KR20220149476A

KR20220149476A - 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물 및 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물

Info

Publication number: KR20220149476A
Application number: KR1020220054265A
Authority: KR
Inventors: 한재용; 우승제; 박진세
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2022-05-02
Publication date: 2022-11-08

Abstract

본 발명은 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물 및 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물은 바람직하게는 바이러스 백신 생산용 조성물로서 활용될 수 있고, 상기 조성물을 사용하여 높은 역가를 가지는 바이러스 생산 방법을 제공할 수 있다. 또한, 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물은 바람직하게는 바이러스 저항성 조류 세포 또는 바이러스 저항성 조류 제조 방법을 제공할 수 있다.

Description

바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물 및 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물{COMPOSITION FOR PREPARING AVIAN CELLS FOR PREPARING VIRUS VACCINE AND COMPOSITION FOR PREPARING VIRUS-RESISTANT AVIAN}

본 발명은 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물 및 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물에 관한 것이다.

조류 인플루엔자 바이러스 (Avian influenza virus, AI)는 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A virus)에 속하며 AI로 인한 피해는 국내뿐만 아니라 전 세계적으로도 심각하다. 우리나라에서는 2003년 12월부터 2016년 4월까지 총 6차례 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스가 발병했고, 같은 해 11월에는 H5N6형의 새로운 변종 돌연변이 고병원성 조류 바이러스가 발병했다. 해외에서는 2003년부터 태국, 베트남 등 동남아시아에서 주로 발병했으나 이후 러시아, 몽골, 유럽, 아메리카, 아프리카, 인도 등 전 세계적으로 발병하며 그 피해가 커지고 있다. 조류 인플루엔자 바이러스 이외에도, 조류에서 감염되는 여러 바이러스 질환들은 발병할 경우 닭, 오리, 거위 등을 사육하는 축산 분야에 치명적인 피해를 끼칠 수 있을 뿐 아니라, 사람에게 전파될 경우, 발열, 오한, 기침, 인후통, 폐렴, 호흡부전, 심하게는 사망에 이르는 경우가 있어 조절이 필요하다.

기존의 인플루엔자 A 바이러스 백신은 주로 달걀에 바이러스를 접종하여 배양하는 방식으로 생산되었다. 하지만 기존의 방법은 고병원성 인플루엔자를 생산하기 어려웠고, 빈번한 바이러스 유전자 변형이 일어났으며, 생산 비용이 높고 가금 질병이 도래했을 때는 달걀을 이용한 백신 생산이 어려운 문제점이 있었다. 이에 따라 달걀 기반의 백신을 대체할 목적으로 세포 배양을 매개로 한 백신이 개발되었다. 하지만 인플루엔자 바이러스 Hemaglutinin (HA) 단백질의 가공을 위해 외부에서 트립신(Trypsin)을 처리해야 하고 높은 트립신 농도는 바이러스 생산량에 영향을 끼친다는 문제점이 있었다.

인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 단백질의 전사 및 번역을 위해 다양한 숙주 단백질을 이용한다 (Aartian, 2016, Nature Reviews Microbiology; Karlas, 2010, Nature Letters). 닭의 경우. 조류 인플루엔자 바이러스를 인지하는 RIG-I(Retinoic acid inducible gene 1) 수용체가 없고 MDA5(Melanoma differentiation associated protein 5)가 바이러스를 인지하는 주요 수용체이다. MDA5에 의한 바이러스 인식 후 면역반응이 유도되어 바이러스를 제거한다. TMPRSS2(Type II transmembrane protease, serine 2)는 트립신과 비슷한 단백질 분해 효소이고, ST3GAL1(ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1)은 당단백질 혹은 당지질로 Sialic acid를 옮겨 바이러스와 세포막의 융합을 돕는다.

반면, 사람의 B4GALNT2 (Beta-1,4 N-acetyl galactosaminyl transferase 2)는 Sialic acid를 포함한 당에 GalNAc를 붙여 바이러스가 Sialic acid를 이용하지 못하도록 하여 바이러스와 세포막의 융합을 방해한다고 알려져 있다.

따라서, 상기 세포의 바이러스 저항성을 조절하는 유전자를 촉진 또는 억제함으로써, 바이러스 백신을 생산하거나, 바이러스 자체에 대한 저항성을 가지는 형질전환 개체를 개발할 수 있다면, 바이러스 감염증에 대한 해결책을 제시할 수 있을 것이다.

일본 공개특허 제 2018-534948호

본 발명은 바이러스 저항성을 조절함으로써, 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 상기 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물을 포함하는 바이러스 백신 생산용 조성물 및 바이러스 백신 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 바이러스 백신 저항성을 가진 조류 세포 제조용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 바이러스 백신 저항성을 가진 조류 세포 제조용 조성물을 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. MDA5(melanoma differentiation associated protein 5) 또는 TLR3(toll like receptor 3)를 결실시키는 물질; 또는 TMPRSS2(type ?protease, serine 2) 또는 ST3GAL1(ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1)를 과발현시키는 물질; 을 포함하는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 MDA5 또는 TLR3를 결실시키는 물질은 MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 물질은 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터인 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.

4. 위 1에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 기러기, 비둘기, 꿩, 봉관조, 칠면조, 메추라기, 고니, 공작, 원앙, 플라밍고, 키위새, 뻐꾸기, 두루미, 제비, 까마귀, 황새, 왜가리, 도요새, 물떼새, 올빼미, 부엉이, 딱따구리, 독수리, 매, 앵무새, 참새, 꾀꼬리 또는 멧새를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.

5. 위 1에 있어서, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬 바이러스 및 기관지염 바이러스를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.

6. 위 1에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.

7. 위 1 내지 6 중 어느 하나의 조성물이 처리된 조류 세포를 포함하는 바이러스 백신 생산용 조성물.

8. 조류 세포에서 MDA5 또는 TLR3를 결실시키거나, 또는 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 제1 단계; 및 상기 제1 단계를 거친 조류 세포를 약독화한 바이러스에 감염시키는 제2 단계를 포함하는 바이러스 백신 생산 방법.

9. 위 8에 있어서, 상기 MDA5 또는 TLR3의 결실은 상기 조류 세포에 MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 물질을 처리하여 수행되는 바이러스 백신 생산 방법.

10. 위 8에 있어서, 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1의 과발현은 상기 조류 세포에 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 처리하여 수행되는 바이러스 백신 생산 방법.

11. 위 8에 있어서, 상기 바이러스의 감염은 상기 조류 세포에 바이러스를 주입하거나 또는 바이러스 유전체 염기서열을 포함하는 벡터를 주입하여 수행되는 바이러스 백신 생산 방법.

12. 위 8에 있어서, 상기 2단계를 거친 조류 세포를 배양하여 그로부터 바이러스를 얻는 제3 단계를 더 포함하는 바이러스 백신 생산 방법.

13. 위 8에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 백신 생산 방법.

14. B4GALNT2(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2)를 과발현시키는 물질을 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.

15. 위 14에 있어서, 상기 B4GALNT2는 인간 B4GALNT2인 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.

16. 위 14에 있어서, 상기 B4GALNT2를 과발현시키는 물질은 B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터인 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.

17. 위 14에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 기러기, 비둘기, 꿩, 봉관조, 칠면조, 메추라기, 고니, 공작, 원앙, 플라밍고, 키위새, 뻐꾸기, 두루미, 제비, 까마귀, 황새, 왜가리, 도요새, 물떼새, 올빼미, 부엉이, 딱따구리, 독수리, 매, 앵무새, 참새, 꾀꼬리 또는 멧새를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.

18. 위 14에 있어서, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬 바이러스 및 기관지염 바이러스를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.

19. 위 14에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.

20. 위 14 내지 19 중 어느 하나의 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물이 처리된 원시생식세포 또는 배반엽세포를 포함하는 바이러스 저항성 조류 제조용 조성물.

21. 조류 세포에서 B4GALNT2를 과발현시키는 단계를 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.

22. 위 21에 있어서, 상기 B4GALNT2는 인간 B4GALNT2인 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.

23. 위 21에 있어서, 상기 B4GALNT2의 과발현은 B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 상기 조류 세포에 처리하여 수행되는 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.

24. 위 21에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.

본 발명의 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물을 통해 바이러스 백신 생산용 조성물을 제공한다. 이는 종래보다 더 높은 생산 효율을 가지는 바이러스 백신 생산 방법을 제공할 수 있어, 바람직하게는 바이러스 백신 생산 공정에 활용할 수 있다.

또한, 본 발명의 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물을 통해 바이러스 저항성 조류 제조 방법을 제공한다. 이는 바람직하게는 조류 인플루엔자, 뉴캐슬병 바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스 등에 대한 저항성을 가진 형질전환 조류를 제조할 수 있어 축산 분야에서 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 대한 모식도로서, 구체적으로는 MDA5를 결실시키거나, TMPRSS2, ST3GAL1의 발현을 유도하면 바이러스 백신의 전구체의 생산 효율이 증가하고, 인간 유래 B4GALNT2를 발현시키면 바이러스 생산을 억제할 수 있다.
도 2는 조류 유전체 편집 기술을 활용하여 닭 섬유아세포(DF-1)에서 닭 MDA5, TLR3 또는 MDA5와 TLR3를 동시에 타깃하여 유전자 변형을 유도한 후 야생형 유전자형과 대비해서 유전자 편집된 양상을 보여주는 그림이다.
도 3은 바이러스 RNA 유사체인 poly I:C 및 저병원성 인플루엔자 A 바이러스를 야생형 닭 섬유아세포, 닭 MDA5 혹은 TLR3가 제거된 섬유아세포, 그리고 닭 MDA5, TLR3가 동시에 제거된 섬유아세포에 처리했을 때 인터페론 및 하위 유전자들의 활성/발현 유도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 닭 MDA5가 제거된 세포주에 닭 MDA5를 과발현하면 나타나는 효과와 저병원성 인플루엔자 A 바이러스를 야생형 닭 섬유아세포, 닭 MDA5가 제거된 섬유아세포에 감염시켰을 때 생산된 바이러스 역가를 비교한 그래프이다.
도 5는 닭 섬유아세포에 TMPRSS2를 과발현하고 TMPRSS2 유전자 발현량 증가를 보여주고 TMPRSS2 과발현 세포주가 조류 인플루엔자 바이러스 생산을 증가시킴을 보여주는 그래프이다.
도 6은 닭 섬유아세포에 ST3GAL1을 과발현하고 ST3GAL1 유전자 발현량 증가를 보여주고 ST3GAL1 과발현 세포주가 조류 인플루엔자 바이러스 생산을 증가시킴을 보여주는 그래프이다.
도 7은 닭 섬유아세포에 TMPRSS2, ST3GAL1을 동시에 과발현 하는 세포주가 조류 인플루엔자 바이러스 생산을 증가시킴을 보여주는 그래프이다.
도 8은 사람 B4GALNT2의 기능을 모식도로 보여주고 PiggyBac을 매개로 사람 B4GALNT2를 과발현 했을 때 그 발현을 보여주는 그림이다.
도 9는 CRISPR/Cas9을 매개로 닭 GAPDH 뒤에 사람 B4GALNT2를 knock-in하기 위한 모식도 및 유전자 편집된 세포 클론의 유전자형을 보여주는 그림이다. 또한 GAPDH 뒤에 knock-in된 사람 B4GALNT2의 발현을 보여준다.
도 10은 사람 B4GALNT2가 도입된 닭 섬유아세포주가 야생형 닭 섬유아세포보다 바이러스가 이용하는 Sialic acid와의 결합이 저해되어 바이러스 역가가 유의적으로 낮고 세포 활성이 높음을 보여주는 그림이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적인 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 의미를 따른다.

본 발명은 MDA5(melanoma differentiation associated protein 5) 또는 TLR3(toll like receptor 3)를 결실시키는 물질; 또는 TMPRSS2(type Ⅱ transmembrane protease, serine 2) 또는 ST3GAL1(ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1)를 과발현시키는 물질; 을 포함하는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 MDA5 또는 TLR3를 결실시키는 물질은 정상적인 기능을 수행하는 상기 유전자의 산물 단백질의 합성을 저해하는 것이라면, 그 종류는 제한되지 않는다. 예를 들면, MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합하는 gRNA(guide RNA)를 들 수 있고, 상기 MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합하는 TALEN(transcription activator-like effector nuclease) 또는 ZFN(zinc-finger nuclease)을 코딩하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 상기 MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합할 수 있거나, 상보적으로 결합하는 단백질을 코딩할 수 있다면 염기 서열에 관계 없이 본 발명의 MDA5 또는 TLR3를 결실시키는 물질에 해당할 수 있고, 해당 서열은 당업자에 의해 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

상기 gRNA는 타깃 유전자의 염기서열 또는 이에 대응되는 서열에 상보적인 RNA로서, 표적 DNA 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 gRNA는 두 개의 RNA, 즉 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 gRNA는 바람직하게는, 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

본 발명에서 상기 MDA5 또는 TLR3는 조류 세포에서 외부 RNA 리간드를 인식하여 외부 항원에 대한 선천성 면역기전을 활성화하는 역할을 수행할 수 있으므로, 상기 MDA5 또는 TLR3가 결실되는 경우, 조류 세포에서 바이러스의 복제 및 조립이 더욱 촉진될 수 있다. 반면, MDA5의 발현이 상보적인 siRNA를 처리하는 등으로 감소하는 경우에는, 상기 효과가 발휘되지 않을 수 있다. 상기 MDA5 또는 TLR3는 조류에서 보존되어 있어, 조류의 종에 관계 없이 모든 조류에서 상기 효과를 발휘할 수 있으나, RIG-1(Retinoic acid inducible gene 1)이 결실된 조류에서 더욱 효과적일 수 있다. 상기 RIG-1(Retinoic acid inducible gene 1)이 결실된 조류는 구체적으로 닭일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, MDA5 유전자 또는 TLR3 유전자 중 하나를 결실시키는 물질을 조류 세포에 처리하는 경우 그렇지 않은 경우에 비해 더 높은 바이러스 역가를 나타낼 수 있고, 바람직하게는 MDA5 및 TLR3가 모두 결실되거나 그 발현이 모두 감소된 경우, 대조군 대비 30 배 가량의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 물질은 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터는 각각 서열번호 1의 TMPRSS2 염기서열 또는 서열번호 2의 ST3GAL1 염기서열 또는 각각의 염기서열의 상동체를 포함할 수 있다. 상기 상동체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 일부 상이한 염기서열이 있더라도 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산과 동일한 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있고, 일부 아미노산 서열이 상이하더라도 코딩된 단백질의 기능에 차이가 없거나 효과의 일부 증감 정도의 차이만이 존재하는 염기 서열을 포함할 수도 있다. 상기 대응되는 서열은 종간 염기 변이에 의해 달라지는 서열을 포함할 수 있고, 일부 염기 변이가 있더라도, 그 서열의 얼라인(align) 및 서열 대비를 통해 그 유전자의 확인이 가능하다. 예를 들면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 임의의 염기서열을 얼라인했을 때, 최소 60 %의 상동성, 바람직하게는 70 %, 보다 바람직하게는 80 %, 보다 더 바람직하게는 90 %, 가장 바람직하게는 99 %의 상동성을 가지는 서열이 본 발명의 상기 상동체에 해당할 수 있다.

본 발명에서 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1는 조류 세포에서 외부 바이러스가 세포 내부로 유입되는 것을 촉진할 수 있으므로, 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1이 과발현되는 경우, 조류 세포에서 바이러스 복제 및 조립이 더욱 촉진될 수 있다. 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1이 조류에서 보존되어 있으므로, 조류의 종에 관계 없이 상기 효과를 발휘할 수 있으나, 바람직하게는 RIG-1이 결실된 조류에서 더욱 효과적일 수 있다. 상기 RIG-1이 결실된 조류는 구체적으로 닭일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, TMPRSS2 또는 ST3GAL1 중 하나가 과발현되는 물질을 조류 세포에 처리하는 경우 그렇지 않은 경우에 비해 더 높은 바이러스 역가를 나타낼 수 있고, 바람직하게는 TMPRSS2 및 ST3GAL12 모두를 과발현 하는 경우, 10 내지 100 배의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물은 MDA5(melanoma differentiation associated protein 5) 또는 TLR3(toll like receptor 3)를 결실시키는 물질; 또는 TMPRSS2(type Ⅱ transmembrane protease, serine 2) 또는 ST3GAL1(ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1)를 과발현시키는 물질; 을 담지한 재조합 벡터를 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 상기 물질들을 타겟 세포로 전달할 수 있는 것이라면, 그 서열에 관계 없이 당업자에 의해 제한 없이 사용될 수 있다. 재조합 벡터의 예를 들면, 플라스미드(plasmid), 박테리오파지(bacteriophage), 코스미드(cosmid), BAC(bacteria artificial chromosome), YAC(yeast artificial chromosome), 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스(adeno-associated virus), 비바이러스성 벡터일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 조류는 조강(Avian)에 속하는 조류라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 예를 들면, 닭, 오리, 거위, 기러기, 비둘기, 꿩, 봉관조, 칠면조, 메추라기, 고니, 공작, 원앙, 플라밍고, 키위새, 뻐꾸기, 두루미, 제비, 까마귀, 황새, 왜가리, 도요새, 물떼새, 올빼미, 부엉이, 딱따구리, 독수리, 매, 앵무새, 참새, 꾀꼬리 또는 멧새 등을 포함할 수 있다, 바람직하게 상기 조류는 닭일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 바이러스는 상기 조류 세포에 전달될 수 있는 바이러스라면 숙주의 종에 관계 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 구체적으로는 조류를 숙주로 하고, RNA를 유전체로 하는 바이러스일 수 있다. 조류를 숙주로 하고, RNA를 유전체로 하는 바이러스의 예를 들면, 조류 인플루엔자(Avian influenza, AI), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV) 또는 닭 전염성 기관지염 바이러스(Avian infectious bronchitis virus) 가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 MDA5또는 TLR3를 결실시키는 물질; 또는 TMPRSS2또는 ST3GAL1을 과발현시키는 물질; 을 포함하는 조성물이 처리된 조류 세포를 포함하는 바이러스 백신 생산용 조성물에 관한 것이다.

상기 MDA5 또는 TLR3를 결실시키는 물질; 또는 TMPRSS2또는 ST3GAL1을 과발현시키는 물질; 을 포함하는 조성물이 처리된 조류 세포는 앞서 언급하였듯, 조류에서 상기 MDA5, TLR3, TMPRSS2 또는 ST3GAL1의 작용기전이 보존되어 있으므로 세포 종류에 제한되지 않고, 당업자에 의하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 표피세포(epithelial cell), 간세포(hepatocyte), 림프구(lymphocyte), 섬유아세포(fibroblast), 원시생식세포(primordial germ cell, PGC), 내피세포(endothelial cell), 알세포(egg cell) 등일 수 있다. 다만 바람직하게는, 분열 속도가 빠르고, 배양이 용이한 섬유아세포(fibroblast) 일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 조류 세포에서 MDA5 또는 TLR3를 결실시키거나, 또는 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 제1 단계; 및

상기 제1 단계를 거친 조류 세포를 약독화한 바이러스에 감염시키는 제2 단계를 포함하는 바이러스 백신 생산 방법에 관한 것이다.

상기 바이러스 백신 생산 방법 과정에 있어서, 상기 제1 단계는 앞서 언급한 조류 세포에 상기 MDA5 또는 TLR3를 결실시키는 물질; 예를 들면 MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합하는 gRNA가 포함된 조성물을 처리하거나, TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 물질; 예를 들면 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 처리하는 것일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않고, 당업자가 사용하는 유전자 발현 조절 방법을 통하여 수행될 수도 있다.

상기 제 2단계의 약독화한 바이러스에 감염시키는 단계에서, 감염시키는 약독화 바이러스와 생산되는 백신이 타깃으로 하는 바이러스는 동일한 바이러스이거나, 동일한 항원을 공유하는 것일 수 있다. 또한, 상기 바이러스에 감염시키는 단계는 앞서 언급한 백신의 타깃이 되는 바이러스 자체를 상기 제 1 단계를 거친 조류 세포에 주입하는 것일 수 있고, 또는 백신의 타깃이 되는 바이러스 유전체를 담지한 벡터를 조류 세포에 전달하여, 바이러스가 세포 내에서 합성되도록 하는 것일 수도 있다. 상기 백신의 타깃이 되는 바이러스 유전체를 담지한 벡터는 앞서 언급하였던 것처럼, 그 종류에 제한되는 것은 아니고, 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, BAC, YAC, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스 또는 비바이러스성 벡터 등 당업자가 제한 없이 선택해서 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 바이러스 백신 생산 방법은 상기 2단계를 거친 조류 세포를 배양하여, 그로부터 바이러스를 얻는 제 3단계를 더 포함할 수도 있다. 상기 2단계를 거친 조류 세포를 배양하면, 앞서 주입한 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 세포에서 새로운 바이러스 단백질이 합성될 수 있고, 그로부터 새로운 바이러스가 조립될 수 있다. 상기 배양하는 시간은 실험 조건에 따라 당업자에 의하여 제한 없이 선택될 수 있다. 배양 시간의 증가는 바이러스 유전체의 복제 및 바이러스의 조립을 증가시킬 수 있으나, 일정 수치를 초과하는 경우, 세포의 사멸로 인하여 바이러스 백신의 회수율의 증가에 영향이 없을 수 있다. 배양 시간은 적어도 6 시간 이상 배양하는 것 일수 있고, 상한은 제한되지 않으나 예를 들면, 120 시간, 96 시간 또는 72 시간 일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다. 이후 상기 조립된 바이러스는 당업자에 의해 공지된 방법에 의하여, 추출 및 분리될 수 있다. 예를 들면, 조류 세포 배양액을 파쇄한 후, 원심분리하여 얻은 상층액에 포함된 바이러스를 농축하여 얻을 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 바이러스 백산 생산 방법에 의하는 경우, 종래의 방법에 비하여 더 높은 역가의 바이러스 백신을 수득할 수 있다. 앞서 언급하였던 것처럼 일 실시예에서 본 발명의 상기 조류 세포에서 MDA5 또는 TLR3를 결실시키거나, 또는 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 제1 단계를 거친 조류 세포의 경우, 그렇지 않은 대조군에 비하여 더 높은 바이러스 역가를 보이는 것을 확인하였고, 바람직하게는 상기 MDA5 및 TLR3 가 모두 결실되거나 또는 그 발현이 억제되고, TMPRSS2 및 ST3GAL1이 모두 과발현되는 경우에, 가장 높은 바이러스 역가를 보일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 B4GALNT2(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2)를 과발현시키는 물질을 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 바이러스 저항성은 바이러스가 세포 내로 주입되는 것이 차단되는 것일 수 있고, 주입된 바이러스가 유전자를 복제하여 다음 세대의 바이러스의 조립을 억제하는 것일 수 있고, 또는 조립된 바이러스의 방출을 억제하는 것일 수 있다. 상기 기전에 제한되지 않고, 바이러스 감염에 대해 저항성을 가지는 것을 의미한다.

상기 바이러스 저항성에서 저항성을 가지는 바이러스는 조류를 숙주로 하는 바이러스라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 앞서 언급한 것과 같이, 조류 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬 바이러스 또는 닭 전염성 기관지염 바이러스 등이 이에 포함될 수 있고, 이외에도 DNA를 유전체로 가지는 전염성 후두 기관염 바이러스(infectious laryngotracheitis virus, ILTV), 허피스바이러스(Herpes virus), 마렉병바이러스(Marek's disease virus, MDV), 조류 백혈병 바이러스(Avian leucosis virus, ALV) 및 전염성 훼브리셔스낭병 바이러스(infectious bursal of fabricius disease virus, IBDV)가 포함될 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 B4GALNT2는 조류 세포에서 외부 바이러스의 세포와의 결합 친화도(binding affinity)를 조절하여 바이러스 유전물질의 세포 내 유입을 억제할 수 있으므로, B4GALNT2가 과발현되는 경우, 조류 세포에서 바이러스에 대한 저항성이 증가할 수 있다. 조류 세포는 일반적으로 B4GALNT2가 발현되지 않으므로, 조류의 종에 관계 없이, 본 B4GALNT2에 의한 효과가 발휘될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 일 실시예에서, 닭 섬유아세포에 인간 B4GALNT2를 과발현 시키는 경우 그렇지 않은 경우에 비해 3배 내지 4배 낮은 바이러스 역가를 나타내는 것을 확인하였다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 B4GALNT2는 종에 관계없이, B4GALNT2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 상동체라면 제한 없이 포함될 수 있다. B4GALNT2 단백질을 코딩하는 염기서열은 예를 들면 인간, 쥐, 염소, 양, 고양이, 돼지, 개구리, 원숭이, 침팬지, 햄스터, 개, 또는 도마뱀 등의 종에서 보존되는 B4GALNT2 유전자 염기서열일 수 있고, 더욱 구체적으로는 서열번호 3의 염기서열일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 B4GALNT2를 과발현시키는 물질은 B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터일 수 있다. 앞서 언급하였듯, B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터는 그 종류에 제한되는 것은 아니고, 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, BAC, YAC, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스 또는 비바이러스성 벡터 등 당업자가 제한 없이 선택해서 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물에서 상기 조류는 앞서 언급한 조류, 예를 들면, 닭, 오리, 거위, 기러기, 비둘기, 꿩, 봉관조, 칠면조, 메추라기, 고니, 공작, 원앙, 플라밍고, 키위새, 뻐꾸기, 두루미, 제비, 까마귀, 황새, 왜가리, 도요새, 물떼새, 올빼미, 부엉이, 딱따구리, 독수리, 매, 앵무새, 참새, 꾀꼬리 또는 멧새일 수 있고, 조류 세포는 세포의 종류와 무관하게 발명의 범위에 포함될 수 있으나, 바람직하게는 만능성(totipotency)을 가진 조류 세포, 예를 들면 줄기세포 또는 배반엽 세포(blastocyst)일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 B4GALNT2(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2)를 과발현시키는 물질을 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물이 처리된 원시생식세포 또는 배반엽 세포를 포함하는 바이러스 저항성 조류 제조용 조성물에 관한 것이다.

상기 원시생식세포 또는 배반엽 세포는 조류 개체로서 분화할 수 있는 전능성을 가진 세포로서, 상기 B4GALNT2(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2)를 과발현시키는 물질을 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물을 원시생식세포 또는 배반엽 세포에 주입하여 발현시킨 것 일 수 있다. 상기 조성물이 주입된 원시생식세포 또는 배반엽 세포를 성체로 분화시키는 방법은 공지된 방법에 따라 제한 없이 실시될 수 있다.

본 발명은 또한 조류 세포에서 B4GALNT2를 과발현시키는 단계를 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법에 관한 것이다.

상기 조류 세포에서 B4GALNT2를 과발현시키는 단계는 앞서 언급하였듯, 당업자가 사용할 수 있는 유전자 과발현 방법, 예를 들면 B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 상기 조류 세포에 처리하여 수행될 수도 있고, 바람직하게는 닭의 배반엽 세포에 인간 B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 처리하는 단계일 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 바이러스 저항성 조류 세포로부터 조류를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 B4GALNT2 과발현된 조류 세포로부터 조류를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 당업자에 의해 공지된 형질전환 개체 제조 방법을 제한 없이 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 B4GALNT2 유전자와 선별 물질에 내성을 부여하는 표지 유전자를 포함하는 벡터를 배반포 세포에 처리하고, 상기 벡터를 포함하는 세포의 선별을 항생제 또는 대사 억제제 등의 선별 물질을 처리하여 이루어질 수 있고, 상기 선별된 배반포 세포를 암컷 성체 또는 핵을 제거한 미수정란 등에 주입하여, 상기 형질전환된 세포를 가지는 키메라(chimeric) 개체를 제조할 수 있다. 이후 교배과정을 거쳐, 상기 형질전환 유전자를 동형 접합으로 가지는 개체를 제조할 수 있다. 상기 과정은 해당 분야의 동업자에게 공지된 방법으로서, 실험 조건 등에 따라 용이하게 변경이 가능하다. 상기 선별 물질의 예를 들면, 퓨로마이신, 네오마이신, lactose 또는 ganciclovir(GCV)를 들 수 있고, 상기 표지 유전자로는 퓨로마이신 아세틸트렌스퍼라아제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, LacZ 또는 thymidine kinase를 들 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예 1. 닭 면역 수용체 유전자 편집 벡터 작성 및 면역 수용체 유전자 편집 세포주의 개발

본 발명에서는 pX459(Addgene) 플라스미드에 표 1의 합성 cMDA5 gRNA Sense Oligo, antisense oligo (Bionics)를 공지된 방법에 따라 연결했다(Lee 2017, Dev Comp Immunol). 구체적으로, 합성된 cMDA5 gRNA Sense Oligo, antisense oligo를 95℃ 30초, 72℃ 2분, 37℃ 2분, 25℃2분 조건으로 각각의 단일가닥을 이중가닥으로 붙이고, 이중가닥 Oligo 2.5 μl, 25 ng/μl Px459 1.5 μl, 10X T4 DNA Ligase buffer (Takara) 1 μl, BbsI (NEB) 0.5 μl, T4 DNA Ligase (Takara) 0.5 μl, Distilled water (DW) 4 μl를 섞어 37 ℃ 5분, 16℃ 10 분간 12 사이클 조건으로 Px459 벡터에 이중가닥 Oligo를 연결시켰다. Competent E. coli에 연결된 벡터를 넣어 형질전환 한 뒤 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 플라스미드를 추출하여"cMDA5 CRISPR/Cas9" 벡터를 완성하였다. 12-well 세포 배양 플레이트에서 자라는 닭 섬유아세포주 (DF-1) (ATCC)에 cMDA5 CRISPR/Cas9을 Lipofectamine® Transfection Reagent(ThermoFisher)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 트랜스팩션 했다. 트랜스펙션 후 하루 뒤 1 μg/ml 농도의 퓨로마이신(GIBCO)을 처리하여 3~4일간 배양한다. 배양 후 세포를 Phosphate-Buffered Saline(PBS, ThermoFisher)로 washing해준 뒤 0.5% Trypsin/EDTA (TE) Solution (ThermoFisher)를 10배 희석한 0.05% TE solution으로 세포 부착을 떼어냈다. 세포를 걷어 세포수를 측정한 뒤 96-well 플레이트에 웰 한 개당 세포 한 개가 들어갈 수 있도록 희석하여 세포 클론을 배양하여 닭 MDA5를 제거한 닭 섬유아세포주를 확립한다.

확립된 세포주를 걷어 New England Biolabs에서 제공하는 프로토콜 (https://international.neb.com/protocols/2019/04/30/quick-protocol-for-extraction-and-purification-of-genomic-dna-using-the-monarch-genomic-dna-purification-kit-neb-t3010, 2021. 4. 16., 17:51)대로 Genomic DNA를 추출한 뒤 표 1의 "cMDA5 T7 F/R" 프라이머와 Taq polymerase 0.1 μl, dNTP 0.4 μl, 10X buffer 1 μl (BIOFACT)로 제조사의 방법대로 중합효소 연쇄 반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행한 뒤 1% agarose A (Biotech) gel에 전기영동하여 밴드를 블레이드로 잘라 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 타깃 DNA를 추출했다. pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM®-T Easy Vector에 라이게이션 (ligation)한 뒤 Competent E.coli에 트랜스포메이션하고 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 Bionics (한국)에 시퀀싱 (Sequencing)을 의뢰하여 닭 MDA5 편집 여부를 확인했다(도 2).

같은 방식으로 pX459 벡터에 표 1의 합성 cTLR3 gRNA Sense Oligo, antisense oligo (Bionics)를 연결 및 형질전환하여 닭 Toll like receptor 3 (TLR3)를 타깃하는 "cTLR3 CRISPR/Cas9"를 작성하여 Lipofectamine® Transfection Reagent (ThermoFisher)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 트랜스팩션했다. 트랜스펙션 후 하루 뒤 1 μg/ml 농도의 퓨로마이신(GIBCO)을 처리하여 3~4일간 배양했다. 96-well 플레이트에 단일 클론을 확립하여 genomic DNA를 추출한 뒤 PCR을 수행했다. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 타깃 DNA를 추출했다. 표 1의 "cTLR3 T7 F/R" 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤, pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM®-T Easy Vector에 라이게이션 (ligation)한 뒤 Competent E.coli에 트랜스포메이션하고 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 서열 분석을 진행하여 (Bionics, 한국), 닭 TLR3 편집 여부를 확인했다(도 2).

같은 방식으로 닭 MDA5가 제거된 섬유아세포에 "cTLR3 CRISPR/Cas9"을 도입하여 닭 MDA5, TLR3가 모두 제거된 단일클론 세포주를 확립한 뒤 시퀀싱을 통해 닭 MDA5, TLR3가 모두 제거됨을 확인했다(도 2).

명칭	서열(5'-3’)	번호
cMDA5 gRNA Sense Oligo forward	CACCGAACCGAGGTCGAAACGTACG	서열번호 4
cMDA5 gRNA anti-sense Oligo reverse	AAACCGTACGTTTCGACCTCGGTTC	서열번호 5
cMDA5 T7 forward	GAGACGAGCGCTTCCTCTAC	서열번호 6
cMDA5 T7 reverse	CCTTATTGCTGGCCCACTGA	서열번호 7
cTLR3 gRNA Sense Oligo forward	CACCGAAAGGATCCACTTAGAGCTG	서열번호 8
cTLR3 gRNA anti-sense Oligo reverse	AAACCAGCTCTAAGTGGATCCTTTC	서열번호 9
cTLR3 T7 forward	TGACCGAGTACAGCAATCTG	서열번호 10
cTLR3 T7 reverse	ATCCCCAAAGCCCTGGGAGA	서열번호 11
IFNB promoter forward	ACAGCCACCACATGGTCTCACCTTGCCAG	서열번호 12
IFNB promoter reverse	GATGGTGTTTGGGGTGTTGC	서열번호 13
IFNB promoter infusion forward	TCGAACAGCCACCACATGGTCTCACCTTGCCAG	서열번호 14
IFNB promoter infusion reverse	AGCTGATGGTGTTTGGGGTGTTGC	서열번호 15
ACTB forward	AGGAGATCACAGCCCTGGCA	서열번호 16
ACTB reverse	CAATGGAGGGTCCGGATTCA	서열번호 17
TMPRSS2 forward	TTCTGCCAGGCCACAAGTAG	서열번호 18
TMPRSS2 reverse	GGAGAAATGCACACTCCCGA	서열번호 19
ST3GAL1 forward	CACCCACCATTGGCTACGAA	서열번호 20
ST3GAL2 reverse	AGGCCTGTGGAAGGGTATCT	서열번호 21
Human B4GALNT2 RT-PCR forward	GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT	서열번호 22
Human B4GALNT2 RT-PCR reverse	ACCTCTGCCATCTCTCCACA	서열번호 23
GAPDH gRNA Sense Oligo forward	CACCGCTATTCCTTATAAAGAAAGT	서열번호 24
GAPDH gRNA anti-sense Oligo reverse	AAACACTTTCTTTATAAGGAATAGC	서열번호 25

실시예 2. 닭 MDA5 편집 세포주에서의 생합성 리간드, 바이러스 처리 및 항 바이러스 반응 측정

본 발명에서는 "pNL 1.2 [NlucP]" (Promega) 플라스미드 5 μg을 HindIII-HF, XhoI (New England Biolabs) 1μl, 1X CutSmart® Buffer (New England Biolabs) 5 μl처리하여 플라스미드를 선형화시켰다. 표 1의 "IFNB promoter F/R" 프라이머를 이용하여 닭 섬유아세포에서 추출한 genomic DNA (gDNA)로부터 인터페론 베타 (Interferon Beta) 프로모터 (Promoter)를 클로닝했다. 보다 더욱 상세히 설명하면 BioFACT 2X Pfu PCR Master Mix1 (BIOFACT) 25 μl, "IFNB promoter F/R" 프라이머 각각 1 μl, 앞서 추출한 gDNA 1μl, UltraPureTM distilled Water (Invitrogen) 22 μl를 섞어 제조사의 방법대로 PCR을 수행한 뒤 1% agarose A (Biotech) gel에 전기영동하여 성공적으로 인터페론 베타 (Interferon Beta) 프로모터 (Promoter) 밴드를 얻을 수 있었다. 해당 부분을 블레이드로 자르고, Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 타깃 DNA를 추출했다. pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 IFNB promoter를 pGEM®-T Easy Vector에 연결시켰다. Competent E. coli에 연결된 샘플을 넣어 형질전환 한 뒤 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 "IFNB_T vector"를 완성했다. 추출한 플라스미드를 Bionics (한국)에 시퀀싱 의뢰를 맡겨 IFNB 프로모터 시퀀스를 확인했다. 이후 "IFNB_T vector"를 표 1의 XhoI 인지부위와 상보결합을 할 수 있도록 5'-TCGA-3' 점착성 말단, HindIII-HF 인지부위와 상보결합을 할 수 있도록 5'-AGCT-3' 점착성 말단이 삽입된 "IFNB promoter infusion F/R"을 이용하여 선형화된 플라스미드 HindIII-HF, XhoI의 인지 부위에 상보적으로 결합 할 수 있는 인서트 (insert)를 클로닝 했다. XhoI, HindIII-HF로 선형화된 "pNL 1.2 [NlucP]" (Promega) 플라스미드, 앞서 클로닝한 IFNB 프로모터 인서트를 In-Fusion® HD cloning Kit (Takara)를 이용하여 제조사의 방법대로 연결시켜 "IFNB_pNL1.2"를 완성했다.

닭 MDA5가 제거된 섬유아세포, 닭 TLR3가 제거된 섬유아세포, 닭 MDA5, TLR3 모두 제거된 섬유아세포 그리고 야생형 (wild type) 섬유아세포에 "IFN-Beta_pNL1.2" 플라스미드 200ng, "pGL 4.53" (Promega) 25ng을 닭 MDA5 적중 태아 섬유아세포에 Lipofectamine® Transfection Reagent (ThermoFisher)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 트랜스팩션했다.

트랜스팩션 수행 후 24시간동안 세포를 배양하고 double strand RNA (dsRNA)의 일종으로 바이러스 RNA 유사체인 포유류 MDA5의 리간드인 Poly (I:C) (HMW)/LyoVecTM (InvivoGen, 이하 long poly I:C라고 명명) 혹은 Park (2019, JID)의 보고에서 만들어진 저병원성 인플루엔자 A 바이러스 (PR8-H5N8)를 Multiplicity of infection (MOI) = 0.1로 처리 후 각각 24시간, 8시간 후 세포를 걷어 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega)를 이용해서 인터페론 베타(IFNB) 프로모터 활성을 제조사의 방법에 따라 측정했다. Promoter assay 결과 닭 MDA5를 제거한 세포주는 야생형 세포주와 비교할 때 poly I:C 자극과 인플루엔자 A 바이러스 감염에 인터페론 베타의 활성을 유의적으로 유도하지 못했다(도 3). 또한, 닭 MDA5를 제거한 세포주에 PR8-H5N8을 MOI=0.1로 Park (2019, JID)에 나타난 방식으로 바이러스를 감염시키고 TICD50을 수행했을 때 30배 정도의 바이러스 역가가 증가했음을 확인했다(도 4).

실시예 3. 닭 TMPRSS2, ST3GAL1 과발현 벡터의 작성

Piggy Bac (Addgene) 플라스미드 5μg를 AgeI, BsrGI (NEB) 1μl, 1X CutSmart® Buffer (New England Biolabs) 5μl처리하여 플라스미드를 선형화시켰다. TMPRSS2, ST3GAL1 유전자는 Bionics (한국)에서 합성되어 선형화된 Piggy Bac에 In-Fusion® HD cloning Kit (Takara)를 이용하여 제조사의 방법대로 라이게이션 하여 "TMPRSS2_PB", "ST3GAL1_PB", "ST3T2_PB" 플라스미드를 작성했다. 닭 섬유아세포 (DF-1) 세포주에 "TMPRSS2_PB", "ST3GAL1_PB" 혹은 "ST3T2_PB" 1.2 μg와 0.8 μg PiggyBac transposon (pCyL50)을 Lipofectamine® Transfection Reagent (ThermoFisher)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 트랜스팩션했다. 트랜스펙션 후 1 μg/ml 퓨로마이신을 처리하여 15번의 계대배양을 유지했다. 이후 Tri-reagent (Molecular Research Center Inc)을 이용하여 제조사의 방법대로 RNA를 추출하고 Superscript IV (Thermo Fisher)룰 이용하여 제조사의 방법대로 complementary DNA (cDNA)를 합성했다. 표 1에 나온 "ACTB-F/R", "ST3GAL1-F/R", "TMPRSS2-F/R" 프라이머와 Taq polymerase 0.1 μl, dNTP 0.4 μl, 10X buffer 1 μl (BIOFACT), 20X EvaGreen (Biotium) 1 μl로 StepOnePlus real time PCR system (Applied Biosystems)에 제시된 방법대로 유전자 발현을 조사했다. TMPRSS2는 야생형 섬유아세포주 대조군에 비해 350배 발현이 증가했고(도 5), ST3GAL1은 1,500배 발현이 증가했다(도 6). 또한, TMPRSS2, ST3GAL1을 동시에 발현시킨 결과, TMPRSS2, ST3GAL1 모두 120배 유전자 발현이 증가되었다(도 7).

실시예 4. TMPRSS2, ST3GAL1 과발현 세포주에서의 바이러스 역가 측정

앞서 Park (2019, JID)에 제시된 PR8-H5N8, PR8-H9N2 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 뒤 TICD50를 수행한 결과, TMPRSS2, ST3GAL1 과발현된 세포주에서 야생형 섬유아세포주보다 유의적으로 높은 바이러스 역가를 보였다(도 5 및 도 6). 또한, PR8-H5N8, PR8-H9N2 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 뒤 TICD50를 수행한 결과, TMPRSS2, ST3GAL1을 동시에 과발현하는 세포주에서 트립신 처리 없이 감염 후 72시간때 야생형 섬유아세포주보다 유의적으로 높은 바이러스 역가를 보였다(도 7).

실시예 5. 사람 B4GALNT2 과발현 벡터의 작성 및 닭 게놈으로의 도입

Piggy Bac (Addgene) 플라스미드 5μg를 HindIII, NotI (NEB) 1μl, 1X CutSmart® Buffer (New England Biolabs) 5μl처리하여 플라스미드를 선형화시켰다. 사람 B4GALNT2 유전자는 Bioneer (한국)에서 합성되어 선형화된 Piggy Bac에 In-Fusion® HD cloning Kit (Takara)를 이용하여 제조사의 방법대로 라이게이션 하여 "PB_B4GALNT2"를 작성했다. GAPDH유전자 뒤에 T2A, B4GALNT2 유전자를 Bioneer (한국)에서 pBHA 플라스미드에 합성했다 GAPDH 유전자 인트론 10을 타깃하는 CRISPR/Cas9은 실시예 1에서 기술하듯 pX459 벡터를 기반으로 표 1의 GAPDH gRNA Sense/anti-sense oligo을 연결시켜 작성했다. 실시예 3의 PiggyBac transposon (pCyL50) 3 μg, CRISPR/Cas9 3 μg를 벡터 닭 섬유아세포주에 실시예 1에 기술하듯 Lipofectamine® Transfection Reagent (ThermoFisher)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 트랜스팩션했다. 트랜스펙션 후 300 μg/ml G418을 처리하여 7일간 배양 후 표 1의 "Human B4GALNT2 RT-PCR F/R"로 실시예 3에서 기술하듯 사람 B4GALNT2 발현량을 분석했다. "PB_B4GALNT2"를 도입한 후 발현량을 조사한 결과 사람 B4GALNT2의 전사체가 관찰되었다(도 8). 또한, 닭 GAPDH 유전자 뒤에 사람 B4GALNT2 유전자를 CRISPR/Cas9을 매개로 한 Knock-in을 수행한 결과, 사람 B4GALNT2의 전사체가 관찰되었다(도 9).

실시예 6. 사람 B4GALNT2 과발현 세포주에서의 바이러스 역가 측정

PB_B4GALNT2를 도입하여 무작위적으로 사람 B4GALNT를 닭 게놈에 도입하거나 CRISPR/Cas9을 통해 GAPDH 유전자 뒤에 사람 B4GALNT2를 knock-in한 후, 형광 유전자 (Green fluorescent protein)이 라벨링된 alpha-2,3 linked sialic acids에 붙는 Maackia Amurensis (MMA) Lectin I (Vector Laboratories)를 제조사의 방법대로 처리하여 형광을 측정한 결과, MMA-lectin binding이 사람 B4GALNT2가 도입되었을 때 형광이 유의적으로 감소함을 보였다(도 10).

실시예 4와 같이 저병원성 인플루엔자 바이러스 (PR8-H5N8, PR8-H9N2)를 MOI=0.1로 감염시킨 뒤 Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara)를 제조사의 방법에 따라 세포 활성을 측정한 결과, 사람 B4GALNT2가 도입된 세포주가 야생형 섬유아세포주보다 유의적으로 높은 세포활성을 보였다(도 10). 또한 PR8-H5N8, PR8-H9N2를 감염시켜 TCID50을 통해 바이러스 역가를 측정한 결과, GAPDH 뒤에 사람 B4GALNT2 유전자를 삽입한 세포주에서 야생형 섬유아세포주에 비해 각각 4.4, 4.6배 감소된 바이러스 역가를 보였다(도 10).

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PREPARING AVIAN CELLS FOR PREPARING VIRUS VACCINE AND COMPOSITION FOR PREPARING VIRUS-RESISTANT AVIAN <130> SNU-2021-07341 <150> KR 10-2021-0056519 <151> 2021-04-30 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1461 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 1 atgacctcta ctgtaaatcc accaccatac tacgaaaatc atggcttcca gacagaaaac 60 tactattctg ccaggccaca agtaggtgct aacccatatc cacagtactt ttctacgaat 120 gttccatcag tgccaaccta tatcccaaga gtttcaaccc atcagtcaag cattccagta 180 gcacctccat ccagttcgtc caggatgtgt tcatcaagca taaagaaaat cgtaataatt 240 acattatcca ttttactagt catctgttgt gcaattgctg ctttcctcat ctggtatttt 300 gtcgagaatc gttgtctcgg atccttaata gagtgtggat cttcgggagt gtgcatttct 360 ccctcagtgt ggtgtgatgg agtgactgac tgcccaaatg gggaggatga aaaccggtgt 420 gttagacttt atggaccaaa cttcattctc gaagtttatt cgcctgtcag ccaaacctgg 480 taccctgttt gtcaagatga ctggactgat gattttggga agattgcatg tgaagacatg 540 ggctacaatg tagatacgta ttactatagt caaggagtag 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gatgtcccag acagtgtggt gcagggcaga ggccagaagc agctgatcat ttctaccagt 600 gaccggaagc tgttgaagtt cattcttcag cacgtgacat acaccagcac ggggtaccag 660 caccagaagg tagacatagt gagtctggag tccaggtcct cagtggccaa gtttccagtg 720 accatccgcc atcctgtcat acccaagcta tacgaccctg gaccagagag gaagctcaga 780 aacctggtta ccattgctac caagactttc ctccgccccc acaagctcat gatcatgctc 840 cggagtattc gagagtatta cccagacttg accgtaatag tggctgatga cagccagaag 900 cccctggaaa ttaaagacaa tcacgtggag tattacacta tgccctttgg gaagggttgg 960 tttgctggta ggaacctggc catatctcag gtcaccacca aatacgttct ctgggtggac 1020 gatgattttc tcttcaacga ggagaccaag attgaggtgc tggtggatgt cctggagaaa 1080 acagaactgg acgtggtagg cggcagtgtg ctgggaaatg tgttccagtt taagttgttg 1140 ctggaacaga gtgagaatgg ggcctgcctt cacaagagga tgggattttt ccaacccctg 1200 gatggcttcc ccagctgcgt ggtgaccagt ggcgtggtca acttcttcct ggcccacacg 1260 gagcgactcc aaagagttgg ctttgatccc cgcctgcaac gagtggctca ctcagaattc 1320 ttcattgatg ggctagggac cctactcgtg gggtcatgcc cagaagtgat tataggtcac 1380 cagtctcggt ctccagtggt ggactcagaa ctggctgccc tagagaagac ctacaataca 1440 taccggtcca acaccctcac ccgggtccag ttcaagctgg ccctccacta cttcaagaac 1500 catctccaat gtgccgcata a 1521 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cMDA5 gRNA sense oligo forward <400> 4 caccgaaccg aggtcgaaac gtacg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cMDA5 gRNA sense oligo reverse <400> 5 aaaccgtacg tttcgacctc ggttc 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cMDA5 T7 forward <400> 6 gagacgagcg cttcctctac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cMDA5 T7 reverse <400> 7 ccttattgct ggcccactga 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cTLR3 gRNA sense oligo forward <400> 8 caccgaaagg atccacttag agctg 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cTLR3 gRNA sense oligo reverse <400> 9 aaaccagctc taagtggatc ctttc 25 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cTLR3 T7 forward <400> 10 tgaccgagta cagcaatctg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cTLR3 T7 reverse <400> 11 atccccaaag ccctgggaga 20 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNB promoter forward <400> 12 acagccacca catggtctca ccttgccag 29 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNB promoter reverse <400> 13 gatggtgttt ggggtgttgc 20 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNB promoter infusion forward <400> 14 tcgaacagcc accacatggt ctcaccttgc cag 33 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNB promoter infusion reverse <400> 15 agctgatggt gtttggggtg ttgc 24 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB forward <400> 16 aggagatcac agccctggca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB reverse <400> 17 caatggaggg tccggattca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMPRSS2 forward <400> 18 ttctgccagg ccacaagtag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMPRSS2 reverse <400> 19 ggagaaatgc acactcccga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ST3GAL1 forward <400> 20 cacccaccat tggctacgaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ST3GAL1 reverse <400> 21 aggcctgtgg aagggtatct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human B4GALNT2 RT-PCR forward <400> 22 ggtggtgcta agcgtgttat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human B4GALNT2 RT-PCR reverse <400> 23 acctctgcca tctctccaca 20 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH gRNA sense Oligo forward <400> 24 caccgctatt ccttataaag aaagt 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH gRNA sense Oligo reverse <400> 25 aaacactttc tttataagga atagc 25

Claims

MDA5(melanoma differentiation associated protein 5) 또는 TLR3(toll like receptor 3)를 결실시키는 물질; 또는 TMPRSS2(type Ⅱ transmembrane protease, serine 2) 또는 ST3GAL1(ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1)를 과발현시키는 물질; 을 포함하는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 MDA5 또는 TLR3를 결실시키는 물질은 MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 물질은 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터인 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 기러기, 비둘기, 꿩, 봉관조, 칠면조, 메추라기, 고니, 공작, 원앙, 플라밍고, 키위새, 뻐꾸기, 두루미, 제비, 까마귀, 황새, 왜가리, 도요새, 물떼새, 올빼미, 부엉이, 딱따구리, 독수리, 매, 앵무새, 참새, 꾀꼬리 또는 멧새를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬 바이러스 및 기관지염 바이러스를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 백신 생산용 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물이 처리된 조류 세포를 포함하는 바이러스 백신 생산용 조성물.
조류 세포에서 MDA5 또는 TLR3를 결실시키거나, 또는 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 과발현시키는 제1 단계; 및
상기 제1 단계를 거친 조류 세포를 약독화한 바이러스에 감염시키는 제2 단계를 포함하는 바이러스 백신 생산 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 MDA5 또는 TLR3의 결실은 상기 조류 세포에 MDA5 또는 TLR3에 상보적으로 결합하는 gRNA를 포함하는 물질을 처리하여 수행되는 바이러스 백신 생산 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 TMPRSS2 또는 ST3GAL1의 과발현은 상기 조류 세포에 TMPRSS2 또는 ST3GAL1을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 처리하여 수행되는 바이러스 백신 생산 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 바이러스의 감염은 상기 조류 세포에 바이러스를 주입하거나 또는 바이러스 유전체 염기서열을 포함하는 벡터를 주입하여 수행되는 바이러스 백신 생산 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 2단계를 거친 조류 세포를 배양하여 그로부터 바이러스를 얻는 제3 단계를 더 포함하는 바이러스 백신 생산 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 백신 생산 방법.
B4GALNT2(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2)를 과발현시키는 물질을 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 B4GALNT2는 인간 B4GALNT2인 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 B4GALNT2를 과발현시키는 물질은 B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터인 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 기러기, 비둘기, 꿩, 봉관조, 칠면조, 메추라기, 고니, 공작, 원앙, 플라밍고, 키위새, 뻐꾸기, 두루미, 제비, 까마귀, 황새, 왜가리, 도요새, 물떼새, 올빼미, 부엉이, 딱따구리, 독수리, 매, 앵무새, 참새, 꾀꼬리 또는 멧새를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬 바이러스 및 기관지염 바이러스를 포함하는 군에서 선택되는 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물.
위 14 내지 19 중 어느 하나의 바이러스 저항성 조류 세포 제조용 조성물이 처리된 원시생식세포 또는 배반엽세포를 포함하는 바이러스 저항성 조류 제조용 조성물.
조류 세포에서 B4GALNT2를 과발현시키는 단계를 포함하는 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 B4GALNT2는 인간 B4GALNT2인 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 B4GALNT2의 과발현은 B4GALNT2를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 상기 조류 세포에 처리하여 수행되는 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 조류는 닭이고, 상기 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 바이러스 저항성 조류 세포 제조 방법.