KR20230003283A - 소분자 표적을 확인하기 위한 고처리량 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 그의 돌연변이를 통해 제약상 유용한 소분자의 발견에 대한 정보를 알아낼 수 있는 것인 단백질 결합 파트너 쌍을 확인하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 방법을 통해 특정 질환 표적, 특히 오랫동안 약물화가 불가능한(undruggable) 것으로 간주되어 왔던 표적을 단백질 수준에서 조정하기 위해 천연 단백질 분해 시스템을 적합화시킬 수 있다.
Description
관련 출원
본 출원은 2020년 5월 11일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 63/023,181을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
배경
약리학적 개입을 위해 세포 내 생물학적 프로세스를 표적화하는 것이 약물 발견의 중심 목표이다. 특정 표적 단백질에 대한 억제 약물을 확인하는 프로세스는 표적에 대한 높은 친화도, 표적 효과에 대한 높은 효능 및 선택성, 및 독성 및 의도하지 않은 부정확한 효과는 최소화하면서, 원하는 약리학적 효과를 지속시키기 위해 의도된 조직에서 충분히 높은 약물 농도를 유지하는 용량 확인이라는 요구 사항을 충족하여야 한다. 소분자는 원형질막을 통과할 수 있고, 광범위한 조직 및 작용 부위에 접근할 수 있으며, 다중 표적에 대해 동시에 영향을 줄 수 있고, 대규모로 경제적으로 생산될 수 있는 능력이 있기 때문에 세포내 표적의 조정을 위해 관심의 대상이 되는 후보물질이다.
유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (UPS)은 진핵생물 종 간에 고도로 보존되는 내인성 세포내 단백질 분해 시스템이다. E3 유비퀴틴 리가제에 의한 표적 단백질의 다중유비퀴틴화는 표적 단백질 기질을 단백질 분해에 의해 분해하는 다단위 원통형 구조인 프로테아좀에 의한 후속 파괴를 위한 표적 단백질을 결정한다. 이러한 고도로 조절된 단백질 분해 시스템은 세포 항상성에 중요하며, 다양한 질병 상태에서 중단될 수 있다. 특정 질환 표적을 단백질 수준에서 조정하기 위해 이 천연 단백질 분해 시스템을 공동으로 선택하는 것이 현행 연구의 활발하게 진행되는 분야이고, 특히 오랫동안 "약물화가 불가능한(undruggable)" 것으로 간주되어 왔던 표적에 대해 큰 치료적 잠재력을 가지고 있다.
E3 유비퀴틴 리가제에 의한 유비퀴틴 분자의 표적 단백질인 기질로의 전달은 기질 인식 및 근접성 모두에 의해 매개된다. 기본 맥락에서 수개의 상이한 기질 인식 기전이 존재하며, 그 대부분은 E3 유비퀴틴 리가제에 의해 인식되고, 리가제와 표적 단백질 기질 사이의 상호작용을 매개하는 표적 단백질 상에 데그론-짧은 아미노산 서열 또는 화학적 모티프를 포함한다. 표적 단백질 N-말단의 N-데그론은 단백질분해 절단에 의해 밝혀지고, E3 유비퀴틴 리가제에 의한 인식을 매개할 수 있다. 포스포데그론은 표적 단백질의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기의 인산화에 의해 그의 활성 및 인식되는 형태로 전환된다. 유비퀴틴 리가제는 리가제-기질 결합 부위 내의 안정화에 기인하여 기질의 인산화된 버전만 인식할 수 있으며, 인산화되지 않은 기질은 인식되지 못한다. 추가로, 기질의 산소, 소분자 또는 구조적 모티프도 데그론 인식에 영향을 줄 수 있다.
이전 연구에서는 표적 단백질과 상호작용하는 것으로 알려진 소분자가 E3 유비퀴틴 리가제와 상호작용하는 것으로 알려진 에피토프에 연결될 수 있고, 이를 통해 표적 단백질과 E3 유비퀴틴 리가제 사이의 근접 기반 상호작용을 매개함으로써 표적 단백질의 세포 분해를 일으킬 수 있다는 것이 입증되었다. 소위 "단백질분해-표적화 키메라"라고 하는 것, 또는 PROTAC는 E3 유비퀴틴 리가제와 분해 표적 사이의 삼원 복합체의 인공적인 안정화가 표적의 성공적인 분해를 초래한다는 것을 입증하였다. PROTAC는 링커에 의해 연결된 두 소분자로 구성된다. 그러나, 대부분의 PROTAC은 상대적으로 높은 분자량, 물리화학적 특성 및 제약상 특성으로 인해 소분자 약물의 후보물질로서는 적합하지 않다.
최근, 한 부류의 소분자가 E3 유비퀴틴 리가제와 그의 표적 단백질 기질 사이의 상호작용을 매개하거나, 또는 유도하는 것으로 밝혀졌다. 레날리도마이드 및 포말리도마이드를 비롯한, 탈리도마이드 유사체는 E3 유비퀴틴 리가제 CRL4CRBN에 결합하고, 놀라운 다양성과 선택성으로 이카로스(Ikaros) (IKZF1), 아이올로스(Aiolos), 및 CK1α를 비롯한 다양한 표적의 분해를 유도한다. 이러한 발견은 그 중에서도 특히 예컨대, E3 유비퀴틴 리가제와 신규 표적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용에 효능작용할 수 있는 소분자를 확인하고, 치료 표적을 확인할 수 있는 기회를 조명하였다. 예를 들어, 소분자는 전통적인 소분자 억제제에 면역성을 나타내는 약물화가 불가능한 단백질의 UPS 매개 분해를 화학적으로 유도하도록 확인되거나 디자인될 수 있다.
본원에 개시된 본 방법은 기존의 단백질-단백질 상호작용 스크리닝 접근법, 예컨대, 파지 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 포함한다. 첫째, 본원에 개시된 방법을 통해 라이브러리별 스크리닝, 즉, 한 복수의 잠재적인 단백질 결합 파트너와 또 다른 복수의 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용을 대량으로 고처리량 방식으로 조사할 수 있다. 파지 및 효모 표면 디스플레이 기술은 기존 형광성 리포터의 스펙트럼 분해능에 기인하여 제한된 개수의 표적에 대한 결합에 대해서만 동시에 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 상기 기술은 한 번에 오직 소수의 E3 유비퀴틴 리가제의 표적에 대한 스크리닝으로 제한된다. 본원에 개시된 방법을 통해 단일 검정법에서 한 번에 다수의 E3 유비퀴틴 리가제의 다수의 변이체의 표적에 대해 스크리닝할 수 있다.
둘째, 본원에 개시된 방법은 매우 미세한 분해능 수준에서 상호작용 강도의 정량적 결과를 제공한다. 기존 접근법은 연구원에 의해 확립된 특정 임계값을 초과하는 강한 상호작용만을 검출하는 것으로 제한될 수 있으며, 이러한 강한 상호작용으로만 강화될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 예를 들어, 제2 단백질 결합 파트너의 부위 포화 돌연변이유발 (SSM) 라이브러리에 대한 한 단백질 결합 파트너의 부위 포화 돌연변이유발 (SSM) 라이브러리의 스크린 동안 잠재적인 단백질 결합 파트너의 변이체 간의 결합 친화도의 미묘한 조정을 검출할 수 있다. 다른 스크리닝 플랫폼에 의해서는 검출되지 않았을 결합 계면에서의 돌연변이의 적당한 정량적 효과는 본원에 개시된 방법에 의해 검출될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 방법은 예를 들어, E3 유비퀴틴 리가제에 대한 신규한 기질과 같은, 표적화 단백질에 대한 잠재적으로 신규한 기질을 검출하고, 확인하는 데 특히 매우 적합하다. E3 유비퀴틴 리가제와 이전에 알려지지 않은 기질 사이의 상호작용은 소분자 발견 및 디자인을 위한 관심의 대상이 되는 후보물질을 나타낸다.
마지막으로, 본원에 개시된 방법은 처리량이 높고, 신속하며, 비용면에서 효율적이다. 본원에 개시된 방법에 의해 가능하게 된 광범위한 라이브러리별 연구에서 모든 단백질 결합 파트너는 효모 세포에 의해 유전적으로 코딩되고, 생산된다. 재조합 단백질의 비싸고, 힘든 발현 및 정제는 요구되지 않는다. 수천 개의 잠재적 상호작용이 단일 검정법에서 신속하고, 저렴하게 스크리닝된다.
따라서, 상기에서 논의된 이유에서, 이들의 상호작용이 소분자에 의한 조정에 적합화될 수 있는 것인 단백질 결합 파트너 쌍, 예컨대, E3 유비퀴틴 리가제 및 그의 표적 단백질 기질을 발견하기 위한 합리적인 고처리량 방법이 요구되고 있다. 상기 한 쌍의 단백질 결합 파트너가 발견된 후, 단백질-단백질 계면의 결정 구조를 기반으로 한, 고처리량 소분자 스크리닝 캠페인 또는 합리적인 약물 디자인이 이루어졌다. 본원에 개시된 방법은 상기 필요를 충족시켜준다.
요약
일부 실시양태에서, 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포의 표면 상에 발현 및 디스플레이된 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종을 제공하는 단계로서, 여기서, 제1 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종은 야생형 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종, 및 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 돌연변이체 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종의 라이브러리를 포함하는 것인 단계; 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포의 표면 상에 발현 및 디스플레이된 복수의 폴리펩티드 기질 종을 제공하는 단계로서, 여기서, 복수의 폴리펩티드 기질 종은 야생형 폴리펩티드 기질 종, 및 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 돌연변이체 폴리펩티드 기질 종의 라이브러리를 포함하는 것인 단계; 액체 배지 중에서 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포 및 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포를 합하여 배양물을 제조하는 단계; 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나 이상과 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 이상 사이의 하나 이상의 상호작용이 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포 중 하나 이상과 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포 중 하나 이상 사이의 하나 이상의 메이팅 이벤트를 매개하도록 하는 시간 동안 및 그러한 조건하에서 배양물을 성장시켜 하나 이상의 이배체 효모 세포를 제조하는 단계; 배양물 중의 메이팅 이벤트수에 기초하여 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나 이상과 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 이상 사이의 상호작용의 강도를 결정하는 단계; 및 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나 및 폴리펩티드 기질 종 중 하나, 이 둘 중 하나 또는 그들 모두가 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형되고, 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용 강도 (K D )가 상응하는 야생형 폴리펩티드 종 사이의 상호작용보다 적어도 10%만큼 더 강하거나 또는 더 약한 것인 폴리펩티드 쌍을 확인하는 단계를 포함하는, 단백질-단백질 상호작용을 검정하는 방법을 제공한다.
추가 실시양태에서, 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 상호작용 강도 (K D )는 상응하는 야생형 폴리펩티드 종 사이의 상호작용보다 적어도 25%만큼 더 강하거나 또는 더 약하다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종은 E3 유비퀴틴 리가제 종이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리펩티드 기질 종은 알려진 또는 예측되는 데그론 모티프를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 복수의 폴리펩티드 중 하나 이상은 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형되어 폴리펩티드의 도메인에 입체 벌크를 도입할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 방법은 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 계면 구조를 결정하기 위해 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 계면을 컴퓨터를 사용하여 모델링하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 성장시키는 단계는 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 존재하에 배양물을 성장시키는 것을 추가로 포함한다.
추가의 다른 실시양태에서, 확인하는 단계는 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 존재하에서의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 상호작용 강도 (K D)가 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 부재하에서의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 상호작용보다 적어도 10%만큼 더 강하거나 또는 더 약한 것인 폴리펩티드 쌍을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종은 야생형 유비퀴틴 리가제 종이고, 복수의 폴리펩티드 기질 종은 야생형 폴리펩티드 기질 종이다. 다른 실시양태에서, 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나와 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 사이의 상호작용은 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물의 존재하에서 검출되는 반면, 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 부재하에서는 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나와 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 사이의 상호작용이 검출되지 않는다.
다른 실시양태에서, 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포의 표면 상에 발현 및 디스플레이된 복수의 제1 단백질 결합 파트너를 제공하는 단계로서, 여기서, 복수의 제1 단백질 결합 파트너는 야생형 폴리펩티드 종, 및 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 돌연변이체 폴리펩티드 종의 라이브러리를 포함하는 것인 단계; 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포의 표면 상에 발현 및 디스플레이된 복수의 제1 단백질 결합 파트너를 제공하는 단계로서, 여기서, 복수의 제2 단백질 결합 파트너는 야생형 폴리펩티드 종, 및 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 돌연변이체 폴리펩티드 종의 라이브러리를 포함하는 것인 단계; 액체 배지 중에서 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포 및 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포를 합하여 배양물을 제조하는 단계; 복수의 제1 단백질 결합 파트너 중 하나 이상과 복수의 제2 단백질 결합 파트너 중 하나 이상 사이의 하나 이상의 상호작용이 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포 중 하나 이상과 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포 중 하나 이상 사이의 하나 이상의 메이팅 이벤트를 매개하도록 하는 시간 동안 및 그러한 조건하에서 배양물을 성장시켜 하나 이상의 이배체 효모 세포를 제조하는 단계; 배양물 중의 메이팅 이벤트수에 기초하여 복수의 제1 단백질 결합 파트너 중 하나 이상과 복수의 제2 단백질 결합 파트너 중 하나 이상 사이의 상호작용의 강도를 결정하는 단계; 제1 단백질 결합 파트너 중 하나 및 제2 단백질 결합 파트너 중 하나, 이 둘 중 하나 또는 그들 모두가 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형되고, 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용 강도 (K D )가 상응하는 야생형 폴리펩티드 종 사이의 상호작용보다 적어도 10%만큼 더 강하거나 또는 더 약한 것인 폴리펩티드 쌍을 확인하는 단계를 포함하는, 단백질-단백질 상호작용을 검정하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 통합되고, 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 하나 이상의 실시양태를 예시하고, 설명과 함께 이들 실시양태를 설명한다. 첨부 도면은 반드시 축척에 맞게 도시될 필요는 없다. 첨부된 그래프 및 도면에 예시된 값 치수는 단지 예시 목적인 것이며, 실제 또는 바람직한 값 또는 치수를 나타내거나, 나타내지 않을 수 있다. 해당되는 경우, 기본 특징에 대한 설명을 돕기 위해 일부 또는 모든 특징이 설명되지 않을 수 있다. 도면에서:
도 1은 본원에 개시된 방법의 라이브러리별 스크리닝 용량 및 해상도를 보여주는 일련의 차트를 도시한 것이다.
도 2a는 두 단백질 결합 파트너 사이의 계면 및 두 단백질 결합 파트너의 부위 포화 돌연변이유발 (SSM) 스크린을 강조하는, 복합체로 상호작용하는 두 단백질 결합 파트너의 개략도이다.
도 2b는 두 단백질 결합 파트너의 SSM 라이브러리 사이의 상호작용의 라이브러리별 스크린에 대하여 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 상대적인 강도 데이터를 나타내는 히트맵이다.
도 3a는 도 2b의 히트맵에 제시된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트에 대한 정량적 상호작용 데이터를 그래프로 나타낸 것이고, 야생형 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하고, 돌연변이체 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하지만, 제1 또는 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체는 나머지 다른 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지 않는다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 3b는 도 2b의 히트맵에 제시된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트에 대한 정량적 상호작용 데이터를 그래프로 나타낸 것이고, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지만, 야생형 제1 단백질 결합 파트너는 돌연변이체 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이가 야생형 제1 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 3c는 도 2b의 히트맵에 제시된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트에 대한 정량적 상호작용 데이터를 그래프로 나타낸 것이고, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 형태와 상호작용하지만, 돌연변이체 제1 단백질 결합 파트너는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 4는 본원에 개시된 방법을 사용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다.
도 5는 본원에 개시된 방법을 사용한 후보 소분자의 존재하에서의 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다.
도 6a는 공지된 소분자 효능제가 두 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용에 미치는 효과를 검출할 수 있는 본원에 개시된 방법의 능력을 도시한 것이다.
도 6b는 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바와 같은, 라파마이신 및 그의 유사체가 FKBP12와 FRB 도메인 사이의 상호작용에 미치는 효능작용 효과를 도시한 플롯이다.
도 7a는 CRBN과 IKZF1 사이의 상호작용을 매개하는, 탈리도마이드, 또는 그의 유사체를 도시한 개략도이다.
도 7b는 돌연변이체 CRBN이 아닌, 야생형 CRBN과 IKZF1의 상호작용에 대하여 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드가 미치는 효능작용 효과를 강조한 차트이다.
도 8은 기능적 소분자 스크리닝을 위한 후보물질을 나타낼 수 있는 단백질 결합 파트너에서 추정 "홀"을 확인하기 위한 본원에 개시된 방법에 따른 프로세스를 도시한 개략도이다.
도 9는 본원에 개시된 방법에 따른 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 스크린을 도시한 개략도이다.
도 10은 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 스크린을 도시한 개략도이다.
도 11은 본원에 개시된 방법의 워크플로우를 도시한 흐름도이다.
도 12는 본원에 개시된 방법을 사용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이며, 여기서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 1 초과의 구성원은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제이고, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 1 초과의 구성원은 폴리펩티드 표적 기질이다.
도 13은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시한 것이다.
도 14a는 더 큰 해상도로 단백질 결합 파트너 사이의 특정 상호작용의 강도를 강조하는 도 13의 히트맵의 확대된 섹션을 도시한 것이다.
도 14b는 추가로 더욱 상세하게 설명하기 위해 확대된 도 14a의 히트맵의 섹션, 및 소분자 화합물을 포함하는 추가 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 15는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 KEAP1과 폴리펩티드 표적 기질 Nrf2 사이의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시한 것이다.
도 16은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시하고, E3 유비퀴틴 리가제 KEAP1 및 SPSB2에 대한 신규한 기질을 확인시켜 주는 것이다.
도 17a는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 세레블론(cereblon) (CRBN)의 변이체의 라이브러리와 그의 폴리펩티드 표적 기질 이카로스 (IKZF1)의 변이체의 라이브러리 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시한 것이다.
도 17b는 도 17a의 히트맵에 제시된 결합 친화도 데이터의 서브세트의 플롯이다.
도 18은 CRBN 및 IKZF1의 야생형 및 돌연변이체 변이체의 결합 계면을 강조하는, CRBN과 IKZF1 사이의 결합 계면의 구조적 모델을 도시한 것이다.
도 1은 본원에 개시된 방법의 라이브러리별 스크리닝 용량 및 해상도를 보여주는 일련의 차트를 도시한 것이다.
도 2a는 두 단백질 결합 파트너 사이의 계면 및 두 단백질 결합 파트너의 부위 포화 돌연변이유발 (SSM) 스크린을 강조하는, 복합체로 상호작용하는 두 단백질 결합 파트너의 개략도이다.
도 2b는 두 단백질 결합 파트너의 SSM 라이브러리 사이의 상호작용의 라이브러리별 스크린에 대하여 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 상대적인 강도 데이터를 나타내는 히트맵이다.
도 3a는 도 2b의 히트맵에 제시된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트에 대한 정량적 상호작용 데이터를 그래프로 나타낸 것이고, 야생형 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하고, 돌연변이체 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하지만, 제1 또는 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체는 나머지 다른 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지 않는다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 3b는 도 2b의 히트맵에 제시된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트에 대한 정량적 상호작용 데이터를 그래프로 나타낸 것이고, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지만, 야생형 제1 단백질 결합 파트너는 돌연변이체 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이가 야생형 제1 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 3c는 도 2b의 히트맵에 제시된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트에 대한 정량적 상호작용 데이터를 그래프로 나타낸 것이고, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 형태와 상호작용하지만, 돌연변이체 제1 단백질 결합 파트너는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 4는 본원에 개시된 방법을 사용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다.
도 5는 본원에 개시된 방법을 사용한 후보 소분자의 존재하에서의 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다.
도 6a는 공지된 소분자 효능제가 두 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용에 미치는 효과를 검출할 수 있는 본원에 개시된 방법의 능력을 도시한 것이다.
도 6b는 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바와 같은, 라파마이신 및 그의 유사체가 FKBP12와 FRB 도메인 사이의 상호작용에 미치는 효능작용 효과를 도시한 플롯이다.
도 7a는 CRBN과 IKZF1 사이의 상호작용을 매개하는, 탈리도마이드, 또는 그의 유사체를 도시한 개략도이다.
도 7b는 돌연변이체 CRBN이 아닌, 야생형 CRBN과 IKZF1의 상호작용에 대하여 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드가 미치는 효능작용 효과를 강조한 차트이다.
도 8은 기능적 소분자 스크리닝을 위한 후보물질을 나타낼 수 있는 단백질 결합 파트너에서 추정 "홀"을 확인하기 위한 본원에 개시된 방법에 따른 프로세스를 도시한 개략도이다.
도 9는 본원에 개시된 방법에 따른 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 스크린을 도시한 개략도이다.
도 10은 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 스크린을 도시한 개략도이다.
도 11은 본원에 개시된 방법의 워크플로우를 도시한 흐름도이다.
도 12는 본원에 개시된 방법을 사용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이며, 여기서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 1 초과의 구성원은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제이고, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 1 초과의 구성원은 폴리펩티드 표적 기질이다.
도 13은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시한 것이다.
도 14a는 더 큰 해상도로 단백질 결합 파트너 사이의 특정 상호작용의 강도를 강조하는 도 13의 히트맵의 확대된 섹션을 도시한 것이다.
도 14b는 추가로 더욱 상세하게 설명하기 위해 확대된 도 14a의 히트맵의 섹션, 및 소분자 화합물을 포함하는 추가 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 15는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 KEAP1과 폴리펩티드 표적 기질 Nrf2 사이의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시한 것이다.
도 16은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시하고, E3 유비퀴틴 리가제 KEAP1 및 SPSB2에 대한 신규한 기질을 확인시켜 주는 것이다.
도 17a는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 세레블론(cereblon) (CRBN)의 변이체의 라이브러리와 그의 폴리펩티드 표적 기질 이카로스 (IKZF1)의 변이체의 라이브러리 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 정량적 결합 친화도 데이터의 히트맵을 도시한 것이다.
도 17b는 도 17a의 히트맵에 제시된 결합 친화도 데이터의 서브세트의 플롯이다.
도 18은 CRBN 및 IKZF1의 야생형 및 돌연변이체 변이체의 결합 계면을 강조하는, CRBN과 IKZF1 사이의 결합 계면의 구조적 모델을 도시한 것이다.
첨부된 도면과 관련하여 하기 기재되는 설명은 개시된 주제의 다양한 예시적인 실시양태를 설명하기 위한 것으로 의도된다. 특정 특징 및 기능은 각각의 예시적인 실시양태와 관련하여 설명되지만; 개시된 실시양태는 각각의 특정 특징 및 기능 없이도 실시될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
명세서 전체에 걸쳐 "한 실시양태"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 기술된 특정 특징, 구조 또는 특성이 개시된 주제의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 명세서 전체에 걸쳐 다양한 곳에서 "한 실시양태에서" 또는 "한 실시양태에서"라는 어구의 출현은 반드시 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 추가로, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 추가로, 개시된 주제의 실시양태는 그 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"라는 단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 즉, 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "하나"라는 단어 등은 "하나 이상"의 의미를 가진다. 추가로, 본원에서 사용될 수 있는 "좌측," "우측," "상단," "하단," "전면," "후면," "측면," "높이," "길이," "너비," 본원에서 사용될 수 있는 "상부," "하부," "내장," "외장," "내부," "외부" 등은 단지 참조점을 설명하는 것이며, 본 개시내용의 실시양태를 임의의 특정 배향 또는 구조로 반드시 제한하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 추가로, 예컨대, "제1," "제2," "제3" 등과 같은 용어는 단지 본원에 개시된 바와 같은 다수의 부분, 구성요소, 단계, 작동, 기능 및/또는 참조점 중 하나를 식별할 뿐이며, 마찬가지로 본 개시내용의 실시양태를 임의의 특정 구조 또는 배향으로 반드시 제한하는 것은 아니다.
추가로, "대략," "약," "근접한," "작은 변동"이라는 용어 및 유사한 용어는 일반적으로 20%, 10% 또는 바람직하게는 5% 범위 내에서, 및 특정 실시양태에서, 그 사이의 임의의 값 범위 내에서 확인되는 값을 포함하는 범위를 지칭한다.
한 실시양태와 관련하여 기술된 모든 기능은 분명하게 언급된 경우 또는 특징 또는 기능이 추가 실시양태와 양립하지 않는 경우를 제외하면, 하기 기술되는 추가의 실시양태에 적용가능한 것으로 의도된다. 예를 들어, 주어진 특징 또는 기능이 한 실시양태와 관련하여 분명하게 기술되었지만, 대안적 실시양태와 관련해서는 분명하게 언급되지 않은 경우, 본 발명자들은 그 특징 또는 기능이 대안적 실시양태와 양립한다면, 특징 또는 기능이 대안적 실시양태와 관련하여 전개, 활용 또는 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 설명된 기술의 실행은 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있는, 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 세포 생물학, 세포 배양, 생화학 및 시퀀싱 기술에 대한 통상적인 기술 및 설명을 사용할 수 있다. 상기 통상적인 기술로는 박테리아, 진균 및 포유동물 세포 배양 기술 및 스크리닝 분석을 포함한다. 적합한 기술의 구체적인 예시는 본원 실시예를 참조할 수 있다. 그러나, 다른 등가의 통상적인 방법도 물론 사용될 수 있다. 이러한 통상적인 기술 및 설명은 예컨대, 문헌 [Green, et al., Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)]; [Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual]; [Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), PCR Primer: A Laboratory Manual]; [Bowtell and Sambrook (2003), DNA Microarrays : A Molecular Cloning Manual]; [Mount (2004), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis]; [Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual]; 및 [Sambrook and Russell (2002), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.]; [Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London]; [Nelson and Cox (2000), Lehninger , Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.]; [Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.] (상기 문헌들은 모두 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다)와 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 살펴볼 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌은 기술된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 방법, 및 세포 집단을 기술하고, 개시하기 위한 목적으로 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "상보적"이라는 용어는 뉴클레오티드 간의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 지칭하며, 구체적으로, 뉴클레오티드가 서로 수소 결합된 것으로, 여기서, 티민 또는 우라실 잔기는 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 연결되고, 시토신 및 구아닌 잔기는 3개의 수소 결합에 의해 연결된다. 일반적으로, 핵산은 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 "상보성(%)" "상동성(%)"을 갖는 것으로 기술된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 80%, 90% 또는 100% 상보성을 가질 수 있으며, 이는 서열의 10개 중 8개, 10개 중 9개 또는 10개 중 10개의 뉴클레오티드가 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이라는 것을 나타낸다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-AGCT-3'에 대해 100% 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-TTAGCTGG-3'의 영역에 100% 상보적이다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이, 또는 보다 흔히는 본 개시내용의 맥락에서는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 용어 "상동성 영역" 또는 "상동성 아암"은 표적 게놈 DNA 서열과 특정 정도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 상의 영역을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 이때 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 간의 상동성 정도는 서열이 공유되는 매칭되거나, 또는 상동성인 위치의 개수의 함수이다.
"작동가능하게 연결된"은 요소, 예를 들어, 바코드 서열, 유전자 발현 카세트, 코딩 서열, 프로모터, 인핸서, 전사 인자 결합 부위의 배열로서, 여기서, 상기 기술된 구성요소는 그들의 통상적인 기능을 수행하도록 구성된 것을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 전사, 및 일부 경우에는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 코딩 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지 않지만 전사되는 개입 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 그대로 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 실제로, 상기 서열은 동일한 인접 DNA 분자 (즉, 염색체)에 상주할 필요가 없으며, 변경된 조절을 초래하는 상호작용을 여전히 그대로 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "선별가능한 마커"는 인공 선택에 적합한 형질을 부여하는 세포 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 일반적인 용도의 선별가능한 마커는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예컨대, 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, 블라스티시딘 및 G418과 같은 약물 선별가능한 마커가 사용될 수 있다. 선별가능한 마커는 또한 영양요구성 선별가능한 마커일 수도 있으며, 여기서, 선별되는 세포 균주는 필수 영양소를 합성할 수 없도록 하는 돌연변이를 보유한다. 그러한 균주는 결핍된 필수 영양소가 성장 배지에 공급되는 경우에만 성장할 것이다. 예를 들어, 효모 돌연변이체 균주의 필수 아미노산 영양요구성 선별은 일반적이고, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 바, "선별 배지"는 선별가능한 마커에 대해 선별하거나, 이에 대해 선별하는 화학적 화합물 또는 생물학적 모이어티가 첨가된 세포 성장 배지 또는 필수 영양소가 결핍되고, 영양요구성 균주에 대해 선별되는 배지를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "벡터"는 세포로 전달하고/거나, 세포에서 발현시키고자 하는 원하는 서열 또는 서열들을 포함하는 다양한 핵산 중 임의의 것이다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 이용가능하다. 벡터는 그 중에서도 특히 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈, BAC, YAC, PAC, 합성 염색체 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "친화도"는 단일 생체분자와 그의 리간드 또는 결합 파트너 사이의 결합 상호작용의 강도이다. 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수, K D 를 사용하여 측정되고 설명된다. K D 값이 낮을수록 단백질과 그의 결합 파트너 사이의 친화도가 크다. 친화도는 수소 결합, 정전기 상호작용, 결합 파트너 간의 소수성 및 반 데르 발스 힘, 또는 다른 분자, 예컨대, 결합 효능제 또는 길항제의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "부위 포화 돌연변이유발" (SSM)은 단백질 공학 및 분자 생물학에서 사용되는 무작위 돌연변이유발 기술을 지칭하며, 여기서, 코돈 또는 코돈 세트는 폴리펩티드의 위치에 있는 모든 가능한 아미노산으로 치환된다. SSM은 하나의 코돈, 여러 코돈 또는 단백질의 모든 위치에 대해 수행될 수 있다. 그 결과는 폴리펩티드의 하나, 여러 또는 모든 아미노산 위치에서 가능한 아미노산의 전체 상보체를 나타내는 돌연변이체 단백질 라이브러리이다. 일부 구현에서, 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 부위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 상이한 아미노산 잔기로 변이되어 변이체 폴리펩티드 서열의 라이브러리를 생성할 있다.
본원에서 사용되는 바, "표적화 단백질"은 제2 단백질 결합 파트너에 작용하는 제1 단백질 결합 파트너를 지칭한다. "표적 단백질"은 제1 단백질 결합 파트너에 의해 작용받는 제2 단백질 결합 파트너를 지칭한다. 일부 구현에서, 표적화 단백질은 E3 유비퀴틴 리가제일 수 있고, 표적 단백질은 E3 유비퀴틴 리가제의 정규 기질일 수 있다. 다른 구현에서, 표적 단백질은 E3 유비퀴틴 리가제의 신규, 이전에 특징화되지 않았거나, 또는 추정되는 기질일 수 있다. 다른 구현에서, 표적 단백질은 알려진 또는 예측되는 데그론 모티프를 함유하는 펩티드일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "표적화 단백질" 및 "표적 단백질"은 각각 전장의 단백질, 말단절단된 단백질, 고처리량 올리고뉴클레오티드 코딩된 폴리펩티드, 말단절단된 폴리펩티드 모티프, 또는 알려진 또는 예측되는 데그론 모티프를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "표적화 단백질" 및 "표적 단백질"은 길이가 1-50, 50-100, 100-500, 500-1000, 또는 1000개 초과의 아미노산 잔기 길이인 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 구현에서, 본 방법은 제1 단백질 결합 파트너, 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 포함한다. 제1 단백질 결합 파트너는 표적화 단백질일 수 있다. 다른 구현에서, 제1 단백질 결합 파트너는 예를 들어, E3 유비퀴틴 리가제일 수 있다. 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 예를 들어, 폴리펩티드 기질 종을 포함할 수 있다. 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리는 예를 들어, 이전에 공지된 전장의 맵핑된 E3 유비퀴틴 리가제 기질 도메인; 고처리량 올리고 코딩가능한 말단절단된 E3 유비퀴틴 리가제 기질; 부위 포화 돌연변이유발에 의해 변형된 E3 유비퀴틴 리가제 기질 종; 이전에 정의된 데그론 모티프; 또는 컴퓨터를 사용하여 예측된 데그론 모티프를 추가로 포함할 수 있다. 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 표적 단백질의 복수의 사용자 지정 돌연변이체 및 야생형 표적 단백질을 포함할 수 있다. 표적 단백질의 복수의 사용자 지정 돌연변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 표적 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 표적 단백질에 입체 벌크를 도입하도록 선택될 수 있고, 야생형 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환은 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 제1 단백질 결합 파트너, 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 결합 친화도에 대해 검정되고, 이로써, 친화도는 제1 단백질 결합 파트너와, 복수의 사용자 지정 돌연변이체의 각 돌연변이체와 개별적으로 그들 사이의 상호작용에 대하여 병렬화된 고처리량 방식으로 측정된다. 야생형 표적 단백질과 제1 단백질 결합 파트너의 결합 친화도보다 더 높은 제1 단백질 결합 파트너와의 결합 친화도를 갖는 것으로 나타난 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 구성원을 확인하고, 추가 연구를 위해 선택한다.
제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리가 결합 친화도에 대해 검정되는 일부 구현에서, 검정법은 파지 디스플레이, 효모 표면 디스플레이, 또는 또 다른 병렬화된 고처리량 방법일 수 있다.
다른 구현에서, 본 방법은 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 포함한다. 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 예를 들어, 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 종을 포함할 수 있다. 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리는 예를 들어, 맵핑된 도메인이 있는 전장의 E3 유비퀴틴 리가제; 고처리량 사용자 디자인된 또는 무작위로 생성된 올리고 코딩가능한 말단절단된 E3 유비퀴틴 리가제 도메인; 또는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 변형된 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 종을 추가로 포함할 수 있다. 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 표적화 단백질의 복수의 사용자 지정 돌연변이체 및 야생형 표적화 단백질을 포함할 수 있다. 표적화 단백질의 복수의 사용자 지정 돌연변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 표적화 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 표적화 단백질에 입체 벌크를 도입하도록 선택될 수 있고, 야생형 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환은 인산화 또는 다른 번역 후 변형을 모방하도록 선택될 수 있다. 아미노산 치환은 표적화, 무작위, 또는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 예를 들어, 폴리펩티드 기질 종을 포함할 수 있다. 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리는 예를 들어, 이전에 공지된 전장의 맵핑된 E3 유비퀴틴 리가제 기질 도메인; 고처리량 올리고 코딩가능한 말단절단된 E3 유비퀴틴 리가제 기질; 돌연변이유발에 의해 변형된 E3 유비퀴틴 리가제 기질 종; 이전에 정의된 데그론 모티프; 또는 컴퓨터를 사용하여 예측된 또는 다르게는 예측된 데그론 모티프를 추가로 포함할 수 있다. 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 표적 단백질의 복수의 사용자 지정 돌연변이체 및 야생형 표적 단백질을 포함할 수 있다. 표적 단백질의 복수의 사용자 지정 돌연변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 초과의 아미노산 치환을 갖는 표적 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 표적 단백질에 입체 벌크를 도입하도록 선택될 수 있고, 야생형 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환은 인산화 또는 다른 번역 후 변형을 모방하도록 선택될 수 있다. 아미노산 치환은 표적화, 무작위, 또는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 결합 친화도에 대해 검정되고, 이로써, 친화도는 복수의 돌연변이체 제1 단백질 결합 파트너 각각 및 복수의 돌연변이체 제2 단백질 결합 파트너 각각, 그들 사이의 쌍별 상호작용에 대하여 개별적으로 병렬화된 고처리량 방식으로 측정된다. 야생형 표적화 단백질 및 야생형 표적 단백질의 결합 친화도보다 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 나타난, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리로부터 선택된 구성원 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리로부터 선택된 구성원을 포함하는 쌍을 확인하고, 추가 연구를 위해 선택한다.
일부 구현에서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리로부터 선택된 구성원 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리로부터 선택된 구성원을 포함하는 단백질-결합 파트너 쌍은 본원에 개시된 방법에 의해 야생형 표적화 단백질 및 야생형 표적 단백질의 결합 친화도보다 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된다. 단백질-결합 파트너 쌍은 돌연변이체 표적화 단백질 및 야생형 표적 단백질; 야생형 표적 단백질 및 돌연변이체 표적 단백질; 또는 돌연변이체 표적화 단백질 및 돌연변이체 표적 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 본원에 개시된 방법에 의해 야생형 표적화 단백질 및 야생형 표적 단백질의 결합 친화도보다 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된 단백질-결합 파트너 쌍은 야생형 표적화 단백질 및 야생형 표적 단백질의 결합 친화도보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 500%, 1000%, 또는 그 사이의 값만큼 더 높은 결합 친화도를 가질 수 있다. 다른 구현에서, 본원에 개시된 방법에 의해 야생형 표적화 단백질 및 야생형 표적 단백질의 결합 친화도보다 낮은 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된 단백질-결합 파트너 쌍은 야생형 표적화 단백질 및 야생형 표적 단백질의 결합 친화도보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 500%, 1000%, 또는 그 사이의 값만큼 더 낮은 결합 친화도를 가질 수 있다.
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리가 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리에 대한 결합 친화도에 대해 검정되는 일부 구현에서, 검정법은 효모 2-하이브리드 시스템, AlphaSeq 시스템, 또는 또 다른 병렬화된 고처리량 라이브러리별 스크리닝 방법일 수 있다. AlphaSeq 방법은 미국 특허 출원 일련 번호 15/407,215 (이는 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다).
일부 구현에서, 돌연변이체 표적화 단백질의 라이브러리를 구성하는 돌연변이체 종 또는 돌연변이체 표적 단백질의 라이브러리를 구성하는 돌연변이체 종은 표적화 단백질과 표적 단백질 사이의 계면에 입체 벌크를 추가하도록 선택된다. 원자 그룹이 점유하는 공간의 양을 "입체 벌크"라고 한다. 두 단백질 사이의 상호작용 표면 주위의 입체 벌크를 조정하면, 단백질 사이의 친화도에 영향을 미칠 수 있으며, 예컨대, 상호작용하는 두 단백질 중 하나 또는 나머지 다른 하나의 상호작용을 하는 표면에 벌크를 추가하면, 두 단백질 사이의 친화도는 감소될 수 있거나, 또는 두 단백질 사이의 친화도는 증가될 수 있다.
바람직한 구현에서, 입체 벌크를 도입하도록 선택된 하나 이상의 돌연변이체를 포함하는 단백질 결합 파트너 쌍의 서브세트로서, 여기서, 결합 친화도는 본원에 개시된 방법에 의하면 야생형/야생형 단백질 결합 파트너의 결합 친화도보다 높은 것으로 측정된 것은 추가로 특징화된다. 이러한 단백질 결합 파트너의 서브세트의 경우, 한 결합 파트너의 아미노산 치환에 의해 도입된 입체 벌크가 반대 결합 파트너와의 계면의 "홀"을 충전시킨다고 추론할 수 있다. 단백질-단백질 복합체는 아미노산 치환의 추가의 벌크에 의해 매개되는 홀 충전에 의해 안정화되어 단백질 결합 파트너 사이의 친화도는 증가한다. 일부 구현에서, 상기 안정화 및 친화도 증진은 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너 사이의 새로운 수소 결합에 의해 매개된다. 따라서, 단백질 결합 파트너의 상기 서브세트는 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 추정 홀을 유사하게 충전시키는 소분자의 합리적인 디자인을 위한 후보물질이 된다. 소분자는 한 결합 파트너의 표면에서 확인된 홀을 유사하게 충전시키고, 두 단백질 결합 파트너의 복합체를 안정화시켜 두 단백질 결합 파트너 사이의 친화도를 증진시키도록 확인되거나, 디자인될 수 있다.
일부 구현에서, 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 단백질 결합 파트너 쌍은 예컨대, 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 단백질-단백질 복합체 특징화 방법들 중에서 결정학법, 극저온 전자 현미경법, 미세전자 회절, 질량 분석법, 컴퓨터 모델링에 의해 추가로 특징화된다. 단백질 결합 파트너 또는 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 쌍은 개별적으로 또는 두 파트너 간의 단백질-단백질 복합체의 맥락에서 추가로 특징화될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 의해 확인된 단백질 결합 파트너의 경우, 추정 홀-충전을 재현하고, 단백질 결합 파트너 사이의 복합체를 유사하게 안정화시키는 소분자 약물 후보물질을 디자인하거나 확인하고, 기능적 효과에 대해 스크리닝할 수 있다. 소분자 디자인 또는 확인은 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 단백질 모델링 도구들 중에서 컴퓨터 모델링, 컴퓨터 예측, 표면 모델링, 공동 검출 소프트웨어 또는 컴퓨터 도구, 예컨대, Relibase, sc-PDB, Pocketome, CavBase, RAPMAD, IsoMIF, TrixP의 지원하에 이루어질 수 있다. 후보 소분자는 임의의 통상의 소분자 스크리닝 플랫폼에 의해 스크리닝될 수 있다.
일부 구현에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 전장의 단백질이다. 다른 구현에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 말단절단된 단백질이다. 다른 구현에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 융합 단백질이다. 다른 구현에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 태그부착된 단백질이다. 태그부착된 단백질은 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 걱들 중에서도 에피토프 태그부착된, 예컨대, FLAG-태그부착된, HA-태그부착된, His-태그부착된, Myc-태그부착된 단백질을 포함한다. 일부 구현에서, 제1 단백질 결합 파트너는 전장의 단백질이고, 제2 단백질 결합 파트너는 말단절단된 단백질이다. 제1 단백질 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 각각 하기: 전장의 단백질, 말단절단된 단백질, 융합 단백질, 태그부착된 단백질, 또는 그의 조합 중 임의의 것일 수 있다.
일부 구현에서, 제1 결합 파트너는 E3 유비퀴틴 리가제이다. 다른 구현에서, 제1 결합 파트너의 라이브러리는 E3 유비퀴틴 리가제의 라이브러리 또는 다른 방법 중에서 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성된 E3 유비퀴틴 리가제 돌연변이체의 라이브러리이다. E3 유비퀴틴 리가제는 MDM2, CRL4CRBN, SCFβ - TrCP, UBE3A, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다수의 다른 종을 포함한다. E3 유비퀴틴 리가제는 유비퀴틴이 로딩된 E2 유비퀴틴 접합 효소를 동원하고, 그의 표적 단백질 기질을 인식하고, 프로테아좀 복합체에 의한 후속 분해를 위해 E2에서 단백질 기질로의 유비퀴틴 분자의 전달을 촉매화한다.
일부 구현에서, 제2 결합 파트너는 데그론을 포함하는 표적 단백질이다. 다른 구현에서, 제2 결합 파트너의 라이브러리는 데그론을 포함하는 단백질의 라이브러리, 또는 다른 방법 중에서 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성된 데그론 돌연변이체를 포함하는 단백질의 라이브러리이다. 데그론은 일부 경우에서는 유비퀴틴 프로테아좀 시스템에 의해 조절된 단백질 분해를 매개하는 단백질의 일부이다. 데그론은 다른 것들 중에서도 특히 짧은 아미노산 모티프; 번역 후 변형, 예컨대, 인산화; 구조적 모티프; 당 변형을 포함할 수 있다.
제2 결합 파트너가 데그론인 일부 구현에서, 데그론은 형광 태그부착될 수 있으며, 즉, 유전적으로 코딩된 형광 태그, 예컨대, 다른 것들 중에서도 특히 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), mCherry, M Scarlet, tdTomato를 포함하는 융합 단백질로서 데그론을 발현함으로써 형광 태그부착될 수 있다.
일부 구현에서, 형광 태그부착된 데그론을 코딩하는 발현 카세트를 보유하는 핵산 벡터는 다수의 통상적인 형질감염 방법에 의해 포유동물 세포 내로 형질감염될 수 있다. 핵산 벡터는 또한 포유동물 세포에서 발현 벡터에 의해 일반적으로 전달되는 다른 특징들 중에서도 특히 하나 이상의 분자 바코드, 하나 이상의 선별가능한 마커, 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 형광 태그부착된 데그론 펩티드는 펩티드에 입체 벌크에 기여하는 아미노산 치환으로 SSM에 의해 변형된 데그론 펩티드의 라이브러리를 포함할 수 있다. 형광 태그부착된 데그론 펩티드를 코딩하는 발현 카세트로 형질감염된 포유동물 세포는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 2개 이상의 별개의 집단, 예를 들어, 높은 형광 강도를 나타내는 포유동물 세포를 포함하는 제1 집단 및 낮은 형광 강도를 나타내는 포유동물 세포를 포함하는 제2 집단으로 분류될 수 있다. 일부 구현에서, 낮은 형광 강도를 나타내는 포유동물 세포를 포함하는 집단은 형광 태그부착된 데그론 펩티드가 포유동물 세포에 존재하는 하나 이상의 E3 유비퀴틴 리가제와의 상호작용에 의해 분해된 세포를 추가로 포함한다.
일부 구현에서, 형광 태그부착된 데그론을 코딩하는 발현 카세트는 다수의 통상적인 핵산 추출 기술에 의해 낮은 형광 강도를 나타내는 포유동물 세포 집단으로부터 단리될 수 있다. 형광 태그부착된 데그론 펩티드를 코딩하는 발현 카세트는 분해된 데그론 돌연변이체를 확인하기 위해 다수의 핵산 시퀀싱 방법에 의해 시퀀싱될 수 있다.
일부 구현에서, 상기 개시된 바와 같이 NGS에 의해 확인된 돌연변이체 데그론 펩티드는 돌연변이체 데그론 단백질이 상호작용하는 하나 이상의 E3 유비퀴틴 리가제를 확인하는 펩티드 풀-다운(pull-down) 검정법에서 "미끼(bait)"로서 사용될 수 있다. 돌연변이체 데그론 펩티드 및 그와 상호작용하는 E3 유비퀴틴 리가제를 포함하는 복합체는 관련 기술분야에 널리 공지된 단백질-단백질 복합체를 특징화하는 다른 방법들 중에서도 예컨대, 결정학법, 극저온 전자 현미경법, 미세전자 회절, 질량 분석법, 또는 컴퓨터 모델링에 의해 추가로 특징화될 수 있다.
도 1은 AlphaSeq 방법의 라이브러리별 스크리닝 용량을 보여주는 일련의 차트를 도시한 것이다. 차트 (100)는 100개의 결합 파트너의 제2 라이브러리에 대한 100개의 결합 파트너의 제1 라이브러리의 상호작용을 스크리닝하고, 10,000개의 상호작용을 측정하는 것을 도시한 것이다. 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리는 예를 들어, 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 종을 포함할 수 있다. 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리는 예를 들어, 맵핑된 도메인이 있는 전장의 E3 유비퀴틴 리가제; 고처리량 사용자 디자인된 올리고 코딩가능한 말단절단된 E3 유비퀴틴 리가제 도메인; 또는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 변형된 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 종을 추가로 포함할 수 있다. 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리는 예를 들어, 폴리펩티드 기질 종을 포함할 수 있다. 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리는 예를 들어, 이전에 공지된 전장의 맵핑된 E3 유비퀴틴 리가제 기질 도메인; 고처리량 올리고 코딩가능한 말단절단된 E3 유비퀴틴 리가제 기질; 부위 포화 돌연변이유발에 의해 변형된 E3 유비퀴틴 리가제 기질 종; 이전에 정의된 데그론 모티프; 또는 컴퓨터를 사용하여 예측된 데그론 모티프를 추가로 포함할 수 있다. 차트 (102)는 1,000개의 결합 파트너의 제2 라이브러리에 대한 1,000개의 결합 파트너의 제1 라이브러리의 상호작용을 스크리닝하고, 1,000,000개의 상호작용을 측정하는 것을 도시한 것이다. 차트 (104)는 10,000개의 결합 파트너의 제2 라이브러리에 대한 10,000개의 결합 파트너의 제1 라이브러리의 상호작용을 스크리닝하고, 100,000,000개의 상호작용을 측정하는 것을 도시한 것이다. 차트 (106)는 10,000개의 상호작용에 대한 AlphaSeq 강도와 단백질-단백질 친화도 (K D ) 사이의 상관관계를 보여주는 것이다. 차트 (108)는 1,000,000개의 상호작용에 대한 AlphaSeq 강도와 단백질-단백질 친화도 (K D ) 사이의 상관관계를 보여주는 것이다. 차트 (110)는 100,000,000개의 상호작용에 대한 AlphaSeq 강도와 단백질-단백질 친화도 (K D ) 사이의 상관관계를 보여주는 것이다.
도 2a는 두 단백질 결합 파트너 사이의 계면 및 두 단백질 결합 파트너 (204) 및 (206)의 부위 포화 돌연변이유발 (SSM) 스크린을 강조하는, 복합체로 상호작용하는 두 단백질 결합 파트너의 개략도이다. 단백질 결합 파트너 (204)의 아미노산 잔기 (200)는 단백질 결합 파트너 (206)의 아미노산 잔기 (202)에 상응한다. 단백질 결합 파트너 (204)의 아미노산 잔기 (200)는 자연적으로 발생 또는 인공의 이용가능한 추가 아미노산 잔기 중 어느 하나에 의해 치환될 수 있으며, 단백질 결합 파트너 (206)의 아미노산 잔기 (202)의 치환의 유사한 라이브러리에 대한 상호작용에 대해 스크리닝될 수 있다. 상기 라이브러리별 SSM 스크린의 결과는 도 2b에 제시되어 있다. 히트맵 (208)은 단백질-단백질 계면를 정의하는 모든 아미노산 잔기에서 SSM 돌연변이를 보유하는 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용에 대한 AlphaSeq에 의한 라이브러리별 강도 측정을 도시한 것이다. 더 어두운 음영은 더 높은 AlphaSeq 강도를 나타내고, 더 밝은 음영은 더 낮은 AlphaSeq 강도를 나타낸다. 예를 들어, 삽도 (210)는 아미노산 (214) 치환의 SSM 라이브러리에 대해 측정된 아미노산 (212) 치환의 SSM 라이브러리에 대한 라이브러리별 AlphaSeq 강도를 강조 표시한 것이다.
도 3a-3c는 도 2a-2b에 제시된 데이터에 의해 검출된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트를 그래프로 나타낸 것이고, 야생형 단백질 결합 파트너와 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 상대적 친화도 및 단일 아미노산 치환이 두 단백질 결합 파트너 사이의 친화도에 미치는 효과를 검출하는 본원에 개시된 방법의 능력을 도시한 것이다. 도 3a는 야생형 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하고, 돌연변이체 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하지만, 제1 또는 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체는 나머지 다른 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지 않는다는 시나리오를 도시한 것이다. 도 3b는 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지만, 야생형 제1 단백질 결합 파트너는 돌연변이체 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이가 야생형 제1 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다. 도 3c는 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 형태와 상호작용하지만, 돌연변이체 제1 단백질 결합 파트너는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 4는 AlphaSeq를 사용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다. 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리 (400) 및 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리 (402)는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성되고, 효모에서 발현된다. 두 라이브러리 집단은 혼합되고, 단백질 결합 파트너는 상호작용 단계 (404)에서 결합한다. 상호작용한 단백질 결합 파트너를 발현하는 세포는 융합 단계 (406)에서 메이팅한다. 제1 라이브러리와 제2 라이브러리 사이의 단백질-단백질 상호작용은 측정 단계 (408)에서 검출되고, 정량화된다.
도 5는 AlphaSeq를 사용한 후보 소분자의 존재하에서의 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다. 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리 (500) 및 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리 (502)는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성되고, 효모에서 발현된다. 두 라이브러리 집단은 액체 배양물에서 혼합되고, 소분자 (503)가 배양물에 도입되고, 단백질 결합 파트너는 상호작용 단계 (504)에서 결합한다. 상호작용한 단백질 결합 파트너를 발현하는 세포는 융합 단계 (506)에서 메이팅한다. 제1 라이브러리와 제2 라이브러리 사이의 단백질-단백질 상호작용은 측정 단계 (508)에서 검출되고, 정량화된다.
도 6a 및 6b는 공지된 소분자 효능제가 두 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용에 미치는 효과를 검출할 수 있는 AlphaSeq의 능력을 입증하는 것이다. 도 6a는 프롤릴 이소머라제 FKBP12, TOR의 FRB 도메인, 및 소분자 라파마이신 및 그의 유사체 에베롤리무스 및 리다포롤리무스 사이의 공지된 해리 상수를 도시한 것이다. 이에 따라, 도 6b는 라파마이신 및 그의 유사체가 FKBP12와 FRB 도메인 사이의 상호작용에 미치는 효능작용 효과를 도시한 차트이다. 화합물 농도 증가는 메이팅 효율 증가, 및 따라서, 두 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도 증가와 상관관계를 갖는다.
도 7a 및 7b는 탈리도마이드 및 그의 유사체가 E3 유비퀴틴 리가제 세레블론 (CRBN) 및 그의 기질 이카로스 인자 1 (IKZF1) 사이의 상호작용에 미치는 공지된 효능작용 효과 검출에서의 AlphaSeq의 능력을 입증하는 것이다. 도 7a는 CRBN과 IKZF1의 상호작용을 매개하는 탈리도마이드, 또는 그의 유사체를 도시한 개략도이다. 도 7b는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 및 포말리도마이드가, 돌연변이체 CRBN이 아닌 야생형 CRBN과 IKZF1의 상호작용에 미치는 효능작용 효과를 강조한 차트이다.
도 8은 기능적 소분자 스크리닝을 위한 후보물질을 나타낼 수 있는 단백질 결합 파트너에서 추정 "홀"을 확인하기 위한 프로세스를 도시한 개략도이다. 예를 들어, 야생형 단백질 결합 파트너 (800) 및 야생형 단백질 결합 파트너 (802)는 약한 상호작용 및 낮거나, 또는 검출불가능한 친화도를 가질 수 있다. 단백질 결합 파트너 (804)는 입체 벌크 (806)에 기여하는 아미노산 치환으로 SSM에 의해 변형된 것이다. 단백질 결합 파트너 (804) 및 (810)는 매우 낮은 K D 로 극적으로 증가된 친화도를 보이며, 이는 추정 "홀" (808)의 존재를 시사하는 것이다. 추가의 입체 벌크 (806)는 "홀" (808)을 충전시키고, 단백질 결합 파트너 (804)와 (810) 사이의 삼원 복합체를 안정화시킨다. 유사하게, 소분자 (814)는 추정 홀을 충전시키고, 삼원 복합체를 안정화시키고, 단백질 결합 파트너 (812)와 (816) 사이의 친화도를 증진시키도록 확인되거나, 디자인될 수 있다.
도 9는 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 스크린을 도시한 개략도이다. 야생형 단백질 결합 파트너 (900) 및 야생형 단백질 결합 파트너 (902)는 결합 친화도를 거의 보이지 않거나, 또는 전혀 보이지 않는다. 단백질 결합 파트너 (906)는 입체 벌크 (908)에 기여하는 아미노산 치환으로 SSM에 의해 변형되었고, 각각이 추가 입체 벌크에 기여하는 상이한 아미노산 치환을 보유하는 SSM에 의해 유사하게 변형된 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 구성원이다. 상기 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 단백질 결합 파트너 (904)에 대해 스크리닝되어 결합 친화도를 검출 및 측정하고, 소분자 개발을 위해 약물화가 가능한 표적을 나타내는 추정 "홀"을 확인한다. 대안적으로, 단백질 결합 파트너 (904)는 SSM에 의해 유사하게 변형된 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 생성하기 위해 입체 벌크에 기여하는 아미노산 치환으로 SSM에 의해 변형될 수 있고, 이 라이브러리는 단백질 결합 파트너 (906)에 대해 스크리닝될 수 있다.
도 10은 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 스크린을 도시한 개략도이다. 야생형 단백질 결합 파트너 (1000) 및 야생형 단백질 결합 파트너 (1002)는 결합 친화도를 거의 보이지 않거나, 또는 전혀 보이지 않는다. 단백질 결합 파트너 (1004)는 입체 벌크 (1006)에 기여하는 아미노산 치환으로 SSM에 의해 변형되었고, 각각이 추가 입체 벌크에 기여하는 상이한 아미노산 치환을 보유하는 SSM에 의해 유사하게 변형된 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 구성원이다. 단백질 결합 파트너 (1008)는 입체 벌크 (1010)에 기여하는 아미노산 치환으로 SSM에 의해 변형되었고, 각각이 추가 입체 벌크에 기여하는 상이한 아미노산 치환을 보유하는 SSM에 의해 유사하게 변형된 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 구성원이다. 돌연변이체 단백질 결합 파트너 (1004)를 포함하는 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 돌연변이체 단백질 결합 파트너 (1008)를 포함하는 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 라이브러리에 대해 스크리닝되어 결합 친화도를 검출 및 측정하고, 소분자 개발을 위해 약물화가 가능한 표적을 나타내는 추정 "홀"을 확인한다.
도 11은 본원에 개시된 방법의 워크플로우를 도시한 흐름도이다. 본원에 개시된 방법에 따른 단계 (1100)에서, 단백질 결합 파트너 중 하나 또는 그 둘 모두가 입체 벌크를 도입하도록 돌연변이화되고, 야생형 단백질 결합 파트너 대비 증가된 친화도로 결합하는 단백질 결합 파트너 쌍을 확인한다. 단계 (1102)에서, 돌연변이체 단백질 결합 파트너를 예를 들어, 결정학법에 의해 추가로 특징화하여 그의 구조를 복합체로서 또는 개별적으로 결정한다. 단계 (1104)에서, 생성된 구조를 컴퓨터를 사용하여 그의 야생형 아미노산 서열로 복원시킨다. 단계 (1100)에서 확인된 돌연변이체와 그의 각 야생형 구조를 비교함으로써 추정 "홀"의 구조를 나타낸다. 단계 (1106)에서, 추정 홀의 구조를 컴퓨터에 의한 소분자 디자인에 사용한다.
도 12는 AlphaSeq를 사용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이며, 여기서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 1 초과의 구성원은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제이고, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 1 초과의 구성원은 폴리펩티드 표적 기질이다. E3 유비퀴틴 리가제의 제1 라이브러리 (1200) 및 폴리펩티드 표적 기질의 제2 라이브러리 (1202)는 돌연변이유발에 의해 생성되고 효모에서 발현된다. 두 라이브러리 집단을 혼합하고, 상호작용 단계 (1204)에서 단백질 결합 파트너는 결합한다. 상호작용한 단백질 결합 파트너를 발현하는 세포는 융합 단계 (1206)에서 메이팅한다. 제1 라이브러리와 제2 라이브러리 사이의 단백질-단백질 상호작용은 측정 단계 (1208)에서 검출되고, 정량화된다.
도 13은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 (1302)와 폴리펩티드 표적 기질 (1304) 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 AlphaSeq 데이터의 히트맵 (1306)을 도시한 것이며, 여기서, 스케일 바 (1300)에 따라 더 어두운 음영은 상대적으로 더 강한 상호작용을 나타내고, 더 밝은 음영은 상대적으로 더 약한 상호작용을 나타낸다. 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 (1302)의 라이브러리의 개별 구성원은 그리드의 수직 축으로 제시되어 있고, 폴리펩티드 표적 기질 (1304) 라이브러리의 개별 구성원은 그리드의 수평 축으로 제시되어 있다. 히트맵의 음영 처리된 박스는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 (1302)의 라이브러리의 단일 구성원과 폴리펩티드 표적 기질 (1304)의 라이브러리의 단일 구성원 사이의 상호작용 강도를 나타낸다.
도 14a는 더 큰 해상도로 단백질 결합 파트너 사이의 특정 상호작용의 강도를 강조하는 히트맵 (1306)의 확대된 섹션 (1400)을 도시한 것이고, 여기서, 박스 (1408)는 더 자세히 조사하기 위해 선택되었다. E3 유비퀴틴 리가제 MDM2는 특징이 잘 규명되어 있고, 수백 개의 폴리펩티드 표적 기질과 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 다양한 말단절단된 MDM2 E3 유비퀴틴 리가제의 라이브러리 및 공지된 MDM2 표적 기질의 서브세트의 라이브러리를 사용하여 AlphaSeq 검정법을 수행하였다. 말단절단된 MDM2 E3 유비퀴틴 리가제의 라이브러리는 히트맵 (1400)의 수직 축 (1404)으로 표시되어 있고, 공지된 MDM2 표적 기질의 라이브러리는 히트맵 (1400)의 수평 축 (1402)으로 표시되어 있다. 예를 들어, 박스 (1406) 부근의 박스에서 더 어두운 음영은 다양한 말단절단된 MDM2 E3 유비퀴틴 리가제의 라이브러리의 개별 구성원과 공지된 MDM2 표적 기질의 서브세트의 라이브러리 사이의 상대적으로 더 강한 상호작용을 나타낸다.
도 14b는 추가로 더욱 상세하게 설명하기 위해 확대된 히트맵 (1400)의 섹션, 및 소분자 화합물을 포함하는 추가 실험의 결과를 도시한 것이다. 히트맵 (1410)은 도 14a에 도시된 사각형 표시 (1406) 부근의 히트맵 (1400)으로부터의 사각형으로 표시된 서브세트를 도시한 것이다. E3 유비퀴틴 리가제 MDM2와 폴리펩티드 표적 기질 p53 사이의 상호작용은 널리 공지되어 있으며, 완전히 특징화되어 있다. 히트맵 (1410)은 E3 유비퀴틴 리가제 MDM2의 다양한 말단절단물 (MDM2 t1; MDM2 t2; MDM2 t3)과 폴리펩티드 표적 기질 p53의 다양한 말단절단물 (p53 t1; p53 t2; p53 t3; p53 t4) 사이의 쌍별 상호작용의 상대적 강도를 나타낸다. 개별 MDM2 말단절단물과 개별 p53 말단절단물 사이의 정규 상호작용은 문헌에 보고된 바와 같이 특정 말단절단된 형태 사이에서만 발생하며, 이는 AlphaSeq 검정법이 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용 강도를 강건하게 검출하고, 정량화한다는 것을 입증하는 것이다. 추가로, 히트맵 (1412)은 MDM2와 p53 사이의 상호작용을 억제시키는 것으로 공지된 시스-이미다졸린 유사체인 2개의 소분자 화합물인 뉴트린의 존재 및 부재하에서 각각의 여러 MDM2 말단절단물과 p53 말단절단물 사이의 쌍별 상호작용의 상대적 강도를 측정하는 추가 실험이다. 예를 들어, 박스 (1414)는 뉴트린 부재하의 MDM2 t2와 p53 t1 사이의 강한 상호작용을 나타낸다. 박스 (1416)는 뉴트린이 상호작용을 파괴시키는 것에 기인한, 뉴트린 존재하의 MDM2 t2와 p53 t1 사이의 상대적으로 약한 상호작용을 나타낸다. 본 실험은 AlphaSeq 검정법이 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용 강도를 강건하게 검출하고, 정량화한다는 것을 추가로 입증하고, 본 검정법이 소분자 화합물의 효과에 기인하여 단백질 결합 파트너 사이의 파괴를 검출한다는 것을 보여주는 것이다.
도 15는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 (1502)와 폴리펩티드 표적 기질 (1504) 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 AlphaSeq 데이터의 히트맵 (1500)을 도시한 것이며, 여기서, 스케일 바 (1506)에 따라 더 어두운 음영은 상대적으로 더 강한 상호작용을 나타내고, 더 밝은 음영은 상대적으로 더 약한 상호작용을 나타낸다. 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 (1502)의 라이브러리의 개별 구성원은 그리드의 수직 축으로 제시되어 있고, 폴리펩티드 표적 기질 (1504) 라이브러리의 개별 구성원은 그리드의 수평 축으로 제시되어 있다. 히트맵 (1508)은 특정 상호작용을 더욱 상세하게 강조하기 위해 확대된 히트맵 (1500)으로부터의 사각형으로 표시된 서브세트를 도시한 것이다. E3 유비퀴틴 리가제 KEAP1과 폴리펩티드 표적 기질 Nrf2 사이의 상호작용은 문헌에 널리 공지되어 있고, 잘 특징화되어 있다. 히트맵 (1508)은 인간 KEAP1 또는 마우스 KEAP1의 말단절단물과 수개의 Nrf2 변이체 (Nrf2 t1; Nrf2 t1 돌연변이체; Nrf2 t2; Nrf2 t2 돌연변이체) 사이의 쌍별 상호작용의 상대적인 강도를 보여주는 것이다. Nrf2 말단절단 돌연변이체는 각각 표적화된 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 박스 (1510) 및 (1512)로 표시된 바와 같이, 인간 KEAP1 t1은 Nrf2 t1 및 Nrf2 t2와 각각 상대적으로 강한 상호작용을 한다. 그러나, 박스 (1511) 및 (1513)은 Nrf2 t1 및 Nrf2 t2의 각 돌연변이는 상기 상호작용을 파괴시킨다는 것을 보여준다. 마우스 KEAP1도 그러하다. 본 실험은 AlphaSeq 검정법이 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용 강도를 강건하게 검출하고, 정량화한다는 것을 입증하고, 본 검정법이 단백질 결합 파트너 중 하나의 돌연변이에 기인하여 단백질 결합 파트너 사이의 파괴를 검출할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
도 16은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 (1602)와 폴리펩티드 표적 기질 (1604) 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 AlphaSeq 데이터의 히트맵 (1600)을 도시한 것이며, 여기서, 스케일 바 (1606)에 따라 더 어두운 음영은 상대적으로 더 강한 상호작용을 나타내고, 더 밝은 음영은 상대적으로 더 약한 상호작용을 나타낸다. 삽도 (1608)는 E3 유비퀴틴 리가제 KEAP1과 수개의 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용에 대한 정량적 데이터를 강조한 것이다. Nrf2는 KEAP1에 대한 이전에 공지된 표적 기질이고, KEAP1과 Nrf2 사이의 상호작용 강도는 KEAP1과 음성 대조군 폴리펩티드 표적 기질 사이의 것보다 적어도 1,000배 더 높다. 그래프에서, 막대 (1612) 및 (1614)는 신규한 두 KEAP1 기질에 대한 정량적 상호작용 강도 데이터를 나타낸다. 이들 신규 폴리펩티드 표적 기질은 KEAP1과, 음성 대조군과 KEAP1의 상호작용보다 적어도 10배 더 높은 상호작용 강도를 갖는다. KEAP1의 상기 두 추정 기질은 가능한 표적을 나타내고, 여기서, 소분자는 KEAP1과 추정 표적 기질 사이의 상호작용을 강화시키도록 선택, 확인, 또는 디자인될 수 있다.
삽도 (1610)는 E3 유비퀴틴 리가제 SPSB2와 수개의 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용에 대한 정량적 데이터를 강조한 것이다. Par4는 SPSB2에 대한 이전에 공지된 표적 기질이고, SPSB2와 Par4 사이의 상호작용 강도는 SPSB2와 음성 대조군 폴리펩티드 표적 기질 사이의 것보다 적어도 1,000배 더 높다. 그래프에서, 막대 (1616) 및 (1618)는 신규한 두 SPSB2 기질에 대한 정량적 상호작용 강도 데이터를 나타낸다. 이들 신규 폴리펩티드 표적 기질은 SPSB2와, 음성 대조군과 SPSB2의 상호작용보다 적어도 10배 더 높은 상호작용 강도를 갖는다. SPSB2의 상기 두 추정 기질은 가능한 표적을 나타내고, 여기서, 소분자는 SPSB2와 추정 표적 기질 사이의 상호작용을 강화시키도록 선택, 확인, 또는 디자인될 수 있다. 본 실험은 AlphaSeq 검정법이 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용 강도를 강건하게 검출하고, 정량화한다는 것을 입증하고, 본 검정법이 소분자 발견을 위한 후보가 될 수 있는, 단백질 결합 파트너 사이의 신규한 상호작용을 검출할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
도 17a는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 세레블론 (CRBN)의 변이체의 라이브러리와 그의 폴리펩티드 표적 기질 이카로스 (IKZF1)의 변이체의 라이브러리 사이의 상호작용의 강도를 나타내는 AlphaSeq 데이터의 히트맵 (1700)을 도시한 것이며, 여기서, 스케일 바 (1702)에 따라 더 어두운 음영은 개별 CRBN 변이체와 IKZF1 변이체 사이의 상대적으로 더 강한 상호작용을 나타내고, 더 밝은 음영은 상대적으로 더 약한 상호작용을 나타낸다. CRBN 변이체의 라이브러리의 개별 구성원은 그리드의 수직 축 (1704)으로 제시되어 있고, IKZF1 변이체의 라이브러리의 개별 구성원은 그리드의 수평 축 (1706)으로 제시되어 있다. 히트맵의 음영 처리된 박스는 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제 (1704)의 라이브러리의 단일 구성원과 폴리펩티드 표적 기질 (1706)의 라이브러리의 단일 구성원 사이의 상호작용 강도를 나타낸다. 야생형 E3 유비퀴틴 리가제 CRBN과 그의 야생형 표적 기질 IKZF1 사이의 상호작용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. CRBN 변이체의 라이브러리 및 IKZF1 변이체의 라이브러리는 각각 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 히트맵 (1708)은 특정 상호작용을 더욱 상세하게 강조하기 위해 확대된 히트맵 (1700)으로부터의 사각형으로 표시된 서브세트를 도시한 것이다. 화살촉 (1712)으로 표시된 사각형은 야생형 CRBN과 야생형 IKZF1의 상호작용을 나타내고, 상대적으로 밝은 음영은 야생형 단백질 결합 파트너 사이의 상대적으로 중간 정도의 결합 친화도를 나타낸다. 화살표 (1710)로 표시된 사각형은 두 단백질 결합 파트너 사이의 계면에 입체 벌크를 도입하는 돌연변이를 보유하는 IKZF1의 돌연변이체와 야생형 CBRN의 상호작용을 나타낸다. 상대적은 어두운 음영은 야생형 CBRN과 야생형 IKZF1 사이의 결합 친화도보다 유의적으로 더 높은, 야생형 CBRN과 돌연변이체 IKZF1 사이의 결합 친화도를 나타낸다.
히트맵 (1700) 및 (1708)에 제시된 결합 친화도 데이터의 서브세트는 도 17b의 플롯에 제시되어 있다. 야생형 CRBN과 야생형 IKZF1 (1716)의 상호작용은 야생형 CRBN (1712)과 음성 대조군 또는 야생형 IKZF1과 음성 대조군 (1714)의 것보다 적어도 10배 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 히트맵 (1708)에 제시된 바와 같이, 야생형 CRBN과 결합 계면에 입체 벌크를 도입한 G151E인 IKZF1의 돌연변이체의 상호작용은 야생형 CRBN과 야생형 IKZF1 (1716)의 결합 친화도 대비 적어도 1,000배만큼 결합 친화도 (1718)를 증가시켰다. 추가로, 돌연변이체 CRBN (E377C)과 돌연변이체 IKZF1 (G151E)의 상호작용은 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 그의 표적 기질 사이의 결합 친화도 (1720)를 야생형 CRBN과 돌연변이체 (G151E) IKZF1 (1718)의 상호작용에 대한 것보다 유의적으로 훨씬 더 크게 증가시킨다. 본 결과는 AlphaSeq 검정법이 폴리펩티드 E3 유비퀴틴 리가제와 폴리펩티드 표적 기질 사이의 상호작용 강도를 강건하게 검출하고, 정량화한다는 것을 입증하고, 단백질 결합 파트너의 포화 돌연변이유발 라이브러리와 조합되었을 때, 본 검정법은 야생형 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도와 비교하여 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도를 유의적으로 증진시키는 신규한 돌연변이를 검출할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 이어서, 본 검정법에 의해 확인된 신규한 돌연변이를 통해 단백질 결합 파트너 사이의 결합 계면에 대해 돌연변이(들)가 미치는 예측되거나, 또는 관찰되는 영향에 기인하여 소분자 스크리닝 캠페인 또는 합리적인 약물 디자인에 대한 정보를 알아낼 수 있다.
도 18은 CRBN과 IKZF1 사이의 결합의 구조적 모델을 도시한 것이다. CRBN과 IKZF1의 결정 구조는 널리 공지되어 있고, 컴퓨터를 이용한 모델링 프로그램 UCSF ChimeraX (Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Meng EC, Couch GS, Croll TI, Morris JH, Ferrin TE. Protein Sci. 2021 Jan;30(1):70-82)을 사용하여 도 17a 및 17b에 제시된 실험에서 확인된 돌연변이의 영향을 예측하였다. 패널 (1800)은 야생형 CRBN과 야생형 IKZF1 사이의 예측된 결합 계면을 도시한 것이다. 패널 (1802)은 분자 접착제인 포말리도마이드의 존재하에서의 야생형 CRBN과 야생형 IKZF1 사이의 예측된 결합 계면을 도시한 것이다. 면역조정 약물 (IMiD) 포말리도마이드는 IKZF1과 CRBN 사이의 결합 친화도를 증진시켜 IKZF1의 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 그의 역할에 대해 특징이 잘 규명되어 있다. 패널 (1802)에 도시되어 있는 바와 같이, 포말리도마이드는 수소 결합을 형성하고, 결합 계면에서 CRBN과 IKZF1 사이의 상호작용을 안정화시킴으로써 이를 달성하였다. 패널 (1804)은 야생형 CRBN과 돌연변이체 (G151E) IKZF1 사이의 예측된 결합 계면을 도시한 것으로, 이는 도 17b에 플롯팅된 정량적 결과에 상응하는 것이다. 패널 (1806)은 돌연변이체 CRBN (E377C)과 돌연변이체 IKZF1 (G151E) 사이의 예측된 결합 계면을 도시한 것으로, 이는 도 17b에 플롯팅된 정량적 결과에 상응하는 것이다. 패널 (1804) 및 (1806)에서 화살표로 강조표시된 바와 같이, 단백질 결합 파트너에 도입된 돌연변이 또한 단백질 결합 파트너 사이의 수소 결합을 매개하고, 결합 계면을 안정화시킴으로써, 도 17b에 정량화된 바와 같이 결합 친화도를 증진시킨다. 패널 (1804)에 제시된 바와 같이, IKZF1 돌연변이 G151E는 야생형 CRBN과 돌연변이체 IKZF1 사이의 수소 결합을 매개하는 것으로 예측된다. 패널 (1806)에 제시된 바와 같이, IKZF1 돌연변이 G151E 및 CRBN 돌연변이 E377C는 각각 돌연변이체 CRBN과 돌연변이체 IKZF1 사이의 수소 결합을 매개하는 것으로 예측된다. 본 결과는 비편향 스크리닝 방법에서 결합 계면에 대한 어떤 사전 지식 없이도 단백질 결합 파트너 사이의 결합 상호작용을 안정화시킴으로써 야생형 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도보다 실질적으로 더 높은 결합 친화도를 갖도록 유도하는 돌연변이를 검출할 수 있는 검정법의 능력을 입증한다. 구조적 모델링 및 컴퓨터를 이용한 예측과 조합하여, 본 방법에 의해 확인된 돌연변이를 사용함으로써 단백질 결합 파트너 사이의 결합 계면에 대해 돌연변이(들)가 미치는 예측되거나, 또는 관찰되는 영향에 기인하여 소분자 스크리닝 캠페인 또는 합리적인 약물 디자인에 대한 정보를 알아낼 수 있다.
특정 실시양태가 설명되었지만, 이들 실시양태는 단지 예로서 제공된 것이며, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 신규 방법, 장치 및 시스템은 다양한 다른 형태로 구현될 수 있고; 추가로, 본 개시내용의 취지로부터 벗어남 없이, 본원에 기술된 방법, 장치 및 시스템의 형태에서 다양하게 생략, 치환 및 변경될 수 있다. 첨부된 청구범위 및 그 등가물은 본 개시내용의 범주 및 취지 내에 포함되는 상기와 같은 형태 또는 변형을 포함하도록 의도된다.
Claims (10)
- 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포의 표면 상에 발현 및 디스플레이된 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종을 제공하는 단계로서, 여기서, 제1 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종은 야생형 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종, 및 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 돌연변이체 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종의 라이브러리를 포함하는 것인 단계;
제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포의 표면 상에 발현 및 디스플레이된 복수의 폴리펩티드 기질 종을 제공하는 단계로서, 여기서, 복수의 폴리펩티드 기질 종은 야생형 폴리펩티드 기질 종, 및 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 돌연변이체 폴리펩티드 기질 종의 라이브러리를 포함하는 것인 단계;
액체 배지 중에서 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포 및 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포를 합하여 배양물을 제조하는 단계;
복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나 이상과 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 이상 사이의 하나 이상의 상호작용이 제1 복수의 재조합 반수체 효모 세포 중 하나 이상과 제2 복수의 재조합 반수체 효모 세포 중 하나 이상 사이의 하나 이상의 메이팅 이벤트를 매개하도록 하는 시간 동안 및 그러한 조건하에서 배양물을 성장시켜 하나 이상의 이배체 효모 세포를 제조하는 단계;
배양물 중의 메이팅 이벤트수에 기초하여 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나 이상과 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 이상 사이의 상호작용의 강도를 결정하는 단계; 및
폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나 및 폴리펩티드 기질 종 중 하나, 이 둘 중 하나 또는 그들 모두가 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형되고, 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 상호작용 강도 (K D )가 상응하는 야생형 폴리펩티드 종 사이의 상호작용보다 적어도 10%만큼 더 강하거나 또는 더 약한 것인 폴리펩티드 쌍을 확인하는 단계를 포함하는, 단백질-단백질 상호작용을 검정하는 방법. - 제1항에 있어서, 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 상호작용 강도 (K D )가 상응하는 야생형 폴리펩티드 종 사이의 상호작용보다 적어도 25%만큼 더 강하거나 또는 더 약한 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종이 E3 유비퀴틴 리가제 종인 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩티드 기질 종이 알려진 또는 예측되는 데그론 모티프를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 복수의 폴리펩티드 중 하나 이상이 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형되어 폴리펩티드의 도메인에 입체 벌크를 도입하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 방법이 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 계면 구조를 결정하기 위해 돌연변이유발에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변형된 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 계면을 컴퓨터를 사용하여 모델링하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 성장시키는 단계가 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 존재하에 배양물을 성장시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 확인하는 단계가 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 존재하에서의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 상호작용 강도 (K D)가 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 부재하에서의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종과 폴리펩티드 기질 종 사이의 상호작용보다 적어도 10%만큼 더 강하거나 또는 더 약한 것인 폴리펩티드 쌍을 확인하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종이 야생형 유비퀴틴 리가제 종이고, 복수의 폴리펩티드 기질 종이 야생형 폴리펩티드 기질 종인 방법.
- 제9항에 있어서, 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나와 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 사이의 상호작용이 하나 이상의 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물의 존재하에서 검출되는 반면, 소분자, 단백질, 펩티드, 제약 화합물, 또는 다른 화학적 엔티티의 부재하에서는 복수의 폴리펩티드 유비퀴틴 리가제 종 중 하나와 복수의 폴리펩티드 기질 종 중 하나 사이의 상호작용이 검출되지 않는 것인 방법.
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