KR20230007688A - 감태 유래 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제 조성물 - Google Patents
감태 유래 후코이단을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan)을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물에 관한 것으로, 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단을 비강 투여한 경우, 림프절의 수지상 세포의 수가 증가하고, 수지상 세포의 활성이 증가하며, 이를 통한 NK 세포 및 T 세포의 활성이 증가하므로, 면역항암 효과가 우수하며, 면역관문 억제제 중 하나인 항-PD-L1 항체와 병용 투여한 결과, 항-PD-L1 항체 단독 투여보다 우수한 항암 효과가 나타나는 것을 확인하고, in vivo에서 암이 전이되는 것을 완전히 억제하는 것을 확인함으로써, 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단을 면역 증강제(adjuvant) 및 암의 치료를 위한 병용 투여제로 제공된다.
Description
본 발명은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan)을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물에 관한 것이다.
암은 신체 전체로 퍼질 가능성이 있는 비정상의 국소적인 세포 성장을 특징으로 하는 질환으로, 현대의학이 정복하지 못한 대표적인 난치성 질환 가운데 하나이다. 암의 유형은 폐암, 방광암, 전립선암, 췌장암, 자궁경부암, 뇌암, 위암, 결장직장암 및 흑색종 등 매우 다양하며, 암을 치료하는 다양한 방법이 개발되었다. 그 중 가장 흔한 치료 방법으로 수술, 방사선 치료 또는 화학요법 약물이 사용되었으나, 최근에는 환자의 면역 체계를 이용하는 면역항암 치료법이 각광받고 있다.
면역항암 치료법은 4세대 암 치료법으로 면역항암제를 이용하는 방법이다. 면역항암제는 투여 약물이 암세포를 직접 사멸시키는 것이 아니라, 환자의 면역 세포를 활성화하여 암에 대한 면역 반응을 증진시키는 물질이다. 면역항암제는 암 항원에 대한 특이적인 반응으로 유도하거나 자연 살해 세포의 활성에 의한 세포독성으로 암을 제거한다.
암에 대한 면역 반응과 관련하여 수지상 세포 및 자연 살해 세포 (natural killer cells; NK cells)에 의한 면역은 항원에 비특이적으로 나타난다. 자연 살해 세포는 외부의 물질 및 병원균에 의해 활성 되면 세포 독성을 나타낼 수 있는 여러 단백질을 분비하게 되고 이는 병원균의 세포막을 파괴시키고 자연 세포 사멸을 유도한다. 따라서 최근에는 자연 살해 세포의 활성을 이용한 다양한 암 치료 방법이 개발되고 있다.
하지만 암환자는 일반적으로 정상인에 비해 면역 활성 능력이 떨어지며 암에 대한 효과적인 면역 활성이 잘 유도되지 않아 치료에 어려움을 겪고 있다. 이는 면역 세포가 암을 발견하더라도 암세포가 분비하는 다양한 면역 억제 물질에 의해 면역 세포의 공격을 회피하기 때문에 나타나는 현상이다. 따라서, 이러한 면역 회피를 극복하고 암세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.
최근 면역을 이용한 암치료법은 탁월한 효능으로 많은 환자의 치료 결과를 도출하고 있다. 면역 항암제는 암 환자의 면역 세포를 인위적으로 활성 시켜 이들 세포가 암세포를 선택적으로 공격하고 사멸시키게 하는 방법을 이용한다. 하지만 암세포는 면역 세포의 공격을 회피하가 위해 다양한 면역 억제 물질을 분비하고 표지하고 있다. 이는 면역 세포가 암 세포를 발견하더라도 암세포가 공격받는 것을 회피하게 하여 지속적으로 암 세포가 성장할 수 있게 해준다. 따라서, 이러한 면역 회피를 극복하고 암 세포를 사멸시킬 수 있는 방법으로 암세포와 면역 세포에서 발현되는 단백질은 중간에서 차단하는 항체가 암치료제로 개발되고 있다. 이들 항체는 면역관문억제 항체라 칭하고 있고 말기 암환자에서도 우수한 항암 효과를 도출하고 있다.
면역 관문 억제제에 의한 암 치료는 활발하게 진행되고 있으나 이에도 단점이 존재한다. 특히, 면역 관문 단백질의 발현이 상대적으로 낮은 환자에게는 큰 효과가 나타나지 않는 것으로 보고되고 있고, 체내에서 충분한 면역 세포의 활성이 일어나지 않아 암세포의 사멸을 유도하지 못하는 경우도 나타나고 있다. 따라서, 본 연구에서는 면역 관문 억제제의 효능을 향상시키기 위한 신규 면역 증강제 (보조제)를 개발하였으며 폐암을 대상으로 특이적 효능을 발휘할 수 있는 새로운 치료 방법이의 개발되는 상황이다.
한편, 면역항암 보조제는 암의 치료를 위해 투여되는 치료제와 병용 투여할 수 있는 약물로, 예컨대 암의 치료를 위한 세포 치료제와 함께 투여되는 면역항암제를 포함한다. 병용투여는 항암제에 대하여 저항성이 나타난 경우에도 유용할 뿐만 아니라 효능이 나타나는 경우에도 항암제의 효능을 증진시켜 투여하는 항암제의 양을 감소시킬 수 있는 장점이 있다. 이를 통하여 항암제의 신체의 각 장기에 미치는 독성 및 부작용은 최소화하면서 항암 효능은 증대시키는 것이 가능하다. 비록 다수의 효과적인 병용 요법 치료법이 지난 수십 년간에 걸쳐 확인되기는 하였지만 계속해서 매년 암 사망수는 높다는 것에 비추어 볼 때, 항암 치료법에서 사용하기 위한 효과적인 치료법을 확인하는 것이 계속적으로 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 면역 세포의 활성을 유도하는 비강 투여용 면역 증강제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 면역 증강제를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan)을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan) 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단을 비강 투여한 경우, 림프절의 수지상 세포의 수가 증가하고, 수지상 세포의 활성이 증가하며, 이를 통한 NK 세포 및 T 세포의 활성이 증가하므로, 면역항암 효과가 우수하며, 면역관문 억제제 중 하나인 항-PD-L1 항체와 병용 투여한 결과, 항-PD-L1 항체 단독 투여보다 우수한 항암 효과가 나타나는 것을 확인하고, in vivo에서 암이 전이되는 것을 완전히 억제하는 것을 확인함으로써, 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단을 면역 증강제(adjuvant) 및 암의 치료를 위한 병용 투여제로 제공될 수 있다.
도 1은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 면역 증진 및 암의 치료를 위한 병용 투여 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 폐 림프절 수지상 세포의 활성에 미치는 영향을 평가한 결과이다. (A)는 50 mg/kg의 감태 유래 후코이단을 투여하는 방법 및 폐 림프절을 도식화한 그림이며, (B)는 폐 림프절 수지상 세포를 유세포 분석기로 분리한 결과이며, (C)는 감태 유래 후코이단에 의한 폐 림프절 수지상 세포의 비율 변화를 유세포 분석기로 분석한 결과이며, (D)는 폐 림프절 수지상 세포의 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7) 발현 양상을 확인한 결과이다. (E)는 수지상 세포의 표면 활성 단백질과 MHC class I과 II의 발현을 유세포 분석기로 확인한 결과이며, (F)는 폐 내부에 분1비된 사이토카인을 확인한 결과이다.
도 3은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 자연살해 세포의 활성에 미치는 영향을 평가한 결과이다. (A)는 폐 림프절 자연살해 세포를 구획한 결과이고 (B)는 감태 유래 후코이단의 비강 투여에 의한 폐 림프절 자연살해 세포의 비율을 확인한 결과이다. (C)는 폐 림프절 내의 자연살해 세포의 수 변화를 관찰한 결과이고 (D)는 활성 자연살해 세포의 세포독성물질 분비 정도를 확인한 결과이다. (E)는 감태 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 폐 내부에 분비되어지는 독성물질을 확인한 결과이다.
도 4는 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 T 세포의 활성화에 미치는 영향을 평가한 결과이다. (A)는 폐 림프절 CD4와 CD8을 발현하는 T 세포의 세포 내 사이토카인 발현 양상과 (B) 비율을 확인한 결과이다.
도 5는 수지상 세포의 유무에 따른 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단에 의해 유도되는 자연살해 세포 및 T 세포의 활성화 변화를 평가한 결과이다.
도 6은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 면역관문 억제제의 항 종양 효과를 평가한 결과이다. (A)는 면역관문억 억제제 항체인 항PD-L1항체와 감태 유래 후코이단 그리고 이들의 혼합 투여에 의한 흑색종(B16 세포주)의 폐 전이 모델 쥐의 생존율을 확인한 결과이고, (B)는 이들 물질을 투여하는 동안 쥐의 체중 변화를 확인한 결과이다. (C)는 암 투여 10일 뒤 (약물 투여 7일 뒤) 폐 내부에 암이 침투된 정도를 병리학적 기법으로 확인한 결과이며 (D)는 자연살해세포 또는 CD8 T 세포가 제거된 쥐에서 항PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단의 혼합 투여에 따른 쥐의 생존율을 확인한 결과이다. (E)는 희쥐에 형광발현 상피세포암(CT-26-iRFP)를 이용한 폐 전이암 모델에서 항PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단의 암 성장 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 폐 림프절 수지상 세포의 활성에 미치는 영향을 평가한 결과이다. (A)는 50 mg/kg의 감태 유래 후코이단을 투여하는 방법 및 폐 림프절을 도식화한 그림이며, (B)는 폐 림프절 수지상 세포를 유세포 분석기로 분리한 결과이며, (C)는 감태 유래 후코이단에 의한 폐 림프절 수지상 세포의 비율 변화를 유세포 분석기로 분석한 결과이며, (D)는 폐 림프절 수지상 세포의 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7) 발현 양상을 확인한 결과이다. (E)는 수지상 세포의 표면 활성 단백질과 MHC class I과 II의 발현을 유세포 분석기로 확인한 결과이며, (F)는 폐 내부에 분1비된 사이토카인을 확인한 결과이다.
도 3은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 자연살해 세포의 활성에 미치는 영향을 평가한 결과이다. (A)는 폐 림프절 자연살해 세포를 구획한 결과이고 (B)는 감태 유래 후코이단의 비강 투여에 의한 폐 림프절 자연살해 세포의 비율을 확인한 결과이다. (C)는 폐 림프절 내의 자연살해 세포의 수 변화를 관찰한 결과이고 (D)는 활성 자연살해 세포의 세포독성물질 분비 정도를 확인한 결과이다. (E)는 감태 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 폐 내부에 분비되어지는 독성물질을 확인한 결과이다.
도 4는 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 T 세포의 활성화에 미치는 영향을 평가한 결과이다. (A)는 폐 림프절 CD4와 CD8을 발현하는 T 세포의 세포 내 사이토카인 발현 양상과 (B) 비율을 확인한 결과이다.
도 5는 수지상 세포의 유무에 따른 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단에 의해 유도되는 자연살해 세포 및 T 세포의 활성화 변화를 평가한 결과이다.
도 6은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단의 비강 투여에 따른 면역관문 억제제의 항 종양 효과를 평가한 결과이다. (A)는 면역관문억 억제제 항체인 항PD-L1항체와 감태 유래 후코이단 그리고 이들의 혼합 투여에 의한 흑색종(B16 세포주)의 폐 전이 모델 쥐의 생존율을 확인한 결과이고, (B)는 이들 물질을 투여하는 동안 쥐의 체중 변화를 확인한 결과이다. (C)는 암 투여 10일 뒤 (약물 투여 7일 뒤) 폐 내부에 암이 침투된 정도를 병리학적 기법으로 확인한 결과이며 (D)는 자연살해세포 또는 CD8 T 세포가 제거된 쥐에서 항PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단의 혼합 투여에 따른 쥐의 생존율을 확인한 결과이다. (E)는 희쥐에 형광발현 상피세포암(CT-26-iRFP)를 이용한 폐 전이암 모델에서 항PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단의 암 성장 억제 효과를 확인한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan)을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물을 제공한다.
상기 후코이단은 림프절에서 면역 세포의 활성을 유도할 수 있으며, 상기 면역 세포는 수지상 세포, NK 세포, 또는 T 세포일 수 있다.
본 발명의 면역 증강제 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 면역 증강제 조성물은 목적에 따라 적절한 방법으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 비강 투여용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 면역 증강제 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan) 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 조성물을 제공한다.
상기 면역관문억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 위암, 경부암, 갑상선암, 편평세포암, 상피세포암, 피부암, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨스 림프종, 비-호지킨스 림프종, 모발상 세포 림프종, 버켓 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 전골수구 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종, 신경교종, 성상세포종, 신경아세포종, 신경초종, 골육종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포상암 및 기형 암종으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 상기 암은 전이성 암일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예> 실험 재료 및 방법
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 동물 모델
C57BL/6(5-8 주령, 암컷) 및 BLAB/c(5-8 주령, 암컷) 마우스는 Shanghai Public Health Clinical Center (SPHCC, Shanghai, China) 또는 Hyochang Science (Daegu, Korea)에서 구입하였다. 마우스는 특정 병원체가 없는 조건에서 SPHCC의 실험 동물 센터 및 영남 대학교에서 사육되었다. 동물 실험은 영남 대학교 실험 동물 센터(#2019-029) 및 SPHCC(#2018-A049-01)의 승인을 받았다. 모든 실험은 동물 실험 윤리 원칙에 따라 수행되었으며, 영남대학교 및 SPHCC의 IACUC 규정에 따라 수행되었다.
2. 암세포 주
B16-F10 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)를 1% 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 10% FBS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함유하는 RPMI-1640 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양되었다. CT26.WT-iRFP-Neo (CT-26-iRFP; Imanis Life Sciences, CL091, Rochester, USA) 세포는 0.4 mg/mL의 G418 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양되었다.
3. 감태 유래 후코이단 추출
건조된 감태(E. cava) 20 g을 분쇄하고, 85% 에탄올 수용액 1 L에 현탁하였다. 10 분 동안 85℃ 환류 조건에서 가열하고, 여과하여 에탄올 용해성 물질을 제거하였다. 여과된 잔류물을 메탄올로 세척하고, 20분 동안 3,000 xg에서 원심분리하여 가수분해되지 않은 잔류물을 제거하였다. 정제된 잔류물에 아세트산, 아세트산 나트륨을 첨가하고, 42%(v/v) 농도 로 에탄올을 추가하여 농축액을 제조하였다. 상기 농축물을 30분 동안 4℃ 10,000 xg에서 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상층액을 수확하여 60%(v/v) 농도로 에탄올을 추가하여 농축액을 제조하였다. 상기 농축액을 30분 동안 4℃ 10,000 xg에서 원심분리하여 침전물을 수확하여 증류수에 재현탁하고, 72 시간 동안 4℃에서 투석(MWCO, 10-12 kDa)후, 동결건조 하였다. 건조된 분말은 감태(E. cava) 유래 후코이단(ECF) 샘플로 사용되었다.
4. 시약 및 항체
이소형 대조군 항체 및 Fc 수용체 항체(Abs)는 BioLegend (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 항-CD3 (17A2), 항-CD11c (N418), 항-CD40 (HM40-3), 항-CD80 (16-10A1), 항-CD69 (H1.2F3), 항-CD86 (GL-1), 항-CD253(종양 괴사 인자 관련 세포 사멸 유도 리간드; TRAIL, N2B2), 항-그랜자임 B (GB11), 항-IFN-γ (R4-6A2), 항-인터류킨(IL)-6 (MP5-20F3), 항-IL-12/23p40 (C17.8), 항-주오 조직 적합성 복합체(MHC) class I (AF6-88.5), 항-MHC class II (M5/114.15.2), 항-NK1.1 (PK136), 항-퍼포린 (S16009A), 및 항-TNF-α (MP6-XT22)는 BioLegend (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 항-PD-L1(programed cell death-ligand 1) Abs는 BioXcell (Lebanon, NH, USA)에서 구입하였다. LPS(Lipopolysaccharide; O111:B4)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
5. 종격림프절(mediastinal lymph node; mLN)의 단일 세포 현탁액 준비
종격림프절(mLN) 세포를 20분 동안 소화 완충액을 함유하는 콜라게나아제 IV 및 DNase I(Sigma-Aldrich)로 처리하였다. 세포를 5 mL의 Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich)에 현탁하고, 5 mL의 신선한 히스토파크(histopaque)로 상부층을 만들었다. 세포를 10분 동안 2,000 xg에서 원심분리하였다. 백혈구는 PBS로 세척한 후에 수확하였다.
6. NK 세포 활성화 분석
종격림프절(mLN) 세포를 Fc 수용체 결합 항체와 함께 배양한 후, 비접합 이소형 대조군 항체로 염색하였다. PBS로 세척한 후 세포를 CD3, CD69, NK1.1, 및 TRAIL의 항체들과 함께 배양하였다. DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색한 후, 세포를 유세포 분석기(ACEA Biosciences Inc., San Diego, CA, USA)로 분석하였다.
7. 세포 내 사이토카인 및 세포 독성 매개체 생산 분석
종격림프절(mLN) 단일 세포 현탁액을 Golgistop™ (2 μM 모네신 용액; BioLegend)과 함께 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 Zombie Violet Fixable Viability Kit (BioLegend)를 사용하여 염색하였다. 세포를 표면 항체로 염색한 후, 4℃에서 20분 동안 고정(BioLegend)하였다. 투과성 세척 완충액(BioLegend)을 사용하여 세포를 투과성화하고, 30분 동안 25℃에서 세포내 항체로 염색하였다. 세척 후, 세포를 PBS에 재현탁하고 유세포 분석기(ACEA Biosciences Inc.)로 분석하였다.
8. ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)
IFN-γ, IL-6, IL-12p70, 및 TNF-α의 수준은 ELISA 키트(BioLegend)를 사용하여 측정하였다. 퍼포린용 ELISA 키트는 Abbkine (Wuhan, China)에서 구입하였다. 그랜자임 B용 ELISA 키트는 LSBIO (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 사이토카인의 농도는 3 반복으로 정량화하였다.
9. mLN DC 분석
종격림프절(mLN) 세포를 lineage 항체(항-B220, 항-CD3, 항-CD49b, 항-CD90.1, 항-Gr-1, 및 항-TER-119) 및 항-CD11c 항체로 염색하였다. 살아있는 백혈구에서 CD11c+lineage-세포는 DC로 정의하였다.
10. DC 고갈
종격림프절(mLN) 세포는 항-CD11c-비오틴 항체(BioLegend)와 함께 4℃에서 15분 동안 배양되었다. 세포를 추가로 항-비오틴-마이크로비드(Miltenyi Biotec)로 20분 동안 염색하였다. 세포를 LD 컬럼(Miltenyi Biotec)에 적용하고 음성 세포를 수확하였다. CD11c+ 세포의 고갈 효능은 유세포 분석(ACEA Biosciences)에 의해 분석된 바와 같이 95% 이상이였다.
11. 마우스 폐암 모델 및 감태 유래 후코이단(ECF) 투여
C57BL/6 마우스에 B16(0.5 × 106) 세포를 정맥 내(i.v.) 투여하였다. 마우스를 무작위로 PBSA, 항-PD-L1 항체, ECF 및 항-PD-L1 항체 + ECF 그룹으로 나눴다. ECF(50 mg/kg)는 종양 주입 후 3일째부터 3일마다 비강 내(i.n.)로 투입되었다. 항-PD-L1 항체(10 mg/kg)는 종양 주입 후 5일째부터 3일마다 복강 내(i.p.)로 투입되었다. 마우스의 생존은 종양 주입 후 30일까지 모니터링되었다.
12. 조직학적 분석
종양 이식 후 10일째에 4% 파라포름알데하이드(1 ml)를 폐에 주입한 후 조직을 수확하였다. 폐를 24 시간 동안 4%의 파라포름알데하이드로 고정하고, 파라핀 포매를 따랐다. 폐를 5 μm의 두께로 절단하였다. 절편의 파라핀 제거 및 재수화 후, 폐 절편을 헤마톡실린 및 에오신(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다.
13. NK 세포 및 T 세포 고갈
NK 또는 CD8 T 세포는 각각 C57BL/6 마우스에서 2일마다 50 μg의 항-NK1.1 (PK136) 또는 항- CD8α (2.43) 항체(BioXcell)를 투여하여 고갈되었다.
14. in vivo 형광 이미지
폐의 전이성 CT-26 암은 BALB/c 마우스에서 CT-26-iRFP 챌린지 후 14일에 FOBI (Cellgentek, Cheongju, Republic of Korea)의 형광생체 내 이미징 시스템을 사용하여 이미지화 되었다.
15. 통계
실험은 각각 3회씩 두 개의 샘플로 수행되었다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SEM)로 분석되어다. Tukey 다중 비교 테스트 및 Mann-Whitney t- 테스트를 사용하여 모든 실험 데이터를 분석하였다. P < 0.05는 통계적 유의미한 것으로 간주되었다.
실시예 1. 림프절에서 감태 유래 후코인단(ECF)이 수지상세포(DC)에 미치는 영향
감태 유래 후코이단(ECF)이 점막 면역 자극에 미치는 영향을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스의 비강으로 50 mg/kg 농도의 감태 유래 후코이단(ECF) 및 1 mg/kg 농도의 내독소(LPS)를 투여하였다. 18 시간 뒤에 비장을 적출하고, 비장 내 수지상 세포(DC)의 활성을 분석하였다. 수지상 세포는 도 2B와 같이 비장의 수지상 세포(DC)는 유세포 분석기를 이용하여 Lineage를 발현하지 않고, CD11c를 발현하는 살아있는 단일 부유 백혈구로 정의되었다. 감태 유래 후코이단(ECF)를 투여한 마우스의 경우, 18 시간후에 종격림프절(mLN)에서 수지상 세포(DC)의 수 및 빈도가 크게 증가(도 2C)하고, PBS 처리한 경우(도 2D)에서도 mLN에서 DC 수가 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 감태 유래 후코이단(ECF)를 투여한 마우스의 경우, 수지상 세포 표면에서 세포의 이동을 유도할 수 있는 C-C 케모카인 수용체 타입 7(CCR7)의 발현이 대조군에 비해 급격히 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 감태 유래 후코이단(ECF)이 수지상 세포(DC)의 림프절로의 이동을 촉진했음을 입증한다(도 2E). 또한, 감태 유래 후코이단(ECF)은 종격림프절(mLN)에서 수지상 세포(DC)에서 공동 자극기, MHC 클래스 I 및 II 발현의 상향 조절을 유도하였다(도 2F). 대조군과 비교하여 기관지 폐포 세척액(BAL)에서 IL-6, IL-12p70, 및 TNF-α의 농도 수준이 감태 유래 후코이단(ECF)에 의해 유의하게 증가하였다(도 2G). 상기 결과는 감태 유래 후코이단(ECF)는 림프절에서의 수지상 세포의 표면 활성 단백질 발현 인자의 발현을 유도하고, 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키며, 수지상 세포의 활성화를 유도함을 입증한다.
실시예 2. 림프절에서 감태 유래 후코인단(ECF)이 NK 세포에 미치는 영향
성숙한 수지상 세포(DC)는 자연 살해 세포(NK 세포)와 같은 다른 면역 세포 활성화를 촉진한다. NK 세포는 항원 비특이적으로 암세포 및 병원균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 강력한 면역 세포중 하나이다. 감태 유래 후코이단이 수지상 세포의 활성화를 유도하는 것을 확인하고, NK 세포의 활성화를 유도하는지 평가하였다. 종격림프절(mLN)에서 감태 유래 후코이단(ECF)가 NK 세포의 활성화에 미치는 영향을 평가하기 위해, 감태 유래 후코이단(ECF)을 50 mg/kg 농도로 C57BL/6 쥐에 비강으로 투여하고, 폐 림프절 내의 NK 세포를 구획화하여 비유을 비교하였다. NK 세포는 도 3A에 나타난 바와 같이 NK1.1+CD3- 세포로 정의되었다. 감태 유래 후코이단(ECF)를 투여한 마우스의 경우, NK1.1+CD3- 세포의 수 및 밀도가 증가하는 것으로 나타났으며(도 3B, 3C), NK 세포의 표면 활성화 마커인 CD69 및 TRAIL의 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 3D). 또한, 감태 유래 후코이단(ECF)은 BAL 유체에서 IFN-γ 및 세포 독성 매개체(그랜자임 B 및 퍼포린)의 농도도 크게 증가시켰다(도 3E). 상기 결과는 감태 유래 후코이단(ECF)는 림프절에서 NK 세포의 활성화를 유도하는 것을 입증한다.
실시예 3. 림프절에서 감태 유래 후코인단(ECF)이 T 림프구에 미치는 영향
성숙한 수지상 세포(DC)는 naive T 세포의 분화 및 활성화를 유도한다. 감태 유래 후코이단이 수지상 세포의 활성화를 유도하는 것을 확인하고, T 림프구 활성화에 미치는 영향을 평가하였다. C57BL/6 쥐의 비강으로 감태 유래 후코이단(ECF)을 3일 간격으로 두 번 투여하고, 폐 림프절을 적출하여 T 세포의 활성을 확인하였다. 종격림프절(mLN)에서 감태 유래 후코이단(ECF)은 효과기 T 세포(effector T cell) 분화를 촉진하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 감태 유래 후코이단(ECF)을 투여한 경우, 인터페론-감마(IFN-γ)의 생산이 증가하고, 종양사멸인자-알파(TNF-α)를 발현하는 CD8 및 CD4 T 세포가 증가하였다. 상기 결과는 감태 유래 후코이단(ECF)이 naive T 세포를 IFN-γ 및 TNF-α를 생산하는 Th1 및 Tc1 세포로 분화를 촉진했음을 입증한다.
실시예 4. 감태 유래 후코인단(ECF)의 T 세포 및 NK 세포 활성화 메커니즘
NK 세포 및 T 세포의 활성화는 성숙한 수지상 세포에 의해 제어된다. 종격림프절(mLN)에서 감태 유래 후코이단(ECF)으로 자극된 수지상 세포가 T 세포 및 NK 세포 활성화 유도에 필수적인지 확인하였다. 림프절 현탁액에서 비오틴이 결합된 항- CD11c 항체를 사용하여 수지상 세포를 제거하고, 감태 유래 후코이단(ECF)을 처리하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 수지상 세포가 제거된 상태에서는 감태 유래 후코이단(ECF)을 처리하여도 NK 세포에서 나타나던 CD69 및 TRAIL의 상향 조절이 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 그랜자임 B, IFN-γ, 및 퍼포린의 상향 조절이 수지상 세포가 제거된 상태에서는 억제되는 것으로 나타났다. 상기 결과는 감태 유래 후코이단(ECF)에 의해 유도되던 NK 세포 및 T 세포의 활성화는 수지상 세포가 존재할 때에만 나타나는 것을 입증한다.
실시예 5. In vivo에서 감태 유래 후코이단의 항 종양 효과 평가
종격림프절(mLN)에서 감태 유래 후코이단(ECF)이 면역 세포의 활성화를 촉진함을 확인함에 따라, 암 치료제로서 감태 유래 후코이단(ECF)이 관문면역 억제제인 항-PD-L1 항체의 효과를 향상시키는 평가하였다. C57BL/6 쥐의 꼬리 정맥으로 흑색종 세포인 B16 세포를 정맥 투여하여 폐 전이암을 유도하였다. 암 투여 3일 후부터 식염수(음성 대조군), 항-PD-L1 항체, 감태 유래 후코이단(ECF) 또는 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)의 혼합물을 3일 간격으로 비강 투여하였다. 이때, 도 1에 나타난 바와 같이 항-PD-L1 항체는 복강으로 주사하였으며, 감태 유래 후코이단(ECF)은 비강으로 투여하였다.
도 6A에 나타난 바와 같이, 항-PD-L1 항체를 단독 투여하는 경우에는 23일 차에 모든 마우스가 사멸하였고, 감태 유래 후코이단(ECF)을 단독 투여한 경우에는 17일에 모든 쥐가 사멸하였으나, 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 모두 투여한 경우에는 80%의 마우스가 30일까지 생존하는 것으로 나타났다. 항-PD-L1 항체를 처리한 경우 식염수(대조군)을 투여한 경우에 비해 마우스의 사망을 지연시켰으나, 마우스가 23일 이내에 모두 사멸되는 것으로 나타났다. 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 모두 투여받은 마우스의 경우에는 30일까지 생존하였다.
또한, 마우스의 체중 변화를 측정한 결과, 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 모두 투여받은 마우스의 경우에는 시간이 지날수록 체중이 증가하는 반면, 다른 실험군 및 대조군에서는 체중이 점진적으로 감소하는 것으로 나타났다(도 6B). 또한, 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 모두 투여받은 마우스의 경우에는 B16 세포가 폐로 침투되는 것이 억제된 반면, 다른 실험군 및 대조군에서는 B16 세포가 폐로 침투되는 것으로 나타났다(도 6C). 상기 결과는 감태 유래 후코이단(ECF)이 NK 세포 및 T 세포의 활성화를 촉진했으며, 활성화된 NK 세포 및 T 세포가 항 종양 효과를 유발 했음을 입증한다.
항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)의 병용 투여로 나타나는 항암 효과가 NK 세포 및 T 세포의 활성이 필요하다는 것을 확인하기 위해, 체내 면역 세포를 제거하는 항체를 투여하여 NK 세포 및 T 세포를 제거하고 나서, 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 병용 투여하였을 때에도 항암 효과가 나타나는지 확인하였다. 도 6D에 나타난 바와 같이, NK 세포 및 T 세포가 제거된 마우스에서는 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 병용 투여함에도 불구하고 B16 종양 세포의 투입으로 마우스의 사멸을 방지하지 못하는 것으로 나타났다. 다른 대조군에 비해 NK 세포 및 T 세포가 모두 제거된 마우스에서 마우스가 생존하는 기간이 가장 짧게 나타났다. 상기 결과를 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 병용 투여로 인한 항암 효과는 NK 세포 및 T 세포의 활성화를 통해 나타난다는 것을 입증한다.
또한, B16 종양 세포로 유발되는 암 이외에도 다른 다양한 암에서도 감태 유래 후코이단(ECF)의 항암 효과가 나타나는지 평가하였다. BALB/c 마우스에서 상피세포암 세포인 CT-26 세포를 꼬리 정맥으로 투여하여 종양을 유발하였다. 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 상기와 동일한 방법으로 투여하였다. 도 5E에 나타난 바와 같이, 항-PD-L1 항체와 감태 유래 후코이단(ECF)을 병용 투여하는 경우 폐에서 전이성 CT-26 종양이 성장하는 것을 완전히 억제하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 감태 유래 후코이단(ECF)이 T 세포 및 NK 세포를 활성화하여 항-PD-L1 항체의 항 종양 효과를 향상시키며, 상기 효과는 다양한 암에서 나타난다는 것을 입증한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (9)
- 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan)을 유효성분으로 포함하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 면역 증강제(adjuvant) 조성물을 비강 투여용인 것을 특징으로 하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 후코이단은 림프절에서 면역 세포의 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 면역 세포는 수지상 세포, NK 세포, 또는 T 세포인 것을 특징으로 하는 면역 증강제(adjuvant) 조성물.
- 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan) 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는 병용 투여용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 위암, 경부암, 갑상선암, 편평세포암, 상피세포암, 피부암, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨스 림프종, 비-호지킨스 림프종, 모발상 세포 림프종, 버켓 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 전골수구 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종, 신경교종, 성상세포종, 신경아세포종, 신경초종, 골육종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포상암 및 기형 암종으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 병용 투여용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 암은 전이성 암인 것을 특징으로 하는 병용 투여용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 감태(Ecklonia cava) 유래 후코이단(Fucoidan)은 비강 투여용이고, 상기 면역관문억제제는 정맥 주사용인 것을 특징으로 하는 병용 투여용 조성물.
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