KR20220151333A - 가시광선에 의해 활성화되는 항암 면역치료용 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

가시광선에 의해 활성화되는 항암 면역치료용 나노입자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가시광선에 의해 활성화되는 항종양 또는 항종양 면역작용 유도용 자가조립 나노입자에 관한 것으로, 암세포에 강력한 세포 사멸을 유도하고, 항암 면역원성을 그 자체를 높여 암에 대한 치료 효능을 극대화 할 수 있다.

Description

가시광선에 의해 활성화되는 항암 면역치료용 나노입자 및 이의 용도{Visible light-activatable nanoparticles for cancer immunotherapy and use thereof}
본 발명은 가시광선에 의해 활성화되는 항암 면역치료용 자가조립 나노입자에 관한 것이다.
최근, 항암 치료 중에서는 항암 면역치료(Cancer immunotherapy)가 가장 각광받고 있다. 면역항암제는 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역세포 치료제(immune cell therapy), 항암 백신(Anti-cancer vaccine), 면역 바이러스 치료제로 구분될 수 있다.
이중에서 면역관문억제제는 T 세포 활성 및 기능을 억제하는 PD-1/PD-L1과 같은 주요 면역관문 분자의 수용체/리간드 간의 상호작용을 차단하는 작용을 한다. 일부 환자 및 암종에서 우수하고 지속적인 치료 효과를 보였으나, 암 면역원성과 미세환경에 따라 상당수의 환자들에서는 치료 효과가 크지 않고 내성이 발생하는 등 여전히 한계점이 존재하는 것으로 확인되었다.
상기 면역관문억제제에 대해 반응률이 낮은 환자는 선천적으로 낮은 면역세포 수와 종양 침윤 림프구의 특성을 갖고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 종래 문제점을 해결하기 위하여, 항암 면역원성을 그 자체를 높여, 면역관문억제제를 이용한 항암 면역치료의 효율을 극대화하는 치료법의 개발이 절실한 실정이다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0126431호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 하기 일반식 1로 표시되는 양친매성 펩티드;를 중심으로 양 말단에 소수성 항암제 및 광감각제가 각각 결합되어 구성된 복합체;를 포함하는 자가조립 나노입자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 일반식 1로 표시되는 양친매성 펩티드;를 중심으로 양 말단에 소수성 항암제 및 광감각제가 각각 결합되어 구성된 복합체;를 포함하는 자가조립 나노입자를 제공한다.
[일반식 1]
Xaa1-Arg-Arg-Gly
상기 일반식에서, 상기 Xaa는 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 중에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 자가조립 나노입자의 평균 직경은 50 내지 500 nm일 수 있다.
상기 소수성 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 가시광선에 의해 활성화되는 암세포 특이적 항암 활성을 갖는 것으로, 종양조직에서 특이적으로 발현하는 카텝신 B 효소에 의해 분해되며, 소수성 항암제(Doxorubicin)와 광감각제 (Verteporfin)을 방출하는 프로드러그(prodrug)로, 종양세포에 특이적으로 반응하여 활성화되기 때문에, 암 예방 또는 치료과정에서 유도되는 심각한 세포 손상 및 사망 등의 부작용을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는, 암세포 사멸 효과가 매우 우수하며, 광감각제를 동시에 방출하여 항암 면역치료 과정 중 암세포에 강력한 면역원성 세포사멸을 일으켜(Immunogenic cell death; 이하 ICD), 인체 내 면역 체계를 활성화할 수 있다. 이러한 면원원성은 종양 조직으로의 면역 세포의 침투 및 활성을 향상하여 Cold tumor의 Hot Tumor 전환이 가능하며 이는 항암 면역치료의 효능을 크게 증진시킬 수 있다.
본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 단독으로 사용하여도 암 세포의 성장 및 증식을 저해하고, 인체 내 면역체계를 활성화하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 종래 항암제와 병용 투여할 경우, 보다 우수한 약리 효과를 나타내는 바, 암의 재발, 전이, 진행을 억제시킬 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 병용 제제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 가시광선에 의해 활성화되는 항암 면역치료용 나노입자에 의한 면역치료의 작용 메커니즘을 나타낸 도면이다. 도 1a는 항암 면역치료용 자가조립 나노입자의 형성과정과 활성화 과정을 나타낸 것이고, 도 1b, c는 생체내에서 항암 면역치료용 자가조립 나노입자의 작용 메커니즘을 나타낸 도면이다.
도 2는 가시광선에 의해 활성화되는 자가조립 나노입자의 합성 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)의 물리/화학적 특성을 분석한 결과이다.
도 3a는 자가조립 나노입자(LT-NP)의 크기를 동적광산란(DLS)으로 측정한 결과 그래프이다.
도 3b는 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신, 베르테포르핀(VPF)의 형태를 분석하기 위해 투과전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3c는 마우스 혈장 내에서 자가조립 나노입자(LT-NP)의 시간에 따른 크기변화를 분석한 그래프이다.
도 3d는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF) 또는 독소루비신(DOX)과 베르테포르핀(VPF)의 혼합물에 대한 UV 스펙트럼이다.
도 3e는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF) 또는 독소루비신(DOX)과 베르테포르핀(VPF)의 혼합물에 대한 형광세기를 측정한 그래프이다.
도 3f는 실시예 1의 자가조립 나노입자(LT-NP)를 카텝신 B와 각각 0, 9 및 24 시간 동안 반응시킨 후, 효소 반응에 의하여 상기 자가조립 나노입자(LT-NP)가 절단되는 것을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3g는 실시예 1의 자가조립 나노입자(LT-NP)를 카텝신 B와 각각 24시간 동안 반응시킨 후, 효소 반응에 의하여 상기 자가조립 나노입자(LT-NP)가 절단되는 것을 형광 분광광도계(F-7000, Hitachi)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3h는 VPF, LT-NP-Cat-B, LT-NP+Cat-B 및 LT-NP+Cat-B+inhibitor의 레이저 조사 시간에 따른 활성산소 (Reactive oxygen species; ROS) 생성량을 도시한 그래프이다.
도 4a는 CT26 암세포에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리하고 형광현미경으로 촬영한 결과이다.
도 4b는 H9C2 심장 세포에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리하고 형광현미경으로 촬영한 결과이다.
도 4c는 카텝신 B 억제제를 처리한 CT26 세포에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 후, 형광현미경으로 촬영한 결과이다.
도 4d는 CT26 세포에 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF), 이의 혼합물(VPF+DOX) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)를 각각 처리하고, 가시광선을 조사한 후 세포의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4e는 CT26 세포에 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF), 이의 혼합물(VPF+DOX) 자가조립 나노입자(LT-NP)를 각각 처리하고, 가시광선을 조사한 후, Annexin-V 및 PI 염색을 하여 세포사멸 정도를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 4f는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)에 대한 칼레티쿨린(calreticulin, CRT) 발현 여부를 유세포분석기로 분석한 결과이다.
도 4g는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)의 배양액으로부터 세포 외로 배출된 HSP70 및 HMGB1의 상대적 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 4h는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)에 대한의 배양액으로부터 세포 외로 배출된 ATP의 양을 정량적으로 분석한 결과이다.
도 4i는 실험예 10에 따른 실험방법을 개략적으로 도시한 것이고, 도 3j는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)을 비장세포((Spleen cells)와 함께 배양하였을 때, 성숙된 수지상 세포(matured dendritic cells)로의 분화정도를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 4j는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)을 비장세포((Spleen cells)와 함께 배양하였을 때, 활성화된 T 세포(activated T cells)로의 분화정도를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 5a는 1군(VPF) 및 2군(LT-NP)으로 구분되는 동물모델에서 약물의 거동을 근적외선 이미징(IVIS Lumina 기기)을 통해 분석한 결과이다.
도 5b는 1군(VPF) 및 2군(LT-NP)으로 구분되는 동물모델의 각 조직(간, 폐, 비장, 신장, 심장, 암)에서 축적된 약물의 농도를 분석한 결과이다.
도 5c는 1군(VPF) 및 2군(LT-NP)으로 구분되는 동물모델의 암세포에 대한 조직학적 분석 결과이다.
도 5d는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암세포 크기 변화를 측정한 그래프이다.
도 5e는 7 일이 지난 후, 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암세포 사멸 정도를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 5f 내지 도 5k는 7 일이 지난 후, 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서의 암 조직 내 HSP70의 양 (f), HMGB1의 양 (g) 과 면역원성 세포사멸된 암세포 비율(h)과 성숙된 수지상 세포 비율(i), 활성화된 T 세포 비율(j) 및 IFN-γ의 발현정도를 평가한 그래프이다.
도 6a는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암크기(최대 직경 ㅧ 최소 직경2 ㅧ 0.53) 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6b는 7 일 후, 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암세포 사멸정도를 분석한 결과이다.
도 6c는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6d는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6e는 두 번째 암세포를 접종하고 20 일이 지난 후, 1군 및 2군으로 구분되는 동물모델의 암세포 내 활성화된 T 세포(CD45, CD3 및 CD8) 비율을 측정한 그래프이다.
도 6f는 두 번째 암세포를 접종하고 20 일 동안, 1군 및 2군으로 구분되는 동물모델의 암크기 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6g는 두 번째 암세포를 접종하고 20 일이 지난 후, 1군 및 2군으로 구분되는 동물모델의 혈액 내 여러 사이토카인의 발현농도를 분석한 결과이다.
도 7a는 실험예 15의 실험 설계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 7b는 폐 전이를 유도하고 20 일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델에 대한 폐 조직의 사진이다.
도 7c는 폐 전이를 유도하고 20 일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델에서 분리한 폐 조직에 대한 H&E 염색 결과와 면역조직염색 (Ki67) 결과이다.
도 7d는 폐 전이를 유도하고 20 일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델에서의 전이암 조직에서 세포독성 T 림프구 (Cytotoxic T cell)의 침투 정도를 면역조직염색으로 분석한 결과이다.
도 7e는 폐 전이를 유도하고 20 일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델의 폐 조직 무게를 측정한 결과이다.
도 7f는 폐 전이를 유도하고 20 일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델의 생존율을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K)과 같다.
본 발명에서 용어 '펩타이드'란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 일 측면은 하기 일반식 1로 표시되는 양친매성 펩티드;를 중심으로 양 말단에 소수성 항암제 및 광감각제가 각각 결합되어 구성된 복합체;를 포함하는 자가조립 나노입자에 관한 것이다.
[일반식 1]
Xaa1-Arg-Arg-Gly
상기 일반식에서,
상기 Xaa는 소수성 아미노산이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 가장 바람직하게는 페닐알라닌(Phe; Phenylalanine)일 수 있다.
상기 양친매성 펩타이드는 암세포 과발현 효소인 "카텝신-B"에 의해 절단되는 것으로, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.
상기 자가조립 나노입자는 구, 캡슐, 다면체 등의 다양한 형상을 가질 수 있으며, 바람직하게는 구형일 수 있다, 또한 평균 직경은 5 내지 1,000 nm 이상일 수 있고, 바람직하게는 50 내지 500 nm일 수 있으며, 보다 바람직하게는 50 내지 150 nm일 수 있다, 상기 범위의 평균입경을 가지는 자가조립 나노입자는 병변 부위에서 입자의 탈락 없이 안정적으로 머무를 수 있고, 약물 방출 이후 생체 내에서 쉽게 분해 및 제거가 가능하고, 카테터 또는 주사기 바늘의 관을 통한 체내로의 주입 또한 효과적이다.
또한, 상기 자가조립 나노입자는 도 3에 도시된 바와 같이, 구형의 나노입자 형태로 존재함에 따라 다수의 복합체를 포함함에도 불구하고 하나의 입자로 작용할 수 있어, 외부로부터 가시광선 노출 시 해당 위치에서 즉각적으로 활성화 상태로 변화가 용이하고 병변 부위로 보다 빠르고 정확하게 표적화할 수 있다.
상기 자가조립 나노입자는 양친매성 펩타이드를 중심으로 양 말단에 소수성 항암제와 광감각제가 각각 결합된 복합체가 유체 내에서 자가조립을 통해 형성된 구형의 나노입자(전구약물 형태)이다. 구체적으로 상기 복합체가 유체 중에서 자발적으로 구형의 나노입자를 형성할 때, 상기 자가조립 나노입자는 상기 복합체의 소수성 부분(항암제)이 코어를 형성하며, 친수성 부분인 광감각제가 상기 코어의 외부로 노출되어 유체와 닿는 표면을 형성하는 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자를 제공한다.
본 발명의 자가조립 나노입자는 유체 상에서 크기가 균일하고, 생체 내에서 안정적으로 존재할 수 있다는 장점을 갖는다.
본 발명에서 광감각제, 양친매성 펩타이드, 항암제가 순차적으로 결합되어 있고, 상기 양친매성 펩타이드의 양 말단에 광감각제와 항암제가 각각 결합되어 있다(도 1a).
상기 양친매성 펩타이드는 종래 펩타이드 합성과정을 통해 제조된 것일 수 있다. 상기 양친매성 펩타이드의 경우 당업계에 공지된 화학적 합성 방법 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)). 구체적으로 상기 양친매성 펩타이드는 아미드가 C-말단에 고정되어 있는 형태인 링크 아미드 레진에 Fmoc으로 보호된 아미노산 단량체를 차례로 붙여나가는 SSPS(solid-phase peptide synthesis) 방법을 사용하여 합성하는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 자가조립 나노입자는 양친매성 펩타이드에 소수성 약물이 결합된 형태로, 양친매성 펩타이드와 소수성 약물의 상호작용에 의해, 정상세포에 대해 약물의 독성을 나타내지 않도록 안정화되었으므로, 종래 항암치료제가 가지고 있던 부작용 문제를 극복 및 해결함과 동시에 생체 내 구조적 안정성 및 용해성은 현저히 개선되었다.
상기 양친매성 펩타이드와 소수성 항암제 및 광감각제는 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 결합될 수 있다. 또는 상기 양친매성 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 소수성 항암제 또는 광감각제가 각각 결합할 수 있다. 예를 들어, 양친매성 펩타이드 N-말단 페닐알라닌의 아민기 또는 C-말단 글리신의 카복실기에 이동 대상을 결합시키는 공유 결합을 통해 펩타이드에 소수성 항암제 또는 광감각제가 결합될 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에서 링커(linker)를 통해 양친매성 펩타이드와 소수성 항암제 또는 광감각제가 결합될 수 있다, 예를 들어 양친매성 펩타이드 N-말단 페닐알라닌의 아민기 또는 C-말단 글리신의 카복실기에 Hynic(6-하이드라지노피리딘-3-카르복시산, 6-hydrazinopyridine-3-carboxylic acid) 링커와 같은 링커를 도입한 후, 링커에 소수성 항암제 또는 광감각제를 결합시킬 수 있다.
상기 양친매성 펩타이드의 길이가 길어지면 세포 투과 효율이 급격히 감소하고, 유체 내에서 제대로 나노입자를 형성하지 못하며, 길이가 짧아지면 각각의 구성들의 기능이 제대로 발휘되지 못하게 되는 문제가 발생할 수 있다.
또한, 상기 양친매성 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열 중 그 어느 하나라도 변경되면 소수성 항암제와 성공적으로 결합할 수 없거나, 결합된 접합체가 용액상에서 자가조립을 통해 나노입자를 구성하지 못하거나, 종양세포 내에서 분해되었을 때 광감각제와 소수성 항암제가 제 기능을 발휘하지 못할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 카텝신-B에 의해 카텝신-B로 절단가능한 펩타이드(FRRG에서 'FR', 'RR'이 절단부위임)가 분해되고, 소수성 항암제와 광감각제가 방출되게 된다(이하, 활성화 상태라고도 한다). 상기 소수성 항암제는 기존과 달리 절단된 펩타이드의 일부가 결합되지 않은 상태로 바로 방출되게 되는데, 만약 상기 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 서열이 달라지면 소수성 항암제가 바로 방출되지 못하고 일부 아미노산 잔기와 결합된 상태(일예로 G-DOX, RG-DOX 등)로 방출되게 되어, 세포 핵 내로 투과되지 못하게 되며, 그럴 경우 항암제의 항암 효과가 현저히 저하되거나, 세포 외부로 방출되어 부작용을 유발하게 되는 등의 문제가 발생할 수 있다.
상기 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 소수성 항암제와 광감각제가 결합된 접합체는, 용액 상에서 자가조립을 통해 구형의 나노입자 형태(항암제 전구체 형태, 비활성 상태)를 형성하기 때문에, 정상세포와 조직에 대해서는 세포독성을 전혀 나타내지 않을 수 있고, 종양세포 내 전달과 축적이 용이하여, 현저히 우수한 항암 효능을 가지게 된다(도 1a, b).
만약, 자가조립 나노입자를 형성하지 못하고, 광감각제와 소수성 항암제가 단순히 혼합된 상태로 존재한다면, 정상세포 및 암세포 모두에 세포 독성을 나타내어 부작용을 유발하게 될 뿐만 아니라 암세포의 억제 효과 및 항암 면역치료 효과 역시 본 발명에 따른 자가조립 나노입자에 비해 현저히 낮은 등, 다양한 문제점이 발생할 수 있다.
상술한 구조로 이루어진 자가조립 나노입자는 식염수, 체액 등의 유체 내에서 독성이 없는 매우 안정적인 구조를 나타낸다. 상기 자가조립 나노입자는 암세포에 과도하게 발현되는 카텝신-B에 의해 결합이 끊어질 수 있으며, 이에 따라 분리된 항암제와 광감각제는 정확한 표적 부위에서만 활성화될 수 있다(도 1b, c).
특히 광감각제의 경우, 자가조립 나노입자 형태로 존재할 경우에는 가시광선이 조사되어도 활성화되지 않는데, 암세포에서 카텝신-B에 의해 분리된 경우에는 가시광선에 의해 활성화되기 때문에 정상세포에 대한 독성을 현저히 감소시키면서 암세포에 대해서만 예방 또는 치료효과가 활성화되도록 할 수 있다.
상기 소수성 항암제는 소수성을 띄는 항암제라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 광감각제는 프로토포르피린IX(Protoporphyrin IX), 베르테포르핀(Verteporfin), 포스캔(Foscan), 레뷸란(Levulan), 메트빅스(Metvix), 헬스빅스(Hexvix), 퍼리틴(Purlytin), 포토클로어(Phothchlor), 루텍스(Lutex) 및 탈라포르핀(Talaporfin)로부터 선택되는 어느 하나이상의 화합물일 수 있고, 바람직하게는 베르테포르핀(Verteporfin)일 수 있다.
상기 서열번호 1로 표시되는 양친매성 펩타이드의 일 말단에 소수성 항암제와 광감각제가 결합된 접합체는 바람직하게 하기 구조식 1로 표시되는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 선택적으로 카텝신 B를 과발현하는 암세포 내에 축적되고, 항암제를 통해 세포사멸을 유도함과 동시에 광감각제를 통한 가시광선 조사에 의한 감광화(ex vivo photooxidation)롤 통해서 활성산소를 생성하여 암세포 사멸 효과를 강화할 수 있다. 무엇보다 항암제와 광감각제의 복합적 효과에 의해 암세포 내에 강력한 면역원성 세포 사멸을 유도할 수 있어, 종래 항암제 또는 광감각제에서는 예측할 수 없던 우수한 항암 면역치료 효과를 달성할 수 있다.
[구조식 1]
Figure pat00001
본 발명의 자가조립 나노입자는 종양세포에서 우수한 면역 원성 세포사멸 효과를 나타내고 있으므로, 매우 우수한 항암 면역치료 효능을 기대할 수 있으며, 항암제를 단독으로 각각 사용하거나 단순히 혼합하여 병용투여할 때보다 항암효과, 세포 내 흡수 및 축적, 특이성, 암에 대한 치료, 예방 효과 등이 현저히 우수함을 확인하였다.
보다 구체적으로, 자가조립 나노입자를 경구, 경피, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 주사를 통해 체내에 투입하면, 상기 자가조립 나노입자가 세포 내로 이동하고, 카텝신-B가 다량 존재하는 암세포에서만 결합이 끊어지면서 항암제와 광감각제로 각각 분리될 수 있다. 상기 항암제는 암세포 내에서 방출되므로 자체 치료 효과를 나타낼 수 있다. 이때 외부에서 가시광선을 병변부위에 조사하면, 분리된 광감각제가 활성화되면서, 항암제에 의한 항암효과와 함께 암세포 내 면역 원성 세포 사멸을 유도하는 효과를 동시에 나타나도록 할 수 있다(도 1b, c).
카텝신 B가 적게 발현되는 정상세포는 가시광선에 노출되더라도 자가조립 나노입자가 활성화되지 않으므로 정상세포에 대한 사멸은 유도되지 않는다. 나아가 자가조립 나노입자는 정상세포에 대해 독성을 나타내지 않는 안정한 물질임을 확인하였다.
상술한 구조로 이루어진 복합체를 포함하는 상기 자가조립 나노입자는, 암세포 내에서 항암제와 광감각제를 동시에 방출하여 암세포 내 면역 원성 세포 사멸을 유도하는 효과를 나타낸다. 이를 통해 암을 예방하거나 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.
또한 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 별도의 담체를 포함하지 않음에도 불구하고 상술한 종양 조직 특이적 활성과 세포독성 안정화 등의 효과를 발휘하므로, 임상적 사용에 있어서 제약이 없다.
즉, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 (i) 어떠한 종류의 나노담체없이도 자가조립에 의해 구형의 나노입자를 형성하고, 평상시에 세포에 독성을 전혀 나타내지 않는 전구약물 형태로 존재하여, 부작용이 없고, (ii) 가시광선 조사 하에 종양세포에 특이적 활성을 가지며, (iii) 낮은 농도에서도 매우 우수한 항암 효과를 나타내며, (iv) 암세포 내에 우수한 면역 원성 세포사멸을 일으켜 항암 치료 효능을 극대화할 수 있다.
최근 종양세포의 내성 문제를 해결하기 위해 다양한 치료제들이 개발되었으나, 항암제와의 결합을 통한 단순 접합체 형태만을 제공하고 있을 뿐이고, 이마저도 종양세포의 성장을 현저히 저하시키는 것으로, 장기간의 치료가 필요하다는 문제가 있다. 또한, 면역관문 억제제와의 병용투여에 대해서도 완전한 종양의 제거는 어려웠으나, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 면역관문억제제와의 병용투여를 통해 적은 횟수의 투여에도 불구하고 암조직의 사멸과 면역세포 활성화를 통해 암조직의 완전 사멸을 유도할 수 있으므로, 상승효과 이상의 효과를 거둘 수 있다.
또한 본 발명에 따른 자가조립 나노입자를 투여하는 동안에는 암에 대한 전이를 억제할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 암조직이 사멸된 후, 암에 대한 면역원성을 향상시켜, 암의 재발을 억제할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자는 종래 펩타이드-항암제 복합체 또는 면역관문 억제제와의 병용투여와 비교하여, 예측할 수 없던 암 치료와 예방 효과와 더불어 암 재발 및 암 전이 억제 효과라는 암에 대한 복합기능적 치료 또는 예방 효과를 거둘 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 암은 고체 종양 및 혈액 종양(blood born tumor)을 포함하는 일반적인 암 질환을 말하며, 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암, 피부암, 내성암, 재발암 및 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학조성물의 용도, 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 약물복합체 혹은 자가조립 나노입자의 용도, 인간을 포함한 포유류에 약제학적으로 허용가능한 양의 자가조립 나노입자를 투여하는 것을 포함하는 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다.
암 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 본 발명의 자가조립 나노입자를 식품 또는 음료에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 상기 "내성암"이란, 광역학적 치료와 같은 방사선 치료법 등의 암 치료요법에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어, 상기 치료법에 의해 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료 증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성암은 특정한 치료법에 대하여 처음부터 내성을 가질 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 암 세포 내의 유전자 변이 등에 의하여 동일한 치료에 대해 더 이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다.
본 발명에서 상기 "전이암"이란, 암 세포가 원발 장기를 떠나 다른 장기로 이동하여 증식되어 발생된 암을 의미한다. 암이 신체 다른 부분으로 퍼지는 것은 크게 원발암에서 암 조직이 성장하여 직접적으로 주위 장기를 침습하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격 전이를 하는 것으로 구분할 수 있다. 바람직하게는 다른 원발암에서 암이 위의 장기로 전이된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 "재발암"이란, 최초 암의 발생 후 치료로 인해 완치 판정을 받은 후 암이 생긴 부위에 다시 암이 발생한 경우를 의미한다. 본 발명의 목적상 상피 중간엽 전이 과정을 통해 발생한 암의 재발일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitor)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "면역 관문"은 면역세포 표면에서 면역 반응의 자극 또는 억제 신호를 유발하는데 관여하는 단백질을 총칭하며, 암세포는 이러한 면역 관문을 통해 면역반응의 자극 및 이에 따른 암세포의 억제가 제대로 진행되지 않도록 조작하여 면역체계의 감시망을 회피하게 된다. 바람직하게 상기 면역 관문 단백질은 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, PD-L2 길항제, CD27 길항제, CD28 길항제, CD70 길항제, CD80 길항제, CD86 길항제, CD137 길항제, CD276 길항제, KIRs 길항제, LAG3 길항제, TNFRSF4 길항제, GITR 길항제, GITRL 길항제, 4-1BBL 길항제, CTLA-4 길항제, A2AR 길항제, VTCN1 길항제, BTLA 길항제, IDO 길항제, TIM-3 길항제, VISTA 길항제, 및 KLRA 길항제, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니나. 바람직하게는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, PD-L2 길항제일 수 있고, 가장 바람직하게는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제일 수 있다.
면역 관문 억제제는 이러한 면역 관문 단백질을 표적으로 하는 길항제 또는 항체로서, 면역반응을 자극시키는 단백질을 증진시키거나 면역반응을 억제하는 단백질을 차단하여 면역반응에 의한 항암 효과를 나타낸다. 면역 관문 억제제는 일반적인 세포 독성 항암제보다 구토나 탈모와 같은 부작용이 적고, 치료 효과가 크다는 장점 이외에도 기억능이 우수한 면역반응 체계를 이용하기 때문에 약물 투여를 중단한 후에도 치료효과가 오랫동안 지속될 수 있으나, 본원발명의 자가조립 나노입자의 병용을 통한 항암 효과 증진에 대해서는 알려진 바가 없는 실정이다. 이에, 본 발명자들은 상기 자가조립 나노입자의 항암 효과를 시키기 위하여, 면역 관문 억제제와의 병용을 시도하였으며, 면역 관문 억제제와의 병용 제제로서, 암의 예방 또는 치료를 위한 상기 자가조립 나노입자의 의약적 용도를 제공하였다는 점에서 또 다른 기술적 특징이 있다.
본 발명의 자가조립 나노입자와 면역관문 억제제와의 혼합 중량비는 1 : 0.1 내지 1 : 0.8인 것이 바람직한데, 상기 범위 미만이거나 초과하면 암에 대한 저해 효과 및 면역세포 활성화 효능이 현저히 감소한다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 상기 자가조립 나노입자가 암, 내성암, 재발암 또는 전이암에 대해 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
또한 상기 자가조립 나노입자를 유효성분으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 자가조립 나노입자는 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 자가조립 나노입자는 용액 상에서 전구약물 형태인 나노입자로 형성되어, 세포에 전혀 독성을 나타내지 않은 매우 안정적인 상태로 존재하기 때문에 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 자가조립 나노입자의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 종양 내 국소 주입 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.01-100 mg/㎏이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 암 치료 또는 예방 방법에서, 상기 자가조립 나노입자와 면역관문 억제제를 동시에, 순차적으로, 또는 개별적으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 "동시" 투여는 자가조립 나노입자와 면역관문 억제제를 복강 내 투여 방법을 통해 한번에 투여되는 것을 의미한다.
상기 "순차적" 투여는 별개의 주입방법을 이용하여 상기 자가조립 나노입자와 면역관문 억제제를 투여하되, 각각을 비교적 연속적으로 투여하는 것을 의미하는 것으로, 투여 간격에 소모되는 시간으로 가능한 최소한의 시간을 허락한다. 상기 "개별적" 투여는 일정 시간 간격을 두고 상기 자가조립 나노입자와 면역관문 억제제를 투여하는 것을 의미한다. 상기 자가조립 나노입자와 면역관문 억제제의 투여 방법은 환자의 치료 효능 및 부작용을 고려하여 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1. 가시광선에 활성화되는 면역치료용 나노입자(LT-NPs)의 합성
양친매성 펩타이드 합성
서열번호 1의 양친매성 펩타이드를 종래에 알려진 고상 펩타이드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 서열번호 1의 양친매성 펩타이드는 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 서열번호 1의 양친매성 펩타이드의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다: NH2-Gly(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
펩타이드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu(t-butylester), Pbf(2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다: Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH.
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate]/HOBt[N-Hydroxxybenzotriazole]/NMM [4-Methylmorpholine]를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩타이드를 레진에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail)[TFA(trifluoroacetic acid)/TIS(triisopropylsilane)/EDT(ethanedithiol)/H2O=92.5/2.5/2.5/2.5]를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
VPF-FRRG-DOX로 구성된 자가조립 나노입자(LT-NP) 제조
자가조립 나노입자(LT-NP)는 2 단계 아미드 결합 반응을 통해 합성하였다(도 2). 우선 베르테포르핀(VPF)(1 g, 1.33 mmol), EDC(0.75 g, 3.93 mmol) 및 NHS(0.5 g, 6.52 mmol)를 100 mL의 무수 DMF(Dimethylformamide)에 용해시키고, 37 ℃에서 12 시간 동안 교반하여 VPF-NHS를 합성하였다. ACN/H2O의 농도구배 조건(80:20~20:80, 30 min) 하에서 상기 VPF-NHS를 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제된 VPF-NHS(1 g, 1.15 mmol)를 DMF(100 mL)에 혼합하고, 여기에 NH2-FRRG-COOH(1 g, 1.87 mmol)를 첨가하여 37 oC에서 12 시간 동안 반응시켜, VPF-FRRG-COOH를 합성하였다.
VPF-FRRG-COOH를 HPLC로 정제한 후, VPF-FRRG-COOH(800 mg, 0.62 mmol), 독소루비신(Doxorubicin)(660 mg, 1.22 mmol), EDC(0.37 g, 1.94 mmol)과 함께 혼합하여 VPF-FRRG-DOX(LT-NPs)을 합성하였다. 합성된 VPF-FRRG-DOX(LT-NPs)를 100 mL의 무수 DMF에 첨가하고, 여기에 NHS(0.25 g, 3.26 mmol)를 넣은 후, 37 ℃에서 24 시간 동안 교반하였다. ACN/H2O의 농도구배 조건(80:20~20:80, 30 min) 하에서 상기 VPF-FRRG-DOX(LT-NPs)를 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)로 정제하였다. 상기 방법을 통해 제조된 VPF-FRRG-DOX(LT-NPs)의 최종 순도는 99% 이상이라는 것을 확인하였다.
실험예 1. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 크기 분석
실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)를 식염수에 1 mg/mL의 농도로 혼합하고, 동적광산란(DLS; Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments)을 사용하여 입자크기를 분석하였다.
도 3a는 자가조립 나노입자(LT-NP)의 크기를 동적광산란(DLS)으로 측정한 결과 그래프로, 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)의 평균 입경은 87 nm이라는 것을 확인하였다.
실험예 2. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 형태 분석
생리식염수(1 mL, Saline)에 시료(실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신(DOX) 또는 베르테포르핀(VPF)) 1 mg을 혼합한 혼합액을 제조하고, 이들을 투과전자현미경(TEM; CM-200, 필립스)으로 측정하였다. 이때, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 CatB(Cathepsin-B) 단백분해효소(50 μg/mL)를 혼합하고 24 시간 반응시킨 후, 이를 투과전자현미경으로 관찰하였다(LT-NP+Cat-B).
도 3b는 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신, 베르테포르핀(VPF)의 형태를 분석하기 위해 투과전자현미경으로 촬영한 사진으로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)는 식염수 내에서 응집되지 않고 분산되어 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 자가조립 나노입자(LT-NP)는 암세포에 존재하는 카텝신-B에 의해 분해되어, 항암 효과를 나타내는 상태로 활성화되어 존재하는 것을 확인할 수 있다.
독소루비신(DOX)과 베르테포르핀(VPF)과 같은 항암제와 광감각제는 단독으로 존재할 경우에는 서로 응집되어 500 nm 이상의 매우 큰 입자형태로 존재한다는 것을 확인하였다.
실험예 3. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 안정성 분석
체액 내에서 자가조립 나노입자(LT-NP)의 안정성을 확인하고자 하였다. 이를 위해 자가조립 나노입자(LT-NP)를 BALB/c 쥐에서 확보한 혈장에 0, 1, 3, 6, 24, 48, 72 시간 보관하고 크기를 동적광산란 (DLS)으로 측정하였다.
도 3c는 마우스 혈장 내에서 자가조립 나노입자(LT-NP)의 시간에 따른 크기변화를 분석한 그래프로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)는 72시간 까지 유의적인 크기 차이가 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 자가조립 나노입자(LT-NP)는 체액 내에서 형태를 안정적으로 유지하고 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 4. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 구조 분석
생리식염수(1 mL, Saline)에 시료(실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF) 또는 독소루비신(DOX)과 베르테포르핀(VPF)의 혼합물) 10 μM을 혼합하여 혼합액을 제조하고, 이들을 UV 분광광도계(agilent cary 300; Agilent Technologies)와 형광 분광광도계(F-7000, Hitachi)로 측정하였다.
도 3d는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF) 또는 독소루비신(DOX)과 베르테포르핀(VPF)의 혼합물에 대한 UV 스펙트럼이고, 도 3e는 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP), 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF) 또는 독소루비신(DOX)과 베르테포르핀(VPF)의 혼합물에 대한 형광세기를 측정한 그래프이다.
도 3d, 및 도 3e에 나타난 바와 같이 자가조립 나노입자(LT-NP)는 독소루비신과 베르테포르핀의 피크를 모두 갖고 있는 것으로 확인되었다.
실험예 5. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 반응성 분석
카텝신 B(Cat-B)에 의한 활성화를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험군과 비교군을 제조하여 37 ℃ 인큐베이터에서 반응시켰다. 0, 9, 24 반응시간에 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RT-HPLC)를 이용하여 카텝신 B 특이적 절단을 평가하였다.
실험군(Cat-B): 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)(10 μM)를 카텝신 B 효소(10 μg)를 함유하는 MES(2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid) buffer(200 μL)에 혼합하였다.
비교군(Cat-B+inhibitor): 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)(10 μM)를 카텝신 B 효소(10 μg) 및 카텝신 B 효소 저해제(inhibitor; Z-FA-FMK) 50μM을 함유하는 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid(MES) buffer(200 μL)에 혼합하였다.
도 3f는 실시예 1의 자가조립 나노입자(LT-NP)를 카텝신 B와 각각 0, 9 및 24 시간 동안 반응시킨 후, 효소 반응에 의하여 상기 자가조립 나노입자(LT-NP)가 절단되는 것을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 분석한 결과이고, 도 3g는 실시예 1의 자가조립 나노입자(LT-NP)를 카텝신 B와 각각 0~72 시간 동안 반응시킨 후, 효소 반응에 의하여 상기 자가조립 나노입자(LT-NP)가 절단되는 것을 형광 분광광도계(F-7000, Hitachi)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3f 및 도 3g에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)는 카텝신 B에 의해 결합이 절단되어, 독소루비신과 광감각제가 방출되는 것을 확인하였다.
실험예 6. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 활성산소 (ROS) 생성 특성
ROS의 생성은 N-니트로소디메틸아닐린(N-nirosodimethylanilin (RNO))의 ROS에 의한 표백을 440 nm에서의 흡광도 감소로 관찰하는 RNO 테스트로 분석하였다.
가시광선에 대한 자가조립 나노입자(LT-NP)의 반응성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험군과 비교군을 제조하였다. 각각의 시료에 10 μM 의 RNO 표준 용액을 혼합하고, 여기에 671 nm의 레이저(SDL-671 시리즈, Shanghai Dream Laser Technology Co., Ltd.)를 이용하여 40 mW의 출력으로 250초 동안 가시광선을 조사하며 시간에 따른 440 nm의 흡광도를 측정하였다.
대조군(VPF, control): 베르테포르핀(VPF)(10 μM)를 생리식염수(1 mL, Saline)에 혼합하였다.
실험군(LT-NP-Cat-B): 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)(10 μM)를 생리식염수(1 mL, Saline)에 혼합하였다.
실험군(LT-NP+Cat-B): 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)(10 μM)를 카텝신 B 효소(10 μg)와 1.2 mM의 히스티딘을 함유하는 증류수(200 μL)에 혼합하였다.
비교군(LT-NP+Cat-B+inhibitor): 실시예 1로부터 제조된 자가조립 나노입자(LT-NP)(10 μM)를 카텝신 B 효소(10 μg), 카텝신 B 효소 저해제(inhibitor; Z-FA-FMK) 50μM 및 1.2 mM의 히스티딘을 함유하는 증류수(200 μL)에 혼합하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 3h는 VPF, LT-NP-Cat-B, LT-NP+Cat-B 및 LT-NP+Cat-B+inhibitor의 레이저 조사 시간에 따른 ROS 생성량을 도시한 그래프이다.
도 3h에 나타난 바와 같이, 측정된 440 nm의 흡광도 값을 레이저 조사 전의 흡광도 값을 1로 하여 그에 대한 흡광도 감소율을 계산하고, 계산된 값을 음의 자연로그 (-ln(y))로 취한 후, 그 계산 결과에 100을 곱하여 활성산소의 생성량으로 정의하고, 이를 시간에 따라 도시하였다.
또한, 상기 자가조립 나노입자(LT-NP) 각각의 레이저 조사 시간에 따른 ROS의 생성 효율을 각각의 기울기로 나타낼 수 있고, 이를 레이저 조사 시간 0 일 때의 ROS 생성 양자 효율을 기준으로 서로 비교하여 상대적인 ROS 생성 양자 효율을 계산할 수 있다.
상기 자가조립 나노입자(LT-NP)는 안정적인 상태에서는 가시광선에 대해 반응을 거의 하지 않는 것을 확인하였다, 이에 반해 카텝신 B로 절단된 상태에서는 ROS 생성량이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이는 베르테포르핀(VPF)의 80% 수준에 해당한다.
실험예 7. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 암세포 특이성
자가조립 나노입자(LT-NP)의 세포 내 거동을 평가하기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다. CT26 세포 또는 H9C2 세포를 35 mm 크기의 세포 배양접시에 1 x 105 개(cell) 분주하고, 여기에 실시예 1의 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 처리한 뒤, 24 시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 세포를 DPBS(Dulbecco's PBS)로 세척하고, 4% 포름알데히드로 10 분 고정한 뒤, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 5 분 동안 염색한 다음, Leica TCS SP8 공초점 현미경(Leica Microsystems GmbH)을 통해 분석하였다.
도 4a는 CT26 세포에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리하고 형광현미경으로 촬영한 결과이고, 도 4b는 H9C2 세포에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리하고 형광현미경으로 촬영한 결과이며, 도 4c는 카텝신 B 억제제를 처리한 CT26 세포에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 후, 형광현미경으로 촬영한 결과이다. 도면에서, 적색은 독소루비신(DOX)이고, 녹색은 베르테포르핀(VPF)을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)는 심근세포(H9C2)와 암세포(CT26) 모두에서 관찰되었다. 그러나 암세포(CT26)에서는 심근세포(H9C2)와 달리 세포 핵에서는 독소루비신(적색)이, 세포질에서는 베르테포르핀(녹색)이 관찰되는 것을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 자가조립 나노입자(LT-NP)는 암세포에 특이적으로 절단되어 항암 효과를 갖는 독소루비신과 베르테포르핀으로 분해되고, 분해된 독소루비신은 세포의 핵으로 이동하여 항암 효과를 나타내며, 베르테포르핀은 세포질에 남아 가시광선 조사에 의해 암세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있다.
또한, 카텝신 B 억제제를 처리한 암세포(CT26)에서는 자가조립 나노입자(LT-NP)이 분해되지 못하고, 세포질에 안정적인 형태로 존재하는 것을 확인하였다.
본 발명의 자가조립 나노입자(LT-NP)는 암세포에 대하여 특이적 활성을 가지며, 일반 세포에서는 안정적인 형태로 존재하는 것을 확인한 바, 자가조립 나노입자(LT-NP)는 정상 세포에 대해서는 독성을 나타내지 않는 것을 알 수 있다.
실험예 8. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 암세포 사멸 분석
CT26 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 5 x 103 개(cell)/웰(well) 분주한 뒤, 각 웰에 독소루비신(DOX)(0, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM), 베르테포르핀(VPF)(0, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM), 이의 혼합물(DOX+VPF), 자가조립 나노입자(LT-NP)(0, 0.01, 0.1, 1 및 10 μM)를 각각 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후에 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시켰다. 그 다음, 각 웰에 10 ㎍의 CCK 용액을 함유한 세포 배양액을 넣은 뒤, 세포를 20 분 추가 배양하고, 96-웰 플레이트의 흡광도를 VERSAmaxTM(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 분석하였다.
또한 자가조립 나노입자(LT-NP)의 항암효과를 정확히 평가하기 위하여 암세포 사멸(apoptosis)과 암세포 괴사(necrosis) 정도를 정량적 분석하였다. 상기 과정을 통해 얻은 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF), 이의 혼합물(VPF+DOX) 자가조립 나노입자(LT-NP)와 레이저가 처리된 각각의 CT26 세포를 준비하고, 5 ㎍의 Annexin V-FITC 및 10 ㎍의 PI 용액을 10 분간 처리하였다. 그 다음, 10 분간 세포 고정액과 배양하고 DAPI와 20 분 추가 배양한 뒤 유세포 분석기(BD FACSVerse, BD bioscience, USA)를 이용하여 세포사멸과 괴사 정도를 정량적으로 분석하였다.
도 4d는 CT26 세포에 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF), 이의 혼합물(VPF+DOX) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)를 각각 처리하고, 가시광선을 조사한 후 세포의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4e는 CT26 세포에 독소루비신(DOX), 베르테포르핀(VPF), 이의 혼합물(VPF+DOX) 자가조립 나노입자(LT-NP)를 각각 처리하고, 가시광선을 조사한 후, Annexin-V 및 PI 염색을 하여 세포 사멸 정도를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 4d 및 도 4e에 나타난 바와 같이, 세포 생존율만 비교하면 자가조립 나노입자(LT-NP)는 종래 약물(독소루비신, 베르테포르핀)과 크게 차이가 없는 것처럼 보인다. 그러나 세포 사멸 정도를 살펴보면, 자가조립 나노입자(LT-NP)가 종래 약물(독소루비신, 베르테포르핀)보다 유의적으로 현저히 높다는 것을 알 수 있다.
구체적으로 독소루비신(DOX)울 단독으로 처리한 경우에는 매우 적은 양의 세포 사멸만 나타났다. 베르테포르핀(VPF)을 처리한 경우에는 많은 양의 세포 사멸과 괴사가 나타났다. 그러나 late apoptosis 비율이 높은 것을 확인하였다. 이에 반해 자가조립 나노입자를 처리한 경우에는 세포 사멸 및 괴사가 다른 경우에 비해 유의적으로 높을 뿐만 아니라 late apoptosis 비율과 세포 괴사 비율이 낮고, early apoptosis 비율이 높은, 우수한 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 9. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 면역원성 세포사멸 평가
면역원성을 일으키는 세포사멸(immunogenic cell death; ICD)은 일부 항암제 계열(anthracycline 계, 옥살리플라틴(oxaliplatin), 보르테조밉(bortezomib) 등)에 의해 유도되는 세포사멸의 한 방식으로, 사멸한 dying/dead 암세포가 항원으로 작용하여 수지상 세포를 활성화하여 항종양을 유도하는 것이다. ICD가 유도된 암세포는 DAMPs(damage-associated molecular patterns)로 통칭하는 ICD 특이적인 표지자를 세포 표면에 발현하거나 세포 밖으로 배출시킨다. 대표적인 ICD 표지자의 일례로는 칼레티쿨린(calreticulin, CRT)의 세포 표면에서의 발현, ATP 배출, HMGB1 배출이 알려져 있다.
본 실험에서는 실시예 1의 자가조립 나노입자(LT-NP)에 의한 항종양 면역 유도 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
시료
먼저, CT26 세포를 35 mm 크기의 세포 배양접시에 1 x 105 개(cell) 분주하고, 각각에 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 첨가하였다. 24 시간동안 배양한 후, 절반은 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시키고(+L), 나머지 절반은 비교를 위해 가시광전을 조사하지 않은 시료로 준비하였다(-L). 상기 각각의 세포와 세포배양액을 사용하여 자가조립 나노입자(LT-NP)의 면역원성 세포사멸을 평가하였다.
Calreticulin 분석
상기 각각의 세포를 APC-conjugated CRT 항체로 12 시간 동안 염색한 후 공초점 형광 현미경 (Confocal fluorescence microscope)로 관찰 하였다.
세포외 HSP70, HMGB1 발현 분석(웨스턴블롯)
APC-conjugated CRT 항체로 세포를 염색하기 전, 각각의 세포에서 배양액을 회수하고, HMGB1 및 HSP70의 세포외 발현정도를 웨스턴 블롯을 수행하였다.
각 세포 배양액을 얻고, 세포 배양액은 4 ℃에서 30 분 동안 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology)을 처리한 후, 용해물의 단백질 양을 Pierce BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다. SDS-PAGE 후, 단백질을 PVDF 막(Bio-Rad)에 옮긴 다음, 막을 5% skim milk와 0.1% Tween-20를 포함하는 TBS 완충액(Tris-buffered saline; TBS-T)으로 처리하였다. 그리고 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다: HSP70, HMGB1 항체를 사용하였다. 막을 TBS-T로 세척하고 2차 항체로 상온에서 1 시간동안 배양하였다. 막을 TBS-T로 세척하고, EZ-Western Lumi Pico 또는 Femto reagent(DoGen)로 처리하였다. 밴드 세기를 측정하기 위하여 Fusion-Solo software(Vilber)을 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다.
ATP 함량
ATP의 경우, 상용화된 ATP 분석 키트(Beyotime Biotechnology)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 4f는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)에 대한 칼레티쿨린(calreticulin, CRT) 발현 여부를 유세포분석기로 분석한 결과이다.
도 4g는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)의 배양액으로부터 세포 외로 배출된 HSP70 및 HMGB1의 상대적 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다. 도 4h는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)에 대한의 배양액으로부터 세포 외로 배출된 ATP의 양을 정량적으로 분석한 결과이다.
도 4f 내지 도 4h에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 단독으로 처리한 경우에는, 칼레티쿨린 발현뿐만 아니라 HMGB-1, HSP70 및 ATP의 배출도 가장 낮은 것을 알 수 있다.
반면, 베르테포르핀을 단독으로 처리한 경우에는 독소루비신만을 처리한 경우보다 칼레티쿨린 발현뿐만 아니라 HMGB-1, HSP70 및 ATP의 배출이 상대적으로 증가하였다는 것을 확인하였다.
자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 경우에는 독소루비신 뿐만 아니라 베르테포르핀 보다도 유의적으로 높은 칼레티쿨린 발현, HMGB-1, HSP70 및 ATP의 배출이 나타나는 것을 확인하였다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)는 암세포에 대해 DAMPs의 방출을 유의적으로 증가시켜, 종래 항암제보다 현저히 우수한 면역원성 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있다.
실험예 10. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 면역세포 활성화
시료
100-pi 세포 배양접시에 1 x 106 개의 CT26 세포를 분주하고, 24 시간동안 안정화되도록 배양하였다. 각각에 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 첨가하였다. 24 시간동안 배양한 후, 절반은 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시키고(+L), 나머지 절반은 비교를 위해 가시광전을 조사하지 않은 시료로 준비하였다(-L). 상기 각 세포에 Balb/c 마우스로부터 분리한 비장세포(Spleen cells) 1 x 106 개를 첨가하여 24 시간 공배양하였다(도 4i).
유세포 분석
상기 각 시료로부터 성숙된 수지상 세포(matured dendritic cells)와 활성화된 T 세포(activated T cells)로의 유세포 분석기 (Flow cytometer)로 분석하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 4i는 실험예 10에 따른 실험방법을 개략적으로 도시한 것이고, 도 4j는 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)을 비장세포((Spleen cells)와 함께 배양하였을 때, 성숙된 수지상 세포(matured dendritic cells)로의 분화정도를 유세포 분석기로 분석한 결과이고, 독소루비신(DOX)(5 μM), 베르테포르핀(VPF)(5 μM) 및 자가조립 나노입자(LT-NP)(5 μM)를 각각의 CT26 세포에 처리한 후, 가시광선을 조사한 것(+L), 가시광선을 조사하지 않은 것(-L)을 비장세포((Spleen cells)와 함께 배양하였을 때, 활성화된 T 세포(activated T cells)로의 분화정도를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 4j에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 경우, 독소루비신과 베르테포르핀을 단독으로 처리한 경우에 비해 성숙된 수지상 세포와 활성화된 T 세포로의 분화가 유의적으로 높다는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자(LT-NP)는 종래 항암제 보다 많은 DAMPs를 유도함으로써, 면역세포의 활성화를 현저히 증가시킨다는 것을 알 수 있다.
실험예 11. 자가조립 나노입자(LT-NPs)의 생체 내 거동 평가
실험동물
무균 환경에서 사육된 흉선 누드 마우스(6 주령, 20 - 25 g, 수컷)를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ㅁ 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한국과학기술연구원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
상기 수컷 누드마우스에 대장암을 발현시키기 위하여, 1 x 106 개의 CT26 세포를 왼쪽 허벅지에 피하 접종하여 종양동물모델을 제작하였다. 이후 종양 부피가 약 200 내지 250 ㎣에 도달할 때까지 키웠다가 실험을 진행하였다. 시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 24 마리씩 네 그룹으로 나누어 진행하였다. VPF 투여 그룹은 베르테포르핀(VPF)을 5 mg/kg의 농도로 정맥 투여하였고, LT-NP 투여 그룹은 자가조립 나노입자(LT-NP)를 5 mg/kg의 농도로 정맥 투여하였다.
상기 그룹들은 0.5~9 시간 동안 근적외선 이미징(IVIS Lumina 기기)을 통해 생체 내 투여한 약물의 거동을 평가하였다.
2개 군의 동물모델
1군(VPF) : 베르테포르핀(VPF)을 5 mg/kg의 농도로 정맥 투여
2군(LT-NP) : 자가조립 나노입자(LT-NP)를 5 mg/kg의 농도로 정맥 투여
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 5a는 1군(VPF) 및 2군(LT-NP)으로 구분되는 동물모델에서 약물의 거동을 근적외선 이미징(IVIS Lumina 기기)을 통해 분석한 결과로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 2군이 베르테포르핀을 처리한 1군보다 암세포에서의 형광세기가 높은 것을 확인하였다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)가 종래 항암제보다 암세포 축적 효능이 유의적으로 현저히 높다는 것을 확인하였다.
도 5b는 1군(VPF) 및 2군(LT-NP)으로 구분되는 동물모델의 각 조직(간, 폐, 비장, 신장, 심장, 암)에서 축적된 약물의 농도를 분석한 결과로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 2군이 베르테포르핀을 처리한 1군보다 암세포에서의 형광세기가 높은 것을 확인하였다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)가 종래 항암제보다 암세포에 대한 축적 효능이 유의적으로 높다는 것을 다시금 확인하였다.
도 5c는 1군(VPF) 및 2군(LT-NP)으로 구분되는 동물모델의 암세포에 대한 조직학적 분석 결과로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 2군이 베르테포르핀을 처리한 1군보다 암세포에서의 축적 효능이 유의적으로 높다는 것을 다시금 확인하였다.
실험예 12. 자가조립 나노입자(LT-NPs)의 항암효과
실험동물
무균 환경에서 사육된 흉선 누드 마우스(6 주령, 20 - 25 g, 수컷)를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한국과학기술연구원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
상기 수컷 누드마우스에 대장암을 발현시키기 위하여, 1 x 106 개의 CT26 세포를 왼쪽 허벅지에 피하 접종하여 종양동물모델을 제작하였다. 이후 종양 부피가 약 200 내지 250 ㎣에 도달할 때까지 키웠다가 실험을 진행하였다. 시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 24 마리씩 네 그룹으로 나누어 진행하였다. Con(대조군)은 0일과 2일에 PBS를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여하였고, DOX 투여 그룹은 0일과 2일에 독소루비신(DOX)을 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여하였고, VPF(+L) 투여 그룹은 0일과 2일에 베르테포르핀(VPF)을 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시켰고, LT-NP(-L) 투여 그룹은 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여하였고 및 LT-NP(-L) 투여 그룹은 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시켰다.
상기 그룹들은 총 0~25일 동안 2일 마다 암크기(최대 직경 × 최소 직경2 × 0.53) 변화를 측정하였다. 7일 후에 각 그룹으로부터 혈액을 수확하여 HSP70, HMGB1, 면역원성 세포사멸된 암세포, 성숙된 수지상 세포, 활성화된 T 세포 및 IFN-γ수준을 분석하였다.
5 군의 동물모델
1군(Con) : 0일과 2일에 PBS를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여
2군(DOX) : 0일과 2일에 독소루비신(DOX)을 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여
3군(VPF+L) : 0일과 2일에 베르테포르핀(VPF)을 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선 조사
4군(LT-NP-L) : 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여
5군(LT-NP+L) : 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP)를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여하고, 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선 조사
조직학적 분석
약물을 투여하고 9 시간이 지난 후, 각 그룹으로부터 암조직을 분리하였다. 상기 암조직을 10 μm 두께의 절편으로 제작하고, 이를 DBPS로 2 회 세척한 뒤, 어두운 조건에서 15 분 동안 DAPI로 염색하였다. 상기 절편을 Leica TCS SP8 초점 현미경(Leica Microsystems GmbH)을 사용하여 촬영하였다.
면역세포 분석
각 그룹의 암세포 내에 침윤된 면역세포를 분석하고자 하였다. 7 일이 지난 후, 각 그룹을 마취하고 안락사하여 암조직을 수집하였다. 암 해리 키트(Tumor dissociation kit, Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 단일세포(monocytes)를 분리하였다. 다음 비특이적 결합을 피하기 위해 5 분 동안 FcBlock과 함께 배양하고, 암조직에서 ⅰ, ⅱ. ⅲ 세포의 비율을 확인하기 위해 1 시간 동안 항체를 이용하여 염색하였다:i.면역원성 세포사멸이 일어난 암세포(CD45 및 CRT 염색), ii.활성화된 T 세포(CD45, CD3 및 CD8 염색) 및 iii.성숙한 수지상 세포(CD11c, CD40 및 CD86 염색).
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 5d는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암세포 크기 변화를 측정한 그래프로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)와 레이저를 동시에 처리한 경우, 다른 항암제를 투여한 그룹보다 암세포 성장이 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다. 5군으로 구분되는 동물모델(LT-NP+L) 중에서 3마리는 완치가 되었다. 2군 내지 4군으로 구분되는 동물모델은 25일 이내에 종양이 성장하여 모두 사망하였고, 완치가 되는 사례는 나타나지 않았다.
도 5e는 7 일이 지난 후, 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암세포 사멸 정도를 분석하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 군은 다른 군들에 비해 암세포 사멸 정도가 유의적으로 높다는 것을 알 수 있다.
도 5f 및 도 5g는 7 일이 지난 후, 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서의 HSP70 및 HMGB1 발현정도를 웨스턴 블롯으로 분석한 그래프로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)를 처리한 군은 다른 군들에 비해 HSP70 및 HMGB1 발현정도가 유의적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 자가조립 나노입자(LT-NP)가 종양 내에 강력한 면역원성 세포사멸을 유도하여 DAMPs를 발생시킨다는 것을 알 수 있다.
도 5h 내지 도 5k는 7 일이 지난 후, 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델에서의 면역원성 세포사멸된 암세포 비율(h)과 성숙된 수지상 세포 비율(i), 활성화된 T 세포 비율(j) 및 IFN-γ의 발현정도를 평가한 그래프이다.
도 5h 내지 도 5k에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)를 투여한 군은 다른 군보다 면역원성 세포사멸된 암세포, 성숙된 수지상 세포 및 활성화된 T 세포 모두 유의하게 높은 것을 확인하였다. 이는 자가조립 나노입자(LT-NP)가 종양 내에 강력한 면역원성 세포사멸을 유도하여 DAMPs를 발생시켜, 현저한 면역세포의 침윤 및 활성을 유도하는 것을 의미한다.
실험예 13. 자가조립 나노입자(LT-NPs)와 면역관문 억제제와의 병용투여
실험동물
무균 환경에서 사육된 흉선 누드 마우스(6 주령, 20 - 25 g, 수컷)를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한국과학기술연구원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
상기 수컷 누드마우스에 대장암을 발현시키기 위하여, 1 × 106 개의 CT26 세포를 왼쪽 허벅지에 피하 접종하여 종양동물모델을 제작하였다. 이후 종양 부피가 약 200 내지 250 ㎣에 도달할 때까지 키웠다가 실험을 진행하였다. 시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 5 마리씩 다섯 그룹으로 나누어 진행하였다. Con(대조군)은 0일과 2일에 PBS를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여하였고, PD-L1 Ab 투여 그룹은 0일과 2일에 PD-L1 Ab(Bioxbio)을 10 mg/kg의 농도로 두 번 복강 투여하였고, DOX+PD-L1 Ab 투여 그룹은 0일과 2일에 독소루비신(DOX) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 각각 정맥 및 복강 투여하였고, VPF+PD-L1 Ab(+L) 투여 그룹은 0일과 2일에 베르테프로핀(VPF) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 각각 정맥 및 복강 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시켰으며, LT-NP+PD-L1 Ab(+L) 투여 그룹은 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 각각 정맥 및 복강 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시켰다.
상기 그룹들은 총 0~100일 동안 2일 마다 암크기(최대 직경 ㅧ 최소 직경2 ㅧ 0.53) 변화를 측정하였다.
5 군의 동물모델
1군(Con) : 0일과 2일에 PBS를 5 mg/kg의 농도로 두 번 투여
2군(PD-L1 Ab) : 0일과 2일에 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 두 번 투여
3군(DOX+PD-L1 Ab) : 0일과 2일에 독소루비신(DOX) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 동시에 투여
4군(VPF+PD-L1 Ab(+L)) : 0일과 2일에 베르테프로핀(VPF) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 동시에 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사
5군(LT-NP+PD-L1 Ab(+L)) : 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 동시에 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사
조직학적 분석
약물을 투여하고 9 시간이 지난 후, 각 그룹으로부터 암조직을 분리하였다. 상기 암조직을 10 μm 두께의 절편으로 제작하고, 이를 DBPS로 2 회 세척한 뒤, 어두운 조건에서 15 분 동안 DAPI로 염색하였다. 상기 절편을 Leica TCS SP8 초점 현미경(Leica Microsystems GmbH)을 사용하여 촬영하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다. 도면 상에서 'CR'은 암이 완치된 동물모델의 수를 나타낸다.
도 6a는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암크기(최대 직경 × 최소 직경2 × 0.53) 변화를 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab를 동시투여한 군(LT-NP+PD-L1 Ab(+L))은 다른 군보다 암크기가 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 특히 종래 항암제를 단독 또는 병용으로 사용한 경우에도 완치되지 못하고, 전부 사망하였는데, 본 발명에 따른 자가조립 나노입자(LT-NP)를 사용한 경우에는, PD-L1 Ab와 동시투여(LT-NP+PD-L1 Ab(+L))를 통해 전부 완치되는 것을 확인하였다.
도 6b는 7일 후, 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 암세포 사멸정도를 분석한 결과로, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab를 동시투여한 군(LT-NP+PD-L1 Ab(+L))은 다른 군보다 암세포의 사멸정도가 유의적으로 높다는 것을 확인할 수 있다. 특히 종래 항암제는 면역관문억제제와 병용투여하더라도 효과의 상승이 미미하다는 것을 확인하였다. 반면 본원발명 자가조립 나노입자(LT-NP)는 면역관문 억제제와의 병용투여를 통해 거의 완전한 암 치료효과를 나타내고 있다. 이는 현저함을 넘어서는 예측불가능한 정도의 효과라 할 것이다.
도 6c는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 6d는 1군 내지 5군으로 구분되는 동물모델의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6c 및 도 6d에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab를 동시투여한 군(LT-NP+PD-L1 Ab(+L))은 다른 군들과 달리 체중과 생존율이 오히려 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있다. 종래 항암제의 경우 체중이 감소하고, 40일 이내에 사망하였는 것을 확인하였다.
실험예 14. 자가조립 나노입자(LT-NP)의 재발 억제 효능 평가
실험동물
무균 환경에서 사육된 흉선 누드 마우스(6 주령, 20 - 25 g, 수컷)를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한국과학기술연구원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
암 재발 모델-생체 내 면역기억(immune memory)
상기 수컷 누드마우스에 대장암을 발현시키기 위하여, 1 × 106 개의 CT26 세포를 왼쪽 허벅지에 피하 접종하여 종양동물모델을 제작하였다. 이후 종양 부피가 약 200 내지 250 ㎣에 도달할 때까지 키웠다가 실험을 진행하였다. 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 각각 정맥 및 복강 투여한 후, 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하며 노출시켜, 100일 동안 사육하여 암을 완치시켰다.
상기 완치된 마우스에서 생체 내 면역기억(immune memory)을 확인하기 위하여 1 × 106 개의 CT26 세포를 처음 암세포를 접종한 위치와 동일한 위치에 피하 접종하여, 암을 재발시켜 암 재발 모델을 제조하였다(CR). 암의 크기(최대 직경 × 최소 직경2 × 0.53) 변화를 측정하였다.
대조군(naive)으로 아무런 치료도 받지 않은 수컷 누드마우스에 암세포를 접종하여 유발된 암 동물모델을 사용하였다.
2 군의 동물모델
1군(Naive) : 아무런 치료도 받지 않은 수컷 누드마우스에 암세포를 접종
2군(CR) : 암 동물모델에 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 각각 정맥 및 복강 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사하여, 암이 완치되고 100일 지난 후, 동일한 위치에 암세포를 접종하여 재발시킴
면역세포 분석
각 그룹의 암세포 내에 침윤된 면역세포를 분석하고자 하였다. 100 일이 지난 후, 각 그룹을 마취하고 안락사하여 암조직을 수집하였다. 암 해리 키트(Tumor dissociation kit, Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 단일세포(monocytes)를 분리하였다. 다음 비특이적 결합을 피하기 위해 5 분 동안 FcBlock과 함께 배양하고, 암조직에서 활성화된 T 세포(CD3, CD8, CD44 및 CD62 다중염색)의 비율을 확인하기 위해 1 시간 동안 항체를 이용하여 염색하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 6e는 두 번째 암세포를 접종하고 20일이 지난 후, 1군 및 2군으로 구분되는 동물모델의 암세포 내 활성화된 T 세포(CD45, CD3 및 CD8) 비율을 측정한 그래프이다.
도 6e에 나타난 바와 같이 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사를 통해 암이 완치된 경우(CR), 다시 암이 접종되더라도 많은 양의 기억 T 세포가 비장조직 내에 존재하게 되는 것을 확인하였다(Naive 대비 5배 더 높은 수치). 이에 반해 2군(Naive)은 기억 T 세포가 매우 맞은 농도로 존재하는 것을 알 수 있다.
도 6f는 두 번째 암세포를 접종하고 20일이 지난 후, 1군 및 2군으로 구분되는 동물모델의 암크기 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6f에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사를 통해 암이 완치된 경우(CR), Naive 군에 비해 암 성장이 크게 억제되는 것을 확인하였다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)가 생체 내에서 암 특이적 면역기억을 확립시켜 추가적인 암 재발을 방지할 수 있다.
도 6g는 두 번째 암세포를 접종하고 20일이 지난 후, 1군 및 2군으로 구분되는 동물모델의 혈액 내 여러 사이토카인의 발현농도를 분석한 결과이다. 도 6g에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사를 통해 암이 완치된 경우(CR), Naive 군에 비해 사이토카인의 발현농도가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)를 투여하면, 면역관문 억제제의 효능을 현저히 극대화하여 종양을 완치할 수 있고, 추후 암의 재발을 효과적으로 방지할 수 있다.
실험예 15. 자가조립 나노입자(LT-NP)와 면역관문 억제제 병용 투여의 암 전이 억제 효능 평가
실험동물
무균 환경에서 사육된 흉선 누드 마우스(6 주령, 20 - 25 g, 수컷)를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한국과학기술연구원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
암 전이 모델
상기 수컷 누드마우스에 대장암을 발현시키기 위하여, 1 × 106 개의 CT26 세포를 왼쪽 허벅지에 피하 접종하여 종양동물모델을 제작하였다. 7일 후에 다음과 같이 시료를 투여하였다. Con(대조군)은 0일과 2일에 PBS를 5 mg/kg의 농도로 두 번 정맥 투여하였고, PD-L1 Ab 투여 그룹은 0일과 2일에 PD-L1 Ab을 10 mg/kg의 농도로 두 번 복강 투여하였고, VPF+PD-L1 Ab 투여 그룹은 0일과 2일에 베르테프로핀(VPF) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 각각 정맥 및 복강 투여하고 6 시간 후 671 nm 레이저에 100 mW로 15 분 동안 가시광선을 조사하며 노출시켰으며, LT-NP+PD-L1 Ab(+L) 투여 그룹은 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 각각 정맥 및 복강 투여하고 6 시간 후 671 nm 레이저에 100 mW로 15 분 동안 가시광선을 조사하며 노출시켰다.
24 시간이 지난 후, 상기 그룹들에 1 × 105 개의 CT26 세포를 꼬리 정맥을 통해 추가로 주입하여 폐 전이를 유도하였다. 폐 전이를 유도하고 20일이 지난 후, 폐 조직을 분리하고 H&E 및 면역조직염색을 수행하였다.
4 군의 동물모델
1군(Con) : 0일과 2일에 PBS를 5 mg/kg의 농도로 두 번 투여+24 시간 후 CT26 세포를 꼬리 정맥으로 투여
2군(PD-L1 Ab) : 0일과 2일에 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 두 번 투여+24 시간 후 CT26 세포를 꼬리 정맥으로 투여
3군(VPF+PD-L1 Ab(+L)) : 0일과 2일에 베르테프로핀(VPF) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 동시에 두 번 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사+24 시간 후 CT26 세포를 꼬리 정맥으로 투여
4군(LT-NP+PD-L1 Ab(+L)) : 0일과 2일에 자가조립 나노입자(LT-NP) 5 mg/kg과 PD-L1 Ab 10 mg/kg를 동시에 두 번 투여한 후 671 nm 레이저에 40 mW로 250초 동안 가시광선을 조사+24 시간 후 CT26 세포를 꼬리 정맥으로 투여
면역조직염색
면역조직염색을 위하여 상기 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델로부터 전이 암 조직(폐 조직)을 회수하고, 이를 10% 중성 완충 포르말린(formalin)으로 고정시켰다. 그 뒤, 고정된 조직을 파라핀으로 고정하고, 4 μm의 크기로 절편화하였다. 상기 절편을 56 ℃에서 1시간 건조시켰다. 염색을 위하여 탈파라핀화 하는 과정을 거친 뒤, EZprep으로 조직을 재수화하고, 반응 버퍼(ventana medical systems)로 세척한 뒤, Ki67, CD8+ 항체를 Tri-EDTA 완충액과 함께 90 ℃에서 30분 동안 열처리한 뒤, 항체를 제거하고 현미경으로 조직을 확인하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 7a는 실험예 15의 실험 설계를 개략적으로 도시한 것이고, 도 7b는 폐 전이를 유도하고 20일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델에 대한 폐 조직의 사진이다.
도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사한 4 군의 경우, 폐에서 종양이 발견되지 않았다. 이외에 1군, 2군 및 3군에서 폐에서 종양이 다수 발견되었다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사를 통해 암 전이를 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.
도 7c는 폐 전이를 유도하고 20일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델에서 분리한 폐 조직에 대한 H&E 염색 결과와 면역조직염색 결과이다. 도 7d는 폐 전이를 유도하고 20일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델에서의 전이 암조직에서 면역세포의 침투 정도를 면역조직염색으로 분석한 결과이다.
도 7c 및 도 7d에 나타난 바와 같이, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사한 4 군의 경우, 다른 군에 비해 폐 조직에서 유의하게 많은 수의 세포 독성 T 세포(CD8+ T cell)가 침윤되어 있는 것을 확인하였다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)가 생체 내에서 강한 면역원성을 유도하는 것을 알 수 있다.
도 7e는 폐 전이를 유도하고 20일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델의 폐 조직 무게를 측정한 결과로, 이에 따르면, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사한 4 군의 경우, 정상군(Naive)와 유의적 차이가 관찰되지 않았다. 그러나 1군, 2군 및 3군에서는 폐 무게가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
자가조립 나노입자(LT-NP)는 종래 항암제와 달리, 암의 전이를 완전 차단하여, 폐 무게 변화를 야기하지 않는다는 것을 알 수 있다.
도 7f는 폐 전이를 유도하고 20일 후의 1군 내지 4군으로 구분되는 동물모델의 생존율을 분석한 결과로, 이에 따르면, 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사한 4 군의 경우, 다른 군에 비해 유의적으로 생존율이 증가하는 것을 알 수 있다. 즉 자가조립 나노입자(LT-NP)와 PD-L1 Ab 및 가시광선 조사한 4 군의 경우, 생존율이 100% 유지되는데 반해, 아무처리 하지 않은 1군은 20일에 100% 사망하고, 종래 항암제를 투여한 2군과 3군은 면역관문 억제제와 병용투여하였음에도 30일을 넘기지 못하고 다 사망하였다.
자가조립 나노입자(LT-NP)는 종래 항암제와 달리, 암 세포의 사멸 뿐만 아니라 생체 내 강한 면역원성까지 유도하므로, 암의 완치뿐만 아니라 암의 재발과 전이까지 효과적으로 예방하므로, 생존율이 종래 항암제와 달리 100%를 달성하고 있다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Visible light-activatable nanoparticles for cancer immunotherapy and use thereof <130> HPC9889 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amphipathic peptide <400> 1 Phe Arg Arg Gly 1

Claims (7)

  1. 하기 일반식 1로 표시되는 양친매성 펩티드;를 중심으로 양 말단에 소수성 항암제 및 광감각제가 각각 결합되어 구성된 복합체;를 포함하는 자가조립 나노입자.
    [일반식 1]
    Xaa1-Arg-Arg-Gly
    상기 일반식에서,
    상기 Xaa는 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 중에서 선택되는 어느 하나이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자가조립 나노입자의 평균 직경은 50 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 소수성 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 광감각제는 프로토포르피린IX(Protoporphyrin IX), 베르테포르핀(Verteporfin), 포스캔(Foscan), 레뷸란(Levulan), 메트빅스(Metvix), 헬스빅스(Hexvix), 퍼리틴(Purlytin), 포토클로어(Phothchlor), 루텍스(Lutex) 및 탈라포르핀(Talaporfin)로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자가조립 나노입자.
  5. 제1항에 따른 자가조립 나노입자를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암, 피부암, 내성암, 재발암 및 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitor)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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