KR20230018174A - 대장암 진단용 통합 자기 전기화학장치 및 그 방법 - Google Patents

대장암 진단용 통합 자기 전기화학장치 및 그 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230018174A
KR20230018174A KR1020210100019A KR20210100019A KR20230018174A KR 20230018174 A KR20230018174 A KR 20230018174A KR 1020210100019 A KR1020210100019 A KR 1020210100019A KR 20210100019 A KR20210100019 A KR 20210100019A KR 20230018174 A KR20230018174 A KR 20230018174A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
crc
magneto
electrochemical device
electrode
evs
Prior art date
Application number
KR1020210100019A
Other languages
English (en)
Inventor
박준석
박종민
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
강원대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단, 강원대학교산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020210100019A priority Critical patent/KR20230018174A/ko
Publication of KR20230018174A publication Critical patent/KR20230018174A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 혈장으로부터 CRC 유래 검출 EV(CRC-EV)의 빠른 프로파일을 가능하게 하는 통합 자기 전기화학장치 및 방법에 관한 것이다.
이를 위해, 표적 분석물 결합 자기 비드가 로드되는 복수의 전극 어레이; 상기 전극 어레이의 전극들 각각에 전기적으로 커플링되는 정전위기; 상기 정전위기의 입력에 전기적으로 커플링되어 디지털 신호를 아날로그 신호로 변환하는 DAC; 상기 정전위기의 출력에 전기적으로 커플링되어 상기 정전위기의 전압 신호를 디지털 신호로 변환하는 ADC; 및 상기 DAC에 전기적으로 커플링되어 상기 DAC를 통해 정전위기로 제어명령을 전송하거나 상기 ADC에 전기적으로 커플링되어 상기 ADC로부터 전송된 디지털 신호를 통해 표적 분석물을 판단하는 마이크로 컨트롤러;를 포함하는 자기 전기화학장치 및 방법을 제공한다.

Description

대장암 진단용 통합 자기 전기화학장치 및 그 방법{An integrated magneto­electrochemical device for the rapid profiling of tumour extracellular vesicles from blood plasma}
본 발명은 진단 키트 또는 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장암을 진단할 수 있는 대장암 진단 키트 또는 장치에 관한 것이다.
액체 생검(biopsy)으로도 알려진 순환 바이오마커의 평가는 반복적이지만 최소 침습적 샘플링을 통해 환자의 종양에 대한 분자 정보를 얻는 새로운 접근 방식이다.
그러한 평가를 위한 한 가지 매력적인 표적은 세포외 소포(extracellular vesicles, EV), 즉 세포에서 분비되는 막 입자이다.
일반적으로 풍부하고 안정적일 뿐만 아니라 EV는 모세포의 생체분자(예: 단백질, 핵산 및 지질)를 운반하는 것으로 보고되었다.
특히 종양 유래 EV의 분석은 종양의 동적 상태를 밝혀 현재의 암 진단을 개선할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있다.
그러나 임상 EV 테스트를 설정하는 것은, (1) 힘든 수동 샘플 준비, (2) 기존 도구의 제한된 감도 및 처리량, (3) 테스트 장비 또는 분석의 높은 비용(예: 시퀀싱)과 같은 몇 가지 기술적 문제에 직면해 있다.
한국공개특허 10-2014-0050465호(2014년 4월 29일 공개)
본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 대장암을 진단할 수 있는 대장암 진단 키트를 제공한다.
이를 위해, 본 발명의 일 태양은, 표적 분석물 결합 자기 비드가 로드되는 복수의 전극 어레이; 상기 전극 어레이의 전극들 각각에 전기적으로 커플링되는 정전위기; 상기 정전위기의 입력에 전기적으로 커플링되어 디지털 신호를 아날로그 신호로 변환하는 DAC; 상기 정전위기의 출력에 전기적으로 커플링되어 상기 정전위기의 전압 신호를 디지털 신호로 변환하는 ADC; 및 상기 DAC에 전기적으로 커플링되어 상기 DAC를 통해 정전위기로 제어명령을 전송하거나 상기 ADC에 전기적으로 커플링되어 상기 ADC로부터 전송된 디지털 신호를 통해 표적 분석물을 판단하는 마이크로 컨트롤러;를 포함하는 자기 전기화학장치를 제공한다.
또한, 상기 복수의 전극 어레이의 각 전극은 워킹 전극, 카운터 전극 및 기준 전극의 3개의 개별전극으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 복수의 전극 어레이의 각 전극은, 상기 정전기와 푸시 핀(push-pin connectors)로 연결되고, 상기 자기 비드를 집중시키기 위해 내장 자석 위에 배치되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 정전위기는, 워킹 전극에 전기적으로 커플링되고 상기 워킹 전극과 기준 전극 사이에 미리 정의된 전위차를 유지하는 제1 연산 증폭기와, 상기 기준전극 및 카운터 전극에 전기적으로 커플링되고 상기 워킹 전극으로부터 카운터 전극을 가로지르는 유도된 전류를 전압 신호로 변환하는 트랜스임피던스 증폭기로 구성된 제2 연산 증폭기를 포함할 수 있다.
또한, 상기 ADC의 전단에 형성되어 상기 정전위기로부터 출력을 상기 ADC의 입력에 전기적 커플링시에 다수의 입력에서 선택되게 하는 멀티플렉서를 더 포함하고, 상기 마이크로 컨트롤러는 상기 멀티플렉서와 해당 입력 선택 개수의 ADC를 구성하여 각 전극에 순차적으로 액세스(access)하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 표적 분석물은 대장암 세포외 소포(CRC-EV)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 세포외 소포는 혈장으로부터 스파이킹(spiking)한 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 대장암 진단 바이오 마커는 CD44, B7-H3, EGFR, ABCG2, GPA33, EpCAM, HER2, MUC1, MET, CD44v6, CD24, CD166, STEAP1 및 ALDH1, MRP1, MDR1, TS 및 CD133 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 선택되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 대장암 진단 바이오 마커는, EGFR, EpCAM, CD24 및 GPA33의 조합으로 구성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 마이크로 컨트롤러는, ROC 곡선에서 민감도와 특이도의 합을 최대화하는 컷오프 값을 결정하고, 상기 결정된 컷오프 값을 EVCRC 점수로 정의하여, 정의된 EVCRC 점수를 토대로 하여 대장암 여부를 판단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 태양은, (a) 복수의 자기 비드에 표적 분석물을 결합하고 복수회의 세척 후 반응성 효소에 결합되게 하며, 전자 매개체 용액과 화합시켜 복수의 전극 어레이에 표적 분석물 결합 자기 비드가 로드되는 단계;
(b) 상기 복수의 전극 어레이를 정전위기에 전기적으로 커플링되게 하여 상기 표적 분석물 결합 자기 비드를 자기장에 노출시키는 단계;
(c) 상기 표적 분석물 결합 자기 비드 내의 전자 매개체들과 상기 반응성 효소간의 산화-환원 반응을 유도하는 단계; 및
(d) 상기 정전위기의 출력 결과를 통해 표적 분석물을 판단하는 단계를 포함하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법을 제공한다.
또한, 상기 반응성 효소는 HRP를 포함하고, 상기 전자 매개체는 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, (d) 단계에서, 상기 표적 분석물은 대장암 세포외 소포(CRC-EV)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 세포외 소포는 혈장으로부터 스파이킹(spiking)한 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 대장암 진단 바이오 마커는 CD44, B7-H3, EGFR, ABCG2, GPA33, EpCAM, HER2, MUC1, MET, CD44v6, CD24, CD166, STEAP1 및 ALDH1, MRP1, MDR1, TS 및 CD133 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 선택되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 대장암 진단 바이오 마커는, EGFR, EpCAM, CD24 및 GPA33의 조합으로 구성하는 것을 특징으로 한다.
또한, ROC 곡선에서 민감도와 특이도의 합을 최대화하는 컷오프 값을 결정하고, 상기 결정된 컷오프 값을 EVCRC 점수로 정의하여, 정의된 EVCRC 점수를 토대로 하여 대장암 여부를 판단하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 고처리량 통합 자기전기화학 세포외 소포(high-throughout integrated magneto-electrochemical extracellular vesicle, HiMEX)라는 임상적으로 채택 가능한 고처리량 EV 분석 장치 및 방법을 제공한다.
이를 통해, EV 농축과 전기화학적 검출을 단일 분석에서 결합하여 EV 분석을 간소화하여 임상 샘플에서 직접 EV 단백질 프로파일링을 가능하게 한다.
총 분석 시간은 1시간 미만으로 짧고(96-well format), 분석 신호는 모든 검출 프로브(96개)에서 병렬로 판독되어 매우 빠른 처리속도를 보여준다.
또한, HiMEX 분석은 CRC 관리를 위한 EV의 다양한 잠재력을 보여주었다.
첫째, 모체 종양의 주요 단백질 특징을 반영하는 EV가 순환계에 존재하고 이러한 CRC 유래 검출 EV(CRC-EV)는 매우 정확한 암 진단으로 이어졌다(전체 정확도 >96%).
둘째, CRC-EV의 연속적인 변화는 환자의 치료 반응과 관련이 있을 수 있는데, 특히, CRC-EV의 수치는 근치적 수술 후 모든 환자에서 감소했지만 종양 재발과 함께 각 환자의 베이스라인 값에서 반등하여 종양 재발가능성을 예측할 수 있게 한다.
세째, 수술 전 CRC-EV 수치는 환자의 5년 무병 생존기간(DFS)(n=90)과의 중요한 상관관계를 보여주는데, 이는 환자를 고위험군과 저위험군으로 효과적으로 분류하여 치료 예방에 기여할 수 있게 한다..
따라서, 이러한 결과는 시기 적절하고 더 좋은 정보에 입각하여 암치료에 영향을 미치며 CRC 진단, 재발 모니터링 및 예후에 EV의 임상적 유용성을 확대할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 임상 EV 분석을 위한 HiMAX 접근구성을 나타낸 도면이다
도 1a는 본 발명에 따른 연구 디자인(Study design)의 개념도이다. 도 1a를 참조하면, 표준 임상 치료 동안 CRC(n=91) 환자로부터 혈액 샘플을 수집하였다. EV 및 기존 마커(예: CEA 및 CA19-9)를 혈액 샘플에서 분석하고 면역 조직학, 방사선 보고서 및 생존을 포함한 임상 결과와 교차 비교하였다.
도 1b는 본 발명에 따른 2단계(two-step) HiMEX 분석 프로토콜을 나타낸 도면이다. 도 1b를 참조하면, EV는 면역자기 포착을 통해 강화된다. 비드 결합 EV는 전기화학 반응에 의한 신호 생성을 위한 프로빙 항체로 표시된다. 분석은 간단하고 빠르며(<1시간), 정제 단계 없이 혈장 샘플을 직접 분석한다.
도 1c는 본 발명에 따른 대장암 진단 키트(HiMAX reader)의 구성을 나타낸 도면이다. 도 1c를 참조하면, 터치스크린 인터페이스가 있는 소형 HiMEX 리더를 개발하였다. 리더기는 기존의 96웰 플레이트에 96개의 전극 어레이를 수용하였다. 각 전극 아래에는 전기 접점을 만들기 위한 푸시 핀 커넥터와 비드 바인딩된 EV를 집중시키기 위한 자석이 있다.
도 1d는 도 1c의 HiMAX 리더기의 구성을 나타낸 블럭도이다. 도 1d를 참조하면, HiMEX 리더는 2분 이내에 96개의 병렬 측정을 수행하도록 설계되었다. 각 전극은 자체 정전위기(potentiostat)에 연결되었다. 마이크로컨트롤러는 DAC(디지털-아날로그 변환기)를 통해 전위를 적용하여 전기화학 반응을 시작한다. 전극의 결과 전류는 MUX(Rapid Multiplexing)를 통해 아날로그-디지털 변환기(ADC)에 의해 판독되었다. 마이크로컨트롤러는 데이터를 처리하고 터치스크린에 표시한다. 리더기는 또한 데이터 로깅을 위해 외부 장치(예: 스마트폰)와 통신할 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 HiMAX 분석 최적화 및 특징을 나타낸 도면이다.
도 2a는 EV 샘플과 함께 배양 후 마이크로비드(microbead)의 주사 전자 현미경(Scanning electron micrograph) 이미지를 나타낸 도면이다. 도 2a를 참조하면, CD63에 대한 항체로 기능화된 비드(직경, 3μm)는 세포 배양 배지(HCT116 세포주)에서 분리된 EV를 포착(capture)하였다. 대표 이미지는 기술 복제 샘플에서 선택된다.
도 2b는 각기 다른 테트라스파닌에 특정한 3가지 유형의 자기 비드와 이들의 혼합물(Mix)을 사용하여 EV를 캡처한 도면이다. 도 2b를 참조하면, 각기 다른 테트라스파닌에 특정한 3가지 유형의 자기 비드와 이들의 혼합물(Mix)을 사용하여 EV를 캡처하였고, 그런 다음 캡처된 EV에서 주요 테트라스파닌 발현을 측정하였다. 비드 칵테일은 EV 이질성을 가장 효율적으로 극복하였다. 중복 측정에서 대표 이미지가 선택된다. 전체 웨스턴 블롯 이미지(western blot image)는 보충 정보에 표시된다.
도 2c는 HT29 세포주로부터의 EV(107 ㎖-1)를 포획하고 EGFR로 추가로 표지하여 나타낸 그래프이다. 도 2c를 참조하면, 혼합 비드 유형은 가장 높은 HiMEX 신호로 이어졌다. 데이터는 기술 삼중에서 평균 ±s.d이다.
도 2d는 본 발명에 따른 HiMAX 분석과 기존 ELISA 분석을 비교한 그래프이다. 도 2d를 참조하면, HiMEX 분석(assay)은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)보다 감도가 우수하고 dynamic range가 넓다. LOD는 임의의 단위로 HiMEX의 경우 약 104 EVs ㎖-1 이고, ELISA의 경우 약 107 EVs ㎖-1 이다. EV 수는 나노입자 추적 분석에서 추정되었다. 데이터 포인트는 기술 중복의 평균 값을 나타낸다.
도 2e는 다른 CRC 세포주의 EV에 대해 단백질 마커 세트로 프로파일링한 그래프이다. 도 2e를 참조하면, HiMEX 결과는 ELISA 분석 결과와 좋은 일치(Pearson 상관 계수, r=0.82)를 보여주었다. 표적 단백질 마커(M)의 HiMEX 발현(ξ)을 얻기 위해, 마커 관련 전류 수준을 로딩 대조군, CD63의 현재 수준에 대해 정규화하였다. ELISA의 경우 각 마커에 동일한 양의 EV(109 EVs ㎖-1)가 사용되었다. 데이터는 작은 값을 더 잘 표시하기 위해 로그 스케일에 표시되었다. 파란색 점선은 로그-로그 척도에서 가장 좋은 선형 맞춤을 나타내며 음영 처리된 회색 영역은 95% 신뢰 대역을 나타낸다. HiMEX 데이터는 기술 복제의 평균 값을 나타낸다.
도 3는 본 발명에 따른 CRC 검출을 위한 EV 프로파일링 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 종양 조직의 이미지(상부) 및 혈장 EV 분석(하부)을 나타낸 그래프이다. 도 3a를 참조하면, 3개의 주요 CRC 단백질 마커(EpCAM, EGFR 및 CD24)를 각 환자의 종양 조직(면역조직화학) 및 혈액 샘플(HiMEX)에서 평가하였다. 발현 프로파일은 정성적 일치를 보였다. 두 명의 대표적인 환자의 데이터가 표시된다. 데이터는 기술적 삼중 측정에서 평균 ± s.e.m. 이다. 이 샘플의 전체 이미지는 보충 정보에 나와 있다.
도 3b는 CRC 환자 12명의 종양 조직(왼쪽) 및 혈장 EV 샘플(오른쪽)을 EpCAM, EGFR 및 CD24의 발현에 대해 분석한 도면이다. 도 3b를 참조하면, 조직 염색은 전체 암세포 중 표지자 양성 세포의 비율로 등급을 매겼다. 병리학적 점수와 EV 발현 프로파일은 유의한 상관관계를 보였다(Spearman 순위 계수 ρs=0.65, P<0.0001, 양측 t-검정).
도 3c는 CRC 진단을 위한 HiMEX 분석 도면이다. 도 3c를 참조하면, 상단의 도면은 훈련 세트로서 수술 전 CRC 환자 58명과 건강한 대조군 25명의 혈장 샘플을 분석하였다. 5개의 CRC 마커(EpCAM, EGFR, CD24, CD133 및 GPA33)의 발현을 HiMEX로 측정하였다. 하단의 도면에서, 진단 메트릭인 EVCRC는 로지스틱 회귀에 의해 4가지 마커 수준(EpCAM, EGFR, CD24 및 GPA33)의 가중 합계로 결정되었다.
도 3d는 CRC 환자와 대조군에서 5개의 CRC 마커(EpCAM, EGFR, CD24, CD133 및 GPA33)에 대한 평균 레벨을 나타낸 도면이다. 도 3d를 참조하면, 표시된 각각의 마커에 대한 평균 수준은 건강한 대조군보다 CRC 환자에서 더 높았다. 그러나, 마커 분포는 환자와 대조군 사이에 중첩되어 단일 마커의 분류 능력을 감소시킨다.
도 3e는 5개의 CRC 마커(EpCAM, EGFR, CD24, CD133 및 GPA33)에 대한 ROC 곡선을 나타낸 그래프이다. 도 3e를 참조하면, EVCRC의 곡선 아래 면적(AUC)은 0.98로 단일 마커보다 유의하게 크다(모두 P<0.001). ROC 곡선에서 민감도와 특이도의 합을 최대화한 컷오프 수준을 결정하였다.
도 3f 및 도 3g는 대조군과 CRC 환자에 대한 EVCRC를 나타낸 도면이다. 도 3f 및 도 3g를 참조하면, EVCRC는 대조군과 CRC 환자에 대해 효과적으로 분류한다(P=0.0009, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정)(f).훈련 코호트에서 진단 정확도는 98%였다. EVCRC ROC 곡선의 컷오프 값은 4.96(g)이었다.
도 4는 본 발명에 따른 CRC 진단을 위한 전향적 코호트 분석을 나타낸 도면이다.
도 4a의 상단은 EpCAM, EGFR, CD24 및 GPA33의 발현을 위해 CRC 환자 33명, 건강한 기증자 9명, CRC가 아닌 질환이 있는 환자 6명(위장관 기질 종양, n=2, 소장 내부 탈출, n=2, 맹장염, n=2)의 혈장 EV를 분석한 것이다. 도 4a의 하단은 EVCRC는 훈련 코호트와 동일한 공식에 의해 계산되었다.
도 4b를 참조하면, EVCRC 수준은 EV 기반 진단 알고리즘을 검증하는 건강한 대조군보다 CRC 환자에서 유의하게 더 높았다. 훈련 세트로부터 동일한 컷오프 값(4.96)이 적용되었다.
도 4c를 참조하면, EVCRC는 단일 마커의 AUC보다 훨씬 큰 AUC로 CRC 검출에서 여전히 우수하였다. 자세한 통계는 표 2에 나와 있다.
도 5는 CRC 환자로부터 종단적인 샘플의 HiMAX 분석을 나타낸 도면이다.
도 5a를 참조하면, CRC 환자의 혈액 샘플을 수술 전후에 분석하였다(n=13).
분자 EV 프로파일링은 EVCRC 값이 모든 환자에서 감소한 것으로 나타났다(P<0.0001, 쌍을 이루는 양측 t-검정)(가운데 왼쪽). 반면 총 EV 농도(P=0.59, 쌍을 이루는 양측 t-검정)(왼쪽) 및 기존 혈청 마커 CEA(P=0.19, 쌍을 이루는 양측 t-검정)(오른쪽 가운데) 및 CA19-9 (P=0.19, paired two-sided t-test) (오른쪽)은 유의한 변화를 보이지 않았다.그래프의 각 데이터 포인트는 기술적 중복의 평균값을 나타냅니다.
도 5b를 참조하면, 일부 환자가 화학 요법을 받았기 때문에 수술 후 플라즈마 EV를 추가로 모니터링하였다. 재발성 종양(왼쪽 및 중간)이 있는 모든 환자(n=7)에서 EVCRC 값이 반등하였다. 대조적으로, 재발성 종양이 없는 환자(n=4)(오른쪽)에서 EVCRC 값은 수술 후 수준에서 계속 감소하거나 안정화되었다. 데이터는 기술 복제에서 평균 ± s.e.m. 이다.
도 5c를 참조하면, 재발성(n=3) 및 비재발성(n=3) CRC가 있는 환자의 EV를 mRNA 발현에 대해 분석하였다. 고도로 가변적인 유전자를 플로팅하였다. DNA 복구, 산화 압력에 대한 보호 및 화학 내성(5-FU)에 관여하는 유전자는 재발성 종양 환자의 EV에서 더 높은 수준을 보였다.
도 5d를 참조하면, CRC 환자(n=90)는 DFS에 대해 최대 5년 동안 모니터링되었다. DFS에 대한 Kaplan-Meier 추정치는 수술 전 EVCRC 수준으로 계층화되어 플롯되었다. 높은 EVCRC 값(≥53.4)은 불량한 예후와 관련이 있었다(P=0.02, 양측 로그 순위 검정).
이하에서 첨부된 도면을 참조하며 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 대장암 진단 키트에 대해 자세히 설명한다.
먼저, EV 진단이 임상적으로 유용해지기 위해서는 EV의 분리 및 분자 분석을 위한 새로운 통합 방법, 이상적으로는 높은 처리량 작업이 가능한 방법이 필요하다. 또한, 질병 상태에 대한 강력한 EV 바이오마커 기준선을 설정하기 위해 대규모 임상 샘플을 분석하는 것도 마찬가지로 중요하다.
여기에서 우리는 고처리량 통합 자기전기화학 세포외 소포(high-throughout integrated magneto-electrochemical extracellular vesicle, HiMEX)라는 임상적으로 채택 가능한 고처리량 EV 분석 기술의 개발을 설명한다.
이 기술은 EV 농축과 전기화학적 검출을 단일 분석에서 결합하여 EV 분석을 간소화하여 임상 샘플에서 직접 EV 단백질 프로파일링을 가능하게 한다.
총 분석 시간은 1시간 미만(96-well format)이었고 분석 신호는 모든 검출 프로브(96)에서 병렬로 판독되었다.
그런 다음 HiMEX를 임상 샘플 분석에 적용하여 HiMEX의 실질적인 이점을 보여준다.
구체적으로, 우리는 수술과 화학 요법을 받은 102명의 대장암(colorectal cancer, CRC) 환자와 40명의 비 CRC 대조군(즉, 맹장염이나 소장 내부 탈장과 같은 비 CRC 질환이 있는 환자)의 혈액 샘플을 분석했다(n= 총 142개).
다음과 같이, HiMEX 분석은 CRC 관리를 위한 EV의 다양한 잠재력을 보여주었다.
(1) 모체 종양의 주요 단백질 특징을 반영하는 EV가 순환계에 존재하고 이러한 CRC 유래 검출 EV(CRC-EV)는 매우 정확한 암 진단으로 이어졌다(전체 정확도 >96%).
(2) CRC-EV의 연속적인 변화는 환자의 치료 반응과 관련이 있을 수 있는데, 특히, CRC-EV의 수치는 근치적 수술 후 모든 환자에서 감소했지만 종양 재발과 함께 각 환자의 베이스라인 값에서 반등하였다.
(3) 수술 전 CRC-EV 수치는 환자의 5년 무병 생존기간(DFS)(n=90)과의 중요한 상관관계를 보여주는데, 이는 환자를 고위험군과 저위험군으로 효과적으로 분류한다.
이러한 결과는 시기 적절하고 더 좋은 정보에 입각하여 암치료에 영향을 미치며 CRC 진단, 재발 모니터링 및 예후에 EV의 임상적 유용성을 확대할 수 있게 한다.
이에 따라, 임상 EV 테스트를 위한 HiMEX 분석과 그에 따른 결과를 이하에서 자세히 설명한다.
<결과>
<임상 EV 테스트를 위한 HiMEX 접근>
전술한 바와 같이, 본 발명에서는, CRC 진단, 치료 모니터링 및 예후에 적용하기 위해 HiMEX를 평가하는 것을 목표로 하였다(그림 1a 및 보충 그림 1).
전반적으로, 우리는 CRC가 있는 102명의 환자와 40명의 비-CRC 대조군(n=142 총)의 혈장 샘플을 분석하였다.
CRC 진단을 위해 우리는 먼저 발표된 결과, 시험관 내 연구 및 조직 면역조직화학을 기반으로 CRC-EV 시그니처를 정의했으며 다음으로 혈장 EV에서 이러한 마커를 측정하였다.
총 131명의 환자 샘플이 사용되었다. 즉, 25명의 비-CRC 대조군과 58명의 CRC 환자로 구성된 훈련 코호트(cohort); 및 15명의 비-CRC 대조군과 33명의 CRC 환자의 테스트 코호트이다.
환자 모니터링을 위해 표준 임상 치료를 받은 CRC 환자 11명을 추가로 추적하였다.
일련의 혈액 샘플을 정의된 시점(즉, 수술 전후 및 화학요법 동안)에 수집하고 CRC-EV 마커에 대해 분석하였다.
그런 다음 EV 프로파일링 결과를, 예를 들면, 기존 종양 마커로서 암 배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 및 탄수화물 항원(carbohydrate antigen, CA19-9) 등과 같은 레벨(level), 방사선학적 평가 및 치료 결과를 포함한 임상 정보와 비교하였다.
마지막으로 EV 프로파일링의 예후 사용을 위해 CRC 환자 90명을 대상으로 5년 DFS와 수술 전 CRC-EV 수준의 상관 관계를 분석하였다.
EV 분석을 간소화하기 위해 HiMEX 기술을 최적화하여 단일 분석 내에서 샘플 준비 및 측정을 통합하였다(그림 1b).
우리는 면역 자기 분리(immunomagnetic separation)를 사용하여 대상별 EV를 강화하여 추가 조작 없이 기본 샘플(native sample)에서 직접 EV를 신속하게(~15분) 분리할 수 있었다. 그런 다음 후속 신호 생성을 위한 기판으로 자기 비드(magnetic beads)를 활용하였다. 또한, 비드 결합 EV(bead-bound EVs)는 전기화학 반응을 위한 촉매 효소로 기능화된 프로빙 항체(probing anti-bodies)로 표지(label)되었다.
HiMEX 전략에는 다음과 같은 장점이 있다.
(1) 요구된 EV의 광범위한 정화 없이도 시료(sample) 취급이 간단하다(즉, 자기 당기기(magnetic pulling).
(2) EV 캡처 및 라벨링(총 약 30분)에서 빠른 결합 동역학 및 고효율의 분석 결과를 갖는다.
(3) 분석 신호는 효소 반응에 의해 증폭되었으며,
(4) 검출 양식(즉, 전기 측정)은 높은 처리량 측정을 위해 확장할 수 있었다.
<병렬 측정을 위한 HiMEX 검출 시스템>
HiMEX의 고유한 기술적 이점을 활용하기 위해 병렬 측정이 가능한 소형 시스템을 개발하였다(그림 1c).
즉, 시스템은 96 웰 플레이트(well plate)와 호환되어 일괄 처리가 가능하다.
EV 캡처 및 라벨링은 기존의 96 well plate, 즉, 맞춤 설계된 자석 어레이(보충 그림 2a)는 비드 처리(예: 세척 및 버퍼 교환)에 사용되었다.
그런 다음 EV 결합 비드가 검출 장치에 로드된 12x8 프로브 어레이(보충 그림 2b)에서 발견되었다.
3개의 전극(즉, 워킹 전극, 카운터 전극 및 기준 전극)이 포함된 어레이의 각 프로브는 빠른 푸시 핀 커넥터(push-pin connectors)로 정전위기(potentiostat)에 연결되었고 자기 비드를 집중시키기 위해 작은 내장 자석 위에 배치되었다(그림 1c 및 보충 그림 2c).
검출 시스템은 또한 장치 제어 및 데이터 표시를 위한 터치스크린 인터페이스를 특징으로 하며 데이터 저장을 위해 외부 서버와 무선으로(Bluetooth를 통해) 통신하였다.
분석 신호로 워킹 전극(working electrode)과 카운터 전극(counter electrode) 사이의 전류를 모니터링하면서 워킹 전극과 기준 전극 사이에 일정한 전압을 인가하였다.
빠른 판독을 가능하게 하기 위해 측정 중에 각 프로브를 빠르게(100Hz) 폴링(poll)하도록 시스템 전자 장치를 설계하였다(그림 1d).
즉, 임베디드 마이크로컨트롤러는 6개의 아날로그-디지털 변환기(ADC)와 6-to-1 멀티플렉서(multiplexer, MUX) 구성을 통해 개별 프로브에 순차적으로 액세스하였다(access).
이 체계는 실시간, 병렬 측정을 효과적으로 실행하였다(보충 그림 2d).
모든 96개 프로브의 총 판독 시간은 2분 미만이었다.
다양한 농도의 K4Fe(CN)6 샘플을 사용하여 시스템 성능을 벤치마킹하였고, 특히 96개 프로브 간의 재현성을 평가하는 데 중점을 두었다.
주어진 K4Fe(CN)6 농도에 대해 어레이의 다른 프로브가 일관된 신호를 보고하였다(보충 그림 3a).
K4Fe(CN)6 희석 시리즈(dilution series)의 병렬 측정으로 생성된 4개의 표준 곡선은 전류 레벨과 K4Fe(CN)6 농도 사이의 우수한 선형 관계를 보여주었다(보충 그림 3b).
특히, 이러한 곡선은 통계적으로 동일하여 병렬 검출에 대한 프로브 간의 높은 충실도(즉, 낮은 프로브 내 변동)를 보여준다.
<HiMEX 분석 특징>
다음으로 핵심 분석 단계, 즉 EV 캡처 및 전기화학적 검출을 최적화하여 분석 신호를 최대화하였다.
EV 캡처를 위해 EV에 풍부한 테트라스파닌(tetraspanins)(즉, CD63, CD9 및 CD81) 중 하나에 특정한 세 가지 유형의 자기 비드(magnetic bead)를 준비하였다.
EV와 혼합하면 이들 비드는 소포(vesicles)로 효과적으로 덮였다(그림 2a). 즉, IgG 항체와 접합된 대조군 비드(control bead)는 최소의 비특이적 결합(non-specific binding)을 보여주었다(보충 그림 4).
본 발명에서 EV 풀다운(pull-down)을 위해 단일 유형 또는 캡처 비드 칵테일(cocktail)을 추가로 사용하고 EV 테트라스파닌의 레벨을 비교하였다(그림 2b).
캡처 비드(CD63, CD9 및 CD81)의 혼합물은 단일 마커 비드 단독(그림 2b 및 보충 그림 5a)보다 모든 테트라스파닌 레벨에서 더 높은 신호를 생성했으며, 이는 아마도 EV 이질성(heterogeneity)을 반영한다.
단일 EV 이미징(보충 그림 6)은 관찰을 지원하였다. 즉, 현미경으로 볼 수 있는 EV의 수는 CD63, CD9 및 CD81 항체의 칵테일을 형광 염색(fluorescent staining)에 사용할 때 가장 높았다.
면역 자기 포획은 혈장(plasma)에서도 효율적이었다(보충 그림 5b).
면역 포집 전후의 CD63 수준을 기준으로 풀다운 수율(pull-down yield)은 82%로 추정되었다.
검출 신호를 생성하기 위해, 우리는 포획된 EV를 산화 효소(horseradish peroxidase, HRP)로 라벨하기 위해 프로빙(probing) 항체를 사용하고, 접합체를 발색 전자 매개체(3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine(TMB))와 혼합하였다.
산화 환원 반응은 전류가 1분 이내에 안정되면서 빠르게 평형에 도달하였다(보충 그림 7).
반응 개시 후 50초에서 55초 사이의 전류를 기록하고 평균값(I)을 분석 지표로 사용하였다.
최대 HiMEX 신호를 일관되게 생성했기 때문에(그림 2c) 나머지 연구에서 EV 캡처를 위해 3개 비드 칵테일(three bead cocktail)을 사용하였다.
다음 단계는 HiMEX의 분석 능력을 특성화하는 것이었다.
먼저 다양한 농도의 EV로 샘플을 준비하였다.
CD63, CD9 및 CD81 비드 혼합물을 사용하여 EV를 캡처하고 CD63으로 라벨하였다(label). 즉, 캡처된 EV에 IgG 항체를 표시하여(label) 대조군 샘플(control sample)을 생성하였다.
그런 다음 HiMEX 검출기를 사용하여 이러한 샘플을 측정하였다(보충 그림 7).
공통 모드 오류(common-mode error)(예: 온도 변동 및 비특이적 결합)의 영향을 최소화하기 위해 순 전류(net current), 즉 ΔICD63=ICD63 - IIgG를 분석 메트릭(analytic metric)으로 사용하였다.
적정 결과(그림 2d)에서 HiMEX 기술의 검출 한계(limit of detection, LOD)는 기존 ELISA 분석보다 낮은, 1,000배 이상으로, 약 104 EVs로 추정되었다.
HiMEX는 또한 ELISA assay(103 EVs 미만)보다 훨씬 더 넓은 동적 범위(약 105 EVs)를 가졌다.
다음으로 분석 재현성을 평가하였다.
3일에 걸쳐 우리는 EV 샘플을 준비하고 HiMEX 어레이를 사용하여 CD63, CD9 및 CD81에 대해 조사했다(probe).
주어진 마커에 대해 관찰된 신호는 다른 날에 통계적으로 동일했다(보충 그림 8).
또한, 신호 수준을 혈장 또는 혈청 중 하나에 스파이크된 EV와 추가로 비교했으며 (보충 그림 9) 두 샘플 유형에서 유사한 신호 변화를 관찰하였다.
또한, 혈장이 EV의 생리학적 매개체로 간주되고 혈소판 유래 소포가 더 적기 때문에 혈장을 선택하였다.
비드 혼합물에 의해 캡처된 EV에 CRC 관련 마커가 포함되어 있는지 테스트하기 위해 경쟁 분석을 수행하였다(보충 그림 10a).
샘플은 CRC 세포주(SW480 세포, EpCAM 및 CD24에 대해 양성)의 EV를 인간 혈장에 스파이킹(spiking)하여 준비하였다.
EV 면역 자기 포획은 과량의 자유 부동 포획 항체(CD63, CD9 및 CD81의 혼합물)의 존재하에 수행되었다.
그런 다음 CD63, EpCAM 및 CD24의 발현에 대해 비드 결합 EV를 조사하였다.
측정된 HiMEX 신호는 유리 항체의 농도가 증가함에 따라 감소했으며(보충 그림 10b), 이는 비드 캡처된 EV에 CRC 마커가 있음을 나타낸다.
정량적 HiMEX 분석을 위해 다음 프로토콜을 설정하였다.
주어진 관심 마커(M)에 대해 EV 캡처 및 라벨링 후 HiMEX 신호(ΔIM = IM- IIgG)를 측정하였다.
EV 로딩 대조군으로서 동일한 샘플의 분취량을 사용하여 ΔICD63 도 측정하였다.
표적 마커의 발현 수준(ξM)은 로딩 대조군(ξM = ΔIM /ΔICD63)에 대해 IM을 스케일링함으로써 추정되었다.
다른 단백질 마커에 대한 EV를 프로파일링하는 방법을 적용하였다.
결과는 ELISA와 좋은 선형 상관관계(Pearson r=0.82)를 보여주었다(그림 2e).
<세포주 유래(cell-line derived) EV의 고처리량 스크리닝(screening)>
CRC 검출과 관련된 초기 EV 마커를 선택하기 위해 맞춤형으로 설계된 생물정보학 파이프라인을 공용 데이터베이스에 적용하였다(방법 및 보충 그림 11).
Human Protein Atlas에서 CRC 및 건강한 조직에 대한 단백질 발현 프로필을 검색하고 CRC에서 과발현된 마커를 선택하였다. 그런 다음 이 컬렉션을 UniProt 주석과 상호 참조하여 세포외 도메인을 포함하는 단백질을 선택한다.
두 가지 기준, 즉, (1) EV에서 보고된 마커 존재(Vesiclepedia 데이터베이스), 및 (2) ELISA 호환 항체의 가용성(보충 표 1)을 적용하여 목록을 더욱 좁혔다.
이 알고리즘은 9개의 마커(CD44, B7-H3, EGFR, ABCG2, GPA33, EpCAM, HER2, MUC1 및 MET)를 선택했다. 또한, CRC(CD44v6, CD24, CD166, STEAP1 및 ALDH1)에서 과발현되는 것으로 확인된 마커와 약물 내성 모니터링에 사용되는 마커(MRP1, MDR1, TS 및 CD133)를 포함하여 목록을 추가하였다. 그런 다음 HiMEX의 높은 처리량을 사용하여 CRC 세포에서 파생된 EV에서 후보 마커를 측정하였다.
이 전임상 연구는 다음 2가지의 조사에 중점을 두었다. 즉, (1) EV와 그 기원 세포 사이의 마커 발현 상관 관계; 및 (2) EV에서 후보 마커의 존재를 확인하는 것이다.
세포주 패널(cell-line panel)에는 다양한 CRC 단계(SW480 세포, Dukes 분류 B형; DLD-1 및 SW620 세포, C형: Colo201 세포, D형)와 약물 내성(irinotecan) 표현형 (HT29 및 HCT116)을 나타내는 세포가 포함되었다.
음성 대조군(negative control)으로서 우리는 건강한 결장 세포주(CCD-18Co)의 EV와 건강한 기증자의 혈장을 프로파일링하였다.
분석 목표가 CRC-EV에서 과발현된 마커를 식별하는 것이었기 때문에 건강한 혈장 샘플을 포함하는 것은 정당화되었다.
EV를 수집한 후 HiMEX로 프로파일링하고(보충 그림 12a), 세포 발현은 유세포 분석으로 측정하였다.
전반적으로 EV에 대해 선택된 마커와 그 모세포의 발현 프로파일은 밀접하게 일치했으며(r=0.89)(보충 그림 12b), 이는 EV를 세포 대리물(cellular surrogates)로 사용하는 것을 지원한다.
임상 EV 샘플에 대한 추가 테스트를 위해 CRC 세포주에서 상대적으로 더 높은 발현을 기반으로 EpCAM, EGFR, CD24 및 CD133을 선택하였다(보충 그림 12c).
또한, CRC 진단에서 임상적 관련성을 위해 GPA33을 포함하였다.
<임상 샘플에서 CRC 진단을 위한 EV 단백질 서명(protein signature) 정의>
다음으로 HiMEX를 적용하여 임상 샘플에서 CRC EV를 감지하였다.
먼저, CRC 환자의 순환 EV가 CRC 조직에서 발견되는 주요 단백질 마커를 포함하는지 여부를 조사하였다.
CRC 환자 12명의 파일럿 코호트에서 수술 전 혈액 샘플과 수술 중 조직 표본을 모두 얻었다.
또한, 세포주 연구에서 확인된 상위 3개 마커(EpCAM, EGFR 및 CD24)의 발현을 평가하였다.
조직 표본을 이러한 마커에 대해 염색하고(면역조직화학), 병리학자가 발현을 전체 암세포 중 마커 양성 세포의 일부로 등급을 매겼다(0에서 1까지 0.1씩 증가하는 방법).
EV는 HiMEX를 통해 동일한 마커에 대해 스크리닝되었다(그림 3a).
전반적으로 조직과 EV 샘플 사이의 마커 발현은 좋은 일치(그림 3b 및 보충 그림 13)와 양의 상관 관계(Spearman의 순위 계수 ρs=0.65, P<0.0001)를 나타냈다.
이러한 결과는 순환에서 CRC 유래 EV의 존재를 나타내므로 EV 프로파일링으로 종양 분자 상태를 평가하는 근거를 뒷받침한다.
CRC-EV 진단을 설정하기 위해 코호트를 확장하고 EV 프로파일링에서 전체 마커 세트를 사용하였다.
수술 전에 CRC 환자로부터 혈액을 채취하였다.
대조군 샘플은 비-CRC 질환이 있는 환자뿐만 아니라 건강한 기증자로부터 얻었다.
모든 혈액 샘플은 확립된 프로토콜(방법)에 따라 수집되고 일관되게 처리되었다.
순환 EV는 EpCAM, EGFR, CD133, GPA33, CD24 및 CD63 수준에 대해 HiMEX에 의해 평가되었다.
샘플의 분취량은 또한 임상적으로 관련된 혈청 마커 CEA 및 CA19-9에 대해 분석되었다.
도 3c는 초기 훈련 코호트(CRC 환자 58명, 비 CRC 대조군 25명)의 EV 마커 발현 프로필을 요약한다.
5개 마커 모두의 평균 수준은 대조군보다 CRC 환자에서 더 높았다(그림 3d).
그러나, 두 분포가 겹쳤기 때문에 단일 마커를 기준으로 분류하기가 어렵기 때문에 다중 마커 조합을 고려하였다. 특히, 최적 가중치가 로지스틱 회귀(방법)에 의해 결정된 EV 마커의 가중치 합을 사용하였다.
개별 마커와 그 조합 모두에 대해 ROC 곡선을 구성하였다(그림 3e 및 보충 그림 14).
각 ROC 곡선에서 민감도와 특이도의 합을 최대화하는 컷오프 값을 결정하였고, EGFR, EpCAM, CD24 및 GPA33의 조합이 최적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이 메트릭은 EVCRC 점수로 정의되었다.
EVCRC의 AUC는 개별 EV 마커(그림 3e) 및 2개 또는 3개 마커 조합보다 유의하게 더 높았다(모든 P<0.001, DeLong 테스트).
5개 마커 조합과 비교하여 EVCRC는 통계적으로 동일한(P=0.17, DeLong 테스트) 분류 성능을 보였다.
전반적으로 컷오프 값이 4.96인 EVCRC는 훈련 코호트에서 높은 진단력(도 3f, 3g)을 보여 97%의 검출 감도, 100%의 특이성 및 98%의 정확도를 달성하였다(방법 및 표 1, 2).
Figure pat00001
Figure pat00002
본 발명에서는 전향적 테스트 코호트(수술 전 CRC가 있는 33명의 환자 및 15개의 비 CRC 대조군)로부터 샘플을 분석하여 통계 모델을 추가로 테스트하였다(도 4a).
훈련 세트의 동일한 컷오프 값이 적용되었을 때(도 4b 및 도 4c), EVCRC는 우수한 진단 통계(민감도 94%, 특이도 100%, 정확도 96%)를 유지하였다.
EVCRC의 진단 정확도는 EV 분석의 CRC 특이적 특성으로 인해 기존의 혈청 마커(보충 그림 15a)보다 우수하였다.
EVCRC는 CEA(ρS = -0.12, P=0.24) 또는 CA19-9(ρS = -0.11, P=0.29)와 유의한 상관관계(보충 그림 15b)를 나타내지 않았다. 이러한 혈청 마커 중 하나를 EVCRC와 결합(로지스틱 회귀에 의해)해도 AUC는 유의하게 개선되지 않았다(CEA 추가의 경우 P=0.20, CA19-9 추가의 경우 P=0.18, DeLong 테스트).
<임상 치료 중 세로 CRC-EV 모니터링>
다음으로, 환자가 표준 임상 치료를 받았을 때 종단 EV 프로파일 변화를 추적하였다.
먼저, 수술 전후의 EV 수준을 비교하였다(도 5a).
혈액 샘플(n=13)은 수술 24시간 전과 수술 후 1주일 이내에 수집되었다.
전체 EV 부하는 유의미한 변화(P=0.634, paired t-test) 또는 방향성을 나타내지 않았다.
대조적으로, EVCRC는 모든 환자에서 감소하였고(P<0.0001, paired t-test), 이는 아마도 치료적 종양 절제 후 CRC 유래 EV가 더 적기 때문일 것이다.
비 CRC 질환(예: 충수염 및 소장 내부 탈장)으로 복부 수술을 받은 환자(n=4)의 혈액 샘플을 분석했을 때 추론이 더욱 뒷받침되었다.
이 환자의 경우 EVCRC 값은 수술 전후에 통계적으로 동일하게 유지되었다(P=0.77, paired t-test)(보충 그림 16).
환자 전체 평균에서 CEA와 CA19-9의 수치는 수술 후 감소했지만 쌍별 비교(수술 전후)에서 하향 추세는 통계적으로 유의하지 않았다(CEA의 경우 P=0.19, CA19-9, paired t-test의 경우 P=0.190).
시간성을 더 잘 확인하기 위해 수술 후 6개월 동안 CRC(n=11)를 갖는 추가 환자를 모니터링하였다.
위험 인자가 있는 Ⅱ기 (부적절한 림프절 샘플링, 천공 또는 림프혈관 침범) 또는 Ⅲ기의 8명의 환자는 5-플루오로우라실(fluorouracil)(5-FU)과 류코보린(leucovorin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)을 사용한 보조 치료(FOLFOX 화학요법)를 받았다.
나머지 3명의 환자는 모두 Ⅱ기였으며 치료에서 제외되었다(환자 세부 정보는 보충 표 2 참조).
치료를 받은 환자의 경우 치료 전후에 혈액 샘플을 수집하였고, 치료를 받지 않은 환자의 경우 수술 후 약 6개월에 샘플을 수집하였다.
종양 재발 상태는 시간이 지남에 따라 크기가 증가하는 병변의 외과적 절제 또는 방사선학적 검출에 의해 나중에 확인되었다.
치료받은 환자(n=8) 중 4명은 재발하지 않은 것으로 분류되었고, 나머지는 재발로 분류되었고 치료를 받지 않은 모든 환자에서 종양이 재발하였다(n=3).
이러한 분류를 맹목적으로 HiMEX EV 프로파일링을 수행하였고, 모든 환자에서 수술 후 EVCRC 값이 감소하였다(보충그림 17).
수술 후 EVCRC 기준선에서 EVCRC는 치료 상태에 관계없이 모든 재발 환자에서 증가하였다.
대조적으로, EVCRC는 재발하지 않은 환자에서 감소하거나 안정되었다(도 5b).
따라서, EVCRC(ΔEVCRC)의 연속적인 변화는 단기 종양 재발의 지표로서의 가능성을 보여주었다(P=0.0004, unpaired two-sided t-test) (보충 그림 18).
또한, CEA(P=0.13, t-test)와 CA19-9(P=0.76, t-test) 레벨의 변화는 재발 여부와 상관없이 유사하였다.
<EV 캡처 및 RNA 분석>
HiMEX에 사용된 면역 자기 캡처를 통해 CRC 단백질 검출(HiMEX) 뿐만 아니라 다른 분자 분석을 위해 EV를 강화할 수 있었다.
여기서, 보조 화학 요법 후에 수집된 혈액 샘플에서 EV-RNA 분석을 돕기 위해 이 기술을 적용하였다.
HiMEX 분석에서와 같이 테트라스파닌(tetraspanin) 자기 비드 칵테일을 사용하여 EV를 캡처하였다.
재발(n=3) 및 비재발(n=3) 환자의 혈장 샘플을 처리하였다. 그런 다음 캡처된 EV를 용해하고 RNA 함량을 정량적 유전자 발현 프로파일링(방법)을 위해 시퀀싱하였다.
mRNA 판독을 기반으로 한 주성분 분석은 2 코호트(즉, 재발성 대 비재발성)를 분리했으며, 더 많은 유전자가 재발성 환자 그룹에서 상향 조절되었다(보충 그림 19a).
또한, 샘플에서 매우 가변적인 유전자를 식별하기 위해 차등 분석을 수행하였다(보충 그림 19b). 특히, 선택된 유전자는 모두 재발 환자에서 더 높은 발현을 보였다(도 5c). 이 유전자는 DNA 손상 복구(GADD45A 및 CDKN1A), 산화 스트레스에 대한 보호(GPX1, GPX4, PRDX6 및 UCP2), 지방산 산화(ACOT7 및 CD36) 및 5-FU에 대한 내성(TGFB1, DNAJB6, DNAJC6 및 ATF4)에 대한 내성에 관여한다.
<5년 DFS의 예후(prognosis)에 대한 CRC-EV 서명(signature) 평가>
마지막으로, DFS를 예측하는 EV 분석의 능력을 평가하였다.
높은 CRC-EV 부담은 큰 원발성 병변 또는 악성 표현형을 나타낼 수 있다.
따라서, 수술 전 높은 수준의 EVCRC는 아마도 수술 후 잔류 종양 존재 또는 전이에 의해 야기되는 질병 재발의 위험과 상관관계가 있을 수 있다고 판단할 수 있다.
또한, 모두 수술 전 혈액 검사를 받았고 종양 절제술을 받은 CRC(보충 표 3) 환자 90명을 최대 5년 동안 전향적으로 추적하였다.
EV 분석에서 종양이 결국 전이로 진행된 환자 그룹에서 초기 EVCRC 점수가 더 높다는 것을 발견하였다(P = 0.041, unpaired two-sided t-test)(보충 그림 20).
생존 분석은 높은 EVCRC 값과 열악한 DFS 사이의 결합(association)을 보다 더 견고하게 확인할 수 있었다.
EVCRC 점수에 따라 환자를 두 그룹으로 계층화했으며 두 계층 간의 절대 로그 순위 통계를 최대화하기 위해 53.4의 점수 임계값을 선택하였다.
또한, 높은 EVCRC 점수를 가진 18명의 환자 중 13명이 5년 동안의 추적 관찰 동안 종양 전이를 보고한 반면, EVCRC 점수가 역치 미만인 환자 72명 중 21명이 종양 전이를 보고했음을 발견하였다. 즉, 두 생존 곡선을 비교하면 두 그룹 사이에 상당한 예후 차이가 있음을 시사하였다(P = 0.02, two-sided log-rank test)(도 5d 및 방법).
대조적으로, CRC 예후에 자주 사용되는 수술 전 CEA 농도(컷오프 값 7ngml-1)는 이 코호트(P = 0.07, wo-sided log-rank test)에서 DFS와 관련하여 경계선 성능(borderline performance)을 표시하였다(보충 그림 21).
<토론(discussion)>
종양 유래 EV를 분석하면 종양의 분자 구성에 대한 실시간 스냅샷을 제공할 수 있으며, 잠재적으로 시기적절하고 정보에 입각한 임상 개입 기회를 제공할 수 있다.
본 발명에서 이러한 EV 기반 테스트를 임상 현실에 더 가깝게 배치하기 위해 HiMEX를 개발하였다.
HiMEX 접근 방식은 EV 분리 및 단백질 검출을 연속 워크플로에 통합하여 임상 샘플의 일괄 처리를 가능하게 한다.
특히, HiMEX는 다음과 같은 기술적 이점을 제공한다.
(1) 표적 특이적 EV 단백질 분석을 위한 혈장 샘플의 직접 사용;
(2) 자기 농축 및 효소 신호 증폭에 의한 우수한 검출 감도(ELISA보다 약 1,000배 높음);
(3) 기계 스캐너를 사용하지 않고 병렬 측정을 실행하는 소형 장치의 장점을 제공한다.
본 발명에서는 이러한 개념을 증명하기 위해 96 전극 어레이를 사용하는 소형 HiMEX 장치를 구현하였고, 또한 EV 분리에서 분석에 이르기까지 전체 HiMEX 분석이 1시간 이내에 완료되었음을 보여주었다.
HiMEX는 표준 실험실 설정에서 EV 프로파일링을 간단하게 만들 수 있다. 즉, 이 기술은 비용 효율적이며 빠르고 병렬 EV 단백질 검출이 가능하다.
HiMEX의 초기 분석 단계인 Immunomagnetic pulling은 다른 분자 분석을 위한 EV 수집을 용이하게 할 수도 있다. 예를 들어, 약물 내성 상태를 조사할 때 우리는 면역 자기적으로 혈장에서 직접 EV를 캡처한다. 그런 다음 비드 캡처된 EV의 일부는 HiMEX에 의한 CRC 단백질 검출에 사용되었고 나머지는 표적 mRNA 시퀀싱에 사용되었다.
시스템을 더욱 개선하기 위해 검출 전극을 설계하여 분석 감도와 처리량을 향상시킬 수 있다.
전극을 마이크로미터 규모로 소형화하면 질량 검출 한계를 개선하고(샘플 부피를 줄임으로써) 조밀한 어레이의 구성을 용이하게 한다.
감지 전극 표면은 나노 구조로 질감 처리되어 절묘한 감도를 얻을 수도 있다.
이러한 개선 사항은 HiMEX가 희소한 EV 표적(예: 소포 내부의 돌연변이 단백질, 단백질 변형 및 핵산)을 감지하여 단일 분석 시스템에서 포괄적인 분자 프로파일링을 가능하게 할 수 있다.
CRC 검출에 HiMEX를 사용하기 위해 처음에 CRC 진단을 위한 과발현된 단백질 바이오마커를 결정하기 위해 생물정보학적 조사를 수행하였다.
많은 단백질이 CRC와 연관되어 있지만 EGFR, EpCAM, CD24 및 GPA33으로 구성된 패널로 좁혔다.
특히 CRC-EV 패널은 발견(98%) 및 테스트(96%) 코호트에서 높은 정확도를 달성했으며, 이는 순환계에 종양 EV가 열성적으로 방출되었기 때문일 수 있다.
더욱이, 직렬 EV 프로파일링은 EV의 분자 서명과 종양 부담의 시간적 변화 사이의 상관관계를 밝혀냈다.
CRC-EV 수치는 수술 직후 모든 환자에서 떨어졌다.
단기 재발이 없는 환자의 경우 CRC-EV 수준은 시간이 지남에 따라 계속 감소한 반면, 재발 환자의 경우 CRC-EV 수준은 종양 진행과 함께 반등하였다.
초기 EV 부담이 단기(5년) 종양 재발의 예측 위험 요소가 될 수 있음을 추가로 관찰하였다.
결합하여 이러한 결과는 진단뿐만 아니라 치료 모니터링 및 예후를 위한 CRC 바이오마커로서의 EV의 잠재력을 넓힐 것이다.
그러나 현재 작업의 몇 가지 제한 사항은 향후 연구에서 해결해야 한다.
조직과 순환 EV 간의 비교는 3개의 마커(EpCAM, EGFR 및 CD24)에 대해 수행되었으며 면역조직화학 최적화를 위한 조직의 양이 부족하여 제한되었다.
두 마커(예: CD133 및 GPA33)와 샘플 수를 확장하면 종양 세포를 대표하는 CRC 유래 EV의 존재가 확고하게 확립될 것이다.
특히 치료 모니터링을 위한 직렬 EV 추적은 또한 강력한 통계를 얻기 위해 현재 연구보다 더 빈번한 샘플링과 더 큰 전향적 코호트를 필요로 한다.
환자 클래스의 경우, 치료 중 EV 변화를 모니터링하는 데 관심이 있었기 때문에 확립된 질병이 있는 절제 가능한 환자를 등록하였다.
변함없이, 많은 환자들이 Ⅱ기와 Ⅲ기에 있었고 소수만이 I기에 있었다.
향후 연구에서는 CRC 선별 도구에 패널을 적용하는 것이 흥미로울 수 있다.
추가 분자 마커(예: KRAS(G12D), KRAS(G13D), KRAS(G12V), BRAF(V600E), MLH1, MSH3, MSH6 및 IGF2)를 이러한 목적으로 테스트할 수 있다고 판단된다.
앞으로 우리는 현재 연구를 다음으로 확장할 계획이다.
그 영향력을 확대한다.
첫째, EV 기반 CRC 진단을 추가로 검증하기 위해 CRC 환자와 대조군 모두 연구 코호트를 확대할 수 있다.
여러 기관에서 CRC 환자의 샘플을 수집하면 인종 및 지리적 다양성을 설명할 수 있다.
잠재적으로 혼동을 일으킬 수 있는 장 증상(예: 과민성 대장 증후군 또는 크론병)이 있는 비 CRC 환자를 포함하여 EV 바이오마커 및 해당 컷오프를 개선하는 데 도움이 될 것이다.
처리량과 낮은 장비 비용으로 HiMEX는 표준 실험실 설정에서도 이러한 샘플 볼륨을 신속하게 처리한다.
둘째, 기존 이미징을 보완하기 위해 다양한 CRC 단계를 구별하는 EV 테스트를 설계할 수 있다.
개선된 비침습적 CRC 병기결정 및 분자 프로파일링은 (1) 보조 화학요법보다는 선행 보조 요법에 대한 환자를 선택하는 강력한 도구가 될 것이며, (2) 재발 위험이 높은 그룹을 식별할 수 있게 하며,(3) 표적 임상 시험을 위해 환자를 선택한다.
이러한 분류 능력을 달성하려면 현재 연구보다 각 CRC 단계에서 더 많은 수의 환자가 필요하다.
세째, 다양한 임상 관련 정보를 얻기 위해 EV 스크리닝을 확대할 수 있다.
예를 들어, 종양 유래 EV는 인테그린의 독특한 패턴을 나타내는 것으로 나타났다.
이러한 EV는 전이 전 틈새를 준비하는 장기 특정 방식으로 상주 세포에 의해 채택될 수 있다.
다른 사람들은 화학 요법이 전이 가능성이 있는 EV를 방출하기 위해 원발성 종양을 추가로 유발할 수 있다고 가정하였다.
종양 특정 EV를 강화하는 HiMEX의 능력은 이러한 EV 하위 집단의 탐지를 촉진하여 전이를 이해, 모니터링 및 예측하는 데 도움이 될 것이다.
<방법>
<임상 샘플 수집(Collecting clinical samples)>
본 발명은 모든 임상 샘플을 수집한 경북대학교 의료원(원장: J.S.P.)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았다.
이후의 절차는 기관 지침에 따랐다.
모든 피험자로부터 사전 동의를 얻었다.
말초 혈액(~15ml)을 환자에게서 채취하고 400g에서 15분 동안 원심분리하여 혈장을 적혈구 및 담황색에서 분리하였다.
각 마커를 분석하기 위해 20㎕의 혈장을 사용하였다.
<HiMEX 시스템 구축>
HiMEX 장치는, 마이크로컨트롤러(ATSAMD21G18, Atmel Corporation)와, 디지털-아날로그 변환기(DAC8552, Texas Instruments)와, 아날로그-디지털 컨버터(AD7490, Analog Devices)와, 멀티플렉서(ADG708, Analog Devices)와, 96개의 전위차계(ptentiostats)로 구성된다.
각 potentiostat에는 2개의 연산 증폭기(AD8606, Analog장치)를 구비한다.
즉, 하나의 증폭기는 워킹 전극과 기준 전극 사이의 전위차를 유지했으며, 다른 하나는 전류를 전압 신호로 변환하는 트랜스임피던스(transimpedance) 증폭기로 기능하였다.
트랜스임피던스 증폭기의 전류 측정 범위는 ±7.5㎂이고, 12×8 전극 어레이(96×220, DropSens)를 사용하였다.
<분석 시약 제조>
첫 번째 단계는 면역 자성 비드를 생산하는 것이었다.
실온에서 10분 동안, 에폭시기가 있는 자기 비드 5mg(예: 14302D, Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen)을 0.1M 인산나트륨(soduim phosphate) 용액 1㎖에 현탁하였다(suspend).
자기 비드(magnetic beads)를 영구 자석으로 용액에서 분리하고 동일한 용액 100㎕에 재현탁하였다.
그런 다음 CD63, CD9 또는 CD81에 대한 항체 100㎍(참조 자세한 내용은 보충 표 1)을 추가하고 철저히 혼합하였다.
다음으로, 100㎕ 황산암모늄 용액(3M)을 첨가하고, 전체 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 느린 기울기 회전(slow tilt rotation)으로 4℃에서 밤새(overnight) 배양하였다.
비드를 PBS로 2회 세척하고 최종적으로 1% 소혈청 알부민(BSA, bovine serum albumin)이 포함된 2㎖의 PBS에 재현탁시켰다.
두 번째 단계는 항체에 라벨을 붙이는 것이었다.
PBS 중 10mM 설포(sulfo)-NHS-비오틴(biotin)(A39257, Pierce) 용액을 실온에서 2시간 동안 항체와 함께 인큐베이션(배양)하였다.
미반응 Sulfo-NHS-Biotin은 Zeba 스핀 탈염 컬럼(column), 7K MWCO(89882, Thermo Scientific)를 사용하여 제거하였다.
Biotinylated 항체는 사용할 때까지 4℃에서 보관되었다.
<HiMEX 분석>
우리는 15분 동안 면역 자기 비드 용액 50㎕로, EV 샘플(EV 스파이크(spiked) PBS 10㎕ 또는 혈장 20㎕)을 혼합하였다.
그런 다음 영구 자석으로 그것들을 수집하여 비드를 세척하고 상층액(supernatant)을 버리고 새로운 완충액(1% BSA가 포함된 PBS 50㎕)을 추가하였다.
그런 다음, 10㎕의 관심 바이오틴화된 항체(PBS 중 20㎍㎖-1)를 첨가하고 혼합물을 15분 동안 인큐베이션하였다.
우리는 위에서 설명한 대로 비드를 분리하고 세척하고 streptavidin-conjugated HRP 효소(21130, Pierce, PBS에 1:100 희석, 21℃에서 15분) 5㎕를 추가하였다.
비드를 분리하고 세척하고 최종적으로 7㎕의 PBS에 현탁시켰다.
신호를 생성하기 위해 준비된 비드 용액과 20㎕의 UltraTMB 용액(34028, ThermoFisher Scientific)을 스크린 인쇄된 전극 위에 로드하였다.
3분 후, 크로노암페로메트리(chronoamperometry) 측정이 시작되었다.
50초와 55초 사이의 전류 레벨을 평균화하였다.
총 분석 시간은 약 1시간이었다.
모든 분석 단계는 21℃에서 수행되었다.
<EV 캡처(capture)>
EV 캡처 항체(항-CD63, 항-CD9 또는 항-CD81)는 회전하면서 4℃에서 밤새(overnight) 배양하여 비드 100㎕에 총 항체 10㎍의 비율로 자기 비드에 결합한다.
비드를 500㎕의 PBST 완충액(PBS + 0.001% Tween 20)으로 3회 세척하고 동일한 완충액 100㎕에 재현탁하였다.
EV는, 이전에 설명한 바와 같이, OptiPrep density gradient ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리)에 의해 분리되었다.
최종 펠렛(pellet)을 PBS 100㎕에 재현탁시켰다.
수집된 EV(5㎕, 5 × 109 vesicles ㎖-1)를 항체 코팅 비드 25㎕와 혼합한 다음 PBST 170㎕를 첨가하고 4℃에서 회전하면서 배양하였다.
풀다운된 EV가 있는 비드를 수집하고 500㎕ PBST로 3회 세척하였다.
통과 흐름(flow-through)은 Amicon Ultra 10-kDa 필터(UFC501096, Millipore Sigma)를 사용하여 50㎕로 농축되었다.
웨스턴 블롯팅을 위해 샘플을 비환원성 LDS 샘플 완충액으로 용해하고 95℃에서 5분 동안 끓인 다음 겔(gel)에 로딩하였다.
단백질은 SDS-PAGE로 분리되어 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겨지고 다음 항체로 면역 염색되었다. 즉, 다음 항체는, 항-CD63(클론 H5C6, BD Biosciences, 1:200 희석); 항-CD9(클론 D8O1A, 세포 신호, 1:1,000 희석); 및 항-CD81(클론 1.3.3.22, Thermo Fisher, 1:500 희석)로 면역 염색(immunostained)되었다.
HRP 접합 이차 항체를 추가한 다음에, 화학 발광 기재(WesternBright Sirius, Advansta)을 추가하고 자동 방사선 필름을 사용하여 블롯(blot)을 현상하였다(그림 2b 및 보충 그림 22).
필름을 디지털화하고 ImageJ를 사용하여 신호 강도의 정량화를 수행하였다.
<ELISA(엘리사)>
CD63 항체(Ancell) 및 IgG1 항체(Ancell)를 PBS( 5㎍㎖-1)에 희석하고 Maxisorp 96웰 플레이트(Nunc)로 옮겨 4℃에서 밤새 배양하였다.
PBS로 세척한 후, PBS 차단 용액 중 2% BSA를 플레이트에 첨가하였다(실온에서 1시간 인큐베이션).
이어서, EV 샘플(100㎕ PBS 에서)을 실온에서 1시간 배양 동안 각 웰에 첨가하였다.
차단 용액을 버리고 다양한 마커에 대한 항체(1 ㎍㎖-1)를 각 웰에 삽입하고 실온에서 추가 1시간 동안 배양하였다.
결합되지 않은 항체를 PBS로 삼중 세척하였다.
그런 다음 Streptavidin-HRP 분자를 각 웰에 첨가하고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
PBS로 세척한 후, 화학발광 신호를 플레이트 판독기(Tecan)로 측정하였다.
<유세포 분석(Flow cytometry)>
마커당 약 106개의 세포가 유세포 분석 실험에 사용되었다.
세포를 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 PBS(0.5% BSA)로 세척하였다.
다음으로, 세포를 BSA(PBS 중 0.5%)로 차단하고 1차 항체(4 ㎍㎖-1)와 함께 인큐베이션하였다.
표지된 세포를 세척하고 형광단이 결합된 2차 항체(2 ㎍㎖-1; Abcam)와 함께 배양한 후 다시 세척하였다.
대조군 샘플은 isotype-matched IgG 및 이차 항체를 사용하여 유사하게 표지되었다.
배경 추정기로 세포의 분취량을 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다.
블로킹 및 항체(1차 및 2차)를 사용한 인큐베이션을 실온에서 각각 30분 동안 수행하였다.
모든 세척 단계는 PBS(0.5% BSA)를 사용하여 300g에서 5분간 3회 세척하는 것으로 구성되었다.
표지된 세포의 형광 신호는 BD LSRII Flow Cytometer(BD Biosciences)를 사용하여 측정되었다.
평균 형광 강도(MFI)는 세 가지 유형의 샘플(즉, 표적화(target), IgG 및 2차 전용(secondary-only))에서 얻었다.
표적 마커의 발현 수준은 (MFItarget- MFIIgG)/MFIsecondary로 구하였다.
게이팅(gating) 정보는 보충 그림 23에 나와 있다.
<세포 배양(cell culture)>
CRC 세포주(cell line)의 패널을 구입(ATCC)하고 다음 공급업체 권장 매체(vendor-recommended medium)에서 성장했다: 즉, DLD-1(RPMI-1640, Cellgro); HT29(2% NaHCO3로 변형된 MacCoy's 5a, Cellgro); HCT116(MacCoy's 5a, Cellgro); Colo201(1% 피루브산나트륨으로 변형된 RPMI-1640, Cellgro); SW480 및 SW620(DMEM, Cellgro); CCD-18Co(Eagle's MEM, Cellgro); CCD-112Con(Eagle's MEM, Cellgro); CCD-33Co (Eagle의 MEM, Cellgro)의 미디엄(배지)으로 성장했다.
모든 배지는 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신(Cellgro)으로 보충되었다.
모든 세포주를 테스트하고 마이코플라스마(mycoplasma) 오염이 없는 것으로 결정하였다(MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, Lonza, LT07-418).
<세포 배양에서 EV 분리(Isolating EVs from cell culture)>
스파이크 인 실험을 위해 세포 배양에서 순수한 EV를 준비하였다.
passage 1-15의 세포는 (FBS가 5% 소모된 상태에서) 48시간 동안에 소포 고갈 배지(medium)에서 배양되었다.
대략 107개 세포로부터 조절된 배지를 수집하고 300g(5분)에서 원심분리하였다.
상층액을 0.2㎛ 멤브레인 필터(Millipore)를 통해 여과하고 100,000g(1h)에서 원심분리하여 농축시켰다.
상층액을 제거한 후, EV 펠렛을 PBS로 세척하고 100,000g(EV)에서 원심분리하였다.
수집된 EV를 PBS에 재현탁하고 4℃에서 보관하였다.
원액 샘플의 경우 나노입자 추적 분석(NTA)을 통해 EV 농도를 추정하였다.
<면역조직화학(Immunohistochemistry)>
CRC 환자의 종양 및 비종양 조직 절편에 면역조직화학 염색을 실시하였다(그림 3a 및 보충 그림 24).
EGFR(EGFR1, Abcam, 1:50 dilution), EpCAM(VU-1D9, Abcam, 1:100 dilution) 및 CD24(eBioSN3, ebioscience, 1:100 dilution)에 대한 1차 단일클론항체를 사용하였고, 제조업체의 권장 사항에 따른 Ventana BenchMark XT 자동 슬라이드 염색기(Ventana Medical Systems)를 통해 염색을 수행하였다.
스테인드 이미지(Stained image)는 임상 병리학적 변수 및 EV 프로파일링 결과에 대해 눈이 멀었던 병리학자(G.Y.)가 전체 암세포 중 양성 세포의 비율을 기준으로 점수를 매겼다.
양성 세포는 양성으로 염색된 세포질 또는 비 신생물 조직(non-neoplastic tissues)에서 동시 음성 표지(labelling)에 직면하여 암세포 내의 막 패턴(membranous pattern)으로 정의되었다.
마커 발현은 0(음수)에서 1(양성)까지 0.1의 증가로 순위가 매겨졌다.
이 수준은 EV 프로파일링 결과와 함께 Spearman의 순위 테스트에서 서수 변수(ordinal variable)로 사용되었다.
<종양 재발 상태 결정(Tumour recurrence status determination)>
재발은 시간이 지남에 따라 크기가 증가하는 병변의 외과적 절제 또는 방사선학적 검출에 의해 병리학적으로 진단되었다.
방사선과 전문의와 병리학자는 방사선 영상과 병리학적 표본을 독립적으로 평가했다.
국소 재발은 골반강 또는 회음부 내부의 모든 재발로 정의되었다.
전신 재발은 골반강 외부의 모든 재발로 정의되었다.
<EV mRNA 분석(EV mRNA analyses)>
공급업체에서 권장하는 대로 약 3㎖의 환자 혈장 샘플을 사용했다.
환자 혈장의 EV는 자기 비드에 캡처되었고 RNA는 exoRNeasy Serum/Plasma Starter 키트(77023, Qiagen)를 사용하여 분리되었다.
라이브러리는 제조업체의 지침(Human Molecular Toxicology Transcriptome, Qiagen)에 따라 QIAseq Targeted RNA 패널로 준비되었다.
라이브러리는 Qubit dsDNA HS Assay 키트(Q32850, ThermoFisher Scientific) 및 QIAseq 라이브러리 Quant Assay 키트를 사용하고, 라이브러리 크기는 Agilent 2100 Bioanalyzer(고감도 DNA 분석 키트, Agilent Technologies)를 사용하여 결정하였다.
준비된 라이브러리를 풀링하고(각 라이브러리에 대해 4nM), 풀링된 혼합물(6.5pM)을 Illumina MiSeq(MiSeq Reagent Kit v2, Illumina)에서 실행하였다.
데이터는 R 버전 3.6.1의 DESeq2 패키지를 사용하여 분석되었다.
<단일 EV 이미징(Single EV imaging)>
CRC 세포주(SW480, HT29; 108 vesicles ㎖-1)의 EV를 유리 슬라이드(63429-04, Electron Microscopy Science)에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
용액을 종이 타월로 배수한 후 EV 고정을 위해 실온에서 4% 파라포름알데히드 용액(AAJ19943K2, Thermo Scientific)에서 15분 동안 인큐베이션하였다.
슬라이드를 PBS로 두 번 세척하였다.
Perm/Wash 버퍼(554723, BD Science)를 EV 투과성을 위해 첨가하고 슬라이드를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
PBS로 5회 세척한 후 슬라이드를 PBS 중 2% BSA로 30분 동안 차단하였다.
그런 다음 10㎕의 AF647(1434, Click Chemistry Tools)-표지된 항-CD63(215-020, Ancell), CD9(555675, BD science) 또는 CD81(555370, BD Science) 항체(1%의 BSA를 함유한 10 ㎍㎖-1 PBS )는 4℃에서 밤새 EV 라벨링을 위해 추가되었다.
PBS에서 세 번 세척한 후 슬라이드를 커버 슬립으로 덮고 EV를 BX63 형광 현미경(Olympus)으로 이미지화했다.
<초기 마커를 선택하기 위한 생물정보학 알고리즘(Bioinformatic algorithm for selecting initial markers)>
Human Protein Atlas 포털에서 CRC 및 정상 조직에 대한 면역조직화학 데이터를 다운로드하였다.
염색 정도(높음, 3, 중간, 2, 낮음, 1, 미검출, 0)에 숫자 값을 할당하고 각 단백질에 대한 평균 염색 값을 얻었다.
각 조직 유형(즉, CRC 및 정상)에 대해 이러한 값은 정규화된 z-점수였다.
그런 다음 마커는 차등 z-점수(CRC-정상)에 따라 순위가 매겨졌다.
이 목록은 특정 세포 도메인(예: 막횡단)에서 단백질을 선택하기 위해 UniProt을 상호 참조하여 좁혀졌다.
우리는 EV 데이터베이스를 사용하여 목록을 추가로 필터링하여 EV에서 발견된 것으로 보고된 마커를 수집하였다.
사용자 지정 스크립트를 사용하여 R에서 분석을 수행하였다.
<통계 분석(Statistical analyses)>
통계 분석은 Stata 버전 12.1(StataCorp LP), GraphPad Prism 버전 8.0(GraphPad Software Inc.) 또는 R 버전 3.6.1을 사용하여 수행되었다.
모든 통계적 테스트에서 P 값 <0.05는 유의미한 것으로 간주되었다.
CRC 감지를 위한 마커 선택(Marker selection for CRC detection)
최소 절대 수축 및 선택 연산자(Lasso) 회귀를 적용하여 EV 프로파일링 데이터(그림 Sa)에서 후보 예측 마커를 선택하였다.
건강한 혈장 샘플의 EV 데이터로 비 CRC 대조군을 보강하였다.
교차 검증 오류를 계산하고 교차 검증 오류를 최소화하는 조정 매개변수(λ)를 결정하였다.
우리는 R에서 glmnet 패키지를 사용하였다.
CRC 진단(CRC diagnosis)
CRC 사례를 예측하기 위해 개별적으로 또는 조합하여 선택된 단백질 마커의 능력을 평가하기 위해 훈련 코호트(n=83)를 사용하여 ROC 분석을 수행하였다.
고려 중인 특정 개별 바이오마커는 EGFR, EpCAM, CD24, GPA33 및 CD133이었다.
또한, 2개 마커(EGFR + CD24, EGFR + EpCAM 및 EpCAM + CD24), 3개의 마커(EGFR + EpCAM + CD24), 4개 마커 조합(EGFR + EpCAM + CD24 + GPA33 및 EGFR + EpCAM + CD24 + CD133), 및 5개 마커 조합(EGFR + EpCAM + CD24 + GPA33 + CD133)의 선형 조합을 고려하였다.
각 바이오마커 조합에 대해 최적의 가중치는 로지스틱 회귀를 통해 결정되었다.
본 발명에서는 ROC 곡선을 구성하고 민감도와 특이도의 합을 최대화하는 수준 컷오프 값을 결정하였다.
표준 공식을 사용하여 민감도(진양성 비율), 특이성(진음성 비율) 및 정확도[(진양성+진음성)/(양성+음성)]를 정의하였다.
AUC는 Delong의 방법에 따라 비교되었다.
다음으로 선택된 컷오프 값을 사용하여 예상 코호트(n=48)를 분석하고 각 바이오마커와 바이오마커 조합의 분류 성능을 결정하였다.
감도(sensitivity), 특이도(specificity) 및 정확도(accuracy)에 대해 정확한 95% 신뢰 구간으로 추정했다.
R의 pROC 패키지를 사용하여 분석을 수행하였다.
<생존 분석(survival analyses)>
본 발명에서 최대 61개월 동안 근치적 수술을 받은 CRC 환자 90명을 모니터링하였다.
DFS는 수술과 CRC로 인한 첫 번째 방사선학적 재발 또는 사망 사이의 간격으로 정의되었다.
Kaplan-Meier 방법을 사용하여 EVCRC 또는 CEA 수준으로 계층화된 생존 함수를 계산하였다.
환자 분류를 위해 선택된 EVCRC 컷오프 값은 두 분류 그룹 간의 절대 로그 순위 점수 통계를 최대화한 값이었다. 즉, 선택한 EVCRC 컷오프 값 위 대 아래 두 그룹에 대한 해당 생존 곡선을 비교하기 위한 P 값은 최대로 선택된 순위 통계의 널(null) 분포를 근사화하기 위해 10,000번의 복제가 있는 조건부 몬테카를로 시뮬레이션을 사용하여 얻었다.
로그 순위 테스트는 기존 CEA 컷포인트에서 생존 곡선을 비교하는 데 사용되었다.
R의 maxstat 및 생존 패키지를 사용하여 분석을 수행하였다.
<보고 요약(Reporting Summary)>
연구 설계에 대한 추가 정보는 이 기사에 링크된 Nature Research 보고 요약에서 확인할 수 있다.
<데이터 가용성(Data availability)>
본 연구의 결과를 뒷받침하는 주요 데이터는 논문 및 보충 정보에서 사용할 수 있다.
연구 기간 동안 생성 및 분석된 원시 환자 데이터 세트는 합리적인 요청이 있을 경우 교신저자에게 제공되며, 경북대학교병원 기관심사위원회의 승인을 받는다.
초기 마커 선택을 위해 공개 데이터베이스 Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org) 및 UniProt(https://www.uniprot.org)를 사용하였다. 소스 데이터는 이 논문과 함께 제공된다.
<코드 가용성(Code availability)>
마커 선택을 위한 소스 코드는 https://csb.mgh.harvard.edu/bme_software에서 사용할 수 있다.
기한 바와 같은, 본 발명의 실시예들에서 설명한 기술적 사상들은 각각 독립적으로 실시될 수 있으며, 서로 조합되어 실시될 수 있다. 또한, 본 발명은 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 실시예를 통하여 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다. 따라서, 본 발명의 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (17)

  1. 표적 분석물 결합 자기 비드가 로드되는 복수의 전극 어레이;
    상기 전극 어레이의 전극들 각각에 전기적으로 커플링되는 정전위기;
    상기 정전위기의 입력에 전기적으로 커플링되어 디지털 신호를 아날로그 신호로 변환하는 DAC;
    상기 정전위기의 출력에 전기적으로 커플링되어 상기 정전위기의 전압 신호를 디지털 신호로 변환하는 ADC; 및
    상기 DAC에 전기적으로 커플링되어 상기 DAC를 통해 정전위기로 제어명령을 전송하거나 상기 ADC에 전기적으로 커플링되어 상기 ADC로부터 전송된 디지털 신호를 통해 표적 분석물을 판단하는 마이크로 컨트롤러;를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 전극 어레이의 각 전극은 워킹 전극, 카운터 전극 및 기준 전극의 3개의 개별전극으로 구성되는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  3. 제1항어서,
    상기 복수의 전극 어레이의 각 전극은, 상기 정전기와 푸시 핀(push-pin connectors)로 연결되고, 상기 자기 비드를 집중시키기 위해 내장 자석 위에 배치되는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 정전위기는, 워킹 전극에 전기적으로 커플링되고 상기 워킹 전극과 기준 전극 사이에 미리 정의된 전위차를 유지하는 제1 연산 증폭기와,
    상기 기준전극 및 카운터 전극에 전기적으로 커플링되고 상기 워킹 전극으로부터 카운터 전극을 가로지르는 유도된 전류를 전압 신호로 변환하는 트랜스임피던스 증폭기로 구성된 제2 연산 증폭기를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 ADC의 전단에 형성되어 상기 정전위기로부터 출력을 상기 ADC의 입력에 전기적 커플링시에 다수의 입력에서 선택되게 하는 멀티플렉서를 더 포함하고,
    상기 마이크로 컨트롤러는 상기 멀티플렉서와 해당 입력 선택 개수의 ADC를 구성하여 각 전극에 순차적으로 액세스(access)하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분석물은 대장암 세포외 소포(CRC-EV)인 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포외 소포는 혈장으로부터 스파이킹(spiking)한 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 대장암 진단 바이오 마커는 CD44, B7-H3, EGFR, ABCG2, GPA33, EpCAM, HER2, MUC1, MET, CD44v6, CD24, CD166, STEAP1 및 ALDH1, MRP1, MDR1, TS 및 CD133 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 대장암 진단 바이오 마커는, EGFR, EpCAM, CD24 및 GPA33의 조합으로 구성하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 마이크로 컨트롤러는,
    ROC 곡선에서 민감도와 특이도의 합을 최대화하는 컷오프 값을 결정하고,
    상기 결정된 컷오프 값을 EVCRC 점수로 정의하여,
    정의된 EVCRC 점수를 토대로 하여 대장암 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치.
  11. (a) 복수의 자기 비드에 표적 분석물을 결합하고 복수회의 세척 후 반응성 효소에 결합되게 하며, 전자 매개체 용액과 화합시켜 복수의 전극 어레이에 표적 분석물 결합 자기 비드가 로드되는 단계;
    (b) 상기 복수의 전극 어레이를 정전위기에 전기적으로 커플링되게 하여 상기 표적 분석물 결합 자기 비드를 자기장에 노출시키는 단계;
    (c) 상기 표적 분석물 결합 자기 비드 내의 전자 매개체들과 상기 반응성 효소간의 산화-환원 반응을 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 정전위기의 출력 결과를 통해 표적 분석물을 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 반응성 효소는 HRP를 포함하고, 상기 전자 매개체는 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    (d) 단계에서, 상기 표적 분석물은 대장암 세포외 소포(CRC-EV)인 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 세포외 소포는 혈장으로부터 스파이킹(spiking)한 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 대장암 진단 바이오 마커는 CD44, B7-H3, EGFR, ABCG2, GPA33, EpCAM, HER2, MUC1, MET, CD44v6, CD24, CD166, STEAP1 및 ALDH1, MRP1, MDR1, TS 및 CD133 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 대장암 진단 바이오 마커는, EGFR, EpCAM, CD24 및 GPA33의 조합으로 구성하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    ROC 곡선에서 민감도와 특이도의 합을 최대화하는 컷오프 값을 결정하고,
    상기 결정된 컷오프 값을 EVCRC 점수로 정의하여,
    정의된 EVCRC 점수를 토대로 하여 대장암 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 자기 전기화학 장치를 이용한 진단 방법.
KR1020210100019A 2021-07-29 2021-07-29 대장암 진단용 통합 자기 전기화학장치 및 그 방법 KR20230018174A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210100019A KR20230018174A (ko) 2021-07-29 2021-07-29 대장암 진단용 통합 자기 전기화학장치 및 그 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210100019A KR20230018174A (ko) 2021-07-29 2021-07-29 대장암 진단용 통합 자기 전기화학장치 및 그 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230018174A true KR20230018174A (ko) 2023-02-07

Family

ID=85221148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210100019A KR20230018174A (ko) 2021-07-29 2021-07-29 대장암 진단용 통합 자기 전기화학장치 및 그 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230018174A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140050465A (ko) 2012-10-19 2014-04-29 포항공과대학교 산학협력단 다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140050465A (ko) 2012-10-19 2014-04-29 포항공과대학교 산학협력단 다공성 중합체 모노리드 필터를 포함하는 체액으로부터 세포밖 소포를 분리하기 위한 장치

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Park et al. An integrated magneto-electrochemical device for the rapid profiling of tumour extracellular vesicles from blood plasma
Sharma et al. Prostate cancer diagnostics: Clinical challenges and the ongoing need for disruptive and effective diagnostic tools
Chatterjee et al. Cancer biomarkers: knowing the present and predicting the future
Brennan et al. Antibody-based proteomics: fast-tracking molecular diagnostics in oncology
Wang et al. Comparative study of autoantibody responses between lung adenocarcinoma and benign pulmonary nodules
Pan et al. Unique distribution of programmed death ligand 1 (PD-L1) expression in East Asian non-small cell lung cancer
Dhondt et al. Urinary extracellular vesicle biomarkers in urological cancers: From discovery towards clinical implementation
Wu et al. Enrichment and enumeration of circulating tumor cells by efficient depletion of leukocyte fractions
Journe et al. TYRP1 mRNA expression in melanoma metastases correlates with clinical outcome
US20120309018A1 (en) Cancer detection markers
WO2010065968A1 (en) Cancer detection markers
Shan et al. A cancer/testis antigen microarray to screen autoantibody biomarkers of non-small cell lung cancer
Pértega‐Gomes et al. Monocarboxylate transporter 2 (MCT2) as putative biomarker in prostate cancer
Roe et al. Mesothelin-related predictive and prognostic factors in malignant mesothelioma: a nested case–control study
Lim et al. Evaluation of two high-throughput proteomic technologies for plasma biomarker discovery in immunotherapy-treated melanoma patients
Zheng et al. The combination of CTCs and CEA can help guide the management of patients with SPNs suspected of being lung cancer
Prensner et al. Systematic, evidence-based discovery of biomarkers at the NCI
Søreide et al. Assessment of clinically related outcomes and biomarker analysis for translational integration in colorectal cancer (ACROBATICC): study protocol for a population-based, consecutive cohort of surgically treated colorectal cancers and resected colorectal liver metastasis
US20140072987A1 (en) Methods of detecing bladder cancer
Chan et al. Prostate cancer detection: A systematic review of urinary biosensors
Kilic et al. Multielectrode spectroscopy enables rapid and sensitive molecular profiling of extracellular vesicles
Sun et al. The advantage of circulating tumor cells over serum carcinoembryonic antigen for predicting treatment responses in rectal cancer
Abalde‐Cela et al. Multiplexing liquid biopsy with surface‐enhanced Raman scattering spectroscopy
KR102208140B1 (ko) 전립선암의 바이오마커 검출에서 사용하기 위한 방법 및 어레이
Liedberg et al. Tissue microarray based analysis of prognostic markers in invasive bladder cancer: much effort to no avail?

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal