KR20220166322A - 만능 줄기 세포 유래 혈관 평활근 세포의 생성 방법, 용도 및 이와 관련된 조성물 - Google Patents

만능 줄기 세포 유래 혈관 평활근 세포의 생성 방법, 용도 및 이와 관련된 조성물 Download PDF

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에모리 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 전구 줄기 세포로부터 혈관 평활근 유사 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 혈관 활성제에 반응하여 수축할 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 접촉시킨 다음, 콜라겐의 존재 하에 무혈청 혈관 평활근 세포 성장 배지에서 세포를 복제하는 단계, 및 카드헤린-2를 발현하는 복제된 세포를 정제하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 정제된 세포는 심혈관 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용된다.

Description

만능 줄기 세포 유래 혈관 평활근 세포의 생성 방법, 용도 및 이와 관련된 조성물
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 4월 9일에 출원된 미국 가출원 제63/007,698호의 이익을 주장한다. 본 출원의 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되어 있다.
연방 정부 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 HL127759 및 DK108245 하에 미국 정부 지원으로 이뤄졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
특허청 전자 출원 시스템(EFS-WEB)을 통해 텍스트 파일로 제출된 자료의 참조에 의한 통합
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며 이로써 참조로 명세서에 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 이름은 19072PCT_ST25.txt이다. 상기 텍스트 파일은 10 KB이며, 2021년 4월 8일에 생성되었고, EFS-web을 통해 전자적으로 제출되어 있다.
혈관 기능 장애는 전형적으로 심근 경색(MI) 및 말초 동맥 질환(PAD)과 같은 심혈관 허혈성 병태 이후에 발생한다. 이러한 질환은 종종 혈관의 죽상경화성 폐색을 수반하여, 낮은 혈액 순환 및 결국 조직 괴사를 유발한다. 따라서, 혈관 기능 장애의 결과를 관리하는 개선된 방법을 확인할 필요가 있다.
내피 세포 외에도, 혈관 평활근 세포(VSMC)가 혈관에 존재한다. VSMC는 스무텔린(SMTN) 및 평활근 미오신 중쇄의 발현을 특징으로 하는 수축성(분화된) 표현형으로 존재한다. 혈관 평활근 세포(VSMC)의 수축성의 상실 및 상피 표현형의 획득은 혈관 염증, 플라크 형성, 죽상동맥경화증, 재협착증 및 폐 고혈압과 같은 증식성 혈관 병리와 관련이 있다. 그러나, 혈청의 존재 하에 단리 및 배양되는 경우, VSMC는 증식성인 합성 표현형으로 지칭되는 덜 분화된 상태로 변환한다. 따라서, 수축성 표현형을 유지하기 위해 VSMC를 생성하고 유지하는 개선된 방법을 확인할 필요가 있다.
Cheung 등은 인간 혈관 평활근 서브타입을 생성하는 것을 보고한다. Nat Biotechnol. 2012, 30(2): 165-173. Patsch 등은 인간 만능 줄기 세포로부터 혈관 내피 및 평활근 세포의 생성을 보고한다. Nat Cell Biol 2015, 17:994-1003.
본원에 인용된 참고문헌은 선행 기술의 인정은 아니다.
본 개시내용은 전구체 줄기 세포로부터 혈관 평활근 유사 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 혈관 활성제에 반응하여 수축할 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 접촉시킨 다음, 콜라겐의 존재 하에 무혈청 혈관 평활근 세포 성장 배지에서 세포를 복제하는 단계, 및 카드헤린-2를 발현하는 복제된 세포를 정제하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 정제된 세포는 심혈관 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 만능 줄기 세포를 스무텔린(smoothelin) 및 평활근 미오신 중쇄를 발현하는 세포로 형질전환시키는 단계 및 카드헤린-2를 발현하는 세포를 정제하여 수축성 표현형의 카드헤린-2를 발현하는 혈관 평활근 유사 세포의 정제된 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 수축성 표현형의 혈관 평활근 유사 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 방법은 카드헤린-2를 발현하는 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 a) 만능 줄기 세포가 유도된 중배엽 유사 세포를 형성하는 조건 하에서, 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 중배엽 유도 성장 배지는 1) rho 관련 단백질 키나제 억제제, 2) 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제, 및 3) 염기성 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 것인 단계; 중배엽 유사 세포가 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 형성하는 조건 하에서, 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지는 1) 형질전환 성장 인자-베타, 2) 표피 성장 인자, 및 3) 혈소판 유래 성장 인자를 포함하는 것인 단계; c) 유도된 혈관 평활근 유사 세포가 서로 분리되어 분리되는 조건 하에서, 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 프로테아제 및/또는 콜라게나제와 접촉시켜 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계; d) 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하여 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계; e) 복제된 혈관 평활근 유사 세포가 유도된 혈관 평활근 유사 세포의 제2 배치(batch)를 형성하는 조건 하에서, 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지는 1) 형질전환 성장 인자-베타, 2) 표피 성장 인자, 및 3) 혈소판 유래 성장 인자를 포함하는 것인 단계; 및 f) 카드헤린-2를 발현하는 세포를 선택함으로써 유도된 혈관 평활근의 제2 배치를 정제하여, 정제된 카드헤린-2를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 혈관 평활근 유사 세포를 제조하는 무혈청 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 형질전환 성장 인자-베타의 농도는 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 형질전환 성장 인자-베타의 농도와 비교하여 증가된다.
특정 구현예에서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 혈소판 유래 성장 인자의 농도는 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 혈소판 유래 성장 인자의 농도와 비교하여 감소된다.
특정 구현예에서, rho 관련 단백질 키나제 억제제는 트랜스-4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-4-피리디닐사이클로헥산카르복스아미드(Y-27632) 또는 이의 염이다.
특정 구현예에서, 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제는 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴(CHIR-99021) 또는 이의 염이다.
특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 배아 줄기(ES) 세포 또는 유도된 만능 줄기(iPS) 세포이다.
특정 구현예에서, 상기 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 4일 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 5일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 상기 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 20일 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 21일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 상기 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 것은 15일 동안 복제하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 상기 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 것은 16일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 상기 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 25일 이상 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 26일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 정제된 카드헤린-2를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 콜라겐 및 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 정제된 카드헤린-2를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 카드헤린-2를 발현하는 세포를 선택하는 것은 세포를 항-카드헤린-2 항체와 접촉시키는 단계, 항체를 형광 항체로 마킹하는 단계, 및 형광 활성화 세포 분류에 의해 세포를 선택하는 단계 및 형광 활성화 세포 분류에 의해 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 세포를 포함하는 조성물 및 성장 배지에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 대상체로부터 유래된 유도된 만능 줄기 세포이다. 특정 구현예에서, 대상체는 심근 경색, 혈관 염증, 플라크 형성, 죽상동맥경화증, 재협착증 및 폐 고혈압으로 진단된다.
특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 카르바콜, 엔도텔린-1(ET-1) 또는 KCl과 같은 혈관 활성제에 반응하여 수축한다.
특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 내피 세포 또는 내피 유사 세포와 혼합되거나 조합하여 투여되어 내피 세포 또는 내피 유사 세포 단독의 투여와 비교하여 개선된 혈류 복원을 초래한다.
특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 내피 세포 또는 내피 유사 세포와 혼합되거나 조합하여 투여되어 모세혈관 유사 세포와 혼합되거나 조합하여 투여되어 모세관 유사 튜브를 생성한다.
도 1은 hiPSC로부터 VSMC를 생성하는 과정을 예시한다.
도 2는 분화 동안 hiPSC-VSMC의 유전자 발현 패턴에 대한 데이터를 보여준다.
도 3은 hiPSC-VSMC과 hAoSMC의 유전자 발현 패턴의 비교를 보여준다.
도 4는 57일에 CDH2 양성 hiPSC-VSMC에서의 감소된 만능성 관련 유전자 발현을 나타내는 데이터를 보여준다.
도 5는 63일에 VSMC 특이적 마커에 대해 양성인 hiPSC-VSMC의 백분율을 보여준다.
도 6a는 hiPSC-VSMC의 증가된 세포내 칼슘 플럭스(flux)를 나타내는 데이터를 보여준다.
도 6b는 hiPSC-VSMC의 증가된 수축성을 나타내는 데이터를 보여준다.
도 7은 HUVEC를 사용한 hiPSC-VSMC의 튜브 형성의 정량화를 보여준다.
도 8은 hiPSC-VSMC에서의 MMP2 및 MMP9 유전자 발현에 대한 데이터를 보여준다.
본 개시내용이 더 상세히 설명되기에 앞서, 본 개시내용은 기술된 특정 구현예에 제한되지 않으며, 따라서 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되므로 제한하는 것을 의도하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에도 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것처럼 참조로 본원에 포함되고, 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 참조로 본원에 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 전에 공개하기 위한 것이며, 본 개시가 사전 공개로 인해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 또한, 제공된 공개일은 실제 공개일과 상이할 수 있으므로 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 각각의 개별 구현예는 본 개시내용의 범위 또는 취지를 벗어나지 않으면서 임의의 다른 몇 가지 구현예의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 개별 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 개시내용의 구현예는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술에 속하는 의학, 유기 화학, 생화학, 분자 생물학, 약리학 등의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 점에 유의해야 한다.
"대상체"는 임의의 동물을 의미하지만, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 인간, 원숭이, 마우스 또는 토끼이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 및 "치료하는"은 대상체(예컨대, 환자)가 치유되고 질환이 근절되는 경우에 제한되지 않는다. 오히려, 본 개시내용의 구현예는 또한 단순히 증상을 감소시키고/거나 질환 진행을 지연시키는 치료를 고려한다.
용어 "평활근 α-액틴"과 "대동맥 평활근 액틴"은 염색체 10 상의 ACTA2의 유전자 생성물을 지칭한다. 호모 사피엔스 액틴 알파 2, 평활근(ACTA2), 전사체 변이체 1, mRNA는 NCBI 참조 서열: NM_001141945.2를 갖는다.
용어 "평활근 미오신 중쇄" 및 "SMHC"는 호모 사피엔스 염색체 16 상의 MYH11의 유전자 생성물을 지칭한다. 호모 사피엔스 미오신 중쇄 11(MYH11), 전사체 변이체 SM2B, mRNA는 NCBI 참조 서열: NM_001040113.2를 갖는다.
용어 "트랜스겔린(transgelin)" 및 "SM22-알파"는 호모 사피엔스(인간) 염색체 11 상의 TAGLN의 유전자 생성물을 지칭한다. 호모 사피엔스 트랜스겔린(TAGLN), 전사체 변이체 2, mRNA는 NCBI 참조 서열: NM_003186.5를 갖는다.
용어 "칼포닌 1(calponin 1)" 및 "CNN1"은 호모 사피엔스(인간) 염색체 19 상의 CNN1의 유전자 생성물을 지칭한다. 호모 사피엔스 칼포닌 1(CNN1), 전사체 변이체 1, mRNA는 NCBI 참조 서열: NM_001299.6을 갖는다.
용어 "칼데스몬 1(caldesmon 1)" 및 "CALDl"은 호모 사피엔스 염색체 7 상의 CALDl의 유전자 생성물을 지칭한다. 호모 사피엔스 칼데스몬 1(CALDl), 전사체 변이체 2, mRNA는 NCBI 참조 서열: NM_004342.7을 갖는다.
용어 "스무텔린(smoothelin)" 및 "SMTN"은 호모 사피엔스 염색체 22 상의 SMTN의 유전자 생성물을 지칭한다. 호모 사피엔스 스무텔린(SMTN), 전사체 변이체 4, mRNA는 NCBI 참조 서열: NM_001207017.1을 갖는다.
글리코겐 합성 효소 키나제-3(GSK-3)은 세린/트레오닌 키나제이다. 그것은 포스페이트 기를 그의 기질의 세린 또는 트레오닌 잔기로 전달한다. GSK-3 인산화는 대사(글루코스 조절), 세포 신호전달, 세포 수송, 세포자멸사 및 증식을 포함하는 생물학적 과정을 조절한다. "GSK-3 억제제"는 기질 인산화를 방해하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 GSK-3 억제제는 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴(CHIR99021); N-6-[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(1H-이미다졸-1-yl)-2-피리미디닐]아미노]에틸]-3-니트로-2,6-피리미딘아민(CHIR-98014); 3-(1,3-디하이드로-3-옥소-2H-인돌-2-일이덴)-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(Indirubin); (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO); (2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심(BIO-아세톡심); 3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온(SB216763); 3-[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일옥시]페놀(TWS119); 4-벤질-2-(나프탈렌-1-일)-[1,2,4]티아디아졸리딘-3,5-디온(Tideglusib); 3-[(3-클로로-4-하이드록시페닐)-아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온(SB415286); 3-아미노-6-[4-[(4-메틸-1-피페라지닐)설포닐]페닐]-N-3-피리디닐-2-피라진카르복스아미드(AZD2858); 2-하이드록시-3-[5-[(모르폴린-4-일)메틸]피리딘-2-일]-1H-인돌-5-카르보니트릴(AZD1080); N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아(AR-A014418); 3-[9-플루오로-1,2,3,4-테트라하이드로-2-(1-피페리디닐카르보닐)피롤로[3,2,1-jk][1,4]벤조디아제핀-7-일]-4-이미다조[1,2-a]피리딘-3-일-1h-피롤-2,5-디온(LY2090314); 및 3-(4-플루오로페닐에틸아미노)-1-메틸-4-(2-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온(IM-12) 또는 이의 염으로부터 선택된다.
Rho 관련 단백질 키나제(ROCK)는 세린-트레오닌 키나제이며, 혈관수축 및 혈관 리모델링을 매개하는 것을 포함하는 세포 현상에서 역할을 한다. ROCK은 작은 GTPase Rho의 다운스트림 효과기 단백질이다. "ROCK 억제제"는 기질 인산화를 방해하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 ROCK 억제제는 파수딜(fasudil); 리파수딜(ripasudil); 네타르수딜(netarsudil); N-[(3-하이드록시페닐)메틸]-N'-[4-(4-피리디닐)-2-티아졸릴]우레아(RKI-1447); 트랜스-4-[(lR)-l-아미노에틸]-N-4-피리디닐사이클로헥산카르복스아미드(Y-27632); 4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-2-메틸-6-옥소-l,4,5,6-테트라하이드로-3-피리딘카르복스아미드(GSK-429286); 및 4-(1-아미노에틸)-N-(1H-피롤로(2,3-b)피리딘-4-일)사이클로헥산카르복스아미드(Y-30141) 또는 이의 염으로부터 선택된다.
용어 "형질전환 성장 인자 β", TGF-β" 및 "TGF-beta"는 다양한 세포 유형에 의해 분비되고 정상 상피 세포에서 항상성을 조절하는 사이토카인을 지칭한다. 3개의 TGF-β 이소형이 있다. TGF-베타 이소형 1이 가장 두드러진다. 인간 재조합 TGF-β는 다음 서열을 갖는 112 aa를 함유하는 각각의 서브유닛과 단일 디설파이드 결합에 의해 연결된 25.0 kDa 단백질로서 상업적으로 이용가능하다.
Figure pct00001
용어 "염기성 섬유아세포 성장 인자" 또는 "bFGF"는 FGF 수용체(FGFR) 패밀리 구성원에 결합하는 β-트레포일(β-trefoil) 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 인간 재조합 bFGF는 다음 서열을 갖는 154개 아미노산 단백질의 형태로 상업적으로 이용가능하다:
Figure pct00002
용어 "표피 성장 인자" 및 "EGF"는 약 6 kDa인 단백질을 지칭한다. 인간 EGF 유전자는 표피와 다른 세포의 분열을 자극하는 기능을 하는 펩타이드를 생성하기 위해 단백질 분해적으로 처리되는 프리프로단백질을 코딩한다. 인간 재조합 EGF는 다음 서열을 갖는 54개 아미노산 단백질의 형태로 상업적으로 이용가능하다.
Figure pct00003
혈소판 유래 성장 인자(PDGF)는 PDGF-A 및 PDGF-B 사슬로 명명된 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 디설파이드 연결된 이량체이다. 3개의 자연 발생 PDGF는 PDGF-AA, PDGF-BB 및 PDGF-AB이다. 인간 재조합 PDGF-BB는 다음 서열을 갖는 2개의 β 사슬(총 218개의 아미노산)의 24.3 kDa 디설파이드 연결된 동종이량체로서 상업적으로 이용가능하다.
Figure pct00004
N-카드헤린 및 CD325로도 알려진 카드헤린-2(CDH2)는 칼슘 의존성 세포 접착 분자 패밀리에 속하는 막횡단 호모필릭(homophilic) 당단백질이다. 인간 재조합 CDH2는 다음 서열을 갖는 폴리펩타이드 사슬로서 상업적으로 이용가능하다.
Figure pct00005
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이계(allogeneic)"는 동일한 사람으로부터 유래되지 않기 때문에 유전적으로 다른 세포를 지칭한다. 동일한 사람으로부터 유래된 세포는 "동계(syngeneic)"로서 지정된다.
배아 줄기 세포(ESC)는 수정 5-7일 후에 발생하는 포유류 배반포(blastocyst)의 내부 세포 덩어리로부터 비롯된다. ESC는 정의된 조건 하에서 무기한으로 미분화된 상태를 유지하며 체외에서 배양되는 경우 이른바 배아체(embryonic body)로 분화한다. 만능성을 가지므로, 이들은 모든 세포 유형으로 분화할 수 있다. 조혈, 신경, 및 중간엽 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포(체세포) 는 하나를 초과하는 세포 유형이 되는 능력을 갖지만 임의의 세포 유형이 되는 능력은 없다.
유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)는 만능 단계로 되돌아가도록 재프로그래밍된 분화된 세포이다. 재프로그래밍된 완전 분화된 세포는 ESC 만능성의 유지에 관여하는 유전자, 예컨대, Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 및 이들의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 용어 "유도된 만능 줄기 세포"는 체세포 또는 성체 줄기 세포로부터 배아 줄기 세포(ESC) 유사 만능 상태로 재프로그래밍되는 세포를 지칭한다. 문헌[Takahashi et al. "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors," Cell, 2006, 126(4):663-676]을 참고한다. Park 등은 정의된 인자를 사용하여 인간 체세포를 만능성으로 재프로그래밍하는 것을 보고한다, 문헌[Nature, 2008, 451(7175): 141-146]. 따라서, 세포에서 iPSC를 제조하는 것은 전형적으로 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MyC의 트랜스 발현에 의해 달성될 수 있다. 콜로니가 나타나며 형태학적으로 ESC와 유사하다. 대안적으로, 특정 만능 줄기 세포는 4개의 모든 전사체보다 적은 전사체를 필요로 할 수 있으며, 예컨대, 제대혈 CD133+ 세포는 iPSC를 생성하기 위해 OCT4와 SOX2만 필요로 한다. iPSC 생성에 대한 추가 지침의 경우, 문헌[Gonzalez et al. "Methods of making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte," Nature Reviews Genetics, 2011, 12:231-242]을 참조한다.
유도된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타제, Oct 4, Sox2, Nanog 및/또는 다른 만능 촉진 인자를 발현한다. 유도된 만능 줄기 세포는 배아 세포와 완전히 동일한 것으로 의도되지 않는다. 유도된 만능 줄기 세포는 반드시 임의의 유형의 세포로 분화할 수 있는 것은 아니다. TRA-1-60, TRA-1-8 또는 이의 조합은 인간 iPSC를 확인하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 유도된 만능 줄기 세포가 성체 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포로부터 유도된다는 것을 고려한다. 이들 용어는 세포 집단의 배양된(자가 재생된) 자손을 포함한다. 용어 "중간엽 간질 세포" 또는 "중간엽 줄기 세포"는 플라스틱 부착 특성을 갖고 골수, 지방 조직, 제대 내의 와튼 젤리, 제대 혈관주위 세포, 제대혈, 양수, 태반, 피부, 치아 속질, 모유 및 활막으로부터 유래될 수 있는 중배엽 기원의 세포로 시험관내 분화할 수 있는 섬유아세포 또는 섬유아세포 유사 비조혈세포의 하위집단, 예컨대 중배엽 기원의 여러 세포, 예컨대 지방 세포, 조골 세포, 연골 세포, 골격 근세포 또는 내장 간질 세포로 분화할 수 있는 클론생성 능력을 갖는 섬유아세포 또는 섬유아세포 유사 세포를 지칭한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 유도된 만능 줄기 세포가 인간 지방 줄기 세포로부터 유래된다는 것을 고려한다. 문헌[Sun et al. Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106(37):15720-15725]은 환자로부터 새로 분리된 성인 인간 지방 줄기 세포(HASC)로부터 유도된 만능 줄기(iPS) 세포가 생성될 수 있음을 보고한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 유도된 만능 줄기 세포가 골수 유래 중간엽 간질 세포로부터 유래된다는 것을 고려한다. 골수 유래 중간엽 간질 세포는 전형적으로 골수 흡인물로부터 생체 외에서 컨플루언스(confluence)까지 확장된다. 특정 중간엽 간질/줄기 세포(MSC)는 핵심 마커 및 특성의 유사한 세트를 공유한다. 특정 중간엽 간질/줄기 세포(MSC)는 CD105, CD73 및 CD90에 대해 양성이고 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79α 또는 CD19, 및 HLA-DR 표면 마커에 대해 음성으로 정의될 수 있으며 플라스틱에 부착하는 능력을 가질 수 있다. 문헌[Dominici et al. "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells," The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 2006, 8(4):315-317]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "성장 배지"는 비타민, 아미노산, 무기 염, 완충액 및 연료, 예컨대 아세테이트, 석시네이트, 당류 및/또는 선택적으로 뉴클레오타이드와 같은, 단백질 생합성을 통해 세포 유지 및 성장을 촉진하는 구성요소를 포함하는 조성물을 지칭한다. 또한, 성장 배지는 pH 지시제로서 페놀 레드를 함유할 수 있다. 성장 배지 내의 구성요소는 혈청으로부터 유래되거나 성장 배지는 무혈청일 수 있다. 성장 배지는 선택적으로 알부민, 지질, 인슐린 및/또는 아연, 트랜스페린 또는 철, 셀레늄, 아스코르브산, 및 항산화제, 예컨대 글루타티온, 2-머캅토에탄올 또는 1-티오글리세롤로 보충될 수 있다. 성장 배지에서 고려되는 다른 고려되는 구성요소는 암모늄 메타바나데이트, 황산 구리, 염화 망간, 에탄올아민, 및 피루브산 나트륨을 포함한다. 성장 배지 내의 다른 고려되는 구성요소는 아스코르브산, L-알라닌, 황산 아연, 인간 트랜스페린, 알부민 및 인슐린을 포함한다.
최소 필수 배지(MEM)는 염화 칼슘, 염화 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 인산 나트륨 및 중탄산 나트륨, 필수 아미노산, 및 비타민: 티아민(비타민 B1), 리보플라빈(비타민 B2), 니코틴아미드(비타민 B3), 판토텐산(비타민 B5), 피리독신(비타민 B6), 엽산(비타민 M), 콜린, 이노시톨(원래는 비타민 B8로 알려짐)을 함유하는 성장 배지를 지칭하는 당업계의 용어이다. 다양한 성장 배지가 당업계에 알려져 있다.
둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 증가된 양의 비타민, 아미노산 및 글루코스와 함께 글리신, 세린 및 질산 철과 같은 추가적인 구성요소를 함유하는 성장 배지이다.
[표 1] - 둘베코 변형 이글스 배지의 조성
Figure pct00006
Figure pct00007
Ham's F-12 배지는 높은 수준의 아미노산, 비타민, 및 기타 미량 원소를 갖는다. 푸트레신 및 리놀레산이 제제에 포함된다. 하기 표 2를 참조한다.
[표 2] - Ham's F-12 배지의 조성
Figure pct00008
특정 구현예에서, 본 개시내용은 DMEM 및 Ham's F-12의 혼합물인 DMEM/F-12 배지를 사용하는 본원에 개시된 성장 배지를 고려한다. 특정 구현예에서, 성장 배지는 항미생물제 또는 항미생물제의 조합, 예컨대 항생제 페니실린, 스트렙토마이신 및 항진균제 암포테리신 B를 함유하는 항진균제를 함유할 수 있다.
인간 배아 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 존재 하에서, 예컨대 섬유아세포 공급기 층 상에서 또는 100 ng/mL 초과의 bFGF가 보충된 비조건 배지(UM)에서 배양될 수 있다. 지정된 성장 배지(TeSR1TM)는 인간 혈청 알부민, 비타민, 항산화제, 미량 미네랄, 특정 지질 및 클론 성장 인자가 보충된 DMEM/F12 베이스로 구성된다. TeSR 배지는 그 자체로 52개의 구성요소를 갖는 DMEM/F12 베이스 배지에 추가된 18개의 구성요소를 갖는다. TeSR1TM의 개별 구성요소의 목록은 문헌[Ludwig et al., Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions, Nature Biotechnology volume 24, pages185-187 (2006)]의 보충 물질의 관련 농도와 함께 보고된 바와 같이 하기에 제공된다.
무기염 황산 구리(CuSO4-5H2O)
염화 칼슘(무수) 황산 아연(ZnSO4-7H2O)
HEPES 암모늄 메타바나데이트(NH4VO3)
염화 리튬(LiCl) 황산 망간 일수화물(MnSO4-
염화 마그네슘(무수) H2O)
황산 마그네슘(MgSO4) NiSO4 6H2O
염화 칼륨(KC1) 셀레늄
중탄산 나트륨(NaHCO3) 나트륨 메타실리케이트 Na2SiO3 9H2O
염화 나트륨(NaCl) SnCl2
인산 나트륨, 이염기성(무수) 몰리브덴산, 암모늄염
인산 나트륨, 모노. (NaH2PO4-H20) CdCl2
CrCl3
미량 미네랄 AgNO3
질산 철(Fe(NO3)3-9H2O) AlCl3 6H2O
황산 철(FeSO4-7H2O) Ba (C2H3O2)2
CoCl2 6H2O L-글루타민
GeO2 글리신
KBr L-히스티딘-HCl-H2O
KI L-이소류신
NaF L-류신
RbCl L-리신 하이드로클라이드
ZrOCl2 8H2O L-메티오닌
에너지 기질 L-페닐알라닌
D-글루코스 L-프롤린
나트륨 피루브산 L-세린
지질 L-트레오닌
리놀레산 L-트립토판
리놀렌산 L-티로신 ZrOCl2 8H2O
리포산 L-발린
아라키돈산 비타민
콜레스테롤 아스코르브산
DL-알파 토코페롤-아세테이트 바이오틴
미리스트산 B12
올레산 콜린 클로라이드
팔미트산 D-칼슘 판토테네이트
팔미톨레산 엽산
스테아린산 i-이노시톨
니아신아미드
아미노산 피리독신 하이드로클로라이드
L-알라닌 리보플라빈
L-아르기닌 하이드로클로라이드 티아민 하이드로클로라이드
L-아스파라긴-H2O
L-아스파르트산 성장 인자 및 기타 단백질
L-시스테인-HCl-H2O GABA
L-시스틴 2HC1 피페콜산
L-글루탐산 bFGF
TGF 베타 1 페놀 레드
인간 인슐린 푸트레신-2HC1
인간 홀로-트랜스페린 티미딘
인간 혈청 알부민 글루타티온 2-머캅토에탄올
(환원됨) 플루로닉 F-68
기타 구성요소 트윈 80
하이포잔틴 Na
동물성 단백질(소 혈청 알부민(BSA) 및 Matrigel™) 및 클로닝된 제브라피쉬 염기성 섬유아세포 성장 인자(zbFGF)의 사용을 포함하는 배지에 대한 변형(mTeSRl)이 문헌[Ludwig et al. "Feeder-independent culture of human embryonic stem cells," Nature Methods, volume 3, pages 637-646 (2006)]에 보고되어 있다. Matrigel™ 매트릭스는 세포외 기질 단백질이 풍부한 종양인 엥겔브레스-홀름-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm, EHS) 마우스 육종으로부터 추출한 가용화된 기저막 제제이다. Matrigel™은 라미닌(주 구성요소), 콜라겐 IV, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴(entactin)/니도겐(nidogen) 및 여러 성장 인자, 예컨대 TGF-베타 1, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제를 포함하는 부분적으로 정의된 세포외 기질(ECM) 추출물이다. Braam 등은 Matrigel™ 또는 천연 및 재조합 비트로넥틴이 3개의 독립적인 인간 배아 줄기 세포주에서 지속적인 자가 재생 및 만능성을 지원하는 데 효과적이었음을 보고한다, Stem Cells, 2008, 26(9):2257-65.
Chen 등은 E8 기반 배지를 사용하여, 정의된 조건이 iPS 세포 유도 및 배양에 사용될 수 있음을 보고한다, Nat Methods, 2011, 8(5): 424-429. 인간 ES 및 iPS 세포는 NaHCO3으로 조정된 pH를 갖는 DMEM/F12에서 인슐린, 셀레늄, 트랜스페린, L-아스코르브산, bFGF 및 TGF-β(또는 NODAL)를 함유하는 배지에서 확장될 수 있다. NODAL(100 ng/ml) 또는 TGF-β1(2 ng/ml)의 첨가는 NANOG 발현 수준을 증가시켰고, 인간 ES 및 iPS 세포 모두의 일관된 장기 배양 안정성을 야기하였다. ROCK 억제제(HA100 또는 Y27632) 또는 블레비스타틴의 포함은 초기 생존을 개선하였고 클로닝을 지원하였으며, 이는 트랜스페린의 첨가에 의해 그리고 저산소 조건에서의 배양에 의해 더 개선되었다. 다수의 매트릭스 단백질, 예컨대 라미닌, 비트로넥틴 및 피브로넥틴은 인간 ES 세포 성장을 지원한다.
용어 "형광 활성화 세포 분류" 또는 "FACS"는 각 세포의 형광 특성에 기초하여, 세포의 혼합물을 2개 이상의 영역으로, 전형적으로 한 번에 하나의 세포씩, 분류하는 방법을 지칭한다. 이는 전형적으로 전하를 가하고 정전기장을 통과하는 움직임에 의해 분리함으로써 달성된다. 세포 표면 마커에 대한 에피토프를 갖는 형광 항체가 세포를 표시하기 위해 세포와 혼합될 수 있다. 전형적으로, FACS에서, 진동 메커니즘은 세포의 스트림이 개별 액적으로 부서지게 한다. 액적 형성 직전에, 유체 내의 세포는 세포의 형광을 측정하기 위한 영역을 통과한다. 전기 충전 메커니즘은 스트림이 액적으로 부서지는 지점에 구성된다. 형광 강도 측정에 기초하여, 액적이 스트림으로부터 부서질 때, 액적에 각각의 전하가 부과된다. 그 다음, 하전된 액적은 액적을 이들의 상대 전하에 기초하여 영역 내로 방향을 바꾸게 하는 정전기 편향 시스템을 통해 이동한다. 일부 시스템에서, 전하가 스트림에 직접 적용되고 액적 파쇄는 스트림과 동일한 부호의 전하를 유지한다. 다른 시스템에서, 전하가 액적에 반대 전하를 유도하는 도관에 제공된다.
본원에 개시된 단백질의 변이체는 당업자에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 컴퓨터 모델링을 사용하여 구조적 유사성을 갖는 기능하는 변이체를 예측할 수 있다. 고유 활성을 확인하는 시험은 문헌 또는 본 명세서에 명시된 절차를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 원하는 특성을 가질 것으로 예상되는 많은 작동가능한 변이체를 생산할 수 있음을 이해할 것이다. 유전자는 알려져 있으며, 구성원은 한 종에서 다른 종으로 상당한 상동성을 공유한다. 서열은 인간 및 마우스 서열 간의 차이에 의해 예시된 바와 같이 동일하지 않다. 일부는 보존된 치환이다. 일부는 보존된 치환이 아니다. 기능하는 변이체를 생성하기 위해, 당업자는 맹목적으로 무작위 조합을 시도하지 않고, 대신에 컴퓨터 프로그램을 활용하여 안정적인 치환을 만들 것이다. 당업자는 특정한 보존된 치환이 바람직할 것임을 알 것이다. 또한, 당업자는 전형적으로 진화적 보존 위치를 변경하지 않을 것이다. 문헌[Saldano et al. "Evolutionary Conserved Positions Define Protein Conformational Diversity," PLoS Comput Biol., 2016, 12(3):e1004775]을 참조한다.
어떤 그리고 얼마나 많은 아미노산 잔기가 생물학적 활성을 폐지하지 않고 치환, 삽입 또는 삭제될 수 있는지 결정하는 지침은 당업계에 널리 알려진 공개적으로 이용가능한 데이터베이스와 조합된 컴퓨터 프로그램, 예컨대, RaptorX, ESyPred3D, HHpred, Homology Modeling Professional for HyperChem, DNAStar, SPARKS-X, EVfold, Phyre, 및 Phyre2 소프트웨어를 사용하여 확인될 수 있다. 단백질 모델링, 예측 및 분석을 위한 Phyre2 웹 포털을 보고하는 Kelley 등. Nat Protoc., 2015, 10(6):845-858을 참조한다. 또한, 문헌[Marks et al., Protein structure from sequence variation, Nat Biotechnol, 2012, 30(11):1072-1080; Mackenzie et al., Curr Opin Struct Biol, 2017, 44:161-167; Mackenzie et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2016, 113(47), E7438-E7447 and Wei et al., Int. J. Mol. Sci., 2016, 17(12), 2118]을 참조한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 50% 초과, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 동일성을 갖는 본원에 개시된 폴리펩타이드 서열의 변이체를 사용하는 것을 고려한다. "서열 동일성"은 2개 이상의 핵산 또는 단백질 간의 관련성의 측정값을 지칭하며, 전형적으로 총 비교 길이에 대한 백분율로서 제공된다. 동일성 계산은 동일하고 이들의 각각의 더 큰 서열에서의 동일한 상대적 위치에 있는 아미노산 잔기를 고려한다. 동일성 계산은 기본 매개 변수를 사용하여 "GAP"(Genetics Computer Group, Madison, Wis.) 및 "ALIGN"(DNAStar, Madison, Wis.)와 같은 컴퓨터 프로그램에 함유된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 서열 "동일성"은 정렬의 2개의 서열 사이의 서열 정렬에서 정확히 일치하는 잔기의 수(백분율로 표시됨)를 지칭한다. 특정 구현예에서, 정렬의 백분율 동일성은 가장 짧은 서열 또는 오버행을 제외한 동등한 위치의 수 중 큰 것으로 나눈 동일한 위치의 수를 사용하여 계산될 수 있으며, 여기서 내부 갭은 동등한 위치로서 계산된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 GGGGGG(서열번호: 6) 및 GGGGT(서열번호: 7)는 5개 중 4개 또는 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 폴리펩타이드 GGGGT(서열번호: 8) 및 GGGAPPP(서열번호: 9)는 7개 중 6개 또는 85%의 서열 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, 임의의 고려되는 백분율 서열 동일성의 경우, 서열은 또한 동일한 백분율 이상의 서열 유사성을 가질 수 있는 것으로 고려된다. 백분율 "유사성"은 정렬의 2개의 서열 사이의 아미노산의 유사성, 예컨대 소수성, 수소 결합 전위, 정전기 전하의 정도를 정량화하는 데 사용된다. 이 방법은 특정 아미노산이 일치를 갖기 위해 동일할 필요가 없다는 점을 제외하면 동일성을 결정하는 것과 유사하다. 특정 구현예에서, 서열 유사성은 기본 파라미터를 사용하여 잘 알려진 컴퓨터 프로그램으로 계산될 수 있다. 전형적으로, 아미노산은, 예컨대 다음 아미노산 그룹에 따라, 유사한 특성을 갖는 그룹에 속하는 경우, 일치로 분류된다: 방향족-F Y W; 소수성-A V I L; 양전하-R K H; 음전하-D E; 극성-S T N Q.
인간 만능 줄기 세포로부터 평활근 세포의 생성
기능 장애 혈관은 심근 경색(MI) 및 말초 동맥 질환(PAD)과 같은 심혈관 허혈 병태에서 발견된다. 종종, 이러한 질환은 혈관의 죽상경화성 폐색을 수반하여, 낮은 혈액 순환 및 결국 조직 괴사를 야기한다. 환부에 더 많은 기능성 혈관을 도입하는 것은 허혈성 병태를 개선하고 삶의 질을 개선할 수 있다.
혈관 평활근 세포(VSMC)는 혈액 및 림프관 모두의 혈관구조의 중요한 구성요소이다. 고압 동맥은 다층 VSMC로 덮여 있는 반면, 정맥은 전형적으로 얼룩 무늬의 VSMC로 덮여 있다. 림프관은 VSMC로 거의 덮여 있지 않다. VSMC는 초기 혈관의 성숙과 안정화에 기여하여, 기능성 혈관을 야기한다.
예컨대, 피부 또는 혈액 세포로부터 유래된, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)는 다양한 유형의 체세포로 성장하고 분화하는 능력을 갖는다. 따라서, 화학적으로 정의된 조건에서 인간 iPSC(hiPSC)로부터 분화된 세포는 다양한 임상 응용분야를 위한 우수한 공급원이다. 그러나, 인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 hiPSC를 포함한 인간 만능 줄기 세포(hPSC)로부터 VSMC의 화학적으로 정의되고 임상적으로 호환되는 분화 조건이 필요하다. 게다가, VSMC에 대한 특정 표면 마커의 부재로 인해, hiPSC 및 HESC로부터 유래된 VSMC의 선택 및 정제는 여전히 어렵다.
인간 iPSC는 GSK3 억제 및 후속적으로 PDGF-BB와 함께 특정 성장 인자 TGF-β1에 노출 후 VSMC로 분화되었다. hiPSC로부터 유래된 VSMC는 TAGLN, CNN1, ACTA2, CALDl, SMTN 및 MYH11과 같은 VSMC 특이적 유전자 및 단백질을 발현한다.
기능적이기 위해, VSMC는 수축성 표현형을 나타내어야 한다. 수축성 VSMC으로부터 합성 VSMC로의 VSMC의 표현형 전환은 혈관구조의 병리학적 변화를 유발한다. G-액틴의 중합에 의한 F-액틴 형성은 성숙한 수축성 VSMC를 나타낸다. 혈청 반응 인자(SRF)의 보조 인자인 미오카르딘(myocardin) 관련 전사 인자-A(MRTFA)는 세포질과 핵 사이를 왕복하며, 이러한 MRTFA의 왕복은 세포질에서 G-액틴에 대한 그의 결합에 의존한다. F-액틴 중합된 G-액틴의 형성시, MRTFA는 G-액틴으로부터 방출된 다음, 핵으로 전위되어 SRF를 활성화시킨다.
매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)는 조직, 특히 혈관구조의 리모델링에서 중요한 역할을 한다. MMP는 세포외 기질(ECM)을 분해한다. ECM 외에도, MMP는 펩타이드 성장 인자 및 티로신 키나제 수용체, 세포 접착 분자, 사이토카인 및 케모카인뿐만 아니라 다른 MMP를 분해한다. MMP2 및 MMP9는 TGFβ, TGFβ 잠복 관련 단백질(이는 TGFβ의 프로도메인임) 및 잠복 TGFβ 결합 단백질로 구성된 비활성 세포외 복합체로부터 TGFβ를 방출한다. MMP2 및 MMP9 매개 TGFβ 활성화는 혈관신생을 유발한다.
SMC 내의 주요 카드헤린인 카드헤린 2(CDH2)는 랫트 혈관구조에서 발현되고 확인되었다. CDH2의 상향 조절은 인간 중간엽 줄기 세포(HMSC)로부터 SMC의 분화시 발생한다. CDH2는 주변세포와의 상호작용에 의한 내피 스프라우트(endothelial sprout)의 성숙과 신생혈관형성에 중요하다. 막횡단 CDH2로의 β-카테닌의 모집은 액틴 중합에 의해 조절되며, 이 과정은 SMC 수축에 중요하다. MMP9 및 MMP12에 의한 CDH2의 세포외 도메인의 절단은 VSMC에서 β-카테닌 신호전달 및 사이클린 D1 발현을 촉발하여, VSMC의 증식을 증가시킨다.
VSMC는 화학적으로 정의된 조건에서 hPSC로부터 생성되었다. hiPSC는 동물 공급기 무세포 조건에서 콜라겐 코팅된 디쉬 상에 플레이팅되었다. GSK 억제제 CHIR-99021 및 bFGF만이 중배엽 유도에 사용되었으며, 단지 3개의 성장인자 TGF-β1, PDGF-BB 및 EGF가 hiPSC로부터 VSMC의 분화에 사용되었다. VSMC를 효율적으로 생성하기 위해, Accutase™에 의한 분리 및 여과 후 10일에 세포의 재시딩을 수행하였다. Accutase™는 단백질분해 효소와 콜라겐용해 효소의 혼합물 및 세포 표면에서 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 중단시키지 않고 약한 분리제로 사용되는 Na4EDTA로 구성된다.
또한, 상이한 농도의 TGF-β1과 PDGF-BB를 갖지만 동일한 농도의 EGF를 갖는 2개의 상이한 VSMC 분화 배지가 사용되었다. 수축성 VSMC는 25일부터 증가된 농도의 TGF-β1(2.5 ng/ml에서 5.0 ng/ml로) 및 감소된 농도의 PDGF-BB(5.0 ng/ml에서 2.5 ng/ml로)를 갖는 VSMC 분화 배지 II에서 생성되었다. 또한, CDH2는 hiPSC-VSMC의 표면 상에서 선택 마커인 것으로 발견되었다. 선별 마커로서 CDH2에 의한 분화된 hiPSC-VSMC의 선택은 hiPSC로부터 효율적으로 분화되고 농축된 수축성 VSMC를 야기한다. 이러한 수축성 hiPSC-VSMC는 간단하고, 화학적으로 정의되고, 동물성 제품 무함유 조건에 의해 생성되었으며 이는 혈관구조의 리모델링 및 재생에서 치료적 잠재력을 보여준다.
사용 방법
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 접촉시킨 다음, 콜라겐의 존재 하에 무혈청 혈관 평활근 세포 성장 배지에서 세포를 복제하는 단계, 및 카드헤린-2를 발현하는 복제된 세포를 정제하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 정제된 세포는 심혈관 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 만능 줄기 세포를 스무텔린 및 평활근 미오신 중쇄를 발현하는 세포로 형질전환시키는 단계 및 카드헤린-2를 발현하는 세포를 정제하여 수축성 표현형의 카드헤린-2를 발현하는 혈관 평활근 유사 세포의 정제된 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 수축성 표현형의 혈관 평활근 유사 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 방법은 카드헤린-2를 발현하는 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 a) 만능 줄기 세포가 유도된 중배엽 유사 세포를 형성하는 조건 하에서, 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 중배엽 유도 성장 배지는 1) rho 관련 단백질 키나제 억제제, 2) 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제, 및 3) 염기성 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 것인 단계; 중배엽 유사 세포가 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 형성하는 조건 하에서, 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지는 1) 형질전환 성장 인자-베타, 2) 표피 성장 인자, 및 3) 혈소판 유래 성장 인자를 포함하는 것인 단계; c) 유도된 혈관 평활근 유사 세포가 서로 분리되는 조건 하에서, 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 프로테아제 및/또는 콜라게나제와 접촉시켜 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계; d) 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하여 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계; e) 복제된 혈관 평활근 유사 세포가 유도된 혈관 평활근 유사 세포의 제2 배치(batch)를 형성하는 조건 하에서, 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지는 1) 형질전환 성장 인자-베타, 2) 표피 성장 인자, 및 3) 혈소판 유래 성장 인자를 포함하는 것인 단계; 및 f) 카드헤린-2를 발현하는 세포를 선택함으로써 유도된 혈관 평활근의 제2 배치를 정제하여, 정제된 카드헤린-2를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 혈관 평활근 유사 세포를 제조하는 무혈청 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 형질전환 성장 인자-베타의 농도는 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 형질전환 성장 인자-베타의 농도와 비교하여 증가된다.
특정 구현예에서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 혈소판 유래 성장 인자의 농도는 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 혈소판 유래 성장 인자의 농도와 비교하여 감소된다.
특정 구현예에서, rho 관련 단백질 키나제 억제제는 트랜스-4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-4-피리디닐사이클로헥산카르복스아미드(Y-27632) 또는 이의 염이다.
특정 구현예에서, 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제는 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴(CHIR-99021) 또는 이의 염이다.
특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 배아 줄기(ES) 세포 또는 유도된 만능 줄기(iPS) 세포이다.
특정 구현예에서, 상기 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 4일 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 5일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 상기 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 20일 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 21일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 상기 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 것은 15일 동안 복제하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 상기 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 것은 16일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 상기 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 25일 이상 동안 접촉시키는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 26일 이하 동안이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 정제된 카드헤린-2(CDH2)를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 콜라겐 및 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 정제된 카드헤린-2(CDH2)를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 카드헤린-2(CDH2)를 발현하는 세포를 선택하는 것은 세포를 항-카드헤린-2 항체와 접촉시키는 단계, 카드헤린-2(CDH2)를 발현하는 세포 표면을 형광과 접합된 항체로 마킹하는 단계, 및 형광 활성화 세포 분류에 의해 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 세포를 포함하는 조성물 및 성장 배지에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 만능 줄기 세포는 대상체로부터 유래된 유도된 만능 줄기 세포이다.
특정 구현예에서, 대상체는 손상되고 협착된 동맥, 동맥류(aneurysm), 협심증, 부정맥, 확장된 좌심, 일시적 허혈성 발작, 뇌졸중, 치매, 신장 흉터, 신부전, 심근 경색, 혈관 염증, 플라크 형성, 죽상동맥경화증, 재협착, 폐 고혈압, 안구 고혈압, 망막증, 맥락막증, 시신경 병증, 녹내장 및 실명을 갖는 것으로 진단되거나 이의 위험에 있다.
특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 카르바콜 또는 KCl과 같은 혈관 활성제에 반응하여 수축한다.
특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 내피 세포 또는 내피 유사 세포와 혼합되거나 조합하여 투여되어, 내피 세포 또는 내피 유사 세포 단독의 투여와 비교하여 개선된 혈류 복원을 초래한다.
특정 구현예에서, 혈관 평활근 유사 세포는 내피 세포 또는 내피 유사 세포와 혼합되거나 조합하여 투여되어, 모세관 유사 튜브를 생성한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 인간 유도된 만능 줄기 세포로부터 생성된 혈관 평활근 세포를 단리하기 위한 바이오마커로서 CDH2를 사용하는 것에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 CDH2에 대한 특정 결합제(예컨대, CDH2 항체)가 CDH2에 결합하는 조건 하에서 평활근 세포를 함유하는 것으로 의심되는 세포의 샘플과 CDH2에 대한 특정 결합제를 혼합하고, 특정 결합을 측정 및/또는 검출하는 것을 고려한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 허혈성 병태를 치료하기 위한 조작된 혈관에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 내피 세포 및 혈관 평활근 유사 세포의 혼합물의 튜브가 시험관 내에서 생산된 후 이를 필요로 하는 대상체에 이식된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 생체 내에서 선택적으로 내피 세포와 조합된 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포를 투여하여 세포가 순환하고 허혈성 손상의 부위에 효과적이라는 것을 고려한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 선택적으로 내피 세포와 조합된 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포를 허혈성 손상 영역에 국소적으로 투여하는 것, 예컨대, 정맥, 동맥, 심장 또는 심장을 둘러싸거나 가까운 영역에 직접 주사함으로써 투여하는 것을 고려한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 허혈 영역에 직접 적용되는 hiPSC-VSMC를 사용하는 방법에 관한 것이다. VSMC는 인접한 초기 혈관에 국한되어 혈관 형성을 안정화시키는 것으로 고려된다. 혈관 형성의 안정화에서의 VSMC의 역할 외에도, 세포가 PDGF-BB 및 TGF-β1과 같은 간접 혈관신생 사이토카인과 함께 인큐베이션될 때, VEGF 및 bFGF와 같은 직접적인 혈관신생 인자를 발현한다. 저산소 조건에서, VSMC는 VEGF를 발현한다. MMP의 발현과 분비는 혈관신생 혈관 리모델링에서 다른 유익한 요인이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 생체외에서 혈관을 생성하고 대상체에게 이식하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 혈관은 선택적으로 튜브 또는 시트 형태의 내피 세포와 조합된 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포를 배양하거나 시트를 원통과 유사한 구조로 변형시킴으로써 생성된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 시트를 취하여 이를 허혈성 혈관구조에 국소적으로 적용하는 것을 고려한다.
특정 구현예에서, 생체내 혈관구조, 예컨대 정맥 또는 동맥을 추출하고, 혈관구조를 선택적으로 내피 세포와 조합된 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포와 접촉시킨 다음, 노출된 혈관구조를 대상체 내로 이식하는 것을 고려한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 선택적으로 내피 세포와 조합된 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포, 및 시험제를 접촉시킨다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포는 바람직하지 않은 심혈관 병태의 위험이 있는 대상체를 나타내는 혈관 결함 및/또는 유전적 프로파일을 갖는 대상체로부터 유래된 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래된다. 시험제가 예컨대, 대조제와 비교할 때, 표현형 변화를 유도하는지 여부를 관찰한다. 예를 들어, 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포를 사용하여 시험제의 존재 하에 수축성의 증가 또는 감소를 결정할 수 있다.
게놈 돌연변이가 대동맥 판막 상부 협착증(supravalvular aortic stenosis, SVAS), 윌리엄스-보이렌 증후군(Williams-Beuren syndrome, WBS), 허치슨 길포드 프로게리아(Hutchison Gilford Progeria, HGP) 증후군, 및 마르판 증후군(Marfan syndrome)과 관련된 선천성 심장 결함을 포함하는 환자 질환과 관련된 VSMC에 영향을 미치는 질환 모델이 있다. 따라서, 본원에 기재된 혈관 평활근 유사 세포는 이들 질환 또는 병태 중 하나 이상을 갖는 대상체로부터 유래된 유도된 만능 줄기 세포로부터 생산될 수 있다. 이후, 이들 병태 중 하나와 관련된 대상체로부터 유래된 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 혈관 평활근 유사 세포는 치료제를 확인하기 위해 약물 스크리닝 라이브러리에서 사용될 수 있다. 문헌[Granata et al. "An iPSC-derived vascular model of Marfan syndrome identifies key mediators of smooth muscle cell death," Nat Genet., 49, 97-109 (2017)]을 참조한다.
hiPSC-VSMC를 생성하기 위한 과정:
인간 유도된 만능 줄기 세포(hiPSC)를 5% CO2로 37℃에서 5% Matrigel™(Corning, Cat#354234) 상에서 mTeSRTMTM(STEMCELL Technologies, Cat#85850)에서 배양하였다. VSMC 분화를 위해, 3개의 상이한 배지인 중배엽 유도 배지, VSMC 분화 배지 I, 및 VSMC 분화 배지 II를 사용하였다. 이들 배지는 20% Knockout™ 혈청 대체물(KO-SR, Invitrogen, Cat #10828-028)을 함유하는 기저 배지에 소분자 및 성장 인자를 함유한다. 기저 배지에서, DMEM/F12(Invitrogen, Cat#11330057)는 항미생물제(Gibco, Cat# 15240-112), MEM NEAA(Gibco, Cat#11140076) 및 GlutaMax™(Gibco, Cat#35050079)로 보충되었다. hiPSC를 디스파제(Dispase, Gibco, Cat#17105-041)를 사용한 해리 후에 0.01% 콜라겐(STEMCELL Technologies, Cat#4902) 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다.
0일에, hiPSC를 Y-27632(STEMCELL Technologies, Cat#72304), 3 μM CHIR-99021(GSK 억제제)(Selleckchem, Cat#S1263), 및 bFGF(4 ng/ml)와 함께 20% Knockout™ 혈청 대체물을 함유하는 기저 배지에서 배양하여 중배엽 계통을 유도하였다. ROCK 억제제 Y-27632는 0일에만 사용하였다. 중배엽 유도 배지는 매일 교체하였다(도 1 참조).
4일에, 중배엽 유도 배지를 TGF-β1(2.5 ng/ml, PeproTech, Cat#100-21C), PDGF-BB(5 ng/ml, PeproTech, Cat#100-14B), EGF(20 ng/ml, R&D System, Cat#236-EG-200), 및 20% Knockout™ 혈청 대체물을 함유하는 VSMC 분화 배지 I로 대체하였다.
10일에, 세포를 Accutase(eBioscience, Cat#00-4555-56)에 의해 분리한 다음 세포 스트레이너(Cell Strainer; 70 pm 나일론 메쉬, Fisher Scientific, Cat#22363548)를 통해 여과한 후, 콜라겐 코팅된 플레이트 상에 재플레이팅하였다. VSMC 분화 배지 I은 매일 교체하였다.
25일부터, 세포를 TGF-β1(5 ng/ml), PDGF-BB(2.5 ng/ml), EGF(20 ng/ml), 및 20% Knockout™ 혈청 대체물을 함유하는 VSMC 분화 배지 II에서 배양하였다. VSMC 분화 배지 II는 매일 교체하였다.
50일에, CDH2 발현 세포를 4℃에서 PE 접합된 항 CDH2 항체(eBioscience, Cat#12-3259-42)로 세포를 표지한 후 FACS에 의해 분류하였다. 선택 후, CDH2 양성 세포를 VSMC 분화 배지 II에서 콜라겐 코팅된 플레이트 상에서 추가로 배양하였다. VSMC 분화 배지 II는 매일 교체하였다. 세포가 컨플루언스가 되었을 때, 세포를 3-4일마다 분할시켰다.
세포 변화의 평가
성장 인자를 사용한 VMSC의 수축성 표현형의 유지가 보고된다. 인간 ESC 및 iPSC로부터 VSMC의 분화는 간단하지 않다. VSMC를 ESC 및 iPSC를 포함한 인간 PSC로부터 생성하였다. 인간 PSC를 공급기 무세포 조건에서 유지시켰다. VSMC를 동물 혈청 보충제가 없는 화학적으로 정의된 조건에서 분화시켰다. 또한, CDH2 양성 선택은 농축된 수축성 VSMC를 초래한다.
Cheung 등(Nature Protocols, 2014)은 PDGF-BB(10 ng/ml) 및 TGF-β1(2 ng/ml)을 이용한 이들의 분화된 VSMC의 약 80%가 CNN1 및 MYH11 이중 양성임을 보고한다. 그러나, ACTA2, CNN1 및 TAGLN이 초기 SMC 마커임에도 불구하고, 적은 수의 세포는 CNN1 및 TAGLN 양성이다. Patsch 등(Nature Cell Biology, 2015)은 VSMC를 분화시켰고, 보고서는 ACTA2(48%), 미오신 IIB(96.99%) 및 TAGLN(100%) 양성 세포를 계수하였다. 미오신 IIB(MYH10)는 VSMC 마커가 아니다. 많은 수의 세포는 CD140b 양성이었다. 섬유아세포는 CD140b도 발현한다.
ACTA2, CNN1 및 TAGLN은 초기 평활근 세포 마커이다. TAGLN, CNN1, ACTA2, SMTN, CALD1, 및 MYH11과 같은 VSMC 특이적 유전자의 mRNA 발현 수준은 22일에 유의하게 증가되었다(도 2). 그러나, hiPSC-VSMC에서 VSMC 특이적 유전자의 이러한 mRNA 발현 수준은 ACTA2 및 SMTN을 제외하고 인간 대동맥 평활근 세포(hAoSMC)에서의 발현 수준과 유사하거나 높았다(도 3).
OCT4, SOX2, NANOG, 및 KLF4와 같은 만능성 관련 유전자의 발현은 CDH2 음성 분획에서 유의하게 높았지만, cMYC의 발현 수준은 CDH2 음성 및 양성에서 유사하였다(도 4). hiPSC-VSMC에서 F-액틴의 형성과 MRTFA의 발현은 49일에 면역형광 현미경에 의해 관찰되었다. 또한, 핵에서의 MRTFA의 국소화는 수축성 유전자 발현의 촉진을 나타낸다. CDH2 양성 hiPSC-VSMC에서 ACTA2, CNN1, SMTN 및 MYH11과 같은 수축성 VSMC 단백질의 발현은 58일에 관찰된다. BD LSRII에 의한 세포내 염색 후 유세포 분석법 분석은 63일에 hiPSC-VSMC에서 CNN1(95.23 ± 2.15), SMTN(95.37 ± 1.96) 및 MYH11(87.87 ± 0.94)의 발현을 보여준다(도 5). SMTN의 긴 이소형(SMTN-B)은 늦게 발현되는 혈관 평활근 세포 마커이다. 일차 세포에서 검출하는 것은 어렵다. SMTN의 발현은 일차 세포를 배양할 때 크게 감소되었다. 그러나, 인간 PSC로부터 유래된 VSMC(HPSC-VSMC)는 SMTN을 발현한다. SMTN의 긴 이소형(SMTN-B)의 발현 수준은 분화된 HPSC-VSMC에서 확인되었다.
카르바콜에 의한 Fluo4 형광의 급격한 증가는 hiPSC-VSMC에서 증가된 세포내 칼슘 플럭스(flux)를 나타낸다(도 6a). 또한, 유의하게 증가된 수축성이 카르바콜 및 KCl로 처리된 hiPSC-VSMC에서 관찰되었다. 카르바콜과 염화 칼륨으로 처리된 세포 사이에서도 유의한 차이가 관찰되었다(도 6b).
혈관신생의 맥락에서 hiPSC-VSMC의 치료 잠재력
미리 염색된 세포를 VEGFA(10 ng/ml)를 갖는 VSMC 분화 배지 I에서 감소된 성장 인자와 함께 Matrigel™ 상에서 인큐베이션하였다. HUVEC를 DiI(빨간색)로 미리 염색하고, hAoSMC 및 hiPSC-VSMC를 DiO(녹색)로 미리 염색하였다. 분기점을 그룹당 5개의 상이한 이미지로부터 정량하였다. 유의한 분기점을 갖는 튜브 형성은 hiPSC-VSMC가 HUVEC와 공동 배양되었을 때 관찰되었다. 분기점의 유의한 차이는 hiPSC-VSMC와 hAoSMC의 HUVEC와의 공동 배양 사이에서 관찰되지 않았다(도 7).
MMP는 혈관구조의 리모델링에 중요한 역할을 한다. hiPSC-VSMC에서의 MMP2 및 MMP9의 발현 수준을 결정하였다. hiPSC-VSMC는 hAoSMC와 비교하여 MMP2 및 MMP9의 유사한 수준의 mRNA를 발현한다(도 8).
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Pro Asn Ser Asn Asp Gly Leu Val Thr Val Val 275 280 285 Lys Pro Ile Asp Phe Glu Thr Asn Arg Met Phe Val Leu Thr Val Ala 290 295 300 Ala Glu Asn Gln Val Pro Leu Ala Lys Gly Ile Gln His Pro Pro Gln 305 310 315 320 Ser Thr Ala Thr Val Ser Val Thr Val Ile Asp Val Asn Glu Asn Pro 325 330 335 Tyr Phe Ala Pro Asn Pro Lys Ile Ile Arg Gln Glu Glu Gly Leu His 340 345 350 Ala Gly Thr Met Leu Thr Thr Phe Thr Ala Gln Asp Pro Asp Arg Tyr 355 360 365 Met Gln Gln Asn Ile Arg Tyr Thr Lys Leu Ser Asp Pro Ala Asn Trp 370 375 380 Leu Lys Ile Asp Pro Val Asn Gly Gln Ile Thr Thr Ile Ala Val Leu 385 390 395 400 Asp Arg Glu Ser Pro Asn Val Lys Asn Asn Ile Tyr Asn Ala Thr Phe 405 410 415 Leu Ala Ser Asp Asn Gly Ile Pro Pro Met Ser Gly Thr Gly Thr Leu 420 425 430 Gln Ile Tyr Leu Leu Asp Ile Asn Asp Asn Ala Pro Gln Val Leu Pro 435 440 445 Gln Glu Ala Glu Thr Cys Glu Thr Pro Asp Pro Asn Ser Ile Asn Ile 450 455 460 Thr Ala Leu Asp Tyr Asp Ile Asp Pro Asn Ala Gly Pro Phe Ala Phe 465 470 475 480 Asp Leu Pro Leu Ser 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Claims (19)

  1. 혈관 평활근 유사 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) 만능 줄기 세포가 유도된 중배엽 유사 세포를 형성하는 조건 하에서, 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 중배엽 유도 성장 배지는
    1) rho 관련 단백질 키나제 억제제,
    2) 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제, 및
    3) 염기성 섬유아세포 성장 인자
    를 포함하는 것인 단계;
    b) 중배엽 유사 세포가 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 형성하는 조건 하에서, 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지는
    1) 형질전환 성장 인자-베타,
    2) 표피 성장 인자, 및
    3) 혈소판 유래 성장 인자
    를 포함하는 것인 단계;
    c) 유도된 혈관 평활근 유사 세포가 서로 분리되는 조건 하에서, 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 프로테아제 또는 콜라게나제와 접촉시켜 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계;
    d) 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하여 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계;
    e) 복제된 혈관 평활근 유사 세포가 유도된 혈관 평활근 유사 세포의 제2 배치(batch)를 형성하는 조건 하에서, 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 단계로서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지는
    1) 형질전환 성장 인자-베타,
    2) 표피 성장 인자, 및
    3) 혈소판 유래 성장 인자
    를 포함하는 것인 단계; 및
    f) 카드헤린-2를 발현하는 세포를 선택함으로써 유도된 혈관 평활근 유사 세포의 제2 배치를 정제하여, 정제된 카드헤린-2를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계
    를 포함하는, 혈관 평활근 유사 세포를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 형질전환 성장 인자-베타의 농도는 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 형질전환 성장 인자-베타의 농도와 비교하여 증가되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 혈소판 유래 성장 인자의 농도는 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지 내의 혈소판 유래 성장 인자의 농도와 비교하여 감소되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, rho 관련 단백질 키나제 억제제는 트랜스-4-[(1R)-1-아미노에틸]-N-4-피리디닐사이클로헥산카르복스아미드(Y-27632) 또는 이의 염인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 글리코겐 합성효소 키나제-3 억제제는 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘-카르보니트릴(CHIR-99021) 또는 이의 염인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포는 배아 줄기(ES) 세포 또는 유도된 만능 줄기(iPS) 세포인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 4일 동안인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 중배엽 유도 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 5일 이하 동안인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 20일 동안인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 유도된 중배엽 유사 세포를 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 21일 이하 동안인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 것은 15일 동안인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 콜라겐 및 제1 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 분리된 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 것은 16일 이하 동안인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 25일 이상인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 복제된 혈관 평활근 유사 세포를 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지와 1일 이상 동안 접촉시키는 것은 26일 이하인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 방법은 정제된 카드헤린-2를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 콜라겐 및 제2 혈관 평활근 세포 성장 배지에 1일 이상 동안 노출시킴으로써 정제된 카드헤린-2를 발현하는 유도된 혈관 평활근 유사 세포를 복제하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 만능 줄기 세포를 혈관 스무텔린(smoothelin) 및 혈관 평활근 미오신 중쇄를 발현하는 세포로 형질전환시키는 단계 및 카드헤린-2를 발현하는 세포를 정제하여 혈관 평활근 유사 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 혈관 평활근 유사 세포를 생산하는 방법.
  17. 제16항의 방법에 의해 제조된 세포를 포함하는 조성물.
  18. 제1항에 기재된 방법에 의해 제조된 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 만능 세포는 대상체로부터 유래된 유도된 만능 세포인 방법.
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