KR20230001353A - 트리코더마 롱기브라키아툼 균주로부터 유래된 살균 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법 - Google Patents
트리코더마 롱기브라키아툼 균주로부터 유래된 살균 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) 균주로부터 유래된 살균 화합물, 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) 균주로부터 유래된 살균 화합물, 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.
식물병원균은 농작물에 심각한 피해를 일으켜, 작물의 수량을 감소시키고 품질을 저해하여 글로벌 식량 안보를 위협하고 있다. 합성 살균제는 식물병 제어에 효과적이지만, 약제의 오남용으로 생태계 교란, 환경오염, 인간과 가축에 대한 독성, 약제 저항성 등의 문제가 야기되었다. 이에, 미래 농업 생산에 있어 화학 농약의 사용을 줄이거나 이를 대체하기 위한 새로운 친환경 식물병 방제 수단의 개발이 요구되고 있으며, 식물, 미생물 또는 이의 이차 대사산물 등의 천연소재를 식물병 방제에 이용하는 방법들이 연구되고 있다.
바이오작물보호제(biopesticide)는 자연에서 유래한 미생물 및 천연물질을 이용하여 병원균, 해충 및 잡초 등을 방제하기 위하여 사용되는 친환경 식물병 방제 수단으로, 식물추출물 또는 미생물이 주요 소재로 이용된다. 이와 관련하여, 미생물과 미생물의 이차 대사산물을 이용한 식물병 방제에 효과가 있다는 연구 결과가 다수 보고되고 있다. 예를 들어, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)의 리포펩타이드(lipopeptides)가 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae) 방제에 효과적이라는 보고가 있었고, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 곰팡이에서 분리한 아세르산 A(aseric acid A)는 in vitro 실험에서 칸디다 알사이클로칸스(Candida albicans)와 크립토콕코스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)에 대해 항균활성을 나타냈으며, 담자균 크리니펠리스 라이조마티콜라(Crinipellis rhizomaticola)의 배양액으로부터 분리한 항생물질 크리니펠린(crinipellins)가 벼 도열병과 고추 탄저병 방제에 효과를 나타내는 등의 미생물을 이용한 식물병 방제에 관한 다양한 연구가 보고되어왔다. 또한, 다양한 목재부후 담자균이 생산하는 스트로비루린(strobilurin) 또는 오우데만신(oudemansin)은 글로벌 살균제 시장에서 가장 많이 판매중인 QoI 살균제의 리드화합물이다.
트리코더마(Trichoderma) 속 균주는 토양 및 근권에서 살아가는 곰팡이로 푸자리움(Fusarium), 피씨움(Pythium), 알터나리아(Alternaria), 파이토프쏘라(Phytophthora) 등의 식물 병원균에 대하여 길항작용을 하는 경우가 많아 식물병 방제에 적극적으로 이용되고 있다. 식물병 방제에 이용되는 대표적인 트리코더마 속 균주는 트리코더마 하르지아눔(Trichoderma harzianum)과 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) 등이며, 전 세계 시판중인 200여 종의 바이오작물보호제의 주요 성분으로 이용되고 있다.
생물학적 방제 방법은 대중의 수용 정도가 크고, 환경 오염을 감소시키며, 지속성을 증가시키는 장점을 갖는 화학적 살충제에 대한 천연의 대체물로서 긍정적으로 인식된다. 그럼에도 불구하고 생물학적 방제제의 경우 방제효과가 떨어지거나 경제적이지 못한 문제가 있다. 이에, 신규한 생물적 방제제의 개발이 여전히 요구된다.
이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 해양으로부터 다양한 미생물을 분리하고 이들의 살균 활성을 조사하던 중 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주가 우수한 살균 활성을 나타낸다는 것을 발견하고, 이 균주의 다양한 식물 병원균에 대한 항균 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 식물병원균을 방제하여 바이오작물보호제로 사용될 수 있는 트리코더마 롱기브라키아툼 균주 배양여액의 에틸아세테이트 분획물; 부탄올 분획물; 및 트리코더마 롱기브라키아툼 균주의 대사산물로부터 분리된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물 또는 비료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 트리코더마 롱기브라키아툼 균주 유래의 살균 활성을 갖는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 트리코더마 롱기브라키아툼 균주 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 식물 또는 환경에 제공하는 단계;를 포함하는 식물병 방제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 식물병원균에 대해 살균활성을 갖는 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "트리코더마(Trichoderma)"는 토양, 해양 및 근권에서 살아가는 곰팡이로 트리코더마 속에 속하는 미생물에는 트리코더마 하르지아눔(T. harzianum), 트리코더마 비리데(T. viride) 등이 있다.
본 발명자들은 트리코더마 속 균주 중에서도 식물병원균에 항균활성을 나타내는 해양 유래의 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주를 분리하였으며, 이를 하기와 같이 규명하였다.
상기 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주는 대한민국 인천광역시 강화군 길상면 장흥리에서 채취한 갯벌 흙을 인공해수로 희석하고, 배양하고, 형성된 균총을 순수 배양하여 선별되었다. 상기 선별된 균주를 translation elongation factor 1-α 유전자 염기서열을 바탕으로 분자계통학적 분석을 실시하여 트리코더마 롱기브라키아툼으로 동정되었다. 동정된 균주를 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC 83038BP를 부여받았다. 또한 상기 트리코더마 롱기브라키아툼 균주는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 확인하였다.
[서열번호 1]
TTTGCCTCTGCCCAACATCTGTCGACCAGGTGGTCTGCGTCGATGGACTTTTTTTCACCACCCCGCTTTCTCCTACCCCTCCTTTGGGCGACGCAAATTTTTTTTGTTGCGTTTCGGGTTTTAGTGGGGATGCACCTCCAGCAAACCACTATGCTCTGCCGCCCTCTGCTCTCGTCTGCAACACCTTTGGCGCTTGCGTCATCAACCTTCCAACAGTCTGCGCAGCAATGCTAATCATTTTCCCCTCAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTGATCCCGTGCACTCATTGCATCATCGCCACAACAACATACTAATGCCCTCTGACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCA
본 발명에 있어서, 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액은 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주를 배양 배지에서 일정 기간 동안 배양한 결과물, 배양하여 수득한 균주 및 그의 대사물인 "배양액"에서 고형분을 제거하고 수득한 액상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물은 상기 배양여액을 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻고, 잔여 배양여액을 부탄올로 분획하여 부탄올 분획물을 수득한 것 일 수 있다.
본 발명의 구체예에서는, 신규하게 분리된 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주가 식물병 원인균에 대해 현저한 항균 활성을 가진다는 것을 구체적으로 확인하였다.
본 발명에 있어서, “식물병원균”은 식물에 기생생활을 하는 균류(기생균), 식물에 살생생활을 하는 균(살생균), 특정한 식물에 기생하는 조건적 기생균 등 식물의 병을 유발하는 균류를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 식물병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성 및/또는 식물병원성 세균에 대한 살균활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물은 식물병원성 곰팡이에 대해 항진균 활성을 가지며, 여기서, 식물병원성 곰팡이는 예컨대 배추과 작물 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerinum), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans), 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수 뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina) 및 보리 흰가루균병(Blumeria graminis f. sp. hordei)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물은 식물병원성 세균에 대해 항균 또는 살균 활성을 가지며, 여기서, 식물병원성 세균은 예컨대 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 호접란 무름병균(Dickeya chrysanthemi), 채소 무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 가지과 작물 풋마름병균(Ralstonia solanacearum) 및 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 고추 탄저병균, 벼 도열병균 또는 감자/토마토 역병균은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물로 방제되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 배추과 작물 검은무늬병균, 고추 탄저병균, 시들음병균, 벼 도열병균, 감자/토마토 역병균, 오이 검은별무늬병균, 인삼 뿌리썩음병균, 토마토 잿빛곰팡이병균 또는 밀 붉은녹병균 그리고 식물병원성 세균인 호접란 세균성갈색점무늬병균, 세균성벼알마름병균, 가지과 작물 풋마름병균은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획으로 방제되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)은 특히, 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 부탄올 분획물로 방제되는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 식물병원균에 의해 발명되는 식물병은 역병, 더뎅이병, 무름병, 시들음병, 잿빛곰팡이병, 마름병, 흰곰팡이병, 뿌리 썩음병, 깨씨무늬병, 궤양병, 모자이크병, 붉은녹병, 오갈병, 구멍병, 혹병 및 탄저병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 식물병원균 방제 활성을 나타내는 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물은 하기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
바람직하게, 상기 화학식 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 및 13으로 표시되는 화합물은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
바람직하게, 상기 화학식 2 및 11로 표시되는 화합물은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 부탄올 분획물로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물은 천연물 유래의 것으로서, 인체에 무독성 또는 저독성을 나타내고, 자연계에서 생분해되어 환경오염을 유발하지 않으면서도 식물병원균에 대한 방제가 뛰어나다. 또한, 상기 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물로 부터 수득된 상기 화합물 각각은 독립적으로 특정 식물병원균에 대한 항진균 또는 항균 활성을 가지므로 특정 병원균의 감염에 대해 빠르게 작용할 수 있는 표적 생물농약으로 적용이 가능하며, 일부 화합물은 광범위한 식물병원균에 대해 복합적인 항진균 또는 항균 활성을 가지므로 포괄적인 생물농약으로 적용이 가능하므로 농가의 병충해 방제 및 생산량 증가에 크기 기여할 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명에 따른 식물병원균 방제용 조성물은 천연물 유래의 것이므로 환경친화적인 생물농약으로 개발될 수 있고 고부가가치의 유기농산물 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양액으로부터 분리된 하기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물로부터 상기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물을 분리 및 동정하여 규명된 구조를 제공하며, 화학식 1의 화합물(화합물 1)은 종래 보고된 바 없는 신규한 구조의 물질로 알려진 화합물과의 구조적 유사성을 바탕으로 스피로소르비실리놀 D(spirosorbicillinol D)로 명명하였다. 한편, 화학식 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물(각각 화합물 2 내지 8, 10 내지 13이라 함)은 알려진 화합물로, 각각 화합물 2는 2',3'-디히드로-에폭시소르비실리놀(2',3'-dihydro-epoxysorbicillinol), 화합물 3은 스피로소르비실리놀 A(spirosorbicillinol A), 화합물 4는 스피로소르비실리놀 B(spirosorbicillinol B), 화합물 5는 스피로소르비실리놀 C(spirosorbicillinol C), 화합물 6은 비스베르티놀론(bisvertinolone), 화합물 7은 비소르비실론(bisorbicillinol), 화합물 8은 비스베르티노퀴놀(bisvertinoquinol), 화합물 10은 트리코다이머롤(trichodimerol), 화합물 11은 에폭시소르비실리놀(epoxysorbicillinol), 화합물 12는 옥소소르비실리놀((oxosorbicillinol), 화합물 13은 사이클로네로디올(cyclonerodiol)이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물은 각각 독립적으로 배추과 작물 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerinum), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans), 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수 뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina), 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 호접란 무름병균(Dickeya chrysanthemi), 채소 무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 가지과 작물 풋마름병균(Ralstonia solanacearum) 및 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 식물병원균에 대해 항진균 활성 또는 살세균활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12 및 13은 감자/토마토 역병균(P. infestans)에 살균활성을 가지며, 특히, 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 11 및 13은 우수한 토마토역병 방제 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 화합물 6, 7, 8, 11, 12 및 13은 벼 도열병균(M. oryzae)에 살균활성을 가지며, 우수한 벼 도열병 방제 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 화합물 6, 7 및 12는 배추과 작물 검은무늬병균(A. brassicicola)에 뛰어난 살균 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 화합물 7 및 10은 가지과 작물 풋마름병균(R. solanacearum)과 에 뛰어난 활성을 갖는다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 화합물 6은 배추과 작물 검은무늬병균(A. brassicicola), 고추 탄저병균(C. coccodes ); 시들음병균(F. oxysporum ); 벼 도열병균(M. oryzae ); 감자/토마토 역병균(P. infestans), 오이 검은별무늬병균(C. cucumerinum ), 인삼 뿌리썩음병균(C. destructans ), 식물병원성 세균인 호접란 세균성갈색점무늬병균(A. avenae subsp. cattleyae ) 및 세균성벼알마름병균(B. glumae )를 아우르는 광범위한 식물병원균 살균활성을 갖는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 농약분야에 공지된 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제형화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 제형화를 위해 다양한 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 또는 보조제 등이 포함될 수 있다.
상기 액체 담체로는 물(water), 식물유(vegetable oil), 에탄올(ethanol) 등이 사용될 수 있으며, 상기 식물유에는 대두유, 유채씨기름, 야자유, 팜핵유, 미강유, 옥수수유, 팜유, 올리브유 등이 포함되고, 이에 제한되지 않는다.
상기 고체 담체로는 광물 분말, 젤라틴, 알긴산 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 광물 분말로는 양이온 점토(cation clay), 벤토나이트(bentonite), 카올린(kaolin), 탈크(Talc), 규조토(diatomaceous earth) 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 계면활성제로는 에틸렌옥사이드(Ethyleneoxide)계, 다이에탄올아민(Diethanolamine)계, 솔비톨(Sorbitol)계, 글리세린(Glycerine)계 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 보조제로는 증량제, 부동액, 용제, 증점제, 전착제 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 식물체의 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 관주용, 침지용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 대사산물로부터 분리된 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 신규한 구조의 트라이코쎄센(trichothecene) 골격의 화합물로 스피로소르비실리놀 D로 명명하였다.
본 발명의 화학식 2의 화합물은 에폭시소르비실리놀(epoxysorbicillinol)을 화학합성하는 과정에서 부반응물로 합성된 예는 있으나, 천연에서 천연물로 발견된 예는 없었다. 본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양액으로부터 분리된 화학식 2로 표시되는 2',3'-디히드로-에폭시소르비실리놀(2',3'-dihydro-epoxysorbicillinol)을 제공한다.
본 발명에 의하면, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 특히, 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans)에 대해 우수한 살균 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 식물, 종자, 식물의 서식지, 종자의 보관장소 및 식물관리 작업자의 의류 또는 신발 중에서 선택되는 1종 이상에 처리하는 단계;를 포함하는 식물병 방제방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 식물병원균 및 식물병은 앞에서 제시한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물은 유효성분으로 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 식물병 방제방법은 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물로부터 분리한 상기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물로부터 선택되는 1종 이상을 식물, 종자, 토양, 종자의 보관장소 및 식물관리 작업자의 의류 또는 신발 중에서 선택되는 1종 이상에 처리하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
상기 처리 방법에는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 분무, 가지절단 또는 농기구소독에 적용하는 처리 방법 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 처리는 식물에 발생된 식물병원균을 사멸시켜 식물을 보호, 식물병원균이 성장하지 못하도록 증식억제, 식물병원균이 서식하지 못하도록 차단할 수 있으므로 식물병을 방제하는데 기여한다.
또한, 본 발명은 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는, 비료 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 비료 조성물은 첨가제로서 질소, 인, 칼륨, 규산소다, 키토산, 목초액, 칼슘, 마그네슘, 철, 망간, 붕소, 황, 아연, 구리, 몰리브덴 및 염소를 첨가할 수 있으며, 작물의 종류, 비료성분의 길항작용 및 상조작용을 참고로 첨가할 수 있다.
상기 첨가제 중 질소, 인산 및 칼륨은 작물에 필수적인 비료의 3요소이다.
상기 인은 식물의 세포핵 분열조직 및 포스폴리라제와 같은 식물의 생리상 중요한 요소의 구성요소이며 뿌리의 발육을 촉진하는 역할을 한다.
상기 규산소다는 작물의 생산량 및 품질을 향상시키고, 스트레스 저항성을 높여 주며, 각종 유해 성분을 중화하는 역할을 한다. 토양 중에 존재하는 규산은 가용성 규산 형태로 작물의 뿌리에 흡수되면 잎이나 줄기의 표피세포 중에 침적되어 식물체의 병충해 등에 대한 저항성을 향상시킨다. 또한, 규산은 냉해에 대한 저항성 증가, 이로 인한 시비효율 증진, 토양 비옥도 증진 및 병충해 경감 등의 작용으로 인해 생산비를 절감하는 효과가 있다.
상기 키토산은 게, 새우 등의 갑각류 껍데기에 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 물질로서, 작물의 생산량을 증대시키고, 우수한 항균 활성을 나타내 작물의 내병성을 증진시키는 역할을 한다. 사용될 수 있는 키토산의 예로는 수용성 키토산 또는 이들의 유도체를 들 수 있으며, 구체적으로 키토산 유도체로서 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan) 또는 설페이티드 키토산(sulfated chitosan), 바람직하게는 카르복시메틸 키토산이 이용될 수 있다.
상기 목초액은 다량의 초산을 함유하고 있어 해충에 대한 기피 작용을 하며 몇몇 병원성 세균에 대해서 높은 저항성을 부여한다.
상기 칼슘은 세포막의 구성요소이며, 단백질의 합성에 관여하고 질소의 흡수 및 이용을 돕는다. 또한, 체내의 유해한 유기산을 중화하고 알루미늄의 과잉흡수를 억제하며 그 독성을 줄여준다. 또한, 상기 마그네슘은 광합성 작용과 인산대사에 관여하는 효소의 활성을 높이고 종자내의 지방질의 집적을 돕는다.
상기 철은 호흡효소의 구성성분이다. 또한, 상기 망간은 각종 효소의 활성을 높이고 동화물질의 합성분해, 호흡작용, 광합성 등에 관여한다. 상기 붕소는 촉매 또는 반응조절물질로 작용하며, 석회결핍의 영향을 줄여준다. 상기 황은 결핍되면 전체적인 생장이 저해된다.
상기 아연은 결핍되면 황화작용이 일어나고 잎이 작아진다. 상기 구리는 결핍되면 새잎의 선단부터 황백화되고 작물이 시들게 된다. 상기 몰리브덴은 결핍되면 질산염의 환원장애를 유발한다. 상기 염소는 결핍되면 새싹 또는 새눈이 황화되고 작물의 품질이 나빠진다.
본 발명에 따른 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물은 천연물 유래의 것으로서, 인체에 무독성 또는 저독성을 나타내고, 자연계에서 생분해되어 환경오염을 유발하지 않으면서도 식물병원균에 대한 방제가 뛰어나다. 또한, 상기 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물로 부터 수득된 상기 화합물 각각은 독립적으로 특정 식물병원균에 대한 항진균 또는 항균 활성을 가지므로 특정 병원균의 감염에 대해 빠르게 작용할 수 있는 표적 생물농약으로 사용이 가능하며, 일부 화합물은 광범위한 식물병원균에 대해 복합적인 항진균 또는 항균 활성을 가지므로 포괄적 생물농약으로 사용이 가능하므로 농가의 병충해 방제 및 생산성 증가에 크게 기여할 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명에 따른 식물병원균 방제용 조성물은 천연물 유래의 것이므로 환경친화적인 생물농약으로 개발될 수 있고 고부가가치의 유기농산물 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다
도 1은 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양 이미지이다.
도 2는 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 계통수를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로부터 활성물질의 분리를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화합물 1의 화학구조의 입체 분석 결과로, 도 4a는 화합물 1의 주요 상관관계를 HMBC(화살표) 및 COZY(굵은 선)로 분석한 결과이며, 도 4b는 화합물 1의 주요 상관관계를 NOE(점선)으로 분석한 결과이고, 도 4c는 화합물 1(흑색점선, 1)과 스피로소르비실리놀 A(적색점선, 3), 스피로소르비실리놀 B(흑색실선, 4), 스피로소르비실리놀 C(적색실선, 5)의 CD 스펙트럼 결과이다.
도 5는 토마토 역병 발생에 대한 화합물 4, 6, 7, 11의 효과 평가 결과로, 도 5a는 화합물 4, 6, 7, 11의 처리 농도에 따른 토마토 역병의 제어 효능이며, 도 5b는 식물에 화합물 6을 농도별로 처리하고, 1일 후, 토마토 역병균을 감염시켜 확인한 화합물 6의 토마토 역병 방제 효능 결과이다.
도 2는 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 계통수를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로부터 활성물질의 분리를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화합물 1의 화학구조의 입체 분석 결과로, 도 4a는 화합물 1의 주요 상관관계를 HMBC(화살표) 및 COZY(굵은 선)로 분석한 결과이며, 도 4b는 화합물 1의 주요 상관관계를 NOE(점선)으로 분석한 결과이고, 도 4c는 화합물 1(흑색점선, 1)과 스피로소르비실리놀 A(적색점선, 3), 스피로소르비실리놀 B(흑색실선, 4), 스피로소르비실리놀 C(적색실선, 5)의 CD 스펙트럼 결과이다.
도 5는 토마토 역병 발생에 대한 화합물 4, 6, 7, 11의 효과 평가 결과로, 도 5a는 화합물 4, 6, 7, 11의 처리 농도에 따른 토마토 역병의 제어 효능이며, 도 5b는 식물에 화합물 6을 농도별로 처리하고, 1일 후, 토마토 역병균을 감염시켜 확인한 화합물 6의 토마토 역병 방제 효능 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1.
트리코더마
롱기브라키아툼
SFC100166
균주의 분리 및 동정
단계 1: SFC100166 균주의 분리
인천광역시 강화군 길상면 장흥리에서 채취한 갯벌 흙 5 g을 인공해수(NaCl 28.32 g, KCl 0.77 g, MgCl2·6H2O 5.48 g, MgSO4·7H2O 7.39 g, CaCl2 1.11 g, NaHCO3 0.2 g, 증류수 1 L)로 10배 희석하고, 희석액 100 μL를 인공해수를 첨가한 dichloran rose bengal chloramphenicol agar(BD Biosciences, Sparks, MD)에 도말하고, 25℃에서 1주 내지 2주 동안 배양하였다. 형성된 균총을 순수 배양하여 SFC100166 균주를 분리하였다. 배양 중인 균주 이미지를 도 1에 나타내었다.
분리된 균주는 멸균된 20% 글리세롤 수용액에 침지하여 -80℃ 보관하였다.
단계 2: SFC100166 균주의 동정
단계 1에서 분리한 SFC100166 균주의 분류학적 동정을 위해 번역 신장 인자(translation elongation factor) 1-α 유전자의 염기서열을 바탕으로 분자계통학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, 상기 SFC100166 균주를 PDB 배지(감자전분 4 g, 포도당 20 g, 증류수 1 L)에 접종하여 25℃에서 일주일간 150 rpm으로 진탕배양하였다. 배양은 AccuPrep DNA 추출 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하였으며, 수득한 균체로부터 유전체 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR(polymerase chain reaction)은 정방향 프라이머 EF1(5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3': 서열번호 2), 역방향 프라이머 EF2(5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3': 서열번호 3)와 AccuPower PCR premix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 94℃ 5분 1회; 94℃ 40초, 55℃ 40초, 72℃ 60초에서 35회; 72℃에서 10분간 1회 조건에서 진행되었다. 수득한 PCR 생성물을 전기영동하고 Expin PCR purification kit(GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제한 후, 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석 서비스(Macrogen, Daejeon, Korea)를 의뢰하였다.
시퀀싱된 염기서열 결과(하기 서열번호 1)를 바탕으로 NCBI BLASTn 데이터베이스에 등록된 다른 균주들의 β유전자 염기서열과 비교 분석하였다. MAFFT 프로그램으로 염기서열을 정렬한 후 Kimura 2-parameter model과 1,000회의 부트스트랩(bootstrap) 법으로 MEGA 프로그램을 사용하여 계통수(neighbor-joining tree)를 작성하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 본 발명에 따라 배양된 SFC100166 균주가 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) CBS 816.68 균주와 높은 상동성(99.3% 이상)을 나타내었다. 이에, SFC100166 균주를 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)으로 동정하였다.
[서열번호 1]
TTTGCCTCTGCCCAACATCTGTCGACCAGGTGGTCTGCGTCGATGGACTTTTTTTCACCACCCCGCTTTCTCCTACCCCTCCTTTGGGCGACGCAAATTTTTTTTGTTGCGTTTCGGGTTTTAGTGGGGATGCACCTCCAGCAAACCACTATGCTCTGCCGCCCTCTGCTCTCGTCTGCAACACCTTTGGCGCTTGCGTCATCAACCTTCCAACAGTCTGCGCAGCAATGCTAATCATTTTCCCCTCAACAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTGATCCCGTGCACTCATTGCATCATCGCCACAACAACATACTAATGCCCTCTGACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCA
이러한 분석 결과를 바탕으로 SFC100166 균주를 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주로 명명하고, 2020년 11월 17일에 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC 83038BP로 기탁하였다.
실시예
2.
트리코더마
롱기브라키아툼
SFC100166
균주의
배양여액을
유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 제조
1 단계: 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액의 제조
실시예 1에서 분리한 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주(KACC 83038BP)를 멸균한 PDA 배지(감자전분 4 g, 포도당 10 g, 한천 15 g, 증류수 1 L)에서 배양한 다음, 배지에 형성된 균총을 코르크 보러로 천공하여 균사 디스크(직경 8 mm)를 제조하였다. 균사 디스크를 멸균한 PDB 배지(감자전분 4 g, 포도당 20 g, 증류수 1 L)에 접종하고 25℃에서 1주일 동안 진탕배양(150 rpm)한 후에 균주배양액을 여과지(또는 거즈)로 걸러서 배양여액을 준비하였다.
2 단계: 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액 함유 식물병 방제 조성물의 제조
1 단계에서 준비한 배양여액에 계면활성제 트윈 20(Tween 20)을 0.025%(w/v) 농도가 되도록 첨가하여 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주 배양여액을 포함하는 식물병 방제 조성물 용액 40 mL를 준비하였다.
실시예 3. 트리코더마
롱기브라키아툼
SFC100166
균주의
배양여액의
분획물
을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 제조
1 단계: 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액의 용매 분획물 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액을 제조하였으며, 준비된 배양여액을 사용하여 분획물을 수득하였다. 구체적으로, 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주 배양여액(10 L)를 동량의 에틸아세테이트로 2회 추출하였고 에틸아세테이트층과 수용액층을 얻었다. 수용액층을 다시 동량의 부탄올로 2회씩 추출하였고 부탄올층과 수용액층을 얻었다. 각 층을 각각 감압 농축함으로써 건조된 에틸아세테이트 분획물(2.6 g), 부탄올 분획물(1.8 g) 및 물 분획물(16.7 g)을 수득하였다.
2 단계: 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액의 용매 분획물 함유 식물병 방제 조성물의 제조
상기 1 단계에서 준비한 에틸아세테이트(EA) 분획물, 부탄올(BuOH) 분획물 및 물 분획물을 각각 20 mg/mL 농도로 메탄올에 용해한 다음, 각각의 시료 2 mL을 증류수에 전착제 트윈 20(Tween 20)을 첨가하여 최종 농도가 0.025%(w/v)가 되도록 만든 용액 38 mL에 첨가하였다. 이를 통해 1000 μg/mL 농도의 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액의 용매 분획물(EA, BuOH, 물)을 함유하는 식물병 방제용 조성물 용액 40 mL를 준비하였다.
실시예
4. 활성물질의 분리
트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물로부터 살균활성물질을 분리하였다. 구체적으로, Sephadex LH-20(Merck) 컬럼 크로마토그래피, Biotage SNAP KP-Sil(50 g) 컬럼 또는 Biotage SNAP Ultra C18 컬럼이 조합된 Biotage Isolera One 중압액체크로마토그래피(mid-pressure liquid chromatography; MPLC) 시스템 및 Shiseido Capcell Pak C18(250×21.2 mm, 5 μm) 컬럼이 조합된 Shimadzu LC-20AR 고성능액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography; HPLC) 시스템을 사용하여 분리를 수행하였다.
구체적으로 에틸아세테이트 분획물(2.6 g)을 Biotage SNAP KP-Sil(50 g) 컬럼이 조합된 MPLC 시스템에 로딩하고, 다이클로로메탄/에틸아세테이트(85:15, 80:20, 75:25, 0:100, v/v) 혼합액을 농도구배 조건으로 분당 5 mL의 유속으로 용출하여 E1 내지 E7로 분획하였다. HPLC 시스템에 118.7 mg의 E2 분획물을 로딩하고 50% 아세토나이트릴 수용액(0.1% 개미산 포함)을 분당 5 mL의 유속으로 용출시켜 화합물 45.4 mg의 화합물 7과 6.8 mg의 화합물 8을 분리하였다. E3 분획물(315.5 mg)을 Sephadex LH-20 레진이 충진된 컬럼(3×100 cm)에 가하고 메탄올로 용출시켜 16.1 mg의 화합물 12를 분리하였다. 잔여 분획물인 E31(218.1 mg)을 HPLC 시스템에 로딩하고 79% 메탄올 수용액(0.1% 개미산 포함)을 분당 5 mL 유속으로 용출시켜 124.2 mg의 화합물 6과 14.2 mg의 화합물 10을 분리하였다. E5 분획물(294.6 mg)을 HPLC 시스템에 로딩하고 60% 메탄올수용액을 분당 5 mL의 유속으로 용출시켜 73.7 mg의 화합물 5와 45.7 mg의 화합물 4를 분리하였다. E6 분획물(273.9 mg)을 Sephadex LH-20 레진이 충진된 컬럼(3×100 cm)에 가하고 메탄올로 용출시켜 64.9 mg의 화합물 9와 11.9 mg의 화합물 13을 분리하였다. 잔여 분획물인 E63(60.6 mg)을 HPLC 시스템에 로딩하고 65% 메탄올 수용액으로 용출시켜 28.2 mg의 화합물 3과 17.0 mg의 화합물 1을 분리하였다.
다음으로, 부탄올 분획물(1.8 g)을 Biotage SNAP Ultra C18(60 g) 컬럼이 조합된 MPLC 시스템에 로딩하고, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% 메탄올 수용액(0.1% 개미산 포함)을 농도구배조건으로 분당 5 mL의 유속으로 용출하여 얻은 분획물 B2(355.0 mg)를 재결정화하여 289.0 mg의 화합물 11을 분리하였다. 또 다른 활성 분획물 B3(78.4 mg)를 HPLC 시스템에 로딩하고 35% 아세토나이트릴 수용액(0.1% 개미산 함유)으로 용출시켜 7.6 mg의 화합물 2를 분리하였다.
활성물질의 분리를 도식화하여 도 3에 나타내었다.
실시예
5. 분리된 화합물 1 내지 13의 구조 규명
핵자기공명(이하 NMR), 질량분광분석(이하 MS) 장치를 사용하여 실시예 4에서 분리한 화합물 1 내지 13의 구조를 규명하였다. 구체적으로 각각의 화합물을 CDCl3 또는 CD3OD(Cambridge Isotope Laboratories)에 녹인 후 Bruker AMX-400 또는 AMX-500 장비에서 1H-NMR, 13C-NMR 및 2D-NMR 스펙트럼을 얻었다. 용매피크를 기준으로 화학적이동(chemical shift) 값을 δ(ppm)으로 나타내었다. 문헌에 나타난 NMR 데이터와 1H-1H correlation spectroscopy(이하 COSY), heteronuclear single quantum correlation(이하 HSQC), heteronuclear multiple bond correlation(이하 HMBC)를 종합하여 스펙트럼에 나타난 피크의 화학적 위치를 결정하였다. Electrospray ionization mass spectrometry(이하 ESIMS)를 사용하여 분리한 화합물의 질량은 측정하였고. 고해상도질량분석기(Synapt G2 HRMS Q-TOF)를 사용하여 분리된 화합물의 화학식을 완성하였다. 또한, 편광분석기(Auto Digital Polarieter, Rudolph Research Analytical) 및 적외선분석기(Identify IR, Smiths)로 분리된 화합물의 비선광도(specific optical rotation)를 측정하였다. Nuclear overhauser effect spectroscopy(이하 NOESY) 및 원편광이색성(circular dichroism; 이하 CD) 분석을 통하여 분리 화합물의 입체구조를 완성하였다.
실시예
5-1. 화합물 1의 화학구조 규명
화합물 1은 황색의 비정형 분말로 분리되었다. HRESIMS 분석에서 m/z 511.1580 [M+Na]+ (calculated m/z 511.1580)의 양이온으로 검출되었고, 화학식은 C25H28O10로 결정하였다. NMR 스펙트럼을 표 1에 나타내었다.
| 탄소 | δ C, Type | δ H, (J in Hz) |
| 1 | 41.4, CH | 3.38, overlapped |
| 2 | 111.1, C | - |
| 3 | 195.4, C | - |
| 4 | 69.2, C | - |
| 5 | 206.8, C | - |
| 6 | 74.6, C | - |
| 7 | 38.0, CH2 | 2.24, dd (14.2, 3.7); 3.13, dd (14.2, 2.3) |
| 8 | 85.8, C | - |
| 9 | 172.2, C | - |
| 10 | 84.1, CH | 4.24, dd (10.4, 8.5) |
| 11 | 67.1, CH | 4.09, td (9.7, 6.8) |
| 12 | 34.4, CH2 | 2.32, m; 2.95, dd (18.3, 6.9) |
| 13 | 131.7, C | - |
| 14 | 134.2, CH | 6.57, s |
| 15 | 70.3, CH | 4.66, m |
| 1′ | 168.3, C | - |
| 2′ | 119.3, CH | 6.46, d (14.9) |
| 3′ | 143.8, CH | 7.36, dd (14.9, 10.9) |
| 4′ | 132.3, CH | 6.44, m |
| 5′ | 140.6, CH | 6.26, dt (14.6, 7.0) |
| 6′ | 18.9, CH3 | 1.92, d (6.8) |
| 4-CH3 | 8.3, CH3 | 1.25, s |
| 6-CH3 | 24.9, CH3 | 1.23, s |
| 14-COOCH3 | 52.7, CH3 | 3.77, s |
| 14-COOCH3 | 167.2, C | - |
구조 규명
표 1에 나타난 바와 같이, 신규 화합물 1의 13C-NMR 스펙트럼에서 2개의 케톤 탄소(δ C 206.8, 195.4), 2개의 카복실 탄소(δ C 172.2, 167.2), 3개의 쿼터너리 sp2 탄소(δ C 168.3, 131.7, 111.1), 3개의 쿼터너리 sp3 탄소(δ C 85.8, 74.6, 69.2), 5개의 메틴 sp2 탄소(δ C 143.8, 140.6, 134.2, 132.3, 119.3), 4개의 메틴 sp3 탄소(δ C 84.1, 70.3, 67.1 41.4), 2개의 메틸렌 sp3 탄소(δ C 38.0, 34.4), 4개의 메틸 탄소(δ C 52.7, 24.9, 18.9, 8.3)로 구성된 25개의 탄소 시그널이 나타났다.
다음으로, COSY, HMBC 및 HSQC 데이터 분석을 통해서 수소와 탄소의 위치를 결정하였으며, 화학구조를 하기와 같이 동정하였다. 구체적으로 HMBC 스펙트럼에서 수소 시그널 H-1은 C-2, C-3, C-5, C-6 및 C-8과, H-7은 C-2, C-4, C-8 및 C-9과 상관관계가 나타나는 것을 확인하였고, COSY 스펙트럼에서 수소 시그널 H-1과 H-7 사이의 강한 상관관계를 나타남을 확인함으로서 트라이코쎄신(trichothecene)의 특징적인 바이사이클로[2.2.2]옥탄(bicyclo[2.2.2]octane) 고리구조를 확인하였다. HMBC 스펙트럼에서 메틸 수소 시그널(δ H 1.23)이 C-1, C-5 및 C-6와, 또 다른 메틸 수소 시그널(δ H 1.25)이 C-3, C-4, C-5 및 C-8과 상관관계를 나타냄을 확인함으로서 두 메틸기가 각각 C-6와 C-4에 위치함을 확인하였다. COSY 및 HMBC 분석을 통해enoyl-sorbyl 사슬구조(C-1', C-2', C-3', C-4', C-5' 및 C-6'로 구성)가 C-2에 위치함을 확인하였다.
화합물 1의 나머지 화학구조는 COSY 분석에서 수소시그널 H-10이 H-12와, H-14가 H-15와, H-15가 H-10과 상관관계를 나타냄을 확인하고, HMBC 분석에서 H-14와 C-10 및 C-12와 상관관계를 나타냄을 확인함으로서 규명하였다. 또한, 메톡시 수소(δ H 3.77), 메틸렌 수소H-12, 올레핀 수소 H-14가 카복실 탄소 시그널(δ C 167.2)과 상관관계를 나타냄을 확인함으로서 메틸에스터기가 C-13 위치에 결합해 있음을 확인하였다. HMBC 분석에서 H-15와 C-8 사이에 나타나는 상관관계를 확인함으로서 나머지 화학구조가 바이사이클로[2.2.2]옥탄(bicyclo[2.2.2]octane) 구조와 산소원자를 통해 연결되어 있음을 결정하였다.
입체화학구조 규명
한편, 화합물 1의 화학적 이동 값은 C-7, C10 및 C-15 제외하고 나머지 탄소시그널은 스피로소르비실리놀 C의 화학적 이동 값과 유사하였다. 따라서 화합물 1은 스피로소르비실리놀 C와 서로 입체이성질체 관계에 있다고 추정하였다. 화합물 1의 입체화학구조는 짝지움 상수와 NOESY 스펙트럼 분석을 통해서 결정하였다.
도 4a는 화합물 1의 주요 상관관계를 HMBC(화살표) 및 COZY(굵은 선)로 분석한 결과이며, 도 4b는 화합물 1의 주요 상관관계를 NOE(점선)으로 분석한 결과이고, 도 4c는 화합물 1(흑색점선, 1)과 스피로소르비실리놀 A(적색점선, 3), 스피로소르비실리놀 B(흑색실선, 4), 스피로소르비실리놀 C(적색실선, 5)의 CD 스펙트럼 결과이다.
H-2'과 H-3' 사이의 14.9 Hz의 짝지움 상수와 H-3'과 H-5' 사이의 NOESY 상관관계 확인을 통해서 에놀-소르브일(enol-sorbyl) 사슬구조의 C-2'/C-3' 및 C-4'/C-5' 이중결합은 각각 E, E 배위(configuration)임을 확인하였다. H-10과 H-11의 짝지움 상수(10.4 Hz)와 H-10과 H-15의 짝지움 상수(8.5 Hz)인 것과 H-11과 H-15 사이에 나타나는 NOESY 상관관계는 이들이 서로 반배향 관계에 있음을 나타낸다.
6-메틸, H-2' 및 H-1 사이의 NOESY 상관관계는 6-메틸과 C-2가 고우시배향(qauche orientation)이라는 것을 나타내고, 1S 배위임을 나타낸다. HMBC 스펙트럼에서 H-7a는 C-6과 H-7b는 C-2, C-9과 강한 상관관계가 있음을 확인하였으나, H-7a는 C-2, C-9과 상관관계가 없었다. 따라서 H-7a와 C-2가 고우시배향이고, H-7b와 C-9a가 이클립스배향(eclipse orientation)이며, 8S 배위임을 확인하였다. NOESY 분석 결과와 종합하여 C-10, C-11, C-15가 각각 10R, 11S, 15R 배위임을 확인하였다.
또한, 화합물 1의 비선광도 값 
= +142 (c = 0.05, 메탄올)은 스피로소르비실리놀 B 
= +428 (c = 0.05, 메탄올)나스피로소르비실리놀 C 
= +464 (c = 0.05, 메탄올) 보다는 스피로소르비실리놀 A의 
= +184 (c = 0.05, 메탄올)와 유사했다. 이러한 결과는 화합물 1이 8R 배위인 스피로소르비실리놀 A와 B와 달리 스피로소르비실리놀 C 처럼 8S 배위를 가지고 있음을 나타낸다.
도 4c의 CD 스펙트럼 분석에서 화합물 1과 스피로소르비실리놀 A~C는 350-360 nm에서는 Δε > + 24 값을 310-320 nm에서는 Δε < - 35 값을 나타내다. 이러한 결과는 이들 화합물이 모두 1R과 4S 배위 임을 나타낸다.
표 1에서 나타난 신규 화합물 1의 NMR 스펙트럼, CD 분석 및 문헌에 나타난 데이터를 종합하여, 트라이코쎄센(trichothecene) 골격의 화합물임을 확인하였다. 최종적으로 신규 화합물 1의 화학구조를 화학식 1로 표시되는 화학구조로 결정하고, 화합물 1을 스피로소르비실리놀 D(spirosorbicillinol D)로 명명하였다.
[화학식 1]
실시예
5-2. 화합물 2의 구조 규명
화합물 1의 방법과 동일한 방법으로 규조를 규명하였으며, NMR 결과는 다음과 같다.
화합물 2(= 2',3'-dihydro-epoxysorbicillinol): 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ H 5.48 (2H, m), 3.59 (1H, s), 2.65 (2H, m), 2.28 (2H, m), 1.69 (3H, s), 1.65 (3H, d, J = 6.8 Hz), 1.48 (3H, s); ESIMS m/z 289 [M+Na]+, m/z 265 [MH]+
상기 분리된 화합물 2는 에폭시소르비실리놀(epoxysorbicillinol)을 화학합성하는 과정에서 만들어진 예는 있으나, 천연물로 보고된 적은 없었으며, 본 출원인에 의해 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주로부터 처음 분리되었다.
실시예
5-3. 화합물 3의 구조 규명
화합물 3(= spirosorbicillinol A): 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 206.8, 195.6, 172.0, 168.3, 167.4, 143.8, 140.7, 139.6, 132.3, 129.0, 119.3, 111.1, 85.9, 84.3, 74.6, 70.6, 69.3, 67.1, 52.7, 41.4, 37.2, 30.5, 24.8, 18.9, 8.1; ESIMS m/z 511 [M+Na]+
실시예
5-4. 화합물 4의 구조 규명
화합물 4(=spirosorbicillinol B): 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 207.2, 196.2, 171.0, 167.9, 167.4, 143.2, 140.1, 139.3, 132.3, 128.8, 119.5, 111.4, 84.3, 82.6, 74.9, 71.3, 70.8, 70.7, 52.7, 41.2, 40.4, 31.4, 24.8, 18.9, 8.8; ESIMS m/z 511 [M+Na]+
실시예
5-5. 화합물 5의 구조 규명
화합물 5(= spirosorbicillinol C): 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 207.2, 196.1, 171.2, 167.9, 167.3, 143.3, 140.2, 134.2, 132.3, 130.8, 119.5, 111.2, 83.7, 82.9, 74.9, 74.9, 70.9, 67.1, 52.7, 41.2, 40.2, 34.0, 24.8, 18.9, 8.2; ESIMS m/z 511 [M+Na]+
실시예
5-6. 화합물 6의 구조 규명
화합물 6(= bisvertinolone): 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 201.2, 197.8, 193.1, 186.3, 169.6, 169.1, 148.4, 144.4, 139.9, 137.8, 132.4, 132.4, 123.8, 121.6, 110.7, 109.2, 105.1, 101.9, 80.5, -, 61.3, 55.7, 25.9, 22.9, 19.6, 19.2, 18.8, 7.3; ESIMS m/z 535 [M+Na]+
실시예
5-7. 화합물 7의 구조 규명
화합물 7(= bisorbicillinol): 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ H 7.24 (2H, dt, J = 15.0, 11.2 Hz), 6.15-6.50 (6H, m), 3.67 (1H, s), 3.41 (1H, s), 1.90 (6H, m), 1.62 (3H, s), 1.43 (3H, s), 1.21 (3H, s), 1.15 (3H, s); ESIMS m/z 519 [M+Na]+ , 495 [M-H]-
실시예
5-8. 화합물 8의 구조 규명
화합물 8(= bisvertinoquinol): 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ H 7.23 (1H, m), 6.36 (2H, m), 6.19 (1H, m), 5.46 (2H, m), 3.64 (1H, d, J = 2.4 Hz), 3.40 (1H, d, J = 2.4 Hz), 2.76 (1H, dt, J = 17.9, 7.2 Hz), 2.55 (1H, dt, J = 17.9, 7.2 Hz), 2.24 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.89 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.64 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.59 (3H, s), 1.47 (3H, s), 1.20 (3H, s), 1.14 (3H, s); ESIMS m/z 521 [M+Na]+ , 497 [M-H]-
실시예
5-9. 화합물 9의 구조 규명
화합물 9(= trichotetronine): 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 210.1, 202.4, 197.4, 179.5, 176.9, 169.6, 147.8, 145.1, 143.8, 140.8, 132.3, 131.6, 128.4, 119.5, 110.0, 97.5, 84.4, 75.8, 63.5, 52.7, 43.9, 43.4, 24.2, 23.5, 19.1, 18.9, 11.3, 6.5; ESIMS m/z 519 [M+Na]+, 496 [M-H]-
실시예
5-10. 화합물 10의 구조 규명
화합물10(= trichodimerol): 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ H 7.28 (2H, dd, J = 14.8, 11.0 Hz), 6.37 (2H, ddd, J = 14.8, 11.0, 2.0 Hz), 6.31 (2H, d, J = 14.7 Hz), 6.21 (2H, dq, J = 14.1, 6.7 Hz), 3.08 (2H, s), 1.89 (6H, d, J = 6.8 Hz), 1.37 (6H, s), 1.35 (6H, s); ESIMS m/z 519 [M+Na]+, 495 [M-H]-
실시예
5-11. 화합물 11의 구조 규명
화합물 11(= epoxysorbicillinol): 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ H ddd.13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 194.4, 188.7, 175.7, 147.3, 144.4, 131.5, 124.4, 107.8, 70.4, 63.7, 62.7, 26.1, 19.0, 7.9; ESIMS m/z 287 [M+Na]+
실시예
5-12. 화합물 12의 구조 규명
화합물 12(= oxosorbicillinol): 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 198.6, 192.6, 185.6, 173.8, 145.7, 141.9, 132.4, 124.8, 105.9, 76.5, 28.8, 19.0, 7.3; ESIMS m/z 287 [M+Na]+, 263 [M-H]-
실시예
5-13. 화합물 13의 구조 규명
화합물 13(= cyclonerodiol): 13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ C 132.0, 125.9, 82.0, 75.5, 55.4, 45.5, 42.1, 41.4, 26.1, 25.9, 25.1, 24.7, 23.7, 17.7, 15.4
위 살핀 바와 같이, NMR 스펙트럼과 문헌에 나타난 데이터를 종합하여 분리한 13종의 화합물 중 1종을 신규 화합물로 나머지 12종을 알려진 화합물로 동정하였다. 수득된 신규 화합물 1을 스피로소르비실리놀 D(spirosorbicillinol D)로 명명하였고, 알려진 12종은 각각 화합물 2는 2',3'-디히드로-에폭시소르비실리놀(2',3'-dihydro-epoxysorbicillinol), 화합물 3은 스피로소르비실리놀 A(spirosorbicillinol A), 화합물 4는 스피로소르비실리놀 B(spirosorbicillinol B), 화합물 5는 스피로소르비실리놀 C(spirosorbicillinol C), 화합물 6은 비스베르티놀론(bisvertinolone), 화합물 7은 비소르비실론(bisorbicillinol), 화합물 8은 비스베르티노퀴놀(bisvertinoquinol), 화합물 9는 트리코테트로닌(trichotetronine), 화합물 10은 트리코다이머롤(trichodimerol), 화합물 11은 에폭시소르비실리놀(epoxysorbicillinol), 화합물 12는 옥소소르비실리놀(oxosorbicillinol), 화합물 13은 사이클로네로디올(cyclonerodiol)로 동정하였다.
분리한 화합물의 구조는 하기 화학식 1 내지 화학식 13과 같다.
시험예
1.
트리코더마
롱기브라키아툼
SFC100166
균주의
배양여액을
유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의
식물병
방제효과 평가
온실 조건에서 실시예 2에서 제조한 식물병 방제 조성물을 6종의 식물병, 구체적으로 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina) 및 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)에 처리하여 방제효과가 있는지 확인하였다. 무처리 대조군은 5%(v/v) 메탄올 및 0.025%(w/v) 트윈 20을 함유하는 증류수로 처리하였다.
벼 도열병
벼 도열병은 2-3엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae KACC 46552)의 포자 현탁액(5×105 spores/mL)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후, 25℃ 상대습도 80%의 항온항습실에서 4일간 재배하여 발병을 유도하였다.
토마토 역병
토마토 역병은 3-4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans KACC 48738)의 유주자낭(2×104 sporangia/mL)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 20℃의 습실상에서 2일간 습실처리하고, 20℃의 항온실에서 2일간 재배하여 발병을 유도하였다.
토마토 잿빛곰팡이병
토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3-4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea KACC 48736)의 포자 현탁액(5×105 spores/mL)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 재배하여 발병을 유도하였다.
밀
붉은녹병
밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 트리티시나(Puccinia triticina, 한국화학연구원)의 포자를 250 μg/mL의 트윈 20 용액에 0.67 g spores/L의 양으로 현탁하고 분무 접종하고, 20℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 재배하여 발병을 유도하였다.
보리 흰가루병
보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 블루메리아 그래미니스 포메 스페살리스 홀데이(Blumeria graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 재배하여 발병을 유도하였다.
고추 탄저병
고추 탄저병은 고추 3-4엽기 유묘에 고추 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes KACC 48737)의 포자 현탁액(4×105 spores/mL)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리한 후에 항온항습실(25℃, 상대습도 80%)에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다.
평가 방법
토마토 잿빛곰팡이병과 고추 탄저병은 접종 3일 후, 토마토 역병은 접종 4일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후 그리고 밀 붉은녹병과 보리 흰가루병은 접종 7일 후에 잎에 발생한 병반면적율(%)을 조사하였다.
상기로부터 얻은 병반면적율(%)을 이용하여 하기 수학식 1에 따라 방제가(%)를 계산하였다. 수득된 방제가는 표 2에 나타내었다.
[수학식 1]
| 대상병 | RCB | TGM | TLB | WLR | BPM | PAN |
| 방제가(%) | 44 | 85 | 90 | 27 | 25 | 15 |
약어 : RCB, 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae); TGM, 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea); TLB, 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans); WLR, 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina); BPM, 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei); PAN, 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주의 배양여액은 식물병에 대한 방제활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대하여 85% 내지 90%의 우수한 방제효과를 나타내었으며, 그 외에도 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 고추 탄저병을 각각 44%, 27%, 25%, 15% 방제효과를 나타내어 생물 방제제로서의 가능성을 입증하였다.
시험예
2.
트리코더마
롱기브라키아툼
SFC100166
균주의
배양여액의
용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물의 식물병 방제효과 평가
온실 조건에서 실시예 3에서 제조한 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주의 배양여액의 용매 분획물 3종(EA, BuOH, 물)을 포함하는 식물병 방제 조성물을 시험예 1과 동일한 방법으로 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina) 및 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)에 처리하여 방제효과가 있는지 확인하였다. 대조군은 5%(v/v) 메탄올 및 0.025%(w/V) 트윈 20을 함유하는 증류수로 처리하였다. 시험예 1과 동일한 평가방법으로 병반면적율(%)을 얻고, 수학식 I에 따라 방제가(%)를 계산하여 표 3에 나타내었다.
| 구분 |
방제가(%) | |||||
| RCB | TGM | TLB | WLR | BPM | PAN | |
| EA 분획물 | 88 | 95 | 100 | 60 | 0 | 60 |
| BuOH 분획물 | 25 | 80 | 100 | 33 | 0 | 35 |
| 물 분획물 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
분획물 농도: 1000 μg/mL
약어 : RCB, 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae); TGM, 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea); TLB, 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans); WLR, 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina); BPM, 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei); PAN, 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes)
표 3에 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트(EA) 분획물은 1000 μg/mL의 처리 농도에서 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대해 방제 효과가 있는 것이 확인되었으며, 특히, 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대해서는 95% 이상의 탁월한 방제 효과가 있는 것으로 나타났다.
한편, 부탄올(BuOH) 분획물 역시 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대해서는 각각 80%, 100%의 탁월한 방제 효과가 있는 것으로 나타났으며, 벼 도열병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대해서도 방제 효과가 있는 것으로 나타났다.
한편, 물 분획물은 테스트한 6종의 식물병에 대해 방제 활성이 없는 것으로 나타났으며, 배양여액과 달리 분획물의 경우 보리 흰가루병에 대해 방제 활성을 나타내지 않는 것이 관찰되었다.
위와 같은 결과로부터, 트리코더마 롱기브라키아툼 SFC100166 균주 배양여액에서 식물병원균에 살균 활성을 나타내는 물질은 수용성이 아닌, 비극성 물질인 것으로 확인되었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물은 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대해 모두 매우 높은 수준의 방제효과를 나타내었으며, 에틸아세테이트 분획물의 경우, 벼 도열병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대한 방제효과가 향상되어 배양여액의 낮은 방제효과를 높은 수준으로 끌어올리는 것으로 확인되었다.
시험예
3.
트리코더마
롱기브라키아툼
SFC100166
균주의
배양여액의
용매 분획물로부터 분리된 화합물의 식물병원성 곰팡이 및 세균에 대한 살균활성 평가
트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주의 배양액으로부터 분리한 13종 화합물의 식물병원성 곰팡이인 배추과 작물 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerinum), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans) 및 식물병원성 세균인 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수 뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 호접란 무름병균(Dickeya chrysanthemi), 채소 무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 가지과 작물 풋마름병균(Ralstonia solanacearum), 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni)에 대한 억제활성을 96-well plate를 사용한 액체배지미량희석법(broth micro-dilution method)으로 평가하여 최소억제농도인 MIC(minimum inhibitory concentration) 값을 구하였다.
배추과 작물 검은무늬병균(A. brassicicola)와 시들음병균(F. oxysporum), 인삼 뿌리썩음병균(C. destructans)은 PDA 배지에 접종하고 25℃에서 10일간 배양하여 형성된 포자를 실험에 사용하였다.
잿빛곰팡이병균(B. cinerea)와 감자/토마토 역병균(P. infestans)은 각각 PDA 배지와 oatmeal agar 배지에 접종하여 20℃에서 6일간 배양한 다음 하루 14시간 광처리 조건에서 4일간 배양하여 형성된 포자를 실험에 사용하였다.
고추 탄저병균(C. coccodes)과 벼 도열병균(M. oryzae)는 오트밀 아가(oatmeal agar) 배지에 접종하여 7일간 25℃에서 배양한 다음 균사를 제거하고 항온항습실(25℃, 상대습도 80%)에서 2일간 하루 12시간 광처리하여 포자형성을 유도하였다.
식물병원성 세균의 경우에는 TSB(tryptic soy broth) 배지에 접종한 후, 키위 궤양병균(P. syringae pv. actinidiae)과 복숭아 세균성구멍병균(X. arboricola pv. pruni)은 25℃에서 나머지 세균은 30℃에서 2일 동안 진탕배양(150 r/min) 하였다. 실험에 사용한 곰팡이는 PDB 배지를 이용하여 포자를 수확하고 이를 4겹 거즈(gauze)로 걸러서 포자현탁액을 제조하였고, 세균은 TSB 배지에 희석하여 세균현탁액을 제조했다.
최종적으로 100 μL 웰에 1000개의 곰팡이 포자 또는 세균이 포함되도록 하였고, 메탄올 추출물이 각각 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 포함되도록 분주하였다. 이때, 메탄올의 함량은 1%를 초과하지 않았다. 1%의 메탄올만 첨가한 것을 무처리구로 사용하였고, 농도별로 3회 반복하여 실험하였다. 이들을 20℃ 또는 25℃에서 2일 내지 3일 배양한 후 곰팡이 및 세균의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도(MIC, minimum inhibitory concentration)로 결정하였다. 실험 결과를 표 4에 나타내었다.
| 화합물 | 최소억제농도(μg/mL) | ||||||||||
| Alt | Bot | Col | Fus | Mag | Phy | Cla | Cyl | Aci | Bur | Ral | |
| 1 | 400 | ||||||||||
| 2 | 400 | ||||||||||
| 3 | 400 | ||||||||||
| 4 | 400 | ||||||||||
| 5 | 400 | ||||||||||
| 6 | 100 | 12.5 | 400 | 50 | 6.3 | 50 | 25 | 50 | 400 | ||
| 7 | 400 | 200 | 100 | 400 | |||||||
| 8 | 200 | 200 | |||||||||
| 9 | |||||||||||
| 10 | 200 | ||||||||||
| 11 | 200 | 400 | 200 | 50 | |||||||
| 12 | 400 | 200 | 100 | 25 | 400 | 200 | |||||
| 13 | 400 | 400 | |||||||||
약어: 배추과 작물 검은무늬병균(Alt, Alternaria brassicicola); 잿빛곰팡이병균(Bot, Botrytis cinerea); 고추 탄저병균(Col, Colletotrichum coccodes); 시들음병균(Fus, Fusarium oxysporum); 벼 도열병균(Mag, Magnaporthe oryzae); 감자/토마토 역병균(Phy, Phytophthora infestans); 오이 검은별무늬병균(Cla, Cladosporium cucumerinum); 인삼 뿌리썩음병균(Cyl, Cylindrocarpon destructans); 식물병원성 세균인 호접란 세균성갈색점무늬병균(Aci, Acidovorax avenae subsp. cattleyae); 세균성벼알마름병균(Bur, Burkholderia glumae); 가지과 작물 풋마름병균(Ral, Ralstonia solanacearum)
표 4에 나타난 바와 같이, 화합물 9는 방제 활성이 없는 것으로 나타났으나, 화합물 1 내지 8 및 화합물 10 내지 13은 6.3-400 μg/mL의 농도 범위에서 식물병원성 곰팡이인 배추과 작물 검은무늬병균(A. brassicicola), 잿빛곰팡이병균(B. cinerea), 고추 탄저병균(C. coccodes), 시들음병균(F. oxysporum), 벼 도열병균(M. oryzae), 감자/토마토 역병균(P. infestans), 오이 검은별무늬병균(C. cucumerinum), 인삼 뿌리썩음병균(C. destructans) 및 식물병원성 세균인 호접란 세균성갈색점무늬병균(A. avenae subsp. cattleyae), 세균성벼알마름병균(B. glumae), 가지과 작물 풋마름병균(R. solanacearum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병원균의 생장을 억제하는 효능을 나타내는 것으로 나타났다.
한편, 화합물 9 및 10을 제외한 나머지 11종 화합물은 모두 감자/토마토 역병균(P. infestans)에 대하여 살균 활성을 나타냈고, 이 중 화합물 6, 11, 12는 각각 6.3, 50, 25 μg/mL의 최소억제농도(MIC)를 나타내어 감자/토마토 역병균(P. infestans) 방제에 특히 효과적임을 확인하였다. 그리고 스피로소르비실리놀 계열 화합물(신규 화합물 1 및 화합물 3-5)은 400 μg/mL의 처리농도에서 감자/토마토 역병균(P. infestans)의 생장을 완전히 억제하는 뛰어난 방제 활성을 나타냈다.
특히, 화합물 6은 6.3-25 μg/mL의 농도 범위에서 감자/토마토 역병균(P. infestans), 고추 탄저병균(C. coccodes), 인삼 뿌리썩음병균(C. destructans)의 생장을 완전히 억제했고, 50-100 μg/mL의 농도 범위에서 배추과 작물 검은무늬병균(A. brassicicola), 오이 검은별무늬병균(C. cucumerinum), 벼 도열병균(M. oryzae) 및 호접란 세균성갈색점무늬병균(A. avenae subsp. cattleyae)의 생장을 완전히 억제하였을 뿐만 아니라, 400 μg/mL 처리농도에서는 시들음병균(F. oxysporum)과 세균성벼알마름병균(B. glumae)에도 살균활성을 나타내며 광범위한 항미생물 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
화합물 12는 감자/토마토 역병균(P. infestans)과 벼 도열병균(M. oryzae)에 대하여 각각 25 μg/mL과 100 μg/mL의 최소억제농도를 보여 우수한 살균활성을 나타내었고, 고추 탄저병균(C. coccodes), 배추과 작물 검은무늬병균(A. brassicicola), 인삼 뿌리썩음병균(C. destructans), 호접란 세균성갈색점무늬병균(A. avenae subsp. cattleyae)에 대하여 200-400 μg/mL 농도 처리에서 사멸효과를 나타내었다.
화합물 11은 감자/토마토 역병균(P. infestans)을 50 μg/mL의 최소억제농도를 보여 우수한 살균활성을 나타냈으며, 200-400 μg/mL 농도에서 잿빛곰팡이병균(B. cinerea), 고추 탄저병균(C. coccodes), 벼 도열병균(M. oryzae)을 완전히 죽이는 효과를 나타냈다.
시험예
4.
트리코더마
롱기브라키아툼
SFC100166
균주의
배양여액의
용매 분획물로부터 분리된 화합물의
식물병
방제효과 평가
본 발명에 따른 트리코더마 공기브라키아툼 SFC100166 균주의 배양여액의 용매 분획물로부터 분리된 화합물의 in vivo 식물병 방제활성을 평가하기 위해, 온실 조건에서 화합물 4, 6, 7 및 11의 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina)에 대한 방제활성을 평가하였다.
구체적으로 화합물 4, 6, 7 및 11을 각각 메탄올에 용해시키고, 250 μg/mL의 트윈 20 용액을 가하여 최종농도가 각각 125 μg/mL, 250 μg/mL 및 500 μg/mL가 되도록 조절하였으며, 모든 시료의 최종 메탄올 농도는 5%로 맞추었다. 대조군으로는 5% 메탄올과 250 μg/mL의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하였다. 각 식물병 당 4개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 이들 3가지 식물병에 대한 방제활성은 시험예 1에 기재된 방법에 따라 평가하였으며, 표 5 및 도 5a에 나타내었다. 하기 도 5a는 화합물 4, 6, 7, 11의 처리 농도에 따른 토마토 역병의 제어 효능결과이다.
| 화합물 | 처리농도 (μg/mL) |
방제가(%) | ||
| TGM | TLB | WLR | ||
| 화합물 4 |
500 | 0 | 71 | 0 |
| 250 | 0 | 14 | 0 | |
| 125 | 0 | 7 | 0 | |
| 화합물 6 |
500 | 92 | 96 | 60 |
| 250 | 50 | 71 | 33 | |
| 125 | 0 | 68 | 0 | |
| 화합물 7 |
500 | 38 | 82 | 0 |
| 250 | 0 | 71 | 0 | |
| 125 | 0 | 0 | 0 | |
| 화합물 11 |
500 | 25 | 75 | 0 |
| 250 | 15 | 64 | 0 | |
| 125 | 10 | 36 | 0 | |
약어 : TGM, 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea); TLB, 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans); WLR, 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticinia)
표 5 및 도 5a에 나타난 바와 같이, 토마토 역병(원인균: P. infestans)에 대하여 500 μg/mL의 농도 수준의 화합물 4, 6, 7 및 11 처리는 71% 내지 96%의 우수한 방제 효과를 나타내었다. 특히, 화합물 6은 방제 효과가 뛰어나, 낮은 농도수준인 125 μg/mL의 처리에도 68%의 높은 방제 효과를 나타내었으며, 화합물 11은 125 μg/mL 낮은 농도 처리에서도 36%의 방제 효과를 나타나기 시작했으며, 250 μg/mL의 처리에서는 64%의 방제 효과를 나타내었다.
한편, 토마토 잿빛곰팡이병(원인균: B. cinerea)에 대해서는 화합물 6, 7 및 11에서 방제 효과가 있는 것으로 나타났으며, 특히, 화합물 6은 방제 효과가 뛰어나 500 μg/mL의 처리 농도에서 92%의 방제 효능을 나타내었다.
밀 붉은녹병(원인균: P. triticina)에 대해서는 화합물 6이 방제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
방제 효과가 뛰어난 화합물 6을 농도별로 식물에 처리하고, 1일 후, 토마토 역병균(Phytophthora infestans)의 포자현탁액을 식물에 접종하여 토마토 역병을 유도한 뒤, 화합물 6에 의한 방제 효과를 확인하였으며, 이를 도 5b에 나타내었다. NC는 5% MeOH를 함유하는 0.025 % Tween 20 용액으로 처리한 음성대조군이며, PC는 화학살균제 dimethomorph(10 g/mL)으로 처리한 양성대조군이다. 도 5b에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 6의 처리는 알려진 토마토 역병균 화학살균제와 비교하여도 우수한 살균 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> Composition for controlling plant diseases comprising compound
lsolated from Trichoderma longibrachiatum as an active ingredient
and method of controlling plant diseases using the same
<130> KCT1-12
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Trichoderma longibrachiatum
<400> 1
tttgcctctg cccaacatct gtcgaccagg tggtctgcgt cgatggactt tttttcacca 60
ccccgctttc tcctacccct cctttgggcg acgcaaattt tttttgttgc gtttcgggtt 120
ttagtgggga tgcacctcca gcaaaccact atgctctgcc gccctctgct ctcgtctgca 180
acacctttgg cgcttgcgtc atcaaccttc caacagtctg cgcagcaatg ctaatcattt 240
tcccctcaac aggaagccgc cgaactcggc aagggttcct tcaagtacgc gtgggttctt 300
gacaagctca aggccgagcg tgagcgtggt atcaccatcg acattgccct ctggaagttc 360
gagactccca agtactatgt caccgtcatt ggtatgtttg atcccgtgca ctcattgcat 420
catcgccaca acaacatact aatgccctct gacagacgct cccggccacc gtgatttcat 480
ca 482
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF1 Forward
<400> 2
atgggtaagg argacaagac 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EF2 Reverse
<400> 3
ggargtacca gtsatcatgt t 21
Claims (11)
- 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
식물병원성 곰팡이에 대한 항진균 활성 또는 식물병원성 세균에 대한 살균활성을 갖는 것인, 식물병원균 방제용 조성물. - 제1항에 있어서,
식물병원균은 배추과 작물 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerinum), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans), 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수 뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina), 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 호접란 무름병균(Dickeya chrysanthemi), 채소 무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 가지과 작물 풋마름병균(Ralstonia solanacearum) 및 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 식물병 방제용 조성물. - 제1항에 있어서,
식물병원균 방제 활성을 나타내는 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물은 하기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것인, 식물병 방제용 조성물:
.
- 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양액으로부터 분리된 하기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 식물병 방제용 조성물:
.
- 제5항에 있어서,
상기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13으로 표시되는 화합물은 각각 독립적으로 배추과 작물 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerinum), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans), 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수 뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina), 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 호접란 무름병균(Dickeya chrysanthemi), 채소 무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 가지과 작물 풋마름병균(Ralstonia solanacearum) 및 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 식물병원균에 대해 항진균 활성 또는 살균활성을 나타내는 것인, 식물병 방제용 조성물. - 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 대사산물로부터 분리된 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물:
.
- 제1항에 있어서,
화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans)에 대해 살균 활성을 나타내는 것인, 화합물. - 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 식물, 종자, 토양, 종자의 보관장소 및 식물관리 작업자의 의류 또는 신발 중에서 선택되는 1종 이상에 처리하는 단계;를 포함하는 식물병 방제방법.
- 제9항에 있어서, 식물병은 배추과 작물 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerinum), 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 감자/토마토 역병균(Phytophthora infestans), 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수 뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 밀 붉은녹병균(Puccinia triticina), 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 호접란 무름병균(Dickeya chrysanthemi), 채소 무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 가지과 작물 풋마름병균(Ralstonia solanacearum) 및 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균에 감염되어 유발되는 식물병인, 식물병 방제방법.
- 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) SFC100166 균주(KACC 83038BP)의 배양여액의 에틸아세테이트 분획물; 부탄올 분획물; 및 상기 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물로부터 분리한 하기 화학식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 및 13의 화합물;로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 비료 조성물:
.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210084120A KR102670172B1 (ko) | 2021-06-28 | 트리코더마 롱기브라키아툼 균주로부터 유래된 살균 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020210084120A KR102670172B1 (ko) | 2021-06-28 | 트리코더마 롱기브라키아툼 균주로부터 유래된 살균 화합물을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법 |
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