다.

공간적 구획화에 의존하는 모든 방법들은 번거로우면서 비용이 많이 든다. 세포의 물리적 구획화가 필요하지 않은 단일세포 전사체 포착 기술은 기존의 단일세포 분석 방법에 비하여 이점이 있다. 실험이 연속적인 배지에서 이루어지기 때문에 실험의 규모를 키우는데 사실상 제한이 없어 약간의 비용 증가만으로 대량의 병렬적인 단일세포 RNA 시퀀싱이 가능하게 한다. 또한, 세포를 구획화 할 때 불가피하게 샘플 일부가 손실되기 때문에 더 많은 샘플의 확보가 가능하다. 중요한 것은, 세포의 구획화에 복잡한 장치가 필요하지 않기 때문에, scRNA-seq의 활용 가능성을 더욱 많은 실험실에서 가능하게 한다. 이러한 많은 장점에도 불구하고, 세포의 공간적 분리 없는 단일세포 전사체의 포착은 분자 확산에 의한 세포간 mRNA 오염을 제거하기 어려워 쉽지 않았다.

이에 본 발명자들은 드롭렛 (droplet) 또는 마이크로웰과 같은 물리적 구획화 없이 단일세포 전사체를 포착하는 새로운 방법인 Onepot-Seq을 개발하였다. onepot-Seq는 각 세포에 대한 시공간이 제한되며, 완만한 용해 후 세포 내용물의 최소한의 확산이 세포 주위에 형성된다. 비드와 세포 모두의 희박한 분포는 연속적인 유체 매체에서 단일에 가까운 세포의 전사체를 특이 적으로 포착하는 비드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

대한민국 공개특허 제10-2019-0069456호

본 발명의 일 양상은 1) 세포와 비드를 버퍼 용액 내에 고정시키는 단계; 2) 상기 버퍼 용액보다 밀도가 낮은 용해 용액을 버퍼 용액 상에 위치하도록 용해 용액을 첨가하는 단계; 및 3) 상기 용해 용액에 의해 용해된 상기 세포 내 전사체가 상기 비드에 포착되는 단계를 포함하는 단일세포 전사체 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 1) 세포와 비드를 버퍼 용액 내에 고정시키는 단계; 2) 상기 버퍼 용액보다 밀도가 낮은 용해 용액을 버퍼 용액 상에 위치하도록 용해 용액을 첨가하는 단계; 및 3) 상기 용해 용액에 의해 용해된 상기 세포 내 전사체가 상기 비드에 포착되는 단계를 포함하는 단일세포 전사체 분석방법을 제공한다.

상기 1) 단계는 세포와 비드를 버퍼 용액 내에 고정시키는 단계로서, 상기 1) 단계는 버퍼 용액 내에 위치한 비드에 세포를 첨가하는 것일 수 있다.

상기 세포는 분석의 목적이 되는 세포로서 전사체를 가지고 있는 모든 종류의 세포를 의미한다.

상기 비드는 후술되는 3) 단계에서 용해된 세포 내 전사체가 포착되기 위한 구성으로, 본 발명이 목적하는 세포 내 전사체 포착의 기능을 하는 한 크기, 소재 및 형상은 임의로 선택할 수 있고, 세포 내 전사체의 분류의 편의성을 위해 바코드로 표지된 것일 수도 있다.

본 발명의 일 구체예로 상기 비드는 세포의 유효반경(Re(effective radius))에 위치하는 것으로, 상기 유효반경은 비드에 세포의 전사체가 포착되기 위한 유효 거리로서, 상기 유효반경은 아래와 같이 계산될 수 있다.

(여기서 λ는 반응 영역에서 비드의 수, ρ는 2차원 표면에서 비드의 밀도)

비드가 세포의 유효반경(Re)에 위치하지 못하는 경우 세포의 전사체가 비드에 포착되기 어려워 본 발명의 효과를 얻기 어렵다.

상기 버퍼 용액은 전술한 세포 및 비드가 고정되는 용액으로, 후술되는 바와 같이 세포를 용해시킬 수 있는 용해 용액에 비하여 밀도가 높고 용해 용액이 확산될 수 있는 성분으로 이루어질 수 있으며, 버퍼 용액의 성분은 본 발명에서 요구되는 버퍼 용액의 기능을 수행하는 한 임의로 선택할 수 있고, 구체적으로는 6% Ficoll PM-400, 20mM EDTA 및 0.2M Tris pH 7.5 를 혼합한 것 일 수 있다.

상기 2) 단계는 상기 버퍼 용액보다 밀도가 낮은 용해 용액을 버퍼 용액 상에 위치하도록 용해 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 용해 용액은 버퍼 용액보다 밀도가 낮다면 공지의 물질을 사용할 수 있고, 일 예시로 20% N-라우로일사르코신 나트륨 용액과 전술한 버퍼 용액 (6% Ficoll PM-400, 20mM EDTA, 0.2M Tris pH 7.5) 를 1:1 로 혼합한 것일 수 있다.

상기 용해 용액은 후술되는 바와 같이 버퍼 용액 방향으로 확산 시키기 위해 버퍼 용액 상에 위치하는 것일 수 있으며, 이는 즉 용해 용액이 버퍼 용액과 혼합되지 않도록 위치되는 것일 수 있다. 이를 위하여 상기 용해 용액은 첨가될 때 피펫 팁의 가장자리를 버퍼 용액에 맞닿게 위치시킨 후 용해 용액이 고르게 퍼지도록 천천히 주입하는 것일 수 있다. 이러한 용해 용액의 첨가는 버퍼 용액에 비하여 낮은 밀도를 가진 용해 용액을 사용함으로써 이루어질 수 있고, 상기 용해 용액이 버퍼 용액 상에 위치하도록 첨가하되 서로 혼합되지 않도록 첨가하지 않아 서로 구별되도록 위치하다가 용해 용액이 버퍼 용액 방향으로 확산되어 세포를 용해시키는 것일 수 있다. 즉, 버퍼 용액 내의 비드와 세포의 움직임을 최소화하기 위해, 버퍼 용액보다 밀도가 낮은 용해 용액을 천천히 쌓은 후, 용해 용액의 확산을 통해 세포가 용해되도록 한다. 종래의 단일세포 분석 실험 기술에서는 여러 세포 유래의 mRNA가 1개의 비드에 포획되는 문제를 방지하기 위해 별도의 장비로 세포간 공간 분리를 수행해야 하는 어려움이 있었으나, 본 발명은 상기와 같은 확산을 통한 용해 방식을 통해 별도의 장비를 이용한 공간 분리 없이도 세포간 혼합 없이 단일 세포 분석을 진행할 수 있다.

상기 3) 단계는 상기 용해 용액에 의해 용해된 상기 세포 내 전사체가 상기 비드에 포착되는 단계로서, 전술한 바와 같이 용해 용액은 버퍼 용액과 직접적으로 혼합되지 않지만 버퍼 용액 상에 위치하여 용해 용액이 버퍼 용액 방향으로의 확산되면서 세포가 용해되는 것일 수 있다.

상기 용해는 2) 단계의 용해 용액 첨가 후 5 내지 30분, 5 내지 25분, 7 내지 23분, 10 내지 20분, 13 내지 17분, 14 내지 16분, 또는 15분간 이루어지는 것일 수 있다. 상기 시간 범위 보다 짧게 이루어질 경우 세포의 용해 및/또는 세포 내 전사체가 비드에 충분히 포착되지 않을 수도 있고, 길게 이루어질 경우 전사체의 확산에 의해 하나의 비드에 둘 이상의 세포로부터 유래한 전사체가 포착되어 분석의 정확도가 떨어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포 전사체 분석방법에서는 비드 : 세포의 비율이 100 : 1 내지 100: 10의 개수비로 첨가되는 것일 수 있으며, 이를 통해 총 부피가 크게 증가하여 분석이 어려워지거나 효율성이 낮아지는 경우를 방지할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포 전사체 분석방법은 세포와 비드가 웰에서 뭉치는 것을 방지하기 위해 플레이트를 상하 좌우로 흔들어 혼합하는 단계, 및 방치하여 세포와 비드가 웰의 바닥에 가라앉도록 하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포 전사체 분석방법은 용해 버퍼를 추가하는 단계에서, 피펫 팁의 가장자리를 수면과 일직선으로 맞추어 첨가되는 유량이 가급적 고르게 퍼지도록 원형으로 움직여 천천히 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포 전사체 분석방법은 용액 첨가 단계 이후, 플레이트를 배양하여 세포의 용해 및 mRNA를 비드가 포착하도록 기다리는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 때 밀도 차로 인해, 세포 비드가 포함된 버퍼 용액의 상층부에 용해 용액이 위치하고, 용해 용액이 웰의 바닥 방향으로 확산되는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포 전사체 분석방법은 용해 버퍼를 첨가한 후 5분 내지 15분 이내에 세포가 완전히 용해되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단일세포 전사체 분석방법은 비드 포착 단계 이후, 비드에 6X SSC 를 첨가하는 단계; 이후 비드를 원심분리 후 6X SSC로 2회 세척 및 Maxima 5X RT buffer로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 복잡한 장치 없이 단일 세포 전사체를 하나의 위치에서 포착할 수 있고, 복잡하고 손이 많이 가는 단일 세포 RNA 염기서열 분석 과정이 크게 간소화된다. 본 발명은 기존의 단일세포 분석방법과 유사한 성능을 가지며 단일세포 RNA 염기서열 분석이 활용되는 영역에서 광범위하게 적용 가능하다. 또한 세포 간 구분 없이 하나의 연결된 공간에서 분석이 이루어짐으로써 실험의 규모(scale)를 확장하는 데에 제한이 없다는 장점이 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 개념을 나타낸 도면 및 사진으로, 도 1은 세포 (10um~20um)와 마이크로 크기의 구형입자 (20um~40um)의 위치에 따른 관계 및 이를 나타내는 사진이고, 도 2는 세포 용해 방식을 나타낸 도면이다.
도 3 및 4는 본 발명의 활용가능성을 확인한 실험 결과로서 도 3은 세포 혼합 후 본 발명의 분석으로 전사체의 혼합여부를 확인한 실험 결과이고, 도 4는 종래 사용하던 Dropseq 방식과 대비한 전사체 포착 효율을 비교한 결과이다.
도 5 및 6은 본 발명의 최적 조건을 확인한 결과로서, 도 5는 세포 용해 시간에 따른 효율을 확인한 것이고, 도 6은 세포 밀도 조건에 따른 multiplet 형성율을 나타낸 것으로 일정 수준 이상의 multiplet 형성을 피하기 위한 세포 밀도 조건을 확인한 것이다.
도 7 내지 10은 본 발명의 유효성을 확인한 결과로서 도 7은 AMG510 약물섭동실험 결과이고, 도 8 은 tSNE 방식으로 세포주 별로 cluster가 형성되는지 여부를 확인하였고, 도 9는 본 발명을 이용한 세포별 유전자 발현 정도를 heatmap으로 확인한 결과이며, 도 10은 GSEA 및 Pseudotime analysis를 본 발명을 적용하여 실험한 결과를 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명의 Onepot-seq 분석

실시예 1-1. 세포주의 준비 및 세포 배양

DC2.4를 제외한 모든 세포주들은 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB))에서 얻어서 사용하였다. 모든 세포주들은 37°C, 5% CO₂ 조건에서 유지되었다. 인간 배아 신장 세포 HEK293T 및 마우스 배아 섬유아세포 NIH3T3은 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA)) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific, USA))이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA)에서 배양되었다. 인간 급성 T세포 백혈병 세포주 Jurkat, 마우스 수지상 세포주 DC2.4, 인간 세 선암종 NCI-H3122 및 NCI-H358, 인간 대장 선암종 SW480은 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPI 1640에서 배양되었다.

실시예 1-2. mRNA 확산 예측

mRNA가 방사 대칭으로 확산된다고 가정하면, 세포 용해 후 mRNA에 대한 확산 방정식은 다음과 같다:

여기서 D는 mRNA의 확산계수, c는 mNRA의 농도, R은 세포로부터의 거리, t는 시간이다. 세포가 반지름 R의 구이고, mRNA의 농도가 세포내에서 동일하다고 가정하면 위의 방정식에 대한 값은 시간과 거리의 농도 관계를 제공한다:

여기서 C₀는 세포 내 mRNA의 초기농도이고, R은 세포 반지름이다. mRNA의 확산계수는 물이나 세포질의 DNA 단편의 확산 계수에 기초하여 1.0 μm2/sec로 가정하였다. 세포 크기와 초기 mRNA 농도는 5 μm, 1.2 μM로 가정하였으며, Drop-Seq의 물방울 내의 mRNA의 농도는 물방울의 부피만큼 세포의 mRNA를 희석한 것으로 보고 계산하였다.

실시예 1-3. Onepot-seq 분석

세포는 표준 세포 배양 방법을 사용하여 채취되었다. 배양 플라스크에서 배지를 제거한 후 접착된 세포들을 1x PBS로 1회 세척한 후 37°C 에서 3~10분간 2ml 트립신 (Trypsin-EDTA; Gibco, USA)을 주입하고 8ml 성장배지에서 트립신들을 불활성화시켰다. 세포는 PBS-BSA (0.1% BSA in 1x PBS)로 3회 세척하였고 500-1000세포/μl 가 되도록 10ml PBS-BSA로 재현탁하였다. 세포들은 이어서 40 μm의 필터를 통과시켰고, 혈구 계산기 (hemocytometer)로 계수하였다. Onepot-Seq에 사용된 바코드 비드는 Chemgene (cat. No. MACOSKO-2011-10(V+)) 에서 구매하였다. Onepot-Seq에서 사용된 비드는 PBS-BSA로 3회 세척하였고, 100 μl 당 20,000 비드가 되도록 인큐베이션 버퍼 (6% Ficoll PM-400 (GE healthcare), 20 mM EDTA (Biosesang), 200 mM Tris pH 7.5 (Biosesang))에 재현탁하였다.

비드와 세포를 준비한 후 900 μl 인큐베이션 버퍼가 12웰 플레이트(TPP®, Switzerland)에 첨가되고, 100 μl의 비드 (인큐베이션 버퍼에서 100 μl 당 20,000 비드)를 웰에 첨가하였다. 그리고, 준비된 세포들을 목적하는 농도에 도달할 때까지 첨가하였다. 총 부피가 크게 증가하는 것을 피하기 위해 첨가된 세포의 부피는 1-10μl 정도 첨가하였다. 웰에서 세포와 비드가 특정 위치에 뭉치는 것을 피하기 위해 플레이트를 상하 좌우로 흔들어 혼합하고, 15분간 방치하여 세포와 비드가 웰의 바닥에 가라앉도록 하였다.

세포 용해는 200 μl의 용해 버퍼 A(20% N-라우로일사르코신 나트륨 용액 (시그마) 와 인큐베이션 버퍼 1:1 혼합)를 웰에 첨가하여 확산 용해를 수행하였다. 용해 버퍼를 추가할 때 피펫 팁의 가장자리를 수면과 일직선으로 맞춰 유량이 최대한 적도록 한 후 고르게 퍼지도록 원형으로 움직여주면서 천천히 넣어주었다. 이후 15분간 플레이트를 배양하여 세포의 용해 및 mRNA를 비드가 포착하도록 두었다. 인큐베이션 버퍼가 용해 버퍼 A에 비하여 밀도가 높기 때문에 용해 버퍼 A는 세포 비드 용액 상에 위치하게 되고 웰의 바닥쪽으로 확산된다. 일반적으로, 세포들은 용해 버퍼를 첨가한 뒤 5분이 지난 시점부터 용해되기 시작하고, 10분이 지난 시점에서 대부분의 세포들이 용해되었으며 15분이 지난 시점에서 완전히 용해되었다.

용해 후 1ml의 6X SSC (Biosesang, Korea)를 첨가하여 비드를 올리고 용액의 2ml를 즉시 Falcon tube의 냉각된 30ml의 6X SSC에 옮겨넣었다. 비드의 회수율을 최대로 높이기 위해 남아 있는 비드들은 추가적인 1ml의 6X SSC를 첨가하고 피펫팅한 뒤 Falcon tube에 추가하였다. 비드들은 1000xG에서 1분간 원심분리되었고 1ml의 6X SSC로 2회 세척한 뒤 50 μl의 Maxima 5X RT buffer (Thermo Fisher Scientific, USA)로 세척하였다. Drop-Seq의 지침에서 설명된 대로 역전사, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 처리 및 cDNA 증폭을 수행하였다. 간략하게 비드들은 TE-SDS(TE buffer (Biosesang)로 1회 세척하고, TE-TW(TE buffer, supplemented with 0.01% of Tween-20 (Sigma))로 2회 세척하고, 역전사 반응(30 분, 25°C 및 90 분, 42°C)을 위하여 10 mM Tris pH 8.0 (Biosesang)로 1회 처리하였다. 그리고 비드들은 엑소뉴클레아제 반응 (45 분, 37°C) 이후 TE-SDS로 1회, TE-TW로 2회, nuclease-free water (Invitrogen)로 세척하였다. 또한, 역전사를 위해 역전사 믹스 (RT mix)를 첨가하고, 30분간 상온에서, 그리고 42℃에서 90분간 교반기 (Rotator)로 배양하였다. 그리고 TE-SDS 1ml 로 비드를 1회, TE-TW 1ml 로 2회 세척하였다. 그리고 엑소뉴클레아제의 처리는 1ml의 10mM Tris pH8.0 로 비드를 세척하고, 엑소뉴클레아제 믹스 (Exonuclease mix)를 첨가하여 이루어졌다. 그리고, 교반기로 45분간 37℃에서 배양하고, TE-SDS 1ml 로 비드를 1회, TE-TW 1ml 로 2회 세척하였다. cDNA는 개별 Onepot-seq well 반응별로 나누어 8개의 튜브로 나누었고, KAPA HiFi HotStart PCR Kit (Kapa Biosystems Inc., Switzerland)를 이용하여 증폭시켰다. cDNA 증폭은 4 μl의 10 μM SMART PCR 프라이머 (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3') (IDT), 25 μl의 KAPA HiFi DNA 폴리머라아제, 및 21 μl의 nuclease-free water로 채워진 50 μl PCR 용액으로 수행되었다. PCR 결과물은 제조사의 지시에 따라 0.6배 AMPure(Beckman Coulter, USA) 비드를 사용하여 풀링 및 정제되었다. cDNA 결과물은 절편화 (fragmented)를 거친 후 Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina, USA)을 이용하여 더욱 증폭되었다.

그 결과 도 1, 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 onepot-seq는 세포와 비드가 특정 표면적 (가령 단일 웰)에 피펫팅되어 특정 위치에서 세포와 비드가 인접하게 위치하게 된다. 세포와 비드의 분포는 용액의 농도를 조절하여 쉽게 조절할 수 있다. 그리고, 이들의 위치를 방해하지 않고, 세포들은 용해액의 확산에 의해 용해되었다. 용해 이후 비드들은 회수되었고 역전사, 엑소뉴클레아제 처리 및 증폭을 수행하였다.

실험예 1: 본 발명 분석 방법의 유효성 검증

실험예 1-1. 혼합 샘플에서 유전체 분석 (도 3)

본 발명의 Onepot-seq의 유효성을 인간과 쥐의 혼합 샘플을 구별가능한지를 확인하여 판단하였다.

구체적으로, 실시예 1의 방법을 사용하되 STAR aligner를 사용하여 판독 값을 hg19-mm10 관련 참조로 정렬하고, 바코드를 제거한 후 인간과 마우스 세포의 디지털 발현 매트릭스를 각각 인간과 마우스 정렬 판독 값을 분리하여 얻었다. 각 셀 바코드마다 인간과 마우스의 전사체들의 수를 계산하였고, 500 개 이상의 전사체가 있는 바코드를 세포로 정의하였다. 세포의 바코드 내에서 인간의 전사체 비율이 계산되었고, 인간 전사체의 비율이 0.9보다 큰 세포 바코드는 인간 세포로, 0.1보다 작은 경우 마우스 세포로, 나머지는 혼합된 것으로 정의되었다. 세포 내에서 인간 전사체의 비율과 마우스의 전사체 비율 중 더 큰 것을 세포의 종 순도로 정하였다. 멀티플렛 비율 (multiplet rate)은 전체 세포에서 혼합된 종의 비율로 계산하였고, 세포 수율은 염기서열을 통해 최종적으로 얻은 세포수와 처음 세포수의 비율로 계산되었다.

그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이, 12웰 플레이트에서 수행한 1000개의 인간-마우스 혼합 세포 실험에서 137개의 인간 세포, 205개의 마우스 세포 및 멀티플렛 비율 2.0% 인 고품질의 단일세포 분석이 가능함을 확인하였다.

실험예 1-2. Drop-seq 과의 비교 (도 4)

Drop-seq은 DC2.4세포와 Jurkat 세포는 T75 플라스크에 1.0x10⁶세포/플라스크의 밀도로 시딩하였다. 배양 후 3일 시점에서 DC2.4 세포와 Jurkat 세포를 채취하였다. 세포들은 PBS-BSA로 3회 세척한 뒤 40μm 필터를 통과시키고, 계수하였다. 세포들은 PBS-BSA로 100세포/μl로 희석하고, 비드 농도 1.0x10⁶세포/ml의 농도로 Drop-Seq을 수행하였다. 본 발명의 Onepot-seq과 Drop-seq를 비교하기 위하여 12웰 플레이트에 웰당 1000개의 세포 수로 HEK293T 및 NIH3T3세포를 사용하였다. 인간 세포들 사이의 크기 차이로 인해 마우스 세포들만 사용하였다.

이후 용해, 시퀀싱 등은 전술한 바와 같이 수행하였다. 전사체의 정렬 후 10%의 간격으로 정렬된 읽기에 대해 bam파일이 무작위로 샘플링 되었다. 각 시퀀싱 깊이에서 원본 데이터에서 500 개 이상의 전사체와 세포들 바코드의 평균 원본 시퀀싱 깊이 및 평균 UMI를 얻었다.

평균 UMI가 서열 깊이에 따라 포화된다고 가정하고, 아래의 방정식을 사용하여 유전자와 UMI의 포화수준을 피팅하고 예측하였다:

여기서 x는 서열 깊이, y는 UMI 또는 유전자의 평균 수이며, a, b, 및 c는 피팅 파라미터이다.

그 결과 도 4에서 확인되는 바와 같이 하위 샘플링 데이터를 사용한 UMI의 포화 분석은 본 발명의 onepot-seq과 Drop-seq 가 유사한 것을 확인하여 본 발명의 분석 방법이 종래 방법과 유사한 수준의 분석력을 가진 것을 알 수 있다. 구체적으로, 도 4A의 경우 세포 당 전사체의 개수가 Drop-seq과 Onepot-seq이 유사한 수준으로 포착되었고 도 4 B와 같이 하위 샘플링 데이터를 이용한 UMI의 포화 분석을 통해 시퀀싱 뎁스(depth)와 관계 없이 유사한 수준의 분석력을 가진 것을 알 수 있다.

실험예 2: Onepot-Seq 최적화 (용해 시간 및 세포 밀도) (도 5, 6)

본 발명의 분석 방법을 최적화 하기 위해 세포 용해 시간과 세포 밀도의 최적화 조건을 확인하였다.

구체적으로 전술한 인간과 쥐의 혼합 세포 실험에서 사용한 동일한 양의 HEK293T 및 NIH3T3 세포가 준비되었다. 세포 용해 조건을 확인하기 위해 용해시간을 달리하여 (100초, 5분, 15분, 30분, 60분) 실험하였다. 세포 밀도상태를 확인하기 위해 12개의 웰에 서로 다른 세포 수 (1,000개, 2,000개, 4,000개, 8,000개, 12,000개, 20,000개)로 하여 실험하였다.

그 결과 도 5에서 확인되는 바와 같이 용해 후 15분이 지난 시점 (900초) 까지는 세포 용해물의 수율이 증가하는 포화수준으로 증가하는 것을 확인하였다. 100초 및 5분 까지의 용해 시간의 누적 곡선에서 상대적으로 낮은 세포 수율과 높은 비포집된 전사체양을 나타내었고, 이는 낮은 수준의 분석 수준을 의미한다. 용해 후 30분이 지난 시점에서 세포 수율은 약간 증가하는 반면 주변 환경으로부터 교차 오염으로 종의 순도는 감소하기 시작하였다. 따라서 세포 수율 및 분석 수준을 극대화 하기 위해서 15분 정도 용해하는 것이 바람직한 것을 알 수 있다.

또한 도 6에서 확인되는 바와 같이, 두 개 이상의 세포가 비드의 반응 범위에 들어가는 멀티플렛 비율은 세포 밀도의 2차원 평면 및 반응 범위의 유효 포착 반지름의 함수로 나타낼 수 있다. 본 발명의 경우 r=60μm의 곡선에 따르는 것을 확인하였으며, 구체적으로 세포 밀도에 따라 멀티플렛의 비율이 증가하는 것을 알 수 있다.

실험예 3: AMG510 (KRAS G12C inhibitor) 약물섭동실험 (도 7 내지 10)

KRAS (G12C) 억제제에 의해 교란된 세포의 단일세포 발현 분석은 각각 WT, G12C, G12V의 KRAS 유전자 형을 가진 NCI-H3122, NCI-H358 및 SW480을 24시간 배양 후 트립신처리 하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고, 1ml의 배지에 1개의 세포당 1000개의 밀도로 폴리-D-라이신으로 코팅된 웰을 가진 12웰 판에 분주하였다. 세포주당 4개의 웰을 다른 약물 농도에 맞게 시딩하고, 플레이트를 흔들어 세포를 고르게 분포시킨 뒤 37℃에서 8시간 동안 배양하여 부착되도록 하였다. 배양 후 바닥에 부착된 세포들이 유지되도록 하면서 700μl의 배지를 제거하고 다양한 농도의 AMG-510 (Selleckchem, Cat No. S8830)를 함유한 700μl의 배지를 추가하였다. 37℃에서 6시간 약물 처리 후 700μl의 배지를 제거하고 20000개의 비드를 포함하는 700μl 인큐베이션 버퍼를 웰에 추가하였다. 비드는 플레이트를 흔들어 고르게 퍼지도록 하고 안착되도록 15분간 배양하였다. 세포는 용해 용액에 의해 용해되는 등 상기한 onepot-seq방법으로 처리되었다 (도 7).

KRAS(G12C) 억제제로 처리된 세포의 경우 Seurat을 이용한 서열 정렬 및 품질 필터링에 이어 최소 1000개 이상의 유전자가 검출된 총 3949개의 단일세포를 확인하였다. 발현 매트릭스를 정규화 하고 확장한 후 2000개의 가변 유전자가 있는 발현 매트릭스를 사용하여 PCA를 실행하여 데이터 세트의 차원성을 줄였다.

그런 다음 처음 11개의 PCA 성분을 선택하고, t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding)를 수행하였다. 세 개의 클러스터가 식별되었고 각 클러스터는 샘플 특징들, 셀 라인별 발현 마커 및 SNP를 기반으로 각 입력 셀 라인에 할당되었다. 각 셀 라인에 대한 발현 마커는 min.pct=0.25 및 logfc.threschold=0.25인 Seurat의 FindAllMarkers 함수로 식별하였다. 표현식 히트맵을 위해 각 세포 라인에 대해 상위 10개 마커의 스케일링된 단일 세포 발현을 사용하였다. 세포 주기 단계의 분류는 Seurat의 CellCycleScoring으로 수행하였다. 각 단일 세포를 세포 주기 표지를 사용하여 G2-M, S 또는 G1 단계로 분류하였다.

그 결과 도 8에서 확인되는 바와 같이, 각 셀 라인은 고유한 클러스터에 해당하는 반면, 풀링된 샘플은 세 개의 클러스터로 구성되었다 (도 8 왼쪽). 각 세포주는 각 클러스터 내에서 4개의 AMG-510 처리량에 대해 고유한 분포를 보였으며, AMG510에 의해 억제 효과를 받는 H358는 0uM(약물X)과 0.1/1/10uM(약물O)이 구별되어 약물 농도별로 클러스터를 형성하는 것을 확인하였다 (도 8 오른쪽).

또한, 도 9에서 확인되는 바와 같이, 각 세포주는 AMG-510 처리량과 무관하게 자체 표지를 가진 고유한 발현 패턴을 보였다. 특히, 풀링 샘플의 단일세포는 각 세포 라인에 대한 고유한 발현 서명을 나타내며 풀링 중 단일 세포 정체성의 보존을 보여주었다.

실험예 4: GSEA 및 Pseudotime analysis에 본 발명을 적용하여 실험한 결과 (도 10)

실험예 4-1. 유전자 세트 농축 분석 (Gene set enrichment analysis)

전사적 반응 서명의 유전자 세트 풍부도를 분석하기 위해 "msigdbr"의 R 패키지를 사용하였다.

조정된 P<0.05 이고 로그 폴드 변화량 > 0.5를 가진 절대 폴드 변화를 기초로 각 유전자 세트와 50개의 상위 상향 조절 및 하향 조절 유전자 사이의 세트 오버랩을 측정하기 위해 Fisher의 측정방법을 사용하였다. P-값은 우도 비율 테스트 (likelihood-ratio test)를 사용하여 얻었고 분석에 사용된 유전자 세트는 MSigDB v7.2 의 “Hallmark" 및 "Canonical" 유전자 세트 모음의 조합을 사용하였다. 세포주당 AMG-510 치료의 유전자 세트 풍부도 분석의 결과를 얻었다.

실험예 4-2. 의사시간 분석 (Pseudotime analysis)

H358 세포주에서 KRAS (G12C) 처리의 의사시간 분석을 위해 R 패키지 "Monocle3"을 적용하였다. H358 세포주에 대한 단일 세포 데이터는 Seurat을 사용하여 KRAS (G12C) 억제제 치료 실험의 결과에서 추출하였다. 데이터는 정규화되고 추가 분석 전에 사전 처리되었다. 세포 궤적에 대한 세포 주기에 따른 효과를 제거하기 위해 align_cds 함수를 사용하여 서로 다른 세포 주기 상태의 그룹과 세포를 정렬하였다. 우리는 UMAP 알고리즘으로 차수와 세포 군집을 줄였다. learn_graph 함수를 사용하여 데이터에 주 그래프 (principal graph)를 맞춘 후 처리되지 않은 세포에 가장 가까운 노드를 원점으로 정의하여 궤적을 따라 세포를 정렬하고 각 단일 세포에 대해 의사시간을 분석하였다. 단일 세포 궤적에 걸쳐 다르게 발현된 유전자를 식별하기 위해 다방향 및 다차원 공간 자기 상관관계를 측정하는 Moran's I test를 수행하였다. 0.01 미만의 q값을 가진 유전자가 DEG로 선택되었다.

실험예 4-3. 실험결과

각 세포주의 AMG-510 유도 유전자들의 유전자 풍부도 분석 결과 도 10 A에서 확인되는 바와 같이 KRAS 및 관련된 경로는 감소된 것을 확인하였다.

그리고 도 10 B와 같이 KRAS(G12C) 세포주에서 지속적으로 변화하는 유전자 발현 패턴을 포착하기 위해 처리되지 않은 세포에 가장 가까운 노드를 원점으로 정의하여 유사 시간 분석을 수행하고 궤적을 따라 세포를 정렬하였다.

그리고 도 10 C와 같이 단일 세포의 유사 시간은 4가지 용량에서 연속적이기 보다는 치료에 따라 이진법적인 양상을 나타내었다.

그러나 도 10 D와 같이, 지속적으로 다양한 모듈들이 확인되었고, 이는 각 처리된 시료 내에서 이종의 약물 반응을 나타내는 것을 시사한다. PLAU, DCBLD2, ITGA2와 같이 KRAS에 의해 조절되는 유전자는 유사시간에 걸쳐 하향 조절되었다.

이러한 결과들을 통해 본 발명의 Onepot-seq가 유전자 발현에서 약물로 인한 반응과 기본 경로에 의해 영향을 받는 반응을 포착할 수 있음을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

1) 세포와 비드를 버퍼 용액 내에 고정시키는 단계;
2) 상기 버퍼 용액보다 밀도가 낮은 용해 용액을 버퍼 용액 상에 위치하도록 용해 용액을 첨가하는 단계; 및
3) 상기 용해 용액에 의해 용해된 상기 세포 내 전사체가 상기 비드에 포착되는 단계
를 포함하는 단일세포 전사체 분석방법.

제1항에 있어서,
상기 1) 단계는 버퍼 용액 내에 위치한 비드에 세포를 첨가하는 것인 분석방법.

제1항에 있어서,
상기 1) 단계의 비드는 세포의 유효반경(Re(effective radius))에 위치하는 것인 분석방법.

제1항에 있어서.
상기 2)단계의 용해 용액은 버퍼 용액과 혼합되지 않도록 위치시키는 것인 분석방법.

제1항에 있어서,
상기 3) 단계의 용해 용액에 의한 용해는 용해 용액의 버퍼 용액 방향으로의 확산에 의한 것인 분석방법.

제1항에 있어서,
상기 3) 단계의 용해는 용해 용액 첨가 후 5 내지 30분간 이루어지는 것인 분석방법.

제1항에 있어서.
상기 3) 단계는 상기 용해 용액에 의해 용해된 상기 세포 내 전사체가 상기 비드에 포착되는 것인 분석방법.