KR20230004646A - 조작된 il-12 및 il-23 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230004646A
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케난 크리스토퍼 가르시아
칼렙 알. 글라스맨
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 개시는 일반적으로 인터루킨-12 및 인터루킨-23에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성이 감소된 인터루킨-12 서브유닛 p40의 신규한 변이체를 제공한다. 또한, 이러한 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체를 생산하는 데 유용한 조성물 및 방법뿐만 아니라 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하기 위한 방법, 및/또는 IL-12p40에 의해 매개되는 신호 전달의 섭동과 관련된 병태의 치료를 위한 방법이 제공된다.

Description

조작된 IL-12 및 IL-23 폴리펩타이드 및 이의 용도
연방 후원 R&D에 관한 진술
[001] 본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 계약 AI051321 및 CA177684 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 상호 참조
[002] 본 출원은 2020년 4월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/011,742호 및 2021년 2월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/150,451호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 개시는 본원에 임의의 도면을 포함하여 그 전체가 인용에 의해 명백하게 포함된다.
서열 목록의 도입
[003] 첨부된 서열 목록의 자료는 본원에 인용에 의해 포함된다. 078430-517001WO-Sequence Listing.txt로 명명된 첨부된 서열 목록 텍스트 파일은 2021년 4월 12일에 생성되었고 76.5 KB이다.
분야
[004] 본 개시는 일반적으로 IL-12 및 IL-23에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성이 감소된 신규한 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 또한, 이러한 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체를 생산하는 데 유용한 조성물 및 방법뿐만 아니라 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하기 위한 방법, 및/또는 IL-12p40에 의해 매개되는 신호 전달의 섭동과 관련된 병태의 치료에 유용한 조성물 및 방법이 제공된다.
[005] 건강 질환 및 질병의 치료를 위한 바이오 의약품 또는 치료용 단백질(들)을 함유하는 약학적 제형의 사용은 다수의 제약 및 생명공학 회사의 핵심 전략이다. 예를 들어, 사이토카인 패밀리의 여러 구성원은 암의 치료에 효과적인 것으로 보고되었고, 암 면역요법의 개발에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 사이토카인 패밀리는 이의 투여 및 생체-동화를 개선시키기 위한 많은 임상 작업 및 노력의 초점이 되어 왔다.
[006] IL-12 패밀리 사이토카인, 인터루킨-12(IL-12) 및 인터루킨-23(IL-23)은 각각 암 면역요법 및 자가면역 질환에 대한 가장 유망한 표적 중 하나가 되었다. IL-12 및 IL-23 복합체는 IL-12p40 사이토카인 서브유닛 및 세포-표면 수용체 IL-12 수용체 베타 1(IL-12Rβ1)을 공유하지만 별개의 다운스트림 신호전달을 유도한다. 특히, IL-12는 IL-12Rβ1 및 IL-12Rβ2의 수용체 복합체를 통해 신호를 보내서 NK 세포 및 활성화된 T 세포 둘 모두에서 STAT4의 포스포릴화를 유도한다. STAT4 신호전달은 인터페론-감마(IFNγ)의 발현 및 향상된 종양 세포 사멸을 초래한다. 대조적으로, IL-23은 IL-12Rβ1 및 IL-23R로 구성된 수용체 복합체를 통해 신호를 보내서 STAT3의 포스포릴화 및 IL-17의 발현을 촉진한다. IL-23이 세포외 병원체에 대한 면역에서 중요한 역할을 하지만, 비정상적인 IL-23 신호전달은 다중 자가면역 질환의 발병과 관련이 있다.
[007] 사이토카인을 포함하는 기존의 치료적 접근법의 임상적 성공은 표적외 독성 및 다면발현으로 인해 제한되었으며, 이는 주로 사이토카인이 서로 균형을 이루고 원치 않는 부작용을 초래하는 요망되는 반응자 세포 및 요망되지 않은 반응자 세포 둘 모두에 수용체를 갖는다는 사실에 기인한다. 예를 들어, IL-12의 경우, IL-12의 전신 투여는 NK-세포 매개된 IFNγ 생산으로 인한 독성을 초래한다.
[008] 최근 몇 년 동안, 사이토카인 공학은 원하는 활성 및 감소된 독성을 갖는 사이토카인을 맞춤화하기 위한 유망한 전략으로 부상하였다. 따라서, 치료제로서 사용하기 위해 IL-12 및 IL-23의 특성을 개선하기 위한 추가적인 접근법이 필요하다. 특히, 다른 것들에 비해 특정 다운스트림 기능 및 작용을 선택적으로 활성화시킬 수 있는, 예를 들어, IL-12 및 IL-23의 많은 유익한 특성을 보유하지만 이들의 공지된 독성 부작용이 없고, 항암제 또는 면역 조절제로서의 개선된 사용을 유도하는 IL-12 및 IL-23의 변이체가 필요하다.
[009] 본 개시는 일반적으로 인터루킨-12(IL-12) 및/또는 인터루킨-23(IL-23)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 선택적으로 조절하기 위한 조성물 및 방법을 포함하는 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 일부 구현예에서, 본 개시는 이의 천연 수용체인 인터루킨-12 수용체 서브유닛 베타 1(IL-12Rβ1)에 대해 변경된 결합 친화성을 갖는 다양한 재조합 인터루킨-12 서브유닛 p40(IL-12p40) 폴리펩타이드를 제공한다. 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, IL-12p40은 STAT3-매개 신호전달 및/또는 STAT4-매개 신호전달의 별개의 수준을 달성하도록 조절될 수 있다. 본 개시의 일부 구현예는 세포-타입 편향된 IL-12p40 신호전달을 야기할 수 있는 IL-12p40 부분 작용제를 제공한다. 일부 구현예는 세포-타입 편향된 IL-12 신호전달, 예를 들어, CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 실질적으로 유지하면서 자연 살해(NK) 세포에서 감소된 IL-12 신호전달을 부여할 수 있는 IL-12p40 부분 작용제를 제공한다. 또한, 이러한 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체를 생산하는 데 유용한 조성물 및 방법, 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하기 위한 방법뿐만 아니라 IL-12 신호전달 및/또는 Il-23 신호전달과 같은, IL-12p40의 다운스트림의 신호 전달의 섭동과 관련된 병태를 치료하기 위한 방법이 제공된다.
[0010] 일 양태에서, 본원에는 (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 하나 이상의 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 재조합 폴리펩타이드가 제공된다.
[0011] 개시된 재조합 폴리펩타이드의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 1의 X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 알라닌(A) 치환, 아르기닌(R) 치환, 아스파라긴(N) 치환, 아스파르트산(D) 치환, 류신 치환(L) 치환, 리신(K) 치환, 페닐알라닌(F) 치환, 리신 치환, 글루타민(Q) 치환, 글루탐산(E) 치환, 세린(S) 치환, 및 트레오닌(T) ) 치환, 및 이들 중 임의의 것의 조합으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, E81, F82, K106, K217, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다.
[0012] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A, (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) K219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K219A, (n) E81A/F82A/K106A/K217A, (o) 81A/F82A/K106A/E108A/D115A, p) E81F/F82A, (q) E81K/F82A, (r) E81L/F82A, (s) E81H/F82A, (t) E81S/F82A, (u) E81A/F82A/K106N, (v) E81A/F82A/K106Q, (w) E81A/F82A/K106T, (x) E81A/F82A/K106R 또는 (y) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 내지 8 및 13 내지 16으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
[0013] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 하나 이상의 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; (b) SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이러한 양태에 따른 재조합 폴리펩타이드의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[0014] 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 알라닌(A) 치환, 아르기닌(R) 치환, 아스파라긴(N) 치환, 아스파르트산(D) 치환, 류신(L) 치환, 리신(K) 치환, 페닐알라닌(F) 치환, 리신 치환, 글루타민(Q) 치환, 글루탐산(E) 치환, 세린(S) 치환, 및 트레오닌(T) 치환으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, E81, F82, K106, K217, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다.
[0015] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2와 하나 이상의 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A; (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) E219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K217A, (n) E81F/F82A, (o) E81K/F82A, (p) E81L/F82A, (q) E81H/F82A, (r) E81S/F82A, (s) E81A/F82A/K106N, (t) E81A/F82A/K106Q; (u) E81A/F82A/K106T, (v) E81A/F82A/K106R 또는 (w) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 내지 11 및 17 내지 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
[0016] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 인터루킨-12 수용체, 베타 1(IL-12Rβ1)에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-12Rβ1에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정한 경우, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 인터루킨 12 서브유닛 p35(IL-12p35) 폴리펩타이드와 조합될 때, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 STAT4 신호전달을 자극하는 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 인터루킨 23 서브유닛 p19(IL-23p19) 폴리펩타이드와 조합될 때, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 STAT3 신호전달을 자극하는 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, STAT3 신호전달 및/또는 STAT4 신호전달은 유전자 발현 검정, 포스포-플로우 신호전달 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성된 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정된다.
[0017] 일부 구현예에서, 개시된 재조합 폴리펩타이드에서 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여, 인터루킨-12(IL-12) 및/또는 인터루킨-23(IL-23)을 통해 매개된 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 세포-타입 편향된 신호전달은 NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포-타입 편향된 신호전달은 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 실질적으로 변경되지 않은 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 이의 능력은 실질적으로 유지하면서 NK 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 초래한다.
[0018] 또 다른 양태에서, 본원에는 핵산이 본 개시의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산이 제공된다.
[0019] 개시된 핵산 분자의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 발현 카세트 또는 발현 벡터로서 추가로 정의된다.
[0020] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 재조합 세포로서, 재조합 세포는 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; 및 (b) 본 개시의 재조합 핵산 중 하나 이상을 포함하는 재조합 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 포유동물 세포이다. 관련된 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 본 개시의 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에 관한 것이다.
[0021] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법으로서, 방법은 (a) 본 개시의 하나 이상의 재조합 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 세포가 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 생산하도록 배양 배지에서 하나 이상의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
[0022] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법은 생산된 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 반감기를 증가시키기 위해 생산된 폴리펩타이드를 구조적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합, 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함한다. 따라서, 관련 양태에서, 또한 본원에는 본 개시의 방법에 의해 제조된 재조합 폴리펩타이드가 제공된다.
[0023] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 약학적 조성물로서, 약학적 조성물은 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 약학적으로 허용되는 담체 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
[0024] 개시된 약학적 조성물의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 발현시킨다. 치료용 폴리펩타이드를 발현 및 분비하도록 유전적으로 변형된 재조합 세포의 예는, 종래에 예를 들어, 문헌[Steidler L. et al., Nature Biotechnology, Vol. 21, No. 7, July 2003 및 Oh JH et al., mSphere, Vol. 5, Issue 3, May/June 2020]에서 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 개시의 재조합 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
[0025] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하는 방법으로서, 방법은 대상체에 (a) 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, IL-12p40-매개 신호전달은 IL-12-매개 신호 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12p40-매개 신호전달은 IL-23-매개 신호 전달을 포함한다.
[0026] 따라서, 본 개시의 일부 구현예는 대상체에서 IL-12-매개 신호전달을 조절하는 방법으로서, 방법은 대상체에 (a) 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 IL-12p35 폴리펩타이드, 또는 IL-12p35 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
[0027] 일부 다른 구현예에서, 본원에는 대상체에서 IL-23-매개 신호전달을 조절하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 (a) 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 IL-23p19(p19) 폴리펩타이드, 또는 IL-23p19 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
[0028] 또 다른 양태에서, 본원에는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태의 치료를 위한 다양한 방법으로서, 방법은 (a) 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 (a) IL-12p35(p35) 폴리펩타이드; (b) IL-23p19 폴리펩타이드; 및 (c) (a) 또는 (b)를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
[0029] 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하고/하거나 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하기 위한 개시된 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 인터루킨-12 수용체, 서브유닛 베타 1(IL-12Rβ1)에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-12Rβ1에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하는 경우, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-12Rβ1 수용체에 대한 재조합 폴리펩타이드의 감소된 결합 친화성은 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 STAT4-매개 신호전달의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, IL-12Rβ1 수용체에 대한 재조합 폴리펩타이드의 감소된 결합 친화성은 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 STAT3-매개 신호전달의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, STAT3 신호전달 및/또는 STAT4 신호전달은 유전자 발현 검정, 포스포-플로우 신호전달 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성된 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정된다.
[0030] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 인터루킨-12(IL-12) 및/또는 인터루킨-23(IL-23)에 의해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 세포-타입 편향된 신호전달은 NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포-타입 편향된 신호전달은 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 실질적으로 변경되지 않은 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 이의 능력을 실질적으로 유지하면서 NK 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 CD8+ T 세포에서 INFγ의 발현을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 유지한다. 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 종양 미세환경에서 항종양 면역을 향상시킨다.
[0031] 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-12p40 매개 신호전달과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, IL-12p40 매개 신호전달은 IL-12 매개 신호전달 또는 IL-23 매개 신호전달이다. 일부 구현예에서, 병태는 암, 면역 질환, 또는 만성 감염이다. 일부 구현예에서, 면역 질환은 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스 열, 갑상선염, 크론병, 중증 근무력증, 사구체신염, 자가면역 간염, 다발성 경화증, 원형 탈모증, 건선, 백반증, 이영양성 표피박리증, 전신 홍반 루푸스, 중등도 내지 중증의 판상 건선, 건선성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 및 이식편 대 숙주 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0032] 일부 구현예에서, 본원에는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태의 치료를 위한 다양한 방법으로서, 병태는 급성 골수종 백혈병, 역형성 림프종, 성상세포종, B-세포 암, 유방암, 결장암, 뇌실막종, 식도암, 교모세포종, 신경교종, 평활근육종, 지방육종, 간암, 폐암, 외투 세포 림프종, 흑색종, 신경모세포종, 비-소세포 폐암, 희소돌기아교종, 난소암, 췌장암, 말초 T-세포 림프종, 신장암, 육종, 위암, 암종, 중피종, 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택된 암이다.
[0033] 일부 구현예에서, 조성물은 제1 요법으로서 개별적으로 또는 제2 요법과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법 또는 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 병용 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법과 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전 및/또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 교대로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 단일 제형으로 함께 투여된다.
[0034] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 본원에 개시된 방법의 실시를 위한 키트에 관한 것이다. 일부 구현예는 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하는 방법을 위한 키트로서, 키트는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; 본 개시의 재조합 핵산; 본 개시의 재조합 세포; 및 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상, 및 본원에 개시된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 구현예는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법을 위한 키트로서, 키트는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; 본 개시의 재조합 핵산; 본 개시의 재조합 세포; 및 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상, 및 본원에 개시된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
[0035] 본 개시의 또 다른 양태는 IL-12-p40 매개 신호 전달의 섭동과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 개체를 치료하기 위한, 본 개시의 핵산 분자, 본 개시의 재조합 세포, 또는 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상의 용도이다.
[0036] 전술한 요약은 단지 예시적인 것이고, 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다. 본원에 기재된 예시적인 구현예 및 특징에 추가하여, 본 개시의 추가 양태, 구현예, 목적 및 특징은 도면 및 상세한 설명 및 청구범위로부터 완전히 명백해질 것이다.
[0037] 도 1a 내지 도 1e는 4차 IL-23 복합체의 구조를 도시한다. 도 1a: IL-12 패밀리 사이토카인 조성 및 수용체 사용의 개략도. 도 1a 및 도 1b: IL-23 수용체 복합체의 측면도. 도 1c 내지 도 1e: IL-23과 수용체 서브유닛 사이의 3개의 상호작용 부위 사이의 상호작용을 강조하는 확대도.
[0038] 도 2a 내지 도 2h는 IL-12p40이 IL-12 및 IL-23 신호전달에서 보존된 역할을 한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 2a: IL-12p40은 IL-12Rβ1에 직접 결합한다. 고정된 IL-12p40에 대한 IL-12Rβ1의 결합을 나타내는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 센서그램. 해리 상수(KD)는 정상 상태 친화성 모델을 사용하여 결정되었다. 도 2b 및 도 2c: IL-12 및 IL-23은 CD4+ T 세포에서 STAT 포스포릴화의 별개의 패턴을 유도한다. CD4+ T 세포를 2.5 ㎍ αCD3, 5 ㎍ αCD28 및 100 IU/mL rhIL-2로 2일 동안 활성화시키고, 밤새 휴지시키고, 고정, 투과화 및 유세포 분석에 의한 STAT 포스포릴화의 평가 전에 20' 동안 IL-12 또는 IL-23으로 자극하였다. (d-f) IL-12p40의 공유 인터페이스는 IL-12 및 IL-23 신호전달을 조절한다. 도 2d: IL-12p40과 IL-12Rβ1 사이의 상호작용을 보여주는 리본 다이어그램. 삽입도는 돌연변이유발을 위해 표적화된 아미노산 위치를 보여준다. 도 2e: IL-12p40 돌연변이체는 CD4+ T 세포에서 변경된 IL-12 pSTAT4 신호전달을 유발한다. IL-12p40 변이체를 IL-12p35와 공동발현시키고 CD4+ T 세포 모세포에서 STAT4 신호전달을 자극하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 도 2f: IL-12p40 돌연변이체는 CD4+ T 세포에서 변경된 IL-23 pSTAT3 신호전달을 유발한다. IL-12p40 변이체를 IL-23p19와 공동발현시키고, CD4+ T 세포 모세포에서 STAT3 신호전달을 자극하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 도 2g: IL-12Rβ1 계면에서 아미노산을 나타내는 삽입도를 갖는 IL-12p40의 리본 다이어그램. 도 2h: IL-12p40 변이체의 STAT4 신호전달. IL-12p40 변이체를 IL-12p35와 공동발현시키고 CD4+ T 세포 모세포에서 STAT4 신호전달을 자극하는 이들의 능력에 대해 시험하였다.
[0039] 도 3a 내지 도 3d는 IL-12p40이 뮤린 IL-12의 STAT4 신호전달을 조절한다는 것을 입증하는 실험을 요약한다. 도 3a: IL-12Rβ1의 세포-타입 및 활성화-상태 의존적 발현. 뮤린 NK 세포(CD3-NK1.1+) 또는 CD8+ T 세포(CD3+CD8+)의 마우스 IL-12p40 테트라머 염색에 의해 측정된 IL-12Rβ1 발현 수준을 나타내는 유세포 분석 플롯. 빨간색 선은 200 nM 테트라머 염색을 나타내며, 회색 집단은 스트렙타비딘 염색 단독을 나타낸다. C57/BL6 마우스로부터의 비장 및 림프절의 단일 세포 현탁액을 IL-12p40 테트라머로 직접(생체외) 또는 2.5 ㎍/mL αCD3 5 ㎍/mL αCD28 및 100 IU/mL rmIL-2(모세포)로의 2일 자극 후에 염색하였다. 도 3b는 인간 IL-12p40 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 1) 및 뮤린 IL-12p40 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 서열 정렬을 도시한다. 정렬에서, 보존된 위치는 회색 음영으로 표시되고 돌연변이유발을 위해 표적화된 위치는 별표로 지정된다. 도 3c 및 도 3d: IL-12p40 돌연변이는 CD8+ T 세포 모세포에서 IL-12 신호전달을 조절한다. 지시된 IL-12 변이체(2xAla: E81A F82A, 3xAla: E81A F82A K106A, 4xAla: E81A F82A K106A K217A)로 20' 자극 후 포스포-STAT4 염색의 용량 반응(도 3c) 및 최고 농도의 대표적인 히스토그램(도 3d). 용량-반응은 2개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 오차를 나타내고 2개 이상의 독립적인 실험을 나타낸다.
[0040] 도 4a 내지 도 4c는 본 개시의 일부 비제한적인 구현예에 따른 3개의 예시적인 IL-12 부분 작용제가 차별적인 IL-12Rβ1 발현에 기반하여 세포-타입 특이적 반응을 유도한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 4a: IL-12 부분 작용제는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 생산을 촉진한다. OT-I CD8+ T 세포(CD3+CD8+)에서 세포내 IFNγ의 대표적인 히스토그램(좌측) 및 정량화(우측). OT-I 비장세포를 1 ㎍/mL OVA 펩타이드, 100 IU/mL IL-2 및 1 μM IL-12 변이체로 48시간 동안 자극하였다. 마지막 4시간에, 추가 사이토카인 분비를 방지하기 위해 GolgiStop을 첨가하였다. 도 4b: IL-12 부분 작용제는 NK 세포에서 약화된 IFNγ 유도를 나타낸다. 정제된 NK 세포를 1 μM IL-12 변이체를 갖는 50 ng/mL IL-18로 48시간 동안 자극하였다. 마지막 4시간에, 추가 사이토카인 분비를 방지하기 위해 GolgiStop을 첨가하였다. 도 4c: IL-12 부분 작용제는 세포-타입 편향된 활성을 나타낸다. 야생형 IL-12로 정규화된 T 세포/NK 세포에서 αIFNγ AF647 MFI의 비율은 IL-12 및 부분 작용제에 대해 제시된다. 막대 그래프는 2개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 오차를 나타내고, 2개 이상의 독립적인 실험을 나타낸다. MFI, 평균 형광 강도.
[0041] 도 4d 내지 도 4g는 본 개시의 일부 비제한적인 구현예에 따른 추가적인 예시적인 IL-12 부분 작용제가 차별적인 IL-12Rβ1 발현에 기반하여 세포-타입 특이적 반응을 유도한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 4d: IL-12p40 돌연변이는 CD8+ T 세포 모세포에서 IL-12 신호전달을 조절한다. 지시된 IL-12 변이체로 20' 자극 후 포스포-STAT4 염색의 용량 반응. 용량-반응은 2개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 오차를 나타낸다. 도 4e: IL-12 부분 작용제는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 생산을 촉진한다. OT-I CD8+ T 세포(CD3+CD8+)에서 세포내 IFNγ의 정량. OT-I 비장세포를 1 ㎍/mL OVA 펩타이드, 100 IU/mL IL-2 및 1 μM IL-12 변이체로 48시간 동안 자극하였다. 마지막 4시간에, 추가 사이토카인 분비를 방지하기 위해 GolgiStop을 첨가하였다. 도 4f: IL-12 부분 작용제는 NK 세포에서 약화된 IFNγ 유도를 나타낸다. 정제된 NK 세포를 1 μM IL-12 변이체를 갖는 50 ng/mL IL-18로 48시간 동안 자극하였다. 마지막 4시간에, 추가 사이토카인 분비를 방지하기 위해 GolgiStop을 첨가하였다. 도 4g: IL-12 부분 작용제는 세포-타입 편향된 활성을 나타낸다. 야생형 IL-12로 정규화된 T 세포/NK 세포에서 αIFNγ AF647 MFI의 비율은 IL-12 및 부분 작용제에 대해 제시된다. 막대 그래프는 2개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 오차를 나타내고 2개 이상의 독립적인 실험을 나타낸다. MFI, 평균 형광 강도.
[0042] 도 5a 내지 도 5c는 상기 도 4a 내지 도 4c에 기재된 예시적인 IL-12 부분 작용제가 항원-특이적 종양 세포 사멸을 촉진한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 5a 및 도 5b: IL-12 부분 작용제의 존재 하에 생성된 OT-I 이펙터로부터의 상청액은 B16F10 흑색종 세포에 대한 MHC-I 상향조절을 향상시킨다. OT-I 이펙터 상청액과의 밤새 인큐베이션 후 H2-Kb 표면 발현의 용량 반응(도 5a) 및 대표적인 히스토그램(도 5b). 화살표는 대표적인 히스토그램에 표시된 상청액 희석을 나타낸다. OT-I 이펙터를 1 ㎍/mL OVA 펩타이드, 100 IU/mL IL-2 및 1 μM IL-12 변이체와 함께 비장세포의 72시간 공동배양에 의해 생성하였다. 도 5c 및 도 5d: IL-12 부분 작용제는 항원-특이적 종양 세포 사멸의 역가를 향상시킨다. 도 5c: 특정 사멸 검정의 개략도. 야생형 세포 및 OVA-GFP 발현 B16F10 세포의 1:1 혼합물을 다양한 비율의 OT-I 이펙터와 함께 인큐베이션하고, OVA-GFP+ 세포의 빈도를 사용하여 항원-특이적 사멸을 측정하였다. (도 5d) IL-12의 부재 또는 지시된 IL-12 변이체의 존재 하에 생성된 OT-I 이펙터의 특이적 사멸을 나타내는 용량 반응 곡선. 데이터는 2개의 생물학적 복제물의 평균 및 표준 오차로 표시되고, 2개 이상의 독립적인 실험을 나타낸다.
[0043] 도 6a 내지 도 6i는 NK 세포에 대한 마우스 IL-12 신호전달을 특성화하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 6a: IL-12 부분 작용제는 NK 세포에서 감소된 pSTAT4 신호전달을 유도한다. MACS 정제된 NK 세포를 CellTrace Violet 로딩된 담체 세포와 혼합하고 IL-12 작용제로 20분 동안 자극하였다. 도 6b: IL-18은 NK 세포에서 IL-12 매개된 IFNγ 유도에 필요하다. MACS 정제된 NK 세포를 지시된 바와 같이 50 ng/mL IL-18 및 1 nM IL-12로 자극하였다. 도 6c: IL-12는 NK 세포에서 용량 의존적 IFNγ 생산을 유도한다. NK 세포를 도 4b에서와 같이 IL-12의 적정과 함께 자극하고, 세포내 사이토카인 염색에 의해 48-시간에 IFNγ 유도에 대해 분석하였다. 도 6d: IL-12 작용제는 도 4b와 관련된 NK 세포에서 용량 의존적 IFNγ 발현을 유도한다. 도 6E: 3xAla 및 4xAla IL-12 부분 작용제는 IL-12에 비해 NK 세포에 의한 IFNγ의 분비를 감소시켰다. 도 4b와 관련된 ELISA에 의한 NK 세포 배양물의 상청액에서 IFNγ의 분석. 도 6f 및 도 6g: 8시간 동안 50 ng/mL IL-18 및 1 μM IL-12로 자극된 NK 세포로부터 lfng(도 6f) 및 Tigit(도 6g)의 정량적 PCR(qPCR). Ct 값을 Gapdh로 정규화하고 자극되지 않은 대조군에 대한 배수 유도로 표현하였다. 막대 그래프는 기술적 삼중 복제물의 평균 ± 표준 편차를 보여준다. 도 6h: IL-2 사전-활성화는 NK 세포에서 IL-12Rβ1을 상향조절한다. MACS 정제된 NK 세포를 1000 IU/mL IL-2로 48시간 동안 자극하고 도 3a에서와 같이 200 nM p40 테트라머(적색) 또는 스트렙타비딘 대조군(회색)으로 염색하여 IL-12Rβ1 발현 수준을 확인하였다. 도 6i: IL-2는 NK 세포에서 IFNγ 유도를 향상시키지만 IL-12 부분 작용제와 상승작용을 일으키지 않는다. MACS 정제된 NK 세포를 1000 IU/mL IL-2, 50 ng/mL IL-18 및 1 μM IL-12 작용제로 48시간 동안 활성화시켰다. 점선은 IL-18 단독으로 자극된 NK 세포에서의 IFNγ 염색을 나타낸다. 데이터는 달리 언급되지 않는 한 2개의 생물학적 복제물의 평균 ± 표준 편차로 표시되고, 2개 이상의 실험을 나타낸다.
[0044] 도 7a 내지 도 7f는 본 개시의 다양한 예시적인 인간 IL-12 부분 작용제를 특성화하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 7a: 인간 PBMC에서 IL-12Rβ1의 세포-타입 및 활성화-상태 의존적 발현. 인간 NK 세포(CD3-CD56+) 또는 CD8+ T 세포(CD3+CD8+)의 p40 테트라머 염색에 의해 측정된 IL-12Rβ1 발현 수준을 나타내는 유세포 분석 플롯. 빨간색 선은 200 nM 테트라머 염색을 나타내며, 회색 집단은 스트렙타비딘 염색 단독을 나타낸다. T 세포 모세포의 경우, PBMC를 2.5 ㎍/mL αCD3, 5 ㎍/mL αCD28, 및 100 IU/mL IL-2로 2일 동안 자극하였다. 도 7b: NK 세포 및 T 세포 게이팅 방식. 도 7c 및 도 7d: 20분 동안 IL-12 부분 작용제로 자극된 CD8+ T 세포 모세포의 포스포-유세포측정법. 도 7c: 인간 CD8+ T 세포 모세포에서 pSTAT4 신호전달의 용량-반응 곡선. 도 7d: 히스토그램은 8 nM(IL-12) 또는 1 μM(2xAla: E81A/F82A, 3xAla: E81A/F82A/K106A)에서의 pSTAT4 염색을 보여준다. 도 7e: IL-12 부분 작용제는 CD8+T 세포에 의한 IFNγ 분비를 지원한다. MACS 단리된 CD8+T 세포를 IL-12 작용제의 존재 또는 부재 하에 2 ㎍/mL αCD3, 0.5 ㎍/mL αCD28, 및 5 ng/mL IL-2로 자극하였다. 48시간 후, 상청액을 IFNγ ELISA에 대해 분석하였다. 점선은 IL-12의 부재 하의 IFNγ 수준을 나타낸다. 도 7f: IL-12 부분 작용제는 NK 세포에 의한 약독화된 IFNγ 생산을 나타낸다. MACS 단리된 NK 세포를 IL-12 작용제와 함께 또는 없이 100 ng/mL IL-18로 48시간 동안 자극하고, 상청액을 ELISA에 의해 IFNγ에 대해 검정하였다. 배경 위에서 IFNγ이 검출되지 않은 조건은 측정되지 않은 경우 "n.d."로 나열된다. 데이터는 2개의 생물학적 복제물의 평균 ± 표준 편차로 표현되고, 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
[0045] 도 7g 내지 도 7i는 인간 IL-12 부분 작용제 W37A E81A F82A의 편향된 T 세포를 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 7g: 20분 동안 IL-12 부분 작용제로 자극된 CD8+ T 세포 모세포의 포스포-유세포측정법. 도 7h: IL-12 부분 작용제는 CD8+T 세포에 의한 IFNγ 분비를 지원한다. MACS 단리된 CD8+T 세포를 IL-12 작용제의 존재 또는 부재 하에 2 ㎍/mL αCD3, 0.5 ㎍/mL αCD28, 및 5 ng/mL IL-2로 자극하였다. 48시간 후, 상청액을 IFNγ ELISA에 대해 분석하였다. 점선은 IL-12의 부재 하의 IFNγ 수준을 나타낸다. 도 7i: IL-12 부분 작용제는 NK 세포에 의한 약독화된 IFNγ 생산을 나타낸다. MACS 단리된 NK 세포를 IL-12 작용제와 함께 또는 없이 100 ng/mL IL-18로 48시간 동안 자극하고, 상청액을 ELISA에 의해 IFNγ에 대해 검정하였다. 데이터는 2개의 생물학적 복제물의 평균 ± 표준 편차로 표현되며, 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
[0046] 도 8a 내지 도 8e는 포유동물 세포로부터 뮤린 IL-12 작용제의 발현을 검증하기 위해 수행된 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 8a: Expi293F 세포로부터 IL-12의 정제. (A) Ni-NTA 정제된 뮤린 IL-12의 대표적인 S200 크기 배제 크로마토그래피(SEC). mAU: 밀리 흡광도 단위. 도 8b: 환원(R) 및 비-환원(NR) 조건 하에 Ni-NTA 친화성 정제 및 SEC 후 IL-12의 SDS-PAGE. 도 8c 내지 도 8f: 포유동물-발현된 마우스 IL-12 변이체의 특성화. 도 8c 및 도 8d: 사이토카인으로 20분 자극 후 CD8+ T 세포 모세포의 pSTAT4 염색. 히스토그램은 IL-12의 경우 8 nM 및 부분 작용제의 경우 1 μM에서의 pSTAT4 염색을 보여준다. 도 8e: 포유동물-발현된 IL-12 부분 작용제는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ 생산을 촉진한다. 1 ㎍/mL OVA 펩타이드(257-264), 0.5 ㎍/mL로 αCD28, 100 IU/mL IL-2 및 1 μM IL-12 변이체로 48시간 자극 후 OT-I CD8+ T 세포(CD3+CD8+)에서 세포내 IFNγ의 대표적인 히스토그램(좌측) 및 정량화(우측). 도 8f: 포유동물-발현된 IL-12 부분 작용제는 NK 세포에서 약화된 IFNγ 유도를 나타낸다. 정제된 NK 세포를 1 μM IL-12 변이체를 갖는 50 ng/mL IL-18로 48시간 동안 자극하였다.
[0047] 도 9a 내지 9j는 IL-12 부분 작용제가 생체내에서 세포-타입 특이적 반응을 유도한다는 것을 예시하기 위해 수행된 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 9a: 실험 설계의 개략도. OT-I TCR 유전자 이식 마우스(Thy1.2)로부터의 CD8+ T 세포를 0일에 동종 수용체 마우스(Thy1.1)로 옮겼다. 다음 날, 마우스를 불완전 프로인트 애주번트(Incomplete Freund's Adjuvant)(IFA) 중 50 ㎍ OVA(257-264)로 피하 면역화시키고 30 ㎍ 사이토카인의 매일 복강내 주사를 시작하였다. 사이토카인 처리 5일 후, ELISA에 의한 혈청 IFNγ의 분석 및 유세포 분석에 의한 배수 림프절에서의 세포-타입 프로파일링을 위해 마우스를 안락사시켰다. 도 9b: 부분 작용제가 아닌 IL-12는 체중 감소를 초래한다. 마우스 체중을 매일 모니터링하고 사이토카인 처리를 시작하기 전 1일에 체중에 대해 정규화하였다. 도 9c: 6일에 혈청 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 부분 작용제가 아닌 IL-12는 전신 IFNγ를 상승시킨다. 점선은 이러한 패널 및 후속 패널에서 면역화되지 않은 마우스로부터의 측정을 나타낸다. 도 9d 및 도 9e: 면역화는 사이토카인 처리와 무관하게 PD-1+ OT-I T 세포의 빈도를 증가시킨다. 도 9d: CD3+CD8+Thy1.2+로 확인된 OT-I+ T 세포에서 PD-1 발현을 나타내는 대표적인 FACS 플롯. 도 9e: OT-I+ T 세포의 빈도로서 PD-1+ 세포의 정량화. 도 9f: 부분 작용제가 아닌 IL-12는 OT-I T 세포를 확장시킨다. OT-T 세포는 Thy1.2+로 확인되었고, 총 CD8+ T 세포의 빈도로 발현되었다. 데이터를 Dunn의 다중 비교와 함께 Kruskal-Wallis 시험에 의해 분석하였다. 도 9g: 부분 작용제가 아닌 IL-12는 LAG-3+ NK 세포의 빈도를 증가시킨다. 데이터를 Dunn의 다중 비교와 함께 Kruskal-Wallis 시험에 의해 분석하였다. 도 9h 내지 도 9j: IL-12 부분 작용제는 IL-12에 비해 NK 세포에 대한 활성이 감소된 CD25+ 발현 OT-I T 세포의 빈도를 우선적으로 증가시킨다. 도 9h: OT-I T 세포(상부) 및 NK 세포(하부)에서 CD25 발현을 나타내는 대표적인 FACS 플롯. 도 9i: CD25+ OT-I T 세포의 정량. 도 9j: CD25+ NK 세포의 정량. 데이터를 Tukey의 다중 비교로 일원 ANOVA로 분석하였다. 데이터는 n=5마리 마우스/그룹의 평균 ± 표준 편차로 표현되며, 이는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
[0048] 도 10a 내지 도 10g는 IL-12 부분 작용제가 IL-12 관련 독성을 유도하지 않으면서 MC-38 항종양 반응을 지원한다는 것을 예시하기 위해 수행된 실험의 결과를 개략적으로 요약한다. 도 10a: 실험 설계의 개략도. 마우스에 0일에 Matrigel에서 5x105개의 MC-38 세포를 이식하였다. 7일에 시작하여, 마우스에 지시된 바와 같이 PBS(n=10), 1 ㎍의 IL-12(n=10), 30 ㎍의 IL-12(n=9), 30 ㎍의 2xAla(n=9) 또는 30 ㎍g 3xAla n=10)를 매일 주사하였다. 도 10b: 부분 작용제가 아닌 IL-12는 종양-보유 마우스에서 체중 감소를 유도한다. 체중을 사이토카인 처리 전 7일까지 정규화하였다. 30 ㎍ 용량의 IL-12가 투여된 마우스는 13일 내지 15일 사이에 사이토카인 독성에 걸렸다. 도 10c: 부분 작용제가 아닌 IL-12는 전신 IFNγ를 향상시킨다. 10일에 혈청 IFNγ ELISA, n = 5마리의 마우스/그룹. 도 10d: 부분 작용제가 아닌 IL-12는 이동성을 감소시킨다. 사이토카인 처리 후 MC-38 보유 마우스의 누적 변위. 16일에 캡처된 30초 비디오의 정량. 누적 변위는 시간 경과에 따른 △X 및 △Y의 합으로 계산되었다. 데이터는 n=5마리 마우스/그룹의 평균 ± 표준 편차로 제시된다. 도 10e: IL-12 및 부분 작용제는 MC-38 종양 성장을 약화시킨다. 종양 부피를 Dunn 다중 비교와 함께 Kruskal-Wallis 시험에 의해 20일에 비교하였다. 도 10f: IL-12 및 부분 작용제는 MC-38 보유 마우스의 생존을 연장한다. PBS 또는 IL-12 변이체로 처리된 마우스의 카플란-마이어 곡선. 로그-순위 검정으로부터의 P 값은 Holm-Sidak 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 수정되었다. 도 10g: MC-38 보유 마우스의 개별 종양 성장 곡선. PBS-처리된 마우스에 대한 성장 곡선은 색상에서 사이토카인-처리된 마우스와의 비교를 위해 회색으로 도시되어 있다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현되고, 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
[0049] 본 개시는 일반적으로, 특히, 대상체에서 인터루킨 12(IL-12) 및 인터루킨 23(IL-23)에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 선택적으로 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 IL-12p40이 이의 동족 수용체인 IL-12Rβ1과 어떻게 상호작용하는 지에 대한 새로운 통찰력에 기반한 신규한 IL-12p40 조성물을 제공한다. 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, IL-12p40-매개 신호전달은 STAT3-매개 신호전달 및/또는 STAT4-매개 신호전달의 조정에 의해 조절될 수 있다. 보다 특히, 일부 구현예에서, 본 개시는 인터루킨 12 수용체 베타 1 서브유닛(IL-12Rβ1)에 대해 조절된 결합 친화성을 갖는 새로운 시리즈의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 본 개시는 또한 이러한 IL-12p40 폴리펩타이드를 생산하는 데 유용한 조성물 및 방법, 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하기 위한 방법뿐만 아니라 IL-12p40 수용체의 다운스트림에서 신호 전달의 섭동과 관련된 병태를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
[0050] 인터루킨 IL-12 및 IL-23은 IL-12p40 사이토카인 서브유닛 및 IL-12Rβ1 세포-표면 수용체를 공유하는 이종다이머 사이토카인이다. 하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 완전한 IL-23 수용체 복합체의 x-선 결정 구조를 결정하기 위해 실험을 설계하고 수행하였으며, 이는 결국 IL-12 및 IL-23에 걸쳐 공유되는 IL-12p40과 IL-12Rβ1 사이의 모듈식 상호작용을 나타내었다. 이러한 새로운 구조적 이해에 기초하여, IL-12Rβ1과의 계면에서 돌연변이를 갖는 여러 L-12p40 변이체가 생성되고 STAT3 및 STAT4 신호전달을 유발하는 이들의 능력에 대해 시험되었다. 이러한 접근법을 통해, 일련의 IL-12p40 변이체는 IL-12의 맥락에서 등급화된 STAT4 신호전달 및 IL-23의 맥락에서 등급화된 STAT3 신호전달을 생성할 수 있는 것으로 확인되었다. IL-12의 경우, 본원에 기재된 다수의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드는 세포-타입 편향된 IL-12p40 신호전달, 예를 들어, NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 부여하는 것으로 확인되었다. 일부 다른 구현예에서, 세포-타입 기반 IL-12p40 신호전달은 NK 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 포함하는 반면, CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 이의 능력은 실질적으로 유지한다. 이러한 새로운 사이토카인 작용제는 NK 세포 활성화와 관련된 독성을 감소시키면서 세포독성 T 세포의 항종양 효과를 보존함으로써 치료적 유용성을 가질 수 있다.
정의
[0051] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학적 용어 또는 전문 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 반드시 당 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기술되거나 언급된 많은 기술 및 절차는 당업자에 의해 통상적인 방법을 사용하여 잘 이해되고 통상적으로 사용된다.
[0052] 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포(a cell)"는 이들의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함한다. "A 및/또는 B"는 하기 대안 모두를 포함하기 위해 본원에서 사용된다: "A", "B", "A 또는 B", 및 "A 및 B".
[0053] 본원에서 사용되는 용어 "약"은 대략의 통상적인 의미를 갖는다. 근사 정도가 문맥상 달리 명확하지 않은 경우, "약"은 제공된 값을 포함하는 모든 경우에 제공된 값의 + 또는 - 10% 이내, 또는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림됨을 의미한다. 범위가 제공되는 경우, 이는 경계 값을 포함한다.
[0054] 본원에서 사용되는 용어 "투여" 및 "투여하는"은 경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피하, 근육내, 및 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는 투여 경로에 의한 생물활성 조성물 또는 제형의 전달을 지칭한다. 상기 용어는 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
[0055] 용어 "세포", "세포 배양물", "세포주"는 특정 대상체 세포, 세포 배양물, 또는 세포주뿐만 아니라 이러한 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하고, 이는 배양물에서의 전달 또는 계대 수와 무관하다. 모든 자손이 모 세포와 정확히 동일한 것은 아님이 이해되어야 한다. 이는 돌연변이(예를 들어, 고의적이거나 부주의한 돌연변이) 또는 환경 영향(예를 들어, 메틸화 또는 다른 후성적 변형)으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있어, 자손이 실제로 모 세포와 동일하지 않고, 자손이 원래의 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 것과 동일한 기능성을 유지하는 한, 이는 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.
[0056] 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드의 용어 "유효량", "치료적 유효량", 또는 "약학적 유효량"은 일반적으로 조성물의 부재에 비해 조성물이 언급된 목적을 달성하기에 충분한 양을 지칭한다(예를 들어, 투여되는 효과를 달성하거나, 질병을 치료하거나, 신호전달 경로를 감소시키거나, 질병 또는 건강 상태의 하나 이상의 증상을 감소시킴). "유효량"의 예는 질병의 증상 또는 증상들의 치료, 예방 또는 감소에 기여하기에 충분한 양이며, 이는 "치료적 유효량"으로도 지칭될 수 있다. 증상의 "감소"는 증상(들)의 중증도 또는 빈도의 감소, 또는 증상(들)의 제거를 의미한다. "치료적 유효량"을 포함하는 조성물의 정확한 양은 치료의 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 및 Remington: Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).
[0057] 본원에서 사용되는 용어 "IL-12p40"은 천연이든 재조합이든 야생형 IL-12p40을 의미한다. 이와 같이, IL-12p40 폴리펩타이드는 재조합 생산된 IL-12p40 폴리펩타이드, 합성적으로 생산된 IL-12p40 폴리펩타이드, 세포 또는 조직으로부터 추출된 IL-12p40을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 IL-12p40 폴리펩타이드를 지칭한다. 야생형 인간 IL-12p40 전구체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 도시되어 있으며, 이는 306개 아미노산 성숙 단백질을 생성하기 위해 제거될 수 있는 N-말단 22개 아미노산 신호 펩타이드를 갖는 328개 아미노산 잔기 단백질이다. 성숙한 인간 IL-12p40의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 26에 제공된다. 야생형 뮤린(Mus musculus) IL-12p40 전구체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 도시되어 있으며, 이는 313개 아미노산 성숙 단백질을 생성하기 위해 제거될 수 있는 N-말단 22개 아미노산 신호 펩타이드를 갖는 335개 아미노산 잔기 단백질이다. 성숙한 뮤린 IL-12p40의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 27에 제공된다. 본 개시의 목적을 위해, 모든 아미노산 번호매김은 SEQ ID NO: 1(인간 IL-12p40) 또는 SEQ ID NO: 2(마우스 IL-12p40)에 기술된 IL-12p40 단백질의 전구체 폴리펩타이드(또는 사전-단백질) 서열을 기반으로 한다. 그러나, 당업자는 성숙 단백질이 종종 재조합 폴리펩타이드 작제물을 생성하는 데 사용된다는 것을 이해할 것이다.
[0058] 본원에서 사용되는 용어 IL-12p40 폴리펩타이드의 "변이체"는 기준 IL-12p40 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 IL-12p40 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입이 존재하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "IL-12p40 폴리펩타이드 변이체"는 IL-12p40 폴리펩타이드의 자연 발생 대립유전자 변이체 또는 대안적인 스플라이스 변이체를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 변이체는 모 IL-12p40 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 유사하거나 상동성인 아미노산(들) 또는 상이한 아미노산(들)으로의 치환을 포함한다. 아미노산은 유사하거나 상동인 것으로 순위가 매겨질 수 있는 많은 척도가 존재한다(Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, NY 1987.)
[0059] 본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소, 예를 들어, 폴리펩타이드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 물리적 또는 기능적 연결을 나타내며, 이는 이들이 의도된 방식으로 작동하도록 한다. 예를 들어, 관심 폴리뉴클레오티드와 조절 서열(예를 들어, 프로모터) 사이의 작동 가능하게 연결은 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하는 기능적 연결이다. 이러한 의미에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 영역이 관심 코딩 서열의 전사 또는 번역을 조절하는 데 효과적이도록 전사될 코딩 서열 및 조절 영역의 정위화를 지칭한다. 따라서, 프로모터는 핵산 서열의 전사를 매개할 수 있는 경우 핵산 서열과 작동 가능하게 연결되어 있다. 작동 가능하게 연결된 요소는 인접하거나 비연속적일 수 있음이 이해되어야 한다. 폴리펩타이드의 맥락에서, "작동 가능하게 연결된"은 폴리펩타이드의 기재된 활성을 제공하기 위해 아미노산 서열(예를 들어, 상이한 세그먼트, 모듈, 또는 도메인) 사이의 물리적 연결(예를 들어, 직접 또는 간접적으로 연결된)을 지칭한다. 본 개시에서, 본 개시내용의 재조합 폴리펩타이드의 다양한 세그먼트, 영역, 또는 도메인은 세포에서 재조합 폴리펩타이드의 적절한 폴딩, 프로세싱, 표적화, 발현, 결합, 및 다른 기능적 특성을 유지하기 위해 작동 가능하게 연결될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 다양한 모듈, 도메인, 및 세그먼트는 서로 작동 가능하게 연결된다. 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 작동 가능하게 연결된 모듈, 도메인, 및 세그먼트는 인접하거나 비인접적일 수 있다(예를 들어, 링커를 통해 서로에 연결됨).
[0060] 2개 이상의 핵산 또는 단백질의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "퍼센트 동일성"은 하기 기재된 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정하는 경우, 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 특정 백분율(예를 들어, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 대해 최대 일치성을 위해 비교되고 정렬될 때, 특정 영역에 비해 약 60% 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다(예를 들어, NCBI 웹 사이트(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 참조). 이러한 서열은 이후 "실질적으로 동일한" 것으로 언급된다. 이러한 정의는 또한 서열의 상보체를 지칭하거나 이에 적용될 수 있다. 이러한 정의는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 서열 동일성은 공개된 기술 및 널리 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, GCS 프로그램 패키지(Devereux et al, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990)을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은 위스콘신 대학교 생명공학 센터(University of Wisconsin Biotechnology Center)(1710 University Avenue, Madison, WI. 53705)의 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지(Sequence Analysis Software Package)와 같은 서열 분석 소프트웨어(이의 디폴트 파라미터를 가짐)를 사용하여 측정될 수 있다.
[0061] 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 대상체에게 관심 화합물(들)을 투여하기 위한 약학적으로 허용되는 담체, 첨가제 또는 희석제를 제공하는 임의의 적합한 물질을 지칭한다. 이와 같이, "약학적으로 허용되는 부형제"는 약학적으로 허용되는 희석제, 약학적으로 허용되는 첨가제, 및 약학적으로 허용되는 담체로 지칭되는 물질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 투여와 상용성인 염수, 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 항생제 및 추가 치료제)이 또한 조성물에 도입될 수 있다.
[0062] 본원에서 사용되는 용어 "재조합" 또는 "조작된" 핵산 분자는 인간 개입을 통해 변경된 핵산 분자를 지칭한다. 비제한적인 예로서, cDNA는 시험관내 폴리머라제 반응(들)에 의해 생성되거나 링커가 부착되거나 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 통합된 임의의 핵산 분자와 마찬가지로, 재조합 DNA 분자이다. 비제한적인 예로서, 재조합 핵산 분자는 1) 예를 들어, 화학적 또는 효소적 기술을 사용하여(예를 들어, 화학적 핵산 합성의 사용에 의해, 또는 핵산 분자의 복제, 중합, 외부핵분해 소화, 내부내핵분해 소화, 결찰, 역전사, 전사, 염기 변형(예를 들어, 메틸화 포함), 또는 재조합(상동성 및 부위-특이적 재조합 포함)을 위한 효소의 사용에 의해) 시험관내에서 합성 또는 변형되고/되거나; 2) 자연적으로 공동결합되지 않은 공동결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 3) 자연 발생 핵산 분자 서열과 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결여되도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작되고/되거나; 4) 자연 발생 핵산 서열과 관련하여 하나 이상의 서열 변화 또는 재배열을 갖도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작된 것일 수 있다. 비제한적인 예로서, cDNA는 시험관내 폴리머라제 반응(들)에 의해 생성되거나 링커가 부착되거나 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 통합된 임의의 핵산 분자와 마찬가지로, 재조합 DNA 분자이다. 재조합 핵산 및 재조합 단백질의 또 다른 비제한적인 예는 본원에 개시된 바와 같은 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체이다.
[0063] 본원에서 사용되는 "개체" 또는 "대상체"는 인간(예를 들어, 인간 개인) 및 비-인간 동물과 같은 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, "개체" 또는 "대상체"는 의사의 치료를 받는 환자이다. 따라서, 대상체는 관심 질병(예를 들어, 암) 및/또는 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나 가질 위험이 있거나 가질 것으로 의심되는 인간 환자 또는 개체일 수 있다. 대상체는 또한 진단 시점 또는 그 이후에 관심 질환의 위험으로 진단된 개인일 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 비-인간 영장류, 및 양서류, 파충류 등과 같은 다른 포유동물, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 및 비-포유동물을 포함한다.
[0064] 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 서면 설명을 제공하는 것과 같은 임의의 및 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 이들의 하위 범위의 조합을 포함한다. 열거된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 분류할 수 있도록 충분히 기술하고 가능하게 하는 것으로 용이하게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 1/3, 중간 1/3, 상위 1/3 등으로 용이하게 나누어질 수 있다. 당업자에 의해 또한 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "보다 큰", "보다 작은", 및 유사한 용어는 인용된 번호를 포함하고, 상기 논의된 바와 같이 후속하여 하위 범위로 분류될 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 내지 3개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3개의 물품을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1 내지 5개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 물품 등을 갖는 그룹을 지칭한다.
[0065] 용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자 또는 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 전달된 핵산 분자는 일반적으로, 예를 들어, 벡터 핵산 분자에 연결되고, 예를 들어, 여기에 삽입된다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 요소와 회합될 때 복제될 수 있다. 용어 "벡터"는 클로닝 벡터 및 발현 벡터뿐만 아니라 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하여, 시험관내 및/또는 생체내에서 DNA 서열 및 단편을 발현할 수 있는 벡터이다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 유도하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로서 사용된다.
[0066] 본원에 기재된 개시내용의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는(comprising)", "구성되는", 및 "필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)"을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는", 또는 "~에 의해 특징되는"과 동의어이고, 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 사용되는 "~로 구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 "필수적 요소로 하여 구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 특히 조성물의 성분의 설명 또는 방법의 단계의 설명에서 용어 "포함하는"의 본원의 임의의 언급은 인용된 성분 또는 단계를 필수적 요소로 하여 구성되고 이들로 구성된 그러한 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
[0067] 표제, 예를 들어, (a), (b), (i) 등은 단지 명세서 및 청구범위를 읽기 쉽게 하기 위해 제시된다. 명세서 또는 청구범위에서 표제의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 또는 숫자 순서 또는 제시된 순서로 수행될 것을 요구하지 않는다.
[0068] 값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 각각의 개재 값은, 그 범위의 상한 및 하한과 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 또는 개재 값 사이의 하한 단위의 10분의 1까지 본 개시에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 개시 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 개시에 포함된다.
[0069] 특정 범위는 본원에서 용어 "약"이 앞에 오는 수치 값으로 제시된다. 용어 "약"은 그것이 선행하는 정확한 숫자 뿐만 아니라 용어가 선행하는 숫자에 가깝거나 대략적인 숫자에 대한 문자 그대로의 지지를 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 숫자가 구체적으로 인용된 수에 근접하거나 대략적으로 있는 지의 여부를 결정함에 있어서, 인용되지 않은 수에 가깝거나 근사한 수는 제시된 맥락에서 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 등가물을 제공하는 수일 수 있다.
[0070] 명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 설명되는 본 개시의 특정 특징은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 설명되는 본 개시의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 개시에 관한 구현예의 모든 조합은 본 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예 및 이의 요소의 모든 하위-조합은 또한 본 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 이러한 하위 조합이 본원에 개별적으로 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
인터루킨-12 서브유닛 P40(IL-12P40)
[0071] 사이토카인은 세포 표면 수용체의 다량체화 및 JAK-STAT 신호전달 경로의 유도를 통해 생리학의 다양한 양태를 조절하는 분비된 인자이다. 인터루킨-12(IL-12) 및 인터루킨-23(IL-23)은 병원체 관련 분자 패턴에 반응하여 항원 제시 세포에 의해 생산되고 다중 림프구 집단의 활성화 및 분화를 조절하는 이종다이머 사이토카인이다. 일반적인 IL-12p40 서브유닛 및 IL-12 수용체 베타 1(IL-12Rβ1)의 사용에도 불구하고, IL-12 및 IL-23은 면역계에서 비중복 역할을 한다.
[0072] IL-12는 NK 세포 및 T 세포에서 발현된 IL-12Rβ1 및 IL-12Rβ2의 수용체 복합체를 통해 신호를 보낸다(도 1a). IL-12 수용체의 다이머화는 서로를 포스포릴화시키는 수용체 관련 야누스 키나제(JAK) 분자뿐만 아니라 전사 4의 SH2 함유 신호 변환기 및 활성기(STAT4)에 대한 도킹 부위로서 역할을 하는 IL-12Rβ2의 세포내 도메인 상의 잔기를 유도한다. 수용체 관련 STAT4 단백질은 이후 핵으로 전위되기 전에 포스포릴화되며, 여기서, 이러한 것들은 IFNγ의 발현 및 T 헬퍼 1(Th1) 표현형으로의 CD4+ T 세포의 분극화를 촉진한다. 세포내 병원체에 대한 면역과 암 간의 유사성을 감안할 때, 백신 애주번트 및 에피토프의 선택을 통해 간접적으로, 또는 IL-12의 투여를 통해 직접적으로 Th1 반응을 자극하는 치료적 접근법이 암 면역요법의 맥락에서 탐구되었다. 전임상 모델에서의 가능성에도 불구하고, IL-12 투여의 치료 효능은 IFNγ의 NK 세포 매개된 생산과 관련된 독성으로 인해 제한되었다.
[0073] 도 1a에 개략적으로 도시된 바와 같이, IL-12는 IL-12Rβ1 및 IL-23 수용체(IL-23R)에 의해 형성된 수용체 복합체를 통해 신호를 보내는 IL-23과 이의 IL-12p40 서브유닛을 공유한다. IL-12 및 IL-23에 대한 공유 수용체로서, IL-12Rβ1은 T 세포, NK 세포 및 단핵구에서 발현되는 반면, IL-23R의 발현은 γδT 세포 및 CD4+ T 세포로 제한된다. IL-12Rβ1의 공유 사용에도 불구하고, IL-12 및 IL-23은 별개의 표현형 효과를 갖는다. CD4+ T 세포에서, IL-23 신호전달은 STAT3의 포스포릴화 및 Th17 계통을 생산하는 IL-17의 안정화를 촉진한다. Th17 세포 및 IL-23 신호전달이 세포외 병원체에 대한 면역 반응에서 중요한 역할을 하지만, 비정상적인 Th17 활성은 다중 자가면역 병태와 관련이 있다. 실제로, IL-23p19 또는 IL-12p40의 유전적 결핍은 실험적 자가면역 뇌척수염 및 대장염에 대해 마우스를 보호한다. 임상적으로, IL-23을 표적으로 하는 길항제 항체는 중등도 내지 중증 판상 건선, 건선성 관절염, 크론병 및 궤양성 대장염의 치료에 대해 승인되었지만, 이러한 항체 중 다수는 IL-12 및 IL-23 신호전달을 모두 차단하여 합병증, 예를 들어, 감염 위험 증가를 유발한다.
[0074] IL-12 및 IL-23 신호전달의 임상적 중요성을 감안할 때, 이러한 중요한 사이토카인 축을 특이적으로 조절하기 위해서는 새로운 전략이 필요하다. 그러나, IL-12 및 IL-23이 이들의 수용체에 결합하고 다운스트림 신호전달을 개시하는 방법에 대한 구조적 정보의 부족은 새로운 사이토카인 변이체를 조작하는 능력을 제한하였다. 이를 해결하기 위해, 완전한 IL-23 수용체 복합체(IL-23p19/IL-12p40/IL-23R/IL-12Rβ1)의 결정 구조를 해결하기 위한 실험을 수행하였고, 이는 IL-12p40이 IL-12Rβ1에 직접 관여한다는 것을 나타내었다. IL-12Rβ1 및 IL-12p40 둘 모두는 IL-12와 IL-23 사이에 공유되기 때문에, 이러한 계면은 IL-12 및 IL-23 둘 모두의 신호전달을 개시하는 복합 어셈블리에서 중요한 특징을 나타낸다. 결정 구조로부터 수득된 새로운 통찰력을 사용하여 STAT 신호전달을 조절하는 IL-12 및 IL-23 부분 작용제의 패널을 설계하였다. 하기 입증되는 바와 같이, 다수의 IL-12 작용제는 CD8+ T 세포 IFNγ 유도 및 종양 세포 사멸을 보존할 수 있지만 NK 세포로부터 감소된 IFNγ 생산을 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 항원-특이적 T 세포에 대한 IL-12의 활성을 제한함으로써, IL-12 부분 작용제는 IFNγ의 NK 세포 생산과 관련된 독성을 감소시킴으로써 치료적 유용성을 가질 수 있다.
[0075] 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, IL-12p40이 공유 수용체 IL-12Rβ1에 관여함을 나타내는 4차 IL-23 수용체 복합체의 3.4 Å 분해능 결정 구조를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 이러한 수용체 어셈블리의 메커니즘은 사이토카인 슈퍼패밀리에 대해 독특하고, IL-12 및 IL-23 수용체 어셈블리에서 IL-12p40에 대한 공유된 역할을 나타낸다. 이러한 새로이 확립된 구조로부터의 통찰력을 이용하여, NK 세포에 대한 감소된 활성을 갖는 항원-특이적 CD8+ T 세포 기능을 지원하기 위해 세포-타입에 걸친 IL-12Rβ1 발현의 차이를 이용하는 IL-12 부분 작용제의 패널을 설계하고 시험하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 본 개시는 IL-12p40 매개 신호전달을 조절하는 데 유용한 새로운 분자, 및 세포-타입 선택적 사이토카인 작용제를 조작하기 위한 새로운 접근법을 제공한다.
본 개시의 조성물
A. 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드
[0076] 상기 약술된 바와 같이, 본 개시의 일부 구현예는 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성이 변경되고 조직-특이적 방식으로 인터루킨-12(IL-12) 및/또는 인터루킨-23(IL-23)을 통해 매개된 다운스트림 신호 전달의 부분 작용의 특성을 갖는 새로운 시리즈의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 감소된 능력을 부여한다. 일부 다른 구현예에서, 본원에 개시된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 NK 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 감소된 능력을 부여하면서 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 이의 능력을 실질적으로 유지한다.
[0077] 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 (b) SEQ ID NO: 1의 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이다.
[0078] 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0079] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 약 1 내지 약 14개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 약 1 내지 약 5, 약 2 내지 약 8, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 15, 약 3 내지 약 5, 약 7 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 12개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 또는 적어도 15개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
[0080] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 본 개시의 예시적인 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 SEQ ID NO: 1의 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 X39, X40, X81, X82에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함한다.
[0081] 본 개시의 이러한 양태 및 다른 양태에 따르면, IL-12p40 폴리펩타이드에서 임의의 이러한 아미노산 치환은 이러한 치환이 결여된 모 IL-12p40 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-12Rβ1에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는 IL-12p40 변이체를 생성한다. 예를 들어, 본원에 개시된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 IL-12Rβ1에 대해 증가된 친화성 또는 감소된 친화성을 가질 수 있거나 야생형 IL-12p40의 것과 동일하거나 유사한 IL-12Rβ1에 대한 친화성을 가질 수 있다. 본원에 개시된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 또한 IL-12p40의 다른 위치(예를 들어, IL-12p40 변이체의 이차 또는 삼차 구조에 최소 효과를 갖는 것들)에서의 보존적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 이러한 보존적 치환은 문헌[Dayhoff in The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978), 및 Argos in EMBO J, 8:779-785 (1989)]에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 하기 그룹 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다: 그룹 I: Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; 그룹 II: Cys, Ser, Tyr, Thr; 그룹 III: Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; 그룹 IV: Lys, Arg, His; 그룹 V: Phe, Tyr, Trp, His; 및 그룹 VI: Asp, Glu.
[0082] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 아미노산 치환(들)은 알라닌(A) 치환, 아르기닌(R) 치환, 아스파라긴(N) 치환, 아스파르트산(D) 치환, 류신(L) 치환, 리신(K) 치환, 페닐알라닌(F) 치환, 리신 치환, 글루타민(Q) 치환, 글루탐산(E) 치환, 세린(S) 치환, 및 트레오닌(T) 치환, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드에서 아미노산 치환의 비제한적인 예는 하기 표 1에 제공된다.
표 1: 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드에서의 예시적인 아미노산 치환.
Figure pct00001
[0083] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 또는 적어도 7개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
[0084] 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, E81, F82, K106, K217, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 E81, F82, K106, K217, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 W37, P39, D40, E81, F82에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 E81, F82, K106, K217, 및 K219에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) K219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K219A, (n) E81A/F82A/K106A/K217A, (o) 81A/F82A/K106A/E108A/D115A, (p) E81F/F82A, (q) E81K/F82A, (r) E81L/F82A, (s) E81H/F82A, (t) E81S/F82A, (u) E81A/F82A/K106N, (v) E81A/F82A/ K106Q, (w) E81A/F82A/K106T, (x) E81A/F82A/K106R 또는 (y) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) K219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K219A, (n) E81A/F82A/K106A/K217A, (o) 81A/F82A/K106A/E108A/D115A, (p) E81F/F82A, (q) E81K/F82A, (r) E81L/F82A, (s) E81H/F82A, (t) E81S/F82A, (u) E81A/F82A/K106N, (v) E81A/F82A/ K106Q, (w) E81A/F82A/K106T, (x) E81A/F82A/K106R 또는 (y) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) K219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K219A, (n) E81A/F82A/K106A/K217A, (o) 81A/F82A/K106A/E108A/D115A, (p) E81F/F82A, (q) E81K/F82A, (r) E81L/F82A, (s) E81H/F82A, (t) E81S/F82A, (u) E81A/F82A/K106N, (v) E81A/F82A/ K106Q, (w) E81A/F82A/K106T, (x) E81A/F82A/K106R 또는 (y) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 3 내지 8 및 13 내지 16으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0085] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, (b) SEQ ID NO: 2의 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이러한 양태에 따른 재조합 폴리펩타이드의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 서열과 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0086] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 약 1 내지 약 14개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 약 1 내지 약 5, 약 2 내지 약 8, 약 3 내지 약 10, 약 4 내지 약 12, 약 5 내지 약 15, 약 3 내지 약 5, 약 7 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 12개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 또는 적어도 15개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
[0087] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 또는 적어도 7개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 본 개시의 예시적인 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 SEQ ID NO: 2의 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 X81, X82, X106, 및 X217로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 X81, X82, 및 X106에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 X81, X82, X106, 및 X217에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
[0088] 본 개시의 이러한 양태 및 다른 양태에 따르면, IL-12p40 폴리펩타이드에서 임의의 이러한 아미노산 치환(들)은 이러한 치환(들)이 결여된 모 IL-12p40 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-12Rβ1에 대해 변경된 결합 친화성을 갖는 IL-12p40 변이체를 생성한다. 예를 들어, 본원에 개시된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 IL-12Rβ1에 대해 증가된 친화성 또는 감소된 친화성을 가질 수 있거나 야생형 IL-12p40의 것과 동일하거나 유사한 IL-12Rβ1에 대한 친화성을 가질 수 있다. 본원에 개시된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 또한 IL-12p40의 다른 위치(예를 들어, IL-12p40 변이체의 이차 또는 삼차 구조에 최소 효과를 갖는 것들)에서 보존적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 이러한 보존적 치환은 상기 문헌[Dayhoff 1978, 및 Argos 1989]에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 하기 그룹 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화를 나타낸다: 그룹 I: Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; 그룹 II: Cys, Ser, Tyr, Thr; 그룹 III: Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; 그룹 IV: Lys, Arg, His; 그룹 V: Phe, Tyr, Trp, His; 및 그룹 VI: Asp, Glu.
[0089] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 아미노산 치환(들)은 알라닌(A) 치환, 아르기닌(R) 치환, 아스파라긴(N) 치환, 아스파르트산(D) 치환, 류신(L) 치환, 리신(K) 치환, 페닐알라닌(F) 치환, 리신 치환, 글루타민(Q) 치환, 글루탐산(E) 치환, 세린(S) 치환, 및 트레오닌(T) 치환, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 아미노산 치환(들)은 알라닌 치환을 포함한다. 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드에서 아미노산 치환의 비제한적인 예는 하기 표 2에 제공된다.
표 2: 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드에서의 예시적인 아미노산 치환.
Figure pct00002
[0090] 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 또는 적어도 7개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
[0091] 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, E81, F82, K106, K217, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 E81, F82, K106, 및 K217로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 E81, F82, 및 K106에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 E81, F82, K106, 및 K217에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A; (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) E219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K217A, (n) E81F/F82A, (o) E81K/F82A, (p) E81L/F82A, (q) E81H/F82A, (r) E81S/F82A, (s) E81A/F82A/K106N, (t) E81A/F82A/K106Q; (u) E81A/F82A/K106T, (v) E81A/F82A/K106R 또는 (w) P39A/D40A/E81A/F82A.
[0092] 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A; (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) E219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K217A, (n) E81F/F82A, (o) E81K/F82A, (p) E81L/F82A, (q) E81H/F82A, (r) E81S/F82A, (s) E81A/F82A/K106N, (t) E81A/F82A/K106Q; (u) E81A/F82A/K106T, (v) E81A/F82A/K106R 또는 (w) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2와 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A; (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) E219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K217A, (n) E81F/F82A, (o) E81K/F82A, (p) E81L/F82A, (q) E81H/F82A, (r) E81S/F82A, (s) E81A/F82A/K106N, (t) E81A/F82A/K106Q; (u) E81A/F82A/K106T, (v) E81A/F82A/K106R 또는 (w) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 내지 11 및 17 내지 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0093] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 서열에서 아미노산 치환(들)은 IL-12Rβ1에 대한 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 친화성을 변화시키고, IL-12Rβ1에 대한 IL-12p40 결합을 조절한다. IL-12p40 폴리펩타이드의 결합 활성과 관련하여 용어 "조절하는"은 IL-12Rβ1에 대한 폴리펩타이드의 결합 친화성의 변화를 지칭한다. 조절은 폴리펩타이드의 결합 친화성의 증가(예를 들어, 유도, 자극) 및 감소(예를 들어, 감소, 억제) 둘 모두, 또는 그렇지 않으면 폴리펩타이드의 결합 친화성에 영향을 미치는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 IL-12Rβ1-결합 친화성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 서열에서 아미노산 치환(들)은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 IL-12Rβ1-결합 친화성을 감소시킨다.
[0094] 본원에 기재된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 결합 활성은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체 및 이의 동족 리간드(예를 들어, IL-12Rβ1, IL-p35, 및 IL-23p19)의 결합 활성은 Scatchard 분석(Munsen et al. Analyt. Biochem. 107:220-239, 1980)에 의해 결정될 수 있다. 특이적 결합은 또한 경쟁 ELISA, Biacore® 검정 및/또는 KinExA® 검정을 포함하지만 이로 제한되지 않는 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 표적 리간드에 우선적으로 결합하거나 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 당 분야에서 잘 이해되는 개념이며, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법은 또한 당 분야에 공지되어 있다.
[0095] 관심 리간드(예를 들어, IL-12Rβ1, IL-p35, 및/또는 IL-23p19)에 결합하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드를 선택하기 위해 다양한 검정 포맷이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역검정, 면역침전, Biacore™(GE Healthcare, Piscataway, NJ), KinExA, 형광-활성화 세포 분류(FACS), Octet™(ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) 및 웨스턴 블롯 분석은 동족 리간드 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합하는 수용체 또는 이의 리간드 결합 부분과 특이적으로 반응하는 폴리펩타이드를 확인하기 위해 사용될 수 있는 많은 검정 중 하나이다. 일반적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 배경 신호 또는 잡음의 적어도 2배, 보다 통상적으로 배경의 10배 초과, 배경의 20배 초과, 더욱 더 통상적으로, 배경의 50배 초과, 배경의 75배 초과, 배경의 100배 초과, 더욱 더 통상적으로, 배경의 500배 초과, 더욱 더 통상적으로, 배경의 1000배 초과, 및 더욱 더 통상적으로, 배경의 10,000배 초과일 것이다.
[0096] 당업자는 결합 친화성이 또한 2개의 결합 파트너, 예를 들어, IL-12p40 폴리펩타이드 및 IL-12Rβ1 폴리펩타이드 사이의 비공유 상호작용의 강도의 척도로서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 예에서, 결합 친화성은 1가 상호작용(고유 활성)을 기술하는 데 사용된다. 2개의 분자 사이의 결합 친화성은 해리 상수(KD)의 결정에 의해 정량화될 수 있다. 또한, KD는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법(Biacore)을 사용하여 복합체 형성 및 해리의 동역학의 측정에 의해 결정될 수 있다. 1가 복합체의 회합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 각각 회합 속도 상수 ka(또는 kon) 및 해리 속도 상수 kd(또는 koff)로 지칭된다. KD는 방정식 KD = kd/ka를 통해 ka 및 kd와 관련이 있다. 해리 상수의 값은 잘 알려진 방법으로 직접 결정할 수 있으며, 복잡한 혼합물의 경우에도 문헌[Caceci et al. (Byte 9: 340-362, 1984)]에 기술된 방법과 같은 방법으로 계산될 수 있다. 예를 들어, KD는 문헌[Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432)]에 개시된 것과 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정을 사용하여 확립될 수 있다. 표적 수용체에 대한 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 결합 능력을 평가하기 위한 다른 표준 검정은, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유세포계산 분석, 및 실시예에 예시된 다른 검정을 포함하는 당 분야에 공지되어 있다. IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 결합 동역학 및 결합 친화성은 또한 당 분야에 공지된 표준 검정, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 예를 들어, Biacore™ 시스템 또는 KinExA를 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-12Rβ1, IL-p35, 및/또는 IL-23p19에 대한 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 결합 친화성은 고체-상 수용체 결합 검정에 의해 결정된다(Matrosovich MN et al., Methods Mol Biol. 865:71-94, 2012). 일부 구현예에서, IL-12Rβ1, IL-p35, 및/또는 IL-23p19에 대한 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 결합 친화성은 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정에 의해 결정된다.
[0097] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 서열에서 아미노산 치환(들)은 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 IL-12Rβ1-결합 친화성을 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 IL-12R-결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 IL-12Rβ1-결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80% 또는 약 10% 내지 약 90%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-12Rβ1, IL-p35, 및/또는 IL-23p19에 대한 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 결합 친화성은 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정에 의해 결정된다.
[0098] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는, IL-12p35 폴리펩타이드와 조합될 때, 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 STAT4 신호전달을 자극하는 감소된 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, STAT4 신호전달을 자극하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, STAT4 신호전달을 자극하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, STAT4 신호전달을 자극하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 아미노산 치환(들)이 없는 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80% 또는 약 10% 내지 약 90%만큼 감소된다.
[0099] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 IL-23p19 폴리펩타이드와 조합될 때, 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 STAT3 신호전달을 자극하는 감소된 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, STAT3 신호전달을 자극하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, STAT3 신호전달을 자극하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, STAT4 신호전달을 자극하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 아미노산 치환(들)이 없는 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80% 또는 약 10% 내지 약 90%만큼 감소한다.
[00100] 원칙적으로, STAT3 신호전달 및/또는 STAT4 신호전달을 결정하는 데 사용될 수 있는 검정 및 방법론과 관련하여 특별한 제한은 없다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 적합한 예시적인 방법론은 포스포-플로우 신호전달 검정, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 및 다운스트림 유전자의 발현을 검정하기 위해 당 분야에 공지된 임의의 기술을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, STAT3 신호전달 및/또는 STAT4 신호전달의 조절은 실시예 4 및 5에 기재된 포스포-유세포계산 검정과 같은 포스포-플로우 신호전달 검정에 의해 결정될 수 있다.
[00101] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 IL-12p40을 통해 매개된 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 부여한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 IL-12를 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 부여한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 IL-23을 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 부여한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 IL-12 및 IL-23을 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 부여한다.
[00102] IL-12의 경우, 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 개시의 특정 부분 작용성 IL-12p40 변이체는 NK 세포에 비해 T 세포에 대한 선택성을 나타내므로, 천연 IL-12보다 독성이 덜한 것으로 예측되며, 이는 많은 회사에서 암에 대한 임상 개발을 진행하고 있으며, 그 한계는 독성이다. 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 IL-12 부분 작용제는 사이토카인 다면 발현과 관련된 커플링 해제 독성에 의해 암 면역요법에서 치료적 유용성을 가질 것으로 고려된다. 하기 실시예 4에 제시된 바와 같이, 본원에 개시된 특정 IL-12 부분 작용제는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 대한 활성을 유지하지만 NK 세포의 감소된(예를 들어, 손상된) 자극을 나타내는 IL-12Rβ1에 대한 감소된 친화성을 나타낸다. NK 세포 매개된 IFNγ가 IL-12 독성에 책임이 있는 것으로 생각되기 때문에, 이러한 새로운 작용제는 감소된 독성으로 IL-12 자극의 항종양 효과를 보존할 것으로 예상된다. IL-23의 경우, 본 개시의 부분 작용성 IL-12p40 변이체는 IL-23 신호전달의 차등 제어를 가능하게 함으로써 자가면역 질환의 치료에서 치료적 유용성을 가질 것으로 고려된다.
[00103] IL-12 및 IL-23 신호전달을 억제하는 IL-12p40의 항체 차단에 의존하는 현재의 치료적 접근법에 상보적으로, 본 개시의 부분 작용제 IL-12p40 변이체는 IL-12Rβ1에 대한 IL-23의 친화성을 조절함으로써, IL-23 부분 작용제는 IL-12에 영향을 미치지 않으면서 IL-23 신호전달을 특이적으로 조절하는 데 사용될 수 있다.
[00104] 따라서, 본 개시의 일부 구현예는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12 폴리펩타이드와 비교하여 IL-12를 통해 매개된 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 부여하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 세포-타입 편향된 신호전달은 NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 세포-타입 편향된 신호전달은 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 실질적으로 변경되지 않은 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 능력은 변경되지 않고, 예를 들어, 아미노산 치환(들)이 결핍된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체는 NK 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 부여하면서, CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하고 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이, 표적 세포의 특이적 사멸을 촉진시키는 능력을 실질적으로 보유한다.
B. 핵산
[00105] 일 양태에서, 발현 카세트를 포함하는 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다양한 핵산 분자, 및 예를 들어, 숙주 세포 또는 생체외 무세포 발현 시스템에서 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 생체내 발현을 가능하게 하는 조절자 서열과 같은 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 이러한 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.
[00106] 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 및 핵산 유사체를 함유하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는, RNA 및 DNA 분자 둘 모두를 지칭한다. 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥(예를 들어, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥)일 수 있다. 핵산 분자는 비통상적이거나 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 상호교환적으로 폴리뉴클레오티드 분자의 서열을 지칭한다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드 서열은 WIPO Standard ST.25 (1998), 부록 2, 표 1 내지 표 6을 인용에 의해 포함하는 37 CFR §1.82)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 염기 및 아미노산에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시된다.
[00107] 본 개시의 핵산 분자는 일반적으로 약 0.5 Kb 내지 약 20 Kb, 예를 들어, 약 0.5 Kb 내지 약 20 Kb, 약 1 Kb 내지 약 15 Kb, 약 2 Kb 내지 약 10 Kb, 또는 약 5 Kb 내지 약 25 Kb, 예를 들어, 약 10 Kb 내지 15 Kb, 약 15 Kb 내지 약 20 Kb, 약 5 Kb 내지 약 20 Kb, 5 Kb 및 약 10 Kb, 또는 약 10 Kb 및 약 25 Kb인 핵산 분자를 포함하는 임의의 길이의 핵산 분자일 수 있다.
[00108] 본원에 개시된 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, (b) SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1의 X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 X81, X82, X106, X217, 및 X219에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 X39, X40, X81, X82에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, E81, F82, K106, K217, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 E81, F82, K106, K217, 및 K219에 상응하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 P39, D40, E81, F82에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환들에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) K219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K219A, (n) E81A/F82A/K106A/K217A, (o) 81A/F82A/K106A/E108A/D115A, (p) E81F/F82A, (q) E81K/F82A, (r) E81L/F82A, (s) E81H/F82A, (t) E81S/F82A, (u) E81A/F82A/K106N, (v) E81A/F82A/ K106Q, (w) E81A/F82A/K106T, (x) E81A/F82A/K106R 또는 (y) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 내지 8 및 13 내지 16으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
[00109] 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 (a) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, (b) SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 추가의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 X81, X82, X106, 및 X217로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 X81, X82, 및 X106에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 X81, X82, X106, 및 X217에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, E81, F82, K106, K217 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 추가 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환(들)은 SEQ ID NO: 2의 E81, F82, K106, 및 K217로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 E81, F82, 및 K106에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 E81, F82, K106, 및 K217에 상응하는 위치에서 아미노산 치환의 조합을 포함한다.
[00110] 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 2와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) W37A; (b) P39A, (c) D40A, (d) E81A; (e) F82A, (f) K106A, (g) D109A, (h) K217A, (i) E219A, (j) E81A/F82A, (k) W37A/E81A/F82A, (l) E81A/F82A/K106A, (m) E81A/F82A/K106A/K217A, (n) E81F/F82A, (o) E81K/F82A, (p) E81L/F82A, (q) E81H/F82A, (r) E81S/F82A, (s) E81A/F82A/K106N, (t) E81A/F82A/K106Q; (u) E81A/F82A/K106T, (v) E81A/F82A/K106R 또는 (w) P39A/D40A/E81A/F82A. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 분자는 SEQ ID NO: 9 내지 11 및 17 내지 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 IL-12p40 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
[00111] 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트 또는 발현 벡터에 도입된다. 발현 카세트는 일반적으로 생체내 및/또는 생체외에서 수용자 세포에서 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보 및 코딩 서열을 함유하는 유전 물질의 작제물을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일반적으로, 발현 카세트는 원하는 숙주 세포 및/또는 개체로의 표적화를 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 본 개시의 발현 카세트는 발현 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 및 선택적으로, 코딩 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 다른 핵산 서열 중 어느 하나 또는 이의 조합에 작동 가능하게 연결된 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열을 포함한다.
[00112] 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 도입된다. 용어 "벡터"는 변형, 예를 들어, 이종 DNA의 숙주 세포에 도입할 목적으로 사용될 수 있는, 숙주 세포 사이에 전달을 위해 설계된 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물을 지칭한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드, 파지, 또는 코스미드와 같은 레플리콘일 수 있고, 삽입된 세그먼트의 복제를 야기하기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 통합 벡터일 수 있다.
[00113] 일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 일반적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 게놈으로의 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자로의 통합을 용이하게 하는 바이러스 유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드)를 지칭하기 위해 널리 사용된다. 바이러스 입자는 통상적으로 핵산(들) 이외에 다양한 바이러스 성분 및 때때로 또한 숙주 세포 성분을 포함할 것이다. 용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자 또는 전달된 핵산 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터이다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스 속인 렌티바이러스로부터 주로 유래된 LTR을 포함하는, 구조적 및 기능적 유전적 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다.
[00114] 따라서, 또한 본원에 개시된 임의의 재조합 폴리펩타이드 또는 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체를 인코딩하는 핵산 분자 중 하나 이상을 함유하는 벡터, 플라스미드, 또는 바이러스가 본원에 제공된다. 핵산 분자는, 예를 들어, 벡터로 형질전환/형질도입된 세포에서 이들의 발현을 지시할 수 있는 벡터 내에 포함될 수 있다. 진핵 및 원핵 세포에서 사용하기에 적합한 벡터는 당 분야에 공지되어 있으며 상업적으로 입수 가능하거나, 당업자에 의해 용이하게 제조된다.
[00115] DNA 벡터는 통상적인 형질전환 또는 트랜스펙션 기술을 통해 진핵 세포에 도입될 수 있다. 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 형질감염, 미세주입, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크래프 로딩, 탄도 도입, 핵천공, 유체역학적 쇼크, 및 감염과 같은, 세포를 형질전환시키거나 트랜스펙션시키기 위한 적합한 방법은 문헌[Sambrook et al. (2012, supra)] 및 다른 표준 분자 생물학 실험실 매뉴얼에서 확인될 수 있다.
[00116] 본 개시내용에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 바큘로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스, 원숭이 바이러스 40(SV40), 및 소 유두종 바이러스 벡터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vector, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조). 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체는 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포, NIH 3T3 세포, 또는 HeLa 세포)에서 생산될 수 있다. 이러한 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)을 포함하는 많은 공급원으로부터 입수 가능하다. 발현 시스템을 선택할 때, 성분이 서로 상용성인 지를 확인하기 위해 주의를 기울여야 한다. 숙련자 또는 통상의 기술자는 이러한 결정을 내릴 수 있다. 또한, 발현 시스템을 선택하는데 지침이 필요한 경우, 당업자는 문헌[P. Jones, "Vectors: Cloning Applications", John Wiley and Sons, New York, NY, 2009)]을 찾아볼 수 있다.
[00117] 제공된 핵산 분자는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열과 상이한 서열을 함유할 수 있지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 동일한 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체를 인코딩한다. 이러한 핵산 분자는 RNA 또는 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, 또는 포스포아미다이트-기반 합성에 의해 생산된 것과 같은 합성 DNA), 또는 이러한 타입의 핵산 내의 뉴클레오티드의 조합 또는 변형으로 구성될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥)일 수 있다.
[00118] 핵산 분자는 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)를 인코딩하는 서열로 제한되지 않으며; 코딩 서열(예를 들어, 키메라 수용체의 코딩 서열)의 업스트림 또는 다운스트림에 있는 비-코딩 서열의 일부 또는 모두가 또한 포함될 수 있다. 분자 생물학 분야의 당업자는 핵산 분자를 단리하기 위한 일상적인 절차에 익숙하다. 이들은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제로 게놈 DNA를 처리함으로써, 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 수행에 의해 생성될 수 있다. 핵산 분자가 리보핵산(RNA)인 경우, 분자는, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 생산될 수 있다.
[00119] 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 기재된 세포를 배양하기 위한 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 광범위한 상기 언급된 세포 및 종을 형질전환시키는 기술은 당 분야에 공지되어 있으고, 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하는 데 적합한 방법 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있다.
C. 재조합 세포 및 세포 배양
[00120] 본 개시의 재조합 핵산은, 예를 들어, 인간 T 림프구와 같은 세포에 도입되어 핵산 분자를 함유하는 재조합 세포를 생산할 수 있다. 세포로의 본 개시의 핵산 분자의 도입은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스 감염, 트랜스펙션, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개된 트랜스펙션, DEAE-덱스트란-매개된 트랜스펙션, 리포솜-매개된 트랜스펙션, 입자 건기술, 칼슘 포스페이트 침전, 직접 마이크로-주사, 나노입자-매개 핵산 전달 등에 의해 달성될 수 있다.
[00121] 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 당 분야에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 재조합 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있거나, 에피솜으로 복제될 수 있거나, 일시적 발현을 위한 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 에피솜 단위로서 재조합 숙주 세포에서 유지되고 복제된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 재조합 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 안정적인 통합은 고전적인 무작위 게놈 재조합 기술 또는 가이드 RNA-유도 CRISPR/Cas9 게놈 편집, 또는 NgAgo(나트로노박테리움 그레고리 아르고나우트(Natronobacterium gregoryi Argonaute))를 사용한 DNA-가이드 엔도뉴클레아제 게놈 편집, 또는 TALEN 게놈 편집(전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제)과 같은 보다 정확한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 일시적인 발현을 위한 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 세포에 존재한다.
[00122] 핵산 분자는 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화될 수 있거나, 전기천공과 같은 당 분야에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 수단 및 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포 내로 핵산의 도입은 바이러스 형질도입에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예에서, 바큘로바이러스 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)는 바이러스 형질도입을 통해 표적 세포에 핵산을 전달하도록 조작될 수 있다. 여러 AAV 혈청형이 기술되었으며, 모든 공지된 혈청형은 다수의 다양한 조직 타입으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. AAV는 독성의 증거 없이 생체내에서 광범위한 종 및 조직을 형질도입할 수 있고, 비교적 온화한 선천성 및 적응성 면역 반응을 생성한다.
[00123] 렌티바이러스-유래 벡터 시스템은 또한 바이러스 형질도입을 통한 핵산 전달 및 유전자 요법에 유용하다. 렌티바이러스 벡터는 (i) 숙주 게놈으로의 안정적인 벡터 통합을 통한 지속적인 유전자 전달; (ii) 분열 세포 및 비분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력; (iii) 중요한 유전자- 및 세포-요법-표적 세포 타입을 포함하는 광범위한 조직 친화성; (iv) 벡터 형질도입 후 바이러스 단백질의 발현 없음; (v) 폴리시스트론 또는 인트론-함유 서열과 같은 복잡한 유전 요소를 전달하는 능력; (vi) 잠재적으로 더 안전한 통합 부위 프로파일; 및 (vii) 벡터 조작 및 생산을 위한 비교적 쉬운 시스템을 포함하는, 유전자-전달 비히클로서 여러 매력적인 특성을 제공한다.
[00124] 일부 구현예에서, 숙주 세포는, 예를 들어, 바이러스 벡터 또는 숙주 세포의 게놈의 일부에 상동성인 산 서열을 포함하거나, 관심 폴리펩타이드의 발현을 위한 발현 벡터일 수 있다. 숙주 세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 적어도 하나의 핵산 분자로 이미 트랜스펙션된 세포일 수 있다.
[00125] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체내이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체외이다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관내이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 면역 시스템 세포, 예를 들어, 림프구(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포), 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B 세포, 단핵구, NK 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, 조절 T 세포, 헬퍼 T 세포(TH), 세포독성 T 세포(TCTL), 또는 다른 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역계 세포는 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득된 샘플에 대해 수행된 백혈구 성분채집술에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 환자이다.
[00126] 적합한 세포주의 비제한적인 예는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포, 스포도테라 프루지페르다(Spodotera frugiperda) 곤충 세포, Expi293F 세포, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I(GnTI) 결핍 HEK293S 세포, HEK-293T(ATCC #CRL-3216), HT-29(ATCC #HTB-38), Panc-1(ATCC #CRL-1469), HepG2(ATCC #HB-8065), B16F10 흑색종 세포(ATCC #CRL-6475), 및 EC4 세포를 포함한다.
[00127] 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 본원에 제공된다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 기재된 세포를 배양하기 위한 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 광범위한 상기 언급된 세포 및 종을 형질전환시키는 기술은 당 분야에 공지되어 있으며 기술 및 과학 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하는 데 적합한 방법 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있다.
D. IL-12p40 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법
[00128] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위한 다양한 방법으로서, 방법은 (a) 본 개시의 하나 이상의 재조합 세포를 제공하는 단계; 및 배양 배지에서 재조합 세포(들)를 배양하여 세포가 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 생산하도록 하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 재조합 폴리펩타이드는 또한 본 개시의 범위 내에 있다.
[00129] 재조합 폴리펩타이드를 생산하기 위한 개시된 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 생산된 폴리펩타이드를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 생산된 폴리펩타이드를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 반감기를 증가시키기 위해 생산된 폴리펩타이드를 구조적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.
[00130] 일부 구현예에서, 변형은 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합, 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 임의의 재조합 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드 및 이종성 폴리펩타이드(예를 들어, IL-12p40이 아닌 폴리펩타이드 또는 이의 변이체)를 포함하는 융합 또는 키메라 폴리펩타이드로서 제조될 수 있다. 예시적인 이종성 폴리펩타이드는 생체내에서 키메라 폴리펩타이드의 순환 반감기를 증가시킬 수 있고, 따라서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 특성을 추가로 향상시킬 수 있다. 다양한 구현예에서, 순환 반감기를 증가시키는 이종성 폴리펩타이드는 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 또는 IgG 중쇄 가변 영역이 없는 항체의 IgG 서브클래스의 Fc 영역일 수 있다. 예시적인 Fc 영역은 보체 고정 및 Fc 수용체 결합을 억제하는 돌연변이를 포함할 수 있거나, 이는 용해성, 예를 들어, 보체에 결합하거나, 항체-의존적 보체 용해(ADCC)와 같은 다른 메커니즘을 통해 세포를 용해시킬 수 있다.
[00131] 일부 구현예에서, "Fc 영역"은 IgG의 파파인 소화에 의해 생산된 IgG C-말단 도메인에 상동성인 천연 발생 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. IgG Fc는 대략 50 kDa의 분자량을 갖는다. 본 개시의 재조합 융합 폴리펩타이드는 전체 Fc 영역, 또는 이것이 일부인 키메라 폴리펩타이드의 순환 반감기를 연장하는 능력을 보유하는 더 작은 부분을 포함할 수 있다. 또한, 전장 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 즉, 이들은 폴리펩타이드의 기능에 영향을 미칠 수 있거나 영향을 미치지 않을 수 있는 돌연변이를 함유할 수 있고; 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 천연 활성은 모든 경우에 필요하거나 요망되지 않는다. 일부 구현예에서, 재조합 융합 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 IL-12p40 부분 작용제 또는 길항제)은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다.
[00132] Fc 영역은 "용해성" 또는 "비-용해성"일 수 있지만, 통상적으로 비-용해성이다. 비-용해성 Fc 영역은 통상적으로 고친화성 Fc 수용체 결합 부위 및 C'1q 결합 부위가 결여되어 있다. 뮤린 IgG Fc의 고친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에 Leu 잔기를 포함한다. 따라서, Fc 수용체 결합 부위는 Leu 235를 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 파괴될 수 있다. 예를 들어, Leu 235에 대한 Glu의 치환은 고친화성 Fc 수용체에 결합하는 Fc 영역의 능력을 억제한다. 뮤린 C'1q 결합 부위는 IgG의 Glu 318, Lys 320, 및 Lys 322 잔기를 돌연변이시키거나 결실시킴으로써 기능적으로 파괴될 수 있다. 예를 들어, Glu 318, Lys 320, 및 Lys 322에 대한 Ala 잔기의 치환은 IgG1 Fc가 항체-의존적 보체 용해를 지시할 수 없게 한다. 대조적으로, 용해성 IgG Fc 영역은 고친화성 Fe 수용체 결합 부위 및 C'1q 결합 부위를 갖는다. 고친화성 Fc 수용체 결합 부위는 IgG Fc의 위치 235에 Leu 잔기를 포함하고, C'1q 결합 부위는 IgG1의 Glu 318, Lys 320, 및 Lys 322 잔기를 포함한다. 용해성 IgG Fc는 이러한 부위에 야생형 잔기 또는 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 용해성 IgG Fc는 항체 의존성 세포 세포독성 또는 보체 유도된 세포용해(CDC)에 대해 세포를 표적화할 수 있다. 인간 IgG에 대한 적절한 돌연변이가 또한 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Morrison et al., The Immunologist 2:119-124, 1994; 및 Brekke et al., The Immunologist 2: 125, 1994] 참조).
[00133] 다른 구현예에서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 및 FLAG 서열과 같은 항원성 태그로서 기능하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. FLAG 서열은 비오티닐화된 고도로 특이적인 항-FLAG 항체에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 C-말단 c-myc 에피토프 태그를 추가로 포함한다.
[00134] 다른 구현예에서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 및 IL-12p40 폴리펩타이드, 예를 들어, Aga2p 응집소 서브유닛의 발현을 향상시키거나 세포 국소화를 지시하는 기능을 하는 이종성 폴리펩타이드를 포함한다.
[00135] 다른 구현예에서, 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드 및 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 생성될 수 있다. 키메라 단백질의 항체 또는 항원-결합 성분은 표적화 모이어티로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 이는 키메라 단백질을 세포 또는 표적 분자의 특정 서브세트에 국소화하는 데 사용될 수 있다. 사이토카인-항체 키메라 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
[00136] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드는 이의 반감기를 증가시키기 위해 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자로 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 의미한다. 이의 통상적인 형태에서, PEG는 말단 하이드록실 기를 갖는 선형 중합체이고, 화학식 HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH를 가지며, 여기서 n은 약 8 내지 약 4000이다.
[00137] 일반적으로, "n"은 이산 값이 아니지만 평균 값 주위에 대략 가우스 분포를 갖는 범위를 구성한다. 말단 수소는 알킬 또는 알칸올 기와 같은 캡핑 기로 치환될 수 있다. PEG는 적어도 하나의 하이드록시 기를 가질 수 있으며, 보다 바람직하게는 말단 하이드록시 기이다. 이러한 하이드록시 기는 펩타이드와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 링커 모이어티에 부착될 수 있다. PEG의 수많은 유도체가 당 분야에 존재한다. 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드에 공유적으로 부착된 PEG 분자는 대략 10,000, 20,000, 30,000, 또는 40,000 달톤의 평균 분자량일 수 있다. PEG화 시약은 선형 또는 분지형 분자일 수 있고, 단독으로 또는 나란히 존재할 수 있다. 본 개시의 PEG화된 IL-12p40 폴리펩타이드는 펩타이드의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착된 탠덤 PEG 분자를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG화"는 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드와 같은 분자에 대한 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 PEG 분자의 공유 부착을 의미한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어, IL-12p40(p40) 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, K80, K106, E108, D115, H216, 및 K217에 상응하는 위치 중 하나 이상에서 PEG화될 수 있다.
E. 약학적 조성물
[00138] 본 개시의 재조합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 세포, 및/또는 세포 배양물은 약학적 조성물을 포함하는 조성물에 도입될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 본원에 제공되고 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 세포, 및/또는 세포 배양물 중 하나 이상, 및 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 암과 같은 질병을 치료, 예방, 개선하거나 질병의 발병을 감소 또는 지연시키기 위해 제형화된다.
[00139] 따라서, 본 개시의 일 양태는 하기 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다: (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 약학적으로 허용되는 담체. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 (a) 본 개시의 재조합 폴리펩타이드 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 (a) 본 개시의 재조합 세포 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 (a) 본 개시의 재조합 핵산 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화된다.
[00140] 주사용 사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ), 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제, 예를 들어, 소듐 도데실 설페이트의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 일반적으로 등장제, 예를 들어, 당, 다가알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 및/또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
[00141] 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 도입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비히클에 도입시킴으로써 제조되며, 이는 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유한다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이며, 이는 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 생성한다.
[00142] 일부 구현예에서, 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드는 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이, 신체로부터의 빠른 제거에 대해 재조합 폴리펩타이드를 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형은 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 리포솜 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포솜 포함)이 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
[00143] 하기에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 본 개시내용의 재조합 폴리펩타이드는 또한 PEG화, 아실화, Fc 융합, 알부민과 같은 분자에 대한 연결 등에 의해 연장된 작용 지속기간을 달성하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩타이드는 생체내 및/또는 생체외에서 이들의 반감기를 연장하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 본 개시의 재조합 폴리펩타이드를 변형시키기에 적합한 공지된 전략 및 방법의 비제한적인 예는 (1) 프로테아제와의 접촉으로부터 재조합 폴리펩타이드를 방지하는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")과 같은 고도 가용성 거대분자로 본원에 기술된 재조합 폴리펩타이드의 화학적 변형; 및 (2) 본원에 기재된 재조합 폴리펩타이드를 안정한 단백질, 예컨대, 예를 들어, 알부민과 공유적으로 연결하거나 컨쥬게이션시키는 것을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 알부민과 같은 안정한 단백질에 융합될 수 있다. 예를 들어, 인간 알부민은 이에 융합된 폴리펩타이드의 안정성을 향상시키는 데 가장 효과적인 단백질 중 하나로 알려져 있으며, 이러한 융합 단백질이 많이 보고되어 있다.
아실화
[00144] 일부 구현예에서, 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 다이머 IL-12 또는 IL-23 폴리펩타이드의 성분 중 하나 또는 둘 모두는 문헌[Resh (2016) Progress in Lipid Research 63: 120-131]에 기재된 바와 같이 지방산 분자에 컨쥬게이션에 의해 아실화될 수 있다. 컨쥬게이션될 수 있는 지방산의 예는 미리스테이트, 팔미테이트 및 팔미톨레산을 포함한다. 미리스토일레이트는 통상적으로 N-말단 글리신에 연결되지만, 리신은 또한 미리스토일화될 수 있다. 팔미토일화는 통상적으로 DHHC 단백질과 같은 유리 시스테인 -SH 기의 효소적 변형에 의해 S-팔미토일화를 촉매함으로써 달성된다. 세린 및 트레오닌 잔기의 팔미톨릴화는 통상적으로 PORCN 효소를 사용하여 효소적으로 달성된다.
아세틸화
[00145] 일부 구현예에서, 본 개시의 IL-12p40 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 IL-12 또는 IL-23은 N-말단 아세틸트랜스퍼라제 및, 예를 들어, 아세틸 CoA과의 효소 반응에 의해 다이머 IL-12 또는 IL-23 분자의 N-말단 중 하나 또는 둘 모두에서 아세틸화된다. 대안적으로, 또는 N-말단 아세틸화에 추가하여, 본 개시의 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드의 서브유닛은, 예를 들어, 리신 아세틸트랜스퍼라제와의 효소 반응에 의해 하나 이상의 리신 잔기에서 아세틸화된다(예를 들어, 문헌[Choudhary et al. (2009) Science 325 (5942):834L2 ortho840] 참조).
Fc 융합
[00146] 일부 구현예에서, 다이머 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드가 Fc 융합의 형식으로 제공될 수 있는 경우, 다이머 분자의 각 성분은 다이머 Fc 분자의 개개 서브유닛 상에 제공된다. 일부 구현예에서, IL-12p40 융합 단백질은 IgG 중쇄 가변 영역이 결여된 항체의 IgG 서브클래스로부터 유래된 Fc 영역을 도입할 수 있다. "Fc 영역"은 IgG의 파파인 소화에 의해 생산된 IgG C-말단 도메인에 상동성인 천연 발생 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. IgG Fc는 대략 50 kDa의 분자량을 갖는다. 돌연변이체 컨쥬게이트 폴리펩타이드는 전체 Fc 영역, 또는 이것이 일부인 키메라 폴리펩타이드의 순환 반감기를 연장하는 능력을 보유하는 더 작은 부분을 포함할 수 있다. 또한, 전장 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 즉, 이들은 폴리펩타이드의 기능에 영향을 미칠 수 있거나 영향을 미치지 않을 수 있는 돌연변이를 함유할 수 있으며; 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 천연 활성은 모든 경우에 필요하거나 요망되지 않는다. 특정 구현예에서, Fc 융합 단백질(예를 들어, IL-12p35 또는 IL-23p19 및 IL-12p40 변이체)은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 예시적인 Fc 영역은 보체 고정 및 Fc 수용체 결합을 억제하는 돌연변이를 포함할 수 있거나, 용해될 수 있고, 즉, 항체-의존적 보체 용해(ADCC)와 같은 또 다른 메커니즘을 통해 보체에 결합하거나 세포를 용해시킬 수 있다.
[00147] 일부 구현예에서, IL-12p35 또는 IL-23p19 및 p40 변이체 융합 단백질은 Fc-융합 키메라 폴리펩타이드 분자의 기능적 도메인을 포함한다. Fc 융합 컨쥬게이트는 바이오의약품의 전신 반감기를 증가시키는 것으로 나타났으며, 따라서 바이오의약품 제품은 덜 빈번한 투여를 필요로 할 수 있다. Fc는 혈관을 따라 늘어선 내피 세포에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하고, 결합시, Fc 융합 분자는 분해로부터 보호되고 순환계로 재방출되어, 분자를 순환 중에 더 오래 유지시킨다. 이러한 Fc 결합은 내인성 IgG가 이의 긴 혈장 반감기를 유지하는 메커니즘인 것으로 여겨진다. 보다 최근의 Fc-융합 기술은 바이오의약품의 단일 카피를 항체의 Fc 영역에 연결하여 전통적인 Fc-융합 컨쥬게이트와 비교하여 바이오의약품의 약동학적 및 약력학적 특성을 최적화한다. Fc 융합체의 제조에 유용한 "Fc 영역"은 IgG의 파파인 소화에 의해 생산된 IgG C-말단 도메인에 상동성인 천연 발생 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. IgG Fc는 대략 50 kDa의 분자량을 갖는다. IL-12p40 변이체는 전체 Fc 영역, 또는 이것이 일부인 키메라 폴리펩타이드의 순환 반감기를 연장하는 능력을 보유하는 더 작은 부분을 포함할 수 있다. 또한, 전장 또는 단편화된 Fc 영역은 야생형 분자의 변이체일 수 있다. 통상적인 구현예에서, 다이머 Fc의 각각의 모노머는 다이머 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드의 성분을 운반한다.
노브/홀 Fc 컨쥬게이트
[00148] 일부 구현예에서, 다이머 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드가 Fc 융합의 형식으로 제공될 수 있는 경우, 여기서 다이머 분자의 각 성분은 다이머 Fc 분자의 개별 서브유닛 상에 제공되고, 다이머 Fc 분자 서브유닛은, 융합 단백질(선택적으로 p35 또는 p19 서열과 Fc 서브유닛 서열 사이에 개재 링커 서열을 포함함)로서 발현된 IL-12(즉, p35 및 p40 변이체) 또는 IL-23(p19 및 p40 변이체)의 각각의 서브유닛이 "노브" 또는 "홀" Fc 서브유닛 상에서 발현되고, p40 변이체 폴리펩타이드가 상보적인 "노브" 또는 "홀" Fc 서브유닛 상에서 발현되도록 "노브-인투-홀 변형(knob-into-hole modification)"을 지니도록 조작된다. 노브-인투-홀 변형은 문헌[Ridgway, et al. (1996) Protein Engineering 9(7):617-621] 및 미국 특허 번호 제5,731,168호에 더욱 충분히 기술된다. 일반적으로, 노브-인투-홀 변형은 CH3 도메인에서 2개의 면역글로불린 중쇄 사이의 계면에서의 변형을 지칭하며, 여기서 i) 제1 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 표면으로부터 돌출부("노브")를 생성하며, ii) 제2 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 CH3 도메인의 돌출 측쇄 ("노브")가 제2 CH3 도메인에서 공동에 의해 수용되는 제2 CH3 도메인의 계면 내에서 공동("홀")을 생성시킨다. 일 구현예에서, "노브-인투-홀 변형"은 항체 중쇄 중 하나에서 아미노산 치환 T366W 및 선택적으로 아미노산 치환 S354C, 및 항체 중쇄 중 다른 하나에서 아미노산 치환 T366S, L368A, Y407V 및 선택적으로 Y349C를 포함한다. 또한, Fc 도메인은 Fe 영역에서 2개의 항체 중쇄들 사이의 디설파이드 브릿지를 안정화시키는 위치 S354 및 Y349에서 시스테인 잔기의 도입에 의해 변형될 수 있다(Carter, et al. (2001) Immunol Methods 248, 7 -15). 노브-인투-홀 포맷은 "노브" 변형을 갖는 제1 Fc 모노머 상의 제1 폴리펩타이드(예를 들어, 본 개시의 p40 변이체) 및 "홀" 변형을 갖는 제2 Fc 모노머 상의 제2 폴리펩타이드(p19 또는 p35)의 발현을 용이하게 하기 위해 또는 반대로, 이종다이머 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드 Fc 융합 작제물의 발현 및 표면 제시를 용이하게 하기 위해 노브-인투-홀 포맷이 사용된다.
페길화
[00149] 일부 구현예에서, 본 개시의 약학적 조성물은 하나 이상의 페길화 시약을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "PEG화"는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 단백질에 공유 부착함으로써 단백질을 변형시키는 것을 지칭하며, "PEG화된"은 PEG가 부착된 단백질을 지칭한다. 약 10,000 달톤 내지 약 40,000 달톤의 선택적 범위를 갖는 다양한 PEG, 또는 PEG 유도체 크기는 다양한 화학을 사용하여 본 개시의 재조합 폴리펩타이드에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 PEG 또는 PEG 유도체의 평균 분자량은 약 1 kD 내지 약 200 kD, 예를 들어, 약 10 kD 내지 약 150 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 5 kD 내지 약 100 kD, 약 20 kD 내지 약 80 kD, 약 30 kD 내지 약 70 kD, 약 40 kD 내지 약 60 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 100 kD 내지 약 200 kD, 또는 약 1150 kD 내지 약 200 kD이다. 일부 구현예에서, 상기 PEG 또는 PEG 유도체의 평균 분자량은 약 5 kD, 약 10 kD, 약 20 kD, 약 30 kD, 약 40 kD, 약 50 kD, 약 60 kD, 약 70 kD, 또는 약 80 kD이다. 일부 구현예에서, 상기 PEG 또는 PEG 유도체의 평균 분자량은 약 40 kD이다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-숙신이미딜 부티레이트(mPEG-SBA), mPEG-숙신이미딜 석시네이트(mPEG-SS), mPEG-숙신이미딜 카보네이트(mPEG-SC), mPEG-석신이미딜 글루타레이트(mPEG-SG), mPEG-N-하이드록실-석신이미드(mPEG-NHS), mPEG-트레실레이트 및 mPEG-알데하이드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 폴리에틸렌 글리콜이며; 예를 들어, 상기 페길화 시약은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌 잔기에 공유 결합된 평균 분자량이 20,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌 잔기에 공유 결합된평균 분자량이 약 5 kD, 약 10 kD, 약 20 kD, 약 30 kD, 약 40 kD, 약 50 kD, 약 60 kD, 약 70 kD, 또는 약 80 kD인 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 페길화 시약은 본 개시의 재조합 폴리펩타이드의 N-말단 메티오닌 잔기에 공유 결합된 약 40 kD의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이다.
[00150] 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티로 화학적으로 변형되고, 예를 들어, PEG화되고; 또는 유사한 변형으로, 예를 들어, PAS화된다. 일부 구현예에서, PEG 분자 또는 PAS 분자는 개시된 재조합 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 측쇄에 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, PEG화된 또는 PAS화된 폴리펩타이드는 단지 하나의 아미노산 상에 PEG 또는 PAS 모이어티를 함유한다. 다른 구현예에서, PEG화된 또는 PAS화된 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산 상에, 예를 들어, 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 상이한 아미노산 잔기에 부착된 PEG 또는 PAS 모이어티를 함유한다. 일부 구현예에서, PEG 또는 PAS 사슬은 2000, 2000 초과, 5000, 5,000 초과, 10,000, 10,000 초과, 20,000, 20,000 초과, 및 30,000 Da이다. PAS화된 폴리펩타이드는 아미노 기, 설프히드릴 기, 하이드록실 기, 또는 카르복실 기를 통해 (예를 들어, 연결 기 없이) PEG 또는 PAS에 직접적으로 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 약 1 kD 내지 약 200 kD, 예를 들어, 약 10 kD 내지 약 150 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 5 kD 내지 약 100 kD, 약 20 kD 내지 약 80 kD, 약 30 kD 내지 약 70 kD, 약 40 kD 내지 약 60 kD, 약 50 kD 내지 약 100 kD, 약 100 kD 내지 약 200 kD, 또는 약 1150 kD 내지 약 200 kD 범위의 평균 분자량으로 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 약 5 kD, 약 10 kD, 약 20 kD, 약 30 kD, 약 40 kD, 약 50 kD, 약 60 kD, 약 70 kD, 또는 약 80 kD의 평균 분자량으로 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 약 40 kD의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된다.
부위-특이적 PEG화 부위의 도입
[00151] 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어, IL-12p40(p40) 변이체 폴리펩타이드는 예를 들어, 미국 특허 제7,045,337호; 제7,915,025호; 문헌[Dieters, et al. (2004) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 14(23):5743-5745; Best, M (2009) Biochemistry 48(28): 6571-6584]에 기술된 바와 같이 부위 특이적 컨쥬게이션(예를 들어, PEG화)을 용이하게 하기 위해 비-자연 발생 아미노산 측쇄를 비-천연 아미노산에 도입함으로써 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기는, 예를 들어, 문헌[Dozier and Distefano (2015) International Journal of Molecular Science 16( 10): 25831-25864]에 기술된 바와 같은 시스테인 측쇄를 통해 부위-특이적 PEG화를 용이하게 하기 위해 본 개시의 재조합 폴리펩타이드 내의 다양한 위치에서 도입될 수 있다.
[00152] 특정 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 부위 특이적 PEG화(예를 들어, 시스테인 또는 비-천연 아미노산)를 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산의 도입을 포함하는 IL-12p40 변이체 폴리펩타이드를 제공하며, 여기서 부위 특이적 PEG화에 대한 아미노산 치환은 부위는 p40/p35(IL-12) 또는 p40/p19(IL-23) 계면 사이의 계면에 존재하지 않는다.
[00153] 일부 구현예에서, 부위-특이적 아미노산 변형의 도입은 신호 펩타이드가 결여된 성숙 IL-12p40 단백질에 따라 넘버링될 때, SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219(즉, 신호 펩타이드가 결여된 성숙 IL-12p40 단백질에 따라 넘버링할 때, 잔기 W15, P17, D18, A19, K58, E59, F60, K84, E86, D93, H194, K195, L196, 및 K197) 이외의 IL-12p40 아미노산 위치에서 도입된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 1에 따라 넘버링된 아미노산 위치 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219에서 부위 특이적 컨쥬게이션(예를 들어, PEG화)을 가능하게 하는 부위-특이적 아미노산 치환을 포함하는 인간 p40 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.
[00154] 일부 구현예에서, 부위-특이적 아미노산 변형의 도입은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217 이외의 IL-12p40, L218, 및 E219(즉, 성숙기에 따라 넘버링될 때 잔기 W15, P17, D18, A19, K58, E59, F60, K84, E86, D93, H194, K195, L196, 및 E197 신호 펩타이드가 결여된 IL-12p40 단백질) 아미노산 위치에 도입된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 SEQ ID NO: 2에 따라 넘버링된 아미노산 위치 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219에서 부위 특이적 컨쥬게이션(예를 들어, PEG화)을 가능하게 하는 부위-특이적 아미노산 치환을 포함하는 인간 p40 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.
IL-12 및 계면에서 부위 특이적 PEG화를 통한 IL-23 부분 작용제
[00155] 일부 구현예에서, IL-12p40과 p35 또는 p19 단백질의 상호작용은 IL-12p40 계면에서 본원에 기재된 아미노산 위치에서의 부위 특이적 페길화의 도입에 의해 조절될 수 있다. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 잔기 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219(즉, 신호 펩타이드가 결여된 성숙한 IL-12p40 단백질, 즉, SEQ ID NO: 26 또는 SEQ ID NO: 27의 서열에 따라 넘버링될 때 잔기 W15, P17, D18, A19, K58, E59, F60, K84, E86, D93, H194, K195, L196, 및 K197)에 상응하는 위치들 중 하나 이상에서 부위 특이적 PEG화를 촉진하는 비-천연 아미노산(또는 시스테인 잔기)의 도입은 p19 및/또는 p35 서브유닛에 대한 결합이 조절된 IL-12p40 변이체 폴리펩타이드를 제공하여 부분 작용제 활성을 갖는 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 분자를 형성한다. PEG 분자가 계면에 도입되어, p19 또는 p35 단백질과의 IL-12p40 변이체의 결합을 완전히 방해하여 활성을 제거하지 않는 경우에, PEG는 통상적으로 약 1 kDa, 대안적으로 약 2 kDa, 대안적으로 약 3 kDa, 대안적으로 약 4 kDa, 대안적으로 약 5 kDa, 대안적으로 약 6 kDa, 대안적으로 약 7 kDa, 대안적으로 약 8 kDa, 대안적으로 약 9 kDa, 대안적으로 약 10 kDa, 대안적으로 약 12 kDa, 대안적으로 약 15 kDa, 또는 대안적으로 약 20 kD의 저분자량 PEG 종이다.
본 개시의 방법
[00156] 본원에 기재된 치료 조성물 중 어느 하나, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드(예를 들어, IL-12p40 폴리펩타이드 변이체), 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물의 투여는 암, 면역 질환, 및 만성 감염과 같은 관련 질환의 치료에서 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드, IL-12p40 폴리펩타이드 변이체, 핵산, 재조합 세포, 및 약학적 조성물은 IL-12p40 신호전달의 섭동과 관련된 하나 이상의 자가면역 질환 또는 병태를 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 이의 발병 위험이 높을 수 있는 개체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 치료제에 도입될 수 있다. 예시적인 자가면역 질환 또는 병태는 암, 면역 질환, 및 만성 감염을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 개체는 의사의 관리 하에 있는 환자이다.
[00157] 따라서, 일 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하기 위한 방법으로서, 방법은 (a) 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량의 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량의 본 개시의 재조합 핵산을 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, IL-12p40은 인터루킨-12 및 인터루킨-23의 공유 서브유닛이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 대상체에서 IL-12에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 IL-12 신호전달을 조절하는 방법은 대상체에게 IL-12 복합체의 IL-12p35 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 IL-12 복합체의 IL-12p35 서브유닛을 인코딩하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12p35 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 상이한 핵산 분자(예를 들어, 벡터)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, IL-12p40 폴리펩타이드 및 IL-12p35 폴리펩타이드는 단일 발현 카세트(예를 들어, 폴리시스트론 발현 카세트) 내에서 서로 작동 가능하게 연결된 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
[00158] 일부 다른 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 IL-23에 의해 매개되는 신호 전달을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 IL-23 신호전달을 조절하는 방법은 대상체에게 IL-23 복합체의 IL-23p19 서브유닛을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 IL-12 복합체의 IL-12p35 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12p35 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 상이한 핵산 분자(예를 들어, 벡터)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, IL-12p40 폴리펩타이드 및 IL-23p19 폴리펩타이드는 단일 발현 카세트(예를 들어, 폴리시스트론 발현 카세트) 내에서 서로 작동 가능하게 연결된 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
[00159] 또 다른 양태에서, 본 개시의 일부 구현예는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법으로서, 방법은 (a) 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드; (b) 본 개시의 재조합 핵산; (c) 본 개시의 재조합 세포; 및 (d) 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량의 본 개시의 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량의 본 개시의 재조합 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 치료 방법은 IL-12 복합체의 IL-12p35 서브유닛의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 치료 방법은 IL-23 복합체의 IL-23p19 서브유닛의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 치료 방법은 IL-12 복합체의 IL-12p35 서브유닛을 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 IL-23 복합체의 IL-23p19 서브유닛을 인코딩하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
[00160] 일부 구현예에서, 개시된 약학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제형화된다. 본 개시의 재조합 폴리펩타이드는 경구로 또는 흡입에 의해 제공될 수 있지만, 비경구 경로를 통해 투여될 가능성이 더 크다. 비경구 투여 경로의 예는, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경피(국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절용 제제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 일- 및/또는 이-염기성 소듐 포스페이트, 염산 또는 소듐 하이드록사이드와 같은 산 또는 염기로 조정될 수 있다(예를 들어, 약 7.2 내지 7.8, 예를 들어, 7.5의 pH로). 비경구 제조물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 포함될 수 있다.
[00161] 본 개시의 이러한 대상 재조합 폴리펩타이드의 투여량, 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 일반적으로 적합하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 이러한 화합물을 감염된 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계하는 데 주의를 기울여야 한다.
[00162] 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 개시의 방법에서 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정된 IC50(예를 들어, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장 중 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
[00163] 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드의 치료적 유효량(예를 들어, 유효 투여량)은 선택된 폴리펩타이드에 따라 다르다. 예를 들어, 환자 체중의 대략 0.001 내지 0.1 mg/kg 범위의 단일 용량 양이 투여될 수 있고; 일부 구현예에서, 약 0.005, 0.01, 0.05 mg/kg이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 600,000 IU/kg이 투여된다(IU는 림프구 증식 생물검정에 의해 결정될 수 있고 국제 단위(IU)로 표현된다). 조성물은 1일 1회 이상 내지 주 1회 이상 투여되며; 격일로 1회를 포함한다. 당업자는 질병의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이로 제한되지 않는 특정 요인이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 개시의 대상 재조합 폴리펩타이드의 치료적 유효량으로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 일련의 치료를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 5일 동안 8시간마다 투여된 후, 2 내지 14일, 예를 들어, 9일의 휴식 기간이 지난 후, 8시간마다 추가로 5일 동안 투여된다.
[00164] 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하고/하거나 이를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하기 위한 개시된 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[00165] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-12Rβ1에 대한 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 변경된 결합 친화성을 초래한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-12Rβ1에 대한 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드의 결합 친화성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 IL-12Rβ1-결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80% 또는 약 10% 내지 약 90%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-12Rβ1에 대한 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체의 결합 친화성은 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정에 의해 결정된다.
[00166] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드와 비교하여 감소된 STAT4 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 STAT4 신호전달은 또는 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 투여와 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 STAT4 신호전달은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 투여와 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 STAT4 신호전달은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 투여와 비교하여 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80%, 또는 약 10% 내지 약 90%만큼 감소한다.
[00167] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 투여와 비교하여 감소된 STAT3 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 STAT3 신호전달은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 투여와 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 적어도 약 95%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 STAT3 신호전달은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 투여와 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 STAT4 신호전달은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드의 투여와 비교하여 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80%, 또는 약 10% 내지 약 90%만큼 감소한다.
[00168] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 IL-12p40을 통해 매개된 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 발생시킨다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 IL-12를 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 발생시킨다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 IL-23을 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 발생시킨다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 IL-12 및 IL-23을 통해 매개되는 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 발생시킨다.
[00169] 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 세포-타입 편향된 IL-12 신호전달을 초래하며, 여기서 세포-타입 편향된 신호전달은 NK 세포에서 감소된 IL-12-매개된 신호전달을 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달은 아미노산 치환(들)이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 적어도 약 95%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 세포-타입 편향된 신호전달은 CD8+ T 세포에서 실질적으로 변경되지 않은 IL-12 신호전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 아미노산이 결여된 기준 IL-12p40 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 비교하여 CD8+ T 세포에서 변경되지 않은 IL-12-매개 신호전달, 예를 들어, 동일하거나 실질적으로 동일한 IL-12-매개 신호 산 치환(들)을 초래한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 NK 세포에서 감소된 IL-12 신호전달을 초래하는 반면, CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 실질적으로 유지한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 CD8+ T 세포에서 INFγ의 발현을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 보유한다. 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 종양 미세환경에서 항종양 면역을 향상시킨다.
[00170] 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-12p40 매개 신호전달과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-12 매개 신호전달과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-23 매개 신호전달과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 병태는 암, 면역 질환, 또는 만성 감염이다.
[00171] 용어 암은 일반적으로 제어되지 않은 증식, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식 속도, 및 특정 특징적인 모폴로지 특징과 같은 암-유발 세포의 통상적인 특징을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 암 세포는 종종 종양으로 응집되어 관찰되지만, 이러한 세포는 동물 대상체 내에 단독으로 존재할 수 있거나, 백혈병 세포와 같은 비종양유발성 암 세포일 수 있다. 따라서, 용어 "암"은 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변에 대한 언급을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 전암성, 뿐만 아니라 악성 암을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변이다.
[00172] 일부 구현예에서, 본원에는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태의 치료를 위한 다양한 방법이 제공되며, 여기서 병태는 급성 골수종 백혈병, 역형성 림프종, 성상세포종, B-세포 암, 유방암, 결장암, 뇌실막종, 식도암, 교모세포종, 신경교종, 평활근육종, 지방육종, 간암, 폐암, 외투 세포 림프종, 흑색종, 신경모세포종, 비-소세포 폐암, 희소돌기아교종, 난소암, 췌장암, 말초 T-세포 림프종, 신장암, 육종, 위암, 암종, 중피종, 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택된 암이다.
[00173] 일부 구현예에서, 면역 질환은 자가면역 질환이다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스 열, 갑상선염, 크론병, 중증 근무력증, 사구체신염, 자가면역 간염, 다발성 경화증, 원형 탈모증, 건선, 백반증, 이영양성 표피박리증, 전신 홍반 루푸스, 중등도 내지 중증의 판상 건선, 건선성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 및 이식편 대 숙주 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-12p40 매개 신호전달의 섭동과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-12 매개 신호전달의 섭동과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 대상체는 IL-23 매개 신호전달의 섭동과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다.
추가 요법
[00174] 상기 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 재조합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물 중 어느 하나는, 예를 들어, 화학요법제 또는 항암제 또는 항암 요법과 같은 하나 이상의 추가(예를 들어, 보충) 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가 치료제와 "조합하여" 투여는 임의의 순서로 동시(병용) 및 연속 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제, 화학요법제, 항암제, 또는 항암 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 및 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. "화학요법" 및 "항암제"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다양한 부류의 항암제가 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 알킬화제, 항대사물, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 포도필로톡신, 항체(예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 이마티닙 메실레이트(Gleevec® 또는 Glivec®)), 호르몬 치료, 가용성 수용체 및 다른 항종양제를 포함한다.
[00175] 토포이소머라제 억제제는 또한 본원에서 사용될 수 있는 또 다른 부류의 항암제이다. 토포이소머라제는 DNA의 토폴로지를 유지하는 필수 효소이다. 타입 I 또는 타입 II 토포이소머라제의 억제는 적절한 DNA 수퍼코일링을 업셋팅함으로써 DNA의 전사 및 복제 둘 모두를 방해한다. 일부 타입 I 토포이소머라제 억제제는 캄프토테신: 이리노테칸 및 토포테칸을 포함한다. 타입 II 억제제의 예는 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 및 테니포시드를 포함한다. 이들은 아메리칸 메이애플(Podophyllum peltatum)의 뿌리에서 자연적으로 발생하는 알칼로이드인 에피포도필로톡신의 반합성 유도체이다.
[00176] 항종양제는 면역억제제 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 이포스파미드를 포함한다. 항종양성 화합물은 일반적으로 세포의 DNA를 화학적으로 변형시킴으로써 작용한다.
[00177] 알킬화제는 세포에 존재하는 조건 하에 많은 친핵성 작용기를 알킬화할 수 있다. 시스플라틴 및 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴은 알킬화제이다. 이들은 생물학적으로 중요한 분자에서 아미노, 카르복실, 설프히드릴, 및 포스페이트 기와 공유 결합을 형성함으로써 세포 기능을 손상시킨다.
[00178] 빈카 알칼로이드는 튜불린의 특정 부위에 결합하여 튜불린이 미세소관으로 조립되는 것을 억제한다(세포 주기의 M 단계). 빈카 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 및 빈데신을 포함한다.
[00179] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자는 CTLA4, PD-1, PD-L1, A2AR, B7-H3, B7-H4, TIM3, 및 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물은 길항 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 길항 항체는 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 트레멜리무맙, 또는 아벨루맙이다.
[00180] 항-대사산물은 퓨린(아자티오프린, 메르캅토퓨린) 또는 피리미딘과 유사하고, 이러한 물질이 세포 주기의 "S" 단계 동안 DNA에 도입되는 것을 방지하여 정상적인 발달 및 분열을 중단시킨다. 항-대사산물은 또한 RNA 합성에 영향을 미친다.
[00181] 식물 알칼로이드 및 테르페노이드는 식물로부터 수득되고 미세소관 기능을 방지함으로써 세포 분열을 차단한다. 미세소관은 세포 분열에 필수적이기 때문에, 미세소관 없이는 세포 분열이 일어날 수 없다. 주요 예는 빈카 알칼로이드 및 탁산이다. 포도필로톡신은 소화를 도울 뿐만 아니라 2개의 다른 세포증식억제제, 에토포시드 및 테니포시드를 생산하는 데 사용되는 것으로 보고된 식물-유래 화합물이다. 이들은 세포가 G1 단계(DNA 복제의 시작) 및 DNA 복제(S 단계)에 들어가는 것을 방지한다.
[00182] 탁산은 그룹으로서 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한다. 파클리탁셀은 원래 탁솔(Taxol)로 알려져 있고 처음에는 태평양 주목(Pacific Yew) 나무의 껍질로부터 유래된 천연 생성물이다. 도세탁셀은 파클리탁셀의 반-합성 유사체이다. 탁산은 미세소관의 안정성을 향상시켜 후기 동안 염색체의 분리를 방지한다.
[00183] 일부 구현예에서, 항암제는 레미케이드, 도세탁셀, 셀레콕시브, 멜팔란, 덱사메타손(Decadron®), 스테로이드, 젬시타빈, 시스플라티넘, 테모졸로미드, 에토포시드, 사이클로포스파미드, 테모다르, 카보플라틴, 프로카바진, 글리아델, 타목시펜, 토포테칸, 메토트렉세이트, 게피티닙(Iressa®), 탁솔, 탁소테어, 플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 젤로다, CPT-11, 인터페론 알파, 페길화된 인터페론 알파(예를 들어, PEG INTRON-A), 카페시타빈, 시스플라틴, 티오테파, 플루다라빈, 카보플라틴, 리포솜 다우노루비신, 시타라빈, 독세탁솔, 파실리탁셀, 빈블라스틴, IL-2, GM-CSF, 다카르바진, 비노렐빈, 졸레드론산, 팔미트로네이트, 바이악신, 부설판, 프레드니손, 포스포보르테조밉(Velcade®), 비스포스포네이트, 비소 트리옥사이드, 빈크리스틴, 독소루비신(Doxil®), 파클리탁셀, 간시클로버, 아드리아마이신, 에스트라이누스틴 소듐 포스페이트(Emcyt®), 설린닥, 에토포시드, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
[00184] 다른 구현예에서, 항암제는 보르테조밉, 사이클로포스파미드, 덱사메타손, 독소루비신, 인터페론-알파, 레날리도마이드, 멜팔란, 페길화된 인터페론-알파, 프레드니손, 탈리도마이드, 또는 빈크리스틴으로부터 선택될 수 있다.
[00185] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법은 면역요법을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역요법은 하나 이상의 체크포인트 억제제의 투여를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 치료 방법의 일부 구현예는 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물의 추가 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자를 억제하는 화합물은 길항 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 길항 항체는 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 트레멜리무맙, 또는 아벨루맙이다.
[00186] 일부 양태에서, 하나 이상의 항암 요법은 방사선 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 방사선 요법은 암 세포를 사멸시키기 위한 방사선의 투여를 포함할 수 있다. 방사선은 DNA와 같은 세포 내의 분자와 상호작용하여 세포 사멸을 유도한다. 방사선은 또한 세포 및 핵막 및 다른 소기관을 손상시킬 수 있다. 방사선 타입에 따라, DNA 손상의 메커니즘은 상대적 생물학적 효과와 마찬가지로 다양할 수 있다. 예를 들어, 무거운 입자(즉, 양성자, 중성자)는 DNA를 직접 손상시키고 더 큰 상대적 생물학적 효과를 갖는다. 전자기 방사선은 주로 세포 물의 이온화에 의해 생성된 단기 하이드록실 자유 라디칼을 통해 작용하는 간접적인 이온화를 초래한다. 방사선의 임상 적용은 외부 빔 방사선(외부 공급원으로부터) 및 근접요법(환자에게 이식되거나 삽입된 방사선 공급원을 사용함)으로 구성된다. 외부 빔 방사선은 X-선 및/또는 감마선으로 구성되는 반면, 근접요법은 붕괴되어 감마선과 함께 알파 입자 또는 베타 입자를 방출하는 방사성 핵을 사용한다. 본원에서 또한 고려되는 방사선은, 예를 들어, 암 세포로의 방사성동위원소의 지시된 전달을 포함한다. 마이크로파 및 UV 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자가 또한 본원에서 고려된다.
[00187] 방사선은 단일 선량으로 또는 선량-분할 스케줄로 일련의 작은 선량으로 제공될 수 있다. 본원에서 고려되는 방사선의 양은, 예를 들어, 약 5 내지 약 80, 약 10 내지 약 50 Gy, 또는 약 10 Gy를 포함하는 약 1 내지 약 100 Gy의 범위이다. 총 선량은 분획된 요법으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 요법은 2 Gy의 분획화된 개별 선량을 포함할 수 있다. 방사성동위원소에 대한 투여량 범위는 광범위하게 변하며, 동위원소의 반감기 및 방출되는 방사선의 강도 및 타입에 따라 다르다. 방사선이 방사성 동위원소의 사용을 포함하는 경우, 동위원소는 표적 조직(예를 들어, 종양 조직)에 방사성뉴클레오티드를 운반하는 치료용 항체와 같은 표적화제에 컨쥬게이션될 수 있다.
[00188] 본원에 기재된 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 운동 및/또는 파괴되는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제 이외에, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경으로 제어되는 수술(모스 수술)을 포함한다. 전암 또는 정상 조직의 제거가 또한 본원에서 고려된다.
[00189] 따라서, 일부 구현예에서, 조성물은 제1 요법으로서 개별적으로 또는 제2 요법과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법 또는 수술로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 병용 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법과 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법은 제2 요법 전 및/또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 교대로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 요법 및 제2 요법은 단일 제형으로 함께 투여된다.
IL-12p40 변이체를 포함하는 IL-12/IL-23과 보충 치료제의 조합
[00190] 본 개시는 하나 이상의 추가 활성제("보충제")와 조합하여 대상체에게 투여될 수 있는, 본원에 기재된 바와 같은 변이체 IL-12p40 서브유닛을 포함하는 IL-12 또는 IL-23의 용도를 제공한다. 이러한 추가 조합은 상호교환적으로 "보충 조합" 또는 "보충 조합 요법"으로 지칭되며, 본 개시의 변이체 IL-12p40 서브유닛을 포함하는 IL-12 또는 IL-23과 조합하여 사용되는 치료제는 "보충제"로서 지칭된다. 본원에서 사용되는 용어 "보충제"는 별도로 투여되거나 도입될 수 있는 제제, 예를 들어, 별도의 투여(예를 들어, 키트에 제공될 수 있음)를 위해 별도로 제형화될 수 있는 제제 및/또는 본 개시의 IL-12p40 변이체와 조합하여 투여되거나 도입될 수 있는 요법을 포함한다.
[00191] 본원에서 사용되는 용어 "~와 조합하여"는 대상체에 대한 다수의 제제의 투여와 관련하여 사용될 때 대상체에 적어도 하나의 추가(즉, 제2, 제3, 제4, 제5 등)의 제1 제제의 투여를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 하나의 제제(예를 들어, 변이체 IL-12p40 서브유닛을 포함하는 IL-12 또는 IL-23)는 제1 제제 및 제2 제제의 치료 효과가 중첩되도록 제2 제제의 투여와 동시에 대상체에서 제1 제제의 투여로부터 형성된 생물학적 효과가 지속되는 경우 제2 제제(예를 들어, 면역 체크포인트 경로의 조절제)와 조합하여 투여되는 것으로 고려된다. 예를 들어, PD1 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙)는 통상적으로 2주마다 또는 3주마다 I.V. 주입에 의해 투여되며, 본 개시의 변이체 p40 서브유닛을 포함하는 IL-12 또는 IL-23 종은 더욱 자주, 예를 들어, 매일, BID, 또는 매주 투여될 수 있다. 그러나, 제1 작용제(예를 들어, 펨브롤리주맙)의 투여는 연장된 시간에 걸쳐 치료 효과를 제공하고, 제2 작용제(예를 들어, IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체)의 투여는 제1 제제가 제2 제제의 투여 시점으로부터 상당히 먼 시점(예를 들어, 수일 또는 수주)에 투여될 수 있지만, 제2 제제가 제1 제제와 조합하여 투여되는 것으로 고려되도록 제1 제제의 치료 효과가 존재하는 동안 이의 치료 효과를 제공한다. 일 구현예에서, 제1 제제 및 제2 제제가 동시에(서로 30분 이내), 병용하여 또는 순차적으로 투여되는 경우, 하나의 제제는 제2 제제와 조합하여 투여되는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 제1 작용제는 제1 작용제와 제2 작용제가 서로 약 24시간 이내에, 바람직하게는 서로 약 12시간 이내에, 바람직하게는 서로 약 6시간 이내에, 바람직하게는 서로 약 2시간 이내에, 또는 바람직하게는 서로 약 30분 이내에 투여되는 경우, 제2 작용제와 "병용" 투여되는 것으로 간주된다. 용어 "~와 조합하여"는 또한 제1 작용제 및 제2 작용제가 단일 약학적으로 허용되는 제형으로 공동-제형화되고 공동-제형이 대상체에게 투여되는 상황에 적용되는 것으로 이해될 것이다. 특정 구현예에서, IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드 및 보충제(들)는 순차적으로 투여되거나 적용되며, 여기서, 예를 들어, 하나의 제제가 하나 이상의 다른 제제 전에 투여된다. 다른 구현예에서, IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드 및 보충제(들)는 동시에 투여되며, 예를 들어, 여기서, 2개 이상의 제제가 동시에 또는 거의 동시에 투여되며, 2개 이상의 제제는 2개 이상의 개별 제형으로 존재하거나 단일 제형(즉, 공동-제형)으로 조합될 수 있다. 제제가 순차적으로 또는 동시에 투여되는 지의 여부와 관계없이, 이들은 본 개시의 목적을 위해 조합하여 투여되는 것으로 간주된다.
[00192] 추가 구현예는 조합하여 제제(들)의 최적량을 결정하기 위한 방법 또는 모델을 포함한다. 최적량은, 예를 들어, 대상체 또는 대상체 집단에서 최적 효과를 달성하는 양, 또는 제제들 중 하나 이상과 관련된 부작용을 최소화하거나 제거하면서 치료 효과를 달성하는 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체 폴리펩타이드와, 대상체(예를 들어, 인간) 또는 대상체 집단에서 본원에 기재된 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암성 병태)를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 것으로 알려져 있거나 효과적인 것으로 결정되는 보충제의 조합을 포함하고, 하나의 제제의 양은 다른 제제(들)의 양이 일정하게 유지되는 동안 적정된다. 이러한 방식으로 제제(들)의 양을 조작함으로써, 임상의는, 예를 들어, 상황 하에서 허용될 수 있도록 특정 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나, 부작용을 제거하거나 부작용을 감소시키는 데 가장 효과적인 제제의 비율을 결정할 수 있다.
추가 또는 보충제
[00193] 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적(예를 들어, 보충적) 치료제는 화학요법제를 포함한다. 일부 구현예에서, 보충제는 다수의 화학요법제의 "칵테일"이다. 일부 구현예에서, 화학요법제 또는 칵테일은 하나 이상의 물리적 방법(예를 들어, 방사선 요법)과 조합하여 투여된다. 용어 "화학요법제"는 티오테파 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 키오람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로우레아; 항생제, 예를 들어, 아클라시노미신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 예를 들어, 블레오마이신 A2, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 및 유도체, 예컨대, 데메톡시-다우노이노이신, 11-데옥시다우노루비신, 13-데옥시다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C, N-메틸 미토마이신 C와 같은 미토마이신; 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사산물; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트, 디데아자테트라하이드로폴산, 및 폴린산과 같은 폴산 유사체; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-부신; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드(Ara-C); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀, nab-파클리탁셀 및 독세탁셀; 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴, 옥사플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 및 백금 배위 복합체; 빈블라스틴; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀과 같은 탁산; 카르미노마이신, 아드리아마이신, 예컨대, 4'-에피아드리아마이신, 4-아드리아마이신-14-벤조에이트, 아드리아마이신-14-옥타노에이트, 아드리아마이신-14-나프탈렌아세테이트; 콜히친 및 상기 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[00194] 용어 "화학요법제"는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, 오나프리스톤, 및 토레미펜을 포함하는 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항안드로겐; 및 상기 임의의 것의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
[00195] 일부 구현예에서, 보충제는 신생물성 질환의 치료에 유용한 것으로 당 분야에서 확인된 하나 이상의 화학적 또는 생물학적 제제, 예컨대 비제한적으로 사이토카인 또는 사이토카인 길항제, 예를 들어, IL-2, INFγ, 또는 항-표피 성장 인자 수용체, 이리노테칸; 테트라하이드로폴레이트 항대사산물, 예컨대, 페메트렉세드(pemetrexed); 종양 항원에 대한 항체, 모노클로날 항체와 독소의 복합체, T-세포 애주번트, 골수 이식, 또는 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포 요법), 항-종양 백신, 복제 적격 바이러스, 신호 전달 억제제(예를 들어, Gleevec® 또는 Herceptin®) 또는 종양 성장의 상가적 또는 상승적 억제를 달성하기 위한 면역조절제, 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 억제제, 스테로이드, TNF 길항제(예를 들어, Remicade® 및 Enbrel®), 인터페론-β1a(Avonex®), 및 인터페론-β1b(Betaseron®)뿐만 아니라 TAC, FOLFOX, TPC, FEC, ADE, FOLFOX-6, EPOCH, CHOP, CMF, CVP, BEP, OFF, FLOX, CVD, TC, FOLFIRI, PCV, FOLFOXIRI, ICE-V, XELOX, 및 당업자에 의해 용이하게 이해되는 다른 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는 공지된 화학치료 치료 요법에서 실시되는 바와 같은 상기 기술된 것들 중 하나 이상의 조합이다.
[00196] 일부 구현예에서, IL-12(p35/p40) 변이체 또는 (IL-23)p19/p40 변이체는 BRAF/MEK 억제제, 키나제 억제제, 예를 들어, 수니티닙, PARP 억제제, 예를 들어, 올라파립, EGFR 억제제, 예를 들어, 오시머티닙(Ahn, et al. (2016) J Thorac Oncol 11:S115), IDO 억제제, 예컨대, 에파카도스타트, 및 종양용해 바이러스, 예컨대, 탈리모진 라헤르파렙벡(T-VEC)와 조합하여 투여된다.
치료용 항체와의 조합
[00197] 일부 구현예에서, "보충제"는 치료용 항체(이중특이적 T 세포 인게이저(BITE), 이중 친화성 재표적화(DART) 작제물, 및 삼중특이적 킬러 인게이저(TriKE) 작제물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 종양 관련 항원에 결합하는 이중-특이적 및 삼중-특이적 항체를 포함함)이다.
[00198] 일부 구현예에서, 치료용 항체는 HER2(예를 들어, 트라스투주맙, 페르투주맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신), 넥틴-4(예를 들어, 엔포르투맙), CD79(예를 들어, 폴라투주맙 베도틴), CTLA4(예를 들어, 이필루무맙), CD22(예를 들어, 목세투모맙 파수도톡스), CCR4(예를 들어, 마가무이주맙), IL23p19(예를 들어, 틸드라키주맙), PDL1(예를 들어, 더발루맙, 아벨루맙, 에테졸리주맙), IL17α(예를 들어, 익세키주맙), CD38(예를 들어, 다라투무맙), SLAMF7(예를 들어, 엘로투주맙), CD20(예를 들어, 리툭시맙, 토시투모맙, 이브리투모맙 및 오파투무맙), CD30(예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴), CD33(예를 들어, 젬투주맙 오조가미신), CD52(예를 들어, 알렘투주맙), EpCam, CEA, fpA33, TAG-72, CAIX, PSMA, PSA, 폴레이트 결합 단백질, GD2(예를 들어, 디눈툭시맙), GD3, IL6(예를 들어, 실루툭시맙) GM2, Ley, VEGF(예를 들어, 베바시주맙), VEGFR, VEGFR2(예를 들어, 라무시루맙), PDGFR(예를 들어, 올라투무맙), EGFR(예를 들어, 세툭시맙, 파니투무맙 및 네시투무맙), ERBB2(예를 들어, 트라스투주맙), ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, MUC-1, TRAIL R1, TRAIL R2, RANKL RAP, 테나신, 인테그린 αVβ3, 및 인테그린 α4β1로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 종양 항원에 결합하는 항체이다.
[00199] 일부 구현예에서, 항체가 제1 및 제2 종양 항원을 표적화하는 이중특이적 항체, 예컨대, HER2 및 HER3(약칭 HER2 x HER3), FAP x DR-5 이중특이적 항체, CEA x CD3 이중특이적 항체, CD20 x CD3 이중특이적 항체, EGFR-EDV-miR16 삼중특이적 항체, gp100 x CD3 이중특이적 항체, Ny-eso x CD3 이중특이적 항체, EGFR x cMet 이중특이적 항체, BCMA x CD3 이중특이적 항체, EGFR-EDV 이중특이적 항체, CLEC12A x CD3 이중특이적 항체, HER2 x HER3 이중특이적 항체, Lgr5 x EGFR 이중특이적 항체, PD1 x CTLA-4 이중특이적 항체, CD123 x CD3 이중특이적 항체, gpA33 x CD3 이중특이적 항체, B7-H3 x CD3 이중특이적 항체, LAG-3 x PD1 이중특이적 항체, DLL4 x VEGF 이중특이적 항체, 카드헤린-P x CD3 이중특이적 항체, BCMA x CD3 이중특이적 항체, DLL4 x VEGF 이중특이적 항체, CD20 x CD3 이중특이적 항체, Ang-2 x VEGF-A 이중특이적 항체, CD20 x CD3 이중특이적 항체, CD123 x CD3 이중특이적 항체, SSTR2 X CD3 이중특이적 항체, PD1 x CTLA-4 이중특이적 항체, HER2 x HER2 이중특이적 항체, GPC3 x CD3 이중특이적 항체, PSMA x CD3 이중특이적 항체, LAG-3 x PD-L1 이중특이적 항체, CD38 x CD3 이중특이적 항체, HER2 x CD3 이중특이적 항체, GD2 x CD3 이중특이적 항체, 및 CD33 x CD3 이중특이적 항체이다. 이러한 치료용 항체는 직접 또는 링커, 특히 산, 염기 또는 효소적으로 불안정한 링커를 통해 하나 이상의 화학요법제(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트 또는 ADC)에 추가로 컨쥬게이션될 수 있다.
물리적 방법과의 조합
[00200] 일부 구현예에서, 보충제는 하나 이상의 비-약리학적 양상(예를 들어, 국소 방사선 요법 또는 전신 방사선 요법 또는 수술)이다. 예를 들어, 본 개시는 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL23(p19/p40) 변이체 및 하나 이상의 보충제를 포함하는 치료 요법으로 방사선 단계를 선행하거나 후속하는 치료 요법을 고려한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 수술(예를 들어, 종양 절제)과 함께 IL12p35/p40 변이체 또는 IL23p19/p40 변이체의 사용을 추가로 고려한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 골수 이식, 말초 혈액 줄기 세포 이식 또는 다른 타입의 이식 요법과 함께 IL-12p40 변이체의 사용을 추가로 고려한다.
면역 체크포인트 조절제와의 조합
[00201] 일부 구현예에서, 보충제는 대상체에서 신생물성 질환뿐만 아니라 신생물성 질환과 관련된 질병, 장애 또는 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 면역 체크포인트 조절제이다. 당업자는 용어 "면역 체크포인트 경로"를, 면역 반응의 자극(예를 들어, T-세포 활성의 상향조절) 또는 억제(예를 들어, T-세포 활성의 하향조절)을 통해 면역 반응을 조절하는 면역 세포(예를 들어, T-세포) 상에서 발현되는 제2 분자(예를 들어, PDL1과 같은 단백질)에 대한 항원 제시 세포(APC) 상에서 발현된 제1 분자(예를 들어, PD1과 같은 단백질)의 결합에 의해 촉발되는 생물학적 반응으로서 이해할 것이다. 면역 반응을 조절하는 결합 쌍의 형성에 관여하는 분자는 일반적으로 "면역 체크포인트"로 지칭된다. 이러한 면역 체크포인트 경로에 의해 조절되는 생물학적 반응은 세포 활성화, 사이토카인 생산, 세포 이동, 세포독성 인자 분비, 및 항체 생산과 같은 다운스트림 면역 이펙터 경로를 초래하는 세포내 신호전달 경로에 의해 매개된다. 면역 체크포인트 경로는 일반적으로 면역 체크포인트 경로와 관련된 제2 세포 표면 분자에 대한 제1 세포 표면 발현 분자의 결합(예를 들어, PDL1에 대한 PD1의 결합, CD28에 대한 CTLA4의 결합 등)에 의해 촉발된다. 면역 체크포인트 경로의 활성화는 면역 반응의 자극 또는 억제를 유발할 수 있다.
[00202] 활성화가 면역 반응의 억제 또는 하향조절을 초래하는 면역 체크포인트는 본원에서 "음성 면역 체크포인트 경로 조절제"로 지칭된다. 음성 면역 체크포인트 조절제의 활성화로 인한 면역 반응의 억제는 종양-관련 항원과 같은 외래 항원을 인식하는 숙주 면역 시스템의 능력을 감소시킨다. 용어 음성 면역 체크포인트 경로는 PD1의 PDL1, PD1의 PDL2, 및 CTLA4의 CDCD80/86에의 결합에 의해 조절되는 생물학적 경로를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 음성 면역 체크포인트 길항제의 예는 PD1(CD279로도 지칭됨), TIM3(T-세포 막 단백질 3; 또한 HAVcr2로 공지된), BTLA(B 및 T 림프구 감쇠기; CD272로도 공지됨), VISTA(B7-H5) 수용체, LAG3(림프구 활성화 유전자 3; CD233으로도 공지됨) 및 CTLA4(세포독성 T-림프구 관련 항원 4 ; CD152로도 알려져 있음)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 T-세포 억제 수용체와 결합하는 길항제(예를 들어, 길항제 항체)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[00203] 일 구현예에서, 활성화가 면역 반응의 자극을 초래하는 면역 체크포인트 경로는 본원에서 "양성 면역 체크포인트 경로 조절제"로 지칭된다. 이와 같이, 용어 양성 면역 체크포인트 경로 조절제는 ICOSL의 ICOS(CD278), B7-H6의 NKp30, CD155의 CD96, OX40L의 OX40, CD70 내지 CD27, CD40 내지 CD40L, 및 GITRL 내지 GITR의 결합에 의해 조절되는 생물학적 경로를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 양성 면역 체크포인트를 작용시키는 분자(면역 반응을 자극하는 결합 쌍의 성분에 대한 이러한 천연 또는 합성 리간드)는 면역 반응을 상향조절하는 데 유용하다. 이러한 양성 면역 체크포인트 작용제의 예는 T-세포 활성화 수용체에 결합하는 작용제 항체, 예를 들어, ICOS(예를 들어, JTX-2011, Jounce Therapeutics), OX40(예를 들어, MEDI6383, Medimmune), CD27(예를 들어, varlilumab, Celldex Therapeutics), CD40(예를 들어, 다세투즈무맙 CP-870,893, Roche, Chi Lob 7/4), HVEM, CD28, CD137 4-1BB, CD226, 및 GITR(예를 들어, MEDI1873, Medimmune; INCAGN1876, Agenus)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[00204] 당업자는 용어 "면역 체크포인트 경로 조절제"를 면역적격 포유동물을 포함하는 생물학적 시스템에서 면역 체크포인트 경로의 활성을 억제하거나 자극하는 분자로서 이해할 것이다. 면역 체크포인트 경로 조절제는 면역 체크포인트 단백질(예를 들어, 항원 제시 세포(APC), 예컨대, 암 세포 및/또는 면역 T 이펙터 세포의 표면에서 발현된 면역 체크포인트 단백질)에 결합함으로써 이의 효과를 발휘할 수 있거나, 면역 체크포인트 경로에서 상류 및/또는 하류 반응에 이의 효과를 발휘한다. 예를 들어, 면역 체크포인트 경로 조절제는 PD-1 및 CTLA-4 신호전달에 관여하는 티로신 포스파타제인 SHP2의 활성을 조절할 수 있다. 당업자는 용어 "면역 체크포인트 경로 조절제"가 억제성 면역 체크포인트의 기능을 적어도 부분적으로 하향-조절할 수 있는 면역 체크포인트 경로 조절제(들) 둘 모두를 포함하는 것으로 이해할 것이다(본원에서 "면역 체크포인트 경로"로 지칭됨). 억제제" 또는 "면역 체크포인트 경로 길항제") 및 자극 면역 체크포인트의 기능을 적어도 부분적으로 상향조절할 수 있는 면역 체크포인트 경로 조절제(들)(본원에서 "면역 체크포인트 경로 이펙터" 또는 "면역 체크포인트 경로 작용제"로 지칭됨)를 포함한다.
[00205] 면역 체크포인트 경로에 의해 매개되는 면역 반응은 T-세포 매개된 면역 반응으로 제한되지 않는다. 예를 들어, NK 세포의 KIR 수용체는 NK 세포에 의해 매개되는 종양 세포에 대한 면역 반응을 조절한다. 종양 세포는 HLA-C로 불리는 분자를 발현하며, 이는 NK 세포의 KIR 수용체를 억제하여 감소 또는 항종양 면역 반응을 유발한다. 항-KIR3 mab(예를 들어, 리릴루맙, BMS)와 같은 KIR 수용체에 대한 HLA-C의 결합을 길항하는 제제의 투여는 NK 세포 억제 수용체(KIR)에 결합하는 HLA-C의 능력을 억제하여 NK 세포의 암 세포를 검출하고 공격하는 능력을 회복시킨다. 따라서, KIR 수용체에 대한 HLA-C의 결합에 의해 매개되는 면역 반응은 억제가 비-T-세포 매개된 면역 반응의 활성화를 초래하는 음성 면역 체크포인트 경로의 예이다.
[00206] 일 구현예에서, 면역 체크포인트 경로 조절제는 음성 면역 체크포인트 경로 억제제/길항제이다. 또 다른 구현예에서, IL12p35/p40 변이체 또는 IL23p19/p40 변이체와 함께 사용되는 면역 체크포인트 경로 조절제는 양성 면역 체크포인트 경로 작용제이다. 또 다른 구현예에서, IL12p35/p40 변이체 또는 IL23p19/p40 변이체와 함께 사용되는 면역 체크포인트 경로 조절제는 면역 체크포인트 경로 길항제이다.
[00207] 당업자는 용어 "음성 면역 체크포인트 경로 억제제"를 음성 면역 체크포인트 경로의 활성화를 방해하여 면역 반응의 상향조절 또는 향상을 초래하는 면역 체크포인트 경로 조절제로서 이해할 것이다. 예시적인 음성 면역 체크포인트 경로 억제제는 프로그램된 사멸-1(PD1) 경로 억제제, 프로그램된 사멸 리간드-1(PDL1) 경로 억제제, TIM3 경로 억제제 및 항-세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA4) 경로 억제제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
[00208] 일 구현예에서, 면역 체크포인트 경로 조절제는 PD1의 PDL1 및/또는 PDL2에 대한 결합을 억제하는 음성 면역 체크포인트 경로의 길항제("PD1 경로 억제제")이다. PD1 경로 억제제는 T-세포 고갈의 역전, 사이토카인 생산 회복, 및 항원-의존성 T-세포의 확장과 같은 다양한 유리한 면역 반응의 자극을 초래한다. PD1 경로 억제제는 흑색종, 폐암, 신장암, 호지킨스 림프종, 두경부암, 방광암 및 요로상피암을 포함하는 다양한 암의 치료를 위해 USFDA로부터 승인을 받은 효과적인 다양한 암으로서 인식되었다.
[00209] 일부 구현예에서, PD1 경로 억제제는 PD1의 PDL1 및/또는 PDL2에 대한 결합을 방해하는 모노클로날 항체를 포함한다. 항체 PD1 경로 억제제는 당 분야에 잘 알려져 있다. PD1의 PDL1 및/또는 PDL2에 대한 결합을 방해하는 모노클로날 항체를 포함하는 상업적으로 입수 가능한 PD1 경로 억제제의 예는 니볼루맙(nivolumab)(Opdivo®, BMS-936558, MDX1106, BristolMyers Squibb, Princeton NJ로부터 상업적으로 이용 가능), 펨브롤리주맙(Keytruda®MK-3475, 람브롤리주맙, Merck and Company, Kenilworth NJ로부터 상업적으로 이용 가능), 및 아테졸리주맙(Tecentriq®, Genentech/Roche, South San Francisco CA)을 포함한다. 추가 PD1 경로 억제제 항체는 더발루맙(Durvalumab)(MEDI4736, Medimmune/AstraZeneca), 피딜리주맙(CT-011, CureTech), PDR001(Novartis), BMS-936559(MDX1105, BristolMyers Squibb), 및 아벨루맙(MSB0010718C, Merck Serono/Pfizer) 및 SHR-1210(Incyte)을 포함한다. 추가의 항체 PD1 경로 억제제는 미국 특허 제8,217,149호; 제8,168,757호; 제8,008,449호; 및 제7,943,743호에 기술된다.
[00210] PD1 경로 억제제는 길항제 항체로 제한되지 않는다. 비항체 생물학적 PD1 경로 억제제는 또한 PD-L2 IgG2a 융합 단백질인 AMP-224를 포함하는 임상 개발 중이며, PDL2 융합 단백질인 AMP-514는 Amplimmune 및 Glaxo SmithKline에 의해 임상 개발 중이다. 앱타머 화합물은 또한 PD1 경로 억제제로서 유용한 문헌에 기재되어 있다(Wang, et al. (2018) 145:125-130.).
[00211] 일부 구현예에서, PD1 경로 억제제는 펩티딜 PD1 경로 억제제, 예를 들어, 문헌[Sasikumar, et al., 미국 특허 제9,422,339호; 및 Sasilkumar, et al., 미국 특허 제8,907,053호]에 기재되어 있는 것들을 포함한다. CA-170(AUPM-170, Aurigene/Curis)은 보고된 바에 따르면 면역 체크포인트 PDL1 및 VISTA를 표적화하는 경구 생체이용 가능한 소분자이다(Pottayil Sasikumar, et al. Oral immune checkpoint antagonists targeting PD-L1/VISTA or PD-L1/Tim3 for cancer therapy. [abstract]. In: Proceedings of the 107th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2016 Apr 16-20; New Orleans, LA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2016;76(14 Suppl): Abstract No. 4861). CA-327 (AUPM-327, Aurigene/Curis)은 보고된 바에 따르면 면역 체크포인트인 프로그램된 사멸 리간드-1(PDL1) 및 T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질-3(TIM3)을 억제하는 경구 이용 가능한 소분자이다.
[00212] 일부 구현예에서, PD1 경로 억제제는 소분자 PD1 경로 억제제를 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 소분자 PD1 경로 억제제의 예는 문헌[Sasikumar, et al., 1,2,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators (PCT/IB2016/051266호, WO2016142833A1호로서 공개됨) and Sasikumar, et al. 3-substituted-1,2,4-oxadiazole and thiadiazole PCT/IB2016/051343, WO2016142886A2호로서 공개됨), BMS-1166 and Chupak LS and Zheng X. Compounds useful as immunomodulators. Bristol-Myers Squibb Co. (2015) WO 2015/034820 A1호, EP3041822 B1호; WO2015034820 A1호; 및 Chupak, et al. Compounds useful as immunomodulators. Bristol-Myers Squibb Co. (2015) WO 2015/160641 A2호. WO 2015/160641 A2호, Chupak, et al. Compounds useful as immunomodulators. Bristol-Myers Squibb Co. Sharpe, et al. Modulators of immunoinhibitory receptor PD-1, and methods of use thereof, WO 2011082400 A2호; 및 미국 특허 제7,488,802호]을 포함하는 당 분야에 기술되어 있다.
[00213] 일부 구현예에서, IL-12p35/p40 변이체 또는 IL-23p19/p40 변이체와 하나 이상의 PD1 면역 체크포인트 조절제의 조합은 PD1 경로 억제제가 흑색종, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 두경부암, 신장 세포암, 방광암, 난소암, 자궁을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임상 시험에서 질환의 치료 또는 임상 효능의 입증에 대한 승인 자궁내막암, 자궁경부암, 자궁 육종, 위암, 식도암, DNA 불일치 복구 결핍 결장암, DNA 불일치 복구 결함 자궁내막암, 간세포 암종, 유방암, 메르켈 세포 암종, 갑상선암, 호지킨스 림프종, 여포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 마이코시스펀고이데스, 말초 T-세포 림프종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 임상 시험에서 질병의 치료 임상 효능의 입증에 대한 FDA 승인을 통해 인간에서 임상 효과를 입증하는 신생물 병태의 치료에서 유용하다. 일부 구현예에서, IL12p35/p40 변이체 또는 IL23p19/p40 변이체와 PD1 면역 체크포인트 조절제의 조합은 PDL1의 높은 수준의 발현을 특징으로 하는 종양의 치료에 유용하고, 여기서 종양은 종양 돌연변이 부하를 가지며, 종양에서 높은 수준의 CD8+ T-세포, IFNγ와 관련된 면역 활성화 시그니처 및 전이성 질환, 특히 간 전이의 결여가 존재한다.
[00214] 일부 구현예에서, IL-12p35/p40 변이체 또는 IL-23p19/p40 변이체는 CD28에 대한 CTLA4의 결합을 억제하는 음성 면역 체크포인트 경로의 길항제("CTLA4 경로 억제제")와 조합하여 투여된다. CTLA4 경로 억제제의 예는 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,682,736호; 제6,984,720호; 및 제7,605,238호 참조).
[00215] 일부 구현예에서, IL12p35/p40 변이체 또는 IL23p19/p40 변이체는 HVEM에 대한 BTLA의 결합을 억제하는 음성 면역 체크포인트 경로의 길항제("BTLA 경로 억제제")와 조합하여 투여된다. 항-BTLA 항체 및 길항 HVEM-Ig를 사용하여 BTLA/HVEM 경로를 표적화하는 다수의 접근법이 평가되었고, 이러한 접근법은 이식, 감염, 종양, 및 자가면역 질환을 포함하는 다수의 질병, 장애 및 병태에서 유망한 유용성을 시사하였다(예를 들어, Wu, et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30).
[00216] 일부 구현예에서, IL-12p35/p40 변이체 또는 IL-23p19/p40 변이체는 TIM3이 TIM3-활성화 리간드에 결합하는 능력을 억제하는 음성 면역 체크포인트 경로의 길항제("TIM3 경로 억제제")와 조합하여 투여된다. TIM3 경로 억제제의 예는 당 분야에 공지되어 있으며, 대표적인 비제한적인 예는 문헌[2016년 9월 15일에 공개된 미국 특허 공개 PCT/US2016/021005호; Lifke, et al. 2016년 9월 8일에 공개된 미국 특허 공개 US 20160257749 A1호(F. Hoffman-LaRoche), Karunsky, 미국 특허 제9,631,026호; Karunsky, Sabatos-Peyton, et al. 미국 특허 제8,841,418호; 미국 특허 제9,605,070호; Takayanagi, et al., 미국 특허 제8,552,156호]에 기술된다.
[00217] 일부 구현예에서, 변이체 p40 서브유닛을 포함하는 IL-12 또는 IL-23은 LAG3 및 PD1의 차단이 만성 감염의 환경에서 종양-특이적 CD8+ T-세포 및 바이러스-특이적 CD8+ T-세포 중에서 아너지(anergy)를 상승적으로 역전시키는 것으로 제안되었기 때문에 LAG3 및 PD1 둘 모두의 억제제와 조합하여 투여된다. IMP321(ImmuFact)은 흑색종, 유방암, 및 신장 세포 암종에서 평가되고 있다(일반적으로 문헌[Woo et al., (2012) Cancer Res 72:917-27; Goldberg et al., (2011) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 344:269-78; Pardoll (2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64; Grosso et al., (2007) J. Clin. Invest. 117:3383-392] 참조).
[00218] 일부 구현예에서, 변이체 p40 서브유닛을 포함하는 IL-12 또는 IL-23은 A2aR 억제제와 조합하여 투여된다. A2aR은 CD4+ T-세포가 TReg 세포로 발달하도록 자극함으로써 T-세포 반응을 억제한다. A2aR은 세포 회전율로 인한 종양의 세포 사멸의 비율이 높고 죽어가는 세포가 A2aR에 대한 리간드인 아데노신을 방출하기 때문에 종양 면역에서 특히 중요하다. 또한, A2aR의 결실은 감염에 대한 향상되고 때로는 병리학적인 염증 반응과 관련이 있다. A2aR의 억제는 아데노신 결합을 차단하는 항체와 같은 분자의 투여 또는 아데노신 유사체에 의해 수행될 수 있다. 이러한 제제는 암 및 파킨슨병과 같은 치료 장애에 사용하기 위해 IL12p35/p40 변이체 및 IL23p19/p40 변이체와 함께 사용될 수 있다.
[00219] 일부 구현예에서, 변이체 p40 서브유닛을 포함하는 IL-12 또는 IL-23은 IDO의 억제제(인돌아민 2,3-디옥시게나제)와 조합하여 투여된다. IDO는 트립토판의 산화를 통해 매개된 면역 반응을 하향 조절하여 T-세포 활성화의 억제 및 T-세포 아폽토시스의 유도를 일으켜, 종양-특이적 세포독성 T 림프구가 대상체의 암 세포를 기능적으로 불활성화되거나 대상체의 암 세포를 더 이상 공격할 수 없는 환경을 생성한다. 인독시모드(NewLink Genetics)는 전이성 유방암에서 평가되는 IDO 억제제이다.
[00220] 전술한 바와 같이, 본 발명은 2, 3 또는 그 이상의 면역 체크포인트 경로를 조절하는 면역 체크포인트 경로 조절제를 포함하는 적어도 하나의 면역 체크포인트 경로를 조절하는 제제(들)와 조합하여 IL12p35/p40 변이체 또는 IL23p19/p40 변이체의 투여에 의해 포유동물 대상체에서 신생물 질환(예를 들어, 암)의 치료 방법을 제공한다.
[00221] 일부 구현예에서, IL12p35/p40 변이체 또는 IL23p19/p40 변이체는 다중 면역 체크포인트 경로를 조절할 수 있는 면역 체크포인트 조절제와 조합하여 투여된다. 다중 면역 체크포인트 경로는 다중 면역 체크포인트 경로의 조절제로서 작용할 수 있는 다기능 분자의 투여에 의해 조절될 수 있다. 이러한 다중 면역 체크포인트 경로 조절제의 예는 이중-특이적 또는 다중-특이적 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 조절제 또는 다중 면역 체크포인트 경로로 작용할 수 있는 다중-특이적 항체의 예는 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2013/0156774호에는 PD1 및 TIM3을 공동-발현하는 세포를 표적화하기 위한 이중특이적 및 다중특이적 작용제(예를 들어, 항체), 및 이들의 사용 방법이 기술되어 있다. 또한, BTLA 및 PD1의 이중 차단은 항종양 면역을 향상시키는 것으로 나타났다(Pardoll, (April 2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64). 본 개시는 PD1 및 LAG3 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다중 면역 체크포인트 경로를 표적화하는 면역 체크포인트 경로 조절제와 조합된 IL12p35/p40 변이체 및/또는 IL23p19/p40 변이체의 사용을 고려한다. 따라서, 항종양 면역은 여러 수준에서 향상될 수 있고, 다양한 기계론적 고려사항의 관점에서 조합 전략이 생성될 수 있다.
[00222] 일부 구현예에서, IL-12p35/p40 변이체 또는 IL-23p19/p40 변이체는 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 체크포인트 경로 조절제와 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 조합은 면역 체크포인트 경로가 별개의 작용 메커니즘을 가질 수 있고, 이는 다수의 별개의 치료 각도로부터 기저 질환, 장애 또는 병태를 공격할 기회를 제공한다는 점에서 유리할 수 있다.
[00223] 면역 체크포인트 경로 억제제에 대한 치료 반응은 종종 티로신 키나제 억제제와 같은 전통적인 화학요법에 대한 반응보다 훨씬 늦게 나타난다는 점에 유의해야 한다. 일부 예에서, 치료 반응의 객관적인 지표가 관찰되기 전에 면역 체크포인트 경로 억제제로의 치료 개시 후 6개월 이상이 걸릴 수 있다. 따라서, 본 개시의 IL-12p35/p40 변이체 또는 IL-23p19/p40 변이체와 조합된 면역 체크포인트 경로 억제제(들)로의 치료에 관한 결정은 통상적인 화학요법보다 흔히 더 긴 종양 진행 시간에 걸쳐 이루어져야 한다. 원하는 반응은 상황 하에서 유리한 것으로 간주되는 임의의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 요망되는 반응은 질병, 장애 또는 병태의 진행의 예방인 반면, 다른 구현예에서 요망되는 반응은 질병, 장애 또는 병태의 하나 이상의 특징의 퇴행 또는 안정화이다(예를 들어, 종양 크기의 감소임). 또 다른 구현예에서, 원하는 반응은 조합물의 하나 이상의 제제와 관련된 하나 이상의 부작용의 감소 또는 제거이다.
보충제로서의 세포 요법 제제 및 방법
[00224] 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체와, 신생물, 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 위한 세포 요법 형태의 보조 제제와 함께 투여 조합을 포함할 수 있다. 본 개시의 방법과 함께 사용할 수 있는 세포 요법의 예는 하나 이상의 활성화된 CAR-T 세포, 조작된 TCR 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), 조작된 Treg 세포를 포함하는 조작된 T 세포 생성물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 조작된 T-세포 생성물은 일반적으로 대상체에 투여되기 전에 생체외에서 활성화되고 따라서 상향조절된 수준의 CD25를 제공하므로, 이러한 활성화된 조작된 T 세포 타입을 포함하는 세포 생성물은 본원에 기술된 바와 같은 IL-12p40 변이체의 투여를 통해 추가로 지지될 수 있다.
CAR-T 세포
[00225] 본 개시의 방법의 일부 구현예에서, 보충제는 일반적으로 키메라 항원 수용체를 발현하도록 재조합적으로 변형된 T-세포를 지칭하는 "키메라 항원 수용체 T-세포"(CAR-T 세포)이다. 당업자는 키메라 항원 수용체(CAR)가 일반적으로 서열에 아미노에서 카르복시 말단으로 배열된 다중 기능적 도메인: (a) 항원 결합 도메인(ABD), (b) 막횡단 도메인(TD); 및 (c) 하나 이상의 세포질 신호전달 도메인(CSD)을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로 이해할 것이며, 여기서 상기 도메인은 하나 이상의 스페이서 도메인에 의해 선택적으로 연결될 수 있다. CAR은 또한 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 세포의 세포 표면 상의 CAR의 번역-후 프로세싱 및 제시 동안 통상적으로 제거되는 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 CAR은 당 분야에 널리 공지된 원리에 따라 제조된다(예를 들어, 문헌[Eshhaar et al. 미국 특허 번호 제7,741,465 B1호; Sadelain, et al (2013) Cancer Discovery 3(4):388-398; Jensen and Riddell (2015) Current Opinions in Immunology 33:9-15; Gross, et al. (1989) PNAS USA) 86(24):10024-10028; Curran, et al. (2012) J Gene Med 14(6):405-15] 참조). 본 발명의 직교 수용체를 도입하도록 변형될 수 있는 상업적으로 이용 가능한 CAR-T 세포 생성물의 예는 악시캅타진 실로류셀(Gilead Pharmaceuticals로부터 상업적으로 이용 가능한 Yescarta®로 시판됨) 및 티사겐레클레우셀(Novatis로부터 상업적으로 이용 가능한 Kymriah®로서 시판됨)을 포함한다.
[00226] 당업자는 용어 항원 결합 도메인(ABD)이 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로 이해할 것이다. ABD는 표적 세포의 표면 상에 발현된 하나 이상의 세포 표면 분자(예를 들어, 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, ABD는 GD2, BCMA, CD19, CD33, CD38, CD70, GD2, IL3Rα2, CD19, 메조텔린, Her2, EpCam, Muc1, ROR1, CD133, CEA, EGRFRVIII, PSCA, GPC3, Pan-ErbB 및 FAP로 구성된 군으로부터 선택되는 종양 세포와 관련된 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, ABD는 종양 세포와 회합된 적어도 하나의 세포 표면 분자(즉, 적어도 하나의 종양 항원)에 특이적으로 결합하는 항체(하나 이상의 VHH, scFv 등과 같은 분자를 포함하기 위해 상기 정의된 바와 같음)이다. 종양 세포와 회합된 세포 표면 분자가 GD2, BCMA, CD19, CD33, CD38, CD70, GD2, IL3Rα2, CD19, 메조텔린, Her2, EpCam, Muc1, ROR1, CD133, CEA, EGRFRVIII, PSCA, GPC3, Pan-ErbB 및 FAP로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 개시의 방법의 실행에서 보충제로서 유용한 CAR-T 세포의 예는 항-GD2 항체, 항-BCMA 항체, 항-CD19 항체, 항-CD33 항체, 항-CD38 항체, 항-CD70 항체, 항-GD2 항체 및 IL3Rα2 항체, 항-CD19 항체, 항-메조텔린 항체, 항-Her2 항체, 항-EpCam 항체, 항-Muc1 항체, 항-ROR1 항체, 항-CD133 항체, 항-CEA 항체, 항-PSMA 항체, 항-EGRFRVIII 항체, 항-PSCA 항체, 항-GPC3 항체, 항-Pan-ErbB 항체, 항-FAP 항체 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 ABD를 포함하는 CAR 세포를 발현하는 CAR-T 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[00227] CAR 폴리펩타이드의 세포질 도메인은 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하는 T-세포 수용체(TCR) 및 공동-수용체의 세포질 서열 및 이의 기능적 유도체 및 서브-단편을 포함한다. T 세포 수용체 제타-사슬로부터 유래된 것과 같은 세포질 신호전달 도메인은 키메라 수용체와 표적 항원의 결합 후 T 림프구 증식 및 이펙터 기능에 대한 자극 신호를 생성하기 위해 CAR의 일부로서 사용된다. 세포질 신호전달 도메인의 예는 CD27의 세포질 도메인, CD28의 세포질 도메인 S, CD137의 세포질 도메인(4-1BB 및 TNFRSF9로도 지칭됨), CD278의 세포질 도메인(또한 ICOS로서), PI3 키나제의 p110α, β, 또는 δ 촉매 서브유닛, 인간 CD3 ζ-사슬, CD134의 세포질 도메인(OX40 및 TNFRSF4로도 지칭됨), FcεR1γ 및 β 사슬, MB1(Igα) 사슬, B29(Igβ) 사슬 등), CD3 폴리펩타이드(δ, Δ 및 ε), syk 패밀리 티로신 키나제(Syk, ZAP 70 등), src 패밀리 티로신 키나제(Lck, Fyn, Lyn 등) 및 관련된 다른 분자 T-세포 형질도입, 예컨대, CD2, CD5 및 CD28을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[00228] IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체는 제1, 제2, 제3 또는 제4 세대 CAR-T 세포와 조합하여 투여될 수 있다. 용어 1세대 CAR-T 세포는 CAR을 발현하도록 조작된 세포를 지칭하며, 여기서 세포질 도메인은 단지 단일 신호전달 도메인, 예를 들어, IgE FcεR1γ 또는 CD3ζ 사슬에 대한 고친화성 수용체로부터 유래된 신호전달 도메인을 통해 항원 결합으로부터의 신호를 전달한다. 도메인은 항원-의존성 T-세포 활성화를 위한 1개 또는 3개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(들)[ITAM(들)]를 함유한다. ITAM-기반 활성화 신호는 T-세포에 표적 종양 세포를 용해시키고 항원 결합에 반응하여 사이토카인을 분비하는 능력을 부여한다. 2세대 CAR-T 세포는 CD3 ζ 신호 이외에 공동-자극 신호를 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된 세포를 지칭한다. 공동-자극 신호의 우연한 전달은 CAR-형질도입된 T-세포에 의해 유도된 사이토카인 분비 및 항종양 활성을 향상시킨다. 공동-자극 도메인은 일반적으로 CD3ζ 도메인에 비해 막 근위이다. 3세대 CAR-T 세포는 예를 들어, CD28, CD3ζ, OX40 또는 4-1BB 신호전달 영역을 포함하는 삼중 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된 세포를 지칭한다. 4세대에서, 또는 "장갑 car"에서, CAR T-세포는 IL-12, IL-18, IL-7, 및/또는 IL-10; 4-1BB 리간드, CD-40 리간드의 발현과 같은 면역 활성을 향상시키기 위해 분자 및/또는 수용체를 발현하거나 차단하도록 추가로 변형된다. 본 발명의 CAR에 도입될 수 있는 세포내 신호전달 도메인의 예는 (아미노에서 카르복시로): CD3ζ; CD28 - 41BB - CD3ζ; CD28 - OX40 - CD3ζ; CD28 - 41BB - CD3ζ; 41BB - CD-28 - CD3ζ 및 41BB - CD3ζ를 포함한다.
[00229] 상기 용어는 스플릿 CAR, ON-스위치 CAR, 이중특이적 또는 탠덤 CAR, 억제 CAR(iCAR) 및 유도 만능 줄기(iPS) CAR-T 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 CAR 변이체를 포함한다. 용어 "스플릿 CAR"은 CAR의 세포외 부분, ABD 및 세포질 신호전달 도메인이 2개의 개별 분자에 존재하는 CAR을 지칭한다. CAR 변이체는 또한, 예를 들어, 스플릿 CAR의 2개 부분의 조건부 이종다이머화가 약리학적으로 제어되는 스플릿 CAR을 포함하는 조건부 활성화 가능한 CAR인 ON-스위치 CAR을 포함한다. CAR 분자 및 이의 유도체(즉, CAR 변이체)는, 예를 들어, 문헌[PCT 출원 US2014/016527, US1996/017060, US2013/063083; Fedorov et al. Sci Transl Med (2013) ;5(215):215ra172; Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21; Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5; Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4; Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33; Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106; Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47; Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98; Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304]에 기술되며, 이러한 개시는 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함된다. 용어 "이중특이적 또는 탠덤 CAR"은 일차 CAR의 활성을 증폭시키거나 억제할 수 있는 이차 CAR 결합 도메인을 포함하는 CAR을 지칭한다. 용어 "억제 키메라 항원 수용체" 또는 "iCAR"은 2차 CAR 결합 도메인의 억제 신호전달 도메인이 장착된 2차 억제 수용체의 결합을 통해 활성 CAR의 활성화를 셧다운하는 데 표적화하는 이중 항원을 사용한 iCAR의 결합이 1차 CAR 활성화의 억제를 초래하는 CAR을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 억제 CAR(iCAR)은 억제 수용체 신호전달 모듈 활성화를 통해 CAR-T 세포 활성을 조절하도록 설계된다. 이 접근법은 2개의 CAR의 활성을 조합하며, 이 중 하나는 활성화 수용체에 의해 활성화된 CAR-T 세포의 반응을 제한하는 우성 음성 신호를 생성한다. iCAR은 정상 조직에 의해서만 발현되는 특정 항원에 결합될 때 중화 활성제 CAR의 반응을 스위치 오프할 수 있다. 이러한 방식으로, iCARs-T 세포는 암 세포를 건강한 세포와 구별할 수 있고, 항원-선택적 방식으로 형질도입된 T 세포의 기능을 가역적으로 차단할 수 있다. iCAR에서 CTLA-4 또는 PD-1 세포내 도메인은 T 림프구에 대한 억제 신호를 촉발하여, 더 적은 사이토카인 생산, 덜 효율적인 표적 세포 용해, 및 변경된 림프구 운동성을 초래한다. 용어 "탠덤 CAR" 또는 "TanCAR"은 2개의 상이한 종양 관련 항원의 독립적인 관여에 반응하여 자극 또는 공동자극 신호를 전달하도록 설계된 2개의 키메라 수용체의 맞물림을 통해 T 세포의 이중특이적 활성화를 매개하는 CAR을 지칭한다.
[00230] 일반적으로, 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR-T 세포)는 실질적으로 상기 교시에 따라 CAR을 인코딩하는 발현 벡터로의 형질도입에 의해 재조합적으로 변형된 T-세포이다.
[00231] 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 치료되는 개체에 대해 동종이계이다(Graham et al. (2018) Cell 7(10) E155). 일부 구현예에서, 동종이계 조작된 T 세포는 완전히 HLA 매칭된다. 그러나, 모든 환자가 완전히 일치된 공여자를 갖는 것은 아니며, HLA 타입과 무관하게 모든 환자에 적합한 세포 생성물이 대안을 제공한다.
[00232] 본 개시의 방법의 실시에 사용되는 T 세포가 동종이계 T 세포인 경우, 이러한 세포는 이식편 대 숙주 질환을 감소시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조작된 세포는 유전자 편집 기술에 의해 달성된 TCRαβ 수용체 녹아웃일 수 있다. TCRαβ는 이종다이머이고, 이것이 발현되기 위해서는 알파 및 베타 사슬 둘 모두가 존재할 필요가 있다. 단일 유전자는 알파 사슬(TRAC)을 코딩하는 반면, 베타 사슬을 코딩하는 유전자는 2개이므로, 이러한 목적을 위해 TRAC 유전자좌 KO가 결실되었다. 이러한 결실을 달성하기 위해 다수의 상이한 접근법, 예를 들어, CRISPR/Cas9; 메가뉴클레아제; 조작된 I-CreI 귀소 엔도뉴클레아제 등을 포함한다(예를 들어, 문헌[Eyquem et al. (2017) Nature 543:113-117], 여기서 TRAC 코딩 서열은 CAR 코딩 서열로 대체됨; 및 Georgiadis et al. (2018) Mol. Ther. 26:1215-1227], 여기서, CAR을 TRAC 유전자좌에 직접 도입시키지 않으면서 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복체(CRISPR)/Cas9에 의해 CAR 발현을 TRAC 파괴와 연결시킴]). GVHD를 예방하기 위한 대안적인 전략은, 예를 들어, TCR 억제 분자로서 절단된 형태의 CD3ζ를 사용하여 T 세포를 변형시켜 TCRαβ 신호전달의 억제제를 발현시킨다.
[00233] 일부 구현예에서, IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체는 유사체를 포함하는 IL2, IL-7, IL-15 및 IL-18 및 이들 각각의 변이체를 비제한적으로 포함하는 추가적인 사이토카인과 조합하여 투여된다.
[00234] 일부 구현예에서, IL-12(p35/p40) 변이체 또는 IL-23(p19/p40) 변이체는 활성화-유도된 세포 사멸(AICD)을 억제하는 하나 이상의 보충제와 조합하여 투여된다. AICD는 Fas 수용체(예를 들어, Fas, CD95)와 Fas 리간드(예를 들어, FasL, CD95 리간드)의 상호작용으로부터 발생하는 프로그램된 세포 사멸의 한 형태이며, 말초 면역 관용을 유지하는 데 도움이 된다. AICD 이펙터 세포는 FasL을 발현하고, Fas 수용체를 발현하는 세포에서 아폽토시스가 유도된다. 활성화-유도된 세포 사멸은 이들의 T-세포 수용체의 반복된 자극으로 인한 활성화된 T 림프구의 음성 조절자이다. 본원에 기재된 IL-12(p35/p40) 변이체 및 IL-23(p19/p40) 변이체와 조합하여 사용될 수 있는 AICD를 억제하는 제제의 예는 사이클로스포린 A(Shih, et al., (1989) Nature 339:625-626), IL-16 및 유사체(rhIL-16 포함, Idziorek, et al., (1998) Clinical and Experimental Immunology 112:84-91), TGFb1(Genesteir, et al., (1999) J Exp Med189(2): 231-239), 및 비타민 E(Li-Weber, et al., (2002) J Clin Investigation 110(5):681-690)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[00235] 일부 구현예에서, 보충제는 방사선요법, 냉동요법, 온열 요법, 수술, 레이저 절제, 및 양성자 요법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 항-종양성 물리적 방법이다.
키트
[00236] 또한, 본원에 기재된 방법의 실시를 위한 다양한 키트가 본원에 제공된다. 특히, 본 개시의 일부 구현예는 대상체에서 IL-12p40-매개 신호전달을 조절하는 방법을 위한 키트에 관한 것이다. 일부 다른 구현예는 이를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법을 위한 키트에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 제공되고 기재된 바와 같은 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드, 재조합 핵산, 재조합 세포, 또는 약학적 조성물 중 하나 이상; 및 이의 사용 설명서를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 재조합 폴리펩타이드, 본 개시의 IL-12p40 폴리펩타이드 변이체, 본 개시의 재조합 핵산, 본 개시의 재조합 세포 또는 본 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상; 및 이의 사용 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키트는 IL-12p35 폴리펩타이드, 또는 IL-12p35 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 키트는 IL-23p19 폴리펩타이드, 또는 IL-23p19 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
[00237] 일부 구현예에서, 본 개시의 키트는 제공된 재조합 폴리펩타이드, 재조합 핵산, 재조합 세포 또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 개체에 투여하는 데 사용되는 하나 이상의 주사기(사전충전된 주사기 포함) 및/또는 카테터(사전충전된 주사기 포함)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 요망되는 목적을 위해, 예를 들어, 세포의 활성을 조절하거나, 표적 암 세포를 억제하거나, 이를 필요로 하는 개체에서 질환을 치료하기 위해 다른 키트 성분들과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제를 가질 수 있다.
[00238] 임의의 상기 기재된 키트는 하나 이상의 추가 시약을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 이러한 추가 시약은 희석 완충제; 재구성 용액, 세척 완충제, 대조군 시약, 대조군 발현 벡터, 음성 대조군 폴리펩타이드, 양성 대조군 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드의 시험관내 생산을 위한 시약으로부터 선택될 수 있다.
[00239] 일부 구현예에서, 키트의 성분은 별도의 용기에 있을 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 키트의 성분은 단일 용기에서 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 일부 구현예에서, 키트는 하나의 용기에(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에) 본원에 기재된 바와 같은 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드, 재조합 핵산, 재조합 세포, 또는 약학적 조성물 중 하나 이상 및 또 다른 용기에(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에) 추가 치료제를 포함한다.
[00240] 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 키트의 약학적 조성물 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 약학적 조성물 및 투여 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는 데 있어서 환자 및 의사를 돕는다. 예를 들어, 본 개시의 조합에 관한 하기 정보는 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 사용법, 금기, 경고, 주의사항, 부작용, 과다투여, 적절한 투여량 및 투여, 방법 제공, 적절한 보관 조건, 참조, 제조업체/배포자 정보 및 지적 재산권 정보.
[00241] 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 방법을 실시하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기재 상에 인쇄될 수 있다. 설명서는 패키지 삽입물로서 키트에, 키트의 용기 또는 이의 성분의 라벨링(예를 들어, 패키징 또는 서브패키징과 관련됨) 등에 존재할 수 있다. 설명서는 적합한 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체, 예를 들어, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재할 수 있다. 일부 예에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, (예를 들어, 인터넷을 통해) 원격 소스로부터 설명서를 얻기 위한 수단이 제공될 수 있다. 이러한 구현예의 예는 설명서가 보여질 수 있고/있거나 지침이 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서에서와 같이, 설명서를 얻기 위한 이러한 수단은 적합한 기판에 기록될 수 있다.
[00242] 본 개시에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 인용에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 인용에 의해 포함된다.
[00243] 본원에 인용된 임의의 참고문헌이 종래 기술을 구성한다는 것은 인정되지 않는다. 참고문헌의 논의는 그들의 저자가 주장하는 바를 기술하고, 출원인은 인용된 문헌의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 과학 저널 기사, 특허 문헌, 및 교과서를 포함하는 다수의 정보 출처가 본원에서 언급되지만; 이 참고문헌은 이러한 문헌들 중 임의의 문헌이 당 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정을 구성하지 않는 것이 분명히 이해될 것이다.
[00244] 본원에 제공된 일반적인 방법의 논의는 단지 예시 목적으로 의도된 것이다. 다른 대안적인 방법 및 대안은 본 개시의 검토시 당업자에게 명백할 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함된다.
실시예
[00245] 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (본원에서 "Sambrook"으로 공동으로 지칭됨); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (including supplements through 2014); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., Ferre, F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (including supplements through 2014); 및 Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.]에서 충분히 설명되어 있으며, 이러한 문헌의 개시는 본원에 인용에 의해 포함된다.
[00246] 추가 구현예는 하기 실시예에서 추가로 상세히 개시되며, 이는 예시로서 제공되며 어떠한 방식으로도 본 개시 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
일반 실험 절차
인간 T 세포 신호전달
[00247] 재조합 인간 IL-12 및 IL-23의 생산을 위해, IL-12p40(23-328)을 N-말단 HA 신호 펩타이드 및 C-말단 AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE, SEQ ID NO: 12) 및 6xHis를 갖는 pD649 벡터에 클로닝하였다. 인간 IL-12p35(23-219) 및 IL-23p19(28-189)를 N-말단 HA 신호 펩타이드, 플래그 태그 및 TEV 프로테아제 부위를 갖는 pD649에 클로닝하였다. IL-12(IL-12p35 및 IL-12p40), IL-23(IL-23p19 및 IL-12p40) 및 IL-12p40 단독은 제조사의 프로토콜에 따라 Expi293F 세포(ThermoFisher #A14527)의 일시적 트랜스펙션에 의해 발현되었다. 상청액을 Ni-NTA 정제 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 적용하였다.
[00248] 인간 T 세포 신호전달의 경우, IL-12 및 IL-23 변이체를 상기 기재된 바와 같이 Expi293 세포에서 생산하였다. IL-12p35 및 IL-23p19를 IL-12p40 변이체(야생형, E81A, F82A 또는 P39A D40A E81A F82A)로 공동-트랜스펙션시키고, Ni-NTA에 이어서 SEC에 의해 정제하였다. 인간 말초 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Cat # GE17-1440-02)와 함께 SepMate-50 컬럼(STEMCELL Technologies #85450)을 사용하여 Stanford Blood Bank 샘플로부터 단리하였다. 세포를 2% 우태아 혈청(FBS)을 갖는 멸균 PBS(Gibco #20012-050)에서 희석하고, 15 ml Ficoll이 미리 로딩된 SepMate-50 컬럼에 첨가하였다. 적혈구를 ACK 용해 완충제(Gibco #A10492-01)를 사용하여 5분 동안 용해시키고, 2% FBS를 함유하는 PBS로 켄칭하고, 90% FBS 및 10% DMSO를 함유하는 동결 배지에서 50x106/mL로 재현탁시켰다. 세포를 Mr. Frosty 동결 용기(ThermoFisher #5100-0001)에서 -80℃에서 밤새 동결시키고 장기 저장을 위해 -80℃ 저장 박스로 옮겼다. 인간 PBMC를 5 ㎍/mL αCD28(CD28.2, Biolgend, #302943) 및 100 IU/mL 재조합 인간 IL-2가 보충된 10% FBS, 비필수 아미노산(Gibco # 11140050), 소듐 피루베이트(Gibco Cat #11360-070), 15 mM HEPES(Gibco #15630-080) 및 페니실린-스트렙토마이신(Gibco Cat #15140163)을 갖는 RPMI 1640-glutaMAX(Gibco #61870-127) 중 2.5 ㎍/mL αCD3(OKT-3, BioLegend, #317326)으로 코팅된 6웰 플레이트에서 자극하였다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 세포를 1회 세척하고 완전한 RPMI에서 밤새 휴지시켰다. 세포를 αCD4 PacBlue(RPA-T4, BD, #558116)로 염색하고 37℃에서 20분 동안 IL-12 및 IL-23 변이체로 자극한 후 실온에서 10분 동안 1.6% 파라포름알데히드로 고정시키고 -20℃에서 메탄올로 침투시켰다. 세포를 2% FBS 및 2 mM EDTA를 갖는 PBS에서 세척하고, STAT4 pY693 AF488(38/p-Stat4, BD, #558136) 및 STAT3 pY705 AF647(4/P-STAT3, BD, #557815)에 대한 항체로 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 형광 강도를 CytoFlex 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 분석하였다.
[00249] 인간 PBMC에서 IL-12Rβ1의 분석을 위해, 세포를 직접(생체외) 염색하거나 상기 기재된 바와 같이 활성화시켜 T 세포 모세포를 생성하였다. T 세포 및 NK 세포를 확인하기 위해, Fc 수용체를 TruStain FcX(BioLegend)로 차단하고, 세포를 αCD3 Pacific Blue(UCHT1, BioLegend), αCD4 FITC(OKT4, BioLegend), αCD8 AF750(R&D systems), 및 αCD56 BV605(HCD56, BioLegend)의 표현형 패널로 염색하였다. 200 nM 스트렙타비딘-AF647을 표면 플라스몬 공명 섹션에 기재된 바와 같이 발현된 4배 몰 과량의 비오티닐화된 p40과 혼합함으로써 인간 p40 테트라머를 제조하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 염색한 후 프로피디움 아이오다이드(PI, Invitrogen)를 사용하여 생 세포 검출하였다. 샘플을 CytoFlex 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 분석한 후 FlowJo(BD)에서 분석하였다. CD8+ T 세포는 liveCD3+CD8+로 정의되었고, NK 세포는 liveCD3-CD56+로 정의되었다(게이팅은 도 7b 참조).
[00250] 인간 CD8+ T 세포 IFNγ 유도 검정을 위해, CD8+ T 세포 단리 키트(Milteny) 및 LS 자기 컬럼(Miltenyi)을 사용하여 MACS에 의해 PBMC로부터 CD8+ T 세포를 단리하였다. 정제된 CD8+ T 세포를 0.5 ㎍/mL αCD28(CD28.2, BioLegend)의 존재 하에 2 ㎍/mL αCD3(OKT3, BioLegend) 및 5ng/mL 인간 IL-2로 코팅된 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 80,000개 세포/웰로 자극하였다. 48시간 후, 세포를 펠렛화하고, Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트(BioLegend)와 함께 인간 IFNγ ELISA MAX Deluxe(BioLegend)를 사용하여 상청액을 분석하였다. 인간 NK 세포 IFNγ 유도 검정의 경우, EasySep Magnet(StemCell)과 함께 EasySep 인간 NK 세포 단리 키트(StemCell)를 사용하여 MACS에 의해 PBMC로부터 NK 세포를 단리하였다. 정제된 NK 세포를 100 ng/mL IL-18의 존재 하에 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 40,000개 세포/웰로 자극하였다(R&D systems). 48시간 후, 상청액을 수확하고 CD8+ T 세포 IFNγ 유도 검정에 대해 기재된 바와 같이 처리하였다.
IL-12p40 표면 염색
[00251] mIL-12p40 표면 염색을 위해, 마우스 IL-12p40(23-335)을 N-말단 GP64 신호 펩타이드 및 C-말단 AviTag 및 6xHis 태그를 갖는 pAcGP67a로 클로닝하였다. 마우스 IL-12p40은 디설파이드 결합된 동종다이머로서 분비되며, 모노머 IL-12p40을 수득하기 위해, Ni-NTA 정제된 단백질을 20 mM 시스테인으로 환원시키고 HEPES 완충 식염수(HBS) pH 8.2에서 40 mM 아이오도아세트아미드로 알킬화시킨 후 SEC를 수행하였다. 모노머 IL-12p40을 재조합 BirA로 비오티닐화하고, 제2 라운드의 SEC에 의해 정제하였다.
[00252] C57/BL6 마우스로부터의 비장 및 림프절을 단리하고 단일 세포 현탁액을 생성하였다. T 세포 모세포를 5 ㎍/mL αCD28(37.51, Bio X Cell, Cat # BE0015-1) 및 100IU/mL를 갖는 재조합 마우스 IL-2를 갖는 완전 RMPI에서 37℃에서 48시간 동안 2.5 ㎍/mL αCD3(145-2c11, BioLegend, Cat #100340)으로 코팅된 플레이트에서 활성화시켰다. 세포 염색을 위해, 생체외 세포 및 T 세포 모세포를 TruStain FcX(93, BioLegend, 101320)와 함께 인큐베이션하고, αCD3 FITC(17A2, eBiosciences, #11-0032-82), αCD4 PerCP-Cy5.5(GK1.5, BioLegend, #100433), αCD8 BV785(53-6.7, Biolegend, #100749) 및 αNK1.1 e450(PK136, eBioscience, #48-5941-82)의 표현형 패널로 염색하였다. 200 nM 스트렙타비딘-AF647을 4배 몰 과량의 비오티닐화된 IL-12p40과 혼합하여 IL-12p40 테트라머를 제조하고, 세포를 4℃에서 2시간 동안 염색한 후 프로피디움 아이오다이드(PI, ThermoFisher #P3566)로 생 세포 염색하였다. 샘플을 CytoFlex 유세포분석기를 사용하여 분석한 후 FlowJo에서 분석하였다. CD8+ T 세포는 liveCD3+CD8+로 정의되었고, NK 세포는 liveCD3-NK1.1+로 정의되었다.
마우스 IL-12 신호전달
[00253] IL-12 신호전달 및 기능적 검정의 경우, 마우스 IL-12를 이전에 기재된 접근법과 유사하게 단일 사슬로서 발현하였다(Anderson et al., 1997). 마우스 IL-12p40(23-335), 이후 3xGGGS 링커, 3C 프로테아제 부위 및 마우스 IL-12p35(23-215)를 N-말단 GP64 신호 펩타이드 및 C-말단 6xHis 태그를 갖는 pAcGP67a에 클로닝하였다. 마우스 IL-12 변이체를 T. ni 세포에 첨가하고 Ni-NTA 및 SEC에 의해 정제하였다. 세포 신호전달을 위해, 마우스 T 세포 모세포를 상기 기재된 바와 같이 제조하고, 완전한 RPMI에서 밤새 휴지시키고, αCD8 BV785(53-6.7, Biolegend, #100749)로 염색하고, IL-12 변이체로 37℃에서 20' 동안 자극하고, 이후에 인간 T 세포 신호전달에 대해 기술된 바와 같이 pSTAT4에 대한 고정화, 투과화 및 염색을 수행하였다.
NK 세포 INFγ 유도
[00254] NK 세포 IFNγ 유도 검정을 위해, 마우스 NK 세포 단리 키트(Miltenyi #130-115-818) 및 LS 자기 컬럼(Mitenyi #130-042-401)을 사용하여 C57/BL6 마우스의 비장 및 림프절로부터 NK 세포를 단리하였다. NK 세포를 37℃에서 48시간 동안 50 ng/mL 재조합 마우스 IL-18(R&D 시스템 #9139-IL-010) 및 1 μM IL-12 변이체를 갖는 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 25,000개 세포/웰로 자극하였다. 배양의 마지막 4시간에, 추가 사이토카인 분비를 방지하기 위해 GolgiStop(BD #554724)을 첨가하였다. 세포를 고정시키고 Cytofix/Cytoperm 키트(BD, #554714)를 사용하여 투과시키고, αIFNγ AF647(XMG1.2, BD, #557735)로 염색하였다. 형광 강도를 CytoFlex 유세포 분석기를 사용하여 기록하고 FlowJo에서 분석하였다.
CD8+ T 세포 IFNγ 유도
[00255] CD8+ T 세포 이펙터 검정을 위해, OT-I TCR 유전자 이식 마우스(C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/j)(Hogquist et al., 1994)를 Jackson Labs로부터 입수하고 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 스탠포드 동물 시설에서 유지시켰다. OT-I 비장세포를 1 ㎍/mL 난백 알부민(aa257-264, GenScript #RP10611), 100 IU/mL rmIL-2 및 1 μM IL-12 변이체를 함유하는 배지에서 자극하였다. IFNγ 유도 검정을 위해, 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 80,000개 세포/웰로 48시간 동안 자극하였다. 마지막 4시간 동안, 추가 사이토카인 분비를 방지하기 위해 GolgiStop을 첨가하였다. 세포를 αCD3 e450(17A2, eBioscience, 48-0032-82) 및 αCD8 BV785(53-6.7, Biolegend, #100749)로 염색한 후 Cytofix/Cytoperm 키트를 사용하여 고정/투과시키고, αIFNγ AF647로 염색하였다. 샘플을 CD3+CD8+ 세포에 게이팅하고, αIFNγ AF647 염색을 CytoFlex 유세포분석기를 사용하여 평가한 후 FlowJo에서 분석하였다.
MHC-I 상향조절
[00256] MHC-1 상향조절을 위해, 25,000개의 B16F10 흑색종 세포(ATCC #CRL-6475)를 37℃에서 4시간 동안 96개의 평평한 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 상기 기재된 바와 같이 IL-12 변이체의 존재 또는 부재 하에 생성된 OT-I 이펙터로부터의 상청액을 배지에서 희석하고 37℃에서 16시간 동안 B16F10 세포에 첨가하였다. 밤새 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, TrypLE(ThermoFisher #12604013)를 사용하여 B16F10 세포를 단리하였다. 세포를 αH-2Kb APC(AF6-88.5.5.3, BioLegend, #116512) 및 PI로 염색하여 살아있는 세포를 확인하였다. 데이터를 CytoFlex 유세포 분석기에서 수집하고 FlowJo에서 분석하였다.
항원-특이적 종양 세포 사멸
[00257] 항원-특이적 종양 세포 사멸을 위해, B16F10 세포를 pCDH-EF1-cOVA-T2A-copGFP로 형질도입하고(Tseng et al., 2013), 분류하여 OVA-GFP 발현 세포의 순수한 집단을 수득하였다. B16F10 야생형 및 OVA-GFP를 1:1 비로 혼합하고, 25,000개의 세포를 96 평평한 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 37℃에서 4시간 후, 배지를 제거하고, 상기 기재된 바와 같이 IL-12 변이체가 있거나 없이 생성된 OT-I 이펙터를 37℃에서 36시간 동안 완전한 RPMI 중에 첨가하였다. 배지를 제거하고, CytoFlex에서 샘플을 실행하기 전에 PI 및 αCD45.2 APC(104, eBioscience, #17-0454-82)로 염색한 TrypLE를 사용하여 B16F10을 분리하였다. B16F10은 liveCD45.2-로 확인되었고, % GFP+는 이펙터 조건이 없는 것과 비교하여 정량화되었다.
실시예 2
IL-12Rβ1 및 4차 IL-23 수용체 복합체의 결정 구조
[00258] 이러한 실시예는 IL-12Rβ1 및 4차 IL-23 수용체 복합체의 결정 구조를 결정하기 위해 수행된 실험의 결과를 설명하며, 이는 또한 헤테로머 수용체 복합체의 사이토카인-수용체 상호작용 각각을 구동하는 화학을 설명하는 데 도움이 된다.
[00259] 상기 기재된 바와 같이, IL-23(IL-23p19/IL-12p40)은 IL-23R 및 IL-12Rβ1로 구성된 수용체 복합체를 통해 신호를 보낸다(도 1a). IL-12Rβ1의 ECD는 5개의 피브로넥틴 타입 III(FNIII) 도메인으로 구성되며, 이의 N-말단 D1-D2 도메인은 IL-23에 대한 결합을 매개한다. IL-23 및 IL-23R 엑토도메인을 갖는 IL-12Rβ1 D1-D2의 복합체를 결정화하기 위해 실험을 설계하고 수행하였다. 하기 표 3은 3.4 Å 분해능으로 회절된 4차 복합체의 결정학적 데이터 및 정제 통계를 요약한 것이다.
[00260] 복합체의 일부의 구조를 이전에 공개된 IL-23R 삼원(IL-23p19/IL-12p40/IL-23R) 복합체를 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였다. 그러나, IL-12Rβ1의 구조는 여전히 필요하였다. 따라서, 변칙 산란을 갖는 단일 동형 치환(SIRAS)을 사용하여 2.0 Å의 분해능으로 인간 IL-12Rβ1 D1-D2 도메인의 구조를 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 후속하여, 이러한 새롭게 확립된 구조를 4차 복합체의 전자 밀도에 IL-12Rβ1 D1 도메인을 배치하는 것을 허용하는 검색 모델로서 사용하였다. D2 도메인은 보이지 않았으며, 이는 결정 격자의 가요성 때문일 수 있다.
[00261] 4차 IL-23 수용체 복합체는 IL-23이 IL-23R 및 IL-12Rβ1을 응집시키고 세포 내부에서 JAK1/Tyk2 트랜스-포스포릴화를 개시하기 위한 브릿지로서 역할을 하는 모듈식 아키텍처를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 1b 내지 도 1e). IL-12p40 및 IL-12Rβ1 접촉의 요약은 하기 표 3에 제공된다.
표 3: PISA로부터의 IL-12p40 및 IL-12Rβ1 접촉. 약어는 하기와 같음: vdw, 반 데르 발스; hb, 수소 결합; sc, 측쇄; mc 주쇄.
Figure pct00003
[00262] 공유된 수용체인 IL-12Rβ1은 D1 N-말단 Ig와 D2 피브로넥틴 도메인 IL-12p40 사이의 교차점에서 IL-12p40의 "후면"에 결합한다(도 1d). IL-12p40의 D1 도메인은 D2 도메인에 대해 앞으로 기울어져, D1의 베이스와 D2의 상부 사이에 틈(cleft)을 노출시켜 IL-12Rβ1에 대한 도킹 부위를 형성한다. IL-12Rβ1의 D1 도메인은 상호작용하는 단백질들 사이의 높은 정도의 전하 상보성을 특징으로 하는 단일, 1425 Å2 계면에서 IL-12p40에 결합한다. 계면의 염기는 Glu28, Asp58 및 Asp101로 구성된 IL-12Rβ1에서 음으로 하전된 패치와 상호작용하는 IL-12p40(His216, Lys217 및 Lys219)에서 연속적인 양으로 하전된 루프에 의해 형성된다. 이러한 전하-전하 상호작용 위에, IL-12p40에서 측쇄 및 주쇄 원자와 수소 결합 상호작용을 만드는 IL-12Rβ1(Glu102, Ser106, Tyr109, Gln132 및 Tyr134)의 극성 잔기에 의해 고리화된 방향족 잔기, Tryp37 및 Phe82에 의해 형성된 IL-12p40 상의 소수성 스트립 IL-12p40이 있다.
실시예 3
IL-12p40은 IL-12 및 IL-23 신호전달의 공통 조절자로서 작용함
[00263] 이러한 실시예는 IL-12p40이 IL-12 및 IL-23 신호전달의 공통 조절자로서 작용한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험을 설명한다.
[00264] 상기 실시예 2에 기재된 IL-23 수용체 복합체 결정 구조는 IL-12p40이 IL-12Rβ1에 직접 관여함을 나타내었고, 이는 IL-12p40이 IL-12 및 IL-23 신호전달에서 보존된 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 이는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합 측정에 의해 확인되었으며, 이러한 측정은 IL-12Rβ1이 IL-12p40에 1.7 μM의 친화성으로 결합한다는 것을 보여준다(도 2a). IL-12 및 IL-23 신호전달의 차이를 조사하기 위해, IL-12 또는 IL-23으로 인간 CD4+ T 세포를 자극할 뿐만 아니라 포스포-유세포계수법에 의해 STAT3 및 STAT4의 포스포릴화를 측정하기 위해 여러 실험이 설계되고 수행되었다. IL-12 자극은 우선적으로 STAT4의 포스포릴화를 초래한 반면, IL-23은 STAT3 포스포릴화를 더욱 강력하게 촉진시키는 것으로 관찰되었다(도 2b 및 도 2c).
[00265] 상기 논의된 바와 같이 IL-12 및 IL-23 수용체 복합체 둘 모두에서 IL-12p40/IL-12Rβ1 상호작용의 공유된 역할에 기초하여, IL-12Rβ1 동원의 효율을 '조정'함으로써, IL-12의 맥락에서 STAT4 신호전달 및 IL-23의 맥락에서 STAT3 신호전달의 수준을 조절하기 위해 이러한 계면을 표적화하기 위해 추가 실험을 설계하고 수행하였다. 특히, IL-12 및 IL-23 부분 작용제의 패널은 IL-12Rβ1과의 상호작용을 매개하는 IL-12p40 D1의 2개의 루프에 알라닌 치환을 도입함으로써 생성되었다(도 2d). 이러한 실험에서, 개별 알라닌 돌연변이(E81A 및 F82A)는 pSTAT4 및 pSTAT3에 대한 용량-반응 곡선의 우측 이동에 의해 지시되는 바와 같이 IL-12 및 IL-23의 역가를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 2e 및 도 2f). 이러한 실험에서, 다수의 알라닌 돌연변이를 조합함으로써 사이토카인 EC50의 더 큰 증가 및 감소된 최대 STAT 포스포릴화가 획득되었다(4xAla: P39A/D30A/E81A/F82A).
[00266] IL-12Rβ1에 관여하는 IL-12p40 아미노산 위치의 전체 목록은 도 2g에 도시되어 있고, 추가적인 알라닌 돌연변이의 IL-12 신호전달은 도 2h에 도시되어 있다.
실시예 4
IL-12 부분 작용제는 차등 IL-12Rβ1 발현에 기반하여 세포-타입 특이적 활성을 유도한다
[00267] 이 실시예는 IL-12 부분 작용제가 차등적인 IL-12Rβ1 발현에 기반하여 세포-타입 특이적 활성을 유도한다는 것을 입증하기 위해 뮤린 IL-12로 수행된 실험으로부터의 결과를 설명한다.
[00268] 상기 논의된 바와 같이, IL-12의 전신 투여는 종종 NK 세포 매개된 IFNγ 생산으로 인한 독성을 초래한다. 따라서, T 세포를 우선적으로 활성화시키기 위해 IL-12 신호를 편향시키지만, 감소된 NK 세포 IFNγ 유도는 독성을 감소시킬 수 있다. T 세포와 NK 세포 사이의 IL-12 신호전달의 중요한 차이점은 T 세포 수용체를 통한 항원 자극이 이의 수용체 서브유닛의 상향조절을 통해 IL-12 감수성을 향상시킨다는 것이다. IL-12Rβ1 표면 발현을 평가하기 위해 FACS 염색 시약으로서 IL-12p40을 사용하여, 뮤린 CD8+ T 세포 모세포가 NK 세포 또는 생체외 CD8+ T 세포보다 더 높은 IL-12Rβ1 발현을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 3a).
[00269] 구조가 나타난 바와 같이, IL-12p40은 IL-12Rβ1의 동원을 매개한다. 따라서, 임의의 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, IL-12Rβ1에 대한 IL-12p40의 친화성을 감소시키는 것은 항원 경험 T 세포에 비해 IL-12Rβ1 발현의 수준이 감소된 NK 세포에 대한 신호전달을 더욱 심각하게 손상시킬 수 있는 것으로 가정되었다. 인간 IL-12p40과의 서열 상동성에 기반하여 IL-12Rβ1에 대한 결합을 방해할 것으로 예측되는 뮤린 IL-12p40에서 일련의 부분 작용제 알라닌 돌연변이를 설계하기 위해 추가 실험을 설계하고 수행하였다(도 3b). 마우스 IL-12 변이체를 특성화하기 위해, CD8+ T 세포 모세포에 대한 신호전달을 시험하기 위한 실험을 수행하였다. 예측된 바와 같이, IL-12Rβ1 결합 계면에서 IL-12p40의 돌연변이는 EC50을 증가시키고 (3x 알라닌) 및 (4x 알라닌) 돌연변이체에 의한 감소된 최대 STAT4 포스포릴화가 이러한 급성 신호전달 검정에서 측정 가능한 STAT4 포스포릴화를 유도하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 3c).
[00270] T 세포 및 NK 세포 둘 모두에서 IL-12 신호전달의 잘 문서화된 출력은 IFNγ의 유도이다. 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 IFNγ 생산을 촉진하는 IL-12 부분 작용제의 능력을 결정하기 위해, 세포내 사이토카인 염색에 의해 IFNγ 생산을 평가하기 전에 48시간 동안 OVA 펩타이드 및 IL-12 변이체로 난백 알부민 특이적 OT-I T 세포를 자극하기 위한 추가 실험을 수행하였다(Hogquist et al., 1994). 2x, 3x, 및 4x 알라닌 변이체와 함께 IL-12는 3xAla 및 4xAla 돌연변이체가 급성 자극시 측정 가능한 STAT4 포스포릴화를 생성하지 않는다는 사실에도 불구하고 IFNγ의 상향조절을 초래한다(도 4a). 이러한 불일치는 감도의 차이 또는 검정 사이의 신호 통합에 대한 더 긴 시간 때문일 수 있다.
[00271] NK 세포에서 IFNγ 생산을 자극하는 IL-12 변이체의 능력을 평가하기 위해, 세포내 사이토카인 염색에 의한 IFNγ 유도의 분석 전에 48시간 동안 IL-18의 존재 하에 IL-12 변이체로 세포를 자극하기 위해 추가 실험을 수행하였다. IL-12 및 IL-18 자극은 세포내 사이토카인 염색 및 상청액 ELISA에 의해 측정시 (2xAla) 돌연변이체에서 약독화되고 3xAla 및 4xAla 변이체에서 폐지된 반응인 강력한 IFNγ 발현을 유도하였다(예를 들어, 도 4b 참조). 따라서, IL-12는 CD8+ T 세포 및 NK 세포 둘 모두에서 강력한 IFNγ 발현을 유도하지만, (3xAla) 및 (4xAla) 부분 작용제는 NK 세포에 대해 감소된 활성을 갖는 항원 경험 CD8+ T 세포에서 IFNγ 유도를 우선적으로 지지한다(도 4c 및 도 6a). 이러한 결과는 활성화된 CD8+ T 세포가 증가된 IL-12Rβ1 표면 발현으로 인해 IL-12p40의 돌연변이에 더 관대하며, 이는 NK 세포 매개 독성을 줄이기 위해 IL-12 신호전달의 세포 유형 특이성을 변경하는 새로운 메커니즘을 나타낼 수 있음을 시사한다. IL-12에 반응하기 위해 TCR을 통한 자극을 필요로 하는 T 세포와 달리, NK 세포는 IL-1 패밀리 사이토카인 IL-18과 조합하여 IL-12에 반응하여 IFNγ를 생산한다(도 6b). IL-12 및 IL-18 자극은 세포내 사이토카인 염색(도 4b, 6c, 및 6d) 및 상청액 ELISA(도 6e)에 의해 측정된 바와 같이 3xAla 및 4xAla 변이체에 의해 감쇠된 반응인 강력한 IFNγ 발현을 유도하였다. 이러한 결과는 더 큰 패널의 IL-12 부분 작용제로 확인되고 확장되었다(도 4d 내지 4g).
[00272] IL-12 IL-18은 또한 8h 자극 후 전사체 수준에서 lfng의 상향조절을 촉진시켰는데, 이는 3xAla/IL-18 자극에 의해 감소된 효과였다(도 6f); 그러나, 이러한 조건하에서, IL-12에 의한 Tigit의 유도는 관찰되지 않았다(도 6g). 이전에, γc 패밀리 사이토카인 IL-2 및 IL-15는 NK 세포의 활성을 조절하고 IL-12 수용체 성분의 상향조절을 초래하는 것으로 나타났다. 이러한 보고와 일치하게, IL-2에 의한 NK 세포의 사전-활성화가 IL-12Rβ1의 약간의 상향조절을 초래한다는 것을 입증하기 위해 추가 실험을 수행하였다(도 6h). NK 세포 배양물에 IL-2의 첨가는 IL-18 단독보다 IFNγ 생산을 증가시켰다. 그러나, IL-2는 IL-2/IL-18 초과로 IFNγ 유도를 향상시키기 위해 3xAla 및 4xAla와 상승작용을 일으키지 않는 것으로 관찰되었다(도 6i).
[00273] 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 IL-12Rβ1 발현 및 IFNγ 생산을 평가하기 위해 추가 실험을 수행하였고, 이는 인간 IL-12 부분 작용제가 세포-타입-특이적 반응을 유발할 수 있는 지를 결정하는 데 도움이 되었다. 도 7a 내지 도 7d에 요약된 바와 같이, 마우스에서의 발견과 유사하게, TCR 자극은 CD8+ T 세포에서 비활성화된 T 세포 및 NK 세포의 발현보다 IL-12Rβ1 발현을 향상시키는 것으로 관찰되었다(도 7a 및 7b). 이러한 실험에서, 유사한 IL-12 뮤테인이 생성되었고, CD8+ T 세포 모세포에서 pSTAT4 신호전달에 대해 시험되었다(도 7c-7d 및 7e). 인간 IL-12 부분 작용제는 NK 세포에 비해 CD8+ T 세포에 의한 IFNγ의 유도를 우선적으로 지지하는 것으로 관찰되었다(도 7c-7d, 7f-7g). 이러한 발견은 IL-12Rβ1의 상향조절이 IL-12 신호전달에 대한 민감성을 향상시키기 위해 T 세포에 의해 사용되는 보존된 메커니즘이며, IL-12 부분 작용제가 인간 및 마우스 둘 모두에서 T 세포에 대한 신호전달을 편향시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5
IL-12 부분 작용제는 항원-특이적 종양 사멸을 촉진한다
[00274] 이 실시예는 IL-12 부분 작용제가 항원-특이적 종양 사멸을 촉진한다는 것을 입증하기 위해 수행된 실험으로부터의 결과를 설명한다.
[00275] CD8+ T 세포에서, IL-12는 종양 및 바이러스 감염된 세포의 항원-특이적 사멸을 강화시키는 작용을 한다(Schurich et al., 2013). IL-12의 효과는 그랜자임 B와 같은 세포독성 인자의 상향조절, 및 IFNγ를 포함하는 염증성 사이토카인의 분비에 의해 매개된다(Aste-Amezaga et al., 1994). 종양 세포 사멸에서 IFNγ의 잘 설명된 역할은 MHC-I의 상향조절이며, 이는 형질전환된 세포를 T 세포 감시에 민감하게 할 수 있다(Zhou, 2009). IL-12 유도된 IFNγ가 종양 세포주에서 MHC-1의 상향조절을 유도하는지 결정하기 위해, IL-12 부분 작용제의 존재 또는 부재하에 생성된 OT-I 이펙터로부터의 상청액을 수확한 다음 B16F10 뮤린 흑색종 세포주에 첨가하고 밤새 인큐베이션 후 항체 염색에 의한 MHC-I 표면 발현을 평가하였다. 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정된 상승된 수준의 IFNγ와 일치하여, IL-12로부터의 상청액 및 부분 작용제 배양물은 IL-12의 부재 하에 생성된 상청액보다 MHC-1 발현을 더 강력하게 유도하였다(도 5a).
[00276] IL-12 부분 작용제가 종양 세포주에서 IFNγ 생산 및 후속 MHC-1의 상향조절을 촉진한다는 본원에 기재된 발견은 종양 세포 사멸을 강화시키는 IL-12 부분 작용제의 능력의 추가 조사를 초래하였다. 항원-특이적 CD8+ T 세포 사멸을 측정하기 위해, B16F10 세포를 GFP 마커(OVA-GFP)와 함께 난백 알부민을 함유하는 플라스미드로 형질도입하고 이들을 야생형 B16F10 세포와 혼합하였다. 이 혼합물을 OT-I 이펙터와 함께 인큐베이션하고, OVA-GFP 발현 세포의 빈도를 사용하여 항원-특이적 종양 세포 사멸을 측정하였다(도 5b). IL-12 또는 부분 작용제의 존재 하에 생성된 OT-I 이펙터는 더 낮은 이펙터 세포 대 표적 세포 비율로 OVA 발현 종양 세포를 사멸시킬 수 있었고, 이는 항종양 반응의 증가된 역가를 나타낸다(도 5c). 함께, 이러한 데이터는 IL-12Rβ1에 대해 감소된 친화성을 갖는 IL-12 부분 작용제가 NK 세포에 대한 감소된 활성을 갖는 항원-특이적 CD8+ T 세포에 의한 종양 세포 사멸 및 IFNγ 생산을 촉진한다는 것을 나타낸다.
실시예 6
IL-12 부분 작용제는 생체내 감소된 NK 세포 활성화와 함께 항원-특이적 T 세포 반응을 지지한다
[00277] IL-12 부분 작용제가 생체내에서 세포-타입 특이적 반응을 유도하는지 여부를 시험하기 위해, OT-I CD8+ T 세포를 Thy1.1 동족 수용체로 입양하고 불완전 프로이트 애주번트(OVA-IFA)에서 OVA(257-264)로 면역화시킨 후, 5일 동안 매일 사이토카인을 투여하였다(도 9a). 생체내 연구를 위해, IL-12 및 부분 작용제가 포유동물 세포에서 발현되었다(Expi293F). 이어서, 포유동물-발현된 IL-12 부분 작용제는 이전에 사용된 바큘로바이러스-발현된 물질에 대해 볼 수 있는 바와 같이 시험관내에서 세포-타입 편견을 유지하는 것으로 확인되었다(도 8a 내지 도 8e).
[00278] IL-12로의 처리는 2xAla 및 3xAla가 아닌 처리가 혈청에서 체중 감소 및 상승된 수준의 IFNγ를 유도하는 것으로 관찰되었다(도 9b 및 도 9c). T 세포 활성화에 대한 면역화의 영향을 평가하기 위해, OT-I T 세포에 대한 억제 수용체 PD-1의 발현을 모니터링하였다. 면역화는 사이토카인 처리와 무관하게 PD-1+ OT-I T 세포의 빈도를 증가시켰는데, 이는 입양으로 전이된 세포의 활성화를 나타낸다(도 9d 내지 도 9e). 면역화의 효과는 배액 림프절에서 OT-I T 세포의 빈도를 증가시키는 IL-12에 의해 강화되었으며, 이는 부분 작용제에서는 볼 수 없는 효과이다(도 9f). NK 세포 내에서, 부분적 작용제가 아닌 IL-12는 억제 수용체, LAG-3의 발현에 의해 측정된 바와 같이 활성화된 NK 세포의 집단을 증가시켰다(도 9g).
[00279] 이전에 IL-2Rα 사슬인 CD25는 활성화된 T 세포 및 NK 세포의 마커로서 기술되었다. IL-12는 OT-I T 세포 및 NK 세포 둘 모두에서 CD25 발현을 강력하게 상향조절한 반면, 2xAla 및 3xAla 부분 작용제는 NK 세포에서 발현을 증가시키지 않으면서 OT-I T 세포에서 CD25의 중간 상향조절을 초래하였다(도 9h 내지 도 9j). 흥미롭게도, 2xAla 변이체는 시험관내에서 3xAla 변이체만큼 유의한 T/NK 세포 편향을 나타내지 않은 것으로 관찰되었으며(도 8e 내지 도 8f), 이는 생체내에서 3xAla에 대해 비교적 강한 T/NK 세포 편향을 나타내며, 이는 치료학적 윈도우가 시험관내 대 생체내에서 정량적으로 상이할 가능성이 있음을 강조한다. 이러한 결과는 IL-12 부분 작용제가 생체내에서 감소된 NK 세포 자극 및 독성을 갖는 중간 수준의 T 세포 활성화를 지지한다는 것을 나타낸다.
실시예 7
IL-12 부분 작용제는 IL-12에 비해 감소된 독성으로 항종양 면역을 지원한다
[00280] 시험관내 특성화 및 생체내 세포 프로파일링에 기초하여, IL-12 부분 작용제는 항원-특이적 T 세포 쪽으로 및 NK 세포로부터 멀리 IL-12의 활성을 편향시킴으로써 전신 독성 없이 항-종양 T 세포 면역을 지원할 수 있다고 결론지었다. 생체내에서 치료적 이점을 제공하는 IL-12 부분 작용제의 능력을 결정하기 위해, IL-12에 반응성인 것으로 밝혀진 결장 선암종 MC-38을 사용하여 종양에 대해 추가 실험을 수행하였다. 이러한 실험에서, 마우스에 7일 동안 매일 사이토카인 치료를 개시하기 전에 1주 동안 MC-38을 이식하였다(도 10a). 1 ㎍ 또는 30 ㎍의 일일 IL-12 투여는 체중 감소(도 10b), 상승된 혈청 IFNγ(도 10c) 및 감소된 이동성(도 10d)에 의해 측정된 바와 같이 심각한 독성을 초래하였다. 30 ㎍의 IL-12가 투여된 모든 마우스는 13일 내지 15일 사이에 치명적인 독성에 굴복하는 것으로 관찰되었다. 결과적으로, 16일에 이들 마우스의 이동성은 수행되지 않았다. 대조적으로, 2xAla 및 3xAla 부분 작용제는 잘 용인되었고 종양-보유 마우스에서 독성을 유도하지 않았다.
[00281] IL-12 및 부분 작용제 둘 모두가 PBS로의 처리에 비해 종양 성장 및 연장된 생존을 약화시키는 것으로 추가로 관찰되었다(도 10e 내지 도 10h). 그러나, 2xAla 및 3xAla 부분 작용제는 IL-12 투여로 관찰된 전신 독성을 유도하지 않았다. 이러한 결과는 IL-12Rβ1 공유 계면의 구조에 기반하여 설계된 편향된 작용제가 NK 세포 활성화로부터 T 세포를 단리시키는 능력을 갖고, IL-12 다발성을 유의하게 감소시킨다는 가설에 대한 추가적인 생체내 지지를 제공한다.
[00282] 본 개시의 특정 대안이 개시되었지만, 다양한 변형 및 조합이 가능하고 첨부된 청구범위의 진정한 사상 및 범위 내에서 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에 제시된 정확한 개요 및 개시내용을 제한하려는 의도는 없다.
참고문헌
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Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 325 330 335 <210> 22 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> mouse IL-12p40 variant E81A/F82A/K106N <400> 22 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Asn Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 325 330 335 <210> 23 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> mouse IL-12p40 variant E81A/F82A/K106Q <400> 23 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Gln Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 325 330 335 <210> 24 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> mouse IL-12p40 variant E81A/F82A/K106T <400> 24 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Thr Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 325 330 335 <210> 25 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <223> mouse IL-12p40 variant E81A/F82A/K106R <400> 25 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Arg Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val 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Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala 165 170 175 Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala 180 185 190 Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg 195 200 205 Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu 210 215 220 Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp 225 230 235 240 Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln 245 250 255 Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr 260 265 270 Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala 275 280 285 Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro 290 295 300 Cys Ser 305 <210> 27 <211> 313 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Mature wild-type murine IL-12p40 <400> 27 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn 210 215 220 Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro 225 230 235 240 His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys 245 250 255 Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val 275 280 285 Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp 290 295 300 Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 305 310

Claims (77)

  1. 재조합 폴리펩타이드로서,
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 인터류킨 12 서브유닛 p40(IL-12p40) 폴리펩타이드와 하나 이상의 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
    SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 1의 X37, X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 알라닌(A) 치환, 아르기닌(R) 치환, 아스파라긴(N) 치환, 아스파르트산(D) 치환, 류신(L) 치환, 리신(K) 치환, 페닐알라닌(F) 치환, 리신 치환, 글루타민(Q) 치환, 글루탐산(E) 치환, 세린(S) 치환, 및 트레오닌(T) 치환으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 1의 W37, P39, D40, E81, F82, K106, K217, 및 K219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드:
    a) W37A;
    b) P39A;
    c) D40A;
    d) E81A;
    e) F82A;
    f) K106;
    g) D109A;
    h) K217A;
    i) K219A;
    j) E81A/F82A;
    k) W37A/E81A/F82A;
    l) E81A/F82A/K106A;
    m) E81A/F82A/K106A/K219A;
    n) E81A/F82A/K106A/K217A;
    o) 81A/F82A/K106A/E108A/D115A;
    p) E81F/F82A;
    q) E81K/F82A;
    r) E81L/F82A;
    s) E81H/F82A;
    t) E81S/F82A;
    u) E81A/F82A/K106N;
    v) E81A/F82A/K106Q;
    w) E81A/F82A/K106T;
    x) E81A/F82A/K106R; 또는
    (y) P39A/D40A/E81A/F82A.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 3 내지 8 및 13 내지 16으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  8. 재조합 폴리펩타이드로서,
    SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 인터류킨 12 서브유닛 p40(IL-12p40) 폴리펩타이드와 하나 이상의 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
    SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X41, X80, X81, X82, X106, X108, X115, X216, X217, X218, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 2의 X37, X39, X40, X81, X82, X106, X217, 및 X219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 알라닌(A) 치환, 아르기닌(R) 치환, 아스파라긴(N) 치환, 아스파르트산(D) 치환, 류신(L) 치환, 리신(K) 치환, 페닐알라닌(F) 치환, 리신 치환, 글루타민(Q) 치환, 글루탐산(E) 치환, 세린(S) 치환, 및 트레오닌(T) 치환으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 재조합 폴리펩타이드.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 2의 W37, P39, D40, A41, K80, E81, F82, K106, E108, D115, H216, K217, L218, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 SEQ ID NO: 2의 P39, D40, E81, F82, K106, K217, 및 E219로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 있는, 재조합 폴리펩타이드.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2와 하나 이상의 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 하기 아미노산 치환에 상응하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 재조합 폴리펩타이드:
    a) W37A;
    b) P39A;
    c) D40A;
    d) E81A;
    e) F82A;
    f) K106;
    g) D109A;
    h) K217A;
    i) E219A;
    j) E81A/F82A;
    k) W37A/E81A/F82A;
    l) E81A/F82A/K106A;
    m) E81A/F82A/K106A/K217A;
    n) E81F/F82A;
    o) E81K/F82A;
    p) E81L/F82A;
    q) E81H/F82A;
    r) E81S/F82A;
    s) E81A/F82A/K106N;
    t) E81A/F82A/K106Q;
    u) E81A/F82A/K106T;
    v) E81A/F82A/K106R; 또는
    w) P39A/D40A/E81A/F82A.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 9 내지 11 및 17 내지 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 인터루킨-12 수용체, 서브유닛 베타 1(IL-12Rβ1)에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
  16. 제15항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 IL-12Rβ1에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정한 경우, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가, 인터루킨 12 서브유닛 p35(IL-12p35) 폴리펩타이드와 조합될 때, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 감소된 STAT4 신호전달(signaling)을 자극하는 능력을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가, 인터루킨 23 서브유닛 p19(IL-23p19) 폴리펩타이드와 조합될 때, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 감소된 STAT3 신호전달을 자극하는 능력을 갖는, 재조합 폴리펩타이드.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, STAT3 신호전달 및/또는 STAT4 신호전달이 유전자 발현 검정, 포스포-플로우 신호전달 검정, 및 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성된 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정되는, 재조합 폴리펩타이드.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 인터루킨-12(IL-12) 및/또는 인터루킨-23(IL-23)을 통해 매개된 다운스트림 신호 전달(signal transduction)의 세포-타입 편향된 신호전달을 발생시키는, 재조합 폴리펩타이드.
  22. 제21항에 있어서, 세포-타입 편향된 신호전달이 자연 살해(NK) 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 세포-타입 편향된 신호전달이 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 실질적으로 변경되지 않은 능력을 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 이의 능력을 실질적으로 유지하면서 NK 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 능력을 감소시키는, 재조합 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  26. 제25항에 있어서, 핵산 서열이 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 핵산 분자.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 핵산 분자가 발현 카세트 또는 발현 벡터로서 추가로 규정되는, 핵산 분자.
  28. 재조합 세포로서,
    a) 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드; 및/또는
    b) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산을 포함하는, 재조합 세포.
  29. 제28항에 있어서, 재조합 세포가 진핵 세포인, 재조합 세포.
  30. 제29항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포인, 재조합 세포.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 재조합 세포 및 배양 배지를 포함하는, 세포 배양물.
  32. 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
    a) 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 하나 이상의 재조합 세포를 제공하는 단계; 및
    b) 세포가 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 제조하도록 배양 배지에서 하나 이상의 상기 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제조된 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 반감기를 증가시키기 위해 제조된 폴리펩타이드를 구조적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 변형이 인간 Fc 항체 단편에 대한 융합, 알부민에 대한 융합, 및 PEG화로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변경을 포함하는, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 재조합 폴리펩타이드.
  37. 약학적 조성물로서,
    a) 제1항 내지 제24항 및 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드;
    b) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및/또는
    c) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 조성물이 제1항 내지 제24항 및 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 조성물이 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  40. 대상체에서 IL-12-매개 신호 전달을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이 대상체에게
    a) 제1항 내지 제24항 및 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드;
    b) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및/또는
    d) 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 대상체에게 IL-12p35 폴리펩타이드, 또는 IL-12p35 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 대상체에서 IL-23-매개 신호 전달을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이 대상체에게
    a) 제1항 내지 제24항 및 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드;
    b) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및/또는
    d) 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체에게 IL-12p35 폴리펩타이드, 또는 IL-23p19 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 대상체에게
    a) 제1항 내지 제24항 및 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 IL-12p40 폴리펩타이드;
    b) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및/또는
    d) 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 대상체에게
    a) IL-12p35 폴리펩타이드;
    b) IL-23p19 폴리펩타이드; 및/또는
    c) 상기 (a) 또는 (b)를 인코딩하는 핵산을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 인터루킨-12 수용체, 베타 1(IL-12Rβ1)에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는, 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리펩타이드가, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정한 경우, 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드의 결합 친화성과 비교하여 약 10% 내지 약 100%만큼 감소된 IL-12Rβ1에 대한 결합 친화성을 갖는, 방법.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 IL-12Rβ1 수용체에 대한 재조합 폴리펩타이드의 결합 친화성이 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 STAT4-매개 신호전달의 감소를 초래하는, 방법.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 감소된 IL-12Rβ1 수용체에 대한 재조합 폴리펩타이드의 결합 친화성이 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 STAT3-매개 신호전달의 감소를 초래하는, 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, STAT3 신호전달 및/또는 STAT4 신호전달이 유전자 발현 검정, 포스포-플로우 신호전달 검정, 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 구성된 군으로부터 선택된 검정에 의해 결정되는, 방법.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 조성물이 하나 이상의 아미노산 치환이 결여된 기준 폴리펩타이드와 비교하여 인터루킨-12(IL-12) 및/또는 인터루킨-23(IL-23)에 의해 매개된 다운스트림 신호 전달의 세포-타입 편향된 신호전달을 발생시키는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 세포-타입 편향된 신호전달이 NK 세포에서 IL-12-매개 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 감소된 능력을 포함하는 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 세포-타입 편향된 신호전달이 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 실질적으로 변경되지 않은 능력을 포함하는, 방법.
  55. 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 조성물이 CD8+ T 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 이의 능력을 실질적으로 유지하면서 NK 세포에서 IL-12 신호전달을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 능력을 감소시키는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 투여된 조성물이 CD8+ T 세포에서 인터페론 감마(INFγ)의 발현을 자극하는 재조합 폴리펩타이드의 능력을 실질적으로 유지하는, 방법.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 조성물이 종양 미세환경에서 항종양 면역을 향상시키는, 방법.
  58. 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 포유동물이 인간인, 방법.
  60. 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 IL-12p40 매개 신호전달과 관련된 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, IL-12p40 매개 신호전달이 IL-12 매개 신호전달 또는 IL-23 매개 신호전달인, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 병태가 암, 면역 질환, 또는 만성 감염인, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 면역 질환이 자가면역 질환인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스 관절염, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 용혈성 빈혈, 류마티스 열, 갑상선염, 크론병, 중증 근무력증, 사구체신염, 자가면역 간염, 다발성 경화증, 원형 탈모증, 건선, 백반증, 이영양증 표피박리증, 전신 홍반성 루푸스, 중등도 내지 중증 판상 건선, 건선성 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 및 이식편 대 숙주 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  65. 제62항에 있어서, 병태가 급성 골수종 백혈병, 역형성 림프종, 성상세포종, B-세포암, 유방암, 결장암, 뇌실막종, 식도암, 교모세포종, 신경아교종, 평활근육종, 지방육종, 간암, 폐암, 외투 세포 림프종, 흑색종, 신경모세포종, 비-소세포 폐암, 희소돌기아교종, 난소암, 췌장암, 말초 T-세포 림프종, 신장암, 육종, 위암, 암종, 중피종, 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택된 암인, 방법.
  66. 제40항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 제1 요법으로서 개별적으로 또는 제2 요법과 조합하여 대상체에게 투여되는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 제2 요법이 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 또는 수술로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 제1 요법 및 제2 요법이 동시에 투여되는, 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 요법이 제2 요법과 병용 투여되는, 방법.
  70. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 요법 및 제2 요법이 순차적으로 투여되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 제1 요법이 제2 요법 전에 투여되는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 제1 요법이 제2 요법 후에 투여되는, 방법.
  73. 제70항에 있어서, 제1 요법이 제2 요법 전 및/또는 후에 투여되는, 방법.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 요법 및 제2 요법이 교대로 투여되는, 방법.
  75. 제66항 또는 제67항에 있어서, 제1 요법 및 제2 요법이 단일 제형으로 함께 투여되는, 방법.
  76. IL-12p40 매개 신호 전달을 조절하거나, IL-12p40-매개 신호 전달을 조절하거나, 이를 필요로 하는 대상체에서 병태를 치료하기 위한 키트로서, 시스템이,
    a) 제1항 내지 제24항 및 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드;
    b) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및/또는
    d) 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물; 및
    제40항 내지 제75항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  77. IL-12-p40 매개 신호 전달에서의 섭동과 관련된 건강 상태와 관련된 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 하기의 용도:
    a) 제1항 내지 제24항 및 제36항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리펩타이드;
    b) 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산;
    c) 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포; 및/또는
    d) 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물.
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