KR20230015327A - 항-ox40 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 이의 제조 방법 및 OX40-관련된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 용도를 제공한다.

Description

항-OX40 항체 및 이의 용도
본 출원은 2020년 4월 17일자로 출원된 제CN 202010304381.8호를 기반으로 하며 이에 대한 우선권을 주장하고, 이는 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 항체, 특히 항-OX40 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 항체를 제조하는 방법 및 OX40-관련 질환 또는 상태(condition)를 치료 또는 예방하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
OX40(또한 CD134, TNFRSF4 및 ACT35로서 지칭됨)은 종양-괴사 인자 상과(tumor-necrosis factor superfamily)의 구성원이며, 이는 주로 활성화된 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 조절성 T 세포의 표면, 및 천연 킬러 세포(natural killer cell; NK 세포)의 표면에서 발현된다. 활성화된 T 세포에서, OX40L-OX40에 의해 매개된 공자극성 신호는 헬퍼(helper) T 세포를 자극하여 사이토킨을 생산 및 분비하고, 효과기(effector) T 세포를 자극하여 그랜자임 및 페르포린을 방출하고, 효과기 T 세포 및 기억 T 세포가 증식하도록 한다. 동시에, OX40L-OX40 신호는 또한 조절성 T 세포의 분화 및 활성을 억제할 수 있고 조절성 T 세포의 면역억제 기능을 감소시킴으로써, 면역반응을 추가로 향상시킨다. T-세포 면역 반응에서 OX40의 중요한 역할은 OX40 효능제(agonist)가 종양 면역치료요법을 위한 중요한 후보물이 되도록 하는 것이지만, OX40 억제제는 염증(inflammation), 알레르기 질환(allergic disease) 및 자가면역 질환(autoimmune disease)에서 잠재적인 적용 값을 갖는다.
최근 수년 내에, 모노클로날 항체(monoclonal antibody)에 대한 제조 기술의 광범위한 적용으로, OX40에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 예를 들면, 2개의 범주, 즉, OX40 효능제 및 OX40 억제제가 등장하였다. 생리학적 조건 하에서, OX40은 이의 리간드 OX40에 대한 결합 및 삼량체화(trimerization)에 의해 세포 내에서 상응하는 신호전달 경로(signaling pathway)를 활성화시킨다. 따라서, OX40 효능제 모노클로날 항체는 항상 효능제 항체로서 작용하기 위한 가교-결합을 필요로 한다. 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 조건 하에서, 항체 가교-결합은 고체 표면 상의 코팅에 의해 또는 Fc 수용체에 의해 각각 달성될 수 있다. Fc 수용체는 항체의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 수용체의 계열이다. 특히, Fcγ 수용체는 IgG에 특이적으로 결합하여 ADCC 및 ADCP와 같은 기능을 발휘한다. Fcγ 수용체는 주로 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB 등을 포함하고, 이는 다양한 혈액 세포, 예를 들면, B 림프구, 수지상 세포, 천연 킬러 세포, 대식구, 호중구, 호산성 과립구, 호염기성 과립구, 비만 세포, 혈소판 등의 표면에서 발현된다. 생리학적 조건 하에서, Fcγ 수용체는 하나 이상의 IgG 분자의 Fc 단편에 동시 결합하여, 리포터-매개된 기능을 활성화시키면서 IgG 분자의 가교-결합을 달성할 수 있다. OX40 효능제 항체는 Fcγ 수용체에 결합하여 가교-결합함으로써 OX40 분자를 활성화시킬 수 있다. OX40 길항제(antagonist) 항체는 OX40에 대한 OX40L의 결합을 차단할 수 있고, OX40의 삼량체화를 예방함으로써 OX40 활성화-유도된 T 세포 활성화 및 관련된 염증 반응을 억제할 수 있다.
종양 세포는 다수의 메카니즘을 통해 면역계의 인식 및 공격을 피함으로써 면역회피(immune escape)를 달성하고, 체 내에서 생존하여 과도하게 증식할 수 있다. 종양 면역 회피를 매개하는 중요한 메카니즘은 면역 세포 또는 종양 미세환경내 종양 세포 내에서 고도로 발현되는 면역 체크포인트(immune checkpoint)로서 명명된 공자극성 분자(costimulatory molecule)에 의한다. 면역 체크포인트는 이의 기능을 기반으로 PD-1, PD-L1, CTLA-4 등으로 나타낸 억제성 면역 체크포인트; 및 OX40 및 4-1BB로 나타낸, 활성화 면역 체크포인트로 나누어질 수 있다. 억제성 면역 체크포인트의 경우, 항체와 같은 약물을 사용하여 이의 억제성 기능을 차단할 수 있으며, 이는 면역 세포 상에서 브레이크(brake)를 유사하게 방출하여, 면역 세포가 종양 세포를 사멸시키는 이의 역할을 하도록 할 수 있다. PD-1, PD-L1 및 CTLA-4로 나타낸 종양 면역치료요법은 매우 중요한 치료 수단이 되고 있으며 임상 적용시 두드러진 결과를 나타낸다. 브레이크를 방출한 후 가스 페달(gas pedal)에서 걷는 것과 유사하게, 효능성 면역 체크포인트를 활성화시키는 효능제의 사용은 면역 세포의 활성을 추가로 증가시켜, 세포가 종양 세포를 사멸시키는데 보다 효과적이 되도록 하고, 궁극적으로 보다 광범위한 스펙트럼의 종양에서 보다 효과적인 치료학적 효과를 달성하도록 한다.
최근 연구에서 다양한 종양-침윤 T 세포가 OX40을 발현하며, OX40-양성 종양 환자가 비교적 더 긴 생존 시간을 가짐이 밝혀졌으며, 이는 OX40이 종양 면역성에 역할을 담당함을 제시한다. 많은 전임상 동물 모델에서, OX40의 활성화는 자극된 T 세포 증식, 향상된 효과기 T 세포 기능, 및 조절성 T 세포의 기능의 억제를 이끌었다. OX40 효능제(9B12)를 사용하여 전이성 고형 종양(metastatic solid tumor)을 지닌 환자를 치료하는 임상 시험에서, 면역 기능은 암 환자에서 개선되어, 30명의 환자 중 12명에서 적어도 하나의 전이성 병변의 퇴행이 관찰되었고, OX40 항체는 치료된 환자에서 잘 견디어짐이 관찰되었다. 현재, 효능성 OX40 모노클로날 항체(예컨대, MOXR0916, PF-04518600, BMS 986178, GSK3174998, MEDI0562, MEDI6469, 및 MEDI6383)가 단독치료요법으로서 또는 다른 면역조절제와 함께 수개의 임상 시험에서 평가중에 있다.
자가면역 질환은 오늘날 사람이 직면하는 다른 주요한 의학적 과제(challenge)이며, OX40 억제제는 자가면역 질환에 대한 잠재적인 치료인 것으로 예측된다. 전-임상 연구에서, OX40 또는 OX40L 결핍성 마우스는 알레르기성 천식(allergic asthma)의 마우스 동물 모델에서 유의적으로 감소된 Th2 세포 기능을 나타낸다. OX40 억제제는 천식 모델 마우스에서 T 세포 기능의 억제와 관련된 증상을 경감시킬 수 있다. 유사한 결과가 원숭이 생체 내 연구에서 관찰되었다. 또한, OX40-OX40L 신호전달 경로의 차단 후 면역억제 및 증상 경감이 또한 염증 및 자가 면역 질환의 다른 전통적인 모델, 예를 들면, 실험적 알레르기성 뇌척수염 모델(experimental allergic encephalomyelitis model; EAE), 류마티스 관절염 모델(rheumatoid arthritis model; RA) 뿐만 아니라, 대장염(colitis) 모델, 이식체-대-숙주 질환(graft-versus-host disease) 모델, 제I형 당뇨병(type I diabetes) 모델에서 관찰되며, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 중요한 역할을 한다. OX40 길항제 항체와 관련하여, 현재의 임상 시도는 예비 결과를 달성하였다. GRB830은 Glenmark Pharmaceuticals Inc.에 의해 개발된 사람화된 사람 IgG1 모노클로날 항체이며, 이는 OX40의 제2의 시스테인이 풍부한 도메인에 대한 결합에 의해 OX40L에 대한 OX40의 결합을 차단함으로써, OX40L에 의해 유발된 T 세포 활성화를 억제한다. GBR830은 중등도(moderate) 및 중증(severe)의 아토피성 피부염(atopic dermatitis)에 대한 진행중인 임상 시험에서 긍정적인 결과를 입증하였다(제IIa상, NCT 02683928). 또한, Japan Company Kyowa Hakko에 의해 개발된 OX40 길항제 모노클로날 항체 KHK4083은 아토피성 피부염에 대한 제I상 임상 시험에서 양호한 내성 및 효능을 나타내었고, 중등도 및 중증의 아토피성 피부염에 대한 약물(NCT 03703102)의 제II상 임상 시험이 2018년 10월에 개시되었다.
지금까지, 명확한 효능을 지닌 항-OX40 항체도 어떠한 사람 질환의 치료를 위해 승인되지는 않았다. 거대한 임상 요구도를 충족하는 이러한 약물을 추가로 개발하는 것은 매우 중요하다.
발명의 요약
본 발명은 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 이의 제조 및 사용 방법, 예를 들면, OX40-관련된 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region; VH)의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로부터 선택된 1 내지 3개를 포함하는, 단리된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서, VH의 아미노산 서열은 서열 번호: 1, 2, 3, 4 또는 5에 제시된 바와 같다.
일 양태에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역(light chain variable region; VL)의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로부터 선택된 1 내지 3개를 포함하는, 단리된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 VL의 아미노산 서열은 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(VH), 즉, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 3개의 CDR, 및 경쇄 가변 영역(VL), 즉, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 3개의 CDR을 포함하는, 단리된 OX40 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VH의 아미노산 서열은 서열 번호: 1, 2, 3, 4 또는 5에 제시된 바와 같고, VL의 아미노산 서열은 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(VH)의 3개의 CDR, 즉, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 가변 영역(VL)의 3개의 CDR, 즉, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고; 여기서 VH 및 VL은 다음으로부터 선택된다:
(1) 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(2) 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7 또는 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(3) 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL; 또는
(4) 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 7 또는 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일 양태에서, 본 발명은 중쇄 상보성 결정 영역(heavy chain complementary determining region; HCDR), HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 중 1 내지 3를 포함하는 단리된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 경쇄 상보성 결정 영역(light chain complementary determining region; LCDR), LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 중 1 내지 3개를 포함하는, 단리된 항-OX40항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 LCDR1은 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR), HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR), LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR1은 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 LCDR3은 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 1, 2, 3, 4 또는 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2, 3, 4, 또는 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 7, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2, 3, 4 또는 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 7, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린(murine) 항체, 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 사람화된 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 이는 전장 항체(full-length antibody), 단일-도메인 항체(예를 들면, VHH), Fab, Fab', Fab'-SH, (Fab')2, 단일-쇄 항체(예를 들면, scFv), Fv, dAb(도메인 항체) 또는 이중(다중)-특이적 항체(bis(multi)-specific antibody)이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 아미노산 서열은 사람 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역의 서열과 동일하거나 이의 변이체(variant)이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 항체의 CDR 및 FcγR에 결합하는 Fc 영역을 포함하는 항-OX40 항체 효능제를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-OX40 항체 효능제의 Fc 영역의 아미노산 서열은 사람 IgG1 또는 IgG2의 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일하다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 항체의 CDR을 포함하는, 항-OX40 항체 길항제를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-OX40 항체 길항제는 Fc 영역 변이체를 포함하고, 이러한 변이체는 FcγR에 대한 Fc 영역의 결합을 감소시키거나 제거한다. 일부 구현예에서, 항-OX40 항체 길항제는 Fc 영역 변이체를 포함하고, 이러한 변이체는 사람 IgG1 N297A이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은
(1) 중쇄 상보성결정 영역(HCDR), HCDR1, HCDR2 및 HCDR3(여기서 HCDR1은 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다);
(2) 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR), LCDR1, LCDR2 및 LCDR3(여기서 LCDR1은 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다); 및
（3）사람 IgG1 N297A인 Fc 영역 변이체를 포함하는 단리된 항-OX40 항체를 제공한다. 바람직하게는 FcγR에 대한 Fc 영역 변이체의 결합은 감소 또는 제거된다. 구현예에서, 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 전장 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 10 nM 미만의 사람 OX40에 대한 결합 친화도(binding affinity; KD)를 갖는다. 다른 구현예에서, 항체는 OX40 항체 길항제이고 OX40-매개된 신호 형질도입(OX40-mediated signal transduction)을 차단하기 위한 활성을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 단리된 핵산을 제공하고, 이는 본 발명에 의해 제공된 임의의 항체 또는 이의 단편을 암호화(encoding)하고, 여기서 바람직하게는 핵산은 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 하나 이상의 핵산을 포함하는, 재조합 벡터(recombinant vector) 또는 발현 벡터를 제공하고, 여기서 벡터는 본 발명에 의해 제공된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 재조합체 생산에 적합하다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 하나 이상의 핵산, 또는 재조합 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate) 또는 면역 융합체(immune fusion)를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하고, 임의로 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들면, 약제학적 담체 또는 약제학적 부형제(excipient)를 임의로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 OX40-관련된 질환 또는 상태를 치료하기 위한 약물의 제조 시의, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 면역접합체 또는 면역 융합체의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 암을 치료하기 위한 약물의 제조 시의 본 발명의 항-OX40 항체 효능제의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 염증 및/또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약물의 제조 시의 본 발명의 항-OX40 항체 길항제의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체(subject)에게 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 핵산, 벡터, 숙주 세포, 면역접합체 또는 면역 융합체, 또는 본 발명에 의해 제공된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, OX40-관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 여기서 OX40-관련된 질환 또는 상태는 염증 및/또는 자가면역 질환, 예를 들면, 이식체-대-숙주 질환이다. 일부 구현예에서, 여기서 OX40-관련된 질환 또는 상태는 암, 예를 들면, 흑색종, 바람직하게는 전이성 흑색종(metastatic melanoma)이다.
본 발명의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 OX40-관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 다른 치료제 또는 과정과 조합될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용함으로써 샘플에서 OX40을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 OX40-관련된 질환 또는 상태를 진단/검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 구현예의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 구현예 또는 이의 임의의 조합은 본원에 기술된 본 발명의 임의의 및 모든 항-OX40 항체 또는 단편, 방법 및 이의 용도에 적용가능하다.
도 1은 Hu38E11-IgG2 항체가 항-CD3 항체로 활성화된 사람 T 세포에 의한 IFNγ의 분비를 향상시킴을 나타낸다.
도 2는 ELISA에 의해 검출된 바와 같이, OX40L에 대한 OX40의 결합을 차단하기 위한 항체 Hu38E11(IgG1 N297A)의 능력을 나타낸다.
도 3은 ELISA에 의해 검출된 바와 같이, OX40L에 의한 T 세포의 활성화시 항체 Hu38E11(IgG1 N297A)의 차단 효과를 나타낸다.
도 4는 루시퍼라제 리포터 유전자 검정에 의해 측정된 바와 같이, 항체 Hu38E11(IgG1 N297A)의 길항 활성 및 항체 Hu38E11의 효능 활성을 나타낸다.
도 5는 사람 PBMC-유도된 이식체-대-숙주 질환에서 항체 Hu38E11(IgG1 N297A)의 효과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 독특한(unique) CDR 서열을 갖고 사람 OX40에 대한 결합에 대해 높은 친화도(affinity) 및 특이성(specificity)을 갖는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단독으로 또는 질환 또는 상태, 예를 들면, 암, 염증 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 다른 치료요법과 함께 사용될 수 있다.
정의
달리 기술하지 않는 한, 본 발명은 분자 생물학(예를 들면, 재조합 기술), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학에서 통상의 기술을 사용하여 실행될 것이고, 이는 당해 분야의 기술내에 있다.
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 일부 과학적 및 기술적 용어가 다음과 같이 정의된다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학적 및 기술적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 당해 분야의 정의 및 기술을 위해, 구체적인 참고가 문헌: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)에 대해 전문가에 의해 이루어질 수 있다. 아미노산 잔기의 약어는 당해 분야에서 일반적으로 사용된 20개의 L-아미노산 중 어느 하나에 대해 사용된 표준 3-문자 및/또는 1-문자 코드이다. 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형( "a", "an" 및 "the")은 문맥에서 명확하게 달리 명시되지 않는 한, 복수형을 포함한다.
용어 "약"은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 측정된 바와 같은 특수한 값 또는 정수에 대해 허용가능한 오차 범위 내의 값 또는 정수를 의미하고, 이는 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 제한에 부분적으로 의존한다. 예를 들면, "약"은 당해 분야에서 실시 당 1 또는 1 이상의 표준 편차를 지칭할 수 있다. 대안적으로, "약"은 5%, 10% 또는 20% 이하의 범위(즉, ± 5%, ± 10% 또는 ± 20%)를 지칭할 수 있다.
2개 이상의 임의의 항목과 관련하여 사용된 경우, 용어 "및/또는"은 임의의 항목 중 어느 하나 또는 임의의 항목 중 임의의 2개 이상을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하다(comprise" 또는 "include")는 언급된 요소, 정수, 또는 단계를 포함하지만, 임의의 다른요소, 정수, 또는 단계를 배재하지 않음을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하다("comprise" 또는 "include")는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 성분, 정수 또는 단계"로 이루어진"을 포함한다. 예를 들면, 특정 서열을 "포함하는" 항체 가변 영역을 지칭하는 경우, 이는 또한 특정 서열로 이루어진 항체 가변 영역을 포함하는 것으로 의도된다.
본원의 용어 "OX40"는 약 50 KD의 제I형 막관통 당단백질을 지칭하고, 이는 종양 괴사 인자 수용체 상과의 구성원이다. OX40은 또한 ACT35, CD134 또는 TNFRSF4로서 지칭된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 달리 기술하지 않는 한, 임의의 척추동물 공급원, 예를 들면, 포유동물, 예를 들면, 영장류(예컨대, 사람) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 랫트)로부터의 임의의 천연 OX40을 지칭한다. 용어는 "전장(full-length)"의 프로세싱되지 않은 OX40 및 세포 내에서의 프로세싱으로 인하여 OX40의 임의의 형태 또는 이의 임의의 단편을 포함한다. 용어는 또한 OX40의 천연적으로 발생하는 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체(splice variant) 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, OX40은 사람으로부터의 전장 OX40, 또는 이의 단편(예를 들면, 단일 펩타이드를 결여하는 성숙한 단편)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 사람 OX40은 수탁 번호 Uniprot# P43489 하에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열(아미노산 잔기 1 내지 28번은 리더 펩타이드(leader peptide)이다)과 동일한 성숙한 OX40, 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 세포외 도메인)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어는 또한 OX40 또는 이의 단편(예를 들면, 이의 세포외 도메인)을 포함하는 융합 단백질, 예를 들면, 사람 OX40 세포외 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "OX40 리간드" 또는 "OX40L"은 또한 gp34, CD252 또는 TNFSF4로 지칭된 OX40의 유일한 리간드를 지칭한다. 사람 OX40 리간드는 수탁 번호 uniprot# P23510 하에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 동일하거나, 이의 변이체이다. OX40L는 세포 표면 상에 동형삼량체(homotrimer)를 천연적으로 형성하고, 활성화된 항원 제시 세포(activated antigen presenting cell; APC), 예를 들면, 활성화된 B 세포, 성숙한 통상의 수지상 세포(DC), 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell; pDC), 대식구 및 랑게르한스 세포(Langerhans cell) 상에서 주로 발현되고, 다른 세포형, 예를 들면, NK 세포, 비만 세포, 활성화된 T 세포의 서브세트, 및 혈관 내피 세포 및 평활근 세포 상에서 발현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "친화도"는 분자(즉, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예컨대, 항원) 사이의 모든 비공유결합성 상호작용의 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예컨대, 항체 및 항원) 사이의 1;1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 이의 결합 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(dissociation constant; KD)에 의해 발현된다. 결합 친화도를 측정하기 위한 방법, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)(예컨대, BIACORE) 또는 유사한 기술(예컨대, ForteBio)은 당해 분야에 공지되어 있다.
용어 "OX40 길항제", "OX40 억제제", "OX40 길항제 항체", "길항제 OX40 항체" 및 "OX40 항체 길항제"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 OX40-매개된 생물학적 신호 형질도입 활성을 억제 및/또는 중화시킬 수 있는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, OX40 길항제 항체는 OX40에 의해 개시된(triggered) 신호 형질도입 경로를 억제하거나 금지하고/하거나 예를 들면, OX40 리간드에 대한 OX40의 결합을 차단하거나 OX40 리간드에 대한 OX40의 결합을 실질적으로 감소시킴으로써 OX40-매개된 세포 반응, 예를 들면, 림프구 증식, 사이토킨 발현 또는 림프구 생존을 억제하거나 감소시킨다.
용어 "OX40 효능제", "OX40 효능제 항체", "OX40 효능성 항체" 및 "OX40 항체 효능제"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 OX40-매개된 생물학적 신호 형질도입 활성을 촉진 및/또는 향상시킬 수 있는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, OX40 효능제 항체는 OX40에 의해 개시된 신호 형질도입 경로를 촉진시키거나 향상시키고/시키거나 예를 들면, 가교-결합 및 OX40에 대한 결합 및 OX40-매개된 생물학적 신호를 활성화시킴으로써, OX40-매개된 세포 반응, 예를 들면, 림프구 증식, 사이토킨 발현 또는 림프구 생존을 촉진시키거나 향상시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "OX40-관련된 질환 또는 상태"는 OX40의 발현 또는 기능 또는 활성, 또는 OX40-매개된 신호 형질도입의 활성과 관련된 비-생리학적 상태, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 암, 염증 및 자가면역 질환을 지칭한다. 일부 구현예에서, 질환은 OX40-매개된 신호 형질도입의 차단으로부터 유리할 것이다. 일부 구현예에서, 질환은 OX40-매개된 신호 형질도입의 활성화로부터 유리할 것이다.
용어 "면역 반응(immune response)" 및 "면역 반응성(immune reaction)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 예를 들면, 림프구, 항원 제시 세포, 대식구 및 과립구, 및 상기 세포 또는 침입하는 병원체, 병원체에 의해 감염된 세포 또는 조직, 암 세포, 또는 자가면역성 또는 병리학적 염증의 경우에, 사람 신체로부터의 정상의 사람 세포 또는 조직의 선택적인 손상, 파괴 또는 제거를 야기하는 간(예를 들면, 항체, 사이토킨 및 상보체)에 의해 생산된 가용성 거대분자의 작용을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 OX40 항체 길항제는 면역 반응을 억제 또는 감소시키는데, 예를 들면, 이식체-대-숙주 질환에서 면역 거부를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 OX40 항체 효능제는 항-종양 면역 반응을 향상시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 형질도입"은 단백질-단백질 상호작용, 예를 들면, OX40(수용체)에 대한 OX40L(리간드)의 결합에 의해 일반적으로 개시되어, 세포의 하나의 부분으로부터 세포의 다른 부분으로 신호의 전송(transmission)을 야기하는 생화학적 인과 관계를 지칭한다. 일반적으로, 전송은 신호 형질도입을 유발하는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상에 하나 이상의 타이로신, 세린, 또는 트레오닌 잔기의 특정 포스포릴화를 포함한다. 끝에서 두번째 공정은 일반적으로 핵 이벤트(nuclear event)를 포함함으로써 유전자 발현에서 변화를 유발한다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "T 세포 기능을 향상시키는" 또는 "T-세포 효능 활성"은 효과기 또는 기억 T 세포의 재생을 유도, 개시 또는 자극하고/하거나 효과기 또는 기억 T 세포의 생물학적 기능을 유지 또는 증폭, 및/또는 유도, 개시 또는 자극시킴을 포함한다. T 세포의 기능을 향상시키는 예는: 개입(intervention) 전에 이러한 수준과 관련하여, CD8+ 효과기 T 세포로부터 감마 인터페론(INF-γ)의 상승된 분비, CD4+ 기억 T 세포 및/또는 효과기 T 세포로부터 감마 인터페론(INF-γ)의 상승된 분비, CD4+ 효과기 T 세포 및/또는 기억 T 세포의 상승된 증식, 상승된 CD8+ 효과기 T 세포 증식, 및 상승된 항원 반응성(예컨대, 청소(clearance))을 포함한다. 일 구현예에서, 예비-개입과 관련하여, 수준은 적어도 50%, 또는 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 300%, 500% 이상까지 증가된다. 이러한 향상을 측정하는 방식은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 T-세포 효능 활성은 본 발명의 항체의 존재하에 활성화된 T 세포에 의해 방출된 염증성 인자 IFNγ를 검출함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, IFNγ를 방출시키기 위해 T 세포를 촉진시키는 EC50 값은 본 발명의 항체에 대해 측정되며, 여기서 보다 낮은 값은 항체가 보다 높은 T-세포 효능 활성을 가짐을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 참고 OX40 효능제 항체(예컨대, OX40mAb24)와 비교하여 보다 높은 T-세포 효능 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "T 기능을 감소시키는" 또는 "T-세포 길항 활성"은 효과기 또는 기억 T 세포를 감소, 차단, 또는 이의 재생을 감소시키고/시키거나 효과기 또는 기억 T 세포의 생물학적 기능을 감소, 차단, 또는 감소시킴을 포함한다. T-세포 기능을 감소시키는 것의 예는 개입 전에 이러한 수준과 관련하여, CD8+ 효과기 T 세포로부터 감마 인터페론(INF-γ)의 감소된 분비, CD4+ 기억 및/또는 효과기 T 세포로부터 감마 인터페론(INF-γ)의 감소된 분비, CD4+ 효과기 T 세포 및/또는 기억 T 세포의 감소된 증식, 감소된 CD8+ 효과기 T 세포 증식, 및 감소된 항원 반응성(예컨대, 청소)을 포함한다. 일 구현예에서, 예비-개입과 관련하여, 수준은 적어도 50%, 또는 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 300%, 500% 이상까지 감소된다. 이러한 감소를 측정하는 방식은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 T-세포 길항 활성은 본 발명의 OX40 리간드 OX40L 및 항체의 존재하에서 활성화된 T 세포에 의해 방출된 염증 인자 IFNγ를 검출함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, T 세포로부터 OX40-OX40L 매개된 IFNγ 방출을 차단하는 IC50 값은 본 발명의 항체에 대해 측정되며, 여기서 보다 낮은 값은 항체가 보다 높은 길항 활성을 가짐을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 참고 OX40 길항제 항체(예컨대, GBR830)와 비교하여 보다 높은 T-세포 길항 활성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성" 및 "생물학적 활성" 또는 용어 "생물학적 특성" 및 "생물학적 특징"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 에피토프/항원 친화도 및 특이성, 생체 내 또는 시험관 내에서 OX40 활성을 중화시키거나 길항하는 능력, 생체 내 또는 시험관 내에서 OX40을 향상시키거나 활성화시키는 능력, T-세포 효능 활성, OX40L에 대한 OX40의 결합을 차단하는 IC50, OX40-OX40L-매개된 T 세포 활성화를 차단하는 IC50, 항체의 생체 내 안정성 및 항체의 면역원성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당해 분야에 공지된 항체의 다른 확인가능한 생물학적 특성 또는 특징은 예를 들면, 가교 반응성(즉, 일반적으로 표적화된 펩타이드의 비-사람 동족체, 또는 다른 단백질 또는 조직과의 가교 반응성), 및 포유동물 세포 내에서 높은 수준의 항체 발현을 유지하는 능력을 포함한다. 상술한 특성 또는 특징은 당해 분야에 잘 공지된 기술, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 ELISA, FACS 또는 BIACORE 플라스몬 공명 검정, 시험관 내 또는 생체 내 중화 검정, 수용체 결합, 사이토킨 또는 성장 인자의 생산 및/또는 분비, 신호 형질도입 및 상이한 공급원(예를 들면, 사람, 영장류, 또는 임의의 다른 공급원)으로부터의 조직 단면의 면역조직화학을 사용하여 관찰하거나 측정하거나 평가할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 목적한 생물활성을 갖는 항체의 임의의 형태를 지칭한다. 따라서, 이는 광의의 의미로 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 모노클로날 항체(예를 들면, 전장 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 이특이적 항체), 사람화된 항체, 완전한 사람 항체, 키메라 항체, CrossMab 항체, 또는 카멜화된 단일-도메인 항체로 사용된다.
용어 "전체 항체", "전장 항체" 및 "완전한 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 이황화물 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(이후 본원에서 VH로 약술됨) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(이후 본원에서 VL로 약술됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 이루어진다. VH 영역 및 VL 영역은 또한 보다 보존된 영역(골격 영역(FR)으로 지칭됨)이 산재된, 초가변 영역(hypervariable region)(상보성 결정 영역(complementary determining region; CDR)으로 명명됨)으로 추가로 나누어질 수 있다. "상보성 결정 영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "CDR"은 항체 가변 도메인 내 영역이며, 이는 서열에서 초가변성이고 구조적으로 정의된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉 부위")를 함유한다. CDR은 주로 에피토프에 대한 결합에 관여한다. 중쇄 및 경쇄의 CDR은 일반적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 불리며, 이는 N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된다. 항체 중쇄 가변 도메인 내에 위치한 CDR은 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 불리지만, 항체 경쇄 가변 도메인 내에 위치하는 CDR은 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 불린다. 각각의 VH 또는 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 이는 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지 다음의 순서로 정렬되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다중 효과기 기능을 나타낸다.
주어진 VH 또는 VL 아미노산 서열에서, 각각의 CDR의 전밀한 아미노산 서열 경계는 다양한 잘 공지된 도식 중 어느 하나 또는 이의 조합, 예를 들면, 초티아 도식(Chothia scheme)(Chothia et al., Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)); 카밧 도식(Kabat scheme)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health 및 Human Services, National Institutes of Health (1987)), AbM(University of Bath) 및 컨택트(Contact)(University College London); 노쓰 도식(North scheme)(North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명에서 항-OX40 항체의 CDR의 경계부는 당해 분야에서 임의의 도식 또는 이의 조합 및 수동 평가에 따라 측정할 수 있다.
항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 2개의 유형(카파(κ) 또는 람다(λ)로 지칭됨) 중 하나로 지정될 수 있다. 항체의 중쇄는 이의 중새 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 5개의 주요 상이한 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 분할될 수 있고, 이러한 부류 중 수개는 소부류, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다.
"IgG 형태의 항체"는 항체의 중쇄 불변 영역이 IgG 형태의 것임을 의미한다. 예를 들면, IgG2의 형태의 항체는 이의 중쇄 불변 영역이 IgG2 동형의 것임을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 항체의 "항원 결합 단편"은 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 일반적으로, 항원-결합 단편은 항체의 항원-결합 영역 또는 가변 영역의 적어도 하나의 단편(예를 들면, 하나 이상의 CDR)을 포함하고, 항체의 결합 특성 중 적어도 일부를 유지한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아보디(diabody); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예컨대, sc-Fv); 및 항체 단편으로부터 형성된 나노보디 및 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항원-결합 할성이 몰 농도로 발현되는 경우, 결합 단편 또는 유도체는 일반적으로 이로부터 이들이 유래된 항체의 항원-결합 활성의 적어도 10%를 유지한다. 바람직하게는, 결합 단편 또는 유도체는 이로부터 이들이 유래된 항체의 항원 결합 활성의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상을 유지한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편이 이의 생물학적 활성을 유의적으로 변화시키지 않는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있음이 인식된다(항체의 "보존된 변이체" 또는 기능적으로 보존된 변이체"로서 지칭됨). 바람직한 양태에서, 보존적 치환은 하기 표 A에 나타낸 예시적인 보존적 치환 잔기, 및 바람직하게는, 표 A에 나타낸 바람직한 보존적 아미노산 치환 잔기에서 비롯된다.
[표 A]
Figure pct00001
에피토프는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비-연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 정제된 상태를 지칭한다. 예를 들면, "단리된"은 분자가 다른 생물분자, 예를 들면, 핵산, 단백질, 지질, 당 또는 다른 물질, 예를 들면, 세포 부스러기 및 성장 배지를 실질적으로 포함하지 않음을 의미할 수 있다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는 바와 같이, 용어 "단리된"은 이들이 본원에 기술된 항체의 실험적 또는 치료학적 적용을 실질적으로 방해하는 양으로 존재하는 않는 한, 이러한 물질의 완전한 부재, 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들면, 전기영동(예컨대, SDS-PAGE, 등전점 포커싱(isoelectric focusing; IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된 바와 같이 순도가 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과이다(예컨대, 항체 순도를 측정하는 방법의 고찰을 위해, 예를 들면, 문헌: Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87을 참고한다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 집단을 구성하는 개개 항체가 동일함을 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 에피토프에 대해 지시된다. 대조적으로, 통상의(폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지시된(또는 상이한 에피토프에 대해 특이적인) 상이한 항체를 포함한다. 개질인자 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내며, 항체를 생산하는 임의의 특수한 방법을 요구하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항체"는 제1의 항체의 가변 도메인 및 제2의 항체의 불변 도메인을 갖는 항체를 지칭하고, 여기서 제1의 항체 및 제2의 항체는 상이한 종으로부터 유래된다. 일반적으로, 가변 도메인은 설치류와 같은 실험 동물의 항체로부터 수득되는 반면, 불변 도메인 서열은 사람 항체로부터 수득됨으로써, 수득된 키메라 항체가 실험 동물로부터의 항체보다 사람 대상체에서 부정적인 면역 반응을 유도하는 경향의 거의 없도록 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람화된 항체"는 사람 및 비-사람(예컨대, 마우스, 랫트) 항체를 함유하는 항체 형태를 지칭한다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 1개, 및 일반적으로 2개의, 가변 도메인을 포함하고, 여기서 초가변 루프 중 모두 또는 실질적으로 모두는 비-사람 면역글로불린의 것에 상응하고, 골격(FR) 영역 중 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린의 것에 상응한다. 사람화된 항체는 임의로 사람 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역(Fc) 중 적어도 일부를 포함한다. 일부 경우에는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 아미노산 돌연변이를 사람화된 항체(예컨대, 가변 도메인, 골격 영역, 및/또는 불변 영역(존재하는 경우)) 내로 도입하여, 예를 들면, 항체의 특정한 특성을 증진시킬 수 있으며; 이러한 항체 형태는 여전히 본 발명의 "사람화된 항체"의 영역 내에 속한다.
당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는 바와 같이, 항체는 항체를 생산하기 위한 세포 내에서 발견된 당 쇄를 가질 수 있다. 예를 들면, 마우스 내, 마우스 세포 내, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마 내에서 생산된 경우, 항체는 마우스 당 쇄를 함유할 수 있다. 대안적으로, 랫트, 랫트 세포, 또는 랫트 세포로부터 유래된 하이브리도마로부터 생산된 경우, 항체는 랫트 당 쇄를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fc 영역"은 불변 영역 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 천연-서열 Fc 영역은 다양한 천연적으로 발생하는 면역글로불린 Fc 서열, 예를 들면, 다양한 Ig 동형 및 이의 동종이계 Fc 영역을 포함한다(Gestur Vidarsson et al., IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions, 20 October 2014, doi: 10.3389/fimmu.2014.00520). 일 구현예에서, 사람 IgG 중쇄의 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복시 말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단에서 라이신(Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시하지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내 아미노산 잔기는 EU 지표로 또한 지칭되고, 문헌: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기술된 바와 같이, EU 넘버링(numbering)에 따라 넘버링된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fc 영역 변이체" 및 "변이체 Fc 영역"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 천연 서열 Fc 영역과 관련하여 아미노산 변형(들)을 포함하는 Fc 영역 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 발명의 Fc 영역 변이체는 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들면, N297A는 모 폴리펩타이드와 관련하여 297번 위치에서 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 Fc 영역 변이체이고, 여기서 번호는 EU 지표(EU Index)에 따른다. 예를 들면, 사람 IgG1 N297A는 N297A 치환을 지닌 사람 IgG1의 Fc 영역의 서열을 갖는 Fc 영역 변이체를 지칭한다. 변형은 첨가, 결실 또는 치환일 수 있다. 치환은 천연적으로 발생하는 아미노산 및 비-천연적으로 발생하는 아미노산을 포함할 수 있다. 변이체는 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 일부 구현예에서, FcR은 천연 서열 사람 FcR이다. 일부 구현예에서, FcR은 FcγR(감마 수용체), 예를 들면, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 소부류의 수용체, 및 또한 예를 들면, 이러한 수용체의 대립형질 변이체 및 대안의 스플라이싱 형태이다. FcγRII은 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제성 수용체")를 포함하고, 이는 유사한 아미노산 치환을 가지고 이의 세포질성 도메인 내에서 주로 상이하다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질성 도메인 내에서 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질성 도메인 내에서 면역수용체 타이로신-기반 억제성 포티프(ITIM)를 함유한다(참고: 예를 들면, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR의 고찰에 대해서는, 예컨대, 문헌: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)를 참고한다. 다른 FcR, 예를 들면, 미래에 확인될 것은 본원에서 용어 "FcR"에 포함된다. 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 신생아 수용체(neonatal receptor), FcRn을 포함하고, 이는 태아에 모(maternal) IgG를 전달하고(Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) 면역글로불린의 항상성을 조절하는데 관여한다. FcRn의 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다(참고: 예를 들면 Ghetie 및 Ward., Immunol. Today 18 (12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7): 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.)). 사람 FcRn에 대한 생체 내 결합 및 사람 FcRn에 대해 높은 결합 친화도를 지닌 폴리펩타이드의 혈청 반감기는 예를 들면, 유전자이식 마우스 또는 사람 FcRn을 발현하는 형질감염된 사람 세포주, 또는 변이체 Fc 영역을 지닌 폴리펩타이드가 투여된 영장류 내에서 측정될 수 있다. 제WO 2000/42072호(Presta)는 FcR에 대해 증진되거나 감소된 결합을 지닌 항체 변이체를 기술하고 있다. 예를 들면, 문헌: Shields et al., J. Biol. Chem.9 (2): 6591-6604 (2001)을 또한 참고한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 보조 물질"은 활성 물질과 함께 투여되는 희석제, 보조제(adjuvant)(예컨대, 프루언드 보조제(Freund's adjuvant)(완전 및 불완전), 약제학적 부형제, 약제학적 담체 또는 안정화제 등을 지칭한다.
용어 "약제학적 조성물"은 본원에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하고 조성물이 투여된 대상체에 대해 허용불가능한 독성을 갖는 추가의 성분을 함유하지 않는 형태로 존재하는 이러한 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역접합체"는 세포독성제 또는 표지를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 물질에 접합된 항체이다. "면역 융합체"는 하나 이상의 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 공유결합으로 연결됨으로써 융합된 항체이다.
본원에 기술된 바와 같은 "치료학적 제제"는 관련된 질환, 예컨대, 암의 예방 또는 치료에 효과적인 임의의 물질을 망라한다.
본원에 기술된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제하거나 예방하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다.
"화학치료제"는 암 또는 면역계 질환의 치료에 유용한 화학적 소 분자 약물을 포함한다.
용어 "소 분자 약물"은 생물학적 공정을 조절할 수 있는 저 분자량을 지닌 화합물을 지칭한다. "소 분자"는 분자량이 10 kD보다 더 작고, 전형적으로 2 kD보다 더 작고 바람직하게는 1 kD보다 더 작은 분자로서 지칭된다. 소 분자는 무기 분자, 유기 분자, 무기 구성성분을 함유하는 유기 분자, 방사활성 원자를 함유하는 분자, 합성 분자, 펩타이드 모사체(mimic) 및 항체 모사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치료제로서, 소 분자는 거대 분자보다 세포 막을 보다 잘 침투하고, 분해에 대해 거의 민감하지 않고, 면역 반응을 개시하는 경향이 거의 없다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역조절인자"는 면역 반응을 조절하는(예컨대, 억제하거나 향상시키는) 천연 또는 합성 활성제 또는 약물을 지칭한다. 면역 반응은 체액성 반응 또는 세포성 반응일 수 있다. 일부 예에서, 면역조절인자는 면역 반응을 억제하는 면역억제제, 예를 들면, 염증 및 자가면역 질환에서 면역 반응을 유리하게 억제하는 면역억제제를 포함한다. 다른 예에서, 면역조절인자는 면역 반응을 향상시키는 활성제 또는 약물, 예를 들면, 암 치료시 항암 면역 반응을 유리하게 향상시키는 활성제 또는 약물을 포함한다.
용어 "암성" 및 "암"은 조절되지 않는 세포 성장에 의해 일반적으로 특징화된, 포유동물에서 생리학적 장애를 지칭하거나 기술한다. 이러한 정의는 양성 및 악성 종양 및 유지성(dormant) 종양 또는 미세전이(micrometastasis)를 포함한다. "암"은 고형 종양 및 혈액 암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 암의 예는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma) 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"염증 및/또는 자가면역 질환"은 임의의 염증성 또는 면역-관련 상태(예컨대, 병리학적 염증 및 자가면역 질환)을 광범위하게 포함함을 의미한다. "자가면역 질환"은 개체 자체의 조직 또는 기관에 의해 유발되거나, 이를 표적화하는 질환 또는 상태, 또는 공-차별화된 장애(co-segregated disorder) 또는 이의 징후 또는 이로부터 발생하는 상태이다. 자가면역 질환은 정상 체 조직 및 항원과 반응성인 항체를 생산하는 B 세포의 생성에 의해 유발되거나 악화된 상태를 지칭한다. 자가면역 질환은 또한 자가-항원(예컨대, 핵 항원)으로부터 유래된 에피토프에 의해 특이적인 자가항체의 분비를 포함하는 질환일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 형질전환(즉, 이종 DNA의 숙주 세포 내로의 도입)의 목적을 위해 사용될 수 있는 임의의 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 지칭한다. 벡터의 하나의 유형은 이의 내부로 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는, 환형 이중 가닥 DNA 루프인, "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 연결될 수 있다. 특정의 벡터는 이의 내부로 이들이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예컨대, 복제의 세균 기원을 가진 세균 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비-에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 안내할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 발현 벡터는 벡터가 숙주 세포 내로 형질전환, 형질감염 또는 형질도입되는 경우 복제할 수 있고 표적 유전자를 발현할 수 있는 핵산을 지칭한다. 발현 벡터는 하나 이상의 표현형적 선택가능한 마커 및 복제 기원을 포함함으로써 벡터 유지를 보증하고 필요한 경우 숙주 내에서 증폭을 제공한다.
본원에서 용어 "대상체(subject)" 또는 "환자" 또는 "개체(individual)"는 임의의 사람 또는 비-사람 동물을 포함한다. 용어 "비-사람 동물"은 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들면, 비-사람 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 용어 "치료학적 유효량", "치료학적 유효 용량" 및 "유효량"은 하나 이상의 질환 또는 상태의 증상 또는 세포, 조직 또는 대상체에게 단독으로 또는 다른 치료학적 약물과 함께 제공되는 경우 질환 또는 상태의 발달을 효과적으로 예방하거나 증진시키는 본 발명의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 치료학적 유효 용량은 또한 증상의 증진을 야기하기에 충분한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양, 예를 들면, 관련된 의학 상태를 치료, 치유, 예방 또는 증진시키거나 이러한 상태의 치료, 치유, 예방 또는 증진의 속도를 증가시키는 양을 지칭한다. 활성 성분 단독이 개체에게 투여되는 경우, 치료학적 유효 용량은 성분 만을 지칭한다. 조합하여 투여되는 경우, 치료학적 유효 용량은 조합하여, 순서대로 또는 동시에 투여하는 것과 상관없이, 치료학적 효과를 구성하는 활성 성분의 총 양을 지칭한다. 치료제의 유효량은 진단 기준 또는 매개변수에서 적어도 10%, 전형적으로 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 및 가장 바람직하게는 적어도 50%까지의 증진을 야기할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하기 위한" 또는 "치료하는" 또는 "치료"는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 질환의 증상을 치유, 완화 및 경감시키고/시키거나 진단된 병리학적 상태 또는 질환의 진행을 정지시키는 치료학적 척도, 및 2) 병리학적 상태 또는 질환의 발달을 예방하고/하거나 지연시키는 예방적(preventive) 또는 예방학적(prophylactic) 척도를 포함한다. 따라서, 치료를 제공받은 대상체는 질환을 앓는 개체, 질환을 앓는 경향이 있는 개체, 및 질환을 예방하기를 원하는 개체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 치료에 관한 것이다. 일부 다른 구현예에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 예방에 관한 것이다.
본 발명에 따른 일부 구현예에서, 질환 또는 상태의 "치료"는 질환 또는 상태의 증진(즉, 질환 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 진행을 완화 또는 예방 또는 감소시킴)을 지칭한다. 일부 다른 구현예에서, "치료"는 적어도 하나의 신체 매개변수, 예를 들면, 환자에 의해 인식될 수 없는 물리적 매개변수를 경감시키거나 증진시킴을 지칭한다. 일부 다른 구현예에서, "치료"는 물리적으로(예컨대, 구별가능한 증상의 안정화), 생리학적으로(예컨대, 물리적 매개변수의 안정화), 또는 둘 다로 질환 또는 상태의 조절을 지칭한다. 질환의 치료 및/또는 예방을 평가하기 위한 방법은 본원에 명쾌하게 기술되지 않는 한 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다.
본 발명에 다른 여전히 다른 구현예에서, 질환 또는 상태의 "예방(prevention)"은 질환 또는 상태 또는 특수한 질환 또는 상태의 증상의 발생 또는 발달의 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 암의 가족력을 지닌 대상체는 예방학적 요법(prophylactic regimen)에 대한 후보대상이다. 일반적으로, 암의 문맥에서, 용어 "예방"은 암의 상태 또는 증상의 발생 전에 대상체, 특히 암에 걸릴 위험이 있는 대상체에 대한 약물의 투여를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 암을 "치료한" 후, 개체 환자는 개체가 다음 중 하나 이상을 나타낸 경우 성공적으로 치료된 것으로 고려된다: 다수의 암 세포가 감소되거나 암 세포가 완전히 사라지거나; 종양 크기가 감소하거나; 예를 들면, 연 조직 및 골로 암 세포의 확산을 포함하여, 말초 기관 내로 암 세포의 침윤이 억제되거나 부재하거나; 종양 전이가 억제되거나 부재하고; 종양 성장이 억제되거나 부재하거나; 특수한 암과 관련된 하나 이상의 증상이 경감되거나; 발생정도 및 사망률이 감소되거나; 삶의 질이 증진되거나; 종양 발생, 빈도 및 종양원성이 감소되거나; 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도가 감소하거나; 종양 세포가 비-종양원성 상태로 분화되거나; 효과들 중 일부의 조합.
"종양 성장의 억제"는 이에 의해 종양 세포 성장이 억제될 수 있는 임의의 메카니즘을 지칭한다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 증식을 지연시킴으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 증식을 정지함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포를 사멸시킴으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 세포자멸사를 유도함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 분화를 유도함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포에서 영양분을 고갈시킴으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 이주를 예방함으로써 억제된다. 일부 구현예에서, 종양 세포 성장은 종양 세포 침입을 예방함으로써 억제된다.
본원에 사용된 바와 같이, "서열 동일성(sequence identity)"은 비교 윈도우(comparison window)에서 차례로 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 비교하는 것을 기반으로 하는 서열의 동일성 정도를 지칭한다. "서열 동일성 (퍼센트)"는 다음과 같이 계산할 수 있다: 비교 윈도우에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 2개의 서열 내에 동일한 핵산 염기(예컨대, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예컨대, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)를 지닌 위치의 수를 측정하여 일치하는 위치의 수를 얻고, 일치하는 위치의 수를 비교 윈도우에서 위치의 전체 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 이 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 수득한다. 서열 동일성의 퍼센트를 측정하는 목적을 위한 최적의 정렬은 당해 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 서열을 정렬하기 에 적절한 매개변수, 예를 들면, 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 측정할 수 있거나 표적 서열을 비교할 수 있다. 본 발명에서, 항체 서열의 경우, 아미노산 서열 동일성의 퍼센트는 후보물 항체 서열을 참고 항체 서열과, 및 바람직한 구현예에서, 카밧 넘버링 도식(Kabat numbering scheme)에 따라 최적으로 정렬함으로써 측정된다.
본원에 사용된 바와 같이, "GBR830"은 제WO 2013008171호에 개시된 VH6/VL9 중쇄 및 경쇄 서열에 따른 일시적인 발현에 의해 수득된 OX40 길항제 항체이고; "OX40mAb24"는 제WO 2016057667호에 개시된 OX40mAb24 항체의 중쇄 및 경쇄 서열에 따른 일시적인 발현에 의해 수득된 OX40 효능제 항체이고; "11D4"는 제WO 2009079335호에 개시된 11D4 항체의 중쇄 및 경쇄 서열에 따른 일시적인 발현에 의해 수득된 OX40 효능제 항체이다.
항-OX40 항체 및 이의 생산
본 발명의 항체는 항체를 생산하기 위한 임의의 적합한 방법으로 생산할 수 있다. OX40의 임의의 적합한 형태는 면역원(항원)으로서 사용되어 항체를 생산할 수 있다. 예로서 및 제한없이, 임의의 OX40 변이체 또는 이의 단편은 면역원으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 뮤린 모노클로날 항-사람 OX40 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 생산할 수 있다. 이러한 방법은 코흘러(Kohler) 등의 문헌: Kohler et al., (1975) (Nature 256: 495-497)에 의해 원래 개발된 하이브리도마 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 표준 프로토콜에 따라서, 마우스 비장 세포를 단리하고 PEG 또는 전기융합에 의해 마우스 골수종 세포주와 융합시킨다. 이후에, OX40 결합 활성을 지닌 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 스크리닝한다. 본 발명의 하이브리도마 세포로부터의 면역글로불린 가변 영역의 DNA 서열은 퇴화된 프라이머 PCR을 기반으로 한 방법에 의해 검출할 수 있다.
설치류(예를 들면, 마우스)로부터의 항체는 생체 내에서 치료학적 약물로서 사용된 경우 목적하지 않은 항체 면역원성을 유발할 수 있다. 반복된 사용은 사람에서 치료학적 항체에 대한 면역 반응을 유발한다. 이러한 종류의 면역 반응은 적어도 치료학적 효능의 상실을 초래하고, 심각한 경우에, 잠재적으로 치명적인 알레르기 반응을 초래할 것이다. 설치류 항체의 면역원성을 감소시키는 한가지 방법은 키메라 항체의 생산을 포함하고, 여기서 마우스 가변 영역은 사람 불변 영역과 융합된다(Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-43). 그러나, 키메라 항체에서 완전한 설치류 가변 영역의 보유는 환자에서 유해한 면역원성을 여전히 유발할 수 있다.
설치류 가변 영역으로부터 사람 골격으로의 CDR의 이식(즉, 사람화)을 사용하여 설치류 서열을 추가로 최소화시켰다. 본 발명의 사람화된 항체의 경우, 뮤린 CDR 영역을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 사람 배선 골격 내로 삽입할 수 있다. 문헌: 윈터(Winter) 등의 미국 특허 제5,225,539호 및 퀸(Queen) 등의 미국 특허 제US 5,530,101호; 제US 5,585,089호; 제US 5,693,762호 및 제US 6,180,370호을 참고한다.
본 발명의 항체의 가변 영역 CDR의 정밀한 아미노산 서열 경계부는 카밧, 초티아(Chotia), AbM, 컨택트(Contact) 또는 노쓰(North)와 같은 많은 잘 공지된 도식 중 어느 하나를 사용함으로써 측정할 수 있다. 상이한 정의 시스템에 의해 수득된 동일한 항체의 가변 영역의 CDR의 경계부는 상이할 수 있음이 주목될 수 있다. 즉, 상이한 지정 시스템에 의해 정의된 동일한 항체의 가변 영역의 CDR 서열은 상이하다. 따라서, 이것이 본 발명에 정의된 바와 같은 특정 CDR 서열을 지닌 항체를 정의하게 되는 경우, 항체의 영역은 또한 이의 가변 영역 서열이 특정 CDR 서열을 포함하지만, 상이한 도식(예를 들면, 상이한 정의 시스템 또는 이의 조합)의 적용으로 인하여, 특정 CDR 서열에 대해 본 발명에서 규정된 것과는 상이한 지정된 CDR 경계부를 지닌 항체를 포함한다.
상이한 특이성(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 결합 부위)을 지닌 항체는 상이한 CDR을 갖는다. CDR이 항체 사이에서 상이하지만, CDR 내 제한된 수의 아미노산 위치 만이 항원 결합에 직접적으로 포함된다. 최소의 오버랩핑 영역은 카밧, 초티아, AbM 및 노스 도식 중 적어도 2개를 사용하여 측정함으로써 항원 결합에 대해 "가장 작은 결합 단위"를 제공할 수 있다. 가장 작은 결합 단위는 CDR 잔기의 서브세트일 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, CDR 서열의 나머지의 잔기는 항체의 구조 및 단백질 폴딩에 따라 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 나타낸 CDR의 임의의 변이체를 고려한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR의 변이체에서, 가장 작은 결합 단위의 아미노산 잔기는 변하지 않고 남아있지만, 카밧 또는 IMGT에 따라 정의된 바와 같은 다른 CDR 잔기는 보존적 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로부터 선택된 1 내지 3개를 포함하는, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 HCDR1는 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 적어도 1개 및 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)을 갖고, HCDR2는 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 적어도 1개 및 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)을 갖고, HCDR3은 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 적어도 1개 및 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로부터 선택된 1 내지 3개를 포함하는 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 LCDRl은 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 적어도 1개 및 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)을 갖고, LCDR2는 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 적어도 1개 및 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)을 갖고, LCDR3은 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 적어도 1개 및 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 이의 중쇄 가변 영역의 3개의 HCDR은 본원에 구체적으로 개시된 3개의 HCDR과 관련하여, 총 적어도 1개 및 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 포함하고/하거나, 이의 경쇄 가변 영역의 3개의 LCDR은, 본원에 구체적으로 개시된 3개의 LCDR과 관련하여, 총 적어도 1개 및 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고 여기서 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 본원에 구체적으로 개시된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역과 비교하여, 1개 이상(바람직하게는 10개, 보다 바람직하게는, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하)의 아미노산 변화(바람직하게는 아미노산 치환, 보다 바람직하게는 아미노산 보존적 치환)을 포함하고, 바람직하게는, 아미노산 변화는 CDR 영역 내에서 발생하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 여기서 VH는 서열 번호: 1, 2, 3, 4 또는 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 여기서 VL은 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 동일하거나 이에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 본원에 기술된 아미노산 변화는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다. 바람직하게는, 본원에 기술된 아미노산 변화는 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 아미노산 변화는 CDR 외부의 영역 내(예를 들면, FR 내에서)에서 발생한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 아미노산 변화는 중쇄 가변 영역의 외부 및/또는 경쇄 가변 영역의 외부에서 발생한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역에서 발생한다.
일부 구현예에서, 아미노산 변화를 포함하는 본 발명의 항체는 본원에 개시된 특정 항체에 대해 비교가능하거나 유사한 특성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-OX40 항체는 CDR에 대한 해독 후 변형, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄, 또는 중쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체는 전장 항체, 단일-도메인 항체, 예를 들면, VHH, Fab, Fab', Fab'-SH, (Fab')2, 단일 쇄 항체, 예를 들면, scFv, Fv, dAb(도메인 항체) 또는 이중(다중) 특이적 항체이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체는 임의의 IgG 동형의 형태의 항체, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 형태의 항체이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 변경된 효과기 기능(들)을 지닌 항체를 제공한다. 용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기여하는 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 부류에 따라 변한다. 5개의 주요 항체 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 존재하고, 이들 중 일부는 소부류(동형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류된다. 항체의 효과기 기능은 예를 들면, C1q 결합 및 상보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 면역 세포의 보충; 및 세포 표면에서 FcR 수용체에 대한 Fc 영역의 결합에 의해 매개된 가교-결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 적합한 항체 Fc 영역 서열은 필요, 예를 들면, 표적 세포를 사멸시키기 위해 면역계를 보충하거나, FcR과의 상호작용에 의해 항체의 가교-결합을 유도하는 것이 요구되는지의 여부에 따라 선택될 수 있다. 예를 들면, 면역계 보충 및 표적 세포 사멸이 목적한 항체의 바람직한 특성인 경우, 항체의 Fc 영역은 선택되거나 추가로 변형되어 활성화된 FcγR 수용체에 대한 향상된 결합을 제공하고/하거나 보충하여 예를 들면, ADCC 또는 CDC 효과기 기능을 촉진시킬 수 있다. 다른 예를 위해, 면역계 보충이 바람직하지 않는 경우에, 항체의 Fc 영역이 선택될 수 있거나 추가로 변형되어 효과기 기능을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 사람 IgG2 또는 IgG4 아형의 Fc 영역을 사용할수 있고, N297A와 같은 돌연변이를 지닌 IgG1 아형의 Fc 영역이 사용될 수 있다. 또한, Fc 영역이 선택되거나 돌연변이됨으로써, 이를 함유하는 항체가 하나 이상의 Fc 수용체에 선택적으로 결합할 수 있지만, 다른 하나 이상의 FcR에 대한 결합은 감소 또는 제거됨으로써, 항체 효과기 기능의 조절을 달성할 수 있는데, 예를 들면, ADCC 활성의 강도를 변화시키면서 항체의 가교-결합을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌: Xinhua Wang et al., IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions, Protein Cell 2018, 9 (1): 63-73, DOI 10.1007/s13238-017-0473-8; Shields RL, High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcRn 및 Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR, 2001, J Biol Chem. 2001 Mar 2; 276 (9): 6591-604. Epub 2000 Nov 28을 참고한다.
본 발명은 항체 변이체를 항체의 생체 내 반감기가 중요하고, 특정의 효과기 기능(예를 들면, 상보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 경우의 적용에 바람직한 후보물이 되도록 하는 일부 그러나 모두가 아닌 효과기 기능을 지닌 항체 변이체를 제공한다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 검정을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체(FcR) 결합 검정을 수행하여 항체가 FcγR 결합을 결여하지만(및 따라서 ADCC 활성 또는 항체 가교-결합 활성을 결여할 수 있다), FcRn 결합 능력을 보유하도록 할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인, NK 세포는 단지 Fc γ RIII을 발현하지만, 단핵구는 Fcγ RI, Fcγ RII 및 Fcγ RIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 문헌: Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Tmmunol ·9: 457-492 (1991)의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 사람 IgG1에서 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn과의 결합 부위는 묘사되어 왔고, 증진된 결합을 지닌 변이체는 기술되어 왔다(참고: Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, 2001).
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 의해 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생산할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환에서 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는 사람 Fc 영역 서열(예를 들면, 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역)을 포함할 수 있다). 예를 들면, FcγR에 대한 이의 결합을 향상시키거나 감소시키고 상응하는 기능을 향상시키거나 감소시키는 사람 IgG1에 대한 다수의 변형이 문헌: Bruhns 및 Jφnsson published in Immunol Rev. 2015 Nov; 268 (1): 25-51, 제44면에 요약되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 사람 IgG1 Fc 영역 변이체를 포함하고, 이는 감소되거나 결여된 FcγR 결합 활성(예를 들면, 항체 가교-결합 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 사람 IgG1 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 및 특히, 면역글로불린 중쇄의 위치 E233, L234, L235, N297, 및 P331에 아미노산 치환으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IgG1 Fc 영역 변이체는 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297G, N297D 및 P331S로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 사람 IgG1 Fc 영역 변이체의 아미노산 치환은 N297A이다.
일 양태에서, 본원에 제공된 항체는 변형시켜 항체의 글리코실화 정도를 증가시키거나 감소시킨다. 항체의 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 아미노산 서열을 변화시켜 하나 이상의 글리코실호 부위를 생산하거나 감소시킴으로써 편리하게 달성할 수 있다. 글리코실화를 변화시켜, 예를 들면, "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 항체 서열 내에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 변화시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 치환을 이룰 수 있으며, 이는 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 부위의 제거를 야기함으로써, 이러한 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 아글리코실화(aglycosylation)는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 방법 예를 들면, 미국 특허 제5,426,300호에 기술되어 있다. 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 이당류가 변화될 수 있다. 일부 적용에서, 목적한 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형, 예를 들면, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 기능을 증진시키기 위한 푸코스 모듈의 제거가 유용하다. 다른 적용에서, 갈락토실화 변형을 이루어 상보체-의존성 세포독성(CDC)을 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 시스테인 가공된 항체, 예컨대, "티오MAb"를 생산하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 항체의 하나 이상의 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 추가로 변형되어 당해 분야에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비-단백질 모이어티(moiety)를 포함할 수 있다. 항체 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비-제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공-중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디알칸, 폴리-1,3,6-트리알칸, 에틸렌/말레산무수물 공-중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(i) 사람 OX40, 특히 사람 OX40에 대한 세포외 도메인에 대해 고 친화도, 예를 들면, 100 nM 미만, 예를 들면, 50 nM 미만, 예를 들면, 30 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 또는 5 nM 미만의 KD 값으로의 결합으로서, 여기서 바람직하게는 KD 값은 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정되는, 결합;
(ii) 세포의 표면 상에 발현된 사람 OX40에 대해 고 친화도, 예를 들면, 100 nM 미만, 예를 들면, 50 nM 미만, 예를 들면, 40 nM 미만, 바람직하게는 20 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 또는 5 nM 미만의 EC50 값으로의 결합으로서, 여기서 바람직하게는 EC50 값은 FACS 검정을 사용하여 측정되는, 결합;
(iii) 이의 리간드 OX40L에 대해, 예를 들면, ELISA로 측정하여, 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90%의 억제율로, 및 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만의 IC50 값으로 사람 OX40의 결합의 차단;
(iv) 표 2에 나타낸 임의의 항체와 동일하거나 이와 유사한 결합 친화도 및/또는 특이성을 나타냄;
(v) 표 2에 나타낸 임의의 항체의 OX40 결합을 억제(예를 들면, 경쟁적으로 억제)함;
(vi) 표 2에 나타낸 임의의 항체와 동일하거나 오버랩핑된(overlapped) 에피토프에 결합;
(vii) 표 2에 나타낸 임의의 항체와 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 가짐.
일부 구현예에서, 본 발명의 OX40 항체는 FcR(예컨대, FcγR), 예를 들면, 사람 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역 또는 이의 변이체, 바람직하게는 사람 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역 또는 이의 변이체에 결합하는 Fc 영역을 포함하는, 효능제 항체이다. 변이체는 바람직하게는 모 Fc 영역(예컨대, 천연-서열 Fc 영역)의 것과 비슷하거나 이보다 더 강한 FcγR에 대한 결합 친화도를 갖는다. 바람직하게는 항체는 세포 상에서 발현된 FcγR에 이의 Fc 영역을 결합시킴으로써 가교-결합을 달성한다. 바람직하게는, 항체는 서열 번호: 21 또는 22에 제시된 바와 같은 불변 영역 서열의 Fc 영역과 동일한 사람 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역을 포함하거나 서열 번호: 21 또는 22에 제시된 바와 같은 불변 영역의 Fc 영역 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97% 또는 99% 동일성을 갖거나, 서열 번호: 21 또는 22에 제시된 바와 같은 불변 영역 서열의 Fc 영역 서열과 관련하여 10, 5 또는 1 내지 3개 이하의 아미노산 변화를 갖는 사람 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 OX40 효능제 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(i) 사람 OX40에 대해 고 친화도, 예를 들면, 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 5 nM 미만의 KD 값으로의 결합으로서, 여기서 바람직하게는 KD 값은 표면 플라스마 공명 검정을 사용하여 측정되는, 결합;
(ii) 세포(예를 들면, 활성화된 CD4+ T 세포)의 표면에서 발현된 사람 OX40에 대해 고 친화도, 예를 들면, 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 5 nM 미만의 EC50 값으로의 결합으로서, 여기서 바람직하게는 EC50 값이 FACS 검정을 사용하여 측정되는, 결합;
(iii) OX40-매개된 신호 형질도입 활성의 활성화;
(iv) T-세포 효능성 활성을 가짐(여기서 항체의 T-세포 효능성 활성은 예를 들면, 항체의 존재하에서 활성화된 T 세포에 의해 방출된 IFNγ와 같은 사이토킨을 검출함으로써 평가될 수 있고, 일부 구현예에서, 항체의 EC50 값이 10 nM 미만, 바람직하게는 5 nM 미만이다);
(v) 종양 성장의 억제, 예를 들면, 흑색종 세포의 성장의 억제.
일부 구현예에서, 본 발명의 OX40 항체는 길항제 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역 변이체를 포함하고, 여기서, 예를 들면, 모 Fc 영역(예컨대, 천연-서열 Fc 영역)과 관련하여, FCγR에 대한 Fc 영역 변이체의 결합 친화도는 감소되거나 실질적으로 제거된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 세포 표면에서 발현된 FcγR에 실질적으로 결합하지 않고, FcγR-매개된 항체 가교-결합은 발생하지 않는다. 일부 구현예에서, Fc 영역 변이체를 포함하는 본 발명의 항체는 모 Fc 영역(예컨대, 천연-서열 Fc 영역)을 포함하는 상응하는 항체와 관련하여 감소 또는 제거된 FcγR-매개된 효과기 기능을 갖는다. 바람직하게는, 항체의 Fc 영역은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297G, N297D, P331S, 또는 이의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체의 Fc 영역은 N297A 돌연변이를 포함하는 사람 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 항체는 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 불변 영역 서열의 Fc 영역 서열에 대해 사람 IgG1 Fc 영역 서열 동일성을 포함하거나, 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 불변 영역 서열의 Fc 영역 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖거나, 서열 번호: 21에 제시된 바와 같은 불변 영역 서열의 Fc 영역 서열에 대해 10, 5 또는 1 내지 3개 이하의 아미노산 변화를 갖는 사람 IgG1 Fc 영역 변이체를 포함하고, FcγR에 대한 FC 영역의 결합 친화도를 감소시키는 돌연변이(들), 바람직하게는 N297 돌연변이, 보다 바람직하게는 N297A를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 OX40 길항제 항체는 다음의 특성 중 하나 이상을 갖는다:
(i) 사람 OX40에 대해 고 친화도, 예를 들면, 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 5 nM 미만의 KD 값으로의 결합으로서, 여기서 바람직하게는 KD 값은 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정되는 결합;
(ii) 세포(예를 들면, 활성화된 CD4+ T 세포)의 표면에서 발현된 사람 OX40에 대해, 고 친화도, 예를 들면, 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 5 nM 미만의 EC50 값으로의 결합으로서, 여기서 바람직하게는 EC50 값이 FACS 검정을 사용하여 측정되는, 결합;
(iii) 이의 리간드 OX40L에 대해, 예를 들면, ELISA에 의해 측정된 것으로서, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 85% 또는 90%의 억제율, 및 바람직하게는 10 nM 미만, 보다 바람직하게는 1 nM 미만의 IC50 값으로의 OX40의 결합의 차단;
(iv) OX40-매개된 신호 형질도입 활성의 차단;
(v) T-세포 길항 활성을 가짐(여기서 항체의 T-세포 길항 활성은 예를 들면, 사이토킨, 예를 들면, 항체 및 리간드 OX40L의 존재하에서 활성화된 T 세포에 의해 방출된 IFNγ를 검출하여 항체에 의한 OX40L-매개된 T-세포 활성화의 억제를 평가함으로써 평가될 수 있고, 일부 구현예에서, 항체의 IC50 값은 5 nM 미만, 바람직하게는 1 nM 미만이다);
(vi) 항-면역 거부 활성을 억제함, 예를 들면, 이식체-대-숙주 질환에서 면역 거부를 감소시킴.
항체 발현
본 발명은 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 본 발명의 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하기 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 이러한 방법은 숙주 세포를 배양하는 단계, 항체 또는 항원-결합 단편을 정제 및 회수하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 것을 암호화하는 핵산을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 본원에 기술된 중쇄, 경쇄, 가변 영역 또는 상보성 결정 영역을 포함하는 분절을 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 번호: 17 또는 18에 제시된 바와 같은 핵산 서열에 대해 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열 번호; 19 또는 20에 제시된 바와 같은 핵산 서열에 대해 적어도 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
일 양태에서, 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터가 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터의 선택은 숙주 세포에 의존하며 여기서 벡터는 발현되는 것으로 의도된다. 일반적으로, 발현 벡터는 프로모터 및 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 다른 조절 서열(예컨대, 인핸서(enhancer))를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 항체 불변 영역을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 숙주 세포, 예를 들면, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)는 복제하는데 사용되어 본 발명의 핵산을 발현할 수 있는 원핵 숙주이다. 다른 적합한 미생물 숙주는 세균, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 다른 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예를 들면, 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas)를 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 일반적으로 숙주 세포와 혼화성인 발현 제어 서열(예를 들면, 복제 오리진(origin of replication))을 포함하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 항-OX40 항체 폴리펩타이드를 발현 및 생산할 수 있다. 예를 들면, 이들은 내인성 면역글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주, 또는 외인성 발현 벡터를 지닌 포유동물 세포주, 예를 들면, 정상 사람 세포, 또는 영구증식된 동물 또는 사람 세포일 수 있다. 예를 들면, 완전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 많은 적합한 숙주 세포주, 예를 들면, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HEK293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B 세포 및 하이브리도마가 개발되었다.
일 양태에서, 본 발명은 항-OX40 항체를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 방법은 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 및 숙주 세포를 충분한 기간 동안 배양함으로써 항체가 숙주 세포 내에서 발현되도록 하는 단계, 또는 보다 바람직하게는 항체를 숙주 세포가 성장하여 항체를 생산하는 배지 내로 분비시키는 단계를 포함한다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 제조된 항체 분자는 공지된 이용가능한 기술, 예를 들면, 고 성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질을 정제하는데 사용된 실제 조건은 순 전하(net charge), 소수성, 및 친수성과 같은 인자에 의존하며, 이는 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 본 발명의 항체 분자의 순도는 임의의 다양한 잘 공지된 분석 방법, 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 고 성능 액체 크로마토그래피 등에 의해 측정될 수 있다.
상이한 세포주에 의해 발현되거나 유전자이식 동물에서 발현된 항체는 서로 상이한 글리코실화 유형을 가지는 경향이 있다. 그러나, 본원에 제공된 핵산에 의해 암호화되거나 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 글리코실화 유형과 상관없이, 본 발명의 일부이다.
검정
본원에 제공된 항-OX40 항체의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성은 당해 분야에 공지된 다양한 검정에 의해 확인, 스크리닝, 또는 특성화될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명의 항체의 항원-결합 활성은 예를 들면, ELISA 및 웨스턴 블롯과 같은 공지된 방법에 의해 시험된다. 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 OX40에 대한 결합을 측정할 수 있고, 예시적인 방법은 본원에 개시되어 있다.
본 발명은 또한 목적한 생물학적 활성을 지닌 항-OX40 항체를 확인하기 위한 검정 방법을 제공한다. 생물학적 활성은 예를 들면, OX40에 대한 결합(예를 들면, 사람 OX40에 대한 결합), 증가된 OX40-매개된 신호 형질도입(예컨대, 증가된 NFκB-매개된 전사), 향상된 T 세포 효과기 세포 기능(예컨대, 효과기 T 세포 증식을 증가시키고/시키거나 효과기 T 세포에 의해 사이토킨 생산을 증가시킴에 의해) 등을 포함할 수 있다. 생체 내에서 및/또는 시험관 내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 항체를 이러한 생물학적 활성에 대해 시험한다.
임의의 상술한 시험관 내 검정 방법에서 사용하기 위한 세포는 OX40을 천연적으로 발현하거나 OX40을 발현하기 위해 가공된 세포주, 예를 들면, 종양 세포주를 포함한다. 이러한 세포는 또한 OX40을 정상적으로 발현하지 않고 OX40을 발현하기 위해 OX40을 암호화하는 DNA로 감염된 세포주를 포함한다.
본 발명의 면역접합체 또는 면역 융합체가 항-OX40 항체 대신에 또는 이것 외에 사용되어 상술한 검정 방법 중 어느 것도 수행할 수 있음이 이해된다.
항-OX40 항체와 다른 활성제의 조합을 사용하여 상술한 검정 방법 중 어느 것도 수행할 수 있음이 이해된다.
면역접합체 및 면역 융합체
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공된 임의의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 다른 물질을 포함하는 면역접합체를 제공한다. 일 구현예에서, 다른 물질은, 예를 들면, 세포독성제이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 임의의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 면역 융합체를 제공한다.
일부 구현예에서, 면역접합체 및 면역 융합체는 OX40-관련된 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위해 사용된다.
약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 포함할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 키트에 포함될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 진단 키트와 같은 키트 내에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "약제학적 담체"는 생리학적으로 혼화성(compatible)인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장성 제제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 본 발명에 적합한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들면, 물 및 오일, 예를 들면, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원, 예를 들면, 땅콩 오일, 대두 오일, 광 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우 물이 바람직한 담체이다. 염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 액체 담체로서, 특히 주사가능한 용액에 대해 사용하는 것이 또한 가능하다.
적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 곡물, 백악(chalk), 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지유(dry skim milk), 글리세롤, 프로필렌, 디올, 물, 에탄올 등을 포함한다. 부형제의 적용 및 이의 사용을 위해, 또한 문헌: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", fifth edition, R.C. Rowe, P.J. Seskey 및 S.C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago을 참고한다. 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 액제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방성 제제 등의 형태일 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 OX40 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 하나 이상의 모노클로날 항체, 또는 핵산, 벡터 또는 숙주 세포, 또는 면역접합체 또는 면역 융합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물 속의 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터 또는 이의 숙주 세포, 또는 면역접합체, 또는 면역 융합체는 약제학적 제제 속에 적합하게 사용된 적합한 약제학적 담체, 부형제 및 다른 공-투여된 제제와 함께 제형화되어, 증진된 전송, 전달, 내성 등을 제공할 수 있다.
본원에 기술된 항-OX40 항체를 포함하는 약제학적 제제는 목적한 정도의 순도를 갖는 본 발명의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합함으로써, 바람직하게는 수용액 또는 동결건조된 제제 형태로 제조할 수 있다. 예시적인 동결건조된 항체 제제는 미국 특허 제6,267,958호에 기술되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 제6,171,586호 및 제WO 2006/044908호에 기술된 것을 포함하고, 후자의 문헌은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함하는 제제를 기술한다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 제제는 특정 질환의 치료를 위해 요구된 하나 이상의 다른 활성 성분, 바람직하게는 서로에게 부정적인 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 지닌 활성 성분을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 다른 치료제를 또한 포함시키는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 다른 치료제는 화학치료제, 방사선 치료제, 사이토킨, 백신, 다른 항체, 면역조절인자 또는 다른 생물거대분자 약물이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
방법 및 용도
본 발명은 OX40-관련된 질환 또는 상태를 예방, 진단 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본원에 기술된 항-OX40 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 면역접합체 또는 면역 융합체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 투여함을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 OX40-관련된 질환 또는 상태의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제작 또는 제조 시의, 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 면역접합체 또는 면역 융합체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명에 의해 제공된 항-OX40 항체, 및 이의 항원-결합 단편, 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 OX40-관련된 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 표준 방법을 사용함으로써 확인된 대상체에서 OX40-관련된 질환의 경우, 본 발명에 개시된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 본원에 기술된 약제학적 조성물 또는 이를 포함하는 면역접합체 또는 면역 융합체, 또는 본원에 기술된 핵산, 벡터 또는 숙주 세포가 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및 용도는 또한 개체에게 유효량의 적어도 하나의 추가의 치료제 또는 과정을 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는, 예를 들면, 화학치료제, 방사선 치료제, 사이토킨, 백신, 다른 항체, 면역조절인자 또는 다른 생물거대분자 약물이다. 일부 구현예에서, 치료학적 과정은 수술; 및 방사선 치료요법, 국소 조사 또는 집중 조사(focus irradiation) 등을 포함한다.
위에서 언급한 조합 치료요법은 조합 투여(여기서 2개 이상의 치료제는 동일하거나 별개의 제제 속에 함유된다) 및 별개의 투여를 포함하고, 여기서 본 발명의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제 및/또는 과정 이전에, 이와 동시에, 또는 투여 후에 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 OX40-관련된 질환 또는 상태는 대상체 내에서 비정상적인 OX40 발현, 활성 및/또는 신호 형질도입과 관련된 질환 또는 상태, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 암, 염증 및 자가면역 질환을 지칭한다. 일부 구현예에서, OX40-관련된 질환 또는 상태에서, OX40을 암호화하는 핵산(수준 또는 함량)은 증가되거나, OX40 발현이 증가되거나, OX40의 단백질 수준 또는 활성이 증가되거나, OX40에 의해 매개된 신호 형질도입이 증가된다. 일부 다른 구현예에서, OX40-관련된 질환 또는 상태에서, OX40을 암호화하는 핵산(수준 또는 함량)은 감소되거나, OX40 발현이 감소되거나, OX40의 단백질 수준 또는 활성이 감소되거나, OX40에 의해 매개된 신호 형질도입이 감소된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 상태의 치료는 핵산 또는 단백질 수준에서 OX40을 억제하거나, 이의 리간드에 대한 OX40의 결합을 차단하거나 OX40-매개된 신호 형질도입을 억제하는 것으로부터 유리할 것이다.
일부 다른 구현예에서, 질환 또는 상태의 치료는 핵산 또는 단백질 수준에서 OX40을 증가시키는 것으로부터 유리하거나 OX40-매개된 신호 형질도입을 향상시키는 것으로부터 유리할 것이다.
일부 구현예에서, OX40-관련된 질환 또는 상태는 암이다. 특히 암은 고형 종양(solid tumor), 유방 암(breast cancer), 요로 암(urothelial cancer), 흑색종, 신장 암(kidney cancer), 난소 암(ovarian cancer), 두부 및 경부 암(head and neck cancer), 위장 암(stomach cancer), 간 암(liver cancer), 소-세포 폐암(small-cell lung cancer), 비-소 세포 폐 암(non-small cell lung cancer), 피부 암(skin cancer), 중피종(mesothelioma), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 골수종(myeloma), 전립선 암(prostate cancer), 림프성 백혈병(lymphatic leukemia) 및 육종(sarcoma)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 OX40-관련된 암을 예방, 진단 또는 치료하기 위한 항체는 OX40 효능제이다.
일부 구현예에서, OX40-관련된 질환 또는 상태는 염증 및/또는 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, OX40-관련된 염증 및/또는 자가면역 질환은 특발성 피부염(idiopathic dermatitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 천식(asthma)(예컨대, 알레르기성 천식(allergic asthma)), COPD, 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 다발 경화증(multiple sclerosis), 루푸스(lupus)(예를 들면, 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 궤양성 결장염(ulcerative colitis), 경피증(scleroderma), 및 이식체-대-숙주 질환(graft-versus-host disease; GVHD)으로부터 선택된다. 바람직하게는, OX40-관련된 염증 및/또는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 항체는 OX40 길항제이다.
일부 구현예에서, 대상체는 포유동물, 예컨대, 영장류, 바람직하게는 보다 고등인 영장류, 예컨대, 사람(예컨대, 본원에 기술된 질환을 앓거나 본원에 기술된 질환을 앓을 위험이 있는 개체)일 수 있다. 일 구현예에서, 대상체는 본원에 기술된 질환(예컨대, 암)을 앓거나 이를 앓을 위험을 갖는다. 특정의 구현예에서, 대상체는 다른 치료, 예를 들면, 화학치료요법 및/또는 방사선 치료요법을 제공받거나 제공받았다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 임의의 적합한 방식, 예를 들면, 경구, 비경구, 폐내 및 비강내 투여로 투여될 수 있고, 국소 치료가 필요한 경우, 이는 병변내로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 주사에 의해, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사에 의해, 투여가 단기간 또는 장기간인지의 여부에 부분적으로 의존하여 수행될 수 있다. 다양한 투여 요법, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 다양한 시점에서의 단일 또는 다중 투여, 거환 투여(bolus administration), 및 펄스 주입(pulse infusion)이 고려된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 양호한 의학적 실시와 일치하는 방식으로 제형화되고 투여될 것이다. 이러한 경우에 고려된 인자는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 질환의 원인, 약물의 전달 부위, 투여 방식, 투여 스케쥴, 및 숙련가에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 임의로, 항체는 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용된 하나 이상의 제제와 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제제 속에 존재하는 항체의 양, 치료될 상태, 또는 치료학적 방식, 및 상기 논의한 다른 인자에 의존한다.
질환을 예방하거나 치료하기 위하여, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편(단독으로 사용되거나 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 사용된 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적을 위한 것인지의 여부, 사전 치료, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응 및 주치의의 판단에 따라 적합한 투여량으로 투여될 것이다. 항체는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 생물학적 샘플에서 OX40의 존재를 검출할 수 있다. 본원에 사용된 경우 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정의 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 또는 생물학적 기원의 다른 액체 샘플이다. 특정의 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 고증식성 또는 암성 병변 관련된 병변으로부터 유래된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 OX40-관련된 질환 또는 상태, 예를 들면, 암을 진단하고, 예를 들면, 본원에 기술된 질환의 치료 또는 진행, 개체에서 이의 진단 및/또는 상태를 평가(예컨대, 모니터링)할 수 있다. 특정 구현예에서, 표지된 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 표지는 직접적으로 검출가능한 표지 또는 모이어티(예를 들면, 형광성 표지, 발색단 표지, 전자-밀도 표지(electron-dense label), 화학발광성 표지, 및 방사활성 표지), 및 예를 들면, 효소 반응 또는 분자간 상호작용에 의해 간접적으로 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, OX40-관련된 질환을 진단하기 위한 키트가 본원에 제공되고, 이러한 키트는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에 제공된 일부 구현예에서, 샘플은 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용한 치료 전에 수득된다. 일부 구현예에서, 샘플은 다른 치료요법을 사용한 치료 전에 수득된다. 일부 구현예에서, 샘플은 다른 치료요법 동안 또는 이를 사용한 치료 후에 수득된다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예의 임의의 조합을 포함한다. 특정 내용 및 실시예가 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내기 위해 기술되어 있지만, 이는 단지 예시적이고 예로서 사용됨이 이해될 수 있다. 본 발명은 또한 당해 분야의 숙련가에게 명백한 본 발명의 바람직한 구현예를 기반으로 변형된 구현예를 포함한다. 모든 목적을 위해, 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허원, 예를 들면, 인용구는 이의 전문이 본원에 참고로 포함될 것이다.
실시예
실시예 1 하이브리도마-유래된 항체의 제조 및 스크리닝(screening)
OX40 항체는 하이브리도마 기술로 수득하였다. Fc 태그(tag)를 지닌 사람 OX40 세포외 도메인을 함유하는 재조합 OX40-Fc 단백질(R & D, 제품 번호 3388-OX)을 항원으로서 사용하여 마우스를 면역화시켰다. 간략하게, C57BL/6 및 BALB/c 마우스를 혼합된 OX40-Fc로 면역화시키고 완전한 또는 불완전한 프루언드 보조제(complete 또는 incomplete Freund's adjuvant)(Sigma-Aldrich)로 유화시켰다. 마우스에게 1 라운드의 면역화(완전한 프루언드 보조제) 및 2 라운드의 부스터 면역화(booster immunization)(불완전한 프루언드 보조제)에 적용시키고, 혈액을 각각의 부스터 면역화 후에 수집하였다. 각각의 라운드의 부스트 후 마우스로부터 수집한 혈청의 결합 활성을 ELISA에 의해 재조합 사람 OX40-His 단백질(R & D Systems, 제품 번호 9969-OX)를 사용하여 검출하고, 사람 OX40을 과발현하는 CHO 세포(GenScript에 의해 작제됨)에 대한 혈청의 결합 활성을 유동 세포분석법(flow cytometry; FACS)으로 검출하였다. 높은 혈청 역가를 지닌 마우스를 융합을 위해 선택하였다. 융합 4일 전에, 재조합 OX40-Fc 단백질을 최종 부스터 면역화를 위해 마우스 내로 복강내 주사하였다. 주입 당일에, 마우스를 마취시킨 다음, 비장을 마우스로부터 취하고 균질화하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 마우스 비장 세포를 마우스 골수종 세포주 SP2/0 세포(ATCC로부터 입수함)와 전기융합 장치(electrofusion apparatus)의 수단으로 융합시켰다. 융합된 세포를 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 데옥시뉴클레오타이드, GIBCO, 제품번호 21060017)를 함유하는 배지 속에 재현탁시키고, 96-웰 플레이트 내로 접종하고 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 상층액 속에서 하이브리도마 세포에 의해 분비된 항체를 OX40-관련된 기능성 검정(예를 들면, 사람 OX40에 대한 결합 특이성 및 T 세포의 활성화 시 활성)에 의해 확인되었다. 양성 하이브리도마 클론을 단일 또는 다중 라운드를 위해 서브클로닝하여 모노클론을 수득하였다. 스크리닝 후, 38E11을 최적의 하이브리도마 클론(38E11에 대해 지칭되는 여기에 분비된 항체)로서 최종적으로 선택하였다.
후보물(condidate) 하이브리도마 세포 38E11을 확장된 배양물에 적용시키고, 배양 7 내지 10일 후, 상층액을 수집하고, 원심분리하고 여과하여 세포 및 부스러기를 제거하였다. 상층액을 단백질 A 정제 컬럼(Genscript)을 통과시킨 다음, 컬럼을 세척하고 0.05 M 트리스 및 1.5 M NaCl(pH 8.0)을 함유하는 완충제로 평형화시킨 다음, 0.1 M 시트르산나트륨(pH 3.5)으로 용출시키고; 용출액을 1/9의 1 M 트리스-HCl(pH 9)로 즉시 중화시킨 다음 PBS 완충제 내로 투석하였다. 최종적으로, 하이브리도마-유래된 항체 38E11을 추가의 특성화를 위해 수득하였다.
1.1 ELISA에 의한 OX40 세포외 도메인 단백질의 항체의 결합 활성의 검출
재조합 사람 OX40-His(R & D, Cat 9969-OX)를 96-웰 플레이트(96-well plate) 상에 코팅하였다. 차단 후, 일련 희석된 마우스 혈청 또는 항체를 가하고 접종하였다. 플레이트를 0.5% 트윈(Tween)20을 함유하는 PBS로 세척한 후, HRP-표지된 항-마우스 IgG 제2 항체를 접종을 위해 가하고, 플레이트(plate)를 TMD로 전개시키고, OD450 값을 미세플레이트 판독기(microplate reader)를 통해 판독하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 최종적으로 수득된 하이브리도마-유래된 항체 38E11은 사람 OX40 단백질에 대해 높은 결합 활성을 갖고, EC50은 0.276 nM이다.
1.2 FACS에 의한 활성화된 T 세포 상에서 OX40에 대한 항체의 결합 활성의 검출
1차 사람 PBMC를 피콜-플라크(Ficoll-Paque) PLUS(GE Healthcare, 제품 번호 17-1440-02)를 사용한 밀도 구배 원심분리를 통해 건강한 공여자로부터 수득한 백혈구로부터 단리하였다. 원심분리 후, 중간 층 속의 세포를 수집하고 PBS로 3회 세척하고 PBMC를 수득하였다. 이후에, 사람 T 세포를 판 T 세포 단리 키트(Pan T Cell Isolation Kit)(Miltenyi biotec, 제품 번호 130-096-535)를 사용하여 자기 비드 단리 방법에 의해 설명서가 추천한 프로토콜에 따라 단리하였다. T 세포를 RPMI 1640(10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 이중-항생제) 배지 속에 재현탁시키고, PHA-L 및 IL-2(또는 Con-A 및 hIL-2)를 2일 자극 후에 가하여 T 세포로부터 OX40의 발현을 유도하였다. 활성화된 T 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 1회 세척하고, 일련 희석된 OX40 항체를 가하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, PE-표지된 항-사람 IgG 제2 항체(Biolegend, 제품 번호 409304)(또는 PE-표지된 항-마우스 IgG 제2 항체(Biolegend, 제품 번호 405307)) 및 APC-CY7 표지된 항체 사람 CD4 항체(Biolegend, 제품 번호 300518)를 가하였다. CD4 양성 T 세포의 표면에서 OX40 항체의 결합을 BD CantoII 유동 세포분석법으로 검출하였다. 곡선을 중간 형광성 강도 값에 따라 조정하고, EC50을 계산하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 하이브리도마-유래된 항체 38E11은 사람 활성화된 T 세포 상에서 OX40에 대해 결합 활성을 갖고, EC50은 0.8 nM이다.
1.3 항체의 T-세포 효능 활성의 결정
항체의 T-세포 효능 활성을 활성화된 T 세포에 의해 방출된 사이토킨 IFNγ를 검출함으로써 평가한다. 간략하게, 1차 사람 PBMC를 건강한 공여체로부터 수득한 전혈로부터 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare, 제품 번호 17-1440-02)를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 원심분리 후, 중간 층 속의 세포를 수집하고 PBS로 3회 세척하여 PBMC를 수득하였다. 이후에, 사람 T 세포를 Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi biotec, 제품 번호 130-096-535)를 사용하여 자기 비드(magnetic bead) 단리 방법으로 설명서가 추천한 프로토콜에 따라 단리하였다. T 세포를 RPMI 1640(10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 이중-항체를 함유함) 배지 속에 재현탁시켰다. 항-CD3 항체(eBioscience, 제품 번호 16-0037-85) 및 일련 희석된 OX40 항체를 혼합한 후, 혼합물을 96-웰 플레이트에 100 μl/웰에서 가하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 결합되지 않은 항체를 PBS로 세척하여 제거하고, 단리된 T 세포를 웰에 가하였다. 상층액을 배양 3일 후에 수집하고, 상층액 속의 IFNγ의 농도를 ELISA(R & D, 제품 번호 SIF50)에 의해 설명서가 추천한 표준 검출 방법에 따라 검출하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 하이브리도마-유래된 항체 38E11은 T 세포에 의한 IFNγ 분비를 촉진하였고, EC50 값은 1.4 nM이었다.
표 1은 또한 일시적 발현에 의해 수득된 참고 항-OX40 항체 11D4 및 OX40mAb24의 기능적 활성을 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00002
실시예 2 하이브리도마-유래된 항체의 사람화
2.1 하이브리도마-유래된 항체의 가변 영역 서열의 결정
하이브리도마 시퀀싱을 위한 방법을 사용하여, 하이브리도마 클론 38E11의 세포를 확장된 배양에 적용하였다; 총 RNA를 TRIzol(Ambio로부터 시판됨)로 추출하고 DNA로 항체-특이적 프라이머(Takara, PrimerScript 제1 가닥 cDNA 합성 키트)를 사용하여 역 전사시키고; 마우스 면역글로불린 V-영역을 암호화하는 유전자 단편을 항체-특이적 프라이머로 증폭시키고 클론화하였다. 가변 영역 서열을 서열분석으로 수득하였고, 여기서 38E11의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 17에 나타나 있고, 38E11의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 18에 나타나 있다.
2.2 하이브리도마-유래된 항체의 사람화된 설계
항체 사람화를 위해, 우선, 뮤린 항체(murine antibody)의 가변 영역의 서열에 대해 고도로 상동성인 사람 배선 면역글로불린 유전자를 PDB 항체 데이타베이스에서 조사하였다. 38E11의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 사람 배선 IGHV1-46*01 및 사람 배선 IGKV4-1*01 각각과 보다 높은 서열 상동성을 갖는다. 이후에, 가변 영역의 CDR 및 이의 정밀한 경계부의 아미노산 서열은 카밧 넘버링 시스템으로 정의되어 있다. 원칙적으로, 뮤린 항체의 가변 영역과 높은 상동성을 지닌 사람 IGVH 및 IGVk를 주형으로서 선택하고 CDR 이식화(grafting)를 사람화를 위해 사용한다.
사람화된 항체에서 활성을 유지하기 위해, 가변 영역 및 주변의 골격 영역의 아미노산 서열을 또한 컴퓨터 모의 기술 및 분자 도킹(molecular docking)을 사용함으로써 분석하고, 이의 공간 3-D 빙잉 방식(binging mode)을 조사하였다. 정전기력(electrostatic force), 반 데르 바알스 힘(van der Waals force), 친수성 및 소수성, 및 엔트로피(entropy)를 계산함으로써, OX40과 상호작용할 수 있고 공간 구조를 유지할 수 있는 개개 후보물 항체 서열 내 주요 잔기(key residue)를 분석하고, 선택된 사람 항체 유전자 골격 위에 역 이식(grafting back)한다. 이를 기반으로, 보존되어야만 하는 골격 영역 내 아미노산 위치를 표시한 다음, 사람화된 항체를 합성한다. 38E11 항체의 중쇄 가변 영역 내 7개 부위를 역 돌연변이에 대해 선택하였다: V20L, M48I, R67K, M70L, R72V, V79A 및 T91S. 역 돌연변이의 번호 및 정렬에 따라서, 4개의 상이한 사람화된 중쇄 VH1(서열 번호: 2), VH2(서열 번호: 3), VH3(서열 번호: 4), 및 VH4(서열 번호: 5)을 각각 설계하였다. 38E11 항체의 경쇄 가변 영역 내 3개 부위를 역 돌연변이: M4L, V62I 및 L82V에 대해 선택하고, 4개의 상이한 사람화된 경쇄 VL1(서열 번호: 7), VL2(서열 번호: 8), VL3(서열 번호: 9), 및 VL4(서열 번호: 10)를 각각 설계하였다. 따라서, 사람화된 38E11 항체 Hu38E11 및 이의 변이체 Hu38E11-v1, Hu38E11-v2, Hu38E11-v3 및 Hu38E11-v4를 설계하고 추가로 특성화하였다. 각각의 항체 내에 포함된 아미노산 서열을 표 2 및 3에 나타낸다.
2.3 사람화된 항체의 발현
하이브리도마-유래된 항체 38E11, 또는 이의 사람화된 서열로부터 유래된 가변 영역을 증폭시키고 사람 IgG 불변 영역을 포함하는 벡터 내로 클로닝하여 발현 플라스미드를 수득하였다. 이러한 항체의 중쇄 불변 영역은 사람 IgG의 임의의 아형(예를 들면, 사람 IgG1의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 21에 제시되고, 사람 IgG2의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호: 22에 제시되어 있다.) 또는 이의 변이체로부터 유래될 수 있다. 그러나, 구체적으로 나타내지 않는 한, Hu38E11의 중쇄 불변 영역 및 이의 변이체는 사람 IgG1의 중쇄 불변 영역의 서열과 동일하였다. 293 세포를 중쇄 및 경쇄를 포함하는 발현 벡터로 공-형질감염시켰다. 37℃에서 4 내지 6일 동안 배양한 후, 상층액을 수집하고, 상술한 방법에 따라, 재조합 항체를 항체를 추가로 특성화하기 위해 단백질 A 친화도 정제로 수득하였다.
[표 2]
Figure pct00003
[표 3]
Figure pct00004
실시예 3 FACS에 의한 활성화된 T 세포에서 OX40에 대한 사람화된 항체의 결합 활성의 검출
앞서의 실시예 1.2에서 기술된 검출 방법에 따라서, FACS를 사용하여 활성화된 사람 T 세포 상에서 OX40에 대한 사람화된 항체의 결합 활성을 분석하였다.
결과: 표 4에 나타낸 바와 같이, 사람화된 항체 Hu38E11 및 이의 변이체는 활성화된 사람 T 세포의 표면에서 OX40에 대해 보다 우수할 결합 활성을 나타내었다.
[표 4]
Figure pct00005
실시예 4 사람화된 항체의 T-세포 효능 활성의 결정
앞서의 실시예 1.3에 기술된 방법에 따라, T 세포 상에서 사람화된 항체의 효능 활성을 항체의 존재하에 활성화된 T 세포에 의해 방출된 염증성 사이토킨 IFNγ을 검출함으로써 평가하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 사람화된 항체 Hu38E11 및 이의 변이체는 활성화된 T 세포를 효과적으로 촉진하여 IFNγ를 방출하는데, 즉, 사람화된 항체 Hu38E11 및 이의 변이체는 T-세포 효능 활성을 갖는다. 참고 항체 OX40mAb24와 비교하여, 사람화된 항체 Hu38E11 및 이의 변이체는 보다 낮은 EC50 값(T 세포를 촉진하여 IFNγ를 방출하는데 있어서 활성에 대한 척도)을 나타내었고, 이는 보다 유의적인 효능 활성을 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00006
실시예 5 Biacore에 의한 사람 OX40에 대한 사람화된 항체의 결합 활성의 검출
Biacore를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)을 측정함으로써 결합 역학 매개변수를 측정한다. 이러한 기술을 사용하여 항체 및 항원의 결합(ka) 및 해리(kd)의 현미경적 속도 상수를 검출하였다. ka 및 kd 값을 기반으로, 항원에 대한 항체의 친화도 값을 수득한다. Biacore 장치 및 시약은 GE Healthcare로부터 구입하였다. 특히, 항-사람 Fc 항체를 CM5 센서 칩(sensor chip) 상에 고정시켰다. 발현된 항체 또는 정제된 항체를 함유하는 상층액을 이동상 완충제(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 트윈-20, pH 7.4) 속에서 희석시키고 항-사람 Fc 항체로 코팅된 CM5 칩을 통해 유동시켰다. 이후에, 일련 희석된 사람 OX40-His 융합 단백질을 검출 칩을 통해 유동시켜 항체에 대한 항원의 결합을 측정한 다음, 이동상 완충제를 칩을 통해 유동시켜 항체로부터 항원의 해리를 검출하였다. 항원 및 항체의 결합 및 해리 신호 데이타를 상이한 농도에서 수집하고, 1:1 랭뮤어 모델(Langmuir model)에 대해 조정하여 항원과 항체 사이의 친화도를 계산하였다.
표 6에 나타낸 바와 같이, Hu38E11은 사람 OX40에 고 친화도로 결합하며, KD 값은 2.36E-09(M)이다.
[표 6]
Figure pct00007
실시예 6 T 세포에 대한 사람화된 항체 Hu38E11의 효능 활성
앞서의 실시예 1.3에 기술된 방법에 따라서, T 세포 상에서 IgG2의 항체 아형을 사용한 Hu38E11(IgG2)의 효능 활성을 T 세포에 의해 방출된 염증성 사이토킨 IFNγ를 검출함으로써 평가하였다.
결과: 도 1에 나타낸 바와 같이, 플레이트가 항체로 코팅된 조건 하에서, Hu38E11(IgG2)은 또한 T-세포 효능 활성을 나타내었고, EC50는 1.6 nM이었으며, 이는 참고 항체 11D4보다 더 낮았다(EC50 = 5.3 nM).
실시예 7 OX40L에 대한 OX40의 결합에 대한 사람화된 항체의 차단 효과
본 실험에서, ELISA 방법을 사용하여 이의 리간드 OX40L에 대한 OX40의 결합을 차단하는데 있어서 항체 Hu38E11의 활성을 측정하였다. 간략하게, OX40(R & D systems, Cat 3388-OX)을 PBS로 희석시킨 다음, 96-웰 플레이트에 가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하여 결합하지 않은 단백질을 제거한 다음, 플레이트를 1% BSA를 함유하는 PBS를 200 μl/웰에서, 실온으로 1시간 동안 가함으로써 차단시켰다. 플레이트를 0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 일련 희석된 항-OX40 항체를 96-웰 플레이트에 100 μl/웰에서 가하고, 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 0.5% 트윈-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 이후에, OX40L(R & D systems, 제품 번호 1054-OX)를 50 ng/ml의 최종 농도에서 가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 3회 세척한 후, 바이오틴-표지된 항-OX40L 항체(R & D systems, 제품 번호 BAF1054)를 가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리한 다음, 플레이트를 세척한 다음, HRP-표지된 스트렙타비딘(R & D systems, 제품 번호 DY998)을 가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하였다. 200 μl의 TMB 발색 용액을 각각의 웰에 발색을 위해 가하고, 반응을 2N H2SO4로 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기 상에서, O.D. 값을 450 nm에서 검출하고, 배경 O.D. 값을 570 nm에서 측정하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, Hu38E11(IgG1 N297A)은 OX40L에 대한 OX40의 결합을 90%의 최대 억제율로 차단시켰고, 이는 참고 항체 GBR830 및 OX40mAb24의 50%의 최대 억제율보다 더 높았다. Hu38E11(IgG1 N297A) 및 GBR830의 IC50 값은 대략 0.3 nM이었고, OX40mAb24의 IC50 값은 약 1.2 nM이었다.
실시예 8 OX40-OX40L-매개된 T 세포 활성화에 대한 사람화된 항체의 차단 효과
1차 사람 PBMC를 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare, 제품 번호 17-1440-02)를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 공여자의 전혈로부터 단리하였다. 중간 층을 수집하고 PBS로 3회 세척하여 PBMC를 수득하였다. 이후에, 1차 사람 T 세포를 판 T 세포 단리 키트(Pan T Cell Isolation Kit)(Miltenyi Biotec, 제품 번호 130-096-535)로 자기 비드를 사용하여 설명서가 추천한 방법에 따라 단리하였다. T 세포를 RPMI 1640(10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 이중-항체를 함유함) 배지 속에 재현탁시켰다. 항-CD3 항체 OKT3(eBioscience, 제품 번호 16-0037-85)을 96-웰 플레이트에 100 ul/웰에서 가하고, 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 결합하지 않은 항체를 PBS로 세척하여 제거하였다. 일련 희석된 OX40 항체를 OX40L(R & D systems, 제품 번호 1054-OX)와 664 ng/ml의 최종 농도에서 혼합하였다. 혼합물을 코팅된 96-웰 플레이트에 가하고, 단리된 T 세포를 웰에 가하고 3일 동안 배양한 다음, 상층액을 수집하였다. 상층액 속의 IFNγ의 농도를 ELISA(R & D, 제품 번호 SIF50)로 설명서가 추천한 표준 검출 방법에 따라 검출하였다.
OX40L-OX40 상호작용을 차단하는 Hu38E11(IgG1 N297A)의 기능성 실험에서: 플레이트를 항-CD3 항체로 코팅하고, OX40의 음성 리간드로서 OX40L을 가하여 T 세포를 자극시키고, 동시에, 유리된 항-OX40 항체를 배양 시스템에 가하여 OX40에 대한 OX40L의 결합에 의해 유도된 기능에서 항체의 차단 효과를 검출하였다. 플레이트는 항-OX40 항체로 코팅되지 않았으므로, 항-OX40 항체 분자는 T 세포를 자극시켜 가교-결합의 부재하에서 IFNγ를 분비할 수 없다. 또한, 항-OX40 항체는 세포 표면에서 OX40에 결합하여 OX40에 대한 OX40L의 결합을 차단함으로써, T 세포에 의한 IFNγ의 OX40L-유도된 분비를 억제하였다.
도 3에 나타낸 결과에 따라서, 항체 Hu38E11(IgG1 N297A)은 보다 높은 농도에서 OX40L에 의해 자극된 IFNγ의 분비를 억제할 수 있었고, 이는 OX40L에 의한 T 세포 활성화에서 항체의 차단 효과를 나타낸다. GBR830과 비교하여, Hu38E11(IgG1 N297A)은 OX40L-매개된 T 세포 활성화를 차단하는 보다 강력한 활성을 가졌고, 보다 낮은 IC50 값(Hu38E11(IgG1 N297A)에 대해 0.3 nM, 및 GBR830에 대해 1.1 nM)을 가졌다.
실시예 9 T-세포 효능 활성에 대한 사람화된 항체의 Fc 영역의 효과
상이한 Fc 영역을 지닌 Hu38E11의 T-세포 효능 활성을 루시퍼라제 리포터 유전자 검정에서 NF-κB-매개된 전사 활성화에서 항체의 효과를 촉진하는 것을 측정함으로써 평가할 수 있다. 사람 OX40을 과발현하고 NF-κB 신호전달의 제어 하에 루시퍼라제 리포터 유전자(Luc)를 갖는 재조합 저켓 세포(Jurkat cell)(Jurkat-OX40-NF-κB-Luc; Chempartner로부터 구입함)을 작제하였다. 항-CD3 항체(eBioscience, 제품 번호 16-0037-85)를 96-웰 플레이트에 100 μl/웰에서 가하고, 플레이트를 밤새 4℃에서 코팅하였다. 결합하지 않는 항체를 PBS로 세척함으로써 제거하였다. 이후에, 저켓-OX40-NF-κB-Luc 세포 및 라지 세포(Raji cell)를 1:1의 비에서 혼합한 다음 코팅된 96-웰 플레이트에 가한 다음, 일련 희석된 Hu38E11(IgG1), Hu38E11(IgG1 N297A) 또는 hIgG1을 가하였다. 5시간의 항온처리 후, 루시퍼라제 발현의 상대적인 양을 Steady-Glo(Promega) 검출 시약으로 검출하였다.
본 실험에서, Hu38E11(IgG1)은 라지 세포의 표면에서 FcγR 수용체를 통해 가교-결합함으로써 OX40의 하부 신호전달(downstream signaling)을 개시하였다. 이는 NF-κB의 제어 하에서 리포터 유전자의 발현을 유발하였다(EC50 = 0.70 nM). 대조적으로, N297A 돌연변이로 인하여, Hu38E11(IgG1 N297A)은 FcγR 수용체에 결합할 수 없고 가교-결합할 수 없었으므로, OX40의 하부 신호전달을 활성화시키는데 실패하였다. 또한, 라지 세포의 표면 상에 과발현된 OX40L에 대한 OX40의 결합을 차단함으로써, 항체는 NF-κB의 제어 하에서 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현에 있어서 유의적인 억제 효과를 나타내었다(IC50 = 0.20 nM)(도 4에 나타낸 바와 같음).
실시예 10 B16F10 피하 이종이식체 종양 모델에서의 사람화된 항체 Hu38E11의 항-종양 활성
본 발명의 항체의 항-종양 활성을 연구하기 위하여, B16-F10 피하 종양 모델을 사람 OX40을 발현하는 C57BL/6-Tnfrsf4em1Clin(hTBFRSF4) 유전자이식 마우스에서 확립하였다.
마우스 흑색종 세포 B16-F10(ATCC® CRL-6475TM)를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지 속에서 배양하였다. 종양 세포를 RPMI1640 속에 현탁시키고 암컷 유전자이식 마우스(Jiangsu GemPharmatech Biotechnology Co., Ltd.)의 우측 옆구리에 1 Х 105개의 세포/마우스의 용량에서 피하 이식하였다.
종양 세포 접종 당일(1일째)에, 마우스를 이의 체중에 따라 3개 그룹: 제1 그룹(h-IgG2)에서 12마리의 마우스, 제2 그룹(11D4 (IgG2))에서 13마리의 마우스, 및 제3 그룹(Hu38E11 (IgG2))에서 13마리의 마우스로 나누었다. 항체를 DPBS로 희석시키고, 단일 복강내 주사에 의해 10 mg/kg의 용량에서 투여하였다. 종양 용적(종양 용적 = 0.5 Х 긴 직경 Х 짧은 직경2), 및 마우스의 체중을 정규적으로 측정하였다. 투여 후 15일째 및 16일째에 항체의 종양 억제율을 계산하였다.
종양 억제율을 계산하기 위한 식은 다음과 같다: [(대조군 그룹 내 종양 용적 - 처리 그룹 내 종양 용적)/대조군 그룹 내 종양 용적] Х 100%. 마우스의 상대적인 체중을 계산하기 위한 식은 다음과 같다: (측정 당일에 마우스의 중량/그룹화 시기에 마우스의 중량) Х 100%.
결과: 10 mg/kg의 용량에서, 11D4(참고 항체) 및 Hu38E11(IgG2, 본 발명의 항체)는 각각 33.2% 및 48.1%의 종양 성장 억제율을 나타내었다. 또한, 연구 과정 동안에, 각각의 그룹내 마우스의 중량은 급격하게 증가하였고 비정상적인 거동은 관찰되지 않았으며, 이는 항체가 모든 동물에 의해 잘-견디어졌음을 나타낸다.
실시예 11 사람화된 항체 Hu38E11(IgG1 N297A)의 항-면역 거부 활성
이식체-대-숙주 질환(GVHD) 모델을 건강한 자원자로부터의 사람 1차 말초 혈액 단핵 세포(hPBMC)를 면역결핍성 NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju (NCG) 마우스 내로 이식함으로써 확립하고, 본 발명의 항체의 항-면역 거부 활성을 연구하는데 사용하였다.
1차 사람 PBMC를 피콜-파크(Ficoll-Paque)를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 공여자로부터 수득한 전혈로부터 단리하였고, PBMC를 PBS에 현탁시켰다.
PBMC 이식 전일(-1일째)에, 마우스를 이의 체중에 따라 7개 그룹으로 무작위로 나누었다. 그룹은 표 7에 나타내었다. 이식 당일(0일째)에, 모든 마우스에게 137Cs γ 선으로 1.5 Gy TBI의 단일 선량(전체 신체 조사)에서 조사한 다음, PBS로 희석시킨 항체 Hu38E11(IgG1 N297A) 및 GBR830를 꼬리를 통해 매주 정맥내로 1 mg/kg이 용량 및 5 mL/kg의 용적에서 제공하고, 최종적으로 마우스에게 PBMC의 단일 주사를 2.5 Х 107개의 세포/mL에 대해 0.2 mL/마우스에서 꼬리 정맥에 제공하였다. 마우스의 생존을 매일 모니터링하고, 마우스의 체중을 정규적으로 측정하였다. 안락사를 위한 종점은 상대적인 체중 손실이 20%까지에 도달하는 때이었고 생존 시간을 기록하였다.
마우스의 상대적인 중량을 계산하기 위한 식은 다음과 같다: (측정 당일에 마우스의 중량/그룹화 시기에 마우스의 중량) Х 100%.
[표 7]
Figure pct00008
실험 결과는 도 5에 나타낸다. 본 실험에서, 모델 대조군 그룹(hPBMC+ hIgG1 그룹)으로부터의 모든 마우스는 48일째에 죽었고, 중간 생존 시간은 32.5일이었고; 본 발명의 항체 Hu38E11(IgG1 N297A)를 1 mg/kg에서 처리한 모든 마우스는 실험중 64일까지 생존하였고, 중간 생존 시간은 계산될 수 없었고, 모델 대조군 그룹(hPBMC+ hIgG1 그룹)과 비교하여 유의적인 차이가 존재하였다(**: p < 0.01). 양성 대조군 항체 GBR830를 1 mg/kg에서 처리한 마우스의 생존율은 실험 64일째에 66.7%이었고, 중간 생존 시간을 계산될 수 없었고, 모델 대조군 그룹과 비교하여 통계적인 차이는 존재하지 않았다.
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> HUTCHISON MEDIPHARMA LIMITED <120> ANTI-OX40 ANTIBODY AND USES THEREOF <130> PF210196PCT <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Gly Thr Trp 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Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 111 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 9 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Ser 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 10 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Ser 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 11 Ser Tyr Trp Val Asp 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 12 Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 13 Ser Tyr Gly Tyr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Ser Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic 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Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys 225 230 235 240 Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys 275 280 285 Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Thr 290 295 300 Ala Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr 305 310 315 320 Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly 325 330 335 Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly 340 345 350 Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys 355 360 <210> 19 <211> 333 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 19 Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Ala Gly Gly Gly 35 40 45 Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Ala Thr 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Gly Thr Thr Cys Thr 85 90 95 Gly Gly Cys Ala Ala Thr Ala Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys 100 105 110 Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys 130 135 140 Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys 145 150 155 160 Gly Thr Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys 180 185 190 Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly 195 200 205 Gly Gly Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr 210 215 220 Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Thr 225 230 235 240 Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly 245 250 255 Ala Thr Gly Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Thr 275 280 285 Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr 290 295 300 Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala 305 310 315 320 Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala 325 330 <210> 20 <211> 333 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 20 Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 50 55 60 Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys 85 90 95 Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys 100 105 110 Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr 130 135 140 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala 145 150 155 160 Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala 165 170 175 Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys 180 185 190 Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly 195 200 205 Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr 210 215 220 Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly 245 250 255 Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala 260 265 270 Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys 275 280 285 Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr 290 295 300 Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala 305 310 315 320 Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly 325 330 <210> 21 <211> 330 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 21 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 22 <211> 326 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 22 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

Claims (16)

  1. (1) 중쇄 상보성 결정 영역(heavy chain complementary determining region; HCDR), HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로서, 여기서 HCDR1은 서열 번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열 번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열 번호: 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 상보성 결정 영역;
    (2) 경쇄 상보성 결정 영역(light chain complementary determining region; LCDR), LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로서, 여기서 LCDR1은 서열 번호: 14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열 번호: 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열 번호: 16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 상보성 결정 영역; 및
    （3）사람 IgG1 N297A인 Fc 영역 변이체를 포함하는, 단리된 항-OX40 항체.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 단리된 항-OX4 항체로서, 여기서 VH는 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-OX4 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전장 항체(full-length antibody)인, 단리된 항-OX4 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 OX40에 대한 결합 친화도(binding affinity; KD)가 10 nM 미만인, 단리된 항-OX4 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, OX40 항체 길항제(antagonist)이고 OX40-매개된 신호 형질도입(OX40-mediated signal transduction)을 차단하는 활성을 갖는, 단리된 항-OX4 항체.
  6. 제5항에 있어서, FcγR에 대한 Fc 영역 변이체의 결합이 감소 또는 제거되는, 단리된 항-OX4 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-OX4 항체를 암호화(encoding)하는 단리된 핵산.
  8. 제7항에 따른 하나 이상의 핵산을 포함하는, 재조합 벡터(recombinant vector) 또는 발현 벡터로서, 여기서 벡터가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-OX4 항체의 재조합 생산에 적합한, 재조합 벡터 또는 발현 벡터.
  9. 제8항에 따른 하나 이상의 재조합 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-OX4 항체를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate) 또는 면역 융합체(immuno fusion).
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-OX4 항체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포, 또는 제10항에 따른 면역접합체 또는 면역 융합체를 포함하고, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제(excipient)를 임의로 포함하는 약제학적 조성물.
  12. OX40-관련된 질환 또는 상태(condition)를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조 시의, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-OX4 항체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포, 또는 제10항에 따른 면역접합체 또는 면역 융합체의 용도.
  13. 제11항에 있어서, OX40-관련된 질환 또는 상태가 염증(inflammation) 및/또는 자가면역 질환(autoimmune disease), 예를 들면, 이식체-대-숙주 질환(graft-versus-host disease)인, 용도.
  14. 대상체(subject)에게 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-OX4 항체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포, 또는 제10항에 따른 면역접합체 또는 면역 융합체를 투여함을 포함하여, OX40-관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, OX40-관련된 질환 또는 상태가 염증 및/또는 자가면역 질환, 예를 들면, 이식체-대-숙주 질환인, 방법.
  16. (a) 샘플을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항-OX4 항체 또는 제10항에 따른 면역접합체 또는 면역 융합체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 단리된 항-OX4 항체 또는 면역접합체 또는 면역 융합체와 OX40 단백질의 복합체(complex)의 형성을 검출하는 단계를 포함하여, 샘플에서 OX40을 검출하는 방법.
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