KR20220165668A - 종양 스페로이드를 포함하는 미세유체칩 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2차원-3차원 결합 조직 또는 3차원 스페로이드 및 혈관의 구조 및 기능을 모사함으로써 종양 스페로이드에 적합한 환경을 제공하여, 체외에서 동물 모델을 대체하여 암 표적치료제 및 신약개발 등을 위한 모델로 이용될 수 있는 미세유체장치, 미세유체장치 내 세포 배양 방법, 및 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 2차원-3차원 결합 조직 또는 3차원 스페로이드 및 혈관의 구조 및 기능을 모사함으로써 종양 스페로이드에 적합한 환경을 제공하여, 체외에서 동물 모델을 대체하여 암 표적치료제 및 신약개발 등을 위한 모델로 이용될 수 있는 미세유체장치, 미세유체장치 내 세포 배양 방법, 및 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
약물의 효능 및 부작용을 검사하기 위한 실험 동물 모델 사용에 따른 윤리적 문제 및 이종 간의 차이점으로 인한 문제점을 해결하기 위해, 장기 조직을 칩 형태로 집적시킨 장기칩(Organ-on-a-chip)이 개발되었다. 장기칩은 작은 칩에 특정 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써, 해당 장기의 형태 및 생리적 특성을 모사하여 원하는 기능을 구현하는 기술이다. 이를 이용하여 특정 장기의 세포 거동 및 미세환경에서의 물리 화학적 반응의 메커니즘을 상세하게 연구할 수 있으며, 신약개발 및 독성평가 등을 위한 모델로 이용될 수 있다.
장기칩의 개발에 있어서, 기존의 2차원(two-dimensional(2D)) 세포 배양을 이용한 세포 배양 모델은 배양 접시(petri dish)를 이용하여 접시 바닥에 세포를 2차원으로 배양시키므로 많은 세포 타입의 조직 특이적 분화 기능들(tissue-specific differentiated functions)을 설명하지 못하거나 생체 내(in vivo)의 조직 기능과 약물 활성도를 정확하게 예측하지 못하는 문제점을 가진다.
특히, 이러한 2차원 세포 배양 모델의 기하학적 한계는 종양세포의 형성과 조직 내 거동 및 유전자 발현의 프로파일을 변동시킨다는 가능성이 있으며, 지속적인 영양 및 산소 공급, 또는 노폐물의 순환이 이루어지지 않는다는 점으로 인하여 살아있는 조직의 공간적 구조와 생화학적 복잡성을 잘 모사하는 3차원 세포 배양 기술과 이를 지속적으로 관류(perfusion) 배양할 수 있는 혈관 구조 모사에 대한 필요성이 높아지고 있다.
또한, 스페로이드를 이용한 3차원 모델은 생체 내 상태(situation)를 잘 모방하므로 생체 외 실험에서 방향적 성장과 세포간 연결의 복잡성을 구현할 수 있고, 분자 기반(molecular basis)의 조직 기능을 연구하는데 있어서 2차원 세포 배양 모델 대비 다양한 질병 상태의 신호기전(signaling pathway)과 대사, 세포 스트레스 및 약물 반응(drug responsiveness) 등을 포착하는데 유리하다.
한편, 반도체 공정 기술과 함께 발달한 미세유체공학 기술은 높은 정확도로 마이크로 단위의 규격을 가진 구조체를 대량 생산할 수 있도록 하였다. 특히 포토리소그래피 및 소프트리소그래피 기술은 반영구적몰드를 이용한 스탬핑(stamping)을 통해 손쉽게 미세채널 구조를 생산할 수 있도록 하였고, 이를 통해 인체의 혈관이나 장기의 세포층 등 미세 구조를 생체 외에서 모사하려는 시도가 있다.
기존의 연구는 포토리소그래피 또는 소프트리소그래피 기술을 이용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세채널과 다공성 막으로 이루어진 칩을 제작하고, 칩 내부에서의 세포 및 스페로이드 배양을 통해 종양 세포의 주변 환경 구조를 구현하는 형태로 수행되었다. 그러나, PDMS 재질로 제작한 미세유체 장기칩은 약물 또는 단백질들이 PDMS 표면에 흡착되어 소실되는 경우가 많이 발생한다는 단점 때문에 실제 제약산업에 적용하기 힘들다는 한계점이 존재하였다.
따라서, 본 발명자들은 기존의 PDMS를 이용한 미세유체 장기칩의 문제점을 개선하고, 채널 내 내피 세포와 종양 스페로이드의 3차원 배양을 통한 혈관 네트워크 형성을 통하여 관류의 실현 및 인체 내부와 유사한 미세유체장치를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 실험 동물 모델 사용에 따른 윤리적 문제 및 이종 간 차이점으로 인한 문제점을 해결하고, 채널 내 내피 세포와 종양 스페로이드의 3차원 배양을 통해 혈관 네트워크를 형성시킴으로써 2차원-3차원 결합 조직 또는 3차원 스페로이드 및 혈관의 구조 및 기능을 모사하는 미세유체장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면 채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하는, 미세유체장치를 제공한다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면 채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하는 미세유체장치 내 세포 배양 방법에 관한 것으로,
제1 중심채널을 포함하는 인서트, 및 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 조립하는 단계;
상기 인서트를 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면 채널을 포함하는 베이스에 조립하는 단계;
제2 세포를 상기 제2 중심채널에 주입하는 단계;
제1 세포를 상기 제1 중심채널에 주입하는 단계; 및
제1 유체를 상기 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널에 관류시키는 단계를 포함하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 미세유체장치를 이용하여 종양을 억제하거나 치료할 수 있는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 미세유체장치는 채널 내 종양 스페로이드 및 혈관 모사를 위한 내피 세포를 포함함으로써 생체 내 다양한 종양 세포 주변의 주요 구조 및 물질이동 현상을 모사할 수 있으며 항암 약물 효능평가에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 미세유체장치는 종양 스페로이드 주변의 나노 입자 분포에 대한 정밀한 정량화가 가능하며, 인서트가 베이스로부터 탈부착 가능하므로, 미세유체장치 내 포함된 종양 스페로이드를 손상없이 선택적으로 분리하여 분석에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 미세유체장치는 종양 스페로이드의 3차원 배양이 가능하여, 생체 내 세포의 공간적 구조와 생화학적 복잡성을 구현하여 조직 장벽의 구조 및 기능을 보다 잘 모사할 수 있다.
도 1 및 2는 미세유체장치의 단면도이다.
도 3은 미세유체장치의 투시도이다.
도 4 및 5는 미세유체장치의 분해도 및 결합도이다.
도 6은 세포를 포함하는 미세유체장치의 단면도이다.
도 7 및 8은 인서트와 베이스의 탈부착을 위한 구성 및 탈부착 방법을 나타낸 단면도이다.
도 9는 미세유체장치의 베이스 내 유체 흐름을 나타낸 단면도이다.
도 10 및 11은 인서트의 사시도이다.
도 12 및 13은 베이스의 평면도이다.
도 14는 베이스의 저면도이다.
도 15 및 16은 인서트의 탈부착을 위한 구성 및 탈부착 방법을 나타낸 사시도 및 단면도이다.
도 17 및 18은 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 a-a'단면도 및 확대 단면도이다.
도 19 및 20은 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 정면도 및 저면도이다.
도 21은 인서트에 포함된 미세채널 내의 유체 흐름을 나타내는 사시도이다.
도 22는 베이스에 포함된 미세채널 내의 유체 흐름을 나타내는 단면도이다.
도 23 및 24는 커버의 사시도이다.
도 25는 다공성 막을 통과한 인간 혈관 내피 세포(RFP-HUVEC)가 혈관을 생성하여 삼차원 피브린젤(Fibrin ECM) 내부에서 배양한 삼차원 종양 스페로이드의 상단부부터 하단부 방향으로 이동하는 형태를 나타낸다(Scale bar = 200 μm).
도 3은 미세유체장치의 투시도이다.
도 4 및 5는 미세유체장치의 분해도 및 결합도이다.
도 6은 세포를 포함하는 미세유체장치의 단면도이다.
도 7 및 8은 인서트와 베이스의 탈부착을 위한 구성 및 탈부착 방법을 나타낸 단면도이다.
도 9는 미세유체장치의 베이스 내 유체 흐름을 나타낸 단면도이다.
도 10 및 11은 인서트의 사시도이다.
도 12 및 13은 베이스의 평면도이다.
도 14는 베이스의 저면도이다.
도 15 및 16은 인서트의 탈부착을 위한 구성 및 탈부착 방법을 나타낸 사시도 및 단면도이다.
도 17 및 18은 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 a-a'단면도 및 확대 단면도이다.
도 19 및 20은 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 정면도 및 저면도이다.
도 21은 인서트에 포함된 미세채널 내의 유체 흐름을 나타내는 사시도이다.
도 22는 베이스에 포함된 미세채널 내의 유체 흐름을 나타내는 단면도이다.
도 23 및 24는 커버의 사시도이다.
도 25는 다공성 막을 통과한 인간 혈관 내피 세포(RFP-HUVEC)가 혈관을 생성하여 삼차원 피브린젤(Fibrin ECM) 내부에서 배양한 삼차원 종양 스페로이드의 상단부부터 하단부 방향으로 이동하는 형태를 나타낸다(Scale bar = 200 μm).
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고, 상기 제2 중심채널은 상기 제1 중심채널에 비해 채널의 높이가 낮은 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "미세유체장치"는 유기 고분자 물질을 포함하는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘을 포함하는 다양한 소재로 제조된 기판 위에 유체가 흐를 수 있도록 구비된 미세채널 등을 포함하고 있는 장치를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "미세채널"은 유체가 흐를 수 있는 밀리미터(millimeter), 마이크로미터(micrometer), 또는 나노미터(nanometer)의 차원을 갖는 미세한 크기의 채널을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "인서트"는 다른 물체에 형성된 홈에 삽입될 수 있는 형태의 물체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것일 수 있고, 상기 베이스는 상기 인서트가 삽입될 수 있는 홈을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 인서트는 제1 체결 헤드를 포함하고, 상기 베이스는 제2 체결 헤드를 포함하여, 상기 제1 체결 헤드와 상기 제2 체결 헤드가 서로 걸려져서 상기 인서트와 상기 베이스가 스냅핏(snap fit) 탈부착되는 것일 수 있다. 이 때, 상기 제1 중심채널과 상기 제2 중심채널 사이의 누수를 방지하기 위해 상기 다공성 막은 상기 인서트와 상기 베이스 사이에서 강한 압력을 받아 개스킷(gasket) 역할을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "체결 헤드"는 플라스틱, 고무, 실리콘 등의 탄성을 갖는 재질로 구성될 수 있고, 각각 탄성 변형되어 스냅핏 탈부착을 달성할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "스냅핏"은 추가적인 부품이나 체결 기구 없이, 서로 걸리는 홈의 상호작용으로 체결력이 형성되는 체결 방식을 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 제1 중심채널 및 상기 제2 중심채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함할 수 있다. 상기 관류를 유도 및 조절할 수 있는 방법은 상기 입구와 출구의 정수압차(Hydrostatic pressure difference)를 이용하는 방법, 외부 펌프를 상기 입구 및 출구에 연결하는 방법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 베이스는 제1 유체 저장소 및 제2 유체 저장소를 포함할 수 있다. 또한, 상기 베이스는 상기 제1 유체 저장소 및 상기 제2 유체 저장소를 연결하는 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제3 측면채널 및 제4 측면채널은 상기 제1 중심채널에 비해 채널의 높이가 낮을 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제2 중심채널은 상기 제1 중심채널의 방향과 수평으로 형성된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제3 측면채널 및 제4 측면채널은 상기 제1 중심채널의 방향과 수직으로 형성된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 미세유체장치는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 사출 성형(Injection molding) 기술을 이용하여 플라스틱으로 제조될 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제1 중심채널은 혈관 내피 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, human umbilical vein endothelial cell)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포"는 식물 세포, 동물 세포(예컨대, 포유동물 세포), 박테리아 세포 및 곰팡이 세포 등을 포함하는 생물학적 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "조직 혈관 내피 세포"는 조직의 특정한 구조를 유지하는 역할을 하며, 조직을 외부 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 세포를 의미한다. 뿐만 아니라, 조직 장벽 세포간 혹은 세포외 기질과의 강한 결합력을 이용하여, 선택적으로 물질을 투과시키며 조직 내 물질 농도가 항상성을 유지하는 역할을 하는 세포를 의미한다. 조직 혈관 내피 세포는 상피조직세포(Epithelial tissue cell) 및 중간엽세포(Mesenchymal cell)을 포함한다.
일 실시태양에서, 상기 제2 중심채널은 종양 세포를 포함할 수 있다. 또한, 추가적으로 하이드로젤을 포함할 수 있다.
상기 종양 세포는 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 또는 이의 전이암 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 하이드로젤은 콜라겐, 라미닌, 히알루론산, 미네랄, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 펩타이드, 폴리에틸렌글리콜 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 하이드로젤은 콜라겐젤, 피브린젤, 라미닌젤, 마트리젤, 동물 유래 종양 기저막 추출물젤, 조직 탈세포화 세포외 기질젤, 펩타이드젤, 폴리에틸렌글리콜젤 또는 알지네이트젤일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 바람직하게는, 라미닌젤 또는 마트리젤이다.
본원에 사용된 용어 "하이드로젤"은 공유 결합, 수소결합, van der waals 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질을 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 인서트를 상기 베이스로부터 분리하여, 상기 다공성 막에 부착된 세포 및 상기 제2 중심채널에 포함된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 각각 분리할 수 있으며, 상기 분리된 세포를 이용하여 유전자 분석 등의 세포 분석을 수행할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 인서트를 상기 베이스로부터 분리하여, 상기 제1 중심채널에 약물 도포 등 필요한 처리를 가한 후, 다시 상기 인서트를 상기 베이스에 조립하여 세포 반응을 관찰할 수 있다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트와 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 조립하는 단계;
상기 인서트를 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스에 조립하는 단계;
제2 세포를 상기 제2 중심채널에 주입하는 단계;
제1 세포를 상기 제1 중심채널에 주입하는 단계; 및
제1 유체를 상기 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널에 관류시키는 단계를 포함하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법을 제공한다.
일 실시태양에서, 상기 제1 중심채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하고, 상기 제1 세포는 상기 제1 중심채널 입구를 통해 주입되는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제2 중심채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하고, 상기 제2 세포는 상기 제2 중심채널 입구를 통해 주입되는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제1 세포는 혈관 내피 세포이고; 바람직하게는 인간 탯줄 정맥 내피 세포일 수 있으며, 상기 제2 세포는 종양 세포이고; 바람직하게는 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 및 이의 전이암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널, 제4 측면채널, 제1 유체 저장소 및 제2 유체 저장소를 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는 미세유체장치 내 혈관 모사 방법으로서, 제1 유체를 상기 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널에 관류시키는 단계; 및 상기 제2 유체 저장소까지 차례대로 도달시키는 단계를 포함하는, 혈관 모사 방법을 제공한다.
일 실시태양에서, 상기 베이스는 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널, 상기 제4 측면채널, 상기 제1 유체 저장소, 및 상기 제2 유체 저장소를 포함할 수 있다.
이하 도면들을 통하여 본 발명의 미세유체장치를 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명은 도 1 내지 24의 형태로 구체화된 미세유체장치를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특히, 도 10 내지 24에 본 발명의 미세유체장치의 구체적인 실시예를 도시하였으나, 본 발명은 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치는 인서트(100), 베이스(200), 및 인서트(100)와 베이스(200) 사이에 위치하는 다공성 막(300)을 포함한다.
도 1을 참조하면, 상기 인서트(100)는 제1 중심채널(110)을 포함한다. 일 실시태양에서, 상기 베이스(200)의 하단에 바닥부(400)가 부착될 수 있다.
도 2 및 3을 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)는 제1 유체 저장소(240) 및 제2 유체 저장소(250)를 포함할 수 있고, 제1 유체 저장소(240)과 제2 유체 저장소(250)를 연결하는 제2 중심채널(210), 제3 측면채널(220) 및 제4 측면채널(230)을 포함할 수 있다.
도 4 및 5를 참조하면, 상기 미세유체장치의 다공성 막(300)은 제1 중심채널(110) 및 제2 중심채널(210) 사이에 존재하며, 제2 중심채널(210)은 제1 중심채널(110)의 방향과 수평로 형성될 수 있다.
도 6을 참조하면, 상기 미세유체장치의 제1 중심채널(110)은 제1 세포(111)를 포함할 수 있고, 제2 중심채널(210)는 제2 세포(211)를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 제1 세포(111)는 다공성 막(300)의 상단 표면에 부착되어 배양될 수 있고, 상기 제2 세포(211)는 제2 중심채널(210) 내부에서 3D 배양된 것일 수 있다.
도 7 내지 9, 18, 및 19를 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)는 인서트(100)가 삽입될 수 있는 인서트 삽입 홈(201)을 포함하여, 인서트(100)는 베이스(200)로부터 탈부착 가능한 것일 수 있다. 또한, 상기 인서트(100)는 제1 체결 헤드(101)를 포함하고, 상기 베이스(200)는 제2 체결 헤드(202)를 포함하여, 상기 제1 체결 헤드(101)와 제2 체결 헤드(202)가 서로 걸려져서 인서트(100)와 베이스(200)가 스냅핏(snap fit) 탈부착되는 것일 수 있다.
도 10 및 11을 참조하면, 상기 미세유체장치의 인서트(100)는 제1 중심채널 입구(112) 및 제1 중심채널출구(113)를 포함할 수 있다. 상기 제1 중심채널 입구(112) 및 제1 중심채널 출구(113)는 제1 중심채널(110)과 관 형태로 연결될 수 있으며, 상기 관을 통해 전극을 일정한 위치 및 깊이로 삽입하여 TEER 값의 정밀한 측정이 가능할 수 있다.
도 12 내지 20, 및 22를 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)는 하나 이상의 인서트(100)가 탈부착 가능한 구조일 수 있다.
도 23 및 24를 참조하면, 상기 미세유체장치는 커버(500)를 포함할 수 있다.
도 21을 참조하면, 상기 미세유체장치의 인서트(100)에 포함된 제1 중심채널 입구(112)를 통해 유체를 주입하여 제1 중심채널(110)을 거쳐 제1 중심채널 출구(113) 방향으로 유체를 관류시킬 수 있다.
도 9 및 22를 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)에 포함된 제1 유체 저장소(240)에 유체를 주입하여, 제3 측면채널(220), 제2 중심채널(210), 제4 측면채널(230) 및 제2 유체 저장소(250)까지 차례대로 상기 유체를 관류시킬 수 있다.
[실시예 1]
혈관 모방 구조와 삼차원 암 조직세포 배양을 결합한 종양 미세환경장치 제작
조립된 미세유체장치를 이용하여 다음과 같은 방법으로 혈관 모방 구조와 삼차원 종양 스페로이드 배양을 결합한 종양 미세환경(TME, tumor microenvironment) 모사 미세유체장치를 제작하였다.
세포가 미세유체장치에 고르게 부착될 수 있도록 피브로넥틴(Fibronectin) 10 μl를 제1 중심채널과 제2 중심채널에 주입하였다. 1시간 동안 배양한 후, 106 cells/ml 농도의 인간 폐 섬유아세포(NHLF) 10 μl를 제2 중심채널에 주입하고 섬유아세포가 고르게 부착될 수 있도록 2시간 동안 배양하였다. 피브린젤(Fibrin ECM) 15 μl에 임베딩된 300 내지 400 μm 크기의 삼차원 종양 스페로이드를 제2 중심채널에 주입하고, 피브린젤이 굳도록 30분 동안 배양하였다. 15 x 106 cells/ml 농도의 RFP를 발현하는 인간 혈관 내피 세포(RFP-HUVEC) 10 μl를 제1 중심채널에 주입하였다. 제3 측면채널, 2 중심채널 및 제4 측면채널에 연결된 제1 유체 저장소에 배양액을 채워준 상태에서 다공성 막의 표면에 혈관 내피 세포가 고르게 부착될 수 있도록 15시간 이상 배양하였다. 삼차원 종양 스페로이드와 혈관 모방 구조를 공초점 현미경(confocal microscope, Zeiss LSM 780)을 이용하여 이미지화하였다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 다공성 막을 통과한 RFP를 발현하는 인간 혈관 내피 세포(RFP-HUVEC)가 혈관을 생성하여 삼차원 피브린젤(Fibrin ECM) 내부에서 배양한 삼차원 종양 스페로이드의 상단부부터 하단부 방향으로 이동하는 형태를 확인하였다.
100: 인서트
101: 제1 체결 헤드
110: 제1 중심채널
111: 제1 세포
112: 제1 중심채널 입구
113: 제1 중심채널 출구
200: 베이스
201: 인서트 삽입 홈
202: 제2 체결 헤드
210: 제2 중심채널
211: 제2 세포
212: 제2 중심채널 입구
213: 제2 중심채널 출구
220: 제3 측면채널
230: 제4 측면채널
240: 제1 유체 저장소
250: 제2 유체 저장소
300: 다공성 막
400: 바닥부
500: 커버
101: 제1 체결 헤드
110: 제1 중심채널
111: 제1 세포
112: 제1 중심채널 입구
113: 제1 중심채널 출구
200: 베이스
201: 인서트 삽입 홈
202: 제2 체결 헤드
210: 제2 중심채널
211: 제2 세포
212: 제2 중심채널 입구
213: 제2 중심채널 출구
220: 제3 측면채널
230: 제4 측면채널
240: 제1 유체 저장소
250: 제2 유체 저장소
300: 다공성 막
400: 바닥부
500: 커버
Claims (21)
- 제1 중심채널을 포함하는 인서트;
제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스; 및
상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고,
상기 제2 중심채널은 상기 제1 중심채널에 비해 채널의 높이가 낮은 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제2항에 있어서, 상기 인서트는 제1 체결 헤드를 포함하고,
상기 베이스는 제2 체결 헤드를 포함하여,
상기 제1 체결 헤드와 상기 제2 체결 헤드가 서로 걸려져서 상기 인서트와 상기 베이스가 스냅핏(snap fit) 탈부착되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제2항에 있어서, 상기 베이스는 상기 인서트가 삽입될 수 있는 홈을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 중심채널 및 상기 제2 중심채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 베이스는 제1 유체 저장소 및 제2 유체 저장소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제6항에 있어서, 상기 베이스는 상기 제1 유체 저장소와 상기 제2 유체 저장소를 연결하는 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 중심채널은 상기 제1 중심채널의 방향과 수평으로 형성된 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제3 측면채널 및 제4 측면채널은 상기 제1 중심채널의 방향과 수직으로 형성된 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 미세유체장치는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 중심채널은 혈관 내피 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제11항에 있어서, 상기 혈관 내피 세포는 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC, human umbilical vein endothelial cell)인 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 중심채널은 종양 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제13항에 있어서, 상기 종양 세포는 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 및 이의 전이암 세포로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제13항에 있어서, 상기 제2 중심채널은 하이드로젤을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제15항에 있어서, 상기 하이드로젤은 콜라겐, 라미닌, 히알루론산, 미네랄, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 펩타이드, 폴리에틸렌글리콜 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1항에 있어서, 상기 인서트를 상기 베이스로부터 분리하여, 상기 다공성 막에 부착된 세포, 및 상기 제2 중심채널에 포함된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 각각 분리할 수 있는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
- 제1 중심채널을 포함하는 인서트, 및 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 조립하는 단계;
상기 인서트를 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스에 조립하는 단계;
제2 세포를 상기 제2 중심채널에 주입하는 단계;
제1 세포를 상기 제1 중심채널에 주입하는 단계; 및
제1 유체를 상기 제3 측면채널, 제2 중심채널 및 제4 측면채널에 관류시키는 단계
를 포함하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제1 중심채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하고,
상기 제1 세포는 상기 제1 중심채널 입구를 통해 주입되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제2 중심채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하고,
상기 제2 세포는 상기 제2 중심채널 입구를 통해 주입되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제1 세포는 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC, human umbilical vein endothelial cell)이고;
상기 제2 세포는 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 및 이의 전이암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210074453 | 2021-06-08 | ||
| KR20210074453 | 2021-06-08 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220165668A true KR20220165668A (ko) | 2022-12-15 |
Family
ID=84425287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220069804A KR20220165668A (ko) | 2021-06-08 | 2022-06-08 | 종양 스페로이드를 포함하는 미세유체칩 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20220165668A (ko) |
| WO (1) | WO2022260436A1 (ko) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101307196B1 (ko) * | 2011-07-15 | 2013-09-12 | 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 | 미세 세포 배양 장치 |
| WO2013086502A1 (en) * | 2011-12-09 | 2013-06-13 | President And Fellows Of Harvard College | Organ chips and uses thereof |
| JP2017504320A (ja) * | 2013-12-20 | 2017-02-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 低剪断マイクロ流体デバイスならびにその使用および製造の方法 |
| KR102219063B1 (ko) * | 2019-04-24 | 2021-02-22 | 홍익대학교 산학협력단 | 다중 장기 미세유체 칩 구조체의 제조 방법 및 다중 장기 미세유체 칩 구조체 |
| KR102354778B1 (ko) * | 2019-09-30 | 2022-01-24 | 서울대학교병원 | 폐 조직 모사 미세유체 시스템 |
-
2022
- 2022-06-08 WO PCT/KR2022/008095 patent/WO2022260436A1/ko active Application Filing
- 2022-06-08 KR KR1020220069804A patent/KR20220165668A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022260436A1 (ko) | 2022-12-15 |
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