KR20220145043A - 조직 재생능이 향상된 줄기세포의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 miRNA 억제제로 조작된 조직 재생능 강화 줄기세포 치료제에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, miR 203a-3p, miR124-3p, miR181-5p, 128-3p, miR145-5p, miR-128-3p 또는 miR 34a-5P에 대한 안타고미르, 또는 이들의 조합에 의해 MSC에서 EMT 구배가 향상됨으로써 종래의 MSC에 비해 조직 재생 촉진능이 현저히 향상되며, 이를 통해 심근 줄기세포 증식 촉진, 심장 기능 회복 및 개선, 심근 세포 보호, 및 심근 재생을 촉진하는 효과가 있으므로, 이를 심혈관계 질환의 치료 용도로 이용할 수 있다.

Description

조직 재생능이 향상된 줄기세포의 제조방법{PREPARATION OF STEM CELLS IMPROVED TISSUE REGENERATION}

본 발명은 조직 재생능이 향상된 줄기세포에 관한 것으로, miRNA 억제제로 조작된 조직 재생능 강화 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

심근경색증은 심근의 혈액을 공급하는 관상동맥(coronary artery)의 혈류가 막혀 심근의 괴사 및 심기능 저하를 가져오는 치명적 질환이다. 현재 전세계적으로 2015년 기준 매년 1600만명의 환자가 발생하고 있으며 미국에서만 한 해에 백만 명의 심근경색증 환자가 발생한다 (2016). 2011년도 미국을 기준으로 심근경색증은 병원 입원 기간 중 진료비용이 가장 높은 5대 질환에 속하는 것으로 나타났고, 한 해 612,000 일 동안의 병상입원일과 110억 불의 진료비용이 소요되는 것으로 나타났다 (National inpatient Hospital Cost, 2011 보고서) (Statistical Brief #160 (ahrq.gov)).

심근경색증 치료를 위해 다양한 종류의 혈전용해제들이 사용되고 있으며, 경피동맥중개술(PCI; percultaneous coronary intervention)이 사용되기도 하고, 기저질환이 있거나 다수의 동맥을 침범할 경우는 CABG(coronary artery bypass surgery)를 사용하여 치료되기도 한다 (O'Connor et al., 2010). 그러나 항 응고 치료제와 관상동맥 개통술 과 같은 적극적인 치료에도 불구하고 사망률은 10-12%를 보이고 있어, 심근경색증을 치료할 수 있는 새로운 접근이 필요한 상황이다 (Gershlick and More, 1998; Pollard, 2000; Williams and Morton, 1995).

한편, 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stromal cell; MSC)는 다중분화능력(multi-lineage differentiation)을 나타내며 측분비(paracrine)효과를 통해 다양한 조직의 재생을 촉진하는 역할을 한다 (Bazoobandi et al., 2020; Ryu et al., 2020). 이들은 주로 손상 받은 조직에서의 세포 괴사와 섬유화를 억제하는 반면, 혈관형성과 세포의 재생을 촉진하는 물질들을 분비함으로써 손상된 조직의 재생을 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 심혈관계 질환에서는 MSC가 혈관내피세포나 심근세포로 분화할 잠재적 능력이 있다는 점과, 심근경색증으로 인한 심근조직내 염증반응을 조절하는 역할을 한다고 보고된 바 있다 (Hatzistergos et al., 2010; Hume and Chong, 2020; Shafei et al., 2017). 이에, MSC를 이용한 심근경색증 치료를 위해 다양한 임상시험이 실시되어 왔다 (Nakamura and Murry, 2019; Terashvili and Bosnjak, 2019).

그러나, 다양한 의료기관에서 진행된 중간엽 줄기세포를 이용한 임상시험 및 유효성 평가에서는 경계선적 효과(border line effects)를 나타냈다 (Khodayari et al., 2019). 또한, MSC의 효과를 pulse-chasing 실험으로 동물에서 확인한 결과에서도 역시 MSC가 직접 심근세포로의 분화에 기여하지 못한다고 보고되었다 (Wu et al., 2011). 이와 같은 기술적 한계로 인하여, MSC에 의한 심혈관계 질환 치료에 대해 보다 뚜렷한 임상효과를 가져올 수 있는 새로운 기술의 필요성이 제기되고 있다.

본 발명의 목적은 줄기세포의 재생 촉진능 향상용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 재생 촉진능이 향상된 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 조직 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 심혈관계 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 줄기세포의 재생 촉진능 향상 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 마이크로 RNA 억제제를 포함하는 줄기세포의 재생 촉진능 향상용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 재생 촉진능이 향상된 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 조직 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 줄기세포의 재생 촉진능 향상용 조성물; 및 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 줄기세포의 재생 촉진능 향상 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, miR 203a-3p, miR124-3p, miR181-5p, 128-3p, miR145-5p, miR-128-3p 또는 miR 34a-5P에 대한 안타고미르, 또는 이들의 조합에 의해 MSC에서 EMT 구배가 향상됨으로써 종래의 MSC에 비해 조직 재생 촉진능이 현저히 향상되며, 이를 통해 심근 줄기세포 증식 촉진, 심장 기능 회복 및 개선, 심근 세포 보호, 및 심근 재생을 촉진하는 효과가 있으므로, 이를 심혈관계 질환의 치료 용도로 이용할 수 있다.

도 1은 인간 골수유래 MSC에서 EMT 구배 및 다능성을 조절할 수 있는 miRNA 군들을 스크리닝한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 세포의 EMT 구배 및 다능성 관련 유전자를 표적으로 하는 miRNA 군을 그룹화한 도이다.
도 3은 각 miRNA 조합군별 세포의 EMT 구배 및 다능성 관련 유전자 발현 양상을 확인한 도이다.
도 4는 miRNA의 조합군에 대한 antagomir를 BM-MSC에 트랜스펙션하여 제작한 각 EMT 항진 MSC(EMT-MSC)의 심근줄기세포 증식 자극 효과를 확인한 도이다.
도 5는 영구 결찰 동물모델에서 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)의 심근경색증 세포 치료 효과를 확인한 도이다:
A: 심기능 데이터; 및
B: 심초음파 소견.
도 6은 영구 결찰 동물모델에서 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)의 심근 보호 효과를 확인한 도이다:
CM: 심근세포(Cardiomyocyte).
도 7은 IR 동물모델에 EMT-MSC를 주입하고 이의 효과를 확인한 실험 스캐줄을 나타낸 모식도이다.
도 8은 IR 동물모델에서 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)의 심근경색증 세포 치료 효과를 확인한 도이다:
A: 심기능 데이터; 및
B: 심초음파 소견.
도 9는 IR 동물모델에서 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)의 심기능 개선 효과를 심장 압력-볼륨 용적곡선을 통해 확인한 도이다.
도 10은 IR 동물모델에서 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)의 심근 보호 효과를 확인한 도이다.
도 11은 심근경색증 동물 모델에서 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)의 직접적인 심근 재생 효과를 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 miR 203a-3p, miR124-3p, miR181-5p, 128-3p, miR145-5p, miR-128-3p 및 miR 34a-5P로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마이크로 RNA 억제제를 포함하는 줄기세포의 재생 촉진능 향상용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 마이크로 RNA 억제제는 상기 마이크로 RNA에 특이적으로 결합하는 핵산 분자일 수 있으며, 상기 "핵산"이란 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체, 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 RNA(Ribonucleic acid), DNA(deoxyribonucleic acid), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), 안타고미르(antagomir), siRNA(small interfering RNA), miRNA, shRNA(short hairpin RNA), PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 안타고미르(antagomir)인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 용어 "안타고미르(antagomir)"는 단일-가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드로서, 내인성 miRNA의 차단(silence)에 사용되며, 표적서열에 상보적 서열을 가진다. 본 발명에서 안타고미르는 miRNA에 효과적으로 결합하여 저해할 수 있도록 miRNA의 상보적 RNA 염기서열을 hydroxyprolinol- linked cholesterol solid support 및 2'-OMe phosphoramidites로 변형 (Kru tzfeldt, J., Rajewsky, N., Braich,R., Rajeev, K.G., Tuschl, T., Manoharan, M., and Stoffel, M. (2005). Silencing of microRNAs in vivo with “antagomirs.” Nature 438, 685-689 참조)하여 이용하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 용어 "상보적"이란 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miRNA 표적에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가진다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본 발명에 따른 효과 즉, 상기 miRNA의 발현을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

일 구현예에서, 상기 마이크로 RNA 억제제는 상기 마이크로 RNA에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 코딩 및 발현하는 핵산을 포함할 수 있고, 이를 포함하는 플라스미드일 수 있으며, 통상의 기술 분야에서 이용되는 플라스미드 형태, 벡터 형태, 안티센스 형태, shRNA 형태, 올리고 형태 등으로 투여될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 miR145 안타고미르 및 miR124 안타고미르; miR145 안타고미르 및 miR203a 안타고미르; miR145 안타고미르, miR124 안타고미르 및 miR34a 안타고미르; 또는 miR145 안타고미르, miR124 안타고미르 및 miR106b 안타고미르의 조합을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 줄기세포에서 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 구배(gradient) 관련 유전자 및/또는 다능성(pluripotency) 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

일 구현예에서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stromal cell, MSC)일 수 있으며, 중간엽 줄기세포는 제대 유래 중간엽 줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose derived mesenchymal stem cell) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포(stem cell)"이란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, "성체 줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "중간엽 줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 줄기세포에서 EMT 구배를 증진시켜 줄기세포의 조직 재생 촉진능을 향상/증가시킬 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "miR"는 "micro RNA"를 말하는 것으로, 서로 혼용될 수 있다.

작은 RNA(small RNA: 이하 ＂sRNA"라 칭함)는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17 내지 25 뉴클레오티드(nucleotide: 이하 ”nt"라 칭함) 정도 길이의 리보핵산을 말한다. sRNA는 그 생성되는 방식에 따라 크게 마이크로RNA(microRNA, miR: 이하 ＂miRNA"라 칭함)와 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: 이하 ＂siRNA"라 칭함)로 분류된다. miRNA는 부분적으로 이중나선을 이루는 헤어핀 RNA(hairpin RNA)로부터 생성되며, siRNA는 긴 이중가닥 RNA(double strand RNA: 이하 ＂dsRNA"라 칭함)로부터 유래한다. 일반적으로 생체 내의 여러 조절 과정에서 중요한 역할을 하는 sRNA는 miRNA이며, miRNA는 19-25 nt 길이의 단일 가닥 RNA(single strand RNA: 이하 ＂ssRNA"라 칭함) 분자로서 내재적(endogenous) 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript) (Bartel, D.P., Cell 116:281-297, 2004; Kim,V.N., Mol. Cells. 19:1-15, 2005)에 의해 생성된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(UTRs)에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도함으로써 표적 유전자를 억제한다. miRNA는 발전(development), 분화, 증식, 세포사멸 및 신진대사(metabolism)과 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 한다.

또한, miRNA 생합성은 RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의한 전사를 통해 개시된다 (Cai. X., et al., RNA 10:1957-1966, 2004; Kim, V.N. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6:376-385, 2005; Lee, Y., et al., EMBO J 21:4663-4670,2002; Lee, Y., et al., EMBO J 23:4051-4060, 2004). 1차 miRNA(primary microRNA: 이하 ＂pri-miRNA”라 칭함)는 보통 수 Kb의 길이를 넘으며, 5' 캡(cap)과 폴리 A 테일(poly A teil)을 포함한다. pri-miRNA는 리보큐클레아제 Ⅲ, Drosha (Lee, Y., et al., Nature 425:415-419, 2003)와 이의 부요소인 DGCR8 (Gregory, R.I. et al., Nature 432:235-240, 2004; Han, J., et al., Genes Dev. 18:3016-3027, 2004; Landthaler, M., et al.,Curr. Biol. 14:2162-2167, 2004)로 구성된 마이크로프로세서(microprocessor)라는 복합체에 의해 맨 처음 절단되어 65 nt 정도의 헤어핀-구조 전구체(pre-miRNA)로 분리된다. pre-miRNA 프로세스는 miRNA 생합성에 중심적 단계로서, 길이가 긴 pre-miRNA에 mRNA 서열을 포함하는 분자의 한쪽 말단을 생성하는 과정으로 정의된다. 상기 개시 프로세스 이후 생성된 pre-miRNA는 핵 수송요소인 Exp5(exportin-5)에 의해 세포질로 수송된다 (Bohnsack, M.T., et al., RNA 10:185-191, 2004; Lund, E., et al., Science 303:95-98, 2004; Yi,R., et al., Genes Dev. 17:3011-3016, 2003). 세포질 안에서는 세포질내 RNase Ⅲ 타입 단백질인 다이서(Dicer)가 전달된 pre-miRNA를 절단하여 22 nt 정도의 miRNA 이중 가닥을 생성한다. 다이서 생성물의 한쪽 가닥(strand)은 성숙 miRNA로 세포질 속에 존재하여 miRNP(microribonucleoprotein) 또는 miRISC(miRNA-induced silencing complex)라 불리는 실행자 복합체(effector complex)와 조립된다 (Khvorova, A., et al., Cell 115:209-216, 2003; Schwarz,D.S., et al., Cell 115:199-208, 2003). sRNA에 의한 유전자 침묵 기작(gene silecing mechanism)인 RNAi 현상은 포유동물 시스템에서 효과적인 유전자 연구 수단으로 사용되고 있다. 효과적이며 안정한 유전자 넉다운(knockdown)은 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: 이하 ＂shRNA”라 칭함)로 발현하여 작은 간섭 RNA(siRNA)로 프로세스 되면서 일어난다. 최근 RNAi 기술의 비약적인 전진은 자연적 miRNA 유전자를 모방한 shRNA 발현카세트를 제작하면서 이루어졌다 (Dickins, R.A., et al., Nat. Genet. 37:1289-1295, 2005; Silva, J.M. et al., Nat. Genet. 37:1281-1288, 2005: Zeng, Y., et al., Mol. Cell 9:1327-1333. 2002). RNA 폴리머라아제 Ⅱ 프로모터에 의해 조정되는 miRNA를 기초한 shRNA는 동물 모델 같은 배양 세포 내에서 효과적이며 안정적으로 유전자 침묵(gene silencing) 조절을 유도한다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 재생 촉진능이 향상된 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 miR 203a-3p, miR124-3p, miR181-5p, 128-3p, miR145-5p, miR-128-3p 및 miR 34a-5P로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마이크로 RNA에 대한 안타고미르(antagomir)를 줄기세포에 트랜스펙션하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 miR124-3p에 대한 안타고미르 및 miR145-5p에 대한 안타고미르를 중간엽 줄기세포에 트랜스펙션하여 miR124-3p 및 miR-145-5p를 억제한 EMT 항진 MSC를 제작하였으며, 이러한 세포를 모두 "EMT-MSC"로 명명하였다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 조직 재생용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 조직은 심장 조직일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 심혈관계 질환은 동맥경화, 심부전, 심근경색증, 고혈압, 혈전증, 응집전 상태(Precoagulant state) 및 아테롬성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 심근경색증인 것이 더욱 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 심근 줄기세포의 증식을 촉진하고, 심장의 기능을 회복 또는 개선시키며, 심근 세포를 보호하고, 심근의 재생을 촉진시킬 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학적 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학적 조성물에 0.01 ㎍/ml ~ 50 mg/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 50 mg/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 심혈관계 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 줄기세포의 재생 촉진능 향상용 조성물; 및 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는, 심혈관계 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 용어 "세포치료제"란 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

상기 세포치료제 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 세포치료제 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 상기 약학적 조성물의 경구투여를 위한, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

상기 세포치료제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 통상의 방법에 의할 수 있고, 일 예로 경구 및 직장 또는 정맥등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 재생 촉진능 향상 방법에 관한 것이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. MSC의 재생촉진능 향상 miRNA 스크리닝

중간엽 줄기세포(Mesenchymal stromal cell, MSC)에서 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 구배(gradient) 증가시 재생 촉진능이 향상되므로, MSC의 3D 배양과 2D 배양에서 차별적으로 발현되는 miRNA 중 EMT 구배를 증가시킬 수 있는 miRNA군들을 스크리닝하였다. 스크리닝된 miRNA들의 표적 유전자들을 miRNA 데이터 베이스(data base)들을 통해 추적하였으며, 이와 함께 세포에서 줄기세포성(Stemness)과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 miRNA를 유사한 miR 데이터 베이스를 통하여 스크리닝하였다 (도 1).

그 결과, miR 203a-3p, miR124-3p, miR181-5p 및 128-3p가 인간 골수유래 MSC에서 EMT 구배를 증진할 수 있음을 확인하였으며, miR145-5p, miR-128-3p 및 miR 34a-5P가 공통적으로 다능성(pluripotency) 유전자 (oct-4, nanog, Klf-4 및 Sox-2)를 표적으로 하는 것을 확인하였다 (도 2).

실시예 2. miRNA 후보군의 EMT 관련 유전자 및 다능성 관련 유전자 유도능 확인

상기 실시예 1에서 선정한 miRNA 후보군들의 안타고미르(antagomir) 조합이 세포의 재생에 필요한 EMT 구배 및 다능성 관련 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는지 확인하기 위하여 각 조합별 유전자 발현 양상을 비교하였다. 구체적으로, 상기에서 선정한 각 miRNA의 antagomir (표 1)를 (주)상하이 제네틱스에서 주문하였으며, 여러 조합의 miR-antagomir들을 인간 골수에서 유래한 MSC에 각각 트랜스펙션한 뒤 EMT 구배 관련 유전자인 Snai1, Slug, Twist1, Zeb1 및 Zeb2와 다능성 관련 유전자인 Oct4, Nanog, Sox2 및 KLF4의 발현 정도를 qRT-PCR로 확인하였다.

그 결과, 선정된 후보군 중 4가지 조합의 miR-antagomir (miR145 antagomir+miR124 antagomir, miR145 antagomir+miR203a antagomir, miR145 antagomir+miR124 antagomir+miR34a antagomir 및 miR145 antagomir+miR124 antagomir+miR106b antagomir)가 대조군 (scrambled oligonucleotide: NC)에 비해 EMT 구배 관련 유전자 및 다능성 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 확인하였다 (도 3).

실시예 3. 영구 결찰 모델에서 EMT 항진 MSC의 심근경색증 치료 효과 확인

3-1. EMT-MSC의 심근 줄기세포 증식 자극 효과

EMT-MSC가 심장근육의 재생에 관여하는 심근줄기세포의 증식에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 인간 골수에서 유래한 MSC를 10% FBS가 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Media)에서 플라스틱 디쉬에 부착하여 계대배양한 뒤 (Ikebe and Suzuki, 2014), miRNA의 조합군에 대한 antagomir를 BM-MSC에 트랜스펙션하여 EMT 항진 MSC(EMT-MSC)를 제작하고, 이를 인간 태아심근유래 심근줄기세(c-kit+) (Cardiac Progenitor Cell, CPC)를 공동 배양한 후, 심근줄기세포를 CFSE로 염색하여 CPC(Cardiac Progenitor Cell) 증식에 따라 세포막에 염색된 CFSE의 강도가 약해지는 정도를 확인하였다.

그 결과, 대조군 naive MSC (+NC)와 공동배양한 심근줄기세포들에 비해, 각 조합의 miRNA antagomir에 의해 EMT 항진된 MSC (+1, +2, +3 및 +4)와 공동배양한 심근줄기세포들이 더 높은 P4 세포 분획의 비율과 숫자를 나타내, 현저히 높은 증식능을 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

3-2. EMT-MSC의 세포 치료 효과

EMT-MSC의 심근경색증에 대한 세포 치료 효과를 확인하기 위해, 심근경색증 동물 모델에 EMT 항진 MSC를 심근 직접 주사 (direct intramyocardially injection)한 뒤 심장 기능 회복에 미치는 영향을 분석하였다. 구체적으로, Fischer 344 (F344) 랫을 흉부 절개한 뒤, 심장 관상동맥 중 LAD(left anterior descending artery) 결찰(ligation) 1시간 후, 결찰을 제거함으로써, 심근 허혈-재관류(ischemic reperfusion) 모델에 의한 심근경색증을 유도하여 심근경색증 동물 모델을 제작하였다. 또한, EMT 관련 miRNA 중 하나인 miR124-3p에 대한 antagomir 및 다능성 관련 miRNA 중 하나인 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 EMT 항진 MSC를 제작한 뒤, 상기 심근경색증 동물 모델 제작 과정 중 LAD 결찰 제거에 의한 재관류 유발시, 각각의 세포군들을 괴사가 유발된 심근 조직 (infarct area) 주변의 심근에 31G 인슐린 주사기로 주입하였다. 허혈-재관류 1주 후, 같은 방법으로 개흉 수술 후 심근에 각각의 세포군들을 2차 주입하였다. 이 후 8주 동안 심장 기능의 변화를 echocardiography를 이용하여 확인하였다. 좌심실 구혈률(left ventricular ejection fraction: LVEF) 및 좌심실의 구획단축률(Fractional shortening: FS)을 통해 심장의 수축력을 평가하였으며, 좌심실 수축기 내경(Left ventricular internal systolic dimension: LVISd) 및 이완기 내경(Left ventricular internal diastolic dimension LVIDd)을 통해 심실재형성(Adverse Remodeling)에 의한 심장 크기의 변화를 정량적으로 평가하였다.

그 결과, 심근경색증 동물모델에서 EMT-MSC가 좌심실 구혈률(% LVEF: left ventricular ejection fraction) 및 구획단축률 (% FS: fractional shortening)을 대조군 MSC에 비해 유의하게 증가시키는 것으로 나타났고, 이완기 내경 (LVIDd) 및 수축기 내경 (LVISd)을 비처치군 및 대조군 MSC 주입군에 비해 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다 (도 5). 또한, 좌심실 벽 두께를 증가시키고 좌심실 기능장애에 관련된 상대적 벽 두께(relative wall thickness:RWT)를 증가시키는 것으로 나타났다.

3-3. EMT-MSC의 심근 보호 효과

영구 결찰 모델에서 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)가 심근경색증에 대한 치료효과를 나타내는 기전을 분석하기 위하여, 심근경색증 후 심근 조직의 섬유화 및 생존율을 확인하였다. 이를 위해, hybridization-CHP(collagen hybridization peptide) 및 TNNT2(troponin, Cardiac muscle troponin T, cTnT)으로 면역형광염색하고 Image J로 정량적 분석 및 비교하여 심근 조직의 리모델링 및 심장 기능 회복을 조직학적으로 확인하였다.

그 결과, 비처치군 (CON) 또는 대조군 MSC (BM-MSC)에 비해 EMT 항진 MSC (EMT-MSC)를 주입한 군에서 현저하게 섬유화가 줄어든 것으로 나타났으며, 생존 심근 (TNNT2+) 또한 증가한 것으로 나타났다 (도 6).

상기 결과를 통해, 심근경색증 동물 모델(permanent ligation model)에서 EMT-MSC가 심장기능 회복 및 심근 보호 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 4. 허혈 재관류(ischemic reperfusion, IR) 모델에서 EMT 항진 MSC심근경색증 치료 효과 확인

4-1. EMT-MSC의 세포 치료 효과

심근경색증의 EMT-MSC 치료 효과를 더욱 임상 환경과 유사한 모델에서 확인하기 위해, 심근의 관상동맥을 1시간 동안 결찰한 후 재순환(reperfusion) 시키는 IR(ischemic reperfusion) 모델에서의 EMT-MSC의 세포 치료 효과를 분석하였다. 구체적으로, 도 7에 표시된 바와 같이, IR 유도 직후 및 1주일 후 심근경색증 주변부에 각각의 EMT-MSC 세포군 (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)을 직접 주입하였으며, 대조군으로서 IR이 발생한 후 4시간 후의 심기능을 베이스 라인(Base line)으로 설정하여 치료 효과를 echocardiography로 확인하였다.

그 결과, LVEF%, FS% 및 LVIDd, LVISd로 분석한 심초음파 기반 기능 평가에서, 대조군 MSC는 비처치군 (CON)에 비해 유의한 차이를 보이지 않았으나, EMT-MSC 처리군은 이들 두 종류의 대조군에 비해 유의미한 심기능 개선 효과를 나타냈다 (도 8).

4-2. EMT-MSC의 세포 치료 효과의 혈역학적 분석

IR 모델에 EMT-MSC를 처리한 후 심장 내 카테터를 이용한 심장 압력-볼륨 용적곡선(Pressure-volume curve)을 통해 심기능 개선 양상을 분석하여 혈역학적 차원의 변화를 관찰하였다.

그 결과, 수축기 및 이완기에서의 pressure/volume 비율에서 EMT-MSC 처리군이 대조군 및 MSC 처리군에 비해 유의하게 수축력이 증가되었음을 확인하였고, stroke volume 및 cardiac output도 유의하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 9).

이를 통해, EMT-MSC가 임상적 환경에 최적화된 모델인 IR 모델의 심근경색증에서도 비처치군이나 대조군 MSC에 비해 현저하게 심기능을 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.

4-3. EMT-MSC의 심근 보호 효과

IR 모델에서 EMT-MSC가 심근경색증에 대한 치료효과를 나타내는 기전을 분석하기 위하여, 심근경색증에 대한 치료후의 심근의 괴사, 생존 심근의 양 및 심근 섬유화를 확인하였다. 이를 위해, IR 모델에 EMT-MSC를 주입하고 24시간 내에 심근의 괴사(Evan's blue&TTC 시험법으로 측정됨)를 막고, 세포 주입 3일, 7일 및 14일 차에 형광면역염색법을 통하여 심근 세포(cardiomyocyte)의 생존율 (TNNT2+ 세포수)를 확인하고, 실험 종료시 섬유화를 확인하였다.

그 결과, EMT-MSC가 대조군 MSC에 비해 현저하게 심근 세포를 보호하는 것으로 나타났다 (도 10).

4-4. EMT-MSC의 괴사된 심근 재생 효과 확인

EMT-MSC가 괴사된 심근 조직의 재생을 촉진하는지 확인하기 위해, IR 모델에 주입된 EMT-MSC (miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir를 함께 트렌스펙션하여 제작한 EMT 항진 MSC)가 직접적으로 혈관 세포 또는 심근 세포로 분화할 수 있는지 확인하였다. 이를 위해, 주입한 MSC를 Dil로 표지한 후, 이들 세포들을 심근경색증이 발생한 조직에 투여하고 혈관 세포 (Isolectin B4: IB4+) 또는 심근 세포 (TNNT2+/Dil+ 또는 CX43+/Dil+)로 분화하는 양을 형광면역염색법으로 확인하였다.

그 결과, 대조군 MSC을 처리한 군에 비해, EMT-MSC를 처리한 군의 심근 조직에서 혈관 세포 (IB4+/Dil+) 및 심근 세포 (TNN2+/Dil+ 또는 CX43+/Dil+)로 분화하는 세포의 숫자가 현저히 증가하는 것으로 나타났다 (도 11). 이를 통해, EMT-MSC가 심근경색증이 발생한 미세환경에서 혈관 세포 및 심근 세포로 보다 높은 비율로 분화함으로써 심근 재생을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통해, miR124-3p에 대한 antagomir 및 miR-145-5p에 대한 antagomir의 조합에 의해 EMT가 항진된 MSC가 영구 결찰 모델 및 IR 모델에서 심근 보호 및 심근 재생을 통해 손실된 심기능을 유의적으로 증가시킴으로써 기존의 MSC에 비해 현저하게 심근경색증을 치료하는 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (9)

1. mir145 억제제 및 miR124 억제제를 줄기세포에 처리하는 단계;를 포함하는 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 구배(gradient) 관련 유전자 및 다능성(pluripotency) 관련 유전자의 발현이 유도된 줄기세포의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, mir145는 mir-145-5p, miR124는 miR-124-3P인 것인, 방법.
3. 제 1항에 있어서, mir145 억제제 또는 miR124 억제제는 RNA 억제 분자(inhibitoy RNA molecule), 길항제 microRNA, 효소적 RNA 분자 및 항-miRNA 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 방법.
4. 제 1항에 있어서, mir145 억제제 또는 miR124 억제제는 mir145 또는 miR124에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 안타고미르(antagomir), 리보자임(ribozyme), 압타머(aptamer), siRNA, miRNA, shRNA(short hairpin RNA), PNA(peptide nucleic acid) 및 LNA(locked nucleic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것인, 방법.
6. mir145 억제제 및 miR124 억제제가 처리된 줄기세포를 포함하는 심근경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제1항에 제조방법에 의하여 제조된 줄기세포.
8. mir145 억제제 및 miR124 억제제를 줄기세포에 처리하는 단계;를 포함하는 줄기세포에서 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 구배(gradient) 관련 유전자 및 다능성(pluripotency) 관련 유전자의 발현을 유도하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 EMT 구배 관련 유전자는 Snai1, Slug, Twist1, Zeb1 또는 Zeb2이며, 다능성 관련 유전자는 Oct4, Nanog, Sox2 또는 KLF4인 것인 방법.
   

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