KR20230011417A - 글리코실화된 Fc 도메인을 포함하는 단백질의 부위 특이적 컨쥬게이션을 위한 방법 - Google Patents

글리코실화된 Fc 도메인을 포함하는 단백질의 부위 특이적 컨쥬게이션을 위한 방법 Download PDF

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바딤 더킨
샬롬 골드버그
마이클 제이. 맥컬리
크리스틴 와일리
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본원에서는 트랜스글루타미나제에 의한 글리칸 무손상 항체의 부위 특이적 컨쥬게이션 방법을 제공한다. 특정 실시형태에 따르면, 반응 조건은, 항체 탈글리코실화를 필요로 하지 않고 효율적이고 빠른 컨쥬게이션을 가능하게 하는 저이온 강도 조건으로 유지되거나 감소된다. 또한 컨쥬게이션 방법과 관련된 약학 조성물 및 용도가 기재되어 있다.

Description

글리코실화된 Fc 도메인을 포함하는 단백질의 부위 특이적 컨쥬게이션을 위한 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 2020년 5월 20일자로 출원된 미국 임시 출원 제63/027,400호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2021년 4월 27일자로 생성된 ASCII 사본의 명칭은 JBI6303WOPCT1_SL.txt이며, 이의 크기는 12,288바이트이다.
기술분야
본 발명은 더 나은 제조 및 생체 내 특성을 갖는 최적화된 항체-약물-컨쥬게이트(ADC)의 생성을 위한 최적화된 완충액 조건 하에서 트랜스글루타미나제에 의한 글리칸 무손상 항체의 부위 특이적 컨쥬게이션 방법에 관한 것이다.
모노클론 항체(mAb)와 같은 큰 단백질의 특정 부위에 분자를 공유 결합하는 것은 중요성이 증가하고 있는 기술이다. 항체-약물 컨쥬게이트와 같은 부위 특이적 컨쥬게이션을 이용하는 치료 플랫폼은 점점 더 많은 임상 개발에 진입하고 있다. 결과적으로, 기존 접근 방식을 보완하거나 대체하는 새로운 방법은 큰 가치가 있다.
기술된 부위 특이적 컨쥬게이션에 대한 한 가지 접근법은 트랜스글루타미나제(TGase) 효소를 사용한다. 트랜스글루타미나제는 미생물 및 고등 유기체를 대표하는 효소의 큰 부류이다(문헌[Savoca et al., Micromachines (2018) 9(11): 562]). 이 효소는 리신의 ε-아미노기와 단백질의 글루타민 측쇄의 γ-카르복스아미드기 사이의 공유 결합 형성을 촉매하여 이소펩티드 결합을 생성한다. TGase는 혈액 응고, 세포외 매트릭스 조립 및 포자 형성을 포함한 여러 생물학적 과정에서 역할을 한다. 고유한 기능 외에도 일부 TGase는 각각 글루타민 또는 리신 측쇄 대신에 다른 아미드 또는 아민을 사용할 수 있으므로 소분자 기질의 단백질에 대한 공유 컨쥬게이션을 촉매할 수 있다. 예를 들어, 이들은 약물의 1차 아민을 단백질 또는 펩티드의 글루타민 잔기의 측쇄 카르복시아미드기에 컨쥬게이트하고 약물과 단백질 또는 펩티드 사이에 이소펩티드 결합을 형성할 수 있다.
S. 모바렌시스의 미생물 TGase(MTG)는 단백질 측쇄에 대한 소분자의 공유 컨쥬게이션에 특히 유용한 것으로 입증되었다.단백질의 글루타민 측쇄와의 컨쥬게이션을 위해 아민-변형된 PEG를 사용하여, 또는 단백질의 리신 측쇄에 컨쥬게이션을 위해 Gln 함유 다이펩티드로 변형된 PEG를 사용하여, MTG는 재조합 인간 IL2(문헌[Sato, Advanced drug delivery reviews (2002), 54(4):487-504]), 인터페론(문헌[Spolaore et al., Bioconjugate chemistry (2016), 27(11): 2695-2706]), 및 인간 성장 호르몬(문헌[Mero et al., J Control Release (2011), 154(1): 27-34])을 포함한 다양한 단백질에 PEG를 추가하는 것을 촉매하는 것으로 나타났다. 각각의 경우에, PEG는 Gln 또는 Lys 측쇄 중 하나 또는 작은 하위 집합에 선택적으로 추가되었다.S. 모바렌시스 미생물 TGase(MTG)의 기질 특이성은 잘 알려져 있지 않지만, 여러 연구에서 글루타민 기질에 대한 어느 정도의 서열 선택성(문헌[Sugimura et al., Arch Biochem Biophys (2008), 477(2):379-383])과 2차 구조에 대한 어느 정도의 의존성을 보여주었다(문헌[Spolaore et al., Biochemistry (2012), 51(43): 8679-8689]). 현재 MTG가 특정 단백질의 선택적 컨쥬게이션에 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 일반적으로 경험적 접근법이 사용된다.
MTG는 특정 부위에서 단일 클론 항체에 소분자를 선택적으로 컨쥬게이트하는 데 사용되었다. mAb의 Gln 측쇄에 대한 아민 함유 페이로드(payload)의 컨쥬게이션에 대해 두 가지 다른 접근 방식이 입증되었으며, 하나는 태깅 접근 방식이고 두 번째는 특정 Gln 잔기가 특정 조건 하에서 좋은 MTG 기질이 될 수 있다는 우연한 발견을 사용하는 것이다. Gln 함유 페이로드를 리신 측쇄에 컨쥬게이션하기 위한 태그 기반 접근 방식도 설명되었다.
Jeger 등은, 방사성면역컨쥬게이트를 제조하는 과정에서, Asn297에서 N-연결된 글리칸이 손상되지 않은 경우보다 MTG를 사용한 mAb의 변형 속도가 탈글리코실화된 항체에서 훨씬 더 빠르고(문헌[Jeger et al., Angewandte Chemie (2010), 49(51): 9995-9997]) 변형은 mAb의 특정 Gln 부위에 매우 특이적이었다는 것을 입증하였다. 컨쥬게이션 부위는 모든 인간 IgG 이소타입에 걸쳐 보존되고 글리코실화 부위로부터 상류에 있는 2개의 잔기인 CH2 도메인의 위치인 Gln295인 것으로 결정되었다. Gln295에 대한 MTG-촉매 컨쥬게이션에 이은 탈글리코실화는 이후 항체-방사성 컨쥬게이트, 항체-약물 컨쥬게이트 및 기타 분자를 제조하기 위한 전통적인 접근 방식이 되었다. MTG 기반 컨쥬게이션 방법에는 항체 공학이 필요하지 않지만 이 접근 방식의 컨쥬게이션은 Asn297에서 글리칸의 제거를 필요로 한다. Asn297에서 글리칸의 제거는 Fc 수용체에 대한 결합이 제거됨에 따라 항체의 면역학적 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났고, 글리칸 제거 후 최대 7 내지 8℃의 CH2 도메인 용융 온도 감소와 함께 열 안정성 감소가 관찰됨에 따라 항체의 생물물리학적 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
트랜스글루타미나제와 부위 선택적 mAb 컨쥬게이션을 위한 태그 기반 방법도 입증되었다.mAb의 특정 위치에 "Q-태그"(LLQG와 같은 짧은 Gln 함유 펩티드)를 추가하거나 삽입하면 탈글리코실화 없이 태그에서 선택적 컨쥬게이션이 허용되는 것으로 나타났다(문헌[Strop et al., Chem Biol (2013), 20(2):161-167]). 바람직한 접근 방식은 외인성 펩티드 서열의 첨가를 통해 mAb 경쇄 및 중쇄의 C-말단에 Q-태그를 도입하는 것이었다. c-myc 태그를 사용하여 유사한 접근 방식이 설명되었다(문헌[Dennler et al., Chembiochem (2015), 16(5):861-867]).
부위-특이적 컨쥬게이션은 항체-약물 컨쥬게이트(ADC) 분야에서 핵심 초점 영역이 되었는데(문헌[Agarwal, P. and C.R. Bertozzi, Bioconjug Chem, (2015), 26(2): 176-92]), ADC의 효능과 안전성은 랜덤 컨쥬게이션에 비해 부위 특이적 방법으로 증가될 수 있음이 입증되었기 때문이다.
그러나, 컨쥬게이트된 항체의 면역학적 및 생물물리학적 특성을 보존할 항체의 부위 특이적 컨쥬게이션의 효율적인 방법, 예를 들어 N-연결된 글리칸을 보존하고 Gln-함유 펩티드 태그를 도입하지 않는 방법이 안전하고 효과적인 ADC를 생성하기 위해서는 여전히 필요하다.
항체 탈글리코실화에 대한 필요가 없는 항체의 부위 특이적 컨쥬게이션을 위한 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리코실화된 또는 글리칸 무손상 항체 또는 Fc 융합 단백질을 아민 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 컨쥬게이트된 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 글리코실화된 항체의 컨쥬게이션 방법이 본원에 제공된다. 방법의 한 실시형태는 글리칸의 존재에도 불구하고 항체와 1차 아민의 반응을 가능하게 하는 저이온 강도 조건 하에 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리칸 온전한 항체를 1차 아민 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 글리코실화된다. 특정 실시형태에서 항체는 Asn297에서 글리코실화된다. 본 개시내용은 저이온 강도 완충 조건이 글리코실화된 항체의 컨쥬게이션을 허용하고 전통적인 컨쥬게이션 방법에서 요구되는 예비 탈글리코실화 단계를 필요로 하지 않는다는 발견에 기초한다.
방법의 실시형태는 아민 화합물과 반응하기 전에 트랜스글루타미나제 제제 및/또는 항체 제제의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 트랜스글루타미나제 제제 및/또는 항체 제제를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 이 추가 단계는 항체 및/또는 미생물 트랜스글루타미나제 제제가 높은 이온 강도의 완충액에 제공되거나 트랜스글루타민화 반응 속도에 영향을 미칠, 원치 않는 첨가제를 포함하는 경우에 바람직하다.
특정 실시형태에서, 저이온 강도 조건은 10 mM 이하의 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 아세테이트, 또는 Tris 완충액을 포함한다. 또 다른 양태에서, 수득된 컨쥬게이트된 항체의 표지화도(DOL)는 적어도 1.8이다. 일부 실시형태에서, DOL은 2이다.
전술한 요약뿐만 아니라 본 발명의 하기의 상세한 설명도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1은 상이한 반응 완충액 조성물에서 무손상 및 탈글리코실화된 트라스투주맙으로의 3-APA의 MTG-촉매 컨쥬게이션 비율을 도시한다. 중쇄당 표지화도(DOL)는 시간의 함수로 도시된다.
도 2a는 글리칸 온전한 트라스투주맙의 펩티드 맵핑을 도시한다. 트라스투주맙을 트립신으로 분해하고 펩티드를 LC-MS로 분석하였다. Gln295 글리코실화 Gln295를 함유하는 HC 펩티드 289-317에 상응하는 피크는 28.65분의 체류 시간을 나타낸다.
도 2b는 무손상 mAb에서 Gln295 아미노산을 함유하는 피크를 강조하는 25 내지 35분의 LC 추적의 확대된 버전을 도시한다.
도 2c는 3-APA로 변형된 글리칸 무손상 트라스투주맙의 펩티드 맵핑을 도시한다. 3-APA 첨가 부위는 트립신 분해에 이어 LC-MS 분석에 의해 결정되었다. 온전한 샘플에서 관찰된 글리코실화 부위 Gln295(체류 시간 28.65분)를 포함하는 HC 펩티드 289-317에 상응하는 피크는 아지드 컨쥬게이트된 샘플에는 존재하지 않으며 Gln295 위치에서 +83 Da 변형이 있는 HC 289-317에 상응하는 펩티드로 대체된다(체류 시간 30.3분).
도 2d는 아지드 컨쥬게이트된 항체에서 Gln295 아미노산을 함유하는 피크를 강조하는 25 내지 35분의 LC 추적의 확대된 버전을 도시한다.
도 3a는 저이온 강도 방법에 의해 생성된 아지드-컨쥬게이트된 트라스투주맙(글리코실화된 트라스투주맙-3APA) 및 탈글리코실화 방법에 의해 생성된 아지드-컨쥬게이트된 트라스투주맙과 비교한 무손상 트라스투주맙(글리코실화된 트라스투주맙)의 녹는점을 도시한다.
도 3b는 저이온 강도 방법에 의해 생성된 아지드-컨쥬게이트된 트라스투주맙(글리코실화된 트라스투주맙-3APA) 및 탈글리코실화 방법에 의해 생성된 아지드-컨쥬게이트된 트라스투주맙과 비교한 무손상 트라스투주맙(글리코실화된 트라스투주맙)의 응집 온도를 도시한다.
도 4는 확립된 트랜스글루타미나제 방법을 통해 또는 글리칸 무손상 mAb를 사용하는 저염 반응 조건 하에 탈글리코실화된 트라스투주맙으로 생성된 트라스투주맙-Val-Cit-MMAF(T-vcMMAF) 약물 컨쥬게이트의 세포 사멸 활성을 비교한다. SK-BR3 세포를 다양한 농도의 컨쥬게이트로 72시간 동안 처리하고, 세포 사멸을 Cell Titer Glo 분석으로 결정하였다.
다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 장치, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술의 일부를 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본 명세서 전체에 걸쳐 항체 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 따른다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌(특허 출원, 특허, 또는 특허 공개 포함)은 각각의 개별적인 특허 공개 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
용어
본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이고 제한하려는 의도가 아닌 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 관계된 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본원에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "세포(a cell)"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
본 명세서 및 후술되는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥 상 달리 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하지만, 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지는 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "구비하는"으로 치환될 수 있거나, 경우에 따라서는 본원에 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
이행 용어 "포함하는", "~로 본질적으로 이루어진", 및 "~로 이루어진"은 특허 용어에서 그들의 일반적으로 허용되는 의미를 함축하는 것으로 의도되며; 즉, (i) "~을 비롯하여", "함유하는" 또는 "~를 특징으로 하는"과 동의어인 "포함하는"은 포괄적이며 개방적으로, 추가의 언급되지 않는 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않고; (ii) "~로 이루어진"은 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제하고; (iii) "~로 본질적으로 이루어진"은 명시된 재료 또는 단계, 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들"로 청구범위의 범주를 제한한다. "포함하는"(또는 이의 등가물)이라는 구절의 관점에서 기재된 실시형태는 또한 "~로 이루어진" 및 "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 관점에서 독립적으로 기재된 것들을 실시형태로 제공한다.
본원에서 사용될 때, "~로 이루어진"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 구성성분을 배제한다. 본원에서 사용될 때, "~로 본질적으로 이루어진"은 청구항의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 양태 또는 실시형태와 관련하여 본원에 사용되는 모든 경우에, 임의의 전술한 용어 "포함하는", "함유하는", "구비하는" 및 "갖는"은 본 발명의 범주를 변동시키기 위해 용어 "~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"으로 대체될 수 있다.
본원에 사용되는, 다수의 언급된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 선택지 및 조합된 선택지를 둘 다 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 제1 선택지는 제2 요소 없이 제1 요소가 적용가능함을 지칭한다. 제2 선택지는 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제3 선택지는 제1 요소와 제2 요소가 함께 적용가능함을 지칭한다. 이들 선택지 중 어느 것이든 하나는 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 선택지 중 하나 초과의 동시 적용가능성 또한 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
"항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 도메인"은 항원에 결합하는 단백질의 일부를 지칭한다. 항원-결합 단편은 합성이거나, 효소적으로 얻을 수 있거나, 유전자 조작된 폴리펩티드일 수 있으며, 항원에 결합하는 면역글로불린의 부분, 예컨대 VH, VL, VH 및 VL, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 Fv 단편, 1개의 VH 도메인 또는 1개의 VL 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb), 상어 가변 IgNAR 도메인, 낙타화(camelized) VH 도메인, VHH 도메인, 항체의 CDR을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위, 예컨대 FR3-CDR3-FR4 부분, HCDR1, HCDR2, 및/또는 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 및/또는 LCDR3, 항원에 결합하는 대안적인 스캐폴드, 및 항원-결합 단편을 포함하는 다중특이적 단백질을 포함한다. 항원 결합 단편(예컨대 VH 및 VL)은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 다양한 유형의 단일 항체 디자인을 형성할 수 있으며, 여기서 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일 사슬 Fv(scFv) 또는 다이아바디(diabody)를 형성하기 위해, VH/VL 도메인은 분자내에, 또는 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일 사슬에 의해 발현되는 경우에는 분자간에 쌍을 이룰 수 있다. 항원 결합 단편은 또한, 단일특이적 또는 다중특이적일 수 있는 다른 항체, 단백질, 항원 결합 단편, 또는 대안적인 지지체에 컨쥬게이트되어, 이중특이적 단백질 및 다중특이적 단백질을 조작할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편, 예컨대 다이아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 다이설파이드 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv(dsFv-dsFv'), 다이설파이드 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 항체 분자(scFv), 단일 도메인 항체(sdab), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 다중특이적 항체, 낙타화 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모 항체 또는 모 항체 단편과 동일한 항원에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "단일쇄 항체"는 당업계에서의 통상적인 단일쇄 항체를 지칭하는 것으로, 이것은 약 15 내지 약 20개의 아미노산의 짧은 펩티드에 의해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "단일 도메인 항체"는 당업계에서의 통상적인 단일 도메인 항체를 지칭하는 것으로, 이것은 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하거나, 또는 단지 중쇄 가변 영역만을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 넓은 의미로 사용되며, 다중클론 항체, 단일클론 항체, 예를 들어 쥣과, 인간, 인간-적응화, 인간화, 및 키메라 단일클론 항체, 및 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다.
일반적으로, 항체는 본 명세서에서 "표적"으로 지칭되는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 잘 알려져 있다. 무손상 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]참조(모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함됨). 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지(hinge), CH2, 및 CH3으로 이루어짐)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이 산재된(interspersed) 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노 말단 → 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR 분절로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 부류, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로 지정될 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2개의 분명하게 별도인 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 지정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명의 항체는 마우스 항체 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 4개의 IgG 하위부류 각각은 이펙터 기능으로 알려진 상이한 생물학적 기능을 갖는다. 이들 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 수용체(FcγR)와의 상호작용을 통해 또는 C1q 결합 및 보체 결합에 의해 매개된다. FcγR에 대한 결합은 항체 의존성 세포 매개 세포용해로 이어질 수 있으며, 한편 보체 인자에 대한 결합은 보체 매개 세포 용해로 이어질 수 있다. 본 발명에 유용한 항체는 이펙터 기능을 갖지 않거나 최소한으로 가질 수 있지만, FcRn에 결합하는 그의 능력을 보유할 수 있다. "전장 항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC), 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)로 이루어진다.
용어 "Fc 융합 단백질"은 C- 또는 N-말단 융합에 의해 관심 단백질 또는 펩티드에 연결된 적어도 하나의 Fc 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 Fc 융합 단백질의 Fc 폴리펩티드는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "조작된 항체"는 적어도 하나의 조작된 불변 영역, 예를 들어 조작된 Fc 영역, 조작된 Cκ 영역 및/또는 조작된 Cλ 영역을 포함하는 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 조작된 항체는 하나 이상의 돌연변이, 하나 이상의 아미노산 잔기 결실 또는 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
용어 "글리칸"은 다당류 또는 올리고당을 지칭한다. 글리칸은 또한 항체와 같은 글리코컨쥬게이트의 탄수화물 부분을 지칭하는 데 사용된다. O- 및 N-연결 글리칸은 진핵생물에서 매우 일반적이다. N-연결된 글리칸은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열에서 아스파라긴의 R-기 질소(N)에 부착되어 발견되며, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.
용어 "엑소-글리코시다제" 또는 "엑소글리코시다제"는 글리칸 구조의 말단 글리코시드 결합을 가수분해할 수 있는 효소를 지칭한다. 적합한 엑소-글리코시다제의 예는 시알리다제, 갈락토시다제, 알파-푸코시다제, 알파-마노시다제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "엔도-글리코시다제" 또는 "엔도글리코시다제"는 글리칸 구조의 말단 잔기가 아닌 잔기 사이의 글리코시드 결합을 가수분해할 수 있는 효소를 지칭한다. 엔도-글리코시다제는 전체 글리칸의 내부 부위에서 무작위로 글리칸 결합을 가수분해한다. 예에는 엔도-H, 엔도-F3, 엔도-F2 및 엔도-F1이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
용어 "탈글리코실화된 항체"는 N297의 글리칸 기가 제거되어 Q295가 트랜스글루타미나제와 컨쥬게이션되도록 개방된 항체를 지칭한다. 당업계에 알려진 전통적인 컨쥬게이션 방법은 트랜스글루타미나제와의 컨쥬게이션 전에 N297에서 글리칸을 제거하기 위한 이러한 탈글리코실화 과정을 포함하는 방법을 제공한다. "글리코실화된 항체" 또는 "글리코실화된 Fc 융합 단백질"은 각각 위치 N297에 N-연결된 글리칸 및/또는 다른 잔기를 갖는 항체 또는 Fc 융합 단백질을 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "항체 글리칸"은 단일클론 항체 중쇄의 Fc 영역 내의 위치 Asn297에 있는 N-연결 글리칸을 지칭한다.
용어 "글리칸 무손상 항체" 또는 "무손상 항체" 또는 "천연 항체"는 무손상 글리칸 함량을 포함하고 그 글리칸 함량이 천연 항체와 비교하여 변하지 않은 항체 분자를 지칭한다. 글리칸 무손상 항체는 글리칸이 엔도 또는 엑소-글리코시다제(PNGase F 또는 엔도 F와 같지만 이에 제한되지 않음)에 의해 가수분해되지 않은 항체, 또는 글리칸 조작에 의해 변형되지 않은 항체(즉, 글리칸을 환원시키거나 글리칸에 천연 또는 비천연 당을 첨가함으로써 "글리칸 조작"되지 않은 항체)이다. 글리칸 무손상 항체에서 이종 N-연결된 글리칸은 단일클론 항체 중쇄의 Fc 영역의 CH2 도메인의 위치 297(N297)에서 아스파라긴에 부착된다.
IgG의 Fc 영역은 아스파라긴(Asn) 297의 단일 보존 글리코실화 부위에 부착된 2개의 글리칸(중쇄당 하나씩)을 포함한다. 각 글리칸은 체액성 면역을 미세 조정할 수 있는 기회를 제공하는 다양성인 30가지 이상의 다른 형태를 취할 수 있다. 글리칸은 말단 갈락토스의 수 0, 1 또는 2에 따라 각각 G0, G1, G2의 3가지 주요 부류가 있다. 말단 갈락토스 외에 코어 푸코스를 포함하는 복합 올리고당은 G0F, G1F 및 G2F로 설명된다(예를 들어, G2F는 2개의 말단 갈락토스 및 코어 푸코스를 나타냄). 말단 갈락토스가 없는 글리코형태(G0이라고 함, 갈락토스가 없음을 나타냄)은 시알릴화 및/또는 바이갈락토실화(G2) 글리칸을 통해 매개되는 항염증 기전을 동시에 차단하는 동시에 보체를 고정하고 활성화 IgG 수용체 FcγRIIIa와 결합하는 향상된 능력을 부여하기 때문에 특히 전염증성이다. 다른 작은 형태의 글리칸에는 G0F(갈락토스 없음, 이등분(bisecting) N-아세틸글루코사민 없음, 코어 푸코스 있음) 및 G1F(α1,6 또는 α1,3 아암에 부착된 갈락토스)가 있다.
용어 "컨쥬게이트된 항체" 또는 "컨쥬게이트"는 하나 이상의 화학적 모이어티에 공유 연결된 항체를 지칭하고; 용어 "컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질"은 하나 이상의 화학적 모이어티에 공유적으로 연결된 Fc 융합 단백질을 지칭한다. 항체 또는 Fc 융합 단백질에 공유적으로 연결된 화학적 모이어티는 링커, 반응성 링커, 아민 링커, 페이로드, 반응성 페이로드, 아민 페이로드 및/또는 반응성-링커-페이로드를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "항체-페이로드 컨쥬게이트", "반응성 페이로드", "컨쥬게이트" 또는 "항체 약물 컨쥬게이트" 또는 "ADC"는 본원에서 "페이로드"로 지칭되는 세포독성 또는 세포질 약물/작용제, 독소 또는 방사성핵종에 화학적으로 연결되고 종양-특이적 또는 종양-관련 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 일반적으로 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)는 안정적인 링커 시스템을 통해 항암제를 mAb에 공유적으로 연결함으로써 형성된다. 예를 들어, 종양 세포 사멸은 약물 컨쥬게이트가 종양 세포에 결합하고 약물 모이어티의 세포독성 활성을 방출 또는/및 활성화할 때 발생할 수 있다. 약물 컨쥬게이트에 의해 제공되는 선택성은 정상 세포에 대한 독성을 최소화함으로써 환자에서 약물의 내약성을 향상시킨다.
본 개시내용을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 적합한 페이로드가 본 발명에서 사용될 수 있다. 페이로드는 예를 들어 약물/작용제, 링커, 클릭 반응 파트너 등을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 페이로드는 예를 들어 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 링커 또는 제1 클릭 반응 파트너일 수 있다.
본원에 사용되는 "약학 조성물"은 적어도 하나의 활성 약학 성분(API)을 포함하는 조성물을 지칭한다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 API의 예는 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질이다. API(들) 이외의 약학 조성물의 성분은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있으며; 바람직하게는, 부형제(들)는 실질적으로 또는 완전히 약학적으로 불활성이다.
본원에 사용되는 용어 "공유 결합된"은 페이로드가 적어도 하나의 공유 연결을 통해 항체에 부착됨을 의미한다. 연결은 링커 없이 직접적이거나 링커를 통해 간접적일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "링커"는 2개의 분자를 연결하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 적합한 링커가 본 발명에 사용될 수 있다. 링커는, 예를 들어 단일 공유 결합, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 헤테로알킬 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 펩티드 링커, 당-기반 링커, 또는 절단가능한 링커, 예컨대 다이설파이드 결합 또는 프로테아제 절단 부위, 예컨대 발린-시트룰린-PAB일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "아민-함유 페이로드"는 하나 이상의 반응성 아민(예를 들어, 1차 아민)을 함유하는 페이로드를 지칭한다. 예를 들어, 아민-함유 페이로드는 아민 공여체 단위(예를 들어, 1차 아민 NH2), 링커(예를 들어, 아민 공여체 단위에 연결되고 페이로드에 대한 부착을 위한 추가 작용기를 포함하는 분자, 예컨대 소분자, 폴리펩티드 또는 생체적합성 중합체), 및 작용제 모이어티(예를 들어, 페이로드, 예컨대 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 링커 또는 제1 클릭 반응 파트너)를 포함할 수 있다. 아민-함유 페이로드는 또한 폴리펩티드(예를 들어, 항체) 또는 하나 이상의 반응성 리신, N-말단, 또는 반응성 아민을 함유하는 생체적합성 중합체일 수 있다.
용어 "약물 대 항체 비" 또는 "DAR"은 ADC의 항체에 부착된 약물, 예를 들어 3-APA의 수를 지칭한다. 항체 모이어티당 결합된 약물 분자의 수 또는 표지화도는 당업계에서 일반적으로 사용되는 파라미터이며 "약물-항체 비"에 대해 "DAR"로 지정된다. ADC의 DAR은 1 내지 8 범위일 수 있지만, 항체의 연결 부위 수에 따라 더 높은 로드, 예를 들어, 10도 가능하다. 용어 DAR은 개별 항체에 로딩된 약물의 수와 관련하여 사용될 수 있다. DAR2는 2의 약물 로드 종을 지칭한다. 생물학적 샘플에서 DAR의 거동은 ADC의 안정성을 나타낸다. 두 샘플 간의 DAR 감소는 ADC의 안정성을 나타낸다.
용어 "DOL" 또는 "표지화도"는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)의 항체 중쇄당 공유 컨쥬게이트된 표지, 예를 들어 3-APA의 수를 지칭한다. DOL은 1 내지 8 범위일 수 있지만, 항체의 연결 부위 수에 따라 더 높은 로드, 예를 들어, 10도 가능하다. 용어 DOL은 개별 항체에 로딩된 약물의 수와 관련하여 사용될 수 있다. DOL2는 2의 표지화도를 지칭한다. 표지화도는 당업계에서 일반적으로 사용되는 파라미터이다. 용어 "치환 정도" 또는 "DOS"는 DOL과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 표지화도는 질량 분석법, UV-Vis 분광법 또는 크로마토그래피 방법, 예컨대 역상 HPLC 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의해 실험적으로 결정된다. 부위-특이적 표지 방법에 대한 원하는 DOL은 종종 다른 부위에서 표지 없이 원하는 부위의 전체 점유이다. 예를 들어, 각각의 중쇄가 Gln295 컨쥬게이션 부위를 포함하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 전형적인 항체의 경우, 최적의 DOL은 2의 DOL이며, 여기서 항체의 Gln295 잔기는 모두 약물 분자에 완전히 컨쥬게이트되어 있다.
용어 "반응성 기"는 다른 화학기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 기, 즉 적합한 반응 조건 하에서 공유 반응성이고 일반적으로 다른 물질의 부착 지점을 나타내는 기를 지칭한다.
용어 "저이온 강도" 또는 "저염" 조건은 완충 용액의 염 농도가 유지되거나 약 30 mM 미만의 농도로 되는 완충 조건이다(본원에서 "저이온 강도의 용액"이라고도 함). 염은 소듐 염, 포타슘 염, 또는 임의의 종류의 다른 염일 수 있다. 저염 농도는 약 25 mM 이하, 또는 약 24 mM 이하, 또는 약 23 mM 이하, 또는 약 22 mM 이하, 또는 약 21 mM 이하, 또는 약 20 mM 이하, 또는 약 19 mM 이하, 또는 약 18 mM 이하, 또는 약 17 mM 이하, 또는 약 16 mM 이하, 또는 약 15 mM 이하, 또는 약 14 mM 이하, 또는 약 13 mM 이하, 또는 약 12 mM 이하, 또는 약 11.2 mM 이하, 또는 약 11 mM 이하, 또는 약 10 mM 이하일 수 있다. 저염 농도는, 예를 들어, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 0.1 mM 내지 약 12 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 12 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 12 mM일 수 있다. 저염 농도는, 예를 들어, 25 mM, 24 mM, 23 mM, 22 mM, 21 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM, 11 mM, 10 mM, 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 또는 0 mM일 수 있다. 저염 또는 저이온 강도 조건은 희석, 또는 완충제 교환 방법, 예컨대 투석, 정용여과, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 방법 및/또는 기타 방법, 예컨대 침전 또는 동결건조와 같으나 이에 제한되지는 않는 방법에 의해 달성될 수 있다. 용액 또는 제제의 "이온 강도를 감소시키는" 방법은 상기 용액 또는 제제의 염 농도를 감소시키는 것을 지칭한다.
"Tm" 또는 "중간점 온도(mid-point temperature)"는 열 풀림 곡선의 온도 중간점이다. 이는, 아미노산 서열 중 50%가 이의 네이티브 입체배좌에 존재하고 다른 50%가 변성되는 온도를 지칭한다. 열 풀림 곡선은 전형적으로 온도의 함수로서 플롯화된다. Tm은 단백질 안정성을 측정하는 데 사용된다. 일반적으로, 더 높은 Tm은 더 안정한 단백질의 지표(indication)이다. Tm은 원편광 이색성 분광법(Circular Dichroism Spectroscopy), 시차 주사 열량측정법, 시차 주사 형광측정법(내인성 염료와 외인성 염료 둘 다에 기초함), UV 분광법, FT-IR, 및 등온 열량측정법(ITC: Isothermal Calorimetry)과 같이 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.
"Tagg"는, 단백질이 이량체화 또는 올리고머화를 통해 응집되기 시작하는 온도를 지칭한다. 응집 온도는, 단백질이 응집하는 경향을 보여줄 온도인 응집의 개시를 검출한다. Tagg는 시차 주사 열량측정법(DSC), 시차 주사 형광측정법(DSF)에 의해 또는 원편광 이색성(CD)에 의해 결정될 수 있다. 이들 기법은 단백질의 입체배좌에서의 작은 변화를 검출하고, 따라서 응집의 출발점을 검출할 수 있다. Tagg 값은 Tm보다 더 낮거나 더 높을 수 있다. Tagg가 Tm보다 더 낮은 경우, 단백질은 우선 이량체하고/하거나 올리고머화한 다음, 이후에 Tagg보다 더 높은 온도에서 풀리기 시작한다. Tagg가 Tm보다 더 높은 경우, 단백질은 우선 풀리기 시작한 다음, Tm보다 더 높은 온도에서 응집된다. 두 사건 모두는 보편적으로 관찰되고, 아미노산 조성 및 단백질 입체배좌에 의존한다.
본원에 기재된 "Q295" 또는 "Gln295"는 항체 불변 영역의 CH2 도메인에서 발견되는 Fc 컨쥬게이션 부위를 지칭한다. Gln295는 트랜스글루타미나제에 대한 기질이다. 특정 항체에는 2개의 중쇄와 2개의 Gln295 잔기가 있으므로, 트랜스글루타미나제 항체 컨쥬게이션은 최대 2.0의 약물 대 항체 비(DAR)로 각 Gln295 잔기에 항체 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 컨쥬게이션은 글루타민과 아민 컨쥬게이트된 페이로드 사이에서 발생한다. 글루타민과 아민-함유 페이로드 사이의 연결은 화학식 CO-NH-의 이소펩티드 결합이며, 여기서 NH-는 링커 및 페이로드 모이어티에 연결된다.
"N297" 또는 "Asn297"은 중쇄 Fc 글리코실화 부위를 지칭한다. 미생물 트랜스글루타미나제를 사용하는 전통적인 컨쥬게이션 방법에서 이 부위는 컨쥬게이션 전에 탈글리코실화된다.
본원에 사용되는 용어 "트랜스글루타미나제"는 페이로드 상의 유리 아민기와 항체 또는 그 항원 결합 단편에서 글루타민 잔기의 측쇄 상의 아실기 사이의 이소펩티드 결합 형성을 촉매하는 효소를 지칭한다. 트랜스글루타미나제는 단백질-글루타민 γ-글루타밀트랜스퍼라제(EC 2.3.2.13)이며, 이는 일반적으로 리신 잔기로 글루타민 잔기의 pH 의존성 트랜스아미드화를 촉매한다. 트랜스글루타미나제의 예는 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 인간 트랜스글루타미나제, 조직 트랜스글루타미나제(tTG) 및 인자 XIII를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 인간 트랜스글루타미나제의 예에는 각질세포 트랜스글루타미나제(Uniprot P22735), 조직 트랜스글루타미나제(UniProt P21980), 표피 트랜스글루타미나제 및 전립선 트랜스글루타미나제가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 효소는 천연 또는 재조합 공급원으로부터의 것일 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드의 글루타민 및 리신 아미노산은 트랜스글루타미나제 가교를 위한 기질이 될 수 있다. 예를 들어, 페이로드는 리신을 포함하는 링커에 연결될 수 있다.
트랜스글루타미나제는 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 트랜스글루타미나제일 수 있다. 본원에 기재된 본 발명에 사용된 트랜스글루타미나제는 다양한 공급원으로부터 수득되거나 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 형태 변화를 유도하고 효소 활성을 허용하기 위해 칼슘을 필요로 하는 칼슘 의존성 트랜스글루타미나제이다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제는 기니피그 간에서 유래될 수 있고 상업적 공급원(예를 들어, Sigma-Aldrich(St Louis, MO) 및 MP Biomedicals(Irvine, CA))을 통해 입수할 수 있다.
일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 진균 단백질(예를 들어, 난균류, 방선균, 사카로마이세스, 칸디다, 크립토코커스, 모나스쿠스 또는 리조푸스 트랜스글루타미나제)으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제 폴리펩티드는 믹소마이세테스로부터 유래된다(예를 들어, 파이사룸 폴리세팔룸 트랜스글루타미나제). 일부 실시형태에서, mTGase 폴리펩티드는 박테리아 단백질, 예컨대 스트렙토베르티실리움 종 또는 스트렙토마이세스 종의 트랜스글루타미나제에서 유래한다(예를 들어,스트렙토마이세스 모바렌시스 또는 스트렙토베르티실리움 모바렌시스). 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제 폴리펩티드는 박테리아 단백질, 예컨대 트랜스글루타미나제, 비제한적으로, 스트렙토베르티실리움 모바렌시스, 스트렙토베르티실리움 그리세오카메움, 스트렙토베르티실리움 라다카눔, 스트렙토마이세스 모바렌시스, 스트렙토마이세스 비리디스, 스트렙토마이세스 라다카눔, 스트렙토마이세스 카니페루스, 스트렙토마이세스 플라텐시스, 스트렙토마이세스 하이그로스코피우스, 스트렙토마이세스 네트로프시스, 스트렙토마이세스 프라디아에, 스트렙토마이세스 로제오베르티빌라투스, 스트렙토마이세스 신나마오네우스, 스트렙토마이세스 그리세오카메움, 스트렙토마이세스 라벤둘라에, 스트렙토마이세스 리비단스, 스트렙토마이세스 리디쿠스, 스트렙토마이세스 시오얀시스, 악티노마두라 종, 바실루스(예를 들어, 바실루스 시르쿨란스, 바실루스 서브틸리스 등), 코리네박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 클로스트리디움, 엔테로박테르 종, 미크로코쿠스, 프로비덴시아 종, 또는 이의 단리물로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 형태 변화를 유도하고 효소 활성을 허용하기 위해 칼슘을 필요로 하지 않는 칼슘 비의존성 트랜스글루타미나제이다. 일부 실시형태에서, 트랜스글루타미나제 폴리펩티드는 S. 모바렌시스로부터 유래된다.
ACTIVA(Ajinomoto, 일본)와 같은 시판되는 칼슘 비의존성 트랜스글루타미나제도 본 발명에 적합하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 본 발명에 사용된 트랜스글루타미나제는 또한 당업자에게 알려진 재조합 기술을 사용하여 생성된 재조합 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 본 발명에 사용된 트랜스글루타미나제는 정제된 단백질일 수 있다.
달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐 항체 불변 영역 내 아미노산 잔기의 숫자매김은 문헌[Kabat 등 (1991, J Immunol 147(5): 1709-19)]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 따른 것이다.
통상적인 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드는 표 1에 제시된 바와 같이 본원에서 사용된다.
[표 1]
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발명의 방법
본 출원의 독자를 돕기 위한 시도로, 발명의 상세한 설명은 다양한 단락 또는 섹션으로 분리되었거나, 본 출원의 다양한 실시형태에 관련된다. 이들 분리는 단락 또는 섹션 또는 실시형태의 요지를 다른 단락 또는 섹션 또는 실시형태의 요지로부터 분리하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 반대로, 당업자는 발명의 상세한 설명이 넓은 응용을 가지며, 고려될 수 있는 다양한 섹션, 단락, 및 문장의 모든 조합을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 실시형태는 단순히 예시적인 것으로 의도되며, 당업자는 본 발명의 특이적 절차에 대한 다수의 등가물을 인식하거나, 일상적인 것에 불과한 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 모든 그러한 등가물은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주되며, 하기 청구범위에 의해 포함된다.
단일클론 항체(mAb)는 종양 관련 항원에 대한 높은 선택성, 유리한 약동학 및 상대적으로 낮은 고유 독성으로 인해 표적 약물 전달에 점점 더 많이 사용되고 있다. 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)는 일반적으로 안정적인 링커 시스템을 통해 mAb의 특정 부위에 항암제를 mAb에 공유 연결하여 형성된다. mAb의 Fc 중쇄의 CH2 도메인에 위치한 글루타민 295(Q295)는 일반적으로 사용되는 컨쥬게이션 부위이다. 컨쥬게이션은 일반적으로 글루타민 측쇄와 세포독성제의 유리 아민 사이의 안정한 이소펩티드 결합 형성을 촉매하는 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)를 사용하여 수행된다.
ADC 제조의 주요 문제는 컨쥬게이션 부위, 컨쥬게이션 속도 및 표지화도(DOL)를 엄격하게 제어할 수 있는 방식으로 세포독성제를 항체에 부착하는 것이다. 컨쥬게이션 산물은 ADC의 개발을 복잡하게 할 뿐만 아니라 최종 약물의 차선책 치료 창으로 이어질 수 있는 DOL에 비해 종종 다소 이질적인 혼합물이다.
항체는 종종 Q295 컨쥬게이션 부위 근처의 N297 잔기에서 글리코실화된다. 항체 글리칸의 제거는 H-D 교환에 의해 입증된 바와 같이 C'D/E 가닥의 이동성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(문헌[Houde D. et al. Anal Chem (2009), 81(7): 2644]).또한, MTG와의 반응성은 백본 유연성의 지표일 가능성이 있는 프로테아제 민감성과 상관관계가 있음이 입증되었다(문헌[Spolaore et al., 2012, Biochemistry 51(43):8679-8689]). N297에서 글리칸 분자의 입체 효과는 Q295에서 컨쥬게이션을 방해하는 것으로 여겨진다. N297 잔기에서의 글리코실화는 Q295에서의 트랜스글루타미나제 컨쥬게이션을 방해하고 표지화도(DOL) 또는 약물 대 항체 비(DAR)에 영향을 미친다. 결과적으로 전통적인 완충 조건 하에서 글리칸 무손상 항체의 컨쥬게이션은 표지화도가 낮고 효능이 감소된 생성물을 생성할 것이다.
당업계에 알려진 전통적인 컨쥬게이션 방법에서, 항체는 Q295에서 컨쥬게이션을 허용하도록 N297에서 탈글리코실화 또는 무글리코실화된다. 글리코실화를 방해하지 않고 생성된 항체는 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)로 처리하기에 적합하고 1차 아민 화합물과 반응하여 글루타밀-변형된 항체를 생성할 수 있다.
전통적인 컨쥬게이션 방법은 초기 탈글리코실화 단계를 필요로 하기 때문에 역사적으로 글리칸의 제거가 항체와 Fc 수용체의 상호작용을 폐지하기 때문에 제조 가능성이 덜 유리한 항체로 이어졌다. Fc 글리칸은 구조적 무결성, Fc 수용체와의 통신 및 다운스트림 면역학적 반응을 유지하는 데 중요하다. 특히 N297에서 N-연결된 글리칸의 존재 및 구조는 면역 복합체에 의한 이펙터 기능의 활성화에 필요한 것으로 이해된다. 탈글리코실화된 항체 또는 글리칸-조작된 항체를 필요로 하는 전통적인 컨쥬게이션 방법을 통해 생성된 컨쥬게이션된 항체는 일반적으로 글리칸 변형 함량으로 인해 감소된 활성 및/또는 감소된 안정성을 가질 것이다. 예를 들어, 항체는 안정성, 친화성 또는 선택성을 잃을 수 있다.
본원에 기재된 본 발명은 글리코실화된 항체의 컨쥬게이션 방법을 제공하여 제조에 보다 적합한 항체 약물 컨쥬게이트의 생성을 가능하게 한다. 본 발명은 원하는 DOL을 제공하고 임의의 반응성 종 또는 항체에 적용 가능한 조건을 제공한다. 본 발명의 조건은 글리칸-조작 또는 글리칸 제거를 필요로 하지 않는다.
탈글리코실화 또는 글리칸-조작된 항체를 사용하는 전통적인 미생물 트랜스글루타미나제 컨쥬게이션 방법은 일반적으로 유사한 이온 강도를 갖는 PBS 또는 완충제와 같은 전통적인 완충제 조건 하에서 수행된다. 표지화도(DOL)를 조절하는 데 사용되는 기존 방법은 일반적으로 담체 분자의 농도 변경 또는 반응성 표지 종의 농도 변경에 따라 다르다. DOL은 또한 반응성 종의 화학적 성질에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 이러한 변경은 글리칸 무손상 항체에 사용될 때 일반적으로 DOL에 거의 영향을 미치지 않는다. 알려진 절차와 달리, 본 발명의 저이온 강도 조건은 예비 탈글리코실화 단계 및 항체 글리칸의 제거 없이 원하는 DOL을 제공하여 트랜스글루타미나제를 사용하여 아민 화합물 또는 아민 함유 페이로드와 항체의 부위-특이적 컨쥬게이션을 허용하여, 더 나은 제조 가능성을 가진 항체 약물 컨쥬게이트를 허용한다.
특정 실시형태에서, 1차 아민 화합물은 트랜스글루타민화 후에 추가로 반응할 수 있는 반응성 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 글루타밀-변형된 항체는 반응성 페이로드 화합물과 반응하여 항체 페이로드 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 1차 아민 화합물은 아지드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 탈글리코실화 및 후속 정제가 필요하지 않기 때문에 개선된 회수를 포함하여 전통적인 컨쥬게이션 방법에 비해 많은 이점을 제공할 수 있으며; 탈글리코실화가 항체에 대한 Tm 및 Tagg 값을 감소시키는 것으로 나타났기 때문에 안정성이 개선되었다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질은 아미노산 Asn297에서 N-연결된 글리칸을 포함한다. 바람직하게는, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질은 무손상 글리칸 함량을 갖는다. 바람직하게는, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질은 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 아민 화합물과 반응시키기 전에 엔도 또는 엑소-글리코시다제로 처리되지 않는다. 바람직하게는, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 글리코실화 부위는 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 화합물과 반응시키기 전에 글리칸-조작되거나 글리칸-변형되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용된 항체는 부분적으로 변형되거나 부분적으로 조작된 글리칸을 포함하지만 아미노산 Asn297에서 N-연결된 글리칸을 여전히 보유하는 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질이다.
특정 실시형태에 있어서, 글리코실화된 항체는 G0F, G1F, G2F, G0, G1, 또는 G2 글리칸을 갖는다.
특정 실시형태에서, 항체는 당업자에게 알려진 임의의 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서 항체는 카파 또는 람다 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 모노클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 폴리클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
특정 실시형태에서, 아민 화합물은 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 조영제 또는 제1 클릭 반응 파트너 중 하나 이상을 포함하는 아민 함유 페이로드이다.
특정 실시형태에서, 저이온 강도 조건에서의 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법은 약 25 mM 이하, 또는 약 20 mM 이하, 또는 약 15 mM 이하, 또는 약 10 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 컨쥬게이션 반응은 포스페이트, 아세테이트 또는 Tris(이에 제한되지는 않음)로 완충된 물에서 수행된다. 대안적인 실시형태에서, 저이온 강도의 용액은 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, HEPES, 소듐 아세테이트, 또는 Tris를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 컨쥬게이션 반응은 10 mM 이하의 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 아세테이트, 또는 Tris를 포함하는 저이온 강도 조건에서 수행된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 컨쥬게이션 반응은 10 mM 이하의 포타슘 포스페이트, 10 mM 이하의 소듐 포스페이트, 10 mM 이하의 소듐 아세테이트, 또는 10 mM 이하의 Tris를 포함하는 저이온 강도 조건 하에서 수행된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 방법은 아민 화합물과 반응하기 전에 항체 또는 항체 제제의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 항체 제제를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 즉, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법은 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 포함하는 용액의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 조건을 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 방법은 아민 화합물과 반응하기 전에 트랜스글루타미나제 제제의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 트랜스글루타미나제 제제를 제공하는 것을 추가로 포함하며, 즉, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법은 트랜스글루타미나제를 포함하는 용액의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 조건을 제공하는 것을 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 이온 강도는 희석, 또는 투석, 정용여과, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 방법을 통한 완충제 교환에 의해 감소된다. 컨쥬게이션 방법의 실시형태에서, 염(들) 및/또는 첨가제는 방법, 예컨대 투석, 정용여과, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 방법을 통한 희석 또는 완충제 교환, 겔 투과, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 적합한 크로마토그래피 방법에 의해 제거된다. 염(들) 및/또는 첨가제(들)의 제거는 투석 막 튜빙, 단백질을 보유하지만 완충제는 통과시킬 수 있는 크기의 다공성 막이 있는 원심 장치 및/또는 크로마토그래피 지지체를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 염(들) 및/또는 첨가제(들)의 제거는 침전 또는 동결건조에 의해 수행될 수 있다. 염 또는 첨가제의 농도는 바람직하게는 컨쥬게이션 반응의 시작 전에 감소된다. 이상적으로, 염(들) 및/또는 첨가제의 농도는 항체의 글리칸 함량의 제거 및/또는 조작 없이 컨쥬게이트의 컨쥬게이션을 허용하는 수준으로 감소된다. 이상적으로, 염(들) 및/또는 첨가제의 농도는 항체의 90% 이상이 중쇄당 하나의 아민-함유 페이로드에 컨쥬게이트되도록 허용하는 수준으로 감소된다.
일 실시형태에 있어서, 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 아민 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법은 중쇄당 하나의 아민-함유 페이로드에 컨쥬게이트된 (예를 들어, 2의 DOL) 상기 글리코실화된 항체 또는 상기 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 각각 항체 또는 Fc 융합 단백질로의 80 내지 100% 또는 90 내지 100% 전환을 달성하기에 충분하다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 트랜스글루타미나제는 미생물 트랜스글루타미나제이다. 상기 기재된 바와 같이, 트랜스글루타미나제는 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 트랜스글루타미나제일 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 반응은 적어도 18시간 동안 수행된다.
본 발명의 다른 양태에서, 반응은 적어도 24시간 동안 수행된다.
특정 실시형태에서, 아민 화합물은 아지드를 포함하는 1차 아민 화합물이다. 일부 실시형태에서, 1차 아민 화합물은 반응성 기 또는 보호된 반응성 기를 포함한다. 반응성 기 및 보호된 반응성 기는 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 임의의 기일 수 있다. 특정 실시형태에서, 반응성 기는 반응성 페이로드 화합물과 공유 결합을 형성할 수 있다. 유용한 반응성 기는 아지드, 알킨, 시클로알킨, 티올, 알코올, 케톤, 알데하이드, 산, 에스테르, 하이드라지드, 아닐린, 테트라진, 시클로옥텐, 시클로프로펜을 포함한다. 특정 실시형태에서, 1차 아민 기는 카르복실을 포함하고 반응성 페이로드는 아민을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 컨쥬게이트된 항체를 반응성 페이로드 화합물과 반응시켜 항체-페이로드 컨쥬게이트를 형성하는 것을 추가로 포함한다. 반응성 페이로드 화합물의 페이로드는 당업자에게 적합한 것으로 간주되는 임의의 페이로드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 페이로드는 1차 아민 화합물 상의 반응성 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 기를 포함하는 반응성 페이로드 화합물의 형태로 제공된다. 반응성 페이로드 화합물에 대한 반응성 기는 아지드, 알킨, 시클로알킨, 티올, 알코올, 케톤, 알데하이드, 산, 에스테르, 하이드로지드, 아닐린, 및 아민을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 1.8의 표지화도(DOL)를 제공한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 1.9의 표지화도(DOL)를 제공한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 2의 표지화도(DOL)를 제공한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 2.0의 약물 대 항체 비(DAR)를 제공한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 항체 또는 Fc 융합 단백질의 90% 이상이 2개의 아민-화합물에 컨쥬게이트된다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 항체 또는 Fc 융합 단백질의 95% 이상이 2개의 아민-함유 페이로드에 컨쥬게이트된다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 항체 또는 Fc 융합 단백질의 100%는 2개의 아민-함유 페이로드에 컨쥬게이트된다.
특정 실시형태에서, 컨쥬게이션은 항체의 Fc 도메인에서 발생한다.
특정 실시형태에서, 컨쥬게이션은 Gln295에서 발생한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 Gln295에서 링커를 통해 아민-함유 페이로드에 컨쥬게이트된 항체를 제공하고, 페이로드는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴 및 제1 클릭 반응 파트너로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포독성제는 세포의 성장, 생존력 또는 증식에 유해한 임의의 작용제를 포함한다. 페이로드는 또한 킬레이터 또는 방사성핵종을 포함할 수 있다. 예시적인 방사성핵종은 225Ac, 212Bi, 131I, 211At, 227Th 및 186Re를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시형태에서, 아민 화합물은 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴 및 제1 클릭 반응 파트너 중 하나 이상을 포함하는 아민 함유 페이로드이다.
특정 실시형태에서, 아민-함유 페이로드는 제1 클릭 반응 파트너를 포함하고, 바람직하게는, 방법은 항체-페이로드 컨쥬게이트를 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그 및 비오틴 중 하나 이상을 포함하는 제2 클릭 반응 파트너와 반응시켜 제2 항체-페이로드 컨쥬게이트를 수득하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 제1 클릭 반응 파트너는 3-아지도-1-프로필아민이고, 제2 클릭 반응 파트너는 DBCO-val-cit-MMAF 또는 DBCO-MMAF이다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 클릭 화학 방법의 예는 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 국제출원 PCT/US2018/065913호에 기재되어 있다.
열거된 실시형태
본 발명의 번호가 매겨진 예시적인 실시형태가 아래에 제공된다:
1. 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
2. 실시형태 1에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질이 무손상 글리칸 함량을 갖는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
3. 실시형태 1 또는 실시형태 2에 있어서, 아민 화합물이 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 조영제 또는 제1 클릭 반응 파트너 중 하나 이상을 포함하는 아민 함유 페이로드인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
4. 실시형태 1 내지 실시형태 3 중 어느 하나에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질은 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 아민 화합물과 반응시키기 전에 엔도 또는 엑소-글리코시다제로 처리되지 않는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
5. 실시형태 1 내지 실시형태 4 중 어느 하나에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 글리코실화 부위는 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 화합물과 반응시키기 전에 글리칸-조작되거나 글리칸-변형되지 않는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
6. 실시형태 1 내지 실시형태 5 중 어느 하나에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질이 아미노산 Asn297에서 N-연결된 글리칸을 함유하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
7. 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 25 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
8. 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 20 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
9. 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 15 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
10. 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 10 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
11. 실시형태 7 내지 실시형태 10 중 어느 하나에 있어서, 저이온 강도의 용액이 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, HEPES, 소듐 아세테이트, 또는 Tris를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 저이온 강도의 용액이 포타슘 포스페이트를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
13. 실시형태 11에 있어서, 저이온 강도의 용액이 소듐 포스페이트를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
14. 실시형태 11에 있어서, 저이온 강도의 용액이 HEPES를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
15. 실시형태 11에 있어서, 저이온 강도의 용액이 Tris를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
16. 실시형태 11에 있어서, 저이온 강도의 용액이 소듐 아세테이트를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
17. 실시형태 1 내지 실시형태 16 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 포함하는 용액의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 조건을 제공하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
18. 실시형태 1 내지 실시형태 17 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 트랜스글루타미나제를 포함하는 용액의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 조건을 제공하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
19. 실시형태 17 또는 실시형태 18에 있어서, 이온 강도가 희석, 또는 투석, 정용여과, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 방법을 통한 완충제 교환에 의해 감소되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
20. 실시형태 1 내지 실시형태 19 중 어느 하나에 있어서, 트랜스글루타미나제가 미생물 트랜스글루타미나제인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
21. 실시형태 1 내지 실시형태 20 중 어느 하나에 있어서, 아민 화합물이 1차 아민 화합물인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
22. 실시형태 21에 있어서, 1차 아민 화합물이 아지드를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
23. 실시형태 1 내지 실시형태 22 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 컨쥬게이트된 항체를 반응성 페이로드 화합물과 반응시켜 항체-페이로드 컨쥬게이트를 형성하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
24. 실시형태 1 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 중쇄당 적어도 0.9의 평균 표지화도(DOL)를 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
25. 실시형태 24에 있어서, 제조 방법이 중쇄당 1의 평균 표지화도(DOL)를 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
26. 실시형태 1 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 항체 당 적어도 1.8의 DOL을 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
27. 실시형태 26에 있어서, 제조 방법이 항체 당 2.0의 DOL을 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
28. 실시형태 1 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 글리코실화된 항체 또는 상기 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 80% 이상이, 각각 DOL이 2인 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 상기 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질(즉, DOL이 2인 항체 종 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질 종)로 전환되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
29. 실시형태 1 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 글리코실화된 항체 또는 상기 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 90% 이상이, 각각 DOL이 2인 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 상기 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질로 전환되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
30. 실시형태 1 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 100%가, 각각 DOL이 2인 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 상기 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질로 전환되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
31. 실시형태 1 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 각각 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 컨쥬게이션 Fc 융합 단백질에 비해 10% 미만의 부산물을 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
32. 실시형태 24 내지 실시형태 30 중 어느 하나에 있어서, LC-MS에 의해 표지화도(DOL)를 결정하는 것을 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
33. 실시형태 1 내지 실시형태 32 중 어느 하나에 있어서, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질이 그 Fc 도메인에서 컨쥬게이트되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
34. 실시형태 33에 있어서, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질이 Gln295에서 컨쥬게이트되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
35. 실시형태 1 내지 실시형태 32 중 어느 하나에 있어서, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질은 Gln295에서 링커를 통해 아민 함유 페이로드에 컨쥬게이트되고, 페이로드는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, 킬레이트제, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 조영제, 및 제1 클릭 반응 파트너로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 반응성 기를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
36. 실시형태 35에 있어서, 아민-함유 페이로드는 제1 클릭 반응 파트너를 포함하고, 제조 방법은 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질을 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 조영제, 또는 비오틴 중 하나 이상을 포함하는 제2 클릭 반응 파트너와 반응시켜 제2 컨쥬게이트를 수득하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
37. 실시형태 36에 있어서, 제1 클릭 반응 파트너가 3-아지도-1-프로필아민이고, 제2 클릭 반응 파트너가 DBCO-val-cit-MMAF 또는 DBCO-MMAF인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
38. 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리코실화된 항체를 아민 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
39. 실시형태 1 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 있어서, 제조 방법이 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 아민 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
40. 실시형태 1 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 컨쥬게이트된 항체.
41. 실시형태 40의 컨쥬게이트된 항체를 포함하는 약학 조성물.
42. 실시형태 1 내지 실시형태 37 또는 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질.
43. 실시형태 42의 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
본 발명의 하기 실시예는 특정 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공된다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
실시예
하기 실시예에서 사용된 항체는 상업적으로 이용 가능하고 트라스투주맙(Herceptin®), 페르투주맙(Perjeta®) 및 파니투무맙(Vectibix®)을 포함한다. 트라스투주맙 및 페르투주맙은 인간 Her2에 결합한다. 파니투무맙은 인간 EGFR에 결합한다.
실시예 1: Zedira의 미생물 트랜스글루타미나제(MTG)를 사용하여 저이온 강도 조건 하에서 트라스투주맙과 3-APA의 컨쥬게이션
항체 및 트랜스글루타미나제 제조
대장균에서 생산된 독점 재조합 미생물 트랜스글루타미나제(박테리아 트랜스글루타미나제에 대한 MTG 또는 BTG)는 Zedira(카탈로그 번호 T001)에서 구입하였다. 동결건조된 분말을 물에 재현탁하고 완충액을 Zeba 탈염 컬럼(Thermo Fisher)을 사용하여 저이온 강도 완충액(예컨대 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.2)으로 교환하였다. 인간화 IgG1 항체인 트라스투주맙도 Zeba 탈염 컬럼을 사용하여 저이온 강도 완충액(예컨대 10 mM 포타슘 포스페이트)으로 완충액 교환하였다. 완충액 교환된 트라스투주맙 및 미생물 트랜스글루타미나제를 물 또는 원하는 반응 조건에 적합한 완충제로 희석하여 mAb의 경우 1 mg/mL 및 효소의 경우 10 U/mg의 최종 농도에 도달했다. 페이로드 부착에 적합한 반응성을 갖는 아지도 함유 시약인 3-아지도 프로필아민(3-APA) 기질의 mAb에 비해 20x 내지 100x 몰 과량으로 항체 및 효소를 인큐베이션하였다.
컨쥬게이션 반응
미생물 트랜스글루타미나제의 활성 부위 시스테인을 비가역적으로 알킬화하는 Zedira의 MTG-차단제인 C102를 첨가하여 표시된 시점에서 반응을 중단했다. 사용된 MTG-차단제의 최종 농도는 100 uM이었다. 무손상 질량 분석을 위해, mAb를 Rapid PNGase F(2% v/v)로 탈글리코실화하여 샘플의 이질성을 줄이고 분석을 용이하게 했다; 질량 감소 분석을 위해 다이티오트레이톨 또는 TCEP를 첨가하였다.
LC-MS는 Agilent G6224 MS-TOF 질량 분석기에 연결된 Agilent 1260 HPLC 시스템에서 수행되었다. LC는 1 mL/분의 유량으로 Agilent RP-mAb C4 컬럼(2.1 x 50 mm, 3.5미크론)에서 실행되었으며 물 중 0.1% 포름산 이동상(A) 및 아세토니트릴(Sigma-Aldrich Cat# 34688) 중 0.1% 포름산(B) 및 20% B(0 내지 2분), 20 - 60% B(2 내지 3분), 60 - 80% B(3 내지 5.5분)의 구배를 사용하였다. 장비는 양성 전자 분무 이온화 모드에서 작동되었으며 m/z 600에서 6000까지 스캔되었다. 포함된 기기 설정: 모세관 전압 3500 V; 프래그멘터 175 V; 스키머 65 V; 가스 온도 325℃; 건조 가스 유량 5.0 L/분; 분무기 압력 30 psig; 0.42 스캔 속도로 수집 모드 범위 100 내지 7000.
질량 대 전하 스펙트럼은 최대 엔트로피 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션되었고 각 반응의 표지화도(DOL)는 무손상 mAb 또는 83 Da의 배수가 추가된 mAb 중쇄(3-APA에 상응)에 상응하는 디컨볼루션된 질량의 상대 강도를 사용하여 추정되었다.
도 1은 상이한 반응 완충액 조성물에서 무손상 및 탈글리코실화된 트라스투주맙으로의 3-APA의 MTG-촉매 컨쥬게이션 비율을 도시한다. 탈글리코실화된 mAb에 대한 PBS 완충액에서의 컨쥬게이션 속도는 매우 빨랐고 반응은 3시간 이내에 완료되었다. 탈글리코실화된 mAb의 컨쥬게이션 속도는 10 mM 포스페이트 완충액에서 훨씬 더 빠른 것으로 나타났다. 글리칸 무손상 mAb의 컨쥬게이션 속도는 PBS에서 느려서 5시간 만에 25% 전환에 도달하고 밤새 40 내지 60% 전환으로 진행되었다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 5 또는 10 mM 포스페이트 완충액에서 글리칸 무손상 mAb의 컨쥬게이션은 PBS 완충액에서보다 상당히 빨랐고, 5시간 후에 약 70 내지 80% 완료에 도달했으며 더 긴 인큐베이션 시간 후에 완전하거나 거의 완전한 전환에 도달했다(데이터는 표시되지 않음). 저이온 강도 조건 하에서 수행된 반응은 PBS에서 수행된 반응에 비해 증가된 컨쥬게이션 속도를 보여주었다. 10 mM 및 5 mM 포스페이트 완충액 모두 PBS(8 mM 소듐 포스페이트, 1.5 mM 포타슘 포스페이트, 2.7 mM KCl, 138 mM NaCl)에 비해 현저한 속도 향상을 보였다.
트랜스글루타미나제 반응은 다양한 완충액 조건의 패널에서 시험되었다: 1 mg/mL의 인간 IgG1 항체 트라스투주맙; 100몰 과량의 3-APA(690 uM); 및 10 U/mg 의 항체에서 Zedira 트랜스글루타미나제(카탈로그 #T001). 표 2는 일련의 반응 조건에서 37℃에서 MTG 및 3-APA와 함께 18 내지 20시간 인큐베이션한 후 완전히 변형된(DOL=2로) 글리칸 무손상 WT 인간 트라스투주맙의 분율을 보여준다. 다수의 낮은 이온 강도 제형은 변형이 증가한 것으로 나타났으며, 많은 경우에 완전하거나 거의 완전한 변형이 가능했다.
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
저이온 강도 조건 하에서 pH 5.8, 7.2 또는 8.0의 포타슘 포스페이트 완충액, pH 7.2 또는 8.0의 HEPES, pH 7.2, 8.0 또는 9.2의 Tris 완충액 및 pH 5.6의 소듐 아세테이트 완충액에서 수행된 반응은 3-APA로 mAb의 변형이 증가했다. 모든 경우에, 37℃에서 16 내지 20시간 후 2.2 mM 완충액에서 mAb의 DOL=2 종으로의 완전한 또는 거의 완전한 전환이 달성되었다. 많은 경우에 완전한 컨쥬게이션(2의 DOL를 달성하는 반응)은 6.2 및 11.2 mM에서 달성되었으며, 이러한 경우 저염 조건은 PBS 또는 다른 더 높은 이온 강도 반응 조건보다 훨씬 더 많은 컨쥬게이트를 생성했다. 낮은 pH 조건(pH 3.6 및 4.2) 하에서 소듐 아세테이트 완충액에서 시험한 대부분의 조건에서 제한된 생성물이 생성되었는데 아마도 MTG에 대하여 최적의 pH 조건이 아니기 때문일 것이다. 한 가지 예외는 2.2 mM 소듐 아세테이트, pH 4.2 반응으로 3-APA로 mAb를 완전히 변형시켰으며, 이는 낮은 pH를 유지하지 못하는 제한된 완충 용량으로 설명할 수 있다.
펩티드 맵핑
컨쥬게이션 부위를 확인하기 위해, 생성된 컨쥬게이트에 대해 펩티드 맵핑 실험을 수행하였다. 50 μL PBS 중 50 ㎍의 mAb를 pH 8.0에서 150 μL의 8 M GuHCl, 4 mM EDTA 및 30 mM DTT와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 시스테인은 0.5 M 아이오도아세트아미드(IAA) 24 μL를 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하여 알킬화되었다. 그런 다음 mAb를 Zeba 스핀 컬럼(Thermo)을 사용하여 50 mM Tris, 1 mM CaCl2, pH 8.0으로 교환한 다음 트립신 분해를 위한 90 μl 용액과 키모트립신 분해를 위한 130 μl 용액으로 나누었다. 15 μL의 0.1 mg/ml 트립신/Lys-C(Promega #V507) 또는 1 mM HCl 중 0.1 mg/mL 키모트립신을 첨가하고 샘플을 트립신/Lys-C 분해를 위해 37℃에서 4시간 동안 또는 키모트립신 분해를 위해 어두운 곳에서 4시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. LC-MS/MS 데이터는 SCIEX Triple TOF 6600에서 획득하였다. 데이터는 Protein Metrics 소프트웨어인 Byos(버전 3.5-10x64)를 사용하여 처리되었다. 펩티드 맵핑 실험은 변형이 Gln295에 국한되었음을 입증하였다(도 2a 내지 도 2d).
컨쥬게이트의 생물물리학적 특성화
용융 온도 및 응집 온도
컨쥬게이션이 항체의 안정성에 미치는 영향을 결정하기 위해 컨쥬게이션된 트라스투주맙의 생물물리학적 특성화를 수행하였다. 데이터를 비-컨쥬게이트된 야생형(WT) 트라스투주맙과 비교하였다. 언폴딩 온도(Tm)(도 3a) 및 응집 온도(Tagg)(도 3b)는 Nanotemper의 Prometheus nanoDSF 기기를 사용하여 시차 주사 형광 측정법에 의해 PBS에서 결정되었다. Tm은 20 내지 95℃에서 열 스캐닝 시 330 및 350 nm에서 형광 강도의 변화를 모니터링하여 결정되었으며, Tagg는 산란을 모니터링하여 결정되었다. 트라스투주맙 아지드 컨쥬게이트의 Tm은 첫 번째 전이(CH2 도메인에 상응)에 대해 68.3℃인 것으로 결정되었으며, 이는 글리코실화된 WT mAb에 비해 2.1℃의 이동이고, 두 번째 전이(Fab에 상응)에 대해 79.2℃인 것으로 결정되었으며, 이는 글리코실화된 야생형 mAb에 비해 0.3℃의 이동이다. 대조적으로, 트라스투주맙의 탈글리코실화는 CH2 도메인의 Tm을 약 8℃까지 감소시켰다. 글리코실화된 트라스투주맙 컨쥬게이트와 탈글리코실화된 트라스투주맙 컨쥬게이트의 응집 온도(Tagg)는 77.7℃의 Tagg와 유사하지만 글리코실화된 비-컨쥬게이트된 트라스투주맙과 비교할 때 1.1℃ 더 낮다(표 3).
[표 3]
Figure pct00004
크기 배제 크로마토그래피(SEC)
컨쥬게이트된 mAb의 올리고머화 상태는 아지드 변형된 mAb 및 약물 페이로드 DBCO-val-cit-MMAF가 아지드 변형된 mAb에 부착된 컨쥬게이트 mAb 둘 모두에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정되었다. 두 경우 모두, 용출 프로파일은 본질적으로 컨쥬게이트되지 않은 트라스투주맙과 일치했으며 100% 단량체와 일치했다.
컨쥬게이트의 활성
글리코실화된 mAb에서 저이온 강도 조건 하에서 생성된 컨쥬게이트의 활성이 확립된 방법으로 생성된 컨쥬게이트와 유사함을 입증하기 위해, 저염 조건 하에서 생산된 아지도-mAb는 약물 페이로드에 컨쥬게이트되었고 활성은 세포 분석에서 입증되었다(도 4). 트라스투주맙은 위에서 설명한 저염 조건 하에 3-APA에 컨쥬게이트되었거나 37℃에서 밤새 1 U/mL Rapid PNGase F(New England Biolabs)로 탈글리코실화된 다음, PBS 완충액에서 37℃에서 2 내지 4시간 동안 3-APA(100배 몰 과량) 및 MTG(Activa TI, 5 내지 20% w/v 또는 Zedira, 5 내지 20 단위/mg의 mAb)와 반응되었다. DBCO-Val-Cit-PABC-MMAF 약물 페이로드를 10배 몰 과량으로 아지드-컨쥬게이트된 mAb에 첨가하고 실온에서 2 내지 6시간 동안 변형 촉진 클릭 화학(SPAAC)에 의해 반응시켰다. Zeba 탈염 컬럼(Thermo)을 사용하여 생성된 ADC로부터 유리 약물을 제거하였다.
높은 Her2 세포주인 SKBR3 세포를 37℃에서 72시간 동안 다양한 농도의 ADC로 처리했다. Cell Titer Glo를 사용하여 치료 종료 시 세포 생존율을 측정했다. 탈글리코실화 단계를 포함하는 전통적인 컨쥬게이션 방법에 의해 생산된 트라스투주맙-vcMMAF의 세포 사멸 활성은 글리코실화된 항체를 사용하여 저이온 강도 조건 하에 생성된 트라스투주맙-vcMMAF의 세포 활성과 유사한 것으로 밝혀졌다(도 4).
실시예 2: Activa TI 미생물 트랜스글루타미나제를 사용한 저이온 강도 조건 하에 트라스투주맙과 3-APA의 컨쥬게이션
저이온 강도 컨쥬게이션 방법은 Ajinomoto에서 구입한 Activa TI MTG 효소로도 성공적으로 입증되었다.
완충제 교환된 Activa TI 미생물 트랜스글루타미나제를 사용한 저이온 강도 조건 하에서의 트라스투주맙의 컨쥬게이션.
Activa TI MTG는 일반적으로 식품 첨가물 및 기타 용도로 사용되는 다당류인 말토덱스트린으로 제형화되었다. 재가용화된 Activa TI MTG를 사용하여 초기 컨쥬게이션 실험을 수행하였다. 트라스투주맙을 Zeba 탈염 컬럼(Thermo)을 사용하여 10 mM 포타슘 포스페이트 완충제 pH 7.2로 교환하고, Activa TI 분말을 10 mM 포타슘 포스페이트 완충제에 용해시키고, 3-APA를 물에 용해시켰다. 반응 성분은 10 mM 포타슘 포스페이트 pH 7.2에서 트라스투주맙 1 mg/mL, 3-APA 690 uM 및 Activa TI MTG 20% w/v의 최종 농도를 갖는 반응 혼합물에서 조합되었다. 비교를 위해 PBS 완충제에서 동일한 반응을 설정했다(트라스투주맙 1 mg/mL, 3-APA 690 uM, Activa TI MTG 20% w/v, KH2PO4 1.5 mM, Na2HPO4 8.1 mM, KCl 2.7 mM, NaCl 137 mM pH 7). 반응물을 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 분석을 위해, MTG 차단제를 첨가하여 MTG가 비활성화하고 mAb를 Rapid PNGase F(1% v/v)로 50℃에서 20분 동안 탈글리코실화하고 DTT로 50 mM로 환원한 다음 LC-MS로 DOL을 결정하였다.
데이터는 말토덱스트린의 존재 하에서 DOL이 낮게 유지되고 완충제 조성을 수정했음에도 불구하고 컨쥬게이션 속도가 증가하지 않았다는 것을 보여주었다(표 4).
정제된 Activa TI 미생물 트랜스글루타미나제를 사용한 저이온 강도 조건 하에서의 트라스투주맙의 컨쥬게이션. 상업용 MTG에서 말토덱스트린을 제거하기 위해, Ajinomoto로부터 입수한 MTG를 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의해 Activa TI 제형으로부터 정제하고 추가로 저염 완충제로 교환하였다. 50 mg의 Activa 트랜스글루타미나제 분말을 500 ml의 20 mM 소듐 아세테이트 pH 5.2에 용해시켰다. 샘플은 5 ml/분의 유량으로 실온에서 Akta Avant에 부착된 5 ml SP HP HiTrap 컬럼(GE)으로 정제되었다. 이 방법에는 5 컬럼 부피(CV) 평형, 5 CV 세척, 이어서 20 CV에 걸친 완충제 B의 0 - 55% 구배가 포함된다(완충제 A = 20 mM 소듐 아세테이트 pH 5.2, 완충제 B= 20 mM 소듐 아세테이트 pH 5.2, 1 M NaCl). MTG를 포함하는 분획을 모아서 Amicon 농축기(MWCO = 10 kDa)로 농축하였다. 그런 다음 농축된 효소를 Zeba 탈염 컬럼을 사용하여 10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.2로 교환하였다.
트라스투주맙은 37℃에서 밤새 10 mM 포스페이트 완충액 pH 7.2에서 1 mg/ml 항체, 69 μM 트랜스글루타미나제 및 690 μM 3-APA의 각각의 농도에서 트랜스글루타미나제 및 3-APA와 함께 인큐베이션되었다. 이 정제된 MTG를 사용하여 DOL=2 mAb의 생성은 표준 조건과 비교하여 저염 조건 하에서 4배 증가하였다(표 4).
[표 4]
Figure pct00005
실시예 3: PSMA 단일클론 항체의 컨쥬게이션
전립선 특이 막 항원(PSMA)에 결합하는 인간 IgG4 mAb인 PSMB127을 저이온 강도 조건 하에서 MTG와 컨쥬게이트시켰다. PSMB127은 Zeba 탈염 컬럼(Thermo)을 사용하여 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.2로 교환되었다. Zedira MTG를 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액으로 교환하고 3-APA를 물에 용해시켰다. 성분들은 0.9 mM 포타슘 포스페이트 pH 7.2에서 1 mg/mL의 PSMB127, 690 uM의 3-APA, 및 10 U/mg의 Zedira MTG의 최종 농도를 갖는 반응 혼합물에서 조합되었다. 비교를 위해, PBS 기반 완충액에서 동일한 반응을 설정했다(PSMB127 1 mg/mL, 3-APA 690 uM, Zedira MTG 10 U/mg, KH2PO4 1.5 mM, Na2HPO4 8.1 mM, KCl 2.7 mM, NaCl 167 mM, 5 mM 소듐 아세테이트 pH 7). 반응물을 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 분석을 위해, MTG 차단제를 첨가하여 MTG가 비활성화하고 mAb를 Rapid PNGase F(1% v/v)로 50℃에서 20분 동안 탈글리코실화하고 DTT로 50 mM로 또는 TCEP로 5 mM로 환원한 다음 LC-MS로 DOL을 결정하였다.
[표 5]
Figure pct00006
실시예 4: 저이온 강도 조건 하에서 페르투주맙과 3-APA의 컨쥬게이션
Her2에 결합하는 인간 IgG1 mAb인 페르투주맙은 저이온 강도 조건 하에 MTG와 컨쥬게이트되었다. 임상 등급 페르투주맙은 Genentech에서 입수하였으며 Zeba 탈염 컬럼(Thermo)을 사용하여 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.2로 교환하였다. Zedira MTG를 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액으로 교환하고 3-APA를 물에 용해시켰다. 성분들은 0.9 mM 포타슘 포스페이트 pH 7.2에서 1 mg/mL의 페르투주맙, 690 uM의 3-APA, 및 10 U/mg의 Zedira MTG의 최종 농도를 갖는 반응 혼합물에서 조합되었다. 비교를 위해, 동일한 반응이 mAb 및 효소 제형의 추가 완충액 성분과 함께 PBS 기반 완충액에서 설정되었다(페르투주맙 1 mg/mL, 3-APA 690 uM, 및 Zedira MTG 10 U/mg, KH2PO4 1.5 mM, Na2HPO4 7.8 mM, KCl 2.6 mM, NaCl 163 mM, 5 mM 소듐 아세테이트, 0.6 mM 히스티딘 아세테이트, 3.9 mM 수크로스, 0.001% 폴리소르베이트 20 pH 7). 반응물을 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 분석을 위해, MTG 차단제를 첨가하여 MTG가 비활성화하고 mAb를 Rapid PNGase F(1% v/v)로 50℃에서 20분 동안 탈글리코실화하고 DTT로 50 mM로 또는 TCEP로 5 mM로 환원한 다음 LC-MS로 DOL을 결정하였다.
10 mM 포타슘 포스페이트에서 수행된 반응은 100% 컨쥬게이션을 나타낸 반면 PBS에서 수행된 반응에서는 페르투주맙의 28%만이 DOL 2를 달성했다. 표 6. 다양한 반응 조건에서 37℃에서 MTG 및 3-APA와 함께 18 내지 20시간 인큐베이션한 후 완전히 변형된(DOL=2로) 무손상 WT 인간 IgG의 분율. DOL 종은 중쇄(†)의 감소된 질량 분석으로부터 추정되었다.
Figure pct00007
실시예 5: 저이온 강도 조건 하에서 파니투무맙과 3-APA의 컨쥬게이션
EGFR에 결합하는 인간 IgG2 mAb인 파니투무맙은 저이온 강도 조건 하에 MTG와 컨쥬게이트되었다. 임상 등급 파니투무맙은 GSK에서 입수하였으며 Zeba 탈염 컬럼(Thermo)을 사용하여 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.2로 교환하였다. Zedira MTG를 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액으로 교환하고 3-APA를 물에 용해시켰다. 성분들은 0.9 mM 포타슘 포스페이트 pH 7.2에서 1 mg/mL의 파니투무맙. 690 uM의 3-APA, 및 10 U/mg의 Zedira MTG의 최종 농도를 갖는 반응 혼합물에서 조합되었다. 비교를 위해, 동일한 반응이 mAb 및 효소 제형의 추가 완충액 성분과 함께 PBS 기반 완충액에서 설정되었다(파니투무맙 1 mg/mL, 3-APA 690 uM, 및 Zedira MTG 10 U/mg, KH2PO4 1.4 mM, Na2HPO4 7.7 mM, KCl 2.6 mM, NaCl 165 mM, 소듐 아세테이트 8.6 mM, pH 7). 반응물을 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. 분석을 위해, MTG 차단제를 첨가하여 MTG가 비활성화하고 mAb를 Rapid PNGase F(1% v/v)로 50℃에서 20분 동안 탈글리코실화하고 DTT로 50 mM로 또는 TCEP로 5 mM로 환원한 다음 LC-MS로 DOL을 결정하였다.
10 mM 포타슘 포스페이트에서 수행된 반응은 69% 컨쥬게이션을 나타낸 반면 PBS에서 수행된 반응에서는 파니투무맙의 28%만이 DOL 2를 달성했다(표 7).
[표 7]
Figure pct00008
실시예 6: 저이온 강도 조건 하에서 일련의 기질에 대한 트라스투주맙의 컨쥬게이션
저염 조건 하에서 MTG와의 컨쥬게이션을 위해 일련의 아민 함유 기질을 수득하였다. 다양한 크기의 3개의 추가 아지드 함유 아민이 시험되었으며, 아민과 아지드 사이의 링커는 길이는 11 내지 71개 원자 범위이다. 세포독성 페이로드 MMAF에 연결된 아민과 마찬가지로 비오틴 연결된 아민 펜틸아미노비오틴도 시험하였다. 시험한 기질은 표 8에 나타나 있다:
[표 8]
Figure pct00009
저이온 강도 조건 하에서 컨쥬게이션 효율을 평가하기 위해, Zeba 탈염 컬럼을 사용하여 트라스투주맙과 Zedira MTG를 5 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.2로 교환하였다. 성분들은 5 mM 포타슘 포스페이트 pH 7.2에서 1 mg/mL의 트라스투주맙, 690 uM의 기질, 및 10 U/mg의 Zedira MTG의 최종 농도를 갖는 반응 혼합물에서 조합되었다. 비교를 위해, 동일한 반응이 mAb 및 효소 제형의 추가 완충액 성분과 함께 PBS 기반 완충액에서 설정되었다(트라스투주맙 1 mg/mL, 기질 690 uM, 및 Zedira MTG 10 U/mg, KH2PO4 1.4 mM, Na2HPO4 7.7 mM, KCl 2.6 mM, NaCl 165 mM, 소듐 아세테이트 8.6 mM, pH 7). 반응물을 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 분석을 위해, MTG 차단제를 첨가하여 MTG가 비활성화하고 mAb를 Rapid PNGase F(1% v/v)로 20℃에서 20분 동안 탈글리코실화하고 DTT로 50 mM로 환원한 다음 LC-MS로 DOL을 결정하였다.
5 mM 포타슘 포스페이트에서 수행된 반응은 PBS 반응과 비교하여 증가된 컨쥬게이션을 나타냈다(표 9). 일련의 아지드 함유 아민은 모두 저염 조건 하에서 mAb의 DOL=2 종으로의 증가된 전환을 나타냈다. 일반적으로, PBS 및 5 mM 포스페이트 둘 모두에서 더 큰 기질은 더 작은 기질보다 더 적은 생성물을 제공했다. 펜틸아미노 비오틴 기질은 저염 조건 하에서 98% DOL=2에 컨쥬게이션되었고 PBS에서는 40%만 컨쥬게이션되었다. 아민-vcMMAF 분자는 5 mM 포스페이트에서 이러한 조건하에서 DOL 2로 50% 전환에 도달했고 PBS에서는 4%만 전환되었다.
[표 9]
Figure pct00010
위에서 설명한 다양한 이소타입 및 특성의 다양한 인간 IgG 항체는 저이온 강도 조건 하에서 컨쥬게이션 속도 향상을 나타냈다. 여기에는 PSMB127, 인간 IgG4 mAb(실시예 3), 트라스투주맙 및 퍼투주맙, 인간 IgG1 mAb(실시예 1, 2 및 4), 및 파니투무맙, 인간 IgG2 mAb(실시예 5)가 포함된다. 대부분은 본 발명의 저이온 강도 조건 하에 DOL 2에 대하여 > 90% 컨쥬게이션을 나타냈다. 요약하면, 다양한 아민 기질을 사용하여 MTG 촉매 반응에서 WT 인간 IgG가 Gln295에서 완전한 변형(DOL = 2)으로 컨쥬게이트될 수 있는 반응 조건이 확인되었다. 글리칸 조작이 필요하지 않았고, 글리칸은 손상되지 않은 채로 남아있어 mAb의 생물물리학적 및 면역학적 특성을 보존했다.
이러한 결과는 저이온 강도 완충제 조건의 사용이 글리칸 무손상 항체의 일관되고 재현 가능한 표지를 제공한다는 것을 보여준다. 저이온 강도 조건에서(예를 들어, 약 15 mM 이하의 염 완충제, 또는 약 12 mM 이하의 염 완충제, 또는 약 10 mM 이하의 염 완충제, 또는 약 10 mM의 염 완충제에서), 항체의 90% 이상은 항체 또는 약물 컨쥬게이트의 성질에 관계 없이 2의 DOL을 일관되게 나타낸다.
서열
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. <120> METHODS FOR SITE SPECIFIC CONJUGATION OF PROTEINS CONTAINING GLYCOSYLATED Fc DOMAINS <130> JBI6303WOPCT1 <150> US 63/027,400 <151> 2020-05-20 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ser Asp 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Tyr Val Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450

Claims (37)

  1. 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질이 무손상 글리칸 함량을 갖는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아민 화합물이 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 조영제 또는 제1 클릭 반응 파트너 중 하나 이상을 포함하는 아민 함유 페이로드(payload)인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질은 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 아민 화합물과 반응시키기 전에 엔도 또는 엑소-글리코시다제로 처리되지 않는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 글리코실화 부위는 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 저이온 강도 조건에서 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 화합물과 반응시키기 전에 글리칸-조작되거나 글리칸-변형되지 않는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질이 아미노산 Asn297에서 N-연결된 글리칸을 함유하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 25 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 20 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 15 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 저이온 강도 조건에서의 제조 방법이 약 10 mM 이하의 염 농도를 포함하는 용액에서 수행되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 저이온 강도의 용액이 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, HEPES, 소듐 아세테이트, 또는 Tris를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 저이온 강도의 용액이 포타슘 포스페이트를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 저이온 강도의 용액이 소듐 포스페이트를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  14. 제11항에 있어서, 저이온 강도의 용액이 HEPES를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  15. 제11항에 있어서, 저이온 강도의 용액이 Tris를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  16. 제11항에 있어서, 저이온 강도의 용액이 소듐 아세테이트를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 방법이 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질을 포함하는 용액의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 조건을 제공하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 방법이 트랜스글루타미나제를 포함하는 용액의 이온 강도를 감소시켜 저이온 강도 조건을 제공하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 이온 강도가 희석, 또는 투석, 정용여과, 여과, 침전 및/또는 크로마토그래피 방법을 통한 완충제 교환에 의해 감소되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 미생물 트랜스글루타미나제인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 화합물이 1차 아민 화합물인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 1차 아민 화합물이 아지드를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 방법이 컨쥬게이트된 항체를 반응성 페이로드 화합물과 반응시켜 항체-페이로드 컨쥬게이트를 형성하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 방법이 중쇄당 적어도 0.9의 평균 표지화도(DOL)를 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제조 방법이 중쇄당 1의 평균 표지화도(DOL)를 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 방법이 항체 당 적어도 1.8의 DOL을 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 제조 방법이 항체 당 2.0의 DOL을 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코실화된 항체 또는 상기 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 80% 이상이, 각각 DOL이 2인 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 상기 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질(즉, DOL이 2인 항체 종 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질 종)로 전환되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코실화된 항체 또는 상기 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 90% 이상이, 각각 DOL이 2인 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 상기 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질로 전환되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글리코실화된 항체 또는 글리코실화된 Fc 융합 단백질의 100%가, 각각 DOL이 2인 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 상기 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질로 전환되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 방법이 각각 상기 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 컨쥬게이션 Fc 융합 단백질에 비해 10% 미만의 부산물을 제공하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  32. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, LC-MS에 의해 표지화도(DOL)를 결정하는 것을 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질이 그 Fc 도메인에서 컨쥬게이트되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질이 Gln295에서 컨쥬게이트되는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질은 Gln295에서 링커를 통해 아민 함유 페이로드에 컨쥬게이트되고, 페이로드는 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성 핵종, 킬레이트제, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 비오틴, 조영제, 및 제1 클릭 반응 파트너로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 반응성 기를 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  36. 제35항에 있어서, 아민-함유 페이로드는 제1 클릭 반응 파트너를 포함하고, 제조 방법은 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질을 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 독소, 방사성핵종, DNA, RNA, siRNA, 마이크로RNA, 펩티드 핵산, 비천연 아미노산, 펩티드, 효소, 형광 태그, 조영제, 또는 비오틴 중 하나 이상을 포함하는 제2 클릭 반응 파트너와 반응시켜 제2 컨쥬게이트를 수득하는 것을 추가로 포함하는, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  37. 제36항에 있어서, 제1 클릭 반응 파트너가 3-아지도-1-프로필아민이고, 제2 클릭 반응 파트너가 DBCO-val-cit-MMAF 또는 DBCO-MMAF인, 컨쥬게이트된 항체 또는 컨쥬게이트된 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
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