KR20220155980A - 항-뮐러 호르몬 폴리펩티드 - Google Patents

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크레이크 안토니 해리슨
켈리 루이즈 월튼
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모나쉬 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 항-뮐러 호르몬 (AMH) 유사체, 보다 구체적으로 AMH 유형 II 수용체 (AMHR2)의 작용제인 AMH 유사체에 관한 것이다. 보다 특히, 본 개시내용은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 중 하나 이상 내에 존재하는 변형을 갖는 AMH 유사체에 관한 것이다.

Description

항-뮐러 호르몬 폴리펩티드
본 출원은 2019 년 10 월 30 일에 출원된 AU2019904097호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 원용된다.
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서열 목록의 전자 제출의 전체 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 원용된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 항-뮐러 호르몬 (AMH) 유사체, 보다 구체적으로 AMH 유형 II 수용체 (AMHR2)의 작용제인 AMH 유사체에 관한 것이다.
암은 전 세계적으로 제2 주요 사망의 원인이며 2018 년 미국에서만 960만 명이 사망한 것으로 추정된다. 미국에서는, 2026 년까지 200만 명 미만의 젊은 성인 암 생존자 (15-39세)가 있을 것으로 추정된다. 불행하게도, 이들 암 치료 중 다수는 또한 불임, 생식불능 또는 조기 폐경을 유발할 수 있다 (Jeruss, JS et al., (2009) N Engl J Med 360, 902-911). 불임 또는 조기 난소 부전은 화학독성-유도된 난모세포의 가속화된 손실로 인해 암 생존자의 40% 내지 80%에서 보고되었다 (Pereira N et al., (2017) J Oncol Pract 13, 643-651). 암 생존자의 생식 건강은 환자의 미래 삶의 질에 대한 주요 관심사이며, 불임은 현재 및 미래의 관계에서 스트레스의 예측인자이기 때문에 심리적 고통으로 이어질 가능성이 있다 (Rosen A et al., (2009) Semin Oncol Nurs 25, 268-277). 여성 암 환자에 대해 확립된 가임력 치료 옵션은 환자의 서브세트에만 사용하기에 적합한 침습적 접근법으로 제한되는 반면, 조사적 접근법은 유용성이 제한된다 (Woodruff TK et al., (2010), Nat Rev Clin Oncol 7, 466-475). 더욱이, 이들 침습적 접근법은 적시에서의 환자 소개, 및 환자의 이용가능한 옵션에 대한 접근을 제한하고 암 치료 대기 시간을 연장할 수 있는 전문 분야 간의 치유 조정에 크게 의존하기 때문에 물류 장벽을 수반한다. 또한, 많은 치료 비용 및 특정 보험 제공자의 보장범위 부족으로 인한 재정적 장벽은 침습적 가임력 치료의 적용가능성을 더욱 제한한다. 이상적인 온코퍼틸리티(oncofertility) 보존 치료는 암 치료를 받는 젊은 여성의 가임력을 보존하는 암 요법과 함께 투여되는 비-중재 약물일 것이다.
인간 AMH 유전자는 19번 염색체에 위치하며, 이의 발현은 성적으로 이형적이다. AMH는 정상적인 남성 생식관 발달에 절대적으로 필요하며, 이는 방해받지 않고 방치하면 여성 생식관 구조, 예컨대, 자궁, 자궁경부, 나팔관, 질 상부가 생성할 수 있는 쌍전위 비뇨생식 능선의 뮐러관의 퇴행에 영향을 미치기 때문이다 (Cate et al., (1986) Cell 45:685-698). 남성의 경우, AMH (뮐러 억제 물질 (MIS)로서 또한 알려짐)의 발현은 태아 고환에서 임신 9 주에 시작되어 사춘기까지 높은 수준으로 계속되고 그 이후에는 발현 수준이 급격히 떨어진다. 여성의 경우, AMH는 출생 후에 사춘기 전부터 폐경까지의 과립막 세포에서만 성인 남성과 유사한 수준으로 생산되며, 그 이후에는 발현이 중단된다. 남성 태아에서, AMH는 나팔관, 자궁, 자궁경부 및 질 상부의 전구체인 뮐러관의 퇴행을 유발한다.
AMH는 세린 트레오닌 키나제 수용체에 걸쳐 있는 유형 I 및 유형 II 단일 막관통 이종이량체에 결합한 후 생물학적 효과를 발휘한다. AMH는 유형 II 수용체에 결합하여, 유형 I 수용체로부터 신호 전달을 개시하는 유형 II 수용체에 의해 유형 I 수용체의 GS 박스 키나제 도메인의 교차-인산화를 야기한다. 후속적으로 SMAD 1, 5 및 8이 활성화되고, SMAD 4와 함께 유전자 전사를 조절한다. AMH 유형 II 수용체 (본원에서 AMHR2로서 또한 지칭됨)는 65-kDa 단백질이며, 배아 및 성인 뮐러 구조뿐만 아니라 유방 조직, 전립선 조직, 생식선, 운동 뉴런 및 뇌에서 검출되었다. AMHR2의 발현은 생식선뿐만 아니라 난소 체강 상피에서 또한 검출될 수 있다.
예를 들어, 세포독성 약물 또는 기타 약물 치료 (예컨대, 화학요법)에 의해 유발된 조기 난소 부전을 예방하거나, 예를 들어, 만성 질환 또는 장애, 예컨대, 자가면역 질환에 대한 치료 동안에 임신이 바람직하지 않을 장기 치료를 받는 동안 난소 예비력을 보존하기 위해, 가임력의 보존을 용이하게 하는 화합물이 당업계에 필요하다.
개시내용의 요약
연구는 항-뮐러 호르몬 (AMH)이 난소 예비력 (즉, 원시 여포의 질 및 양)의 척도임을 도시한다 (Visser JA et al., (2012) Nat Rev Endocrinol 8, 331-341). AMH 검정은 불임 치료 동안 및 생식샘독성 암 치료 또는 난소 수술 후 난소 예비력을 임상적으로 평가하는 데 사용될 수 있다 (Victoria M et al., (2019) J Gynecol Obstet Hum Reprod 48, 19-24). 화학요법제는 (i) 성장하는 여포에서 아폽토시스를 유도하고 (ii) Akt-의존적 원시 여포 동원을 상향조절함으로써 난소를 손상시키는 것으로 가정된다. 함께, 이들 과정은 난소 예비력의 급속한 "소진"을 야기한다 (R. R. Wong RR et al., (2014) Endocr Relat Cancer 21, R227-233).
본 발명자들은 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여, 인간 AMH 상의 추정되는 유형 II 수용체 (AMHR2) 결합 부위를 식별하였다. 세포 모델을 활용하여, 이들은 야생형 AMH 성숙한 도메인에 비해 AMH 수용체 복합체로부터의 신호 전달을 증가시키는 AMH 유사체를 식별하였다. AMH 유사체는 AMH 유형 II 수용체의 작용제로서 유용할 수 있다고 생각된다. 이들 유사체는 부인과 암의 치료에서 및 가역적 피임제로서 뿐만 아니라 온코퍼틸리티 (즉, 암 치료 동안 및 후에 가임력의 보존)에 적용할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 야생형 AMH 성숙한 도메인 서열에서 Gly533의 돌연변이가 야생형/천연 AMH (서열번호 1)와 비교하여 유의하게 증가된 AMH 활성을 초래한다는 것을 발견하였다. 이 발견은 글리신이 전형적으로 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 잔기가 아니라는 점을 고려할 때 놀라운 것이었다. 이러한 유사체는 화학요법 동안 가임력 보존제, 계통(genealogical) 암 치료를 위한 약제 및 생식샘자극제에 의해 유발된 난소 예비력의 손상을 제한할 수 있는 잠재적인 가역적 피임제로서 종양학 및 가임력-관련 응용분야에서 유용할 것으로 예상된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 천연 AMH 폴리펩티드에 대해 80% 이상의 동일성 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항-뮐러 호르몬 (AMH) 유사체를 제공한다 (도 1a). 달리 표시되지 않는 한, 명세서 전반에 걸친 잔기 넘버링은 서열번호 1 (도 1a)에 도시된 인간 AMH 전구체를 참조하며, 여기서 전구체 서열의 제1 잔기 (예컨대, 메티오닌)는 위치 1로서 넘버링되고, 서열의 마지막 잔기는 위치 560으로서 넘버링된다.
일 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1에 제시된 천연 AMH 폴리펩티드에 대해 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성 또는 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다 (도 1a).
다른 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 천연 인간 AMH 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 AMH 유사체를 제공하며, 여기서 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560 내에 존재한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 C-말단 도메인을 포함하는, 단리된 항-뮐러 호르몬(AMH) 유사체를 제공한다 (도 1a).
다른 양태에서, 본 개시내용은 C-말단 도메인 서열을 포함하는 단리된 항-뮐러 호르몬 (AMH) 유사체를 제공하며, 여기서 C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 천연 인간 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함하고, 여기서 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 중 하나 이상 내에 존재한다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 내에 존재하는 변형은 하나 이상의 아미노산 치환이다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 내에 존재하는 변형은 단일 아미노산 치환이다.
일 예에서, C-말단 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560에 대해 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다 (도 1a).
일 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 447에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다. 일 예에서, N-말단 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 447에 대해 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다 (도 1a). 일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 451에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 447에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 451에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다.
일 예에서, N-말단 도메인 및 C-말단 도메인은 공유적으로 결합되지 않는다. 일 예에서, N-말단 도메인 및 C-말단 도메인은 펩티드 결합에 의해 공유적으로 결합되지 않으며, 즉 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인은 별개의 폴리펩티드이다. 대안적인 예에서, N-말단 도메인 및 C-말단 도메인은 공유적으로 결합된다. 일 예에서, 공유 결합은 펩티드 결합을 포함한다.
일부 예에서, N-말단 도메인은 X1X2X3RKKRX8X9X10X11 (서열번호 37)을 포함하는 전구단백질 전환효소 부위를 포함하며, 여기서 X1은 부재하거나 이소류신이고, X2는 부재하거나 세린이고, X3은 부재하거나 세린이고, X8은 부재하거나 세린이고, X9는 부재하거나 발린이고, X10은 부재하거나 세린이고, X11은 부재하거나 세린이다. 일 예에서, 전구단백질 전환효소 부위는 ISSRKKRSVSS (서열번호 6)를 포함한다. 일 예에서, 전구단백질 전환효소 부위는 RKKR (서열번호 40)을 포함한다.
일부 예에서 유사체의 활성은 천연 인간 AMH의 활성과 비슷하거나 더 크다. 특정 예에서, 천연 인간 AMH는 서열번호 1의 잔기 452 내지 560의 폴리펩티드 서열 또는 서열번호 5에 제시된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일 예에서, AMH 유사체의 활성은 천연 인간 AMH와 등가하며, 천연 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드의 활성과 비교하여 약 2-배 더 크거나, 약 2.5-배 더 크거나, 약 3-배 더 크거나, 약 3.5-배 더 크거나, 약 4-배 더 크거나, 약 4.5-배 더 크거나, 약 5-배 더 크거나, 5-배 초과이다. 일부 실시양태에서, 천연 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드는 서열번호 5에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 천연 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드는 서열번호 36에 제시된 서열을 포함한다. 일 예에서, 유사체의 활성은 루시퍼라제 검정에 의해 결정된다.
일 예에서, AMH 유사체의 활성은 2.5-배 이상 더 크거나, 2.5-배 내지 5-배 더 크다.
일 예에서, 서열은 단일 아미노산 잔기 변형을 포함한다.
일 예에서, 서열은 2 개의 아미노산 잔기 변형을 포함한다.
일 예에서, 서열은 3 개의 아미노산 잔기 변형을 포함한다.
다른 예에서, 서열은 5 개 이하의 아미노산 잔기 변형을 포함한다.
일 예에서, 변형은 치환이다.
일 예에서, C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 천연 인간 AMH 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함하며, 여기서 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 내에 존재한다.
다른 예에서, C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하는 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드에 비해 단일 아미노산 잔기 변형을 포함한다. 다른 예에서, C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하는 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드에 비해 2 개의 아미노 잔기 변형을 포함한다. 다른 예에서, C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하는 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드에 비해 3 개의 아미노 잔기 변형을 포함한다.
일부 예에서, C-말단 도메인은 임의로 (예를 들어, 서열번호 5에 제시된 천연 인간 AMH 폴리펩티드에 비해) N-말단에 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 예에서, 변형은 아미노산 치환이다.
일 예에서, 아미노산 잔기 치환은 서열번호 1의 잔기 533, 535 및/또는 548에 위치한다.
일 예에서, 아미노산 치환은 G533, L535 및 G533 + L535로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 예에서, 치환은 L535M 및 G533A + L535M으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 예에서, 아미노산 변형은 서열번호 1의 G533에 있다. 다른 예에서, 변형은 서열번호 1의 G533A, G533S, G533K, G533L 및 G533R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 예에서, 변형은 서열번호 1의 G533A, G533S 및 G533K로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 예에서, 변형은 서열번호 1의 G533K이다.
일 예에서, N-말단에서의 하나 이상의 추가 아미노산 잔기는 SVSS (서열번호 41)를 포함한다.
또 다른 예에서, AMH 유사체는 AMH 유형 II 수용체 (AMHR2)의 작용제이다. 일 예에서, AMH 유사체는 AMHR2에 특이적으로 결합한다.
일부 예에서, 천연 인간 AMH에 비해 AMHR2에 대한 AMH 유사체의 수용체 결합 친화도는 2-배 이상, 3-배 이상, 4-배 이상, 5-배 이상, 또는 5-배 초과 증가된다.
일 예에서, AMH 유사체는 인간 폴리펩티드이다.
일 예에서, AMH는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 AMH 전구체로부터 유래된다. 일 예에서, 전구체의 G533에서의 아미노산 잔기 (즉, 서열번호 3의 잔기 535)는 알라닌, 세린 또는 리신으로의 치환에 의해 변형된다.
일부 예에서, AMH 유사체 또는 AMH 전구체 서열은 추가로 변형되어 단백질분해 가공을 개선한다. 일 예에서 R448 내지 R451에서의 천연 단백질분해 가공 부위는 ISSRKKRSVSS (서열번호 6; 도 1b)에 제시된 서열로 대체된다.
일부 예에서, AMH 유사체 또는 AMH 전구체는 추가로 변형되어 천연 신호 전달 펩티드를 대체함으로써 재조합 생산을 향상시킨다. 일 예에서, MRDLPLTSLALVLSALGALLGTEAL (서열번호 7)에 제시된 서열로 이루어진 천연 인간 AMH 신호 전달 서열은 랫트 알부민 신호 펩티드 서열로 대체된다. 일 예에서, 랫트 알부민 신호 서열은 MKWVTFLLLLFISGSAFS (서열번호 8)에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, AMH 유사체 또는 AMH 전구체는 단백질분해 가공 부위 및 신호 펩티드 서열 둘 모두에 대한 변형을 포함한다.
일부 예에서, AMH 유사체 또는 AMH 전구체는 His 태그, 예를 들어, His6 태그를 추가로 포함하여 정제를 돕는다. 일부 예에서, N-말단 도메인은 N-말단 His 태그를 추가로 포함할 수 있다.
특정 예에서, AMH 전구체는 하기에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지며:
Figure pct00001
(서열번호 3), 여기서 G533에서의 아미노산 잔기 (볼드체 및 밑줄로서 도시되며 서열번호 1에 제공된 천연 서열을 참조하여 넘버링됨)는 아미노산 치환에 의해 변형된다.
다른 예에서, AMH 유사체는 MKWVTFLLLLFISGSAFS (서열번호 8)로 제시된 신호 서열이 결여된 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 G533에서의 아미노산 잔기 (볼드체 및 밑줄로서 도시됨)는 아미노산 치환에 의해 변형된다.
의심의 여지를 없애기 위해, G533에 대한 언급은 서열번호 1에 도시된 천연 인간 AMH 서열에서 잔기 위치 533에 위치한 Gly를 지칭한다. G533은 서열번호 3에 제시된 변형된 서열의 G535에 상응한다.
일 예에서, 서열번호 3의 G533에서의 아미노산 치환은 G533A, G533S 또는 G533K이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 C-말단 도메인을 갖는 AMH 유사체를 제공한다:
Figure pct00002
일부 예에서, AMH 유사체는 Fc 단백질, 검출 태그, 정제 태그 또는 담체 분자 중 하나 이상으로부터 선택된 융합 파트너를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 AMH 유사체 또는 AMH 전구체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 예에서, 폴리뉴클레오티드는 하기에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지며:
Figure pct00003
, 여기서 뉴클레오티드 1603 내지 1605에서의 폴리뉴클레오티드 서열 (볼드체 및 밑줄로 도시됨)은 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 리신 (K)을 코딩하도록 변형된다.
일 예에서, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 잔기 1603 내지 1605는 gct, gcc, gca, gcg, tct, tcc, tca, tcg, aaa 또는 aag로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 양태에서, C-말단 도메인 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 AMH 전구체를 제공하며, 여기서 C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 천연 인간 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함하며, 여기서 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 중 하나 이상 내에 존재한다.
일부 예에서, 변형은 G533A, G533K 또는 G533S이다.
일부 예에서, 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 서열번호 1의 G533에 상응하는 아미노산은 G533A, G533S 또는 G533K로의 치환에 의해 변형된다.
추가 양태에서, 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하는 AMH 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 서열번호 4의 뉴클레오티드 1603 내지 1605에서의 폴리뉴클레오티드 서열은 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 리신 (K)을 코딩하도록 변형된다.
추가 양태에서, 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 AMH 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 서열번호 33의 뉴클레오티드 1597 내지 1599에서의 폴리뉴클레오티드 서열은 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 리신 (K)을 코딩하도록 변형된다.
추가 양태에서, 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 AMH 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 뉴클레오티드 244 내지 246의 폴리뉴클레오티드 서열은 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 리신 (K)을 코딩하도록 변형된다.
일 예에서, AMH 유사체는 재조합적으로 생산된다. 일 예에서, AMH 전구체는 재조합적으로 생산된다.
일 예에서, AMH 유사체를 코딩하는 폴리펩티드는 벡터, 바람직하게는 포유동물 벡터에서 발현된다. 다른 예에서, 벡터는 박테리아 벡터이다. 추가 예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 예에서, 벡터는 pcDNA3.1 벡터이다.
일부 예에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 특정 예에서, 벡터는 AAV 혈청형 9 (AAV-9)이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일 예에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 다른 예에서, 숙주 세포는 배아 신장, CHO 또는 난소 세포로부터 선택된다. 일 예에서, 숙주 세포는 HEK293T 세포이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 AMH 유사체 또는 본원에 기재된 AMH 유사체 또는 AMH 전구체를 코딩하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 예에서, 조성물은 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 AMH 유사체를 포함한다. 일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 447에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 447에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 451에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 451에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 예에서, C-말단 도메인 및 N-말단 도메인은 공유적으로 결합되지 않는다. 일부 예에서, AMH 유사체는 2 개의 C-말단 도메인 및 2 개의 N-말단 도메인을 포함하는 4차 복합체를 포함한다. 일부 예에서, 4차 복합체는 C-말단 동종이량체 및 N-말단 동종이량체를 포함한다.
다른 예에서, N-말단 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 447에 대해 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 예에서, N-말단 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 451에 대해 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 예에서, N-말단 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 447에 대해 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 예에서, N-말단 도메인은 서열번호 1의 아미노산 잔기 26 내지 451에 대해 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 예에서, 조성물은 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 C-말단 도메인을 포함하는 AMH 유사체를 포함한다.
바람직하게는, 대상체에 투여될 때 임의의 양태에 따른 AMH 유사체는 2 개의 N-말단 도메인 및 2 개의 C-말단 도메인을 포함하는 4차 복합체이다. 일 예에서, 대상체에 투여될 때 임의의 양태에 따른 AMH 유사체는 N-말단 동종이량체 및 C-말단 동종이량체를 포함하는 4차 복합체이다. 바람직하게는, 벡터로부터의 발현 후 AMH 유사체 또는 AMH 전구체는 동종이량체이다. 특정 예에서, 단량체는 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 특정 예에서, N-말단 도메인은 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 특정 예에서, C-말단 도메인은 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 다른 예에서, 단량체는 링커에 의해 접합된다. 다른 예에서, 단량체는 비-공유적으로 회합된다.
일 예에서, AMH 유사체는 치료적 유효량으로 제공된다. "치료적 유효량"은 의도된 용도에 따라 상이할 수 있다. 일 예에서, 치료적 유효량은 대상체에서 여포생성의 완전한 저지를 제공하는 농도로 투여되는 양이다. 다른 예에서, 치료적 유효량은 AMH의 부재와 비교하여 10-50% 더 높거나 50 내지 100% 더 높은 대상체의 혈액에서 AMH 유사체의 농도를 증가시키기에 충분한 양으로 간주된다. 일 예에서, 치료적 유효량은 1 μg/ml 내지 5 μg/ml에서 대상체의 혈액에서 AMH 유사체의 농도를 증가시키기에 충분한 양이다.
다른 예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
일 예에서, 조성물은 인간 또는 비-인간 영장류에 투여된다. 다른 예에서, 조성물은 비-인간 동물에 투여된다. 일 예에서, 조성물은 고양이, 개 및 말로부터 선택된 비-인간 동물에 투여된다. 일 예에서, 대상체는 암을 갖는다. 일 예에서, 암은 부인과 암이다. 다른 예에서, 대상체는 암 치료, 예컨대, 면역요법, 세포 요법, 방사선요법 또는 화학요법을 받고 있다. 다른 예에서, 대상체가 정신적으로 무능력하여, 대상체의 불임화 및/또는 여포생성의 억압이 대상체의 안녕을 위해 최선의 이익이 된다.
조성물의 투여는 당업자에게 알려진 임의의 방법 및 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 복강내 또는 피하 또는 여포로 직접 주사될 수 있다. 투여는 경피적일 수 있다. 일부 예에서, AMH 유사체는 일관된 전달을 위해, 예를 들어, 영구 피임이 바람직한 유전자 요법을 위한 벡터 형식의 1-회 주사로서 투여된다. 다른 예에서, AMH 유사체는 간헐적 펄스 형식으로 전달되며, 여기서 예를 들어, 여포생성의 일시적 저지, 예컨대, 일시적인 피임 방법을 갖는 것이 바람직하거나, 대상체의 일생 중 나중에 임신을 원하는 경우, 단일 투여 후 투여하지 않는 간격이 뒤따른다. 일부 예에서, 펄스형 투여는 AMH 유사체의 투여에 이어 본원에 개시된 조성물의 펄스형 투여 사이에 3 일 이상, 7 일 이상, 약 7 일 내지 3 주의 무치료의 간격을 포함한다.
본 개시내용의 조성물은 경피 패치, 질 링, 바이오겔의 형태로 제공되거나, 이식가능한 피임 장치, 예컨대, 자궁내 장치 (IUD) 상의 코팅으로서 제공될 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 세포 치료제, 면역치료제, 화학치료제 또는 방사선치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에 본 개시내용의 AMH 유사체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 기능적 난소 예비력의 감퇴를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 기능적 난소 예비력의 감퇴를 예방하는 것은 여성 대상체에서 난소 여포 예비력을 보존하는 방법에 관한 것이다. 일부 예에서, 기능적 난소 예비력의 감퇴를 예방하는 것은 AMH 유사체의 부재시와 비교하여 동원되는 원시 여포의 수를 10% 이상 감소시키거나, 동원되는 원시 여포의 수를 10% 내지 99%로 감소시키거나, 여포생성의 완전한 저지를 유발하거나, AMH 유사체의 부재시와 비교하여 원시 여포 활성화를 늦추는 것과 관련된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 AMH 유사체 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서의 피임 방법을 제공한다. 일 예에서, 대상체는 폐경-전 여성 대상체이다. 일 예에서, 대상체 또는 사춘기-전 여성 대상체. 본 개시내용의 AMH 유사체의 사용은 단기 또는 장기일 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 AMH 유사체 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 난소 및/또는 자궁 보호를 위한 방법을 제공한다.
일 예에서, 대상체는 35 세 초과의 인간 대상체이다.
일 예에서, 대상체는 암에 대한 치료를 받고 있거나 받을 것이다. 일 예에서, 대상체는 암에 대한 면역요법, 세포 요법, 화학요법 또는 방사선요법 치료를 받고 있다. 일 예에서, 대상체는 만성 질환 또는 장애에 대한 치료를 받고 있다.
일부 예에서, 방법은 본원에 기재된 AMH 유사체를 투여받지 않은 연령-매칭된 대상체와 비교하여 기능적 난소 예비력의 자연적 연령-관련된 감퇴를 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상 또는 40% 이상, 또는 50% 이상 또는 50% 초과로 억제한다.
일부 예에서, 대상체는 암에 대한 치료를 받고 있거나 받을 예정이거나, 만성 질환 또는 장애에 대한 치료를 받고 있거나 받을 예정이다.
일부 예에서, 대상체는 자가면역 질환을 가지며, 면역요법으로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있다.
일부 예에서, 대상체는 자궁 또는 난소의 세포에 세포 사멸 또는 세포 손상을 유발하는 세포독성 약물 또는 세포독성제로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 AMH 유사체 또는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 부인과 암의 치료 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 난포 여포 예비력, 피임, 자궁 보호를 보존하거나 부인과 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 제공한다.
일부 예에서 여성 대상체는 이들의 난소 예비력을 보존할 필요가 있거나 생식을 지연시킬 필요 또는 욕구를 갖거나, 대상체가 다음 중 어느 하나를 갖고 있거나, 이러한 경향이 있다: 줄어든 난소 예비력 (DOR), 조기 난소 노화 (POA), 원발성 난소 기능부전 (POI), 자궁내막증, BRAC1 돌연변이, 터너 증후군, 자가면역 질환, 갑상선 자가면역, 부신 자가면역 또는 자가면역 다선 증후군.
본원에 기재된 임의의 방법 또는 용도에 따른 특정 예에서, AMH 유사체는 N-말단 동종이량체 및 C-말단 동종이량체를 포함하는 4차 복합체로서 투여된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 다음을 포함한다:
(i) 본원에 기재된 AMH 유사체를 포함하는 투여 장치; 및
(ii) 대상체에서의 사용을 위한 지침서.
일 예에서, 투여 장치는 펌프 또는 주입 장치, 하나 이상의 단일 용량 또는 다중-용량 사전-로딩된 주사 시린지 또는 경피 패치로부터 선택된다. 일 예에서, 펌프는 삼투압 펌프, 예컨대, 알제트 펌프이다. 일 예에서, 투여 장치는 예를 들어, US 5267963, 6277097, 6386306 또는 6793646에 기재된 바와 같은 자동주사기이다.
도 1 (a) 야생형 인간 AMH 단백질 서열의 주석이 달린 아미노산 서열 (GenBank AAH49194; 서열번호 1). 신호 펩티드는 밑줄이 그어져 있고 아미노산 1-25에 상응한다. 전구단백질 전환효소 인식 부위 ("전구단백질 전환효소 부위"로서 또한 지칭됨)는 Arg448 내지 Arg451을 포함하며, Arg451 및 Ser452 사이에 절단이 발생하여 음영으로 표시된다. 프로도메인은 Arg26 내지 Arg451의 서열을 포함한다. 성숙한 도메인 서열 (Ser452 내지 Arg560; 서열번호 5)은 볼드체로 표시된다. Gly533은 성숙한 도메인 서열에서 볼드체 및 밑줄로서 표시된다. (b) 변형된 인간 AMH의 주석이 달린 아미노산 서열 (hAMH+SCUT+RSA; 서열번호 3). 신호 펩티드는 밑줄이 그어져 있으며 아미노산 1-18에 상응한다. 헥사-히스티딘 태그는 볼드체 및 밑줄로 표시된다. 슈퍼-컷 (SCUT) 전구단백질 전환효소 인식 서열 (Ile447a 내지 Ser451d)은 Arg451 및 Ser451a 사이에서 절단이 발생하여 회색 음영 처리된다. 프로도메인은 Pro30 내지 Arg451의 서열이다. 가공된 AMH는 아미노산 Ser451a 내지 Arg560을 포함한다. 성숙한 도메인 (Ser452 내지 Arg560)은 볼드체로 표시된다.
도 2는 mAMH 변이체의 발현을 도시한다. 생체외 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 mAMH cDNA에 대한 변형이 이루어졌다. 변형이 전구체 가공에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, 형질주입된 HEK-293T 세포로부터의 컨디셔닝된 배지를 12.5-배 농축하고, 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 블롯은 AMH의 C-말단을 향한 영역을 특이적으로 인식하는 mAb-5/6A로 탐침되었다. 12.5 kDa의 단량체성 성숙한 도메인 및 70 kDa의 단량체성 AMH 전구단백질이 도시된다.
도 3은 hAMH 돌연변이체의 제1 코호트의 발현을 도시한다. 생체외 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 hAMH+SCUT+RSA cDNA에 대한 변형이 이루어졌다. 돌연변이가 단백질 분비를 방지하는지 여부를 평가하기 위해, 형질주입된 HEK-293T 세포로부터의 컨디셔닝된 배지를 12.5-배 농축하고, 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 블롯은 AMH의 C-말단을 향한 영역을 특이적으로 인식하는 mAb-5/6A로 탐침되었다. 12.5 kDa의 단량체성 성숙한 도메인이 도시된다.
도 4는 hAMH 돌연변이체의 제2 코호트의 발현을 도시한다. 생체외 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 hAMH+SCUT+RSA cDNA에 대한 변형이 이루어졌다. 돌연변이가 단백질 분비를 방지하는지 여부를 평가하기 위해, 형질주입된 HEK-293T 세포로부터의 컨디셔닝된 배지를 12.5-배 농축하고, 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 블롯은 AMH의 C-말단을 향한 영역을 특이적으로 인식하는 mAb-5/6A (하부 패널) 및 가공된 hAMH 프로도메인을 특이적으로 검출하는 mAb-9/6A (상부 패널)로 탐침되었다. 12.5 kDa의 단량체성 성숙한 도메인 (하부 패널) 및 55 kDa의 가공된 AMH 프로도메인 (상부 패널)이 도시된다.
도 5는 hAMH 돌연변이체의 제3 코호트의 발현을 도시한다. 생체외 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 hAMH+SCUT+RSA cDNA에 대한 변형이 이루어졌다. 돌연변이가 단백질 분비를 방지하는지 여부를 평가하기 위해, 형질주입된 HEK-293T 세포로부터의 컨디셔닝된 배지를 12.5-배 농축하고, 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 블롯은 AMH의 C-말단을 향한 영역을 특이적으로 인식하는 mAb-5/6A로 탐침되었다. 12.5 kDa의 단량체성 성숙한 도메인이 도시된다.
도 6은 hAMH 돌연변이체의 제4 코호트의 발현을 도시한다. 생체외 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 hAMH+SCUT+RSA cDNA에 대한 변형이 이루어졌다. 돌연변이가 단백질 분비를 방지하는지 여부를 평가하기 위해, 형질주입된 HEK-293T 세포로부터의 컨디셔닝된 배지를 12.5-배 농축하고, 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 블롯은 AMH의 C-말단을 향한 영역을 특이적으로 인식하는 mAb-5/6A (하부 패널) 및 가공된 hAMH 프로도메인을 특이적으로 검출하는 mAb-9/6A (상부 패널)로 탐침되었다. 12.5 kDa의 단량체성 성숙한 도메인 (하부 패널) 및 55 kDa의 가공된 AMH 프로도메인 (상부 패널)이 도시된다.
도 7은 hAMH 변이체의 Co-IMAC 정제를 도시한다. 일시적으로 형질주입된 세포로 컨디셔닝된 200 mL의 배지를 ~1 mL로 농축하고, 결합 완충액을 이용하여 5 mL의 최종 부피로 다시 만들었다. 농축된 컨디셔닝된 배지를 HisPur™ 코발트 수지를 함유하는 컬럼에서 ~2.5 시간 동안 항온처리하였다. 결합되지 않은 단백질을 수집하고, 컬럼을 PBS로 2 회 세척하였다. 결합된 단백질을 용리하기 위해, HisPur™ 코발트 수지를 500 mM의 이미다졸을 함유하는 3 mL의 PBS에서 ~2.5 시간 동안 항온처리하였다. 결합된 상태로 남아 있는 임의의 단백질을 회수하기 위해, 수지를 1 M의 이미다졸을 함유하는 3 mL의 PBS에서 ~1 시간 동안 항온처리하였다. 10 μL의 각각의 분획을 SDS-PAGE로 분리한 다음, 웨스턴 전달을 수행하였다. 회수는 mAb-5/6A을 이용하여 블롯을 탐침함으로써 평가된다.
도 8은 G533A, G533S 및 G533K 돌연변이체의 활성을 도시한다. Smad1/5-반응성 루시퍼라제 리포터 및 AMHR2로 형질주입된 COV434 인간 과립막 세포를 Co-IMAC 정제된 hAMH 변이체의 농도를 증가시키면서 (A, 3.1-50 ng/mL; B, 0.62-50 ng/mL) 밤새 처리하였다. 측정된 루시퍼라제 활성은 대조군 웰의 평균에 대해 1.0의 조정된 값에 대한 배수-변화로서 표시된다.
도 9는 G533H, H548K, L535M 및 G533A+L535M 돌연변이체의 활성을 도시한다. Smad1/5-반응성 루시퍼라제 리포터 및 AMHR2로 형질주입된 COV434 인간 과립막 세포를 Co-IMAC 정제된 hAMH 변이체의 농도를 증가시키면서 (0.62-50 ng/mL) 밤새 처리하였다. 측정된 루시퍼라제 활성은 대조군 웰의 평균에 대해 1.0의 조정된 값에 대한 배수-변화로서 표시된다.
도 10은 성숙한 호르몬을 형성하기 위한 AMH의 가공 (A) 및 표지된 리스트(wrist) 및 핑거 도메인을 포함하는 성숙한 AMH의 구조적 모델 (B)을 도시한다.
도 11은 인간, 고양이, 개 및 말로부터 가공된 성숙한 AMH의 서열 정렬을 도시한다. ClustalW를 사용하여 준비된 정렬 (Larkin et al., (2007). Bioinformatics, 23, 2947-2948; Thompson et al., (1994). Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680). ESPript를 사용하여 준비된 도면 (Robert & Gouet (2014) Nucleic Acids Res., 42(W1), W320-W324).
도 12는 R&D Systems로부터 구입한 hAMH의 활성과 비교하여 hAMH+SCUT+RSA로부터 생산된 성숙한 가공된 AMH의 활성을 도시한다. 활성은 본원에 기재된 루시퍼라제 검정을 사용하여 결정된다.
서열 목록의 핵심
서열번호 1은 천연 인간 AMH 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열이다
서열번호 2는 천연 마우스 AMH 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열이다
서열번호 3은 hAMH+SCUT+RSA (변형된 신호 서열, 헥사히스틴딘 정제 태그 및 변형된 단백질분해 부위를 갖는 인간 AMH 전구체)의 아미노산 서열이다
서열번호 4는 hAMH+SCUT+RSA (변형된 신호 서열, 헥사히스틴딘 정제 태그 및 변형된 단백질분해 부위를 갖는 인간 AMH 전구체)의 뉴클레오티드 서열이다
서열번호 5는 인간 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드의 서열이다
서열번호 6은 hAMH+SCUT+RSA에 사용된 단백질분해 가공 부위의 서열이다
서열번호 7은 인간 AMH 리더/신호 서열의 서열이다
서열번호 8은 hAMH+SCUT+RSA에 사용된 리더/신호 서열의 서열이다
서열번호 9는 AMH 유사체의 서열이다
서열번호 10은 AMH 유사체의 서열이다
서열번호 11은 AMH 유사체의 서열이다
서열번호 12는 AMH 유사체의 서열이다
서열번호 14는 AMH 유사체의 서열이다
서열번호 14는 AMH 유사체의 서열이다
서열번호 15는 AMH 유사체의 서열이다
서열번호 16은 신호 서열이다
서열번호 17은 신호 서열이다
서열번호 18은 신호 서열이다
서열번호 19는 신호 서열이다
서열번호 20은 신호 서열이다
서열번호 21은 신호 서열이다
서열번호 23은 신호 서열이다
서열번호 24는 신호 서열이다
서열번호 25는 신호 서열이다
서열번호 26은 신호 서열이다.
서열번호 27은 마우스 AMH 전구체 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다
서열번호 28은 말 AMH 전구체 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다
서열번호 29는 개 AMH 전구체 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다
서열번호 30은 고양이 AMH 전구체 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다
서열번호 31은 말 AMH 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열이다
서열번호 32는 개 AMH 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열이다
서열번호 33은 고양이 AMH 전구체 폴리펩티드의 아미노산 서열이다
서열번호 34는 인간 AMH 전구체 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다
서열번호 35는 인간 성숙한 가공된 AMH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다
서열번호 36은 가공된 hAMH+SCUT+RSA의 아미노산 서열이다
서열번호 37은 단백질분해 가공 부위의 서열이다
서열번호 38은 단백질분해 가공 부위의 서열이다
서열번호 39는 단백질분해 가공 부위의 서열이다
서열번호 40은 단백질분해 가공 부위의 서열이다
서열번호 41은 C-말단 도메인에 대한 N-말단 확장이다
상세한 설명
일반 기법 및 선택된 정의
용어 "및/또는", 예컨대, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 두 의미 모두 또는 어느 한 의미에 대한 명시적 지지를 제공하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "(단수형)"은 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 단수형 및 복수형 양태 둘 모두를 포함한다.
본 명세서에 포함된 문서, 법률, 재료, 장치 또는 물품 등의 임의의 논의는 이러한 문제 중 임의의 것 또는 전부가 선행 기술 기반의 일부를 형성하거나 본 출원의 각각의 청구범위의 우선일 이전에 존재하였던 본 개시내용과 관련된 분야에서 일반적인 일반 지식이라는 것을 인정하는 것으로서 간주되어서는 안 된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹에 대한 언급은 이들 단계, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성 그룹 중 하나 및 복수 (즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 기재된 각각의 예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 개시내용의 각각 및 모든 다른 예에 준용하여 적용되어야 한다.
당업자는 본 개시내용이 구체적으로 기재된 것 이외의 변동 및 변형에 취약하다는 것을 이해할 것이다. 본 개시내용은 이러한 모든 변동 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에서 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 둘 이상을 포함한다.
본 개시내용은 단지 예시의 목적으로 의도된 본원에 기재된 구체적인 예에 의해 범주가 제한되어서는 안 된다. 기능적으로-동등한 생성물, 조성물 및 방법은 명확하게 본 개시내용의 범주 내에 있다.
본 개시내용은 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 세포 생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 수행된다. 이러한 절차는 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vol I, II, 및 III 전체; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I 및 II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, 전체 텍스트; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, 전체 텍스트, 및 특히 Gait, ppl-22의 논문; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; 및 Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, 전체 텍스트; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, 전체 텍스트; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), 전체 시리즈, Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. W
Figure pct00004
nsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (M
Figure pct00005
ler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); 및 Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, 전체 텍스트에 기재된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 또는 변동, 예컨대, "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 정수, 또는 단계 또는 요소 또는 정수의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수, 또는 요소 또는 정수의 그룹을 배제하는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 기술 분야 (예컨대, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학)의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다.
용어 "이로 이루어지다" 또는 "이로 이루어지는"은 물질의 방법, 공정 또는 조성이 인용된 단계 및/또는 구성요소를 갖고 추가적인 단계 또는 구성요소가 없음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
측정가능한 값, 예컨대, 중량, 시간, 용량 등의 양을 언급할 때 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적절하기 때문에, ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더 ±1%, 보다 더 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 AMH는 항-뮐러 호르몬을 지칭한다. 이 용어는 용어 뮐러-억제 물질 (MIS)과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "프리-프로 단백질"은 리더 서열, 예를 들어, 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는 전장 단백질 (야생형 AMH 단백질)을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "전구단백질" 또는 "프로도메인"은 리더 서열이 결여된 AMH 단백질 서열, 예를 들어, 아미노산 잔기 Arg26 내지 Gly447의 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "성숙한" AMH 단백질 또는 폴리펩티드는 가공 및 절단 후의 AMH 폴리펩티드를 지칭한다. 성숙한 서열은 Ser452 내지 Arg560의 서열이다. 생물학적 활성 AMH 단백질은 2 개의 단량체 유닛을 포함하는 동종이량체이며, 여기서 각각의 단량체 유닛은 Ser452 내지 Arg560의 서열을 갖는다.
본원에 기재된 AMH 유사체는 단리된 형태인 것으로 이해될 것이다. "단리된"은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 의미한다. 단리된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 실질적으로 순수하다.
AMH 유사체를 언급할 때 본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적으로 결합한다"는 AMHR2를 인식하고 이에 결합하지만 샘플에서의 다른 분자를 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 AMH 유사체를 지칭한다.
용어 "동일성" 또는 "서열 동일성" 및 이의 문법적 변동은 참조된 둘 이상의 엔티티가 동일함을 의미한다. 따라서, 2 개의 폴리펩티드 서열이 동일한 경우, 적어도 참조 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 2 개의 핵산 서열이 동일한 경우, 적어도 참조 영역 또는 부분 내에서 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 정의된 면적 (영역 또는 도메인)에 걸쳐 있을 수 있다. % 동일성은 비교 윈도우에 걸쳐 2 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우의 총 위치 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. % 동일성은 GAP (Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 444-453.1970) 분석 (GCG 프로그램), Smith and Waterman의 상동성 알고리즘 (Adv. Appl. Math. 2:482 (19801), 또는 Pearson and Lipman의 방법 (PNAS USA 85:2444-48 (1988)에 의해 결정될 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 다른 알고리즘은 Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 기재된 BLAST 알고리즘이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "증가된"은 참조 수준, 예를 들어, 천연 AMH 폴리펩티드에 대한 증가를 지칭한다. 증가는 예를 들어, 2-배 이상, 3-배 이상, 4-배 이상, 5-배 이상 또는 그 초과를 포함하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상 또는 그 초과일 수 있다. 증가는 발현 수준, 효능 또는 단백질 활성을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 약 100 개 초과의 핵염기 길이의 분자를 지칭한다. 핵염기는 예를 들어, DNA (예컨대, 아데노신 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA (예컨대, A, G 우라실 "U" 또는 C)에서 발견되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이러스 벡터"는 세포로의 핵산 작제물의 담체로서 바이러스 또는 바이러스-연관 벡터의 사용을 지칭한다. 작제물은 감염 또는 세포로의 형질도입을 위해 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 또는 단순 포진 바이러스 (HSV) 또는 기타와 같은 비-복제성 결함이 있는 바이러스 게놈에 통합 및 패키징될 수 있다. 벡터는 세포 게놈에 혼입되거나 혼입되지 않을 수 있다. 작제물은 원하는 경우 형질주입을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예컨대, EPV 및 EBV 벡터에 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약학 조성물"은 하나 이상의 치료적 또는 생물학적 활성제를 함유하고 환자에 투여하기에 적합한 임의의 조성물을 의미한다. 이들 제형 중 임의의 것은 당업계에 잘 알려져 있고 허용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Gennaro, A.R., ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (2000) 참고.
어구 "약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 범주 내에 있으며 합리적인 이익/위험 비율에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 및/또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형을 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 특이적 장애 또는 병태와 연관된 증상의 경감을 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 병태 또는 장애가 있는 사람들뿐만 아니라 병태 또는 장애를 가지기 쉬운 사람들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방"은 특이적 장애 또는 병태의 프로필락시스를 포함한다. 용어 "예방하는"은 질환 또는 장애 (예컨대, POA 또는 DOR)의 측정가능한 마커 또는 하나 이상의 증상의 소견의 회피 또는 지연을 지칭한다. 용어는 질환 또는 장애가 발달할 유사한 가능성 또는 감수성을 갖는 대조군 또는 비-치료된 개인의 증상 또는 마커에 비해, 또는 질환 또는 장애에 의해 영향을 받은 집단의 역사적 또는 통계적 측정에 기반하여 발생할 가능성이 있는 증상 또는 마커에 비해, 질환의 증상 또는 마커의 회피 또는 예방뿐만 아니라 질환의 증상 또는 마커 중 어느 하나의 감소된 중증도 또는 정도를 포함한다. 감소된 중증도는 대조군 또는 참조에 비해 증상 또는 측정가능한 질환 마커의 중증도 또는 정도의 10% 이상, 예컨대, 15%, 20%, 30%. 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상의 감소 또는 심지어 100%의 감소 (즉, 증상 또는 측정가능한 마커가 없음)를 의미한다.
용어 "치료적 유효량"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 경감시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체 또는 폴리뉴클레오티드의 충분한 양을 의미하는 것으로 간주되어야 하며, 원하는 효과를 제공하기에 또는 장애와 연관된 증상 또는 임상 마커의 유의한 감소를 제공하기에 충분한 양의 조성물에 관한 것이다. 치료의 효험은 가임력의 동물 모델에서 평가될 수 있으며, 임신을 예방하거나 여포생성을 저지시키 것을 야기하는 조성물의 임의의 치료 또는 투여는 효과적인 치료를 나타낸다. 증상의 치료적 또는 예방적으로 유의한 감소는 예컨대, 대조군 또는 비-처리된 대상체와 비교하여 측정된 파라미터에서 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 75% 이상 또는 그 초과이다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "야생형" 또는 "천연"은 생체내에서 정상적으로 존재하는 인간 AMH를 코딩하는 자연 발생 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 개시된 바와 같이, 인간 AMH의 프리-프로 단백질에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열번호 1에 상응하며, 여기서 아미노산 잔기 1-25는 리더/신호 서열에 상응한다. 본원에 개시된 바와 같이, AMH의 전구단백질 형태에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 잔기 26-560 (예컨대, 리더 서열이 결여됨)을 포함하며, 이는 이어서 단백질분해 절단에 의해 번역-후 가공되어 성숙한 AMH 형태를 형성한다. 본원에 개시된 바와 같이, 성숙한 AMH에 대한 야생형 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560을 포함한다. AMH는 활성 AMH를 형성하기 위해 번역-후 가공이 필요한 디설파이드 연결된 동종이량체 전구체로서 생산된다. 번역-후 가공은 성숙한 AMH를 방출하기 위한 프로-도메인으로부터의 절단 및 해리를 포함한다. 본원에 기재된 변이체 또는 돌연변이 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 언급은 "야생형" 또는 "천연" 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는, 즉, 서열번호 1에 제공된 인간 AMH의 프리-프로 단백질 (또는 이의 단편, 예컨대, 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560)과 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560 (즉, C-말단 도메인 또는 성숙한 가공된 AMH) 내에 위치한다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 인간 AMH의 하나 이상의 자연 발생 서열 다형체가 있다. 본 출원의 목적을 위해, 변이체 또는 돌연변이체 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 야생형 서열을 갖지 않는 인간 AMH의 임의의 자연 발생 서열 다형체를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 명세서 전반에 걸친 잔기 넘버링은 서열번호 1 (도 1a)에 도시된 인간 AMH 전구체를 참조하며, 여기서 서열번호 1에 제공된 서열의 제1 잔기는 위치 1로서 넘버링되고 서열번호 1에 제공된 서열의 마지막 잔기는 위치 560으로서 넘버링된다. 예를 들어, 정제 태그, 상이한 리더 서열 및 상이한 프로테아제 절단 서열 등의 포함으로 인해 추가적인 아미노산이 폴리펩티드에 삽입되는 실시양태에서, 삽입된 잔기는 삽입 직전의 야생형 잔기의 잔기 번호 및 알파벳 문자에 기반하여 표지된다. 예를 들어, 하기의 표 1 참고.
표 1: 일차 절단 부위에서 아미노산 삽입의 넘버링.
Figure pct00006
예를 들어, 상이한 리더 서열, 상이한 프로테아제 절단 서열 등의 포함으로 인해 아미노산이 폴리펩티드로부터 결실된 실시양태에서, 잔기는 서열번호 1에 제공된 상응하는 야생형 잔기의 잔기 번호에 기반하여 표지된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하며, 최소 길이에 제한되지 않는다. 용어는 폴리펩티드의 번역-후 변형, 예컨대, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 및 단백질분해 절단 등을 포함한다. 용어는 또한 폴리펩티드가 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대, 첨가 및 치환 (일반적으로 자연적으로 보존적임)을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이들 변형은 PCR 증폭 또는 기타 재조합 방법으로 인한 부위-지시된 돌연변이유발 또는 오류를 통해 의도적일 수 있다. 합성 비-천연 아미노산 치환된 아미노산 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 비-자연 아미노산의 폴리펩티드로의 혼입은 특정 상황에서 바람직하다. D-아미노산-함유 폴리펩티드는 L-아미노산 함유 형태와 비교하여 생체외 및 생체내에서 증가된 안정성을 나타낸다.
폴리펩티드를 설명할 때 용어 "보존적 치환"은 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 폴리펩티드의 아미노산 조성의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성을 갖는 상이한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 지칭한다. 특정 아미노산 서열의 보존적 치환은 폴리펩티드 활성에 중요하지 않은 아미노산의 치환 또는 중요한 아미노산의 치환이 폴리펩티드 활성을 감소시키지 않도록 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 아미노산의 치환을 지칭한다. 예를 들어, 다음의 6 개의 그룹 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
폴리펩티드에 대해 언급할 때 용어 "치환"은 상이한 엔티티, 예를 들어, 다른 아미노산에 대한 아미노산에서의 변화를 지칭한다. 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 게놈, cDNA, 반합성 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이는 기원 또는 조작으로 인해 자연에서 회합된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되지 않는다. 폴리펩티드의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 재조합체는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 동물 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 대상체는 예방적 치료를 포함하는 치료가 본 개시내용의 조성물로 투여되는 인간일 수 있다. 일부 예에서, 비-인간 동물은 반려 동물, 바람직하게는 고양이, 개 또는 말이다. 일부 예에서, 대상체는 비-인간 영장류, 예를 들어, 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크이다. 대상체는 바람직하게는 인간 여성이다. 대상체는 가임 연령 (예컨대, 20 내지 35 세), 십대 (예컨대, 13-19 세) 또는 사춘기-전 (예컨대, 6-12 세)일 수 있다. 여성 대상체는 35 세 초과일 수 있다.
폴리펩티드 (예컨대, AMH)와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유사체"는 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고/되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드로부터 결실되고/되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드에 첨가되는, 변형된 폴리펩티드를 광범위하게 의미하는 것으로 정의된다. 유사체는 천연 폴리펩티드에서 유래된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기의 첨가 또는 결실은 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 폴리펩티드의 C-말단 및/또는 폴리펩티드의 도메인의 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 폴리펩티드의 도메인의 폴리펩티드의 C-말단에서 일어날 수 있다. 첨가되고/되거나 치환된 아미노산 잔기는 코딩가능한 아미노산 잔기 또는 다른 자연 발생 잔기 또는 순수 합성 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유사체는 작용제이다.
자연에서, 일부 폴리펩티드는 표적화 표지, 예컨대, 신호 펩티드 외에 단백질 성숙 동안에 일부 지점에서 제거 (가공)되는 펩티드의 다른 단편을 또한 함유하는 복잡한 전구체로서 생산되어, (신호 펩티드의 제거를 제외하고) 일차 번역 생성물과 상이한 폴리펩티드의 성숙한 형태를 초래한다. 단백질과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "성숙한"은 번역-후 가공된 폴리펩티드를 지칭하며; 즉, 일차 번역 생성물에 존재하는 임의의 프리- 또는 프로펩티드가 절단되거나 제거된 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "전구체 단백질" 또는 "프리프로펩티드" 또는 "프리전구단백질"은 모두 mRNA의 번역의 일차 생성물을 지칭하며; 즉, 프리- 및 프로펩티드가 여전히 존재한다. 이 명명법에서 "프리"는 일반적으로 신호 펩티드를 지칭한다. 신호 펩티드만 제거되고 추가의 가공이 없는 번역 생성물의 형태를 "프로펩티드" 또는 "전구단백질"이라고 칭한다. 제거될 단편 또는 분절 자체는 "프로펩티드"로서 또한 지칭될 수 있다. 따라서, 전구단백질 또는 프로펩티드는 제거된 신호 펩티드를 가졌지만, 프로펩티드 (여기서는 프로펩티드 분절을 지칭함) 및 성숙한 단백질을 구성할 부분을 함유한다. AMH와 관련하여, "성숙한" AMH는 또한 "C-말단 도메인"으로서 지칭되고, 프로펩티드 분절은 또한 "N-말단 도메인"으로서 지칭된다. C-말단 도메인은 서열번호 9 내지 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, C-말단 도메인은 N 또는 C-말단에 추가적인 잔기를 임의로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, C-말단 도메인은 N-말단에 SVSS를 임의로 포함할 수 있다 (예컨대, 서열번호 36). 유사하게, N-말단 도메인은 N 또는 C-말단에 추가적인 잔기를 임의로 포함할 수 있다.
AMH와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "가공된" (즉, "가공된 AMH")은 본원에 논의된 바와 같이 프리 및 프로 도메인을 절단하기 위한 일차 번역 생성물 (즉, 프리전구단백질)의 가공 후의 성숙한 AMH (즉, 서열번호 1의 452 내지 560)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드와 관련하여 용어 "도메인"은 광범위하게 정의되고 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 영역, 단편 또는 분절을 지칭한다. 바람직하게는, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 영역, 단편 또는 분절은 예를 들어, 독립적으로 안정적이고 폴딩될 수 있는 조밀한 3-차원 구조를 형성한다. 그러나, 당업자는 일부 도메인 또는 이의 일부가 구조화되지 않거나 랜덤 코일 구조를 가질 수 있음을 이해할 것이다. 많은 단백질은 단일 도메인만을 함유하지만, 다른 단백질은 여러 도메인을 가질 수 있다.
AMH 유사체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "활성"은 AMH 수용체 복합체에 의한 신호 전달을 유도하는 유사체의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 활성은 AMH 유사체로 치료한 후 Smad-1/5 반응을 측정함으로써 측정된다.
항-뮐러 호르몬
뮐러 억제 물질 (MIS)로서 또한 알려진 항-뮐러 호르몬 (AMH)은 이량체 전구체로서 생산되며, 생체활성 C-말단 단편을 방출하기 위해 N-말단 (프로) 도메인으로부터 절단 및 해리가 필요한 활성화를 위한 번역후 가공을 거친다 (도 10a 참고).
여성이 나이가 들면서 AMH 수준은 감퇴하고 여포 자극 호르몬 (FSH) 수준은 증가한다. 미국 인간 생식 센터는 여성의 난소 예비력을 평가하기 위해 연령별 AMH 및 FSH 수준을 확립하였다. 이러한 기준선 수준은 표 2와 같다:
표 2: AMH 및 FSH의 연령별 수준
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AMH는 당단백질의 큰 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 다중유전자 패밀리의 140 kDa의 디설파이드-연결된 당단백질 구성원이다. 환원 조건 하에서 웨스턴 블롯 분석은 AMH가 각각의 "단량체"가 아마도 생합성 및 분비 과정 동안 2 개의 더 작은 종으로 절단된 디설파이드-연결된 이량체임을 나타낸다. 번역-후 가공 후, AMH는 함께 비-공유 복합체를 형성하는 57 kDa의 N-말단 도메인 이량체 및 12.5 kDa의 카복시-말단 (C-말단) 도메인 이량체를 포함한다. C-말단 도메인은 생물학적으로 활성인 모이어티이고, 절단은 활성에 필요하다. N-말단 도메인은 생체내에서 단백질 폴딩을 돕고 C-말단 펩티드의 수용체, 예컨대, AMHR2로의 전달을 용이하게 할 수 있다.
AMH 프로호르몬은 N-말단 도메인 (즉, 프로도메인) 및 C-말단 도메인 (즉, 성숙한 AMH)을 생성하기 위해 서브틸리신/켁신-유사 전구단백질 전환효소 (PC) 패밀리의 구성원 (예컨대, 푸린)에 의해 절단될 수 있다. 이 단백질분해 과정은 생리적 활성에 필요하며, TGF-β의 서열에서 발견되는 이염기성 절단 부위와 유사한 위치의 부위에서 발생한다. AMH의 비-절단가능한 돌연변이체는 생물학적으로 비활성이다.
AMH 전구체의 가공은 단백질분해 절단 및 리더 서열 (예컨대, 서열번호 1의 아미노산 1-25)의 제거, N-말단 및 C-말단 도메인을 생성하기 위한 AMH 단백질의 절단, 및 생체활성 동종이량체 AMH 단백질을 형성하기 위해 제2 C-말단 도메인에 디설파이드 연결된 C-말단 도메인의 해리를 수반한다. 성숙한 AMH 이량체는 프로도메인 이량체와 비-공유적으로 회합된다.
절단은 RAQR (서열번호 1의 448 내지 451)을 특징으로 하는 kex-유사 부위에서 주로 발생한다. 제2 아르기닌 뒤의 펩티드 결합이 절단된다. 이 부위의 절단은 AMH의 C-말단 도메인 (예컨대, 서열번호 1의 아미노산 452-560)을 생산한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전구단백질 전환효소 부위"는 일차 AMH 절단 부위를 지칭하며, 서열번호 1의 잔기 448 내지 451 (RAQR)을 포함한다.
유의성이 알려지지 않은 이차 절단 부위 ("R/S"로서 지칭됨)는 서열번호 1의 잔기 254-255에서 덜 빈번하게 관찰된다. 이 부위는 R S를 함유하나, 달리 푸린 절단에 대한 공통 Arg-X-(Arg/Lys)-Arg를 따르지 않는다.
AMH의 비-절단가능한 돌연변이체는 생물학적으로 활성이 아니며, 카복시-말단 도메인을 절삭하는 인간 유전자의 돌연변이는 지속적인 뮐러관 증후군을 야기한다. 생체내 아미노 말단 도메인의 역할은 단백질 폴딩을 돕고, C-말단 도메인 단편의 수용체로의 전달을 용이하게 할 수 있다.
일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 RAQR 절단 부위는 예를 들어, Duckert, Brunark & Blom (2004) Protein Eng Des Sel, 17:107-112에 기재된 바와 같은 서브틸리신/켁신-유사 전구단백질 전환효소 (PC) 패밀리에 대한 공통 서열로 대체된다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 절단 부위는 푸린 공통 서열, 예를 들어, 서열 모티프 R-X-[K/R]-R↓에 의해 대체되며, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기이다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 RAQR 절단 부위는 PCT 출원 PCT/US14/024010호에 기재된 바와 같이 RARR로 바뀐다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 절단 부위는 X1X2X3RKKRX8X9X10X11 (서열번호 37)로 바뀌고, 여기서 X1은 부재하거나 이소류신이고, X2는 부재하거나 세린이고, X3은 부재하거나 세린이고, X8은 부재하거나 세린이고, X9는 부재하거나 발린이고, X10은 부재하거나 세린이며, X11은 부재하거나 세린이다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 RAQR 절단 부위는 RKKR (서열번호 38)로 바뀐다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 절단 부위는 ISSRKKRSVSS (서열번호 6; 또한 본원에 SCUT로서 지칭됨)로 바뀐다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 절단 부위는 ISSRKKR (서열번호 39)로 바뀐다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 위치 448-451에서의 일차 절단 부위는 RKKRSVSS (서열번호 40)로 바뀐다. 아미노산 X1 내지 X3 및 X8 내지 X11 중 임의의 하나 이상의 포함 또는 생략은 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 전장 SCUT, 즉, 표 1의 옵션 1을 사용하면 R451 및 다음 S 다운스트림 (즉, S451a) 사이에서 절단이 발생하기 때문에 성숙한 AMH 상에 N-말단 SVSS가 남는다는 것을 주목해야 한다. hAMH+SCUT+RSA로부터 생산된 성숙한 가공된 AMH의 활성은 R&D Systems로부터 구입한 hAMH의 활성과 비슷하다 (도 12). 절삭된 SCUT이 사용되는 경우 (예컨대, 예를 들어, 표 1의 다양한 옵션 참고), 이는 추가적인 N-말단 아미노산의 존재, 서열 및/또는 수를 변경할 수 있다. 예를 들어, 표 1의 옵션 2 또는 3에서, SVSS는 전적으로 부재할 것이다. 다른 옵션 및 결과는 당업자에게 명백할 것이다.
위에 논의된 바와 같이, 성숙한 야생형 AMH 단백질은 서열번호 1의 야생형 AMH 단백질의 아미노산 잔기 1-25에 상응하는 N-말단 리더 서열을 포함하는 전구체로서 초기에 생산된다. 이 리더 서열은 절단 제거되어 AMH 전구단백질을 생산한다. 본 개시내용의 모든 양태에서, AMH 전구체는 비-내인성 리더/신호 서열을 가질 수 있으며, 여기서 서열번호 1의 아미노산 1-25의 리더/신호 서열은 상이한 리더 서열, 예컨대, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 리더 서열로 대체되었다. 본 개시내용의 모든 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 AMH 전구체는 일차 RAQR 절단 부위가 푸린 공통 서열로 대체되고 내인성 리더/신호 서열이 이종 리더 서열로 대체된 변형된 재조합 AMH 폴리펩티드일 수 있다. 본 개시내용의 모든 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 AMH 전구체는 일차 RAQR 절단 부위가 서열번호 6으로 대체되고 내인성 리더/신호 서열이 이종 리더 서열로 대체된 변형된 재조합 AMH 폴리펩티드일 수 있다.
분비된 단백질은 분비 경로로의 진입을 보장하는 리더 서열을 포함하는 전구체 형태로 세포 내부에서 초기에 발현된다. 신호 펩티드로서 또한 지칭된 이러한 리더 서열은 소포체 (ER)의 막을 가로질러 발현된 생성물을 지시한다. 신호 펩티드는 일반적으로 ER로의 전위 동안 신호 펩티다제에 의해 절단 제거된다. 일단 분비 경로에 진입하면, 단백질은 골지체로 수송된다. 골지체로부터의 단백질은 구획, 예컨대, 세포 액포 또는 세포막으로 이어지는 상이한 경로를 따를 수 있거나, 외부 배지로 분비되도록 세포 밖으로 라우팅될 수 있다 (Pfeffer and Rothman (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:829-852).
일부 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 1-25에 상응하는 AMH 단백질의 야생형 리더 서열 대신에 변형된 리더/신호 서열을 포함한다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 1-25의 천연 리더 서열은 이종 리더 서열, 예를 들어, 비제한적으로 알부민 리더 서열, 또는 이의 기능적 단편으로 대체된다. 일부 예에서, 이종 리더 서열은 인간 혈청 알부민 서열 (HSA), 예를 들어, 서열번호 26에 상응하는 리더 서열이다. 일부 예에서, 이종 리더 서열은 랫트 혈청 알부민 서열, 예를 들어, 서열번호 8에 상응하는 리더 서열이다.
HSA 리더 서열의 변형된 버전은 또한 예를 들어, 그 전체가 참조로 본원에 원용되는 미국 특허 제5,759,802호에 개시된 바와 같이 본 개시내용에 포함된다. 일부 예에서, HSA 리더 서열의 기능적 단편은 MKWVTFISLLFLFSSAYS (서열번호 17) 또는 이의 변이이며, 이는 그 전체가 본원에 원용되는 EP 특허 EP2277889호에 개시되어 있다. HSA 신호 서열의 프리-프로 영역의 변이체 (예컨대, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, 서열번호 18)는 단편, 예컨대, HSA 신호 서열의 프리 영역 (예컨대, MKWVTFISLLFLFSSAYS, 서열번호 19) 또는 이의 변이체, 예컨대, 예를 들어, MKWVSFISLLFLFSSAYS (서열번호 20)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리더 서열은 리더 서열이 서열번호 7의 아미노산 잔기에 대해 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, 리더 서열은 리더 서열이 서열번호 8의 아미노산 잔기에 대해 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, 리더 서열은 리더 서열이 서열번호 26의 아미노산 잔기에 대해 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 동일한 것이다.
다른 리더 서열은 또한 서열번호 1의 아미노산 1 내지 25를 대체하기 위해 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 리더 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 전체가 참조로 본원에 원용되는 US 2007/0141666호에 개시된 바와 같이 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 프로펩티드 (IgSP-tPA)에 융합된 면역글로불린 신호 펩티드를 포함하는 리더 서열을 포함한다. 수많은 다른 신호 펩티드가 분비된 단백질의 생산에 사용된다. 이들 중 하나는 뮤린 면역글로불린 신호 펩티드 (IgSP, EMBL 수탁 번호 M13331)이다. IgSP는 Loh et al. (Cell. 33:85-93)에 의해 1983 년에 처음 식별되었다. IgSP는 포유동물 세포에서 양호한 발현을 제공하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어. EP 특허 제0382762호는 IgSP 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제 간의 융합 폴리펩티드를 작제함으로써 홀스래디쉬 퍼옥시다제를 생산하는 방법을 개시한다. 다른 리더 서열은 예를 들어, 비제한적으로 MPIF-1 신호 서열 (예컨대, GenBank 수탁 번호 AAB51134의 아미노산 1-21) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA (서열번호 16); 스타니오칼신 신호 서열 (MLQNSAVLLLLVISASA, 서열번호 17); 인버타제 신호 서열 (예컨대, MLLQAFLFLLAGFAAKISA, 서열번호 18); 효모 교배 인자 알파 신호 서열 (예컨대, K. 락티스 킬러 독소 리더 서열); 하이브리드 신호 서열 (예컨대, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, 서열번호 19); HSA/MFa- 1 하이브리드 신호 서열 (HSA kex2로서 또한 알려짐)(예컨대, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, 서열번호 20); K. 락티스 킬러/MFa-1 융합 리더 서열 (예컨대, MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, 서열번호 21); 면역글로불린 Ig 신호 서열 (예컨대, MGWSCIILFLVATATGVHS, 서열번호 22); 피불린 B 전구체 신호 서열 (예컨대, MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, 서열번호 23); 클러스터린 전구체 신호 서열 (예컨대, MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, 서열번호 24); 및 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 4 신호 서열 (예컨대, MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, 서열번호 25)을 포함한다.
추가 예에서, AMH 전구체 또는 이를 코딩하는 핵산 서열은 정제를 돕기 위한 태그를 또한 포함한다. 일부 예에서, 태그는 c-myc, 폴리히스티딘 또는 FLAG 태그일 수 있다. 일부 예에서, 태그는 폴리히스티딘 태그이다. 특정 예에서, 태그는 번역후 가공 (예컨대, 푸린 또는 유사한 프로테아제를 이용한 절단) 후에 C-말단 도메인 단편이 태깅되지 않도록 위치된다. 다시 말해, 태그는 번역후 가공 (예컨대, 푸린 또는 유사한 프로테아제를 이용한 절단) 후에 N-말단 도메인이 태깅되도록 위치된다. 특정 예에서, 폴리히스티딘 태그는 리더/신호 서열 다음, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 잔기 25 뒤에 위치한다. 특정 예에서, 폴리히스티딘 태그는 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 바로 앞에 위치한다. 폴리히스티딘 태그는 His6 또는 His8일 수 있다. AMH 전구체는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 초과의 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 태그는 AMHR2에 결합하고 활성화할 때 AMH 유사체 기능의 생체활성을 방해하거나 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
추가 예에서, AMH 유사체는 하나 이상의 잔기 상에서 글리코실화된다. 일부 예에서, AMH 유사체는 N-말단 도메인의 하나 이상의 잔기 상에서 글리코실화된다.
일부 실시양태에서, AMH 유사체는 서열번호 5에 제시된 천연 인간 AMH 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 AMH의 추정 핑거 도메인에 있다 (도 10b). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 AMH의 추정 핑거 2에 있다 (도 10b). 일부 실시양태에서, 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 535 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 535에 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 및 535에 있다.
일부 실시양태에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 C-말단 도메인 폴리펩티드, 및 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 447에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 N-말단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일 예에서, AMH 유사체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 452 내지 560에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 2 개의 C-말단 도메인 폴리펩티드, 및 서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 447에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 2 개의 N-말단 도메인 폴리펩티드를 포함한다.
AMH 유사체는 AMHR 복합체의 활성을 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, AMH 유사체는 AMHR2의 작용제이다.
다양한 비-인간 동물로부터의 AMH 서열은 하기 표 3에 제공된다.
표 3: AMH 서열
Figure pct00008
인간 및 비-인간 동물로부터의 성숙한 AMH 서열의 정렬이 도 11에 제공된다.
본원에 기재된 AMH 유사체는 또한 예를 들어, 글리코실화, 아미드화, 카복실화 또는 인산화에 의해, 또는 산 부가 염, 아미드, 에스테르, 특히, C-말단 에스테르, 및 N-아실 유도체의 생성에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, AMH 유사체 폴리펩티드 또는 이의 상응하는 전구체는 하나 이상의 융합 파트너에 융합될 수 있다. 일 예에서, 융합 파트너는 Fc 단백질 (예컨대, 동물 또는 인간 Fc)이다. 융합 단백질은 제2 융합 파트너, 예컨대, 정제 또는 검출 태그, 예를 들어, 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있는 단백질 (예컨대, 녹색 형광 단백질, 헤마글루티닌 또는 알칼리 포스파타제, DNA 결합 도메인 (예컨대, GAL4 또는 LexA); 유전자 활성화 도메인 (GAL4 또는 VP16), 정제 태그 또는 분비 신호 펩티드 (예컨대, 프리프로트립신 신호 서열)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, AMH 유사체 폴리펩티드는 생체이용률을 향상시키기 위해 제2 융합 파트너, 예컨대, 담체 분자에 융합된다. 이러한 담체는 당업계에 알려져 있으며, 폴리 (알킬) 글리콜, 예컨대, 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 고려되는 다른 변형은 중합체 (예컨대, PEG)에 대한 부착을 포함한다. PEG화 방법은 당업계에 알려져 있다. 다른 예는 트랜스페린, 알부민, 성장 호르몬 또는 셀룰로스 또는 폴리펩티드의 약동학을 개선하는 기타 분자와의 컨쥬게이션 또는 유전적 융합을 포함한다.
특정 예에서, AMH 유사체는 유사체의 반감기를 증가시키도록 변형될 수 있다. 일부 예에서, AMH 유사체는 생체내 AMH 유사체의 반감기를 증가시키는 반감기 연장 모이어티를 포함하거나 이에 컨쥬게이션된다. 적합한 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜, 지질 및 단백질 (예컨대, Fc 단편, 알부민 결합 단백질, PAS 서열을 포함하는 폴리펩티드, XTEN)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 혈청 알부민에 대한 융합은 또한 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 증가된 또는 연장된 반감기는 혈액으로부터 특정 분자의 느린 클리어런스를 의미한다.
반감기 연장 모이어티는 예를 들어, 혈청 알부민에 대한 생체내 회합을 허용할 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 특히, 반감기 연장 모이어티는 알부민 결합 모이어티일 수 있다. 알부민 결합 모이어티는 예컨대, 자연 발생 폴리펩티드, 또는 이의 알부민 결합 단편, 또는 조작된 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 조작된 알부민 결합 폴리펩티드는 예를 들어, 단백질 스캐폴드의 변이체일 수 있으며, 이 변이체는 알부민에 대한 특이적 결합 친화도에 대해 선택되었다. 구체적인 실시양태에서, 단백질 스캐폴드는 스트렙토코커스 단백질 G 또는 이의 유도체의 도메인으로부터 선택될 수 있다. 적합한 알부민 결합 도메인의 다른 예는 WO2009/016043호에 개시되어 있다.
반감기 연장 모이어티는 예를 들어, 폴리펩티드-기반의 랜덤-코일 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 PAS 폴리펩티드일 수 있다 (예를 들어, Payne et al. (2010) Pharm. Dev. Technol., 1-18; Pisal et al. (2010) J. Pharm. Sci. 99 (6), 2557-2575; Veronese. (2001) Biomaterials 22 (5), 405-417; PCT/EP2011/058307호 및 PCT/EP2008/005020호 참고). PAS 폴리펩티드는 프롤린, 알라닌 및 임의로 세린 (PA/S 또는 PAS) 잔기의 서열을 함유하여, 안정적으로 무질서한 폴리펩티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 XTEN 폴리펩티드일 수 있다 (예를 들어, Podust et. al., (2016) J Control Release 240:52-66 참고). XTEN은 전적으로 알라닌, 글루타메이트, 글리신, 프롤린, 세린 및 트레오닌 잔기로 구성되어, 고도로 친수성인 구조화되지 않은 폴리펩티드를 형성한다.
당업자는 폴리펩티드의 생체내 반감기를 연장하기 위해 다수의 다른 잘 알려진 접근법이 존재하고 임의의 적합한 접근법이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 치료적 단백질의 반감기를 연장시키기 위한 전략의 예는 Zaman et. al., (2019) J. Control. Release. 301:176-189에 또한 논의된다.
돌연변이체 AMH 폴리펩티드의 제조
변경된 폴리펩티드 (AMH 유사체)는 당업계에 알려진 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 생체외 돌연변이유발에 적용될 수 있다. 이러한 생체외 돌연변이유발 기술은 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터로 서브-클로닝하고, 벡터를 "뮤테이터" 균주, 예컨대, 대장균 XL-1 레드 (Stratagene)로 형질전환하고, 형질전환된 박테리아를 적합한 세대 수 동안 증식시키는 것을 포함한다. 돌연변이된/변경된 DNA로부터 유래된 생성물은 이들이 수용체-결합 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 본원에 기재된 기술을 사용하여 용이하게 스크리닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 알려진 기술, 예를 들어, Stratagene Inc. (현재 Agilent technologies)에 의해 개발된 QuikChange™ 방법 또는 기타 상업적으로 이용가능한 키트/전략을 사용하여 부위-지시된 돌연변이유발에 적용될 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이체를 설계함에 있어, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 성질은 변형될 특질(들)에 의존할 것이다. 돌연변이 부위는 예컨대, (1) 먼저 보존적 아미노산 선정으로 치환한 다음, 달성된 결과에 따라 더 많은 라디칼 선택으로 치환하거나, (2) 표적 잔기를 결실시키거나, (3) 위치된 부위에 인접한 다른 잔기를 삽입함으로써 개별적으로 또는 연속하여 변형될 수 있다.
아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1 내지 15 개의 잔기, 보다 바람직하게는 약 1 내지 10 개의 잔기 및 전형적으로 약 1 내지 5 개의 근접한 잔기 범위이다. 치환 돌연변이체는 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발에 대한 가장 큰 관심 부위는 수용체 결합에 중요한 것으로서 식별된 부위를 포함한다.
특정 예에서, 부위(들)는 비교적 보존적인 방식으로 치환된다. 이러한 보존적 치환은 "예시적인 치환"이라는 제목 하에 표 4에 도시된다.
표 4: 예시적인 치환
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본원에 기재된 아미노산은 바람직하게는 "L" 이성질체 형태이다. 그러나, 결합의 원하는 기능적 특성이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한, D 이성질체 형태의 잔기는 임의의 L-아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 변형은 또한 구조적 및 기능적 유사체, 예를 들어, 합성 또는 비-자연 아미노산 또는 아미노산 유사체 및 유도체화된 형태를 갖는 펩티드모방체를 포함한다.
재조합 생산
벡터
본 개시내용의 AMH 유사체는 예를 들어, 자동화된 펩티드 합성 기구 (예컨대, Applied Biosystems, Foster City, Calif. 참고)와 같이 용이하게 수득가능한 기술 및 재료를 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다.
핵산 분자를 설명하기 위해 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이는 기원 또는 조작으로 인해 자연에서 회합된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되지 않는다. 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 용어 재조합체는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 의미한다. 숙주 세포와 관련하여 사용된 용어 재조합체는 재조합 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주 세포를 의미한다. 재조합체는 또한 이종 재료 (예컨대, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)의 도입에 의해 변형된 재료 (예컨대, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터)와 관련하여 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
재조합 생산을 위해, 본 개시내용의 AMH 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 바람직하게는 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 단리되고 복제가능한 벡터에 삽입된다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예컨대, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되거나 합성된다.
많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 구성요소는 일반적으로 신호 서열, 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하며; 플라스미드는 "벡터"에 포함되는 속의 종이다. 용어 "벡터"는 전형적으로 숙주 세포에서 복제 및/또는 유지에 필요한 복제 기원 및 기타 엔티티를 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 작동적으로 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 일반적으로, 유용성의 발현 벡터는 종종 "플라스미드"의 형태이며, 이는 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않은 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하며, 전형적으로 안정하거나 일시적인 발현 또는 코딩된 DNA를 위한 엔티티를 포함한다.
(i) 신호 서열 구성요소. 본 개시내용의 AMH 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있으며, 이는 바람직하게는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 기타 폴리펩티드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 가공되는 것 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨)이다.
(ii) 프로모터 구성요소. 발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대, tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 알려진 박테리아 프로모터가 적합한다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "프로모터" 또는 "프로모터 영역" 또는 "프로모터 요소"는 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 제어하는 핵산 서열의 분절을 지칭하며, 전형적으로 DNA 또는 RNA 또는 이의 유사체로 제한되지는 않는다. 프로모터 영역은 RNA 중합효소 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 특이적 서열을 포함한다. 프로모터 영역의 이 부분을 프로모터로서 지칭한다. 또한, 프로모터 영역은 RNA 중합효소의 이러한 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조정하는 서열을 포함한다. 이들 서열은 시스-작용일 수 있거나, 트랜스-작용 인자에 반응할 수 있다. 프로모터는 조절의 성질에 따라 구성적이거나 조절될 수 있다. 프로모터는 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 난소 또는 자궁에서의 발현에 특이적)를 지칭할 수 있다.
진핵생물에 대한 프로모터는 알려져 있다. 거의 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 개의 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발로부터 70 내지 80 개의 염기 업스트림에서 발견된 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 단부는 코딩 서열의 3' 단부에 대한 폴리 A 꼬리의 첨가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열을 포함한다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터에 적합하게 삽입된다. 효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 촉진 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 해당 효소, 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다. 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가적인 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소, 및 말토스 및 갈락토스 활용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657호에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서는 또한 효모 포로모터와 함께 유리하게 사용된다.
(iii) 인핸서 요소 구성요소. 고등 진핵생물에 의한 본 개시내용의 AMH 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기원의 후기 쪽에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 쪽에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 요소를 향상시키는 것에 대해 Yaniv (1982) Nature 297: 17-18을 참고한다. 인핸서는 AMH 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
(iv) 전사 종결 구성요소. 진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 또한 함유할 것이다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3'의 비번역된 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역된 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 분절을 함유한다. 한가지 유용한 전사 종결 구성요소는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026호 및 그 안에 개시된 발현 벡터를 참고한다.
(v) 숙주 세포의 선택 및 형질전환. 본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 위에 기재된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예컨대, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에, 예컨대, 에셰리키아, 예컨대, 대장균, 엔테로박터, 에르비니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예컨대, 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예컨대, 세라테아 마르세스칸스 및 시겔라뿐만 아니라 바실리, 예컨대, B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스, 슈도모나스, 예컨대, P. 아에루기노사 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 하나의 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예컨대, 대장균 B, 대장균 X 1776 (ATCC 31,537) 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
본원에서 유용할 수 있는 다른 발현 벡터는 비제한적으로 플라스미드, 에피솜, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터를 포함하며, 이러한 벡터는 숙주의 게놈에 통합되거나 특정 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 동등한 기능을 제공하는 당업자에게 알려진 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어, 자기-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈에 통합되는 벡터가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 벡터는 연결된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현이 가능한 벡터이다. 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 발현 벡터는 DNA의 안정적인 또는 일시적인 발현을 초래할 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 예시적인 발현 벡터는 pcDNA3.1이다.
일부 예에서, AMH 유사체를 코딩하는 핵산은 바이러스 벡터로서 투여된다. 이러한 바이러스 벡터는 예를 들어, US5,399,346호에 기재된 바와 같이 유전자 요법에 사용하기에 적합하다. 세포로의 진입은 당업계에 알려진 수단, 예컨대, 벡터에 폴리뉴클레오티드를 제공하거나 리포솜에 폴리뉴클레오티드를 캡슐화하는 것에 의해 용이하게 될 수 있다.
진핵 세포에 필적하는 발현 벡터를 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체의 발현을 위한 재조합 작제물을 생산할 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 알려져 있으며, 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 이러한 벡터는 전형적으로 DNA 삽입을 위한 제한 부위가 제공된다. 이러한 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 폭스 바이러스, 예컨대, 오르토폭스 (예컨대, 백시니아), 아비폭스, 렌티바이러스 또는 뮤린 말로니 백혈병 바이러스일 수 있다.
일부 예에서, 플라스미드 발현 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드 발현 벡터는 대장균 숙주 세포, 예컨대, BL21, AD494(DE3)pLys, Rosetta (DE3), Origami (DE3) 및 pCIneo에서 단백질 발현을 위한 pcDNA3.1, pET 벡터, pGEX 벡터 및 pMAL 벡터를 포함한다.
일부 예에서, 벡터는 복제 불능 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, pAdeno X, pAd5F35, pLP-Adeno-X-CMV (Clontech®), pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST 벡터 (invitrogen™ Inc.)이다.
본 발명에 활용될 수 있는 바이러스 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노-연관된 바이러스 벡터; (d) 단순 포진 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 파필로마 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 폭스 바이러스 벡터, 예컨대, 오르토폭스, 예컨대, 백시니아 바이러스 벡터 또는 아비폭스, 예컨대, 카나리 폭스 또는 계두; 및 (j) 헬퍼-의존적 또는 유전자미함유(gutless) 아데노바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일 예에서 벡터는 아데노바이러스이다. 복제 결함 바이러스도 유리할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터"는 AAV 벡터 게놈 (이는 결과적으로, 본원에서 언급되는 제1 및 제2 발현 카세트를 포함함)을 함유하는 AAV 바이러스 입자를 의미한다. 적합한 AAV 벡터는 당업자에게 알려져 있으며, 모든 혈청형의 AAV 벡터, 예를 들어, AAV-1 내지 AAV-10, 예컨대, 바람직하게는 AAV-1 (US 6,759,237호), AAV-2, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9 및 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 국제 특허 WO 02/33269호, WO 02/386122호 (AAV8) 및 GenBank의 공개물 및 이러한 서열, 예를 들어, AAV6.2, AAV6.1, AAV6.1.2, rh64R1 및 rh8R이 단일항 오류를 수정하기 위해 어떻게 변경되었는지를 참고한다 (예를 들어, 2006 년 10 월 19 일에 공개된 WO 2006/110689호 참고). 대안적으로, 알려진 기술 (예를 들어, 국제 특허 공개공보 WO 2005/033321호 및 GenBank 참고)을 사용하거나 다른 수단에 의해 당업자에 의해 식별된 것들을 포함하는 다른 AAV 서열은 본원에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
벡터는 세포 게놈에 혼입되거나 혼입되지 않을 수 있다. 작제물은 원하는 경우 형질주입을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예컨대, EPV 및 EBV 벡터에 혼입될 수 있다.
숙주 세포
AMH 폴리펩티드 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포, 예컨대, 스포도프테라 프루기페르다 (애벌레), 아에데스 아에기프티 (모기), 아에데스 알보픽투스 (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (초파리) 및 봄빅스 모리가 식별되었다. 형질주입을 위한 다양한 바이러스 균주, 예컨대, 아우토그라파 칼리포니카 NPV의 L-I 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질주입을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있다.
유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양액에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al. (1977) Gen Virol. 36:59); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO, Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216); 마우스 지대(Sertoli) 세포 (TM4, Mather (1980) Biol. Reprod. 23:243-251); 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL- 1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al. (1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 PER.C6™ (Crucell NV)이다.
특정 예에서, 본원에 기재된 AMH 유사체는 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 하나 이상의 정제 방법에 의해 단리되고/되거나 정제되거나 실질적으로 정제될 수 있다. 일반적으로, 순도는 90% 이상, 특히 95% 및 종종 99% 초과이다.
특정 실시양태에서, 자연 발생 화합물은 더 넓은 속의 일반적인 설명으로부터 제외된다.
AMH 유사체의 활성 측정
AMH 유사체와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "활성"은 AMH 수용체 복합체에 의한 신호 전달을 유도하는 유사체의 능력을 지칭한다. 본원에 기재된 AMH 유사체는 천연 인간 AMH의 활성과 비슷하거나 더 큰 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 AMH 유사체는 천연 인간 AMH에 의해 유발된 활성화의 수준과 비슷하거나 더 큰 수준에서 AMHR2를 활성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 AMH 유사체는 천연 인간 AMH에 의해 유발된 활성화의 수준과 비슷하거나 더 큰 수준에서 AMHR1을 활성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 AMH 유사체는 천연 인간 AMH에 의해 유발된 활성화의 수준과 비슷하거나 더 큰 수준에서 SMAD1/5를 활성화 (예컨대, SMAD1/5의 인산화를 유도)할 수 있다. AMH 유사체의 활성은 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 활성은 AMH 유사체로 치료한 후 Smad-1/5 반응을 측정함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, AMH 유사체의 활성은 본원에 기재된 바와 같이 루시퍼라제 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 간단히 말해서, COV434 세포는 Smad1/5-반응성 BRE-루시퍼라제 리포터 및 AMHR2로 형질주입된다. 형질주입 24 시간 후, 세포를 다양한 농도의 AMH 유사체로 밤새 처리한다. 세포를 수확하고, 용해하고, 기질 D-루시페린을 첨가한 직후 발광을 측정한다. 루시퍼라제 활성은 기준선 활성과 관련된 배수-변화로서 분석된다.
AMH 유사체의 치료적 용도
본원에 기재된 AMH 유사체는 난소 및/또는 자궁 보호에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "난소 보호"는 외상, 손상 또는 외인성 약제, 예컨대, 치료제 또는 치료의 효과의 결과로서 한쪽 또는 양쪽 난소에 대한 해롭거나 유해 효과에 대한 보호를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 외인성 약제는 화학요법제 또는 세포독성제일 수 있다. "난소 보호"는 또한 난소에 대한 임의의 상해 또는 외상 (예컨대, 생착 또는 부상)에 대한 보호를 지칭할 수 있다. 난소 보호는 한쪽 또는 양쪽 난소의 보호를 지칭할 수 있다. "난소 보호"는 난소의 기능 (예컨대, 생식 호르몬 생산, 적절한 수준의 여포 자극 호르몬 유지 또는 여포 생산) 및 난소의 조직학 (예컨대, 크기 및 조직 건강)을 보호하는 것을 지칭한다. 난소 보호는 치료제 또는 치료의 투여 전의 난소 기능과 비교하여, 상기 투여 후 난소 기능의 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상을 유지한다. 난소 보호는 또한 암 치료 동안 손상으로 인한 난소 보호를 포함한다.
본원에 기재된 AMH 유사체는 또한 여포생성을 감소시키고 따라서 난소 보호를 용이하게 하는 데 유용할 수 있다. 여포생성은 미성숙한 난모세포를 함유하는 난소 여포의 성숙이며, 월경 주기의 일부로서 많은 작은 원시 여포가 큰 배란전 여포로 진행된다. 호르몬에 의한 신호에 반응하는 원시 여포 또는 원시 여포의 고갈은 폐경의 시작의 신호를 보낸다. 여포생성을 감소시킴으로써, 원시 여포가 보존된다. 난소 보호는 여성 대상체의 여포생성을 감소시키거나, 동원되는 원시 여포의 수를 AMH 유사체가 부재한 경우와 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 또는 그 초과로 감소시킨다.
일부 예에서, 난소 보호는 조기 난소 부전의 억제일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "조기 난소 부전"은 40 세 이전에 난소 기능의 중단을 지칭한다. 임상적으로, 조기 난소 부전은 혈액 중 높은 수준의 여포 자극 호르몬 및 황체형성 호르몬 수준에 의해 진단된다. 조기 난소 부전의 원인은 화학요법, 방사선요법, 자가면역 질환, 갑상선 질환, 당뇨병 및 외과적으로 유도된 폐경 (예컨대, 자궁적출술 또는 난소절제술)을 포함하나, 이에 제한되지 않다. 난소 보호는 또한 암 치료 양생법, 예컨대, 화학요법 및 방사선요법, 또는 기타 인공 상해, 예컨대, 세포독성 인자, 호르몬 결핍, 성장 인자 결핍, 사이토카인 결핍 및 세포 수용체 항체 등으로부터 여성의 생식계를 보호하는 방법을 포함할 수 있다. 기타 상해는 여성의 생식계가 부분적으로 또는 전체적으로 수술적으로 제거되는 외과적 상해를 포함한다. 특히, 한쪽의 난소의 제거로 인한 호르몬 불균형은 본원에 기재된 AMH 유사체의 투여에 의해 완전히 또는 부분적으로 회복된다.
본원에 기재된 AMH 유사체는 또한 자궁 보호에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, "자궁 보호"는 치료제 또는 치료, 예컨대, 화학요법제 또는 세포독성제의 결과로서 자궁에 대한 해롭거나 유해 효과에 대한 보호를 지칭한다. "자궁 보호"는 자궁의 기능 (예컨대, 배아 착상, 태반의 발달 및 만삭까지 임신을 지속할 수 있는 역량 (예컨대, 유산 또는 조산 없이)) 및 자궁의 조직학 (예컨대, 자궁 내막 건강)을 보호하는 것을 지칭한다. "자궁 보호"는 또한 난소에 대한 상해 (예컨대, 수술, 예컨대, 제왕 절개 또는 부상)에 대한 보호를 지칭할 수 있다. 자궁 보호는 치료제 또는 치료의 투여 전 자궁 기능과 비교하여, 상기 투여 후 자궁 기능의 99% 이상, 95% 이상, 90% 이상, 80% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 50% 이상, 40% 이상, 30% 이상, 20% 이상, 10% 이상을 유지한다. 자궁 보호는 자궁 내막의 증가일 수 있다. 얇은 자궁 내막은 배아가 자궁 내막에 착상하는 역량을 방해할 수 있다. 비-침습적 이미징, 예컨대, 골반 초음파 또는 초음파진단기는 대상체의 자궁 내막의 두께를 평가하는 데 사용될 수 있다. 월경 동안에, 자궁 내막은 2-4 mm이며; 2 mm 미만은 얇은 자궁 내막을 나타낸다.
자궁 보호는 여성 대상체에서 자궁내막증의 가능성을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 자궁내막증은 자궁 외부, 예컨대, 생식 기관 (예컨대, 난소, 나팔관 또는 자궁 주변 조직)에서 자라는 자궁 내막을 초래하는 병태이다. 자궁내막증은 난소, 나팔관 또는 자궁의 기능을 방해하며, 불임을 초래할 수 있다. 자궁 보호는 임신-유도된 고혈압 또는 자간전증의 발생률 또는 이의 위험을 감소시킬 수 있다.
본원에 기재된 AMH 유사체는 피임에 사용될 수 있으며, 이는 이것이 수정 가능성을 저하시켜 임신 가능성을 저하시키는 능력을 정지시킨다는 것을 의미한다. 여성 대상체에 대한 AMH 유사체의 투여는 상기 여성이 월경 주기 및 생식 호르몬 분비를 제어하도록 하고, 원시 여포 동원 및/또는 활성화를 늦추거나 방지한다 (예컨대, AMH 유사체의 투여는 월경 주기를 중지함).
본원에 기재된 AMH 유사체는 기능적 난소 예비력 (FOR)의 감퇴를 예방하거나, 여성 대상체에서 여포생성을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 대상체는 15 세 내지 55 세일 수 있으며, 면역요법, 세포 요법, 화학요법, 방사선요법 또는 화학-방사선요법으로부터 선택된 치료될 것이거나, 치료를 받고 있다. 대상체는 암 또는 자가면역 질환을 가질 수 있다. 대상체는 세포독성 약물로 치료될 것이거나, 치료를 받고 있다. 여성 대상체의 여포생성 감소는 AMH 유사체의 부재시와 비교하여, 동원되는 원시 여포의 수의 10% 이상의 감소, 또는 AMH 유사체의 부재시와 비교하여, 동원되는 원시 여포의 수의 10% 내지 99%의 감소 또는 여포생성의 완전한 저지일 수 있다.
본원에 기재된 AMH 유사체는 암, 예를 들어, AMH 수용체를 발현하는 암 또는 AMHR2 반응성 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 AMHR2를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 AMHR2 반응성 암이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 AMH 유사체는 부인과 암의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "부인과 암"은 여성 생식계의 암, 예를 들어, 자궁경부, 나팔관, 난소, 태반, 자궁, 자궁내막, 질 및 외음부의 암을 지칭한다. 일부 실시양태에서 부인과 암은 자궁암, 난소암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서 부인과 암은 난소암이거나, 난소암 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서 부인과 암은 자궁내막암이거나, 자궁내막암 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 추가적인 약제 또는 암 요법으로 치료될 것이거나, 치료되고 있다. 일부 예에서, 대상체는 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 세포 요법 또는 화학-방사선요법으로부터 선택된 치료를 이용하여 치료될 것이거나, 치료되고 있다. 일부 예에서, 대상체는 세포독성 약물로 치료될 것이거나, 치료를 받고 있다. 일부 실시양태에서, AMH 수용체 (예컨대, AMHR2)의 발현은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플, 예컨대, 암 또는 종양 조직 샘플 또는 암 세포 또는 종양 세포, 예컨대, 생검 조직 샘플에서 측정된다.
AMH 유사체의 투여
본원에 기재된 AMH 유사체 또는 폴리뉴클레오티드 또는 조성물의 치료적 유효량 또는 투여량은 예를 들어, 여포생성을 저지시키기 위해 투여된다. 예를 들어, 유효량은 동원되는 원시 여포의 수를 조성물이 투여되지 않은 경우와 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 99% 이상 감소시키는 AMH 유사체 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 이의 전구체를 코딩하는 핵산의 양이다. 여성 대상체에 투여된 AMH 유사체 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 이의 전구체를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물의 양은, 양이 동원되는 원시 여포의 수를 원하는 수로 감소시키기에 충분하거나, 동원되는 원시 여포의 확률을 원하는 값으로 저하시키기에 충분한 경우, 효과적인 것으로 간주된다. 일부 예에서, 투여되는 조성물의 양은 피임을 달성하기에 충분하다.
본원에 기재된 조성물은 1 회로 투여되거나, 하위-용량으로 분할될 수 있다.
일부 예에서, 투여는 만성, 예컨대, 수주 또는 수 개월의 기간에 걸쳐 매일 1 회 이상의 용량 및/또는 치료일 수 있다. 투약 및/또는 치료 일정의 예는 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 매일, 매일 2 회, 매일 3 회 또는 매일 4 회 이상의 투여이다. 투여량은 유해 부작용을 유발할 정도로 커서는 안 된다.
대상체에 대한 단기 또는 장기 투여는 본 개시내용에 의해 고려된다. 단기 투여의 예는 본원에 기재된 바와 같은 방사선 또는 화학적 상해, 또는 암 치료로부터 난소를 보호하기 위한 투여이다. 단기 투여에서, 조성물은 상해에 노출되기 직전 약 30 일의 기간에 1 회 이상 투여된다.
AMH 유사체의 더 적은 투여량은 보다 장기간 지속적인 투여에 필요할 수 있다.
일부 예에서, 대상체에 대한 투여는 생체내일 수 있다. 생체내 투여는 경구, 혈관내, 복강내, 자궁내, 난소-내, 피하, 근육내, 직장, 국부 (분말, 연고, 점적제, 협측, 설하), 질내, 수조내 또는 이들의 조합을 포함한다. 난소-내 투여가 필요한 실시양태에서, 난소-내 투여는 예를 들어, 난소로의 직접 주사를 포함하는 여러 방법에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 이의 AMH 유사체는 당업계에 알려진 또는 본원에 기재된 임의의 경로, 예를 들어, 경구, 비경구 (예컨대, 정맥내 또는 근육내), 복강내, 직장, 피부, 비측, 질, 흡입제, 피부 (패치), 또는 안구에 의해 투여될 수 있다. AMH 유사체는 임의의 용량 또는 투여 요법으로 투여될 수 있다.
일부 예에서, 투여는 난소를 휴지기 상태로 유지하기에 충분할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기재된 AMH 유사체를 포함하는 조성물을 약 2, 또는 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5 주, 또는 5 주 초과, 예컨대, 약 2, 또는 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5, 또는 약 6 또는 약 7 개월 이상 동안 대상체에 투여한 다음, 적절한 간격 후에 추가적인 기간 동안, 예를 들어, 약 2, 또는 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5 일 또는 5 일 초과 동안 후속적으로 투여한다. 치료 주기는 즉시 연속적으로 또는 주기 사이에 치료를 하지 않는 간격으로 발생할 수 있다. 전형적으로, 가임력의 보존을 위해 (예컨대, 여포생성을 저지시키는 방법에서) 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 포함하는 조성물이 대상체에 투여되는 경우, 대상체에 약 3-4 개월 사이의 기간, 또는 약 4-6 개월 사이의 기간, 또는 약 6-8 개월 사이의 기간, 또는 약 8-12 개월 사이의 기간, 또는 약 12-24 개월 사이의 기간, 또는 약 24-36 개월 사이의 기간 또는 약 36 개월 초과 동안 조성물을 투여한 후, 전달되지 않는 간격을 가질 수 있다.
일부 예에서, 피임 방법에서 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 포함하는 조성물이 대상체에 투여되는 경우, 대상체에 약 3-4 개월 사이의 기간, 또는 약 4-6 개월 사이의 기간, 또는 약 6-8 개월 사이의 기간, 또는 약 8-12 개월 사이의 기간, 또는 약 12-24 개월 사이의 기간, 또는 약 24-36 개월 사이의 기간 또는 약 36 개월 초과 동안 조성물을 투여한 후, 전달되지 않는 간격을 가질 수 있다.
특정 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 포함하는 조성물은 대부분의 임의의 수단에 의해 투여될 수 있지만, 일부 실시양태에서는 주사 (예컨대, 정맥내, 피하, 동맥내), 주입 또는 점적주입으로서 대상체에 전달된다. 특정 실시양태에서, AMH 유사체를 포함하는 조성물은 경구 섭취 또는 질내 투여에 의해 대상체에 전달된다.
일부 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 AMH 유사체는 예컨대, 당업자에게 알려진 바와 같은, 하이드로겔, 질 정제, 페서리/좌약, 미립자 시스템, 및 질내 고리를 포함하는 것을 사용하여 질내 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, AMH 유사체는 화학요법 치료, 면역요법, 세포독성 치료제, 수술 또는 방사선 치료 전에 대상체에 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, AMH 유사체가 투여되는 경우, 여포생성의 감소, 조기 난소 부전의 억제, 피임 또는 기능적 난소 예비력 (FOR)의 감퇴 예방을 위한, 난소 및/또는 자궁 보호는 AMH 유사체를 화학요법 치료, 면역요법, 세포독성 치료제, 수술 또는 방사선 치료 전에 대상체에 투여하는 것이 바람직하다.
일부 예에서, 여성 대상체에 AMH 유사체의 다음의 용량을 투여할 수 있다: 13-45 세 여성: 1 내지 10 ng/mL; 45 세 초과의 여성: 1 ng/mL 미만. 투여량 값은 예를 들어, 여성의 기능적 난소 예비력 또는 난소 노화의 중증도 또는 경감되어야 하는 줄어든 난소 예비력에 따라 달라질 수 있다.
AMH 유사체의 효험 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물의 표준 약학 절차, 예컨대, ED50 (여기서 용량은 집단의 50%에서 유효함) 및 LD50 (용량은 집단의 50%에 대해 치명적임)에 의해 결정될 수 있다. 치료적 효과에 대한 독성의 용량 비율은 치료적 지수이며, LD50/ED50의 비율로서 표현될 수 있다.
사용될 수 있는 적절한 실험 모델은 사용될 수 있는 용량을 결정하는 것을 포함하며, 이는 당업자에게 통상적으로 알려진 뮐러관 회귀 생물검정 또는 생체내 암 모델이다. 생체내 암 모델은 그 전체가 본원에 참조로 원용되는 Frese et al., "Maximizing mouse cancer models" Nat Rev Cancer. 2007 Sep;7(9):645-58 및 Santos et al., Genetically modified mouse models in cancer studies. Clin Transl Oncol. 2008 Dec;10(12):794-803, 및 "Cancer stem cells in mouse models of cancer", 6th Annual MDI Stem Cell Symposium, MDI Biological Lab, Salisbury Cove, ME, August 10-11, 2007"에서 논의된다. 예를 들어, 재조합체 인간 AMH 폴리펩티드의 치료적 유효량은 가임력의 마우스 모델에서 평가될 수 있다.
필요한 경우, 본 개시내용의 조성물은 치료가 필요한 부위 (예컨대, 난소)에 국소적으로 투여될 수 있다. 이는 예를 들어, 수술 중 국소 주입, 국부 적용, 예컨대, 주사, 카테터의 수단 또는 임플란트의 수단에 의해 달성될 수 있으며, 임플란트는 멤브레인, 예컨대, 시알라스틱 멤브레인, 섬유 또는 상업적 피부 대용물을 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 재료이다.
약제, 예컨대, AMH 유사체를 코딩하는 핵산 약제는 또한 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터를 사용하여 전달될 수 있다.
일부 예에서, AMH 유사체는 단일요법으로서 투여된다. 일부 예에서, AMH 유사체는 하나 이상의 추가적인 치료제 (즉, 공동-투여)와 조합하여 (예컨대, 전, 동안 및/또는 후에) 투여된다. 예를 들어, AMH 유사체는 화학요법제, 항-종양제, 방사선 또는 수술과 조합하여 투여될 수 있다. 용어 "공동-투여하다"는 각자의 생물학적 활성 또는 효과의 기간이 중첩되는 시간 프레임 동안 2 개 이상의 화합물 (하나는 AMH 유사체임) 각각이 투여됨을 나타낸다. 따라서, 용어는 화합물의 순차적 투여뿐만 아니라 동연적(coextensive) 투여를 포함한다. 화합물을 투여하는 것과 유사하게, 하나 초과의 물질의 공동-투여는 치료적 및/또는 예방적 목적일 수 있다. 하나 초과의 물질 또는 화합물이 공동-투여되는 경우, 2 개 이상의 물질의 투여 경로가 동일할 필요는 없다. 본원에 기재된 방법 및 용도의 범주는 AMH 유사체와 함께 공동-투여될 수 있는 물질 또는 물질들의 아이덴티티에 의해 제한되지 않는다.
일부 예에서, AMH 유사체는 체크포인트 억제제와 조합하여 투여된다. 체크포인트 억제제는 소분자, 억제성 RNA/RNAi 분자 (단일 및 이중 가닥 둘 모두), 항체, 항체 시약, 또는 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질에 특이적으로 결합하는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 치료제를 표적화하는 일반적인 체크포인트는 PD-1, CTLA4, TIM3, LAG3 및 PD-L1을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, AMH 유사체는 면역요법 (예컨대, 자가-면역 질환을 치료하는 데 사용되는 약물 또는 약제)과 조합하여 투여된다.
조성물
본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 수단으로, 예컨대, 임의의 상용성 담체, 예컨대, 다양한 비히클, 아쥬반트, 첨가제 및 희석제를 함유하는 멸균 주사 용액으로서 제형화될 수 있다. 본 개시내용에 활용되는 화합물은 서방성 피하 이식체 또는 표적화된 전달 시스템의 형태, 예컨대, 단클론 항체, 벡터 전달, 이온삼투, 중합체 매트릭스, 리포솜 및 미소구체로 대상체에 비경구적으로 투여될 수 있다.
비-수성 비히클, 예컨대, 면실유, 참기름, 올리브유, 대두유, 옥수수유, 해바라기유 또는 땅콩유 및 에스테르, 예컨대, 이소프로필 미리스테이트가 또한 조성물을 위한 용매 시스템으로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충액를 포함하여, 조성물의 안정성, 무균성 및 등장성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 및 소듐 클론드(chlonde) 등을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 약학 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
일부 예에서, 조성물은 지질-기반 제형일 수 있다. 예는 조성물의 지속 방출 속도를 제공할 수 있는 다중소포성 리포솜, 멀티라멜라 리포솜 및 유니라멜라 리포솜을 포함한다.
일부 예에서 본원에 기재된 방법에 사용된 조성물은 제어 방출 형태일 수 있다. 다양한 알려진 제어-방출 또는 연장-방출 제형, 제형 및 장치가 본 개시내용의 조성물과 함께 사용하기 위해 조정될 수 있다. 예는 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제4,008,719호; 제5674,533호; 제5,059,595호; 제5,591 ,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 제5,733,566호; 및 제6,365,185호에 기재된 것들을 포함한다. 이들 제형은 예를 들어, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 기타 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템 (예컨대, OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA)), 또는 이들의 조합을 사용하여 하나 이상의 활성 성분의 서방 또는 제어 방출을 제공하도록 사용하여, 다양한 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공할 수 있다.
일 예에서, 조성물은 리포솜으로 전달된다 (Langer (1990) Science 249: 1527-1533 참고).
일부 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 포함하는 조성물은 임의의 다른 치료제와 함께 (예컨대, 조합하여) 투여되고/되거나 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 약학 조성물은 본 개시내용의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 여기서 화합물은 관심 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 조성물에 존재한다. 적절한 농도 및 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 친숙하다. 액체 용액으로서 제형화된 조성물의 경우, 허용가능한 담체는 식염수 및 멸균수를 포함하고, 임의로 항산화제, 완충액, 정균제 및 기타 일반적인 첨가제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 역할을 할 수 있는 재료의 일부 예는 제한 없이 다음을 포함한다: 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대, 마그네슘 하이드록시드 및 알루미늄 하이드록시드; 알긴산; 발열원이 없는 물; 등장 식염수; 링거의 용액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충액; 및 약학 제형에 사용되는 기타 무-독성 상용성 물질.
조성물은 또한 본 발명의 화합물 이외에 희석제, 분산제 및 표면 활성제, 바인더 및 윤활제를 함유하는 환제, 캡슐, 과립제 또는 정제로서 제형화될 수 있다. 당업자는 본 개시내용의 화합물을 허용된 관행, 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1990에 개시된 것들에 따라 적절한 방식으로 추가로 제형화할 수 있다.
일부 예에서, 습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대, 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또한 조성물에 존재할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 예는 다음을 포함한다: 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설페이트 및 소듐 설파이트 등; 유용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등.
"지속-방출", "제어-방출" 또는 유사한 용어는 활성 성분 (예컨대, AMH 유사체)이 시간이 지남에 따라 방출되도록 하는 제형을 지칭하며, 신체에서 (예컨대, 혈류에서) 활성 성분의 보다 일관된 수준을 유지하기 위해 사용되며, 당업계에 알려져 있다.
본 개시내용의 제형은 정맥내, 경구, 비측, 국부, 경피, 협측, 설하, 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 각각 활성 성분으로서 본 개시내용의 화합물의 소정량을 함유하는, 캡슐, 카세제(cachet), 환제, 정제, 로젠지 (향이 첨가된 기제(basis), 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용함), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로서, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로서, 또는 패스틸 (불활성 베이스, 예컨대, 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용함)로서 및/또는 구강 세정제 등을 포함한다.
본 개시내용의 화합물의 경구 투여를 위한 액체 제형은 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분에 이외에, 액체 제형은 당업계에 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대, 예를 들어, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 외에, 경구 조성물은 또한 아쥬반트, 예컨대, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제를 포함할 수 있다.
조성물은 직장 또는 질 투여용으로, 예를 들어, 좌제로서 제형화될 수 있으며, 이는 본 개시내용의 하나 이상의 화합물 (예컨대, AMH 유사체)을 예를 들어, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적합한 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 이는 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로 활성 화합물을 방출한다. 이러한 투여에 적합한 담체 및 제형은 당업계에 알려져 있다.
본원에 기재된 바와 같은 재조합체 인간 AMH 폴리펩티드의 국부 또는 경피 투여, 예컨대, 근육 투여를 위한 제형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다.
경피 패치는 화합물을 적절한 배지에 용해 또는 분산시킴으로써 만들 수 있다. 흡수 증진제는 또한 피부를 가로지르는 화합물의 플럭스를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 플럭스의 속도는 속도 제어 막을 제공하거나 활성 화합물을 중합체 매트릭스 또는 겔에 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 사용 바로 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 멸균 분말과 조합된 본 개시내용의 하나 이상의 화합물을 포함하며, 이는 항산화제, 완충액, 정균제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
이들 조성물은 또한 아쥬반트, 예컨대, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등을 포함함으로써 보장될 수 있다. 이는 또한 등장화제, 예컨대, 당 및 소듐 클로라이드 등을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 야기될 수 있다.
특정 예에서, 약학 조성물은 임의로 하나 이상의 추가적인 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 물론, 이러한 치료제는 당업자에게 알려져 있어 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있다.
특정 예에서, 조성물은 예를 들어, 조직 특이성을 증가시키고 세포, 예를 들어, 근육 세포에 대한 표적화를 위해 표적화제에 컨쥬게이션되거나 공유적으로 부착된 AMH 유사체를 포함할 수 있다. 표적화제는 예를 들어, 제한 없이 항체, 사이토카인 및 수용체 리간드를 포함할 수 있다.
치료가 필요한 대상체
일 예에서, 본원에 기재된 AMH 유사체가 투여되는 대상체는 암을 가지며, 화학요법 또는 항-암제로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있다. 암은 예를 들어, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 연골종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청각 신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병, 만성 백혈병 및 진성 적혈구증가증, 림프종 (호지킨 질환 및 비-호지킨 질환), 다발성 골수종, 발덴스트롬의 거대글로불린혈증, 또는 면역글로불린 중쇄 질환을 포함한다. 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항-암제"는 자궁 및/또는 난소에 대한 유해 효과를 갖는 것으로 나타난 암의 치료를 위한 의도된 용도를 갖는 임의의 치료제 (예컨대, 면역 체크포인트 억제제, CAR T 세포 또는 표적화된 요법)를 지칭할 수 있다. 난소 및/또는 자궁에 대한 손상은 예컨대, 세포 사멸, 조직 결함 또는 부패, 또는 난소 또는 자궁의 비정상 기능 (예컨대, 비정상 호르몬 분비, 증가된 여포생성 또는 호르몬 자극에 대한 여포의 둔감화)의 존재에 의해 측정될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 방법은 여성 대상체가 생존가능한 자손을 생산할 수 있는 능력 및/또는 난소 예비력을 보유할 수 있게 한다. 일부 예에서, 조성물의 투여는 여성 대상체가 세포독성제 또는 화학요법제에 노출되기 전에, 또는 대안적으로 치료와 동시에 및/또는 세포독성제 또는 화학요법제, 또는 암 치료를 이용한 치료 후에 종결된다.
다른 예에서, 본원에 기재된 AMH 유사체가 투여되는 대상체는 자가면역 질환을 가지며, 면역요법으로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "자가면역 질환 또는 장애"는 외래 세포 및 건강한 세포를 구별하는 자신의 면역계의 불능을 특징으로 한다. 자가면역 질환의 비-제한적 예는 난소염, 염증성 관절염, 유형 1 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장 질환, SLE 및 혈관염, 알레르기성 염증, 예컨대, 알레르기성 천식, 아토피 피부염, 및 접촉 과민증, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반성 루푸스, 그레이브스 질환 (과활동성 갑상선), 하시모토 갑상선염 (활동성이지 않은 갑상선(underactive thyroid)), 만성 이식편 대 숙주 질환, 응고 인자에 대한 항체가 있는 혈우병, 셀리악 질환, 크론 질환 및 궤양성 대장염, 길랑-바레 증후군, 원발성 담즙성 경화증/간경변증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 레이노 현상, 경피증, 쇼그렌 증후군, 굿파스쳐 증후군, 베게너 육아종증, 류마티스성 다발근통, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 만성 피로 증후군 CFS), 건선, 자가면역 애디슨 질환, 강직성 척추염, 급성 파종성 뇌척수염, 항인지질 항체 증후군, 재생불량성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 안구간대경련 근간대경련 증후군, 시신경염, 오르드 갑상선염, 천포창, 악성 빈혈, 개의 다발성 관절염, 라이터 증후군, 타카야스 동맥염, 온난 자가면역성 용혈성 빈혈, 베게너 육아종증 및 섬유근육통 (FM)을 포함한다.
일 예에서, 여성 대상체는 자궁 또는 난소에서 세포 사멸 또는 세포 손상을 유발하는 세포독성 약물 또는 세포독성제로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있다.
일 예에서, 여성 대상체는 장기 치료적 양생법, 즉, 만성 병태, 만성 병태의 재발, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 바이러스성 간염, 바이러스성 또는 박테리아성 수막염, 말라리아 또는 신경퇴행성 질환에 대한 치료로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있다. 일 예에서, 여성 대상체는 자궁 및/또는 난소에 대한 손상을 초래하지 않는 장기 치료적 양생법으로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 대한 치료를 받고 있는 대상체는 원시 여포 동원의 동원 및/또는 활성화를 지연시키거나 늦추거나, 이들의 가임력을 보존하기를 원할 수 있다. 대상체는 투여되는 치료제가 태아에 유해 효과를 갖거나 치료의 부작용 (예컨대, 피로 또는 메스꺼움)으로 인해 치료 동안에 임신이 이상적이지 않을 수 있는 이유를 비제한적으로 포함하는 이유로 장기 치료 동안 가임력을 보존하고/하거나 임신을 방지하기를 원할 수 있다.
일부 예에서, 여성 대상체는 치료 동안에 난소 또는 자궁 보호 이외의 이유로 가임력을 보존하기를 원할 수 있다. 여성 대상체는 많은 상이한 생활방식 인자로 인해 아이를 갖는 것을 지연시키기를 원할 수 있다. 일부 예에서, 여성 대상체는 가임력을 보존하기 위해 본원에 기재된 AMH 유사체가 투여되며, 추가적인 치료를 받고 있거나 추가적인 치료제를 받고 있지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, "가임력 보존"은 예컨대, AMH 유사체가 환자에 처음 투여되는 시점에서의 대상체의 가임력 가능성 (인자, 예컨대, 난자의 연령, 월경 주기의 규칙성, 난소 예비력, 난소 기능, 난소 호르몬 분비에 기반하여 아이를 잉태할 가능성)을 기존 상태로 유지하는 것을 지칭한다. "가임력 보존"은 가임 연령이 지난 경우와 같이 자연적 제한을 넘어 확장된 가임력을 지칭할 수 있다. "가임력 보존"은 AMH 유사체의 투여 전에 대상체의 난소에 존재하는 동일한 수의 원시 여포를 유지하는 것을 지칭할 수 있다. AMH 유사체는 연령-관련된 가임력 감퇴를 억제하기 위해 여성 대상체에 투여될 수 있다. 연령-관련된 가임력 감퇴"는 여성의 연령으로 인해 잉태 가능성이 저하하는 것을 지칭한다. 여성이 아이를 가질 수 있는 피크 생물학적 연령은 10대 후반 및 20대 초반이며; 불임의 비율은 여성의 연령과 함께 증가한다.
일부 예에서, 여성 대상체는 대상체가 줄어든 난소 예비력 (DOR), 조기 난소 노화 (POA), 원발성 난소 기능부전 (POI), 자궁내막증, 하나 이상의 FMR1 전돌연변이(premutations) 또는 55-200 GCC FMR1 반복체, BRAC1 돌연변이, 터너 증후군, 자가면역 질환, 난소 자가면역 질환 (예컨대, 난소염) 갑상선 자가면역, 부신 자가면역 또는 자가면역 다선 증후군을 갖거나 소인이 있는 경우, 원시 여포 동원의 동원을 지연 또는 늦추거나, 이들의 가임력을 보존하기를 원할 수 있다.
일부 예에서, AMH 유사체는 대상체에서 피임제로서 사용된다. 따라서, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 피임 방법을 제공한다. 일 예에서, 대상체는 화학요법을 받고 있다. 추가 예에서, 피임제는 아데노바이러스 벡터 내에서 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
키트
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 본원에 기재된 재조합체 AMH 폴리펩티드를 포함하는 펌프 또는 주입 장치, 및 대상체의 치료를 위해 여성 대상체에 펌프 또는 주입 장치를 이식하기 위한 지침서를 포함한다.
일 예에서, 치료를 필요로 하는 여성 대상체는 줄어든 난소 예비력 (DOR), 조기 난소 노화 (POA), 원발성 난소 기능부전 (POI), 자궁내막증, 하나 이상의 FMR1 전돌연변이 또는 55-200 GCC FMR1 반복체 중 하나 이상을 갖거나, 대상체가 암 치료를 받고 있거나, 받았거나, 받을 것이다.
키트는 하나 이상의 시약, 예컨대, AMH 유사체를 포함하는 임의의 상품 (예컨대, 패키지 또는 용기)이며, 상품은 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 홍보, 배포 또는 판매된다.
본원에 기재된 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하는 데 유용한 추가적인 구성요소를 임의로 포함할 수 있다. 예로서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 AMH 유사체 및 본원에 기재된 바와 같은 방법의 성능을 설명하는 지침 자료 등을 포함하는 조성물에 적합한 유체 (예컨대, 완충액)를 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기재된 바와 같은 조성물의 전달을 위한 장치 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 추가적으로, 키트는 지침 전단지를 포함할 수 있고/있거나 수득된 결과의 관련성에 대한 정보를 제공할 수 있다.
당업자는 본 개시내용의 광범위하고 일반적인 범주를 벗어나지 않으면서 위에 기재된 실시양태에 대해 다양한 변동 및/또는 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 실시양태는 모든 면에서 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
실시예
방법
AMH cDNA 공급원 및 부위-지시된 돌연변이유발
포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 내에 함유된 전장 인간 항-뮐러 호르몬 (hAMH)의 변형된 형태를 코딩하는 cDNA 서열은 Dr Axel Themmen (Erasmus University, The Netherlands)에 의해 친절하게 제공되었으며, 그의 실험실에 의해 이전에 설명되었다 (Weenen C et al. (2004) Molecular Human Reproduction 10(2):77-83). 간단히 말해서, hAMH cDNA에 대한 변형은 Glu29 뒤에 His-6 정제 태그의 삽입이었다. 추가적으로, 프로도메인의 3' 단부에서의 단백질분해 가공 부위는 단백질 성숙을 향상시키기 위해 'RARR'로 치환되었다 (본원에서 플라스미드 hAMH로서 지칭됨).
hAMH에 대한 2 개의 추가적인 변형은 중첩-확장 PCR에 의해 이루어졌으며, 이어서, 변형된 cDNA를 제한 부위 NotI 및 HindIII 사이에 pCDNA3.1(-) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 서브클로닝하였다. 제1 변형은 단백질분해 가공 부위를 이론적으로 이상적인 'ISSRKKRSVSS' 슈퍼-컷 모티프로 변형시킴으로써 단백질 성숙을 더욱 향상시키는 것이었다 (Duckert, Brunak & Blom (2004) Protein Engineering Design & Selection 17(1):107-112). 슈퍼-컷 cDNA 서열은 Gly447 및 Ser452에 대한 서열 사이에 삽입되었고, 'RARR' 잔기 대신에 삽입되었다 (본원에서 플라스미드 hAMH+SCUT로 지칭됨). hAMH 리더 서열 (처음 25 개의 아미노산)을 인간 혈청 알부민 리더 서열로 대체하는 것은 포유동물 세포주로부터 hAMH의 재조합 생산을 향상시키는 것으로 이전에 보고되었다 (Peepin D et al. (2013) Technology 1(1):63-71). 따라서, hAMH+SCUT cDNA는 His-6 태그의 아미노산 N-말단 (잔기 MRDLPLTSLA LVLSALGALL GTEALRAEE)을 랫트 혈청 알부민 (RSA) 신호 펩티드 서열 'MKWVTFLLLLFISGSAFS'로 대체하도록 추가로 변형되었다 (본원에서 hAMH+SCUT+RSA로서 지칭됨). hAMH+SCUT+RSA 플라스미드는 후속적으로 제조업체의 지침서에 따라 QuikChange Lightning 부위-지시된 돌연변이유발 키트 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)를 사용하여 수행된 추가 변형을 위한 주형으로서 사용되었다. 생성된 각각의 작제물에 대해, 전체 cDNA 카세트는 Micromon 유전체학 시설 (Monash University, Clayton, VIC)에 의해 수행된 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
재조합체 AMH 단백질의 발현 및 정제
재조합체 AMH 단백질의 생산은 폴리에틸렌이민 (PEI)-MAX (선형; MW 40,000) (Polysciences, Warrington, PA)를 사용한 HEK-293T 세포의 일시적 형질주입에 의한 것이었다. 분비되는 분자 형태를 평가하기 위한 소규모 생산을 위해, 10% 태아 송아지 혈청 (FCS)이 보충된 둘베스코 변형된 이글 배지 (DMEM)에서 폴리-D-리신 (Sigma-Aldrich)으로 코팅된 6-웰 플레이트에 세포를 8 × 105 개의 세포/웰로 플레이팅하고, 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다. 밤새 항온처리한 후, 배지를 OPTI-MEM (Life Technologies, Carlsbad, CA) 배지로 교체하였다. 그런 다음, 플라스미드 DNA (5 μg/웰)를 PEI-MAX와 10 분 동안 결합시켰다. DNA-PEI 복합체를 세포에 직접 첨가하고, 5% CO2에서 37℃에서 4 시간 동안 OPTI-MEM 배지에서 항온처리한 후, 신선한 OPTI-MEM 배지로 대체하고, 추가 90 시간 동안 항온처리한 후, 수집하였다.
분비 후, AMH 프로도메인 및 성숙한 도메인은 성숙유발(pro-mature) 복합체로서 비-공유적으로 회합된 상태로 유지된다. (Pepinsky et al. (1988) Journal of Biological Chemistry 263(35):18961-18964). 따라서, 정제 전략은 프로도메인의 N-말단에 위치한 폴리-히스티딘 태그를 표적화하였다. 이 접근법을 통해 호르몬 생체활성을 담당하는 성숙한 도메인을 태깅 없이 정제할 수 있었다. 정제 전에, 위에 설명한 것과 유사한 방법론을 사용하여 대규모 생산 (200 mL)을 먼저 수행하였다. 간단히 말해서, 폴리-D-리신으로 코팅된 15 cm 플레이트에서 10% FCS가 보충된 DMEM에 10 × 106 개의 세포/플레이트를 씨딩하고, 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다. 밤새 항온처리한 후, 배지를 OPTI-MEM 배지로 교체하였다. 플라스미드 DNA (60 μg의 DNA/플레이트)를 PEI-MAX와 10 분 동안 결합시켰다. DNA-PEI 복합체를 세포에 직접 첨가하고, 5% CO2에서 37℃에서 4 시간 동안 OPTI-MEM 배지에서 항온처리한 후, 0.02% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 신선한 OPTI-MEM 배지로 대체하고, 90 시간 동안 항온처리한 후, 수집하였다.
재조합체 단백질을 함유하는 컨디셔닝된 배지를 풀링하고, 원심분리 (Centricon Plus-70, 5 kDa MW 컷-오프; Millipore, Billerica, MA)에 의해 ~1 mL로 (효과적인 완충액 교환을 보장하기 위해 2 회) 농축한 다음, 결합 완충액 [50 mM 포스페이트 완충액, 300 mM NaCl, pH 7.4]에 5 mL의 최종 부피까지 재현탁하였다. 농축된 배지를 실온에서 ~2.5 시간 동안 ~0.5 mL의 HisPur™ 코발트 수지 (Thermo Fisher Scientific)를 함유하는 컬럼에서 롤링함으로써 코발트-기반 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (Co-IMAC)에 적용하였다. 용리 전에, 비드를 4 mL의 결합 완충액으로 2 회 세척하였다. 결합된 단백질을 실온에서 ~2.5 시간 동안 3 mL의 용리 완충액 [50 mM 포스페이트 완충액, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸]에서 롤링함으로써 용리시켰다. 결합된 채로 남아 있는 임의의 단백질을 용리하기 위해, HisPur™ 코발트 수지를 실온에서 ~1 시간 동안 3 mL의 1 M 이미다졸 [50 mM 포스페이트 완충액, 300 mM NaCl, 1 M 이미다졸]에서 롤링하였다. 이미다졸을 제조업체의 가이드라인에 따라 2 mL의 3.5 K MW 컷-오프 Slide-A-Lyzer® MINI 투석 장치 (Thermo Fisher Scientific)를 사용한 투석에 의해 정제된 단백질로부터 제거하였다. 완충액 교환은 둘베코 포스페이트 완충 식염수 (Life Technologies)로 하였다. 정제된 단백질을 -80℃에서 단백질 LoBind 튜브 (Eppendorf, Hamburg, Germany)에 보관하였다.
웨스턴 블롯팅에 의한 AMH 단백질 분석
웨스턴 블롯팅을 사용하여, 컨디셔닝된 배지로 분비되는 AMH의 분자 형태를 평가하고 Co-IMAC 및 투석 후 질량 추정치를 제공하였다. 간단히 말해서, 컨디셔닝된 배지는 Nanosep 마이크로농축기 (3 kDa MW 컷-오프; Pall Life Sciences, Port Washington, NY)로 12.5-배 농축된 반면, Co-IMAC 분획은 더 이상의 농축이 필요하지 않았다. 샘플을 2X NuPAGE® LDS 샘플 완충액 (Life Technologies) + 5% 2-머캅토에탄올 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 준비하였다.
준비된 샘플을 끓인 물 (~95℃)에서 ~3 분 동안 가열하였다. 단백질을 상단 작동 완충액 [3.5 mM SDS, 100 mM 트리신, 100 mM trizma® 염기 (Sigma-Aldrich)] 및 하단 작동 완충액 [pH 8.9, 200 mM trizma® 염기]을 포함하는 Mini-PROTEAN® 수직 전기영동 셀 (Bio-Rad)에서 작동되는 10% 핸드캐스트 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 겔에서 분리하였다. 유닛을 염료 전면이 분리 겔에 도달하고 단일 짝수 라인을 형성할 때까지 80 볼트에서 작동한 다음, 전압을 150 볼트로 증가시키고, 염료 전면이 겔의 하단에서 떨어질 때까지 작동하였다. SDS-PAGE로 분리한 후, 겔을 0.45 μM의 니트로셀룰로스 멤브레인 (Bio-Rad)에 놓고, 웨스턴 전달 완충액 [10% 메탄올, 200 mM 글리신, 25 mM trizma® 염기]으로 충전된 미니 트랜스-블롯® 셀 (Bio-Rad)에 함께 조립하였다. 전달 유닛을 1 시간 이상 동안 100 볼트에서 작동하였다. 전달 후, 멤브레인을 차단 용액 [트리스-완충 식염수 (TBS)[pH 7.5, 25 mM trizma® 염기, 250 mM NaCl] 중 1% BSA (Sigma-Aldrich) + 0.05% Tween® 20 (Sigma-Aldrich)]에 1 시간 이상 동안 넣은 후, 진탕하면서 일차 항체 (차단 용액 중에 1:5000으로 희석됨)로 밤새 프로빙하였다. 실온에서 일차 항체로 밤새 항온처리한 후, 멤브레인을 TBS-Tween® [pH 7.5, 25 mM trizma® 염기, 250 mM NaCl + 0.05% Tween® 20]으로 각각 5 분 동안 3 회 세척한 다음, TBS로 5 분 동안 2 회 세척하였다. 이 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 이차 항체 (차단 용액 중에 1:10,000으로 희석됨)와 함께 실온에서 1 시간 항온처리하였다. 현상 전에, 멤브레인을 위에 상세히 설명한 바와 같이 다시 5 회 세척하였다. 멤브레인 개발은 1 mL의 루미-라이트 루미놀/인핸서 용액 (Roche, Basel, Switzerland)에 이어 1 mL의 루미-라이트 안정한 퍼옥시드 용액 (Roche)을 첨가하여 이루어졌다. 화학발광 현상의 이미지는 ChemiDocTM (Bio-Rad)로 캡처하고 Image LabTM 소프트웨어 (Bio-Rad)로 분석하였다.
성숙한 AMH 단백질을 검출하기 위해, mAb-5/6A (Oxford Brookes University, Oxford, UK)으로 멤브레인을 탐침하였다. mAb-5/6A는 hAMH 성숙한 도메인의 C-말단을 향한 영역에 상응하는 32 개의 아미노산 펩티드 (VPTAYAGKLLISLSEERISAHHVPNMVATECG, hAMH에서 아미노산 527-558)로 생성되었다 (Weenen et al. (2004) Molecular Human Reproduction 10(2):77-83). 인간 AMH 프로도메인을 검출하기 위해, mAb-9/6A (Oxford Brookes University)로 멤브레인을 탐침하였다. mAb-9/6A는 전체 hAMH 단백질에 대해 마우스를 면역화하여 개발되었다. mAb-9/6A는 이전에 가공된 hAMH 프로도메인을 특이적으로 검출하는 것으로 보고되었으며, 초기에는 개발자가 AMH ELISA에 대한 검출 항체로서 선택하였다 (Al-Qahtani et al. (2005) Clinical Endocrinology 63(3):267-273).
분자량 크기를 평가하기 위해, 사전-염색된 단백질 표준 SeeBlue Plus2 (Life Technologies)를 사용하였다. 농도 추정치는 상업적으로 이용가능한 재조합체 hAMH 성숙한 도메인 (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)을 표준으로서 사용하여 결정되었다. 5 개의 질량 표준 범위가 정제 재료의 4 개의 상이한 부피와 함께 사용되었으며, 4 개의 부피의 평균 농도가 실제 농도의 추정치로서 사용되었다. AMH 돌연변이체 A546M 및 H548K의 경우, mAb-5/6A에 의해 인식되는 에피토프가 파괴되었다. 따라서, 검출 및 후속 농도 추정치는 mAb-9/6A로 막을 탐침하고 이전에 정량화된 성숙유발 AMH 제제와 비교하여 가공된 프로도메인의 농도계를 평가함으로써 결정되었다.
COV434 세포를 이용한 생체외 전사 리포터 검정
과립막 세포는 난소 내의 AMH 표적이며 (Pepin, Sabatini & Donahoe (2018) Current Opinion in Endocrinology Diabetes and Obesity 25(6):399-405), AMH 활성은 Smad-1/5 신호 전달을 통해 세포내에서 매개된다 (Sedes L et al. (2013) PLoS One 8(11):13). COV434 세포는 AMH를 내인성으로 발현하지 않는 것으로 이전에 보고된 (Weenen C et al. (2004) Molecular Human Reproduction 10(2):77-83) 불멸화된 인간 과립막 세포주이며 (Zhang H et al. (2000) Molecular Human Reproduction 6(2):146-153, 이들을 내인성 AMH의 간섭 없이 AMH 활성을 평가하기 위한 인간 과립막 세포 모델로서 사용할 수 있다. 이 실험실 (Al-Musawi SL et al. (2013) Endocrinology 154(2):888-899; Patino LC et al. (2017) Journal of Clinical Endocrinology & metabolism 102(3):1009-1019) 및 기타 실험실 (Moore, Otsuka & Shimasaki (2003) Journal of Biological Chemistry 278(1):304-310; Peng J et al. (2013) PNAS 110(8):E776-E785)은 이전에 BMP 리간드로 처리 후 강력한 Smad-1/5 반응을 나타내는 COV434 세포를 보고하였다. 따라서, 이 연구 동안 생성된 Co-IMAC 정제된 AMH 단백질에 의한 Smad-1/5 경로의 활성화를 평가하기 위해, COV434 세포에서 Smad1/5-반응성 BRE-루시퍼라제 검정을 사용하였다. 이는 Id1 유전자 프로모터로부터 단리된 BMP-반응 요소의 2 개의 카피를 갖는 프로모터 다운스트림에 루시퍼라제 유전자를 함유하는 플라스미드인 BRE-Luc의 일시적 형질주입을 포함한다 (Korchynskyi & ten Dijke (2002) JBC 277(7):4883-4891). 추가적으로, 세포가 AMH에 반응성이도록 하기 위해, AMH-특이적 유형 II 수용체 AMHR2에 대한 소량의 플라스미드로 세포를 공동-형질주입시켰다 (Imbeaud S et al. (1995) Nature Genetics 11(4):382-388).
간단히 말해서, DMEM/10% FCS 중의 세포를 7.5 x 104 개의 세포/웰로 폴리-D-리신으로 코팅된 48-웰 플레이트에 플레이팅하고, 5% CO2에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 세포를 248.44 ng의 pBRE-Luc 및 1.56 ng의 pAMHR2로 구성된 250 ng/웰의 플라스미드 DNA로 형질주입시켰다 (GenScript HK Limited, Hong Kong; 카탈로그 번호: OHu22327D; NM_020547). 플라스미드 DNA를 제조사의 지침서에 따라 리포펙타민 3000 (Life Technologies)과 결합시킨 다음, 세포에 직접 첨가하고, 5% CO2에서 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 다음 날, 형질주입된 COV434 세포를 저-혈청 배지 [50 mM HEPES 및 0.2% FCS를 포함하는 DMEM]에 희석된 AMH 변이체의 용량 범위로 처리하였다. 이는 세포로부터 형질주입 배지를 제거하고 웰당 200 μL의 처리 배지로 대체함으로써 발생하였다. 그런 다음, 세포를 처리 배지에서 밤새 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하였으며, 각각의 용량은 최소 삼중으로 테스트하였다. 루시퍼라제 단백질의 발현을 평가하기 위해, 배지를 제거하고, 가용화 완충액 [26 mM 글리실글리신 (pH 7.8), 16 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 900 μM 디티오트레이톨, 1% Triton X-100]에서 세포를 용해시키면서, 얼음 위에서 20 분 동안 진탕하였다. 용해물을 백색 96-웰 플레이트로 옮겼다. CLARIOstar 마이크로플레이트 판독기 (BMG Labtech, Ortenberg, Germany)를 사용하여 기질 D-루시페린을 함유하는 혼합물 [25 mM 글리실글리신 (pH 7.8), 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM 디티오트레이톨, 1.5 mM ATP, 0.5 mM D-루시페린 (Life Technologies)]의 첨가 직후에 발광성을 측정함으로써 루시퍼라제 발현을 평가하였다. 루시퍼라제 활성은 기준선 활성에 대한 배수-변화로서 분석하였다 (Chand AL et al. (2007) Human Reproduction 22(12):3241-3248).
실시예 1 AMH 단백질 서열 및 변형
천연 인간 AMH 단백질의 서열은 식별자 AAH49194.1로서 GenBank로부터 이용가능하다. 이 서열은 하기에 제공된다.
Figure pct00010
25 개의 아미노산 신호 서열은 밑줄로 표시된다. 단백질분해 가공 부위는 볼드체로 표시된다.
야생형 마우스 AMH 단백질 서열의 서열은 식별자 NP_031471.2로서 GenBank로부터 이용가능하다. 이 서열은 하기에 제공된다.
Figure pct00011
신호 순서는 밑줄로 표시된다.
인간 및 마우스 AMH 서열은 73%의 동일성을 공유한다.
hAMH+SCUT+RSA 변형
야생형 인간 AMH 서열을 His6 태그, 슈퍼-컷 프로-도메인 절단 부위 및 RSA 신호 펩티드를 혼입하기 위해 방법에 기재된 바와 같이 변형시켰다. 이 단백질은 hAMH+SCUT+RSA로 지정되었으며, 단백질 서열은 하기에 제공된다.
Figure pct00012
신호 순서는 밑줄로 표시된다. His6 태그는 음영으로 강조 표시된다. 단백질분해 가공 부위는 볼드체로 표시된다. 서열번호 3에 정의된 바와 같은 hAMH+SCUT+RSA의 가공은 서열번호 36에 제공된 서열을 갖는 성숙한 AMH를 생산한다.
상응하는 핵산 서열은 하기에 제공된다:
Figure pct00013
실시예 2 재조합체 AMH 단백질 발현
전구체 가공 및 단백질 분비를 개선하기 위한 목적으로 중첩-확장 PCR을 통해 hAMH cDNA에 변형이 이루어졌다. 원하는 결과가 달성되었는지 평가하기 위해, HEK-293T 세포를 변형된 hAMH cDNA를 함유하는 변형된 발현 벡터 (각자 hAMH+SCUT 및 hAMH+SCUT+RSA)로 일시적으로 형질주입시켰다.
mAb-5/6A를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의한 농축된 및 환원된 컨디셔닝된 배지의 분석 (도 2)은 12.5 kDa의 단량체 AMH 성숙한 도메인 및 70 kDa의 단량체 AMH 전구체 둘 모두를 검출하였다 (도 2; 레인 4). 슈퍼-컷 (SCUT) 변형을 함유하는 AMH 변이체는 동일한 샘플 내에서 12.5 kDa의 성숙한 형태에 비해 70 kDa의 전구체 형태의 희미한 검출에 의해 정성적으로 판단되는 바와 같이 개선된 전구체 가공을 나타내었다 (도 2; 레인 5). SCUT 변형 및 RSA 신호 펩티드 둘 모두를 함유하는 hAMH 형태 (도 2; 레인 6)는 잠재적인 수용체-결합 에피토프를 표적화하는 후속 돌연변이의 주형으로서 사용하였다.
실시예 3: hAMH의 잠재적 수용체-결합 에피토프를 표적화하는 돌연변이
수용체와 복합체를 이루는 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 수퍼패밀리 리간드의 구조는 이전에 다수의 수퍼패밀리 구성원에 대해 보고되었다 (Hinck, Mueller & Springer (2016) Cold Spring harbor Perspectives in Biology 8(12):51. 이들 보고된 구조 및 단백질 서열 상동성을 가이드로서 사용하여, 본 발명자들은 유형 II 수용체인 AMHR2와의 독특한 상호작용을 매개하는 hAMH 내의 아미노산을 식별하려고 시도하였다. 이 목적을 위해, 생체외 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여, 다수의 hAMH 돌연변이 발현 벡터 코호트를 생산하였다.
코호트 하나의 hAMH 돌연변이체
초기에 (도 3), G533A 및 L535A 돌연변이체를 생성하였다. G533 및 L535는 성숙한 천연 hAMH 서열에서 볼드체 및 아래 밑줄로 표시된다.
Figure pct00014
L535A 돌연변이체는 불량하게 분비되었다 (데이터는 도시되지 않음). 따라서, 본 발명자들은 이 아미노산의 역할을 시도하고 평가하기 위해 보다 보존적인 돌연변이인 L535M을 생성하였다 (도 4).
코호트 2 개의 hAMH 돌연변이체
제2 코호트 (도 4)에서, 다음 돌연변이체를 생성하였다: G533S 및 이중 돌연변이체 G533A+L535M.
코호트 3 개의 hAMH 돌연변이체
제3 코호트 (도 5)에서, 다음 돌연변이체를 생성하였다: G533H, G533K, G533R 및 G533L. G533L 돌연변이체는 분비되지 않은 반면, G533R 돌연변이체는 불량하게 분비되었으며, 따라서 이들 두 돌연변이체의 활성은 결정되지 않았다.
코호트 4 개의 hAMH 돌연변이체
제4 코호트 (도 6)에서, H548K 돌연변이체를 생성하였다.
실시예 4 재조합체 AMH 단백질의 정제
AMH를 정제하기 위해, AMH 프로도메인의 N-말단에 위치한 폴리-히스티딘 태그를 표적화하는 HisPur™ 코발트 수지를 사용하였다. 이 접근법을 통해 호르몬 생체활성을 담당하는 성숙한 도메인을 태깅 없이 정제할 수 있었다. 간단히 말해서, 200 mL의 컨디셔닝된 배지를 농축하고, 수지와 함께 ~2.5 시간 동안 항온처리한 후, 결합되지 않은 단백질을 수집하고, 수지를 PBS로 2 회 세척하여, 느슨하게 결합된 단백질을 제거하였다. 두 가지 상이한 농도의 이미다졸을 사용하여, 코발트-결합된 AMH를 방출하였다. 회수는 mAb-5/6A로 탐침된 웨스턴 블롯팅에 의해 평가되었으며, 결합된 AMH의 대부분은 제1 용리에서 회수되었다. 일부 AMH 단백질은 더 높은 농도의 이미다졸을 함유하는 제2 용리에서 또한 용리된 반면, 일부 AMH 단백질은 수지에 결합하지 않았다. 이미다졸을 둘베코 포스페이트 완충 식염수에 대한 투석에 의해 제제로부터 제거하였다. 돌연변이체 AMH 단백질은 hAMH+SCUT+RSA (본원에서 "야생형"으로서 지정됨)와 유사한 비율로 회수되었으며, 도 7을 참고한다.
실시예 5 재조합체 AMH 단백질의 활성
생성된 정제된 재조합체 AMH 제제의 활성을 평가하기 위해, COV434 세포를 Smad1/5-반응성 BRE-루시퍼라제 리포터 및 AMHR2로 형질주입시켰다. 24 (24) 시간 후, 세포를 용해 전에 AMH의 용량 범위로 밤새 처리하고, 기질 D-루시페린을 첨가한 직후 발광성을 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 기준선 활성과 관련된 배수-변화로서 분석하였다. 상이한 AMH 돌연변이체는 hAMH+SCUT+RSA (야생형) AMH에 비해 BRE-루시퍼라제 리포터를 자극하는 능력에 따라 하기에 그룹화되었다.
(i) 활성이 중등도 내지 주요 증가를 갖는 AMH 돌연변이체 단백질
hAMH+SCUT+RSA (야생형) AMH는 전형적으로 ~6 ng/mL의 EC50으로, 15-50 ng/mL 사이의 COV434 BRE-루시퍼라제 검정에서 피크 반응을 제공한다. G533A 돌연변이체는 "야생형" AMH보다 ~2 배 더 큰 활성을 나타낸 반면 (도 8a), G533S 돌연변이체는 ~3 배 더 큰 활성을 나타내었다 (도 8a, b). G533K 돌연변이체는 "야생형" AMH보다 ~5 배 더 큰 활성을 나타내면서, 또한 최고 용량에서 실질적으로 더 높은 최대 반응을 자극하였다 (도 8b).
(ii) 활성의 관찰가능한 변화가 없는 AMH 돌연변이체 단백질
돌연변이체 G533H, H548K, L535M 및 이중 돌연변이체 G533A+L535M은 루시피라제 검정에서 hAMH+SCUT+RSA (야생형) AMH에 비해 관찰가능한 상이함을 나타내지 않았다 (도 9).
생성된 hAMH 돌연변이체는 하기 표 5에 요약된다.
표 5: hAMH 돌연변이체
Figure pct00015
Figure pct00016
AMH의 핑거 도메인에서 G533 잔기의 위치는 도 10에 도시된다.
효능, 활성 및 반응은 "WT" 성숙한 AMH (hAMH+SCUT+RSA로부터 생성됨, 서열번호 36)와 관련이 있다. 본 발명자들은 hAMH+SCUT+RSA (서열번호 36)로부터 생산된 성숙한 가공 AMH의 활성이 R&D Systems로부터 구입한 hAMH의 활성과 비슷함을 보여주었다.
G = 글리신; A = 알라닌; K = 리신; S = 세린; H = 히스티딘; R = 아르기닌; L = 류신; M = 메티오닌; I = 이소류신; N=아스파라긴
SEQUENCE LISTING <110> Monash University <120> Anti-mullerian hormone polypeptides <130> 530671PCT <150> AU2019904097 <151> 2019-10-30 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 560 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val 20 25 30 Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly 35 40 45 Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn 50 55 60 Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp 85 90 95 Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu 100 105 110 Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln 115 120 125 Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro 130 135 140 Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu 145 150 155 160 Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val 165 170 175 Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp 180 185 190 Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg 195 200 205 Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg 210 215 220 Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg 225 230 235 240 Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu 245 250 255 Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro 260 265 270 Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp 275 280 285 Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro 290 295 300 Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu 305 310 315 320 Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu 325 330 335 Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro 340 345 350 Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser 355 360 365 Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr 385 390 395 400 Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly 405 410 415 Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln 420 425 430 Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg 435 440 445 Ala Gln Arg Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu 450 455 460 Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro 465 470 475 480 Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro Gln 485 490 495 Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys 500 505 510 Met Gln Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro 515 520 525 Thr Ala Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile 530 535 540 Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg 545 550 555 560 <210> 2 <211> 554 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Gln Gly Pro His Leu Ser Pro Leu Val Leu Leu Leu Ala Thr Met 1 5 10 15 Gly Ala Val Leu Gln Pro Glu Ala Val Glu Asn Leu Ala Thr Asn Thr 20 25 30 Arg Gly Leu Ile Phe Leu Glu Asp Glu Leu Trp Pro Pro Ser Ser Pro 35 40 45 Pro Glu Pro Leu Cys Leu Val Thr Val Arg Gly Glu Gly Asn Thr Ser 50 55 60 Arg Ala Ser Leu Arg Val Val Gly Gly Leu Asn Ser Tyr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Phe Leu Glu Ala Val Gln Glu Ser Arg Trp Gly Pro Gln Asp Leu Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Val Cys Ser Thr Asp Ser Gln Ala Thr Leu Pro Ala Leu 100 105 110 Gln Arg Leu Gly Ala Trp Leu Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gln Leu Leu 115 120 125 Val Leu His Leu Ala Glu Val Ile Trp Glu Pro Glu Leu Leu Leu Lys 130 135 140 Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Ser Arg Trp Glu Gln Ala Leu 145 150 155 160 Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Gln Val Thr Val Thr Gly Thr 165 170 175 Gly Leu Arg Gly Thr Gln Asn Leu Cys Pro Thr Arg Asp Thr Arg Tyr 180 185 190 Leu Val Leu Thr Val Asp Phe Pro Ala Gly Ala Trp Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Leu Ile Leu Thr Leu Gln Pro Ser Arg Glu Gly Ala Thr Leu Ser Ile 210 215 220 Asp Gln Leu Gln Ala Phe Leu Phe Gly Ser Asp Ser Arg Cys Phe Thr 225 230 235 240 Arg Met Thr Pro Thr Leu Val Val Leu Pro Pro Ala Glu Pro Ser Pro 245 250 255 Gln Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Met Pro Phe Pro Gln Pro Gly 260 265 270 Leu Ser Leu Glu Pro Glu Ala Leu Pro His Ser Ala Asp Pro Phe Leu 275 280 285 Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Gly Pro Leu Thr Gln 290 295 300 Ala Ser Asn Thr Gln Leu Ala Leu Asp Pro Gly Ala Leu Ala Ser Phe 305 310 315 320 Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Gly Arg Leu 325 330 335 Leu Asp Trp Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Ala Ala Ala 340 345 350 Thr Glu Arg Glu Pro Met Pro Leu His Gly Pro Ala Ser Ala Pro Trp 355 360 365 Ala Ala Gly Leu Gln Arg Arg Val Ala Val Glu Leu Gln Ala Ala Ala 370 375 380 Ser Glu Leu Arg Asp Leu Pro Gly Leu Pro Pro Thr Ala Pro Pro Leu 385 390 395 400 Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Asn Asp Ser Arg Ser Ser Gly 405 410 415 Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg 420 425 430 Ala Glu Trp His Gly Arg Glu Gly Arg Gly Arg Thr Gly Arg Ser Ala 435 440 445 Gly Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp 450 455 460 Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn 465 470 475 480 Asn Cys Gln Gly Ala Cys Ala Trp Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg 485 490 495 Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala Arg Gly Ala 500 505 510 Ala Leu Gly Arg Leu Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr Ala Gly Lys 515 520 525 Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His His Val Pro 530 535 540 Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg 545 550 <210> 3 <211> 562 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified AMH precursor <400> 3 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala 1 5 10 15 Phe Ser His His His His His His Pro Ala Val Gly Thr Ser Gly Leu 20 25 30 Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly Ser Pro Gln Glu Pro 35 40 45 Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn Gly Ser Ser Ser Pro 50 55 60 Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Ala Phe Leu Gly 65 70 75 80 Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp Leu Ala Thr Phe Gly 85 90 95 Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu Pro Ser Leu Arg Arg 100 105 110 Leu Gly Ala Trp Leu Gln Asp Pro Gly Gly Gln Arg Leu Val Val Leu 115 120 125 His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro Ser Leu Arg Phe Gln 130 135 140 Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu Leu Ala Leu Leu Val 145 150 155 160 Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val Thr Arg Ala Gly Leu 165 170 175 Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp Thr Arg Tyr Leu Val 180 185 190 Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg Gly Ser Gly Leu Ala 195 200 205 Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg Leu Ser Thr Ala Arg 210 215 220 Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg Cys Phe Thr Arg Met 225 230 235 240 Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu Pro Ala Pro Leu Pro 245 250 255 Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro Pro Pro Arg Pro Ser 260 265 270 Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp Pro Phe Leu Glu Thr 275 280 285 Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro Pro Ala Arg Ala Ser 290 295 300 Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu Ala Gly Phe Pro Gln 305 310 315 320 Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu Glu Arg Leu Leu Asp 325 330 335 Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Thr Ala Ala Thr Thr 340 345 350 Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser Ala Pro Trp Ala Thr 355 360 365 Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln Ala Ala Ala Ala Glu 370 375 380 Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr Ala Pro Leu Leu Ala 385 390 395 400 Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly Gly Leu Gly Asp Pro 405 410 415 Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln Gly Leu Arg Val Glu 420 425 430 Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Ile Ser Ser Arg Lys Lys 435 440 445 Arg Ser Val Ser Ser Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys 450 455 460 Ala Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu 465 470 475 480 Ile Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp 485 490 495 Pro Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu 500 505 510 Leu Lys Met Gln Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys 515 520 525 Val Pro Thr Ala Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu 530 535 540 Arg Ile Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly 545 550 555 560 Cys Arg <210> 4 <211> 1689 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified AMH precursor <400> 4 atgaagtggg taacctttct cctcctcctc ttcatctccg gttctgcctt ttcccatcat 60 catcatcatc atccagctgt gggcaccagt ggcctcatct tccgagaaga cttggactgg 120 cctccaggca gcccacaaga gcctctgtgc ctggtggcac tgggcgggga cagcaatggc 180 agcagctccc ccctgcgggt ggtgggggct ctaagcgcct atgagcaggc cttcctgggg 240 gctgtgcaga gggcccgctg gggcccccga gacctggcca ccttcggggt ctgcaacacc 300 ggtgacaggc aggctgcctt gccctctcta cggcggctgg gggcctggct gcaggaccct 360 ggggggcagc gcctggtggt cctacacctg gaggaagtga cctgggagcc aacaccctcg 420 ctgaggttcc aggagccccc gcctggagga gctggccccc cagagctggc gctgctggtg 480 ctgtaccctg ggcctggccc tgaggtcact gtgacgaggg ctgggctgcc aggtgcccag 540 agcctctgcc cctcccgaga cacccgctac ctggtgttag cggtggaccg ccctgcgggg 600 gcctggcgcg gctccgggct ggccttgacc ctgcagcccc gcggagagga ctcccggctg 660 agtaccgccc ggctgcaggc actgctgttc ggcgacgacc accgctgctt cacacggatg 720 accccggccc tgctcctgct gccgcggtcc gagcccgcgc cgctgcctgc gcacggccag 780 ctggacaccg tgcccttccc gccgcccagg ccatccgcgg aactggagga gtcgccaccc 840 agcgcagacc ccttcctgga gacgctcacg cgcctggtgc gggcgctgcg ggtccccccg 900 gcccgggcct ccgcgccgcg cctggccctg gatccggacg cgctggccgg cttcccgcag 960 ggcctagtca acctgtcgga ccccgcggcg ctggagcgcc tactcgacgg cgaggagccg 1020 ctgctgctgc tgctgaggcc cactgcggcc accaccgggg atcctgcgcc cctgcacgac 1080 cccacgtcgg cgccgtgggc cacggccctg gcgcgccgcg tggctgctga actgcaagcg 1140 gcggctgccg agctgcgaag cctcccgggt ctgcctccgg ccacagcccc gctgctggcg 1200 cgcctgctcg cgctctgtcc aggaggcccc ggcggcctcg gcgatcccct gcgagcgctg 1260 ctgctcctga aggcgctgca gggcctgcgc gtggagtggc gcgggcggga tccgcgcggg 1320 ccgggtatct catcgagaaa gaaacgctca gtctcatcaa gcgcgggggc caccgccgcc 1380 gacgggccgt gcgcgctgcg cgagctcagc gtagacctcc gcgccgagcg ctccgtactc 1440 atccccgaga cctaccaggc caacaattgc cagggcgtgt gcggctggcc tcagtccgac 1500 cgcaacccgc gctacggcaa ccacgtggtg ctgctgctga agatgcaggc ccgtggggcc 1560 gccctggcgc gcccaccctg ctgcgtgccc accgcctacg cgggcaagct gctcatcagc 1620 ctgtcggagg agcgcatcag cgcgcaccac gtgcccaaca tggtggccac cgagtgtggc 1680 tgccggtaa 1689 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified mature AMH sequence <400> 5 Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu 1 5 10 15 Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr 20 25 30 Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg 35 40 45 Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Ala 50 55 60 Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His 85 90 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ctttgcctgg ggagccagcc 120 acaggcaccg ggggcctcat cttccaccag gactgggact ggccgccagg cagcccccaa 180 gaacccctgg ggtgcttggt gacgctggac gagggtggca accagagcag cgccccgctg 240 cgggtggcgg gggccctgag cggctacgag caggccttcc tggaggccgt gcagcgcacc 300 cactggagcc cccgcgacct gcccaccttc ggggtctgct cccctgccga ccggcaggcg 360 gccgtaccat ctctgcagcg cctgcaggcc tggctggggg caccctgggg gcagcggctg 420 gtggtcctgc acctggagga agtgatgtgg gagccgacgc cctcgctgag gttccaggag 480 cccccatctg gaggagccaa ccccctggag ccagcgctgc tggtgctgta cgccgggccc 540 ggccctgagg tcactgtcac gggggccggg ctgccagggg cccagagcct ctgcccgtcc 600 ccggacaccc gctacctggc gctggccgtc gaccacccag cacgggcctg gcgccaccct 660 gggctcatcc tgaccctgca gcctcgcgga gacggtgccc ccctgagcac ggcccagctg 720 cagacgctgc tgttcggcgc cgacccccgc tgcttcacgc ggatgacccc cgccctgttc 780 ctgctgcagc ggccggggcc cgcgcccatg cccgcgcacg gccgactcga cacggtgccc 840 ttcccgccag ccaggccgtc cccggagccc gaggagccgc ggcccagcgc cgaccccttc 900 ctggagacgc tcacgcgcct ggtgcgcgcg ctgcgggggc ccccgactcc 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tgccggtga 1719 <210> 30 <211> 1767 <212> DNA <213> Felis catus <400> 30 atgcctggtc tgctctctcc gccggccctg gtgctgtcgg tgatgggggc tctgctgatg 60 gccggggacc ctggggaaga ggtctccagc accccggccc tgcctggagg gccagccaca 120 ggcaccgggg gtctcatctt ccacccggat tgggactggc agcccccggg cagtccccaa 180 gaccccctgt gcctggtgac gctggacagg ggtggtaacg ggagcggctc cccgcttcgg 240 gtggtggggg cgctgagagg ctacgagcac gccttcctcg aggctgtgcg gcgggcccgc 300 tggggtcccc acggcctggc caccttcgga gtttgcaccc ccagggacag gcaggccgcc 360 ccgttctctc tgcggcagct gcaggcgtgg ctgggggagc ccggggggcg gcggctggtg 420 gtgctgcacc tggaggaagt gacatgggag ccgacaccct cactgaagtt ccaggagccc 480 ccgcctggag gggccggtcc cctagagctg gcgatgctgg tgctgtaccc tggccctggc 540 cccgaggtca cggtcacagg ggctgggctg ccaggcaccc agagcctctg tcagtcccgg 600 gacacccgct acctggtgct ggcggtggac cacccagaag gggcctggcg cagccccggg 660 ctcaccctga ccctgcaacc ccgcagagac ggtgcgcccc tgagcaccgc ccagctgcag 720 gagctgctgt tcggccccga cccccgctgc ttcacacgca tgaccccggc gctgctcctg 780 ctgccggggc ccgcgcctgc accgctgccc gcgcgtggcc tgctggacca agtgcctctc 840 ccgccgccca ggccctccca ggagcaggcg cccgaggagc cacggtccag cgccgacccc 900 ttcctggaga cgctcacgcg cctggtgcgc gcgctgcggg ggcccccggc ccaggcctcg 960 ccggcgcgcc tggccctgga ccccggcgcg ctggccggct tcccgcaggg cctggtcaac 1020 ctgtcggacc ccgcggcgca ggagcgcctg ctcaacggcg gcgacgagcc gctgctgctg 1080 cttctgctgc cacccgccac gcccaccgcc gccgccgccg ccgccgggga ccccgcgccg 1140 ccgcgcggcc cggcgtccgc gccctgggcc gccggcctag cgcgtcgcgt ggccgccgag 1200 ctgcaggccg cggccgccga gctgcgaggg ctcccggggc tgccgccggc cgccacgccg 1260 ctgctggcgc gcctgctcgc gctgtgcccc ggggattcgg gggactcggg ggacccgggg 1320 gccccccccg gcggcccggg cggcccgctg cgcgcgctgc tgctgctcaa ggcgctgcag 1380 ggtctgcgcg cggagtggcg cgggcgcgag caggccggac cggcgcgggc acagcgcagc 1440 gcgggggccg gggcggccga cgggccgtgc gcgctgcgcg agctgagcgt ggacctgcgc 1500 gccgagcgct ccgtgctcat cccggagacg taccaggcca acaactgcca gggcgcgtgc 1560 ggctggccgc agtccgaccg caacccgcgc tacggcaacc acgtggtgct gctgctcaag 1620 atgcaggccc 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lupus familiaris <400> 32 Met Gly Ala Leu Ala Leu Trp Pro Leu Ala Leu Ala Leu Ser Gly Met 1 5 10 15 Gly Pro Leu Leu Gly Ala Glu Ala Pro Gly Gly Glu Val Ser Gly Thr 20 25 30 Pro Ala Ser Pro Gly Glu Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe 35 40 45 Gln Pro Asp Trp Asp Trp Pro Pro Ser Ala Pro Gln Asp Pro Leu Cys 50 55 60 Leu Val Thr Leu Asp Lys Gly Gly Asn Gly Ser Ser Pro Pro Leu Arg 65 70 75 80 Val Ala Gly Ala Leu Arg Gly Tyr Glu His Thr Phe Leu Glu Ala Val 85 90 95 Arg Arg Ala Arg Trp Gly Pro His Asp Leu Ala Thr Phe Gly Ala Cys 100 105 110 Ala Ala Ser Asp Gly Arg Thr Thr Gln Leu Ser Leu Arg Gln Leu Gln 115 120 125 Ala Trp Leu Gly Ala Pro Gly Gly Arg Arg Leu Val Val Leu His Leu 130 135 140 Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Ala Leu Ser Leu Lys Phe Gln Glu Pro 145 150 155 160 Pro Pro Gly Gly Ala Ser Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr 165 170 175 Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Ala Val Thr Gly Ala Gly Leu Pro Gly 180 185 190 Thr Gln Asn Leu Cys Arg Ser Arg Asn Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala 195 200 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Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys 1505 1510 1515 Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly 1520 1525 1530 Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Gly Thr 1535 1540 1545 Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly 1550 1555 1560 Cys Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys 1565 1570 1575 Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys 1580 1585 1590 Gly Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys 1595 1600 1605 Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Gly Ala Gly 1610 1615 1620 Gly Ala Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly 1625 1630 1635 Cys Ala Cys Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Ala Cys 1640 1645 1650 Ala Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly 1655 1660 1665 Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Ala 1670 1675 1680 <210> 35 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mature processed AMH <400> 35 agcgcggggg ccaccgccgc cgacgggccg tgcgcgctgc gcgagctcag cgtagacctc 60 cgcgccgagc gctccgtact catccccgag acctaccagg ccaacaattg ccagggcgtg 120 tgcggctggc ctcagtccga ccgcaacccg cgctacggca accacgtggt gctgctgctg 180 aagatgcagg tccgtggggc cgccctggcg cgcccaccct gctgcgtgcc caccgcctac 240 gcgggcaagc tgctcatcag cctgtcggag gagcgcatca gcgcgcacca cgtgcccaac 300 atggtggcca ccgagtgtgg ctgccggtga 330 <210> 36 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature processed AMH <400> 36 Ser Val Ser Ser Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala 1 5 10 15 Leu Arg Glu Leu Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile 20 25 30 Pro Glu Thr Tyr Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro 35 40 45 Gln Ser Asp Arg Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu 50 55 60 Lys Met Gln Ala Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val 65 70 75 80 Pro Thr Ala Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg 85 90 95 Ile Ser Ala His His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys 100 105 110 Arg <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X is absent or isoleucine <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> X is absent or serine <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X is absent or serine <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> X is absent or serine <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> X is absent or isoleucine <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> X is absent or serine <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> X is absent or serine <400> 37 Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 38 Arg Lys Lys Arg 1 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 39 Ile Ser Ser Arg Lys Lys Arg 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 40 Arg Lys Lys Arg Ser Val Ser Ser 1 5 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal extension <400> 41 Ser Val Ser Ser 1

Claims (41)

  1. C-말단 도메인 서열을 포함하는 단리된 항-뮐러 호르몬 (AMH) 유사체로서, 상기 C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 천연 인간 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함하며, 상기 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 중 하나 이상 내에 존재하는, 항-뮐러 호르몬 (AMH) 유사체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 AMH 유사체가 천연 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드의 활성과 비교하여 2.5-배 이상 더 큰 활성을 갖는, AMH 유사체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 잔기 30 내지 447에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 도메인을 추가로 포함하는, AMH 유사체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 N-말단 도메인이 X1X2X3RKKRX8X9X10X11 (서열번호 37)을 포함하는 전구단백질 전환효소 부위를 포함하고, 여기서 X1이 부재하거나 이소류신이고, X2가 부재하거나 세린이고, X3이 부재하거나 세린이고, X8이 부재하거나 세린이고, X9가 부재하거나 발린이고, X10이 부재하거나 세린이고, X11이 부재하거나 세린인, AMH 유사체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 전구단백질 전환효소 부위가 ISSRKKRSVSS (서열번호 6)를 포함하는, AMH 유사체.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 전구단백질 전환효소 부위가 RKKR (서열번호 40)을 포함하는, AMH 유사체.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인이 별개의 폴리펩티드인, AMH 유사체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 내에 존재하는 변형이 하나 이상의 아미노산 치환인, AMH 유사체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 내에 존재하는 변형이 단일 아미노산 치환인, AMH 유사체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 아미노산 치환이 서열번호 1의 아미노산 잔기 533, 535 또는 548에 위치하는, AMH 유사체.
  11. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산 치환이 (i) G533, (ii) L535 및 (iii) G533 + L535로 이루어진 군으로부터 선택되는, AMH 유사체.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치환이 (i) L535M 및 (ii) G533A + L535M으로 이루어진 군으로부터 선택되는, AMH 유사체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형이 (i) G533A, (ii) G533S, (iii) G533K, (iv) G533L 및 (v) G533R로 이루어진 군으로부터 선택되는, AMH 유사체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형이 G533K인, AMH 유사체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 C-말단 도메인이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, AMH 유사체:
    Figure pct00017
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 C-말단 도메인이 N-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 임의로 포함하는, AMH 유사체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 N-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기가 SVSS (서열번호 41)를 포함하는, AMH 유사체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 단백질, 검출 태그, 정제 태그 또는 담체 분자 중 하나 이상으로부터 선택된 융합 파트너를 추가로 포함하는, AMH 유사체.
  19. C-말단 도메인 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 AMH 전구체로서,
    상기 C-말단 도메인은 서열번호 5에 제시된 천연 인간 성숙한 가공된 AMH 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함하고, 상기 변형은 서열번호 1의 아미노산 잔기 533 내지 548 중 하나 이상 내에 존재하는, AMH 전구체.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 변형이 G533A, G533K 또는 G533S인, AMH 전구체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 서열번호 1 또는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 G533에 상응하는 아미노산이 G533A, G533S 또는 G533K로의 치환에 의해 변형되는, AMH 전구체.
  22. 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하는 AMH 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 서열번호 4의 뉴클레오티드 1603 내지 1605에서의 폴리뉴클레오티드 서열은 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 리신 (K)을 코딩하도록 변형되는, AMH 폴리뉴클레오티드.
  23. 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 AMH 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 서열번호 33의 뉴클레오티드 1597 내지 1599에서의 폴리뉴클레오티드 서열은 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 리신 (K)을 코딩하도록 변형되는, AMH 폴리뉴클레오티드.
  24. 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 AMH 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 뉴클레오티드 244 내지 246에서의 폴리뉴클레오티드 서열은 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 리신 (K)을 코딩하도록 변형되는, AMH 폴리뉴클레오티드.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AMH 유사체 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 AMH 전구체를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  27. 제26항에 있어서,
    AAV 벡터인, 벡터.
  28. 제26항 또는 제27항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  29. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AMH 유사체, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제26항 또는 제27항에 따른 벡터를 포함하는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 조성물이 세포 치료제, 면역치료제, 화학치료제 또는 방사선치료제와 조합하여 투여되는 것인, 조성물.
  31. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AMH 유사체 또는 제29항 또는 제30항에 따른 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서 기능적 난소 예비력의 감퇴를 예방하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AMH 유사체 또는 제29항 또는 제30항에 따른 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 여성 대상체에서의 피임 방법.
  33. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AMH 유사체 또는 제29항 또는 제30항에 따른 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 난소 및/또는 자궁 보호를 위한, 방법.
  34. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AMH 유사체 또는 제29항 또는 제30항에 따른 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 부인과 암의 치료 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 암에 대한 치료를 받고 있거나 받을 예정이거나, 만성 질환 또는 장애에 대해 치료를 받고 있거나 받을 예정인 것인, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 대상체가 자가면역 질환을 가지며, 면역요법으로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있거나, 대상체가 자궁 또는 난소의 세포에 세포 사멸 또는 세포 손상을 유발하는 세포독성 약물 또는 세포독성제로 치료될 것이거나, 현재 치료 중이거나, 치료된 적이 있는 것인, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인 것인, 방법.
  38. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 고양이, 개 및 말로부터 선택된 비-인간 동물인 것인, 방법.
  39. 난포 여포 예비력, 피임, 자궁 보호를 보존하거나 부인과 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른, AMH 유사체의 용도.
  40. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항 또는 제39항에 있어서,
    상기 AMH 유사체가 N-말단 동종이량체 및 C-말단 동종이량체를 포함하는 4차 복합체로서 투여되는 것인, 방법 또는 용도.
  41. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 사용하기 위한 키트로서,
    (i) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 AMH 유사체를 포함하는 투여 장치; 및
    (ii) 대상체에서의 사용을 위한 지침서
    를 포함하는, 키트.
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