KR20220161332A - C-1 억제제 고갈 혈장으로부터 면역글로불린 조제물을 제조하는 방법 - Google Patents

C-1 억제제 고갈 혈장으로부터 면역글로불린 조제물을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

C1-INH 고갈 혈장 상청액으로부터 면역글로불린 G (IgG) 풍부 분획을 제조하는 방법이 기재되어 있다. C1-INH 고갈 혈장 상청액으로부터의 면역글로불린 G (IgG) 풍부 분획의 단리는 제조 공정을 위한 대안적인 출발 물질을 제공하였다. 본 발명에서, C1-INH 고갈 혈장 상청액은 추가 처리 전에 헤파린으로 처리된다.

Description

C-1 억제제 고갈 혈장으로부터 면역글로불린 조제물을 제조하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2020년 3월 31일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 63/002,791에 대하여 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
혈장-유래 혈액 생성물은 다양한 혈액 장애 뿐만 아니라 다른 기원의 질환을 치료하는 데 사용된다. 예를 들어 인간 혈장의 면역 글로불린 (IgG) 생성물은 면역 결핍을 치료하는 데 1952년 처음 사용되었다. 그 후, IgG 조제물(preparation)은 의학적 병태의 적어도 세가지 주요 범주에서 광범위한 용도를 발견하였다: (1) 낮은 항체 수준을 특징으로 하는, 면역 결핍, 예컨대 X-연관 무감마글로불린혈증, 저감마글로불린혈증 (1차 면역 결핍증), 및 후천성 면역 저하 병태(acquired compromised immunity conditions) (2차 면역 결핍증); (2) 염증성 및 자가면역 질환; 및 (3) 급성 감염.
IVIG 치료는 1차 면역결핍 장애를 관리하는 데 매우 효과적일 수 있지만, 이 요법은 질환의 치료제라기보다는 체내에서 생산되지 않고 있는 항체에 대한 일시적인 대체제일 뿐이다. 따라서, IVIG 요법에 의존하는 환자는 일반적으로 평생동안 약 한 달에 한 번 반복 투약을 필요로 한다. 이러한 필요성은 IVIG 조성물의 지속적인 생산에 대한 큰 수요를 제기한다. 그러나, 재조합 DNA 벡터의 시험관내 발현을 통해 생산되는 다른 생물제제와는 달리, IVIG는 인간 혈액 및 혈장 공여로부터 분별된다. 따라서, IVIG 생성물은 단순히 생산량을 증가시킴으로써 증가될 수 없다. 오히려 상업적으로 이용 가능한 IVIG의 수준은 혈액 및 혈장 공여의 이용 가능한 공급에 의해 제한된다.
다수의 IVIG 제조 방법이 IVIG 생성물의 상업적 공급자에 의해 사용된다. 현재 IVIG 생산 방법의 한가지 일반적인 문제점은 정제 공정 동안의 IgG의 상당한 손실이며, 이는 출발 물질의 총 IgG 함량의 적어도 30% 내지 35%인 것으로 추정된다. 한가지 어려움은 IgG의 수율을 높이면서, 바이러스 불활성화의 품질을 유지하고, 부작용을 유발할 수 있는 불순물이 없도록 하는 것이다.
IVIG의 현재 생산 수준에서, 수율의 작은 증가로 간주될 수 있는 것은 사실상 매우 유의하다. 예를 들어, 2007년 생산 수준에서, 리터당 추가적인 56 밀리그램과 동등한, 효율의 2% 증가는 1.5 미터톤의 추가적인 IVIG를 생성할 것이다.
혈장-유래 생물학적 치료제(biologic therapies)를 제조하고 제형화할 때에는 다양한 안전 주의 사항이 고려되어야 한다. 이들은 혈액 매개 병원체 (예를 들어, 바이러스 및 박테리아 병원체), 항보체 활성, 및 공여된 혈장의 사용으로부터 발생하는 다른 원치 않는 오염물을 제거 및/또는 불활성화하는 방법을 포함한다. 연구는 높은 수준의 아미도분해(amidolytic) 활성의 투여가 원치 않는 혈전색전성 사건을 초래할 수 있다는 것을 시사하였다 (Wolberg AS 등, Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations. Am J Hematol 2000;65:30-34; 및 Alving BM 등, Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulins preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980; 96:334-346; 이 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다).
이러한 우려를 부각한 것은 혈전색전성 사건 보도 증가 이후 최근 미국에서 Octagam® (Octapharma)의 자발적 철수 및 유럽위원회의 Octagam® 및 Octagam 10%에 대한 마케팅 허가의 중단이었다. 증가된 혈전성(thrombolic) 사건은 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 효소원 불순물, 예컨대 인자 XI, 인자 XIa, 인자 XII 및 인자 XIIa에 의해 유발되는, 생물제제에서의 높은 수준의 아미도분해 활성에 의해 유발되었을 가능성이 있다 (FDA 공지: 자발적 시장 철수 - 2010년 9월 23일 Octagam [면역 글로불린 정맥내 (인간)] 5% 액체 조제물; Octagam 50 mg/ml, 용액 - Octapharma France - Mise en quarantaine de tous les lots, AFSSAPS에 의해 2010년 9월 9일 온라인으로 출간; 및 Octagam에 대한 마케팅 허가의 중단에 대한 질의응답 (인간 정상 면역글로불린 5% 및 10%), 유럽의약청에 의해 2010년 9월 23일 온라인으로 출간).
WO2014113659A1은 인터-알파 억제제 단백질 (IαIp)-고갈 혈액 생성물 물질로부터 하나 이상의 혈액 생성물을 단리하는 방법을 개시한다. 혈액 생성물은 IαIp-고갈 저온침전물-결핍 혈장(cryo-poor plasma)을 DEAE 지지체에 접촉시킴으로써 상기 IαIp-고갈 저온침전물-결핍 혈장으로부터 크로마토그래피적으로 단리된다. 이 참조는 IgG의 제조를 위한 C1-INH 고갈 혈장 상청액의 용도를 개시하지 않는다. 또한, 혈장 상청액을 헤파린으로 처리하여 IgG에서 아미도분해 및 응고촉진 활성을 감소시키는 것을 개시하지 않는다.
IgG 제조를 위한 출발 물질의 제한된 공급 및 정제 공정 동안 유의한 양의 IgG의 손실에 대한 우려의 증가로 인해, IgG의 제조를 위한 유의한 양의 대안적인 출발 물질의 이용 가능성을 증가시키는 방법의 제공에 대한 즉각적인 필요성이 당업계에 존재한다.
발명의 간략한 요약
본 발명은 이들 및 다른 문제점을 해결한다. 일 구현예에서, 본 발명은 C1-INH 고갈 혈장 상청액이 면역글로불린 G (IgG) 풍부 분획의 제조를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있고, 따라서 IgG의 제조를 위한 다른 출발 물질의 이용 가능성을 만들 수 있다는 발견에 기반한다. 혈장-유래 단백질 조성물이 투여되는 환자에서 혈전색전성 사건의 발생과 함께 이들 조성물의 아미도분해 함량에 대한 최근의 우려는 이들 생물제제의 제조 동안 세린 프로테아제 (예를 들어, FXIa 및 FXIIa) 및 세린 프로테아제 효소원 (예를 들어, FXI 및 FXII)을 감소시키는 방법에 대한 당업계의 필요성을 부각시켰다. 유리하게는, 본 발명은, 적어도 부분적으로, 헤파린이 분별 공정 동안 응고촉진 및 아미도분해 활성을 허용 가능한 수준으로 감소시키는데 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 기반한다. 또한, 감소된 세린 프로테아제 활성, 세린 프로테아제 함량, 및/또는 세린 프로테아제 효소원 함량을 갖는 치료적 혈장-유래 단백질 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 IgG를 포함하는 C1-INH 고갈 상청액 분획으로부터 면역글로불린 G (IgG) 풍부 분획을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 다음을 포함한다:
(a) C1-INH 고갈 상청액 분획을 헤파린과 접촉시켜 헤파린화된 C1-INH 고갈 분획을 형성하는 단계; 및
(b) 헤파린화된 C1-INH 고갈 분획으로부터 IgG를 단리하여 IgG 풍부 분획을 형성하는 단계.
본원에 기재된 방법의 일 구현예에서, 상청액 분획은 C1-억제제 흡착 후에 생성된 상청액이다.
예시적인 구현예에서, 상청액 분획은 혈장 상청액이다.
일 구현예에서, 혈장 상청액은 C1-INH 고갈 저온침전물-결핍 혈장이다.
다양한 구현예에서, 혈장 상청액은 이중-고갈 저온침전물-결핍 혈장 (DDCPP)으로부터 유래된다.
예시적인 구현예에서, 상청액 분획은 인자 II, VII, IX, X 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 다른 혈액 응고 인자(들)이 고갈된다.
일 구현예에서, 상청액 분획은 추가 처리 전에 정상 혈장의 단백질 값으로 농축된다.
예시적인 구현예에서, 헤파린은 상청액 분획의 mL당 약 1 내지 약 20 단위의 양으로 첨가된다.
예시적인 구현예에서, 헤파린은 상청액 분획의 mL당 약 5 내지 약 10 단위의 양으로 첨가된다.
일 구현예에서, 헤파린은 상청액 분획의 mL당 약 5 단위의 양으로 첨가된다.
다양한 구현예에서, 헤파린은 상청액 분획의 mL당 약 10 단위의 양으로 첨가된다.
일부 구현예에서, 방법은 다음을 추가로 포함한다:
(c) C1-INH를 함유하는 저온침전물-결핍 혈장 분획으로부터 C1-INH 에스테라제 억제제 (C1-INH)를 제거하여 C1-INH 고갈 상청액 분획을 형성하는 단계.
일 구현예에서, IgG 풍부 분획은 상청액 분획에서 발견되는 IgG 함량의 약 60% 내지 약 80%를 함유한다.
일 구현예에서, IgG 풍부 분획은 상청액 분획에서 발견되는 IgG 함량의 적어도 약 50%를 함유한다.
상기 기재된 방법의 일 구현예에서, IgG 풍부 분획에서 γ-글로불린의 순도는 적어도 약 95%이다.
상기 기재된 방법의 일 구현예에서, IgG 풍부 분획에서 γ-글로불린의 순도는 약 95% 내지 약 99.9%이다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 임의의 순서 또는 조합으로 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 단리하는 방법을 제공한다:
(i) 약 7.0 내지 약 7.5의 pH에서 약 6% 내지 약 10% 에탄올, 예를 들어 수성 에탄올로 헤파린화된 분획을 침전시켜 분획 I 침전물 및 분획 I 상청액을 수득하는 단계; 및
(ii) 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 18% 내지 약 27% 에탄올, 예를 들어 수성 에탄올로 분획 I 상청액으로부터 IgG를 침전시켜 분획 II+III 침전물을 형성하는 단계.
상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 방법은 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 18% 내지 약 27% 에탄올, 예를 들어 수성 에탄올로 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 침전시켜 분획 I+II+III 침전물을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 임의의 순서 또는 조합으로 하기 단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다:
(iii) 분획 II+III 또는 분획 I+II+III 침전물을 현탁 완충액에서 현탁시켜 IgG 현탁액을 형성하는 단계;
(iv) 미세하게 분할된 이산화규소 (SiO2)를 IgG 현탁액과 예를 들어 적어도 약 30 분 동안 혼합하는 단계;
(v) IgG 현탁액을 여과하여 여과액 및 필터 케이크를 형성하는 단계.
일 구현예에서, 방법은 임의의 순서 또는 조합으로 하기 단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다:
(vi) 약 4.9 내지 약 5.3의 pH를 갖는 세척 완충액의 적어도 약 1 필터 프레스 데드 볼륨(filter press dead volume)으로 필터 케이크를 세척하여, 세척 용액을 형성하는 단계;
(vii) 여과액을 세척액과 조합하여 조합된 용액을 형성하고, 조합된 용액에 세제를 처리하는 단계;
(viii) 단계 (vii)의 조합된 용액의 pH를 약 7.0으로 조정하고, 그것에 에탄올을 약 20% 내지 약 30%의 최종 농도로 첨가하여 침전물 G 침전물을 형성하는 단계;
(ix) 침전물 G 침전물을 용매, 세제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 구성원을 포함하는 수용액에 용해시키고, 용액을, 예를 들어, 적어도 약 60 분 동안 인큐베이션하여, 인큐베이션된 용액을 형성하는 단계;
(x) 인큐베이션된 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고, 용리액에서 컬럼 상에 흡수된 단백질을 용리시키는 단계;
(xi) 용리액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 관류(flow-through) 분획을 생성하는 단계;
(x) 관류 분획을 나노필터에 통과시켜 나노여과액을 생성하는 단계;
(xi) 한외여과에 의해 나노여과액을 농축하여 제1 한외여과액을 생성하는 단계;
(xii) 제1 한외여과액을 정용여과(diafiltration) 완충액에 대해 정용여과하여 정용여과액을 생성하는 단계; 및
(xiii) 한외여과에 의해 정용여과액을 농축하여 약 8% (w/v) 내지 약 22% (w/v)의 단백질 농도를 갖는 제2 한외여과액을 생성함으로써, IgG 풍부 분획을 형성하는 단계.
일 구현예에서, 방법은 SiO2를 분획 II+III 또는 분획 I+II+III 침전물 그램당 약 0.02 내지 약 0.10 그램의 SiO2의 최종 농도로 첨가하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 세척 완충액의 적어도 약 3 필터 프레스 데드 볼륨으로 필터 케이크를 세척하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 세척 완충액의 적어도 약 2 필터 프레스 데드 볼륨으로 필터 케이크를 세척하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 단백질을 적어도 약 35 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트로 용리시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 정용여과 완충액은 약 200 mM 내지 약 300 mM 글리신을 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 바이러스 불활성화 또는 제거 단계에서 IgG 용액을 용매 및/또는 세제로 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 방법은 약 4.0 내지 약 5.2의 낮은 pH에서의 인큐베이션 단계를 추가로 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 구현예에서, 방법은 약 4.4 내지 약 4.9의 낮은 pH에서의 인큐베이션 단계를 추가로 포함한다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 IgG를 포함하는 C1-억제제 흡착 분획 후의 상청액을 제공하며, 상기 분획은 저온침전물-결핍 혈장 분획에 존재하는 전체의 적어도 약 70%만큼 C1-INH가 고갈된 저온침전물-결핍 혈장 분획이다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 IgG 풍부 분획을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 조성물은 조성물의 리터당 적어도 약 80 내지 220 그램의 IgG를 포함한다.
일 구현예에서, 약학적 조성물의 pH는 약 4.4 내지 약 4.9이다.
A. 도입
숙주 세포주에서 DNA 벡터의 재조합 발현을 통해 생산되는 다른 생물제제와는 달리, 혈장-유래 단백질은 인간 혈액 및 혈장 공여로부터 분별된다. 따라서, 이들 생성물의 공급은 단순히 생산량을 증가시켜서는 증가될 수 없다. 오히려 상업적으로 이용 가능한 혈액 생성물의 수준은 혈액 및 혈장 공여의 이용 가능한 공급에 의해 제한된다. 이러한 역학은 보체 인자 H (CFH) 및 인터-알파-트립신 억제제 단백질 (IαIp)을 포함하는, 덜 확립된 상업적 시장을 갖는 새로운 혈장-유래 혈액 인자의 제조를 위한 미가공 인간 혈장의 이용 가능성의 부족을 초래한다.
혈장-유래 조성물의 아미도분해 함량에 대한 우려는 IgG 및 다른 생물제제의 제조 동안 세린 프로테아제 (예를 들어, FXIa 및 FXIIa) 및 세린 프로테아제 효소원 (예를 들어, FXI 및 FXII)을 감소시키는 방법에 대한 당업계의 필요성을 부각하였다.
C1-억제제 (C1-INH, C1 에스테라제 억제제)는 혈장 칼리크레인, 인자 XIa 및 인자 XIIa의 가장 중요한 생리학적 억제제이다. C1-억제제의 고갈은 GAMMAGARD® LIQUID (GGL)와 같은 상업적 IgG 치료제의 제조를 위한 출발 물질에서 이들 인자의 축적을 초래할 수 있으며, 이는 혈전색전성 사건의 상승된 위험 없이 정맥내 투여용 IgG 조제물을 생산하는 것을 어렵게 한다. 이중 고갈 저온침전물-결핍 혈장 (DDCPP)으로 명명되는, C1-억제제의 흡착 후 혈장 상청액으로부터의 면역글로불린의 생산 복잡성으로 인해, 천연 혈장 상청액은 IgG의 제조를 위한 출발 물질로서 사용되지 않는다. 따라서, 감소된 농도의 C1-억제제로 혈장 칼리크레인, 인자 XIa 및 인자 XIIa의 적절한 제거를 보장하기 위해, 계산된 양의 10,000 IU/L 헤파린이 알코올 분별 공정이 개시되기 전에 DDCPP에 첨가된다.
본 개시내용은 C1-INH 고갈 혈장 상청액 뿐만 아니라 인자 II, VII, IX 및 X 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 다른 혈액 응고 인자 중 하나 이상이 고갈된 상청액 분획이 면역글로불린 G (IgG) 풍부 분획의 제조를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있고, 따라서 IgG의 제조를 위한 또 다른 출발 물질을 이용 가능하게 한다는 발견에 부분적으로 기반한다. 유리하게는, 본 발명은 헤파린이 분별 공정 동안 응고촉진 활성 감소를 증가시키는데 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기반한다.
이러한 문제점을 극복하기 위해, 본 발명자는 C1-INH 고갈 혈장 상청액을 헤파린으로 공동-침전시켜 헤파린화된 분획을 형성하고; 그런 다음 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 단리하는, 정제 단계, 예를 들어 초기 정제 단계를 포함하는 공정을 개발하였다. 따라서, 헤파린 처리된 C1-INH 고갈 혈장 상청액은 면역글로불린 G (IgG) 풍부 분획의 제조를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있고, 이는 IgG의 제조를 위한 새로운 출발 물질을 제공한다.
특정 양태에서, 본 발명은 감소된 응고촉진 및 아미도분해 활성을 갖는 IVIG 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 개선된 제조 방법에 따라 제조된 IgG 조성물을 제공한다. 유리하게는, 이들 조성물은 본원에 제공된 방법에 의해 제공되는 개선된 수율로 인해 현재 이용 가능한 상업적 생성물보다 제조하는 데 비용이 더 적게 든다. 게다가, 이들 조성물은 상업적 방법을 사용하여 제조된 조성물보다 더 순수하지 않더라도 이들만큼 순수하다. 중요하게는, 이들 조성물은 면역 결핍, 염증성 및 자가면역 질환, 및 급성 감염에 대한 IVIG 요법에 사용하기에 적합하다. 일 구현예에서, IgG 조성물은 정맥내 투여에 대해 10% 또는 그 정도의 IgG이다. 또 다른 구현예에서, IgG 조성물은 피하 또는 근육내 투여에 대해 20% 또는 그 정도이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 본원에 제공된 바와 같은 C1-INH 고갈 혈장 상청액으로부터 제조되는 IgG 조성물의 약학적 조성물 및 제형을 제공한다. 특정 구현예에서, 이들 조성물 및 제형은 현재 시판되는 다른 IVIG 조성물과 비교하여 개선된 성질을 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본원에 제공된 조성물 및 제형은 연장된 기간 동안 안정하다.
예시적인 구현예에서, 본 발명은 C1-INH 고갈 혈장 상청액으로부터 제조된 IgG 조성물의 투여를 포함하는 면역 결핍, 염증성 및 자가면역 질환, 및 급성 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, IgG 조성물은 본 발명의 방법에 의해 제조된다.
C1-INH 에스테라제 억제제 (C1-INH)-함유 조성물 생산의 예시적인 방법은 WO2001046219A2에서 찾을 수 있으며, 이는 C1-INH를 단리하기 위한 산성 pH (즉, pH 7 미만)에서의 음이온 교환기의 용도를 기재한다.
B. 정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정맥내 IgG" 또는 "IVIG 치료"는 일반적으로 예를 들어, 면역 결핍, 염증성 질환, 및 자가면역 질환과 같은 병태를 치료하기 위해 환자에게 IgG 면역글로불린의 약학적 조성물을 정맥내로, 피하로 또는 근육내로 투여하는 치료적 방법을 지칭한다. IgG 면역글로불린은 일반적으로 풀링되고(pooled), 혈장으로부터 제조된다. 전체 항체 또는 단편이 사용될 수 있다. IgG 면역글로불린은 피하 투여를 위해 더 고농도 (예를 들어, 10% 초과)로 제형화되거나, 근육내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 이는 특히 특정 항원 (예를 들어, Rho D 인자, 백일해 독소, 파상풍 독소, 보툴리누스 독소, 광견병 등)에 대해 평균 역가보다 높게 제조된 특수 IgG 조제물에 대해 일반적이다. 논의의 용이함을 위해, 이러한 피하 또는 근육내 제형화된 IgG 조성물도 또한 이 출원에서 용어 "IVIG"에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미도분해 활성"은 또 다른 폴리펩티드 내의 적어도 하나의 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 폴리펩티드의 능력을 지칭한다. IgG 면역글로불린 조성물에 대한 아미도분해 활성 프로파일은 PL-1 (넓은 스펙트럼), S-2288 (넓은 스펙트럼), S-2266 (FXIa, 선상(glandular) 칼리크레인), S-2222 (FXa, 트립신), S-2251 (플라스민), 및 S-2302 (칼리크레인, FXIa 및 FXIIa)를 제한 없이 포함하는, 인간 혈장에서 발견되는 프로테아제에 대한 상이한 특이성을 갖는 다양한 발색성 기질로 검정함으로써 결정될 수 있다. 조성물의 아미도분해 활성을 결정하는 방법은 예를 들어 M. Etscheid 등 (Identification of kallikrein and FXIa as impurities in therapeutic immunoglobulins: implications for the safety and control of intravenous blood products, Vox Sang 2011; 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 명확히 포함된다.)에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체"는 분석물 (항원)에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이의 단편에 의해 실질적으로 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 하나로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 차례로 각각 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 정의한다. 예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 두 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50 내지 70 kD)를 갖는다. 각 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "한외여과(UF)"는 정수압이 반투과막을 향하여 액체를 밀어내는 다양한 막 여과 방법을 포괄한다. 현탁된 고체 및 고분자량의 용질은 보유되는 반면, 물 및 저분자량 용질은 막을 통과한다. 이러한 분리 공정은 고분자 (103 내지 106 Da) 용액, 특히 단백질 용액을 정제하고 농축하는데 자주 사용된다. 다수의 한외여과 막이 이들이 보유하는 분자의 크기에 따라 이용 가능하다. 한외여과는 일반적으로 1 내지 1000 kDa의 막 공극 크기 및 0.01 내지 10 bar의 작동 압력에 의해 특징 규명되고, 단백질과 같은 콜로이드를 당 및 염과 같은 소분자로부터 분리하는데 특히 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정용여과"는 한외여과와 동일한 막으로 수행되고 접선 유동 여과이다. 정용여과 동안, 완충액이 재순환 탱크 내로 도입되는 반면, 여과액은 단위 작동에서 제거된다. 생성물이 잔류물 (예를 들어, IgG) 내에 있는 공정에서, 정용여과는 생성물 풀(pool)로부터 여과액 내로 성분을 세척하여, 완충액을 교환하고 원치 않는 종의 농도를 감소시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 특정된 값의 대략적인 범위를 의미한다. 일부 구현예에서, 범위는 특정된 값의 1% 내지 10% 플러스 또는 마이너스이다. 따라서, "약"은 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 및 10%를 포괄한다. 예를 들어, 언어 "약 20%"는 18 내지 22%의 범위를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "용매"는 하나 이상의 다른 물질을 용해 또는 분산시킬 수 있는 임의의 액체 물질을 포괄한다. 용매는 본질적으로 물과 같은 무기물일 수 있거나, 또는 에탄올, 아세톤, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 헥산, 석유 에테르 등과 같은 유기 액체일 수 있다. 용어 "용매　세제　처리"에　사용된　바와　같이,　용매는　용액에서　지질-외피 바이러스를 불활성화하는 데 사용되는 용매 세제 혼합물의 일부인 유기 용매 (예를 들어, 트리-N-부틸 포스페이트)를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세제"는 용어 "계면활성제" 또는 "표면 작용제"와 상호 교환적으로 사용된다. 계면활성제는 일반적으로 양친매성인, 즉, 소수성 기 ("꼬리") 및 친수성 기 ("머리") 둘 모두를 함유하는 유기 화합물이며, 이는 계면활성제가 유기 용매 및 물 둘 모두에 가용성이 되게 한다. 계면활성제는 이의 머리에 형식적으로 하전된 기의 존재에 의해 분류될 수 있다. 비이온성 계면활성제는 이의 머리에 하전된 기를 갖지 않는 반면, 이온성 계면활성제는 이의 머리에 알짜 전하를 갖는다. 쯔비터이온성 계면활성제(zwitterionic surfactant)는 2개의 반대로 하전된 기를 갖는 머리를 함유한다. 일반적인 계면활성제의 일부 예는 다음을 포함한다: 음이온성 (설페이트, 설포네이트 또는 카복실레이트 음이온에 기반함): 퍼플루오로옥타노에이트 (PFOA 또는 PFO), 퍼플루오로옥타네설포네이트 (PFOS), 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 암모늄 라우릴 설페이트, 및 다른 알킬 설페이트 염, 소듐 라우레트 설페이트 (소듐 라우릴 에테르 설페이트, 또는 SLES로도 공지됨), 알킬 벤젠 설포네이트; 양이온성 (4차 암모늄 양이온에 기반함): 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드로 공지된 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 및 다른 알킬트리메틸암모늄 염, 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC), 폴리에톡실화 탈로우 아민 (POEA), 벤잘코늄 클로라이드 (BAC), 벤제토늄 클로라이드 (BZT); 장쇄 지방산 및 이의 염: 카프릴레이트, 카프릴산, 헵타노에이트, 헥사노산, 헵타노산, 나노산, 데카노산 등을 포함함; 쯔비터이온성 (양쪽성): 도데실 베타인; 코카미도프로필 베타인; 코코 암포 글리시네이트; 비이온성: 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드)의 공중합체 (상업적으로 폴록사머 또는 폴록사민으로 공지됨), 옥틸 글루코시드를 포함하는 알킬 폴리글루코시드, 데실 말토시드, 지방 알코올 (즉, 세틸 알코올 및 올레일 알코올), 코카미드 MEA, 코카미드 DEA, 폴리소르베이트 (Tween 20, Tween 80 등), Triton 세제, 및 도데실 디메틸아민 옥사이드.
이 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분무"는 예를 들어, 변형된 Cohn 분별 I 또는 II+III 침전 단계와 같은 알코올 침전 단계 동안 시스템 내로 액체 물질을 액체 물질의 미세 액적 또는 미스트의 형태로 전달하는 수단을 지칭한다. 분무는 분무 머리 또는 노즐을 갖고 액체로부터 미세한 미스트를 생성하도록 수동 또는 자동으로 작동되는 용기 (예를 들어, 분무 병)와 같은 임의의 가압 장치에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 분무는 액체 물질을 수용하는 시스템이 시스템 내에서 액체의 신속하고 균일한 분포를 보장하기 위해 지속적으로 교반되거나 또는 달리 혼합되는 동안 수행된다.
본원에 사용된 바와 같이, "저온침전물-결핍 혈장"은 영하에 가까운 온도, 예를 들어 약 10 ℃ 미만의 온도에서 혈장 또는 풀링된 혈장의 저온 침전 (저온침전(cryo-precipitation)) 후에 형성된 상청액을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 혈장은 회수된 혈장 (즉, 생체외 전혈로부터 분리된 혈장) 또는 공급원 혈장 (즉, 혈장분리법을 통해 수집된 혈장)과 상호 교환적으로 지칭될 수 있다. 저온침전은 일반적으로, 예를 들어, 안전성 및 품질 고려에 대해 이미 검정된 이전에 동결 풀링된 혈장을 해동함으로써 수행되지만, 신선한 혈장도 또한 사용될 수 있다. 해동은 일반적으로 6 ℃ 이하의 온도에서 수행된다. 낮은 온도에서 동결 혈장을 완전히 해동한 후, 액체 상청액으로부터 고체 저온침전물을 분리하기 위해 저온 (예를 들어,
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6 ℃)에서 원심분리가 수행된다. 대안적으로, 분리 단계는 원심분리보다는 여과에 의해 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "Cohn 풀"은 혈장 샘플 또는 혈장 샘플 풀의 분별에 사용되는 출발 물질을 지칭한다. Cohn 풀은 전처리 단계를 거쳤을 수 있거나 거치지 않았을 수 있는 전체 혈장, 저온침전물-결핍 혈장 샘플, 및 저온침전물-결핍 혈장 샘플 풀을 포함한다. 특정 구현예에서, Cohn 풀은 하나 이상의 혈액 인자가 전처리 단계, 예를 들어 고체상 (예를 들어, 수산화 알루미늄, 미세하게 분할된 이산화규소 등) 상으로의 흡착, 또는 크로마토그래피 단계 (예를 들어, 이온 교환 또는 헤파린 친화성 크로마토그래피)에서 제거된 저온침전물-결핍 혈장 샘플이다. 인자 8 억제제 우회 활성 (Factor Eight Inhibitor Bypass Activity, FEIBA), 인자 IX-복합체, 인자 VII-농축물, 또는 항트롬빈 III-복합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 혈액 인자는 저온침전물-결핍 혈장 샘플로부터 단리되어 Cohn 풀을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈장 샘플"은 임의의 적합한 물질, 예를 들어 회수된 혈장 또는 공급원 혈장 또는 혈장 분획 또는 혈장 상청액 또는 혈장 유래 단백질 조제물을 지칭한다. 예시적인 "혈장 샘플"은 혈장 또는 혈장 분획으로부터 유래된 IgG, 저온침전물-결핍 혈장으로부터 유래된 IgG, 저온침전물-결핍 혈장의 C-1 에스테라제 억제제 흡착물로부터 유래된 IgG, 이중-고갈 저온침전물-결핍 혈장 (DDCPP)으로부터 유래된 IgG를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이중 고갈 저온침전물-결핍 혈장 (DDCPP/ C-1 에스테라제 억제제 고갈 저온침전물-결핍 혈장"으로도 공지됨)은 영하에 가까운 온도, 예를 들어 약 8 ℃ 미만의 온도에서 저온침전물-결핍 혈장의 C1-억제제의 흡착 후에 형성된 흡착 상청액을 지칭한다. GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare Corporation, 미국 캘리포니아주 웨스트레이크 빌리지 소재) 제조 공정은 동결 인간 혈장 풀로부터 침전물 G (PptG)로 지칭되는 중간 면역글로불린 G (IgG) 분획을 단리하기 위해 변형된 Cohn-Oncley 저온 에탄올 분별 절차를 이용한다. PptG는 후속적인 약한 양이온 및 약한 음이온 교환 크로마토그래피의 사용을 통해 추가로 정제된다. 3개의 전용 바이러스 감소 단계가 PptG의 다운스트림 정제에 포함되며, 이는 용매/세제 처리, 나노여과, 및 최종 제형의 낮은 pH 및 상승된 온도에서의 인큐베이션이다. 에탄올 분별 공정을 위한 출발 물질은 상이한 흡착 단계를 거쳐 응고 인자 및 혈장 단백질 억제제의 정제를 위한 중간체를 수득할 수 있다. CINRYZE® 제조 공정에서 C1-억제제의 흡착 후에 수득된 흡착 상청액은 이중 고갈 저온침전물-결핍 혈장 (DDCPP)으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 또는 변이체 천연"은 임의의 조정 / 변형 없는 출발 물질로서 DDCPP의 사용을 지칭하고, "변이체 헤파린"은 출발 물질에 5000 IU 헤파린/L DDCPP 또는 10000 IU 헤파린/L DDCPP의 첨가를 지칭한다. '변이체 NaC1'은 DDCPP의 전도도를 증가시키기 위한 소듐 클로라이드의 첨가를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C1-억제제 (C1-inh, C1 에스테라제 억제제)"는 세르핀 상과(superfamily)에 속하는 프로테아제 억제제이다. 이의 주요 기능은 자발적인 활성화를 예방하기 위한 보체계의 억제이다. C1-억제제는 혈액 내에서 약 0.25 g/L 수준으로 순환하는 급성기 단백질이다. 수치는 염증 동안 ~2배 상승한다. C1-억제제는 보체의 고전적 경로의 C1 복합체에서 C1r 및 C1s 프로테아제에 비가역적으로 결합하고 이를 불활성화한다. 렉틴 경로의 만노스-결합 렉틴 (MBL) 복합체에서 MASP-1 및 MASP-2 프로테아제도 또한 불활성화된다. 이러한 방식으로, C1-억제제는 C1 및 MBL에 의한 나중의 보체 성분 C4 및 C2의 단백질분해 절단을 예방한다. 이의 보체 억제 활성을 따서 명명되었지만, C1-억제제는 또한 섬유소용해, 응고, 및 키닌 경로의 프로테아제도 억제한다. C1-억제제는 혈장 칼리크레인, FXIa 및 FXIIa의 가장 중요한 생리학적 억제제임에 주목한다.
1. C1-INH 고갈 상청액 분획의 제조
IgG 풍부 분획을 제조하는데 사용되는 출발 물질은 일반적으로 C1-억제제 흡착 후의 상청액 또는 C1-억제제 흡착 후의 동결 혈장 또는 C1-억제제 흡착 후의 비동결 혈장으로 구성된다. 예시적인 샘플, 예를 들어, 혈장 상청액은 CINRYZE® 제조 공정에서 C1-억제제 흡착 후 수득된 흡착 상청액으로 구성된다. 정제 공정은 일반적으로 바람직하게는 안전성 및 품질 고려에 대해 이미 검정된 이전에 동결 풀링된 혈장을 해동하는 것으로 시작한다. 해동은 일반적으로 6 ℃ 이하의 온도에서 수행된다. 낮은 온도에서 동결 혈장의 해동 완료 후, 저온 (예를 들어, ≤ 6 ℃)에서 원심분리를 수행하여 액체 상청액으로부터 고체 저온침전물을 분리한다. 대안적으로, 분리 단계는 원심분리보다는 여과에 의해 수행된다. 그런 다음,　액체　상청액 (저온-가용성 단백질이 원심분리에 의해 신선한 해동된 혈장에서 제거된 후의 "저온침전물-결핍 혈장"으로도 지칭됨)은　하나　이상의　흡착　단계를　거쳐　응고　인자　및　혈장　단백질　억제제의　정제를　위한　중간체를　수득한다. 저온침전물-결핍 혈장으로부터 C1 억제제를 흡착한 후 수득된 흡착 상청액은 이중 고갈 저온침전물-결핍 혈장 (DDCPP)으로도 명명된다.
2. 헤파린화된 분획의 제조
C1-INH 고갈 상청액 분획은 일반적으로 IgG의 제조를 위한 이상적인 출발 물질로 간주되지 않는데, 이는 C1-INH의 고갈이 혈장 칼리크레인, 인자 XIa 및 인자 XIIa의 축적을 초래하기 때문이다. 명백하게 감소된 농도의 C1-INH와 함께 이들 인자의 적절한 제거를 보장하기 위해, 계산된 양의 헤파린 (5000 U/㎏ DDCPP 또는 10,000 U/㎏ DDCPP)이 알코올 분별 공정이 개시되기 전에 C1-INH 고갈 상청액 분획에 첨가되었다. 수득된 최종 IgG 생성물은 1 IU/mL 미만의 잔류 헤파린 농도를 함유하는 것으로 나타났다.
3. 제1 침전 사건 - 변형된 분별 I
분별 I의 출발 물질은 DDCPP (C1-억제제 흡착 후의 상청액)이었다. DDCPP는 일반적으로 약 0 ± 2 ℃로 냉각되고, pH는 산, 예를 들어 아세트산의 첨가에 의해 약 7.0 내지 약 7.5, 바람직하게는 약 7.1 내지 약 7.3, 가장 바람직하게는 약 7.2로 조정된다. 일 구현예에서, 저온침전물-결핍 혈장의 pH는 약 7.2의 pH로 조정된다. 그런 다음, 혈장이 8% v/v 또는 그 정도의 에탄올의 목표 농도로 교반되는 동안 사전-냉각된 에탄올이 첨가된다. 이와 동시에 온도가 약 -2 ℃ 내지 약 +2 ℃로 추가로 낮춰진다. 바람직한 구현예에서, 온도가 -1.5 ℃ 또는 그 정도로 낮춰져 α2-마크로글로불린, β1A- 및 β1C-글로불린, 피브리노겐, 및 인자 VIII과 같은 오염물을 침전시킨다. 일반적으로, 침전 사건은 적어도 약 1 시간의 홀드 시간(hold time)을 포함할 것이지만, 더 짧거나 또는 더 긴 홀드 시간도 또한 이용될 수 있다. 이어서, 이상적으로 DDCPP에 존재하는 벌크의 IgG 함량을 함유하는 상청액 (상청액 I)은 그런 다음 원심분리, 여과 또는 또 다른 적합한 방법에 의해 수집된다.
저온침전물-결핍 혈장에 대한 제1 분별 단계로서 이용되는 통상적인 방법과 비교하여 (Cohn 등, 상기 문헌; Oncley 등, 상기 문헌), 본 발명은 몇몇 구현예에서 상청액 I 분획으로부터 개선된 IgG 수율을 초래하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 개선된 IgG 수율은 분무에 의해 알코올을 첨가함으로써 달성된다. 또 다른 구현예에서, 개선된 IgG 수율은 분무에 의해 pH 변형제를 첨가함으로써 달성된다. 또 다른 구현예에서, 개선된 IgG 수율은 알코올의 첨가 후 용액의 pH를 조정함으로써 달성된다. 관련된 구현예에서, 개선된 IgG 수율은 알코올의 첨가 동안 용액의 pH를 조정함으로써 달성된다.
일 특정 양태에서, 개선은 감소된 양의 IgG가 제1 침전 단계의 침전 분획에서 손실되는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, Cohn 방법 6 프로토콜의 제1 침전 단계에서 손실된 IgG의 양과 비교하여 제1 침전 단계의 침전 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실된다.
특정 구현예에서, 공정 개선은 침전 알코올의 첨가 후에 용액의 pH를 약 7.0 내지 약 7.5로 조정함으로써 실현된다. 다른 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 후에 약 7.1 내지 약 7.3으로 조정된다. 또 다른 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 후에 약 7.0 또는 약 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5로 조정된다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 후에 약 7.2로 조정된다. 이와 같이, 특정 구현예에서, 용액의 pH가 침전 알코올의 첨가 후가 아닌 전에 조정되는 유사 침전 단계와 비교하여 제1 침전 단계의 침전 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실된다. 일 구현예에서, pH는 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써 침전 홀드 시간 또는 인큐베이션 시간 동안 원하는 pH에서 유지된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
다른 특정 구현예에서, 공정 개선은 pH를 조정하는 데 사용되는 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성(fluent) 첨가보다는 분무로 첨가함으로써 실현된다. 이와 같이, 특정 구현예에서, pH를 조정하는 데 사용되는 알코올 및/또는 용액이 유동성 첨가에 의해 도입되는 유사 침전 단계와 비교하여 제1 침전 단계의 침전물 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
또 다른 특정 구현예에서, 개선은 용액의 pH를 약 7.0 내지 약 7.5로 조정함으로써 실현된다. 바람직한 구현예에서, 용액의 pH는 약 7.1 내지 약 7.3으로 조정된다. 다른 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 후 약 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5로 조정되고, pH를 조정하는데 사용되는 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가함으로써 조정된다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 후 약 7.2로 조정되고, pH를 조정하는데 사용되는 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가함으로써 조정된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
4. 제2 침전 사건 - 변형된 분별 II+III
분별의 IgG 함량 및 순도를 추가로 풍부화하기 위해, 상청액 I은 변형된 Cohn-Oncley 분획 II + III 분별인 제2 침전 단계에 적용된다. 일반적으로, 용액의 pH는 약 6.6 내지 약 6.8의 pH로 조정된다. 바람직한 구현예에서, 용액의 pH는 약 6.7로 조정된다. 그런 다음, 알코올, 바람직하게는 에탄올이 용액에 첨가되면서 약 20% 내지 약 25% (v/v)의 최종 농도로 교반되어 분획에서 IgG가 침전된다. 바람직한 구현예에서, 알코올은 약 25% (v/v)의 최종 농도로 첨가되어 분획에서 IgG가 침전된다. 일반적으로, α1-지질단백질, α1-안티트립신, Gc-글로불린, α1X-글리코프로틴(α1X-glycoprotin), 합토글로불린, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 헤모펙신, 크리스마스 인자의 분획, 티록신 결합 글로불린, 콜린에스테라제, 하이퍼텐시노겐, 및 알부민과 같은 오염물은 이러한 조건에 의해 침전되지 않을 것이다.
알코올 첨가 이전에 또는 알코올 첨가와 동시에, 용액은 약 -7 ℃ 내지 약 -9 ℃로 추가로 냉각된다. 바람직한 구현예에서, 용액은 약 -7 ℃의 온도로 냉각된다. 알코올 첨가 완료 후, 용액의 pH는 즉시 약 6.8 내지 약 7.0으로 조정된다. 바람직한 구현예에서, 용액의 pH는 약 6.9로 조정된다. 일반적으로, 침전 사건은 적어도 약 10 시간의 홀드 시간을 포함할 것이지만, 더 짧거나 또는 더 긴 홀드 시간도 또한 이용될 수 있다. 이어서, 이상적으로 저온침전물-결핍 혈장에 존재하는 IgG 함량의 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%를 함유하는 침전물 (변형된 분획 II+III)이 원심분리, 여과 또는 또 다른 적합한 방법에 의해 상청액으로부터 분리되고 수집된다. 저온침전물-결핍 혈장에 대한 제2 분별 단계로 이용되는 통상적인 방법과 비교하여 (Cohn 등, 상기 문헌; Oncley 등, 상기 문헌), 본 발명은 몇몇 구현예에서, 변형된 분획 II+III 침전물에서 개선된 IgG 수율을 초래하는 방법을 제공한다. 관련된 구현예에서, 본 발명은 변형된 II+III 상청액에서 IgG의 감소된 손실을 초래하는 방법을 제공한다.
저온침전물-결핍 혈장에 대한 제2 분별 단계로서 이용되는 통상적인 방법과 비교하여 (Cohn 등, 상기 문헌; Oncley 등, 상기 문헌), 본 발명은 몇몇 구현예에서, 변형된 분획 II+III 침전물에서 개선된 IgG 수율을 초래하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 개선은 분무에 의한 알코올의 첨가에 의해 실현된다. 또 다른 구현예에서, 개선은 분무에 의한 pH 변형제의 첨가에 의해 실현된다. 또 다른 구현예에서, 개선은 알코올의 첨가 후에 용액의 pH를 조정함으로써 실현된다. 관련된 구현예에서, 개선은 알코올의 첨가 동안 용액의 pH를 조정함으로써 실현된다. 또 다른 구현예에서, 개선은 알코올 (예를 들어, 에탄올)의 농도를 약 25% (v/v)로 증가시킴으로써 실현된다. 또 다른 구현예에서, 개선은 침전 단계의 온도를 약 -7 ℃ 내지 약 -9 ℃로 낮춤으로써 실현된다. 바람직한 구현예에서, 개선은 알코올 (예를 들어, 에탄올)의 농도를 약 25% (v/v)로 증가시키고, 온도를 약 -7 ℃ 내지 약 -9 ℃로 낮춤으로써 실현된다. 이와 비교하여, 침전물 내의 오염물의 수준을 감소시키기 위해 Cohn 등 및 Oncley 등 둘 모두는 -5 ℃에서 침전을 수행하고, Oncley 등은 20% 알코올을 사용한다. 유리하게는, 본원에 제공된 방법은 최종 생성물에서 높은 수준의 오염 없이 최대 IgG 수율을 허용한다.
침전 알코올의 첨가 전에 용액의 pH가 약 6.9의 pH로 조정되는 경우, 부분적으로 단백질 침전으로 인해 용액의 pH가 6.9에서 약 7.4 내지 약 7.7로 이동하는 것으로 밝혀졌다. 용액의 pH가 6.9로부터 멀어짐에 따라, IgG의 침전이 덜 양호해지고 특정 오염물의 침전이 더 양호해진다. 유리하게는, 본 발명자는 침전 알코올의 첨가 후에 용액의 pH를 조정함으로써, 더 높은 백분율의 IgG가 분획 II + III 침전물에서 회수된다는 것을 발견하였다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 의해 실현된 개선은 본 발명의 개선이 포함되지 않은 동일한 방법과 비교할 때 변형된 분획 II+III 침전 단계의 상청액 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실되는 방법에 관한 것이다. 다시 말해, 증가된 백분율의 출발 IgG는 분획 II + III 침전물에 존재한다. 특정 구현예에서, 공정 개선은 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안에 용액의 pH를 약 6.7 내지 약 7.1로 조정함으로써 실현된다. 일부 구현예에서, 공정 개선이 침전 및/또는 인큐베이션 기간 동안 지속적으로 용액의 pH를 약 6.7 내지 약 7.1로 유지함으로써 실현된다. 일부 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안에 약 6.8 내지 약 7.0으로, 또는 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안에 약 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 또는 7.1의 pH로 조정된다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안에 약 6.9로 조정된다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 침전 인큐베이션 기간 동안 지속적으로 약 6.8 내지 약 7.0으로, 또는 침전 인큐베이션 기간 동안 지속적으로 약 6.9의 pH로 유지된다. 본 발명의 공정 파라미터를 적용하면, 특정 구현예에서, 용액의 pH가 침전 알코올의 첨가 후가 아닌 전에 조정된 유사 침전 단계, 또는 용액의 pH가 전체 침전 인큐베이션 기간 동안 유지되지 않는 유사 침전 단계와 비교하여 제2 침전 단계의 상청액 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실된다. 일 구현예에서, pH는 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써 침전 홀드 시간 또는 인큐베이션 시간 동안 원하는 pH로 유지된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
일부 구현예에서, 공정 개선은 pH를 조정하기 위해 사용되는 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 이와 같이, 특정 구현예에서, pH를 조정하기 위해 사용되는 알코올 및/또는 용액이 벌크, 유동성 첨가에 의해 도입되는 유사 침전 단계와 비교하여 제2 침전 단계의 상청액 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
또 다른 구현예에서, 공정 개선은 약 -7 ℃ 내지 약 -9 ℃의 온도에서 침전 단계를 수행함으로써 실현된다. 일 구현예에서, 침전 단계는 약 -7 ℃의 온도에서 수행된다. 예시적인 구현예에서, 침전 단계는 약 -8 ℃의 온도에서 수행된다. 다양한 구현예에서, 침전 단계는 약 -9 ℃의 온도에서 수행된다. 특정 구현예에서, 침전 단계의 알코올 농도는 약 23% 내지 약 27%이다. 바람직한 구현예에서, 알코올 농도는 약 24% 내지 약 26%이다. 예시적인 구현예에서, 알코올 농도는 약 25%이다. 일부 구현예에서, 알코올 농도는 23%, 24%, 25%, 26%, 또는 27% 또는 그 정도일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 제2 침전 단계는 약 25%의 알코올 농도로 -7 ℃ 또는 그 정도의 온도에서 수행된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
Oncley 등, 상기문헌에서 사용된 바와 같이, 제2 침전물의 알코올 농도를 20%에서 25%로 증가시키고, Cohn 및 Oncley 방법에서 사용된 바와 같이 인큐베이션의 온도를 -5 ℃에서 약 -7 ℃로 낮추는 것의 효과는 변형된 분획 II+III 침전물의 IgG 함량의 놀라운 5% 내지 6% 증가이다.
또 다른 구현예에서, 공정 개선은 침전 알코올의 첨가 직후 또는 침전 동안에 용액의 pH를 약 6.7 내지 약 7.1, 바람직하게는 6.9 또는 그 정도로 조정하고, 용액의 pH를 약 6.7 내지 약 7.1의 pH, 바람직하게는 6.9 또는 그 정도로 유지하고, 침전 인큐베이션 기간 동안 pH를 지속적으로 조정하고, pH를 조정하기 위해 사용되는 침전 알코올 및/또는 용액을 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다.
예시적인 구현예에서, 공정 개선은 약 -7 ℃ 내지 약 -9 ℃, 예를 들어 - 7℃의 온도에서 침전 단계를 수행하고, IgG를 약 23% 내지 약 27%, 예를 들어 25%의 알코올 농도로 침전시킴으로써 실현된다. 다양한 구현예에서, 공정 개선은 상기 제공된 모든 변형된 분획 II+III 개선을 공정에 포함시킴으로써 실현된다. 예시적인 구현예에서, 공정 개선은 분무에 의해 첨가된 25% 에탄올로 -7 ℃의 온도에서 IgG를 침전시키고, 그런 다음 침전 알코올의 첨가 후 용액의 pH를 6.9로 조정함으로써 실현된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 용액의 pH는 전체 침전 인큐베이션 시간 또는 홀드 시간 동안 6.9로 유지된다.
5. 변형된 분획 II+III 침전물의 추출
변형된 분획 II+III 침전물의 IgG 함량을 가용화하기 위해, 저온 추출 완충액이 약 1 부분 침전물 대 약 15 부분 추출 완충액의 비율로 분별 II+III 침전물을 재현탁하는데 사용되었다. 다른 적합한 재현탁 비율, 예를 들어 약 1:8 내지 약 1:30, 예를 들어 약 1:10 내지 약 1:20, 약 1:12 내지 약 1:18, 약 1:13 내지 약 1:17, 약 1:14 내지 약 1:16이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 재현탁 비율은 약 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 또는 그 초과일 수 있다.
변형된 II+III 침전물의 추출을 위한 적합한 용액은 일반적으로 약 4.0 내지 약 5.5의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 용액은 약 4.5 내지 약 5.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 추출 용액은 약 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 또는 5.5의 pH를 갖는다. 예시적인 구현예에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.5이다. 예시적인 구현예에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.7이다. 예시적인 구현예에서, 추출 완충액의 pH는 약 4.9일 것이다. 일반적으로, 이들 pH 요건은 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 일염기성 포스페이트, 이염기성 포스페이트, 이들의 혼합물 등으로부터 선택되는 완충제를 사용하여 충족될 수 있다. 적합한 완충액 농도는 일반적으로 약 5 내지 약 100 mM, 또는 약 10 내지 약 50 mM, 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 mM 완충제 범위이다.
예시적인 추출 완충액은 약 0.5 mS·cm-1 내지 약 2.0 mS·cm-1의 전도도를 갖는다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 추출 완충액의 전도도는 약 0.5 mS·cm-1, 또는 약 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 약 2.0 mS·cm-1이다. 당업자는 적절한 전도도를 갖는 추출 완충액을 생성하는 방법을 알 것이다.
일 특정 구현예에서, 예시적인 추출 완충액은 약 4.5 ± 0.2의 pH 및 약 0.7 내지 0.9 mS/cm의 전도도에서 약 5 mM 일염기성 소듐 포스페이트 및 약 5 mM 아세테이트일 수 있다.
일반적으로, 추출은 약 0 ℃ 내지 약 10 ℃, 또는 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃에서 수행된다. 특정 구현예에서, 추출은 약 0 ℃, 1 ℃, 2 ℃, 3 ℃, 4 ℃, 5 ℃, 6 ℃, 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃ 또는 10 ℃에서 수행될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 추출은 약 2 ℃ 내지 약 10 ℃에서 수행된다. 일반적으로, 현탁액이 지속적으로 교반되는 동안 추출 공정은 약 60 내지 약 300 분, 또는 약 120 내지 약 240 분, 또는 약 150 내지 약 210 분 동안 진행될 것이다. 특정 구현예에서, 추출 공정은 약 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 약 300 분 동안 진행될 것이다. 바람직한 구현예에서, 추출 공정은 지속적으로 교반하면서 적어도 약 160 분 동안 진행될 것이다.
5 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 5 mM 아세테이트 및 0.051% 내지 0.06% 빙초산 (v/v)을 함유하는 추출 완충액을 이용하는 방법에서, 최종 생성물의 순도를 손상시키지 않으면서 최종 IgG 조성물의 수율 증가의 실질적인 증가가 수득될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 구현예에서, 분획 II+III 침전물은 4.5 ± 0.2 또는 그 정도의 pH에서 약 1:15 또는 그 정도의 페이스트 대 완충액 비율로 추출된다.
유리하게는, 5 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 5 mM 아세테이트 및 0.051% 빙초산 (v/v)을 함유하는 추출 완충액을 이용하는 GAMMAGARD® LIQUID (Baxter Healthcare)에 대한 현재의 제조 공정과 비교하여 빙초산 함량을 0.06% (v/v) 또는 그 정도로 증가시킴으로써, 최종 IgG 조성물의 수율 증가의 실질적인 증가가 수득될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 제2 침전 단계 (GAMMAGARD® LIQUID)에 의해 형성되는 침전물의 추출을 위해 이전에 이용된 방법과 비교하여, 본 발명은 몇몇 구현예에서, 변형된 분획 II+III 현탁액에서 개선된 IgG 수율을 초래하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 개선은 변형된 분획 II + III 침전물의 비-가용화 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실되는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 공정 개선은 5 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 5 mM 아세테이트, 및 0.06% 빙초산 (v/v)을 함유하는 용액으로 변형된 분획 II + III 침전물을 1:15의 비율 (침전물 대 완충액)로 추출함으로써 실현된다. 또 다른 구현예에서, 개선은 추출 공정의 기간 동안 용액의 pH를 비교적 일정하게 유지함으로써 실현된다. 일 구현예에서, 용액의 pH는 추출 공정의 기간 동안 약 4.1 내지 약 4.9로 유지된다. 예시적인 구현예에서, 용액의 pH는 추출 공정의 기간 동안 약 4.2 내지 약 4.8로 유지된다. 일부 구현예에서, 용액의 pH는 추출 공정의 기간 동안 약 4.3 내지 약 4.7로 유지된다. 다양한 구현예에서, 용액의 pH는 추출 공정의 기간 동안 약 4.4 내지 약 4.6으로 유지된다. 일부 구현예에서, 용액의 pH는 추출 공정의 기간 동안 4.5로 유지된다.
예시적인 구현예에서, 개선은 분획 II+III 용해 단계에서 분획 II+III 침전물로부터 증가된 양의 IgG가 가용화되는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 공정 개선은 분획 II+III 침전물을 약 1000 L당 약 600 mL 빙초산을 함유하는 용해 완충액에 가용화시킴으로써 실현된다. 또 다른 구현예에서, 개선은 분획 II+III 침전물에서 IgG가 가용화된 후에 불순물이 감소되는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 공정 개선은 미세하게 분할된 이산화규소 (SiO2)를 분획 II + III 현탁액과 적어도 약 30 분 동안 혼합함으로써 실현된다.
6. 변형된 분획 II + III 현탁액의 전처리 및 여과
변형된 분획 II+III 침전물의 비-가용화된 분획 (즉, 변형된 분획 II+III 필터 케이크)을 제거하기 위해, 현탁액이 일반적으로 심층 여과를 사용하여 여과된다. 본원에 제공된 방법에서 이용될 수 있는 심층 필터는 금속, 유리, 세라믹, 유기 (예컨대 규조토) 심층 필터 등을 포함한다. 적합한 필터의 예는 Cuno 50SA, Cuno 90SA, 및 Cuno VR06 필터 (Cuno)를 제한 없이 포함한다. 대안적으로, 분리 단계는 여과보다는 원심분리에 의해 수행될 수 있다.
상기 기재된 제조 공정 개선은 정제 공정의 초기 단계에서 IgG 손실을 최소화하지만, PKA 활성, 아미도분해 활성 및 피브리노겐 함량을 포함하는 결정적인 불순물은, 예를 들어 II+III 페이스트가 pH 4.5 또는 4.6에서 추출될 때, 추출이 약 4.9 내지 5.0의 pH에서 일어날 때와 비교하여 훨씬 더 높다.
본원에 제공된 방법에서 추출된 불순물을 완화하기 위해, IgG 조성물의 순도는 여과/원심분리 전의 전처리 단계의 첨가에 의해 크게 향상될 수 있는 것으로 현재 밝혀졌다. 일 구현예에서, 이 전처리 단계는 미세하게 분할된 이산화규소 입자 (예를 들어, 퓸드 실리카(fumed silica), Aerosil®)의 첨가를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 이 처리 후에 40 내지 80 분의 인큐베이션 기간이 뒤따르고, 이 기간 동안 현탁액은 일정하게 혼합된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 50 분 내지 약 70 분이다. 다양한 구현예에서, 인큐베이션 기간은 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 분 이상이다. 일반적으로, 처리는 약 0 ℃ 내지 약 10 ℃, 또는 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃에서 수행될 것이다. 특정 구현예에서, 처리는 약 0 ℃, 1 ℃, 2 ℃, 3 ℃, 4 ℃, 5 ℃, 6 ℃, 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃ 또는 10 ℃에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 처리는 약 2 ℃ 내지 약 10 ℃에서 수행된다.
퓸드 실리카 처리는 WO2011150284A2에 예시되어 있다. 이 특허 출원에서, 분획 II+III 침전물은 현탁되고, 2개의 샘플로 분할되며, 이들 중 하나는 오직 여과 전에만 필터 보조제로 정화되고, 이들 중 하나는 필터 보조제의 첨가 및 여과 전에 퓸드 실리카로 처리된다. 크로마토그래프 및 정량화된 데이터에서 볼 수 있는 바와 같이, 퓸드 실리카로 전처리된 여과액 샘플은 오직 필터 보조제로만 처리된 샘플보다 훨씬 더 높은 IgG 순도를 가졌다.
특정 구현예에서, 퓸드 실리카는 약 20 g/kg II+III 페이스트 내지 약 100 g/kg II+III 페이스트의 농도로 첨가된다 (예를 들어, 1:15의 비율로 추출되는 변형된 분획 II+III 침전물의 경우, 퓸드 실리카는 약 20 g/16 kg II+III 현탁액 내지 약 100 g/16 kg II+III 현탁액의 농도로, 또는 약 0.125% (w/w) 내지 약 0.625% (w/w)의 최종 농도로 첨가되어야 한다). 특정 구현예에서, 퓸드 실리카는 약 20 g/㎏ II + III 페이스트, 또는 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 g/kg II + III 페이스트의 농도로 첨가될 수 있다. 일 특정 구현예에서, 퓸드 실리카 (예를 들어, Aerosil 380 또는 등가물)는 변형된 분획 II + III 현탁액에 약 40 g/16 kg II + III의 최종 농도로 첨가된다. 혼합은 약 2 내지 약 8 ℃에서 적어도 약 50 내지 약 70 분 동안 일어난다.
특정 구현예에서, SiO2는 약 0.01 g/g 단백질 내지 약 10 g/g 단백질의 농도로 IgG 조성물에 첨가된다. 또 다른 구현예에서, SiO2는 약 0.01 g/g 단백질 내지 약 5 g/g 단백질의 농도로 IgG 조성물에 첨가된다. 또 다른 구현예에서, SiO2는 약 0.02 g/g 단백질 내지 약 4 g/g 단백질의 농도로 IgG 조성물에 첨가된다. 일 구현예에서, SiO2는 총 단백질 그램당 적어도 0.1 g의 최종 농도로 첨가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 퓸드 실리카는 총 단백질 그램당 적어도 0.2 g의 농도로 첨가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 퓸드 실리카는 총 단백질 그램당 적어도 0.25 g의 농도로 첨가된다. 다른 특정 구현예에서, 퓸드 실리카는 총 단백질 그램당 적어도 1 g의 농도로 첨가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 퓸드 실리카는 총 단백질 그램당 적어도 2 g의 농도로 첨가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 퓸드 실리카는 총 단백질 그램당 적어도 2.5 g의 농도로 첨가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 미세하게 분할된 이산화규소는 적어도 0.01 g/g 총 단백질 또는 총 단백질 그램당 적어도 0.02 g, 0.03 g, 0.04 g, 0.05 g, 0.06 g, 0.07 g, 0.08 g, 0.09 g, 0.1 g, 0.2 g, 0.3 g, 0.4 g, 0.5 g, 0.6 g, 0.7 g, 0.8 g, 0.9 g, 1.0 g, 1.5 g, 2.0 g, 2.5 g, 3.0 g, 3.5 g, 4.0 g, 4.5 g, 5.0 g, 5.5 g, 6.0 g, 6.5 g, 7.0 g, 7.5 g, 8.0 g, 8.5 g, 9.0 g, 9.5 g, 10.0 g 이상의 농도로 첨가된다.
특정 구현예에서, 필터 보조제, 예를 들어 Celpure C300 (Celpure) 또는 Hyflo-Supper-Cel (World Minerals)이 이산화규소 처리 후에 첨가되어 심층 여과를 용이하게 한다. 필터 보조제는 약 0.01 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 1.0 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.02 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.8 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.03 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.7 kg/kg II+III 페이스트의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 다른 구현예에서, 필터 보조제는 약 0.01 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.07 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.02 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.06 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.03 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.05 kg/kg II+III 페이스트의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 필터 보조제는 약 0.01 kg/kg II + III 페이스트, 또는 약 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0 kg/kg II + III 페이스트의 최종 농도로 첨가될 것이다.
IgG를 정제하는 이전 방법에서, IgG의 유의한 분획은 공정에서 여과 단계 동안 손실되었다. 필터 프레스 프레임 및 라인을 제거하기 위해 1.8 데드 볼륨의 현탁 완충액을 사용하는, 여과 후 세척의 표준 방법은 이 단계에서 IgG의 최대 회수에 불충분하다는 것이 발견되었다. 놀랍게도, 현탁 완충액의 적어도 3.0 데드 볼륨, 예를 들어, 3.6 데드 볼륨은 변형된 분획 II+III 정화된 현탁액에서 IgG의 효율적인 회수에 유용하다는 것이 발견되었다. 특정 구현예에서, 필터 프레스는 임의의 적합한 현탁 완충액으로 세척된다. 예시적인 구현예에서, 세척 완충액은 예를 들어, 5 mM 일염기성 소듐 포스페이트, 5 mM 아세테이트, 및 0.015% 빙초산 (v/v)을 포함할 것이다.
일 구현예에서, 개선은 분획 II + III 현탁액 여과 단계 동안 감소된 양의 IgG가 손실되는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 공정 개선은 1000 L당 빙초산 150 mL를 함유하는 용해 완충액의 적어도 약 3.6 데드 볼륨으로 필터를 후-세척(post-washing)함으로써 실현된다. 일 구현예에서, 후-세척 추출 완충액의 pH는 약 4.6 내지 약 5.3이다. 바람직한 구현예에서, 후-세척 완충액의 pH는 약 4.7 내지 약 5.2이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 후-세척 완충액의 pH는 약 4.8 내지 약 5.1이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 후-세척 완충액의 pH는 약 4.9 내지 약 5.0이다.
제2 침전 단계로부터 형성된 현탁액의 정화를 위해 이전에 이용된 방법과 비교하여, 본 발명은, 몇몇 구현예에서, 정화된 분획 II+III 현탁액에서 개선된 IgG 수율 및 순도를 초래하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 개선은 감소된 양의 IgG가 변형된 분획 II + III 필터 케이크에서 손실되는 방법에 관한 것이다. 다른 양태에서, 개선은 감소된 양의 불순물이 정화된 분획 II+III 현탁액에서 발견되는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 공정 개선은 분획 II + III 현탁액의 여과 또는 원심 정화 이전에 퓸드 실리카 처리를 포함시킴으로써 실현된다. 특정 구현예에서, 퓸드 실리카 처리는 약 0.01 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.07 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.02 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.06 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.03 kg/kg II+III 페이스트 내지 약 0.05 kg/kg II+III 페이스트, 또는 약 0.02 kg/kg II+III 페이스트, 0.03 kg/kg II+III 페이스트, 0.04 kg/kg II+III 페이스트, 0.05 kg/kg II+III 페이스트, 0.06 kg/III 페이스트, 0.07 kg/kg II+III 페이스트, 0.08 kg/kg II+III 페이스트, 0.09 kg/kg II+III 페이스트, 또는 0.1 kg/kg II+III 페이스트의 첨가를 포함할 것이고, 혼합물은 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃의 온도에서 약 50 분 내지 약 70 분, 또는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 분 이상 동안 인큐베이션될 것이다. 또 다른 구현예에서, 공정 개선은 잔류 피브리노겐, 아미도분해 활성 및/또는 프리칼리크레인 활성화제 활성의 수준을 감소시키는 퓸드 실리카 처리를 포함시킴으로써 실현된다. 특정 구현예에서, 공정 개선은 면역글로불린 조제물에서 FXI, FXIa, FXII, 및 FXIIa의 수준을 감소시키는 퓸드 실리카 처리를 포함시킴으로써 실현된다.
또 다른 구현예에서, 공정 개선은 변형된 분획 II + III 현탁액 여과 단계를 완료한 후에 약 3 내지 약 5 볼륨의 필터 데드 볼륨으로 심층 필터를 세척함으로써 실현된다. 특정 구현예에서, 필터는 약 3.5 볼륨 내지 약 4.5 볼륨, 또는 적어도 약 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 볼륨의 필터 데드 볼륨으로 세척된다. 특정 구현예에서, 필터 프레스는 적어도 약 3.6 데드 볼륨의 현탁 완충액으로 세척된다.
7. 세제 처리
변형된 분획 II+III 여과액으로부터 추가적인 오염물을 제거하기 위해, 샘플은 다음에 세제 처리된다. 혈장 유래 분획의 세제 처리 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 임의의 표준 비이온성 세제 처리는 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 세제 처리를 위한 예시적인 프로토콜이 아래에 제공된다.
간략하게, 예시적인 구현예에서, 세제, 예를 들어 폴리소르베이트-80은 약 0.2% (w/v)의 최종 농도로 변형된 분획 II+III 여과액에 교반되면서 첨가되고, 샘플은 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃의 온도에서 적어도 약 30 분 동안 인큐베이션된다. 그런 다음, 소듐 시트레이트 디하이드레이트는 약 8 g/L의 최종 농도로 용액에 혼합하고, 샘플은 약 2 내지 8 ℃의 온도에서 지속적으로 교반되면서 추가 30 분 동안 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 임의의 적합한 비이온성 세제가 사용된다. 적합한 비이온성 세제의 예는 옥틸글루코시드, Digitonin, C12E8, Lubrol, Triton X-100, Nonidet P-40, Tween-20 (즉, 폴리소르베이트-20), Tween-80 (즉, 폴리소르베이트-80), 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), Brij 세제, 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴록사머, 옥틸 글루코시드, 데실 말토시드 등을 제한 없이 포함한다.
일 구현예에서, 공정 개선은 유동성 첨가보다는 분무에 의해 세제 시약 (예를 들어, 폴리소르베이트-80 및 소듐 시트레이트 디하이드레이트)을 첨가함으로써 실현된다. 다른 구현예에서, 첨가제의 신속한 분포를 보장하기 위해 샘플이 혼합되는 동안 세제 시약은 변형된 분획 II + III 여과액에 고체로서 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 국부적인 과농도가 발생하지 않도록, 유동성 첨가와 같이, 여과액의 비편재화된 표면적 위에 고체를 살포함으로써 고체 시약을 첨가하는 것이 바람직하다.
8. 제3 침전 사건 - 침전 G
예시적인 구현예에서, 몇몇 잔류 소단백질, 예를 들어 알부민 및 트랜스페린을 제거하기 위해 제3 침전이 25% 알코올의 농도에서 수행된다. 간략하게, 세제 처리된 II+III 여과액의 pH는 적합한 pH 변형 용액 (예를 들어, 1M 소듐 하이드록사이드 또는 1M 아세트산)으로 약 6.8 내지 약 7.2, 예를 들어, 약 6.9 내지 약 7.1, 예를 들어, 약 7.0으로 조정된다. 그런 다음, 저온 알코올은 최종 농도 약 25% (v/v)로 용액에 첨가되고, 혼합물은 약 -6 ℃ 내지 약 -10 ℃에서 적어도 1시간 동안 교반되는 동안 인큐베이션되어 제3 침전물 (즉, 침전물 G)을 형성한다. 일 구현예에서, 혼합물은 적어도 2 시간, 또는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 시간 이상 동안 인큐베이션된다. 바람직한 구현예에서, 혼합물은 적어도 2 시간 동안 인큐베이션된다. 예시적인 구현예에서, 혼합물은 적어도 4 시간 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 혼합물은 적어도 8 시간 동안 인큐베이션된다.
일 구현예에서, 본 발명의 공정 개선은 제3 침전 단계의 상청액 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실되는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 공정 개선은 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안에 용액의 pH를 약 6.8 내지 약 7.2로 조정함으로써 실현된다. 또 다른 구현예에서, 공정 개선은 침전 인큐베이션 기간 동안 지속적으로 용액의 pH를 약 6.8 내지 약 7.2로 유지함으로써 실현된다. 일부 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안 약 6.9 내지 약 7.1로, 또는 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안에 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 또는 7.2의 pH로 조정된다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 침전 알코올의 첨가 직후 또는 첨가 동안 약 7.0으로 조정된다. 특정 구현예에서, 용액의 pH는 침전 인큐베이션 기간 동안 지속적으로 약 6.9 내지 약 7.1에서, 또는 침전 인큐베이션 기간 동안 지속적으로 약 7.0의 pH에서 유지된다. 개선된 방법에 따르면, 특정 구현예에서, 용액의 pH가 침전 알코올의 첨가 후가 아닌 전에 조정되는 유사 침전 단계 또는 용액의 pH가 전체 침전 인큐베이션 기간 동안 유지되지 않는 유사 침전 단계와 비교하여 제3 침전 단계의 상청액 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실된다. 일 구현예에서, pH는 용액의 pH를 지속적으로 조정함으로써 침전 홀드 시간 또는 인큐베이션 시간 동안 원하는 pH로 유지된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
일부 구현예에서, 공정 개선은 pH를 조정하기 위해 사용되는 침전 알코올 및/또는 용액을 벌크, 유동성 첨가보다는 분무에 의해 첨가함으로써 실현된다. 이와 같이, 특정 구현예에서, pH를 조정하기 위해 사용되는 알코올 및/또는 용액이 유동성 첨가에 의해 도입되는 유사 침전 단계와 비교하여 제3 침전 단계의 상청액 분획에서 감소된 양의 IgG가 손실된다. 일 구현예에서, 알코올은 에탄올이다.
9. 침전물 G (PptG)의 현탁 및 여과
침전물 G의 IgG 함량을 가용화하기 위해, 저온 추출 완충액이 PptG를 재현탁하는데 사용된다. 간략하게, 침전물 G는 약 0 ℃ 내지 약 8 ℃에서 주사용수 (WFI)에 1 내지 3.5로 용해되어 약 40 내지 95의 AU280-320 값을 달성한다. 그런 다음, 적어도 2 시간 동안 교반되는 용액의 최종 pH가 약 5.2 ± 0.2로 조정된다. 일 구현예에서, 이 pH 조정은 1M 아세트산으로 수행된다. IgG의 가용성을 증가시키기 위해, 현탁액의 전도도가 약 2.5 내지 약 6.0 mS/cm로 증가된다. 일 구현예에서, 전도도는 소듐 클로라이드의 첨가에 의해 증가된다. 그런 다음, 임의의 용해되지 않은 입자를 제거하기 위해 현탁된 PptG 용액은 약 0.1 μm 내지 약 0.4 μm의 공칭 기공 크기(nominal pore size)를 갖는 적합한 심층 필터로 여과된다. 일 구현예에서, 심층 필터의 공칭 기공 크기는 정화된 여과액을 수득하기 위해 약 0.2 μm (예를 들어, Cuno VR06 필터 또는 등가물)이다. 또 다른 구현예에서, 현탁된 PptG 용액은 정화된 상청액을 회수하기 위해 원심분리된다. 필터의 후-세척은 약 2.5 내지 약 6.0 mS/cm의 전도도를 갖는 소듐 클로라이드 용액을 사용하여 수행된다. 일반적으로, 침전물 G의 추출에 적합한 용액은 WFI 및 낮은 전도도 완충액을 포함한다. 일 구현예에서, 낮은 전도도 완충액은 약 10 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충액은 약 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충액은 약 6 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충액은 약 4 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 낮은 전도도 완충액은 약 2 mS/cm 미만의 전도도를 갖는다.
10. 용매 세제 처리
혈장-유래 생성물에 존재할 수 있는 다양한 바이러스 오염물을 불활성화하기 위해, 정화된 PptG 여과액이 다음에 용매 세제 (S/D) 처리된다. 혈장 유래 분획의 세제 처리 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (검토를 위해, Pelletier JP 등, Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42 참조). 일반적으로, 임의의 표준 S/D 처리가 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. S/D 처리를 위한 예시적인 프로토콜이 아래에 제공된다.
간략하게, Triton X-100, Tween-20, 및 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)가 각각 약 1.0%, 0.3%, 및 0.3%의 최종 농도로 정화된 PptG 여과액에 첨가된다. 그런 다음, 혼합물은 약 18 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도에서 적어도 약 한 시간 동안 교반된다.
일 구현예에서, 공정 개선은 벌크, 유동성 첨가보다는 분무에 의해 S/D 시약 (예를 들어, Triton X-100, Tween-20, 및 TNBP)을 첨가함으로써 실현된다. 다른 구현예에서, 세제 시약은 정화된 PptG 여과액에 고체로서 첨가될 수 있고, 이는 S/D 성분의 신속한 분포를 보장하기 위해 혼합된다. 특정 구현예에서, 국부적인 과농도가 발생하지 않도록, 유동성 첨가와 같이, 여과액의 비편재화된 표면적 위에 고체를 살포함으로써 고체 시약을 첨가하는 것이 바람직하다.
11. 이온 교환 크로마토그래피
S/D 처리된 PptG 여과액으로부터 IgG를 추가로 정제하고 농축하기 위해, 양이온 교환 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피가 이용될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 IgG를 정제하고 농축하는 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,886,154는 낮은 pH (약 3.8 내지 4.5)에서 분획 II+III 침전물을 추출한 후, 카프릴산을 사용하여 IgG를 침전시키고, 최종적으로 2개의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 실시하는 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 6,069,236은 알코올 침전에 전혀 의존하지 않는 크로마토그래피 IgG 정제 반응식을 기재한다. PCT 공개 번호 WO 2005/073252는 분획 II+III 침전물의 추출, 카프릴산 처리, PEG 처리, 및 단일 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 IgG 정제 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 7,186,410은 분획 I+II+III 또는 분획 II 침전물 중 하나를 추출한 후에 알칼리성 pH에서 수행되는 단일 음이온 교환 단계를 포함하는 IgG 정제 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 7,553,938은 분획 I+II+III 또는 분획 II+III 침전물 중 하나의 추출, 카프릴레이트 처리, 및 하나 또는 두 개의 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 6,093,324는 약 6.0 내지 약 6.6의 pH에서 작동되는 거대다공성(macroporous) 음이온 교환 수지의 사용을 포함하는 정제 방법을 기재한다. 미국 특허 번호 6,835,379는 알코올 분별의 부재하에 양이온 교환 크로마토그래피에 의존하는 정제 방법을 기재한다. 상기 간행물의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, S/D 처리된 PptG 여과액은 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 둘 모두에 적용될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, S/D 처리된 PptG 여과액이 양이온 교환 컬럼으로 통과되고, 이는 용액 내의 IgG에 결합한다. 그런 다음, S/D 시약은 흡수된 IgG로부터 세척될 수 있고, 이어서 이는 약 8.0 내지 9.0의 pH를 갖는 높은 pH 용리 완충액으로 컬럼으로부터 용리된다. 이 방식으로, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 조제물로부터 S/D 시약을 제거하는데 또는 IgG 함유 용액을 농축하는데 또는 둘 모두에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, pH 용리 완충액은 약 8.2 내지 약 8.8, 또는 약 8.4 내지 약 8.6의 pH, 또는 약 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0의 pH를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 약 8.5 ± 0.1이다.
특정 구현예에서, 양이온 교환 컬럼으로부터의 용리액은 더 낮은 pH, 예를 들어 약 5.5 내지 약 6.5로 조정될 수 있고, 용액의 전도도가 감소되도록 적절한 완충액으로 희석될 수 있다. 특정 구현예에서, 양이온 교환 용리액의 pH는 약 5.7 내지 약 6.3, 또는 약 5.9 내지 약 6.1의 pH, 또는 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5의 pH로 조정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 용리액의 pH는 약 6.0 ± 0.1의 pH로 조정된다. 그런 다음, 용리액은 음이온 교환 컬럼에 로딩되고, 이는 조제물에서 발견되는 몇몇 오염물에 결합한다. IgG 분획을 함유하는 컬럼 관류액 (column flow through)은 컬럼 로딩 및 세척 동안 수집된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 이온 교환 크로마토그래피 단계는 컬럼 모드, 배치 모드(batch mode), 또는 이 둘의 조합으로 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 공정 개선은 벌크, 유동성 첨가보다는, 분무에 의해 pH를 조정하는데 사용되는 용액을 첨가함으로써 실현된다.
12. 나노여과 및 한외여과/정용여과
본원에 제공된 IgG 조성물의 바이러스 부하를 추가로 감소시키기 위해, 일부 구현예에서, 음이온 교환 컬럼 유출물은 적합한 나노여과 장치를 사용하여 나노여과된다. 특정 구현예에서, 나노여과 장치는 약 15 nm 내지 약 200 nm의 평균 기공 크기를 갖는다. 이 용도에 적합한 나노필터의 예는, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N, 및 75N (Planova)을 제한 없이 포함한다. 특정 구현예에서, 나노필터는 약 15 nm 내지 약 72 nm, 또는 약 19 nm 내지 약 35 nm, 또는 약 15 nm, 19 nm, 35 nm, 또는 72 nm의 평균 기공 크기를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 나노필터는 Asahi PLANOVA 35N 필터 또는 이의 등가물과 같이 약 35 nm의 평균 기공 크기를 가질 것이다.
선택적으로, 한외여과/정용여과가 나노여과액을 추가로 농축하기 위해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 개방 채널 막은 특이적으로 설계된 후-세척과 사용되고 생산 공정 종결 부근의 제형은 생성된 IgG 조성물이 종래의 IVIG (예를 들어, GAMMAGARD® LIQUID)와 비교해 수율 및 저장 안정성에 영향을 미치지 않으면서 단백질 농도에서 약 2배 더 높도록 (200 mg/mL)한다. 대부분의 상업적으로 이용 가능한 한외여과 막에서, 200 mg/mL IgG의 농도는 주요 단백질 손실 없이 도달될 수 없다. 이러한 막은 조기에 차단될 것이며, 따라서 적절한 후-세척은 달성하기 어렵다. 따라서, 개방 채널 막 구성이 사용되어야 한다. 개방 채널 막을 사용하더라도, 특이적으로 설계된 후-세척 절차가 유의한 단백질 손실 없이 (2% 미만의 손실) 요구되는 농도를 수득하기 위해 사용되어야 한다. 더욱 더 놀라운 것은 200 mg/mL의 더 높은 단백질 농도가 낮은 pH 저장 단계의 바이러스 불활성화 능력을 약화시키지 않는다는 사실이다.
나노여과에 이어서, 여과액은 한외여과/정용여과에 의해 추가로 농축될 수 있다. 일 구현예에서, 나노여과액은 한외여과에 의해 약 2% 내지 약 10% (w/v)의 단백질 농도로 농축된다. 특정 구현예에서, 한외여과는 개방 채널 스크린이 있는 카세트에서 수행되고, 한외여과 막은 약 100 kDa 미만 또는 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 이하의 kDa의 공칭 분자량 컷 오프 (NMWCO)를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 한외여과 막은 50 kDa 이하의 NMWCO를 갖는다.
한외여과 단계 완료 시, 농축물은 정맥내 또는 근육내 투여에 적합한 용액에 대해 정용여과를 통해 추가로 농축될 수 있다. 특정 구현예에서, 정용여과 용액은 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 안정화제 및 완충제는 적절한 농도, 예를 들어 약 0.20 M 내지 약 0.30 M, 또는 약 0.22 M 내지 약 0.28 M, 또는 약 0.24 M 내지 약 0.26 mM의 농도, 또는 약 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0의 농도의 글리신이다. 바람직한 구현예에서, 정용여과 완충액은 약 0.25 M 또는 그 정도의 글리신을 함유한다.
일반적으로, 최소 교환 볼륨은 원래 농축물 볼륨의 적어도 약 3배 또는 원래의 농축물 볼륨의 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9배 이상이다. IgG 용액은 약 5% 내지 약 25% (w/v), 또는 약 6% 내지 약 18% (w/v), 또는 약 7% 내지 약 16% (w/v), 또는 약 8% 내지 약 14% (w/v), 또는 약 9% 내지 약 12%의 최종 단백질 농도, 또는 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% 이상의 최종 농도로 농축될 수 있다. 일 구현예에서, 적어도 약 23%의 최종 단백질 농도가 후-세척 분획을 농축된 용액에 첨가하지 않고 달성된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 약 24%의 최종 단백질 농도는 후-세척 분획을 농축 용액에 첨가하지 않고 달성된다. 적어도 약 25%의 최종 단백질 농도가 후-세척 분획을 농축된 용액에 첨가하지 않고 달성된다. 일반적으로, 농축 공정의 종결 시, 용액의 pH는 약 4.6 내지 5.1일 것이다.
예시적인 구현예에서, IgG 조성물의 pH는 한외여과 전에 약 4.5로 조정된다. 용액은 한외여과를 통하여 5 ± 2% w/v의 단백질 농도로 농축된다. UF 막은 50,000 달톤 이하 (Millipore Pellicon 폴리에테르 설폰 막)의 공칭 분자량 컷 오프 (NMWCO)를 갖는다. 농축물은 10 볼륨의 0.25 M 글리신 용액, pH 4.5 ± 0.2에 대해 정용여과된다. 한외-정용여과 작동 전반에 걸쳐, 용액은 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃의 온도로 유지된다. 정용여과 후, 용액은 적어도 11% (w/v)의 단백질 농도로 농축된다.
13. 제형
정용여과 단계 완료 시, 용액의 단백질 농도는 정용여과 완충액으로 약 5% 내지 약 20% (w/v), 또는 약 6% 내지 약 18% (w/v), 또는 약 7% 내지 약 16% (w/v), 또는 약 8% 내지 약 14% (w/v), 또는 약 9% 내지 약 12%의 최종 농도, 또는 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%의 최종 농도로 조정된다. 예시적인 구현예에서, 용액의 최종 단백질 농도는 약 9% 내지 약 11%, 예를 들어 10%이다.
다양한 구현예에서, 제형화된 벌크 용액은 약 0.22 미크론 이하, 예를 들어 약 0.2 미크론의 절대 공극 크기를 갖는 막 필터를 통해 여과함으로써 추가로 살균된다. 용액은 선택적으로 적절한 밀봉을 위해 최종 용기 내로 무균으로 분포되며, 시험을 위해 샘플이 취해진다.
일 구현예에서, IgG 조성물은 정용여과 완충액으로 약 10.2 ± 0.2% (w/v)의 농도로 추가로 조정된다. 필요에 따라 pH가 약 4.4 내지 약 4.9로 조정된다. 마지막으로, 용액이 멸균 여과되고, 약 30 ℃에서 3 주 동안 인큐베이션된다.
14. 치료 방법
현대 의학에서 일상적으로 실시되는 바와 같이, 농축된 면역글로불린 (특히 IgG)의 멸균 조제물은 이들 3가지 주요 부류인 면역 결핍, 염증성 및 자가면역 질환, 및 급성 감염에 속하는 의학적 병태를 치료하는데 사용된다. 이들 IgG 조제물은 또한 다발성 경화증 (특히, 재발-완화성 다발성 경화증 또는 RRMS), 알츠하이머병, 및 파킨슨병을 치료하는데 유용할 수 있다. 이 발명의 정제된 IgG 조제물은 이러한 목적 뿐만 아니라 IgG 조제물의 다른 임상적으로 허용되는 용도에 적합하다.
FDA는 동종이계 골수 이식, 만성 림프성 백혈병, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 소아 HIV, 1차 면역결핍증, 가와사키병, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 및 높은 항체 수용자 또는 ABO 부적합 공여자와의 신장 이식을 포함하는 다양한 징후를 치료하기 위한 IVIG의 사용을 승인하였다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 IVIG 조성물은 이들 질환 및 병태의 치료 또는 관리에 유용하다.
게다가, IVIG에 대한 오프-라벨(off-label) 사용은 다양한 징후, 예를 들어 만성 피로 증후군, 클로스트리듐 디피실 대장염, 피부근염 및 다발성근염, 그레이브스 안과병증, 길랑-바레 증후군, 근이영양증, 봉입체 근염, 람베르트-이튼 증후군, 홍반성 루푸스, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증, 신생아 동종면역 혈소판감소증, 파보바이러스 B19 감염, 천포창, 수혈 후 자반병, 신장 이식 거부, 자연 유산/유산(spontaneous Abortion/Miscarriage), 강직 인간 증후군, 안구간대경련 근간대경련(opsoclonus Myoclonus), 성인 중환자의 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크, 독성 표피 괴사용해, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, X-연관 무감마글로불린증, 및 저감마글로불린혈증의 치료 또는 관리를 위해 환자에게 일반적으로 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 IVIG 조성물은 이들 질환 및 병태의 치료 또는 관리에 유용하다.
마지막으로, 1차 면역 결핍, RRMS, 알츠하이머병, 및 파킨슨병을 포함하는 질환의 치료 또는 관리를 위한 IVIG의 실험적 사용이 제안되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 U.S. 2009/0148463, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 특정 구현예에서, 본원에 제공된 IVIG 조성물은 1차 면역 결핍, RRMS, 알츠하이머병, 또는 파킨슨병의 치료 또는 관리에 유용하다. 일일 투여를 포함하는 특정 구현예에서, 대상체에게 투여되는 유효량은 연령, 체중, 질환 중증도, 투여 경로 (예를 들어, 정맥내 대 피하) 및 요법에 대한 반응의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 이 발명의 면역글로불린 조제물은 약 5 mg/킬로그램 내지 약 2000 mg/킬로그램으로 매일 대상체에게 투여될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 면역글로불린 조제물은 적어도 약 10 mg/킬로그램, 적어도 15 mg/킬로그램, 적어도 20 mg/킬로그램, 적어도 25 mg/킬로그램, 적어도 30 mg/킬로그램, 또는 적어도 50 mg/킬로그램의 양으로 투여될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 면역글로불린 조제물은 최대 약 100 mg/킬로그램, 약 150 mg/킬로그램, 약 200 mg/킬로그램, 약 250 mg/킬로그램, 약 300 mg/킬로그램, 약 400 mg/킬로그램의 용량으로 매일 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 면역글로불린 조제물의 용량은 더 많거나 더 적을 수 있다. 또한, 면역글로불린 조제물은 하루에 한 번 이상의 용량으로 투여될 수 있다. IgG 조제물에 의해 치료되는 질환에 익숙한 임상의는 당업계에 공지된 기준에 따라 환자에 대한 적절한 용량을 결정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 치료 과정을 완료하는데 필요한 시간은 의사에 의해 결정될 수 있고, 짧게는 하루 내지 한 달 초과의 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, 치료 과정은 1 내지 6 개월일 수 있다.
유효량의 IVIG 조제물은 정맥내 수단에 의해 대상체에게 투여된다. 용어 "유효량"은 대상체에서 질환 또는 병태의 개선 또는 치유를 초래하는 IVIG 조제물의 양을 지칭한다. 대상체에게 투여되는 유효량은 연령, 체중, 치료되는 중인 질환 또는 병태, 질환 중증도 및 요법에 대한 반응의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, IVIG 조제물은 투여당 약 5 mg/킬로그램 내지 약 2000 mg/킬로그램의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 용량은 적어도 약 5 mg/kg, 또는 적어도 약 10 mg/kg, 또는 적어도 약 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg,, 1900 mg/kg,, 또는 적어도 약 2000 mg/kg일 수 있다.
IVIG 치료의 투여량 및 빈도는 다른 요인들 중에서도. 치료되는 중인 질환 또는 병태 및 환자의 질환 또는 병태의 중증도에 의존할 것이다. 일반적으로, 1차 면역 기능장애의 경우, 약 100 mg/kg 내지 약 400 mg/kg 체중의 용량이 약 3 내지 4 주마다 투여될 것이다. 신경계 질환 및 자가면역 질환의 경우, 최대 2 g/kg 체중이 한 달에 한 번 5 일에 걸친 과정이 3 내지 6 개월 동안 실행된다. 이는 일반적으로 약 3 내지 4 주마다 한 번 약 100 mg/kg 내지 약 400 mg/kg 체중의 투여를 포함하는 유지 요법으로 보충된다. 일반적으로, 환자는 약 14 내지 35 일마다, 또는 약 21 내지 28 일마다 한 번, 용량 또는 치료를 받을 것이다. 치료 빈도는 다른 요인들 중에서도, 치료되는 중인 질환 또는 병태 및 환자의 질환 또는 병태의 중증도에 의존할 것이다.
바람직한 구현예에서, 치료를 필요로 하는 인간에서 면역결핍증, 자가면역 질환, 또는 급성 감염을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 약학적 IVIG 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 관련된 구현예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 인간에서 면역결핍증, 자가면역 질환, 또는 급성 감염을 치료하기 위해 본원에 제공된 방법에 따라 제조된 IVIG 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 면역결핍증, 자가면역 질환 또는 급성 감염은 동종이계 골수 이식, 만성 림프성 백혈병, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 소아 HIV, 1차 면역결핍증, 가와사키병, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 높은 항체 수용자 또는 ABO 부적합 공여자와의 신장 이식, 만성 피로 증후군, 클로스트리듐 디피실 대장염, 피부근염 및 다발성근염, 그레이브스 안과병증, 길랑-바레 증후군, 근디스트로피, 봉입체 근염, 람베르트-이튼 증후군, 홍반성 루푸스, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증, 신생아 동종면역 혈소판감소증, 파보바이러스 B19 감염, 천포창, 수혈 후 자반병, 신장 이식 거부, 자연 유산/유산, 강직 인간 증후군, 안구간대경련 근간대경련, 성인 중환자의 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크, 독성 표피 괴사용해, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, X-연관 무감마글로불린증, 저감마글로불린혈증, 1차 면역결핍증, RRMS, 알츠하이머병, 및 파킨슨병으로부터 선택된다.
15. 약학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 정제된 IgG를 포함하는 약학적 조성물 및 제형을 제공한다. 일반적으로, 본원에 기재된 신규한 방법에 의해 제조된 IgG 약학적 조성물 및 제형은 높은 IgG 함량 및 순도를 가질 것이다. 예를 들어, 본원에 제공되는 IgG 약학적 조성물 및 제형은 적어도 약 7% (w/v)의 단백질 농도 및 약 95% 초과 순도의 IgG 함량을 가질 수 있다. 이러한 고순도 IgG 약학적 조성물 및 제형은 치료적 투여, 예를 들어, IVIG 요법에 적합하다. 바람직한 구현예에서, 약학적 IgG 조성물은 정맥내 투여 (예를 들어, IVIG 요법)를 위해 제형화된다.
일 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 본원에 제공된 방법을 사용하여 단리된 수성 IgG 조성물을 제형화함으로써 제조된다. 일반적으로, 제형화된 조성물은 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 2개의, 가장 바람직하게는 적어도 3개의 바이러스 불활성화 또는 제거 단계를 거칠 것이다. 본원에 제공된 방법과 함께 이용될 수 있는 바이러스 불활성화 또는 제거 단계의 비제한적인 예는 용매 세제 처리 (Horowitz 등, Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 및 Kreil 등, Transfusion 2003 (43):1023-1028, 이들 둘 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 명백하게 포함된다), 나노여과 (Hamamoto 등, Vox Sang 1989 (56)230-236 및 Yuasa 등, J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, 이들 둘 모두는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다), 및 고온에서의 낮은 pH 인큐베이션 (Kempf 등, Transfusion 1991 (31)423-427 및 Louie 등, Biologicals 1994 (22):13-19)을 포함한다.
특정 구현예에서, 약 80 g/L IgG 내지 약 220 g/L IgG의 IgG 함량을 갖는 약학적 제형이 제공된다. 일반적으로, 이들 IVIG 제형은 본원에 기재된 방법을 사용하여 혈장으로부터 IgG 조성물을 단리하고, 조성물을 농축하고, 농축된 조성물을 정맥내 투여에 적합한 용액으로 제형화함으로써 제조된다. IgG 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 농축될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 한외여과/정용여과에 의해 농축된다. 일부 구현예에서, 조성물을 농축하는데 사용되는 한외여과 장치는 약 100 kDa 미만 또는 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 이하의 kDa 미만의 공칭 분자량 컷오프 (NMWCO)를 갖는 한외여과 막을 이용할 것이다. 바람직한 구현예에서, 한외여과 막은 50 kDa 이하의 NMWCO를 갖는다. 완충액 교환은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 완충액 교환은 정용여과에 의해 달성된다.
일 특정 구현예에서, IgG의 약학적 조성물이 제공되며, 상기 IgG 조성물은 IgG를 포함하는 C1-INH 고갈 상청액 분획으로부터 정제되고, 상기 방법은:
(a) C1-INH 고갈 상청액 분획을 헤파린과 접촉시켜 헤파린화된 분획을 형성하는 단계; 및
(b) 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 단리하여 IgG 풍부 분획을 형성하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에서, IgG의 약학적 조성물이 제공되며, 상기 IgG 조성물은 (a) 제1 침전 단계에서 헤파린화된 분획을 약 7.0 내지 7.5의 pH에서 약 6% 내지 약 10% 에탄올로 침전시켜 제1 침전물 및 제1 상청액을 수득하는 단계; (b) 약 -5 ℃ 내지 약 -9 ℃의 온도에서 단계 (a)의 헤파린화된 분획의 에탄올 농도를 약 25% (v/v)로 조정하여 혼합물을 형성하는 단계; (c) 단계 (b)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하는 단계; (d) 단계 (c)의 침전물을 포스페이트 및 아세테이트를 함유하는 완충액으로 재현탁시켜, 현탁액을 형성하는 단계로서, 완충액의 pH는 완충액 1000 L당 600 ml의 빙초산으로 조정되는, 단계, (e) 미세하게　분할된　이산화규소(SiO2)를　단계　(d)로부터의　현탁액과　적어도　약　30 분　동안　혼합하는 단계, (f) 현탁액을 필터 프레스로 여과하여 여과액을 형성하는 단계, (g) 필터 프레스를 포스페이트 및 아세테이트를 함유하는 완충액의 적어도 3 필터 프레스 데드 볼륨으로 세척하여, 세척 용액을 형성하는 단계로서, 완충액의 pH는 완충액 1000 L당 150 ml의 빙초산으로 조정되는, 단계, (h) 단계 (f)의 여과액을 단계 (g)의 세척 용액과 조합하여, 용액을 형성하고, 용액을 세제로 처리하는 단계, (i) 단계 (h)의 용액의 pH를 약 7.0으로 조정하고, 에탄올을 약 25%의 최종 농도로 첨가하여, 침전물을 형성하는 단계, (j) 단계 (i)의 혼합물로부터 액체 및 침전물을 분리하는 단계, (k) 침전물을 용매 또는 세제를 포함하는 수용액에 용해시키고, 용액을 적어도 60 분 동안 유지시키는 단계, (l) 단계 (k) 후의 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시키고, 용리액에서 컬럼에 흡수된 단백질을 용리시키는 단계, (m) 단계 (l)로부터의 용리액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로 통과시켜 유출물을 생성하는 단계, (n) 단계 (m)으로부터의 유출물을 나노필터로 통과시켜 나노여과액을 생성하는 단계, (o) 단계 (n)으로부터의 나노여과액을 한외여과 막으로 통과시켜 한외여과액을 생성하는 단계, 및 (p) 단계 (o)로부터의 한외여과액을 정용여과 완충액에 대해 정용여과하여 약 8% (w/v) 내지 약 12% (w/v)의 단백질 농도를 갖는 정용여과액을 생성함으로써, 농축된 IgG의 조정물을 수득하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 헤파린화된 분획으로부터 정제된다.
특정 구현예에서, IgG의 약학적 조성물이 제공되며, 상기 IgG 조성물은 상기 기재된 분별 공정 단계 중 둘 이상에서의 개선을 포함하는, 본원에 제공된 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 특정 양태에서 개선은 제1 침전 단계, 변형된 분획 II+III 침전 단계, 변형된 분획 II+III 용해 단계, 및/또는 변형된 분획 II+III 현탁액 여과 단계에서 발견될 수 있다.
특정 구현예에서, IgG의 약학적 조성물이 제공되며, 상기 IgG 조성물은 본원에 기재된 정제 방법을 사용하여 제조되고, 상기 방법은 하나 이상의 용액의 분무 첨가를 포함하는데 이는 그렇지 않다면 유동성 첨가에 의해 혈장 분획에 도입될 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 방법은 분무에 의한 혈장 분획으로의 알코올 (예를 들어, 에탄올)의 도입을 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 분무에 의해 혈장 분획에 첨가될 수 있는 용액은 pH 변형 용액, 용매 용액, 세제 용액, 희석 완충액, 전도도 변형 용액 등을 제한 없이 포함한다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 알코올 침전 단계는 분무에 의한 혈장 분획으로의 알코올의 첨가에 의해 수행된다. 제2 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 pH 조정 단계는 분무에 의한 혈장 분획으로의 pH 변형 용액의 첨가에 의해 수행된다.
특정 구현예에서, IgG의 약학적 조성물이 제공되며, 상기 IgG 조성물은 본원에 기재된 정제 방법에 의해 제조되고, 상기 방법은 침전제 (예를 들어, 알코올 또는 폴리에틸렌 글리콜)의 첨가 후 및/또는 첨가와 동시에 침전되는 혈장 분획의 pH를 조정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 공정 개선이 pH의 지속적인 모니터링 및 조정에 의해 전체 침전 인큐베이션 단계 또는 홀드 단계 전반에 걸쳐 유지되는 활성적으로 침전되는 혈장 분획의 pH에서 제공된다. 바람직한 구현예에서, pH의 조정은 pH 변형 용액의 분무 첨가에 의해 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명은 약 70 g/L 내지 약 130 g/L의 단백질 농도를 포함하는 IgG의 약학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, IgG 조성물의 단백질 농도는 약 80 g/L 내지 약 120 g/L, 예를 들어, 약 90 g/L 내지 약 110 g/L, 예를 들어, 약 100 g/L, 또는 이들 범위 내의 임의의 적합한 농도, 예를 들어 약 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L, 90 g/L, 95 g/L, 100 g/L, 105 g/L, 110 g/L, 115 g/L, 120 g/L, 125 g/L, 또는 130 g/L이다. 바람직한 구현예에서, 약 100 g/L 또는 그 정도의 단백질 농도를 갖는 약학적 조성물이 제공된다. 특히 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 약 102 g/L 또는 그 정도의 단백질 농도를 가질 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 약 170 g/L 내지 약 230 g/L의 단백질 농도를 포함하는 IgG의 약학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, IgG 조성물의 단백질 농도는 약 180 g/L 내지 약 220 g/L, 예를 들어, 약 190 g/L 내지 약 210 g/L, 예를 들어, 약 200 g/L, 또는 이들 범위 내의 임의의 적합한 농도, 예를 들어 약 170 g/L, 175 g/L, 180 g/L, 185 g/L, 190 g/L, 195 g/L, 200 g/L, 205 g/L, 210 g/L, 215 g/L, 220 g/L, 225 g/L, 또는 230 g/L이다. 바람직한 구현예에서, 약 200 g/L 또는 그 정도의 단백질 농도를 갖는 약학적 조성물이 제공된다.
본원에 제공된 방법은 매우 높은 수준의 순도를 갖는 IgG 약학적 조성물의 제조를 허용한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 제공된 조성물의 총 단백질의 적어도 약 95%는 IgG일 것이다. 다른 구현예에서, 단백질의 적어도 약 96%가 IgG이거나, 또는 조성물의 총 단백질의 적어도 약 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상이 IgG일 것이다. 바람직한 구현예에서, 조성물의 총 단백질의 적어도 97%는 IgG일 것이다. 또 다른 바람직한 구현예에서,, 조성물의 총 단백질의 적어도 98%는 IgG일 것이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 조성물의 총 단백질의 적어도 99%는 IgG일 것이다.
유사하게, 본원에 제공된 방법은 극도로 낮은 수준의 오염제를 함유하는 IgG 약학적 조성물의 제조를 허용한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 약 100 mg/L 미만의 IgA를 함유하는 IgG 조성물이 제공된다. 다른 구현예에서, IgG 조성물은 약 50 mg/L 미만의 IgA, 바람직하게는 약 35 mg/L 미만의 IgA, 가장 바람직하게는 약 20 mg/L 미만의 IgA를 함유할 것이다.
본원에 제공된 약학적 조성물은 일반적으로 정맥내, 피하 및/또는 근육내 투여에 적합한 하나 이상의 완충제 또는 pH 안정화제를 포함할 것이다. 본원에 제공된 IgG 조성물을 제형화하는데 적합한 완충제의 비제한적인 예는 글리신, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 글루타메이트, 타르트레이트, 벤조에이트, 락테이트, 히스티딘 또는 다른 아미노산, 글루코네이트, 말레이트, 숙시네이트, 포르메이트, 프로피오네이트, 카르보네이트, 또는 적절한 pH로 조정된 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일반적으로, 완충제는 장기간 동안 제형에서 적합한 pH를 유지하기에 충분할 것이다. 바람직한 구현예에서, 완충제는 글리신이다.
일부 구현예에서, 제형 중 완충제의 농도는 약 100 mM 내지 약 400 mM, 예를 들어, 약 150 mM 내지 약 350 mM, 예를 들어, 약 200 mM 및 약 300 mM, 예를 들어, 250 mM일 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, IVIG 조성물은 약 200 mM 내지 약 300 mM 글리신, 예를 들어 약 250 mM 글리신을 포함할 것이다.
특정 구현예에서, 제형의 pH는 약 4.1 내지 약 5.6, 예를 들어 약 4.4 내지 약 5.3, 예를 들어 4.6 내지 약 5.1일 것이다. 특정 구현예에서, 제형의 pH는 약 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5 또는 5.6일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제형의 pH는 약 4.6 내지 약 5.1일 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물은 조성물의 오스몰농도를 조정하기 위한 작용제를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 오스몰농도 작용제의 비제한적인 예는 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 레불로스, 프럭토스, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜, 포스페이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 칼슘 글루코노글루코헵토네이트, 디메틸 설폰 등을 포함한다.
일반적으로, 본원에 제공된 제형은 생리학적 오스몰농도, 약 285 내지 295 mOsmol/㎏에 필적하는 오스몰농도를 가질 것이다 (Lacy 등, Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254. 특정 구현예에서, 제형의 오스몰농도는 약 200 mOsmol/㎏ 내지 약 350 mOsmol/㎏, 바람직하게는 약 240 내지 약 300 mOsmol/㎏일 것이다. 특정 구현예에서, 제형의 삼투몰농도는 약 200 mOsmol/kg, 또는 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 또는 350 mOsmol/kg일 것이다.
본원에 제공된 IgG 제형은 일반적으로 장기간 동안 액체 형태로 안정하다. 특정 구현예에서, 제형은 실온에서 적어도 약 3 개월 동안, 또는 실온에서 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 개월 동안 안정하다. 제형은 또한 일반적으로 냉장 조건 (일반적으로 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃) 하에서 적어도 약 18개월 동안(6or), 또는 냉장 조건 하에서 적어도 약 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 또는 45 개월 동안 안정할 것이다.
실시예
하기 실시예는 제한으로서가 아닌 오직 예시로서만 제공된다. 당업자는 본질적으로 동일하거나 또는 유사한 결과를 산출하기 위해 변경 또는 변형될 수 있는 다양한 비임계 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.
사용된 약어:
CAE, 셀룰로스 아세테이트 전기영동; CZE, 모세관 영역 전기영동; FC, 최종 용기; NAPTT, 비활성화된 부분의 트롬보플라스틴 시간; NP, 정상 혈장; PKA, 프리칼리크레인 활성; PL-1, 발색성 기질 PL-1로 측정된 아미도분해 활성; PptG, 침전물 G; TGA, 트롬빈 생성 검정; TP, 총 단백질
실시예 1
본 실시예는 유의한 양의 피브리노겐, 아미도분해 활성, 프리칼리크레인 활성이 C1-INH 고갈 혈장 상청액 (DDCPP)으로부터 수득된 PptG 침전물로부터 제거될 수 있음을 입증한다.
출발 물질에서 상청액 I까지의 피브리노겐 함량은 변이체 천연의 경우 0.94에서 0.26 g/L DDCPP로 (표 1 참조), 변이체 헤파린의 경우 1.23에서 0.34 g/L DDCPP로 (표 2 참조) 그리고 변이체 NaCl의 경우 1.4에서 0.37 g/L DDCPP로 (표 3 참조) 감소된다. 추가 감소는 에어로졸 처리 및 여과 동안 변이체 헤파린에 대해 0.01 g/L로 (표 2) 그리고 다른 변이체 둘 모두에 대해 0.02 g/L DDCPP로 (표 1 및 표 3) 일어난다. 6개 로트의 PptG 용해 샘플 중 피브리노겐은 총 단백질의 0.1% 내지 0.3%이다 (표 4). 이 단계에서 피브리노겐 함량은 PptG로부터 생산된 적합성 로트(conformance lot)에서의 함량 (총 단백질의 0.1 내지 0.3%)과 동일하다. 피브리노겐은 최종 용기 수준에서 검출 한계 미만이었다 (표 15 참조).
분별 II+III은 미가공 알부민 (II+III 상청액)으로부터 미가공 면역글로불린 (II+III 침전물)을 분리한다. 헵토글로빈 및 트랜스페린은 주로 II+III 상청액에 보관된다 (표 1, 표 2 및 표 3 참조). C3 보체는 출발 Cohn 풀에서 낮고, Aerosil 처리 및 여과 단계 동안 헤파린의 경우 0.03 내지 0.05 g/L DDCPP에서 0.004 g/L DDCPP로, 그리고 다른 변이체 둘 모두의 경우 0.01 g/L DDCPP로 제거된다. FXI 단백질은 헤파린의 경우 약 1000 U/L DDCPP에서 148 U/L DDCPP로, 천연의 경우 383 U/L DDCPP로, 그리고 NaCl 변이체의 경우 461 U/L DDCPP로 감소된다. Aerosil 처리 및 여과 단계는 IgA, IgM 및 FXI 단백질의 일부와 함께 피브리노겐, 합토글로빈을 감소시킨다.
PptG에서, 분자 크기 분포에 의해 측정된 바와 같은 저분자량 성분의 낮은 함량이 발견된다 (표 4 참조). 트랜스페린 및 α2 매크로글로불린은 PptG 상청액 내에 남아 있다 (표 1 내지 표 3). 용해된 PptG 중 IgA 함량 (ELISA에 의해 측정된 총 단백질(TP)의 7.7% 내지 10.9%)은 VIE에서의 적합성 로트 (TP의 9.6 내지 12.7%)에서와 같이 약간 더 낮은 범위를 갖는다. PptG에서 용해된 α2-매크로글로불린 수준은 TP의 4.7 내지 5.6% 로 각기 다르다 (표 4). FXI 단백질은 PptG에 변이체 천연 및 변이체 NaCl (37.5 내지 41.9 U/ g 단백질)을 갖는 모든 로트에 대해 유사하게 높지만, 헤파린이 첨가된 로트에 대해서는 더 낮다 (12.1 내지 12.4 U/ g 단백질) (표 4 참조). 이는 표 4에 나타낸 g/L DDCPP 값에 의해 더욱 더 잘 반영된다.
표 1: 업스트림 중간 결과 (Cohn 풀에서 PptG 상청액까지) -천연
Figure pct00002
표 2: 업스트림 중간 결과 (Cohn 풀에서 PptG 상청액까지) -변이체 헤파린
Figure pct00003
표 3: 업스트림 중간 결과 (Cohn 풀에서 PptG 상청액까지) -변이체 NaCl
Figure pct00004
표 4: 침전물 G 특성규명
Figure pct00005
용해된 PptG에서의 PKA는 정량화 한계 미만 내지 최대 9.4 U/mL로 각기 다르다. 벌크에서 PKA는 모든 공정 옵션에 대한 정량화 한계 미만이다 (표 5 참조). 칼리크레인 유사 활성은 PptG 용해 단계에서 높지만 (490 내지 733 nmol/mL*분), 다운스트림 공정에 의해 크게 감소될 수 있다: CM 세파로스 크로마토그래피 수준에 대해 35 mM 용리 완충액을 사용하는 것은 정량화 한계 미만이었다 (< 10 nmol/mL*분). FXI 결핍 혈장에서 시험된 바와 같은 비활성화된 부분의 트롬보플라스틴 시간은 임의의 옵션에 대해 용해된 PptG에서 단축되지 않는다. 발색성 기질 PL-1에 의해 측정된 바와 같은 아미도분해 활성은 용해된 PptG에서 높지만 (97.2 내지 163.1 nmol/mL*분), 대부분의 경우 최종 벌크 수준에서 정량화 한계 미만의 수준으로 감소된다 (<10 nmol/mL*분). 트롬빈 생성은 정보만을 위해 용해된 PptG 수준에서 측정하였다. 시험은 다양하지만, 이 단계에서 측정된 TGA는 헤파린이 DDCPP에 첨가된 로트에 대해 더 낮다 (정상 혈장의 113.14% 및 103.33%)(FC에 대한 132% NP의 모니터링 한계). 벌크에서 - 낮은 pH 인큐베이션 전의 샘플 - TGA 값은 모든 샘플에 대해 132%의 일상적인 최종 용기에 대한 모니터링 한계보다 높다. TGA 값은 NaCl, 헤파린 또는 천연의 첨가에 관계없이 35 mM 용리 완충액을 사용하는 실험(run)에 대한 정상 혈장의 185% 내지 195%이다. FXIa 값은 용해된 PptG에서 헤파린 변이체로 생성된 로트에 대한 정량화 한계 미만이다. 다른 두 로트 모두에 대한 값은 다른 연구와 비교하여 상당히 높다 (10.3 내지 16.7 ng/ g 단백질). 모든 로트에 대한 FXIa 값은 최종 벌크에서 검출되었다. 헤파린을 DDCPP에 첨가한 경우, 다시 가장 낮은 값이 나타났다.
용해된 PptG에서의 높은 칼리크레인 유사 활성은 또한 아미도분해 활성 프로파일에 의해 반영된다. 기질은 구체적으로 570 내지 1780 nmol/ml*분인 칼리크레인, FXIa 및 FXIIa를 측정한다. 이들 값은 최종 벌크에서 8 내지 22 nmol/ml*분으로 감소된다 (표 5 참조).
표 5: PKA, 응고촉진 불순물 및 아미도분해 활성이 PptG 및 벌크를 초래한다
Figure pct00006
실시예 2
Cohn 풀, II+III 상청액 (알부민) 및 중간 PptG 페이스트의 순도는 셀룰로스 아세테이트 전기영동에 의해 결정된다 (표 6 참조). 현재의 Gammagard Liquid/ KIOVIG 사양에 따르면, 중간 생성물인 침전물 G는 CAE 전기영동 또는 상응하는 것으로 측정시 ≥ 86% 감마-글로불린의 순도 사양을 충족시켜야 한다. DDCPP(C1-억제제 흡착 후 혈장)으로부터 수득된 PptG 페이스트는 86% 초과의 Gammagard Liquid/ KIOVIG의 중간 사양 한계를 명백하게 충족시켰다 (표 6 참조). 헤파린 및 소듐 클로라이드의 첨가는 순도를 88%에서 93%로 증가시켰다.
순도는 또한 용해된 PptG 단계 및 최종 용기에서 CZE로 측정한다. Ppt G는 92% 내지 93%의 γ-글로불린 순도를 갖고, 최종 용기 순도는 100% γ-글로불린이었다 (표 7 참조).
표 6: CAE에 의해 측정된 Cohn 풀, II+III 상청액 및 PptG의 순도
Figure pct00007
표 7: CZE로 측정한 용해된 PptG 및 최종 용기(FC)의 순도
Figure pct00008
실시예 3
높은 IgG 회수 및 단백질 수율은 출발 물질이 IgG의 생산에 사용하기에 적합한지 확인하기 위해 결정된다. 단백질 및 IgG 수율은 공정 효율을 입증하기 위해 % 및 g/L 혈장으로 주어진다. Cohn 풀부터 벌크까지의 높은 IgG 회수는 매우 양호한 공정 효율을 반영한다. IgG 측정에 기반하여 68%에서 75%로의 회수를 수득하였다 (표 8 내지 표 10 참조). 전도도의 조정을 위한 Cohn 풀에의 소듐 클로라이드 첨가는 다른 두 옵션 (68% 대 70% 초과)와 비교하여 약간 더 낮은 전체적인 회수율을 초래한다.
표 8: 단백질 및 IgG 회수 - 35 mM CM 용리 완충액을 사용하는 천연
Figure pct00009
표 9: 단백질 및 IgG 회수 - 35 mM CM 용리 완충액을 사용하는 변이체 헤파린
Figure pct00010
표 10: 단백질 및 IgG 회수 - 35 mM CM 용리 완충액을 사용하는 변이체 NaCl
Figure pct00011
실시예 4
최종 용기 방출 파라미터를 Gammagard Liquid/ KIOVIG 제조 방법에 따라 시험하고, 35 mM 용리 완충액을 사용하는 실험에 대해 표 11에 요약하였다. 방출 파라미터의 항체 역가 결과를 표 12 및 표 13에 요약하였다.
표 11: 35 mM CM 세파로스 용리 완충액을 사용하는 최종 용기 사양 시험의 결과
Figure pct00012
실시예 5
항-A/항-B 헤마글루티닌 및 항-D 항체, 디프테리아 (미국만), HAV (유럽만), HBsAg, 홍역 (미국만), 파보 B19 (유럽만) 및 소아마비 (미국만)에 대한 항체에 대한 방출 시험을 최종 컨테이너 로트에 대해 수행하였다 (표 12 - 35 mM 용리 완충액 참조). 모든 항체 시험은 요건을 충족하였다.
표 12: FC 내의 항체 수준 (IU/ g 총 단백질에서 계산된 단백질) - 35 mM 용리 완충액
Figure pct00013
실시예 6
혈장-유래 단백질 조성물에 존재하는 잔류 세린 프로테아제 함량 및 활성을 결정하기 위해, 아미도분해 활성 프로파일을 C1-INH 고갈 혈장 상청액으로부터의 IgG 조제물에 대해 결정하였다. 간략하게, 혈장-유래 단백질 조성물에 대한 아미도분해 활성 프로파일을 결정하였다. PL-1, 아미도분해 활성 프로파일, TGA, NAPTT, FXIa 및 FXI 단백질을 시험하고, 결과를 표 13 (35 mM 용리 완충액)에 요약하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 발색성 기질 PL-1에 의해 측정된 아미도분해 활성은 CM 용리 완충액의 포스페이트 농도에 관계없이 다운스트림 공정의 높은 감소 가능성을 입증하는 모든 로트에 대한 정량화 한계 미만이다. 상이한 발색성 기질로 생성된 아미도분해 활성 데이터는 또한 매우 낮은 값을 나타낸다. FXI 결핍 혈장에서 시험된 바와 같은 NAPTT는 최종 용기 샘플에서 단축되지 않았다. 헤파린을 첨가하는 경우, FXIa는 35 mM CM- 용리 완충액을 사용하는 정량화 한계 미만이었다. 헤파린을 35 mM CM 용리 완충액을 사용하는 DDCPP에 첨가하는 경우, FXI 뿐만 아니라 FXIa도 검출하는 FXI 단백질 시험은 매우 낮은 값을 갖는다.
표 13: 35 mM 용리 완충액을 사용하여 FC에서 측정한 아미도분해 활성 및 응고촉진 활성
Figure pct00014
실시예 7
FXI 단백질 시험은 또한 제조 공정 전반에 걸친 지표이다. 표 14에 DDCPP에서 최종 용기까지의 FXI 단백질의 전체 감소가 요약되어 있다. 출발 물질에서의 FXI 단백질 값을 100%로 설정하였다. 주된 감소는 후속 여과로 Aerosil 처리에서 발생한다. 다운스트림 공정은 FXI 단백질 함량을 초기 값의 0.01% 수준으로 추가로 감소시켰다.
표 14: DDCPP 출발 물질에서 FC까지의 FXI 단백질의 전체 감소 (% 회수)
Figure pct00015
실시예 8
그런 다음, C1-INH 고갈 혈장 상청액으로부터의 IgG 조제물의 다양한 단백질 불순물의 수준을 결정하였다. 표 15에 나타낸 바와 같이, 피브리노겐은 검출 한계 미만이고 (< 0.03 μg/mL), 보체 C3 수준 (0.04 내지 0.07 mg/dL)은 모니터링 한계보다 미만이다 (< 19.4 mg/dL).
표 15: 35mM 용리 완충액을 사용하여 최종 용기 내의 단백질 함량을 추적
Figure pct00016
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 오직 예시적인 목적을 위한 것이며, 이의 관점에서의 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이고, 이 출원 및 첨부된 청구항의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

Claims (28)

  1. 면역글로불린 G (IgG)를 포함하는 C1-INH 고갈 상청액 분획으로부터 IgG 풍부 분획을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) C1-INH 고갈 상청액 분획을 헤파린과 접촉시켜 헤파린화된 분획을 형성하는 단계; 및
    (b) 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 단리하여 IgG 풍부 분획을 형성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 상청액 분획은 C1-억제제 흡착 후의 상청액인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 상청액 분획은 혈장 상청액인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 혈장 상청액은 C1-INH 고갈 저온침전물-결핍 혈장(cryo-poor plasma)인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상청액 분획은 인자 II, VII, IX 및 X 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 다른 혈액 응고 인자 중 하나 이상이 고갈되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상청액 분획은 추가 처리 전에 정상 혈장의 단백질 값으로 농축되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤파린은 상청액 분획 ml당 약 1 내지 약 20 단위의 양으로 첨가되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 헤파린은 상청액 분획 ml당 약 5 단위의 양으로 첨가되는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 헤파린은 상청액 분획 ml당 약 10 단위의 양으로 첨가되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에, C1-INH 에스테라제 억제제 (C1-INH)를 함유하는 저온침전물-결핍 혈장 분획으로부터 C1-INH를 제거하여 C1-INH 고갈 상청액 분획을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG 풍부 분획은 상청액 분획에서 발견되는 IgG 함량의 적어도 약 50%를 함유하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG 풍부 분획의 IgG 순도는 적어도 95%인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b)의 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 단리하는 단계는:
    (i) 약 7.0 내지 7.5의 pH에서 약 6% 내지 약 10% 에탄올로 헤파린화된 분획을 침전시켜 분획 I 침전물 및 분획 I 상청액을 수득하는 단계; 및
    (ii) 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 18% 내지 약 27% 알코올로 분획 I 상청액으로부터 IgG를 침전시켜 분획 II + III 침전물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b)의 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 단리하는 단계는:
    (i) 약 6.7 내지 약 7.3의 pH에서 약 18% 내지 약 27% 알코올로 헤파린화된 분획으로부터 IgG를 침전시켜 분획 I+II+III 침전물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    (iii) 분획 II+III 또는 분획 I+II+III 침전물을 현탁 완충액에서 현탁시켜, IgG 현탁액을 형성하는 단계;
    (iv) 미세하게 분할된 이산화규소 (SiO2)를 IgG 현탁액과 적어도 약 30분 동안 혼합하는 단계;
    (v) IgG 현탁액을 여과하여 여과액 및 필터 케이크를 형성하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    (vi) 약 4.9 내지 약 5.3의 pH를 갖는 세척 완충액의 적어도 1 필터 프레스 데드 볼륨(filter press dead volume)으로 필터 케이크를 세척하여, 세척액을 형성하는 단계;
    (vii) 여과액을 세척액과 조합하여 용액을 형성하고, 용액을 세제로 처리하는 단계;
    (viii) 단계 (vii)의 용액의 pH를 약 7.0으로 조정하고, 에탄올을 약 20% 내지 약 30%의 최종 농도로 첨가하여, 침전물 G 침전물을 형성하는 단계;
    (ix) 침전물 G 침전물을 용매 및/또는 세제/세제들을 포함하는 수용액에 용해시키고, 용액을 적어도 60분 동안 유지하는 단계;
    (x) 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고, 용리액에서 컬럼 상에 흡수된 단백질을 용리시키는 단계;
    (xi) 용리액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 관류 유출물(flow-through effluent)을 생성하는 단계;
    (x) 유출물을 나노필터에 통과시켜 나노여과액을 생성하는 단계;
    (xi) 한외여과에 의해 나노여과액을 농축하여 제1 한외여과액을 생성하는 단계;
    (xii) 제1 한외여과액을 정용여과(diafiltration) 완충액에 대해 정용여과하여 정용여과액을 생성하는 단계; 및
    (xiii) 한외여과에 의해 정용여과액을 농축하여 약 8% (w/v) 내지 약 22% (w/v)의 단백질 농도를 갖는 제2 한외여과액을 생성함으로써, IgG 풍부 분획을 형성하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, (iv)는 SiO2를 분획 II+III 또는 분획 I+II+III 침전물의 그램당 약 0.02 내지 약 0.10 그램의 최종 농도로 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, (vi)는 세척 완충액의 적어도 2 필터 프레스 데드 볼륨으로 필터 케이크를 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, x)는 단백질을 적어도 35 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트로 용리시키는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제16항 내지 오류! 참조 원본을 찾을 수 없음.항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (xii)의 정용여과 완충액은 약 200 mM 내지 약 300 mM 글리신을 포함하는, 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, (vii)의 용액을 용매 및/또는 세제/세제들로 처리하는 단계는 적어도 하나의 바이러스 불활성화 또는 제거 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화는 용매/세제 (S/D) 바이러스 불활성화 단계인, 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 4.0 내지 약 5.2의 낮은 pH에서의 인큐베이션 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 약 4.4 내지 약 4.9의 낮은 pH에서의 인큐베이션 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. IgG를 포함하는 C1-억제제 흡착 분획 후의 상청액으로서, 상기 분획은 저온침전물-결핍 혈장 분획에 존재하는 전체의 적어도 약 70%만큼 C1-INH가 고갈된 저온침전물-결핍 혈장 분획인, 상청액.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 IgG 풍부 분획을 포함하는 약학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 조성물은 조성물의 리터 당 적어도 약 80 내지 220 그램의 IgG를 포함하는, 약학적 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 약학적 조성물의 pH는 약 4.4 내지 약 4.9인, 약학적 조성물.
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