KR20220130692A

KR20220130692A - 친화성 크로마토그래피를 위한 신규한 세척 완충제 용액

Info

Publication number: KR20220130692A
Application number: KR1020227024708A
Authority: KR
Inventors: 하이쿠안 리우; 치안 팡; 징 우
Original assignee: 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-09-27
Also published as: EP4093745A1; US20230092867A1; CN114901671A; JP7462762B2; JP2023511871A; WO2021147857A1; TWI787710B; CN114901671B; EP4093745A4; TW202140510A

Abstract

본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법으로서, 1) 단백질 샘플을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고, 2) 컬럼을 히스티딘 또는 이미다졸 및 pH-조절제를 포함하는 세척 완충제 용액으로 세척하는 단계를 포함하여, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법을 제공한다.

Description

친화성 크로마토그래피를 위한 신규한 세척 완충제 용액

본 개시는 일반적으로는 단백질 샘플을 정제하는 때에 불순물을 제거하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography)는 일반적으로는 단백질 A 리간드(protein A ligand)와 모노클로날 항체(monoclonal antibody) 사이의 특이적 상호작용으로 인해서 고도의 효과적인 정제 단계로 여겨진다. 이러한 이유로, 이는 통상적으로는 생물약제학 제품(biopharmaceutical product)을 위한 순도 요건에 부합시키기 위한 후속 폴리싱 컬럼(polishing column)에 의한 직접적인 포획 단계에 사용된다. 이러한 초기 단계에서, 단백질 A 수지의 높은 선택성은 플로우-스루(flow-through)에 비-표적 단백질의 대부분을 남긴다. 그러나, 숙주 세포 단백질(host cell protein; HCP), 고분자량(high molecular weight; HMW) 및 저분자량(low molecular weight; LMW)을 포함하는 특정의 불순물이 표적 단백질과 함께 컬럼 내에 유지될 수 있다. 하류 공정에서의 불순물 제거를 위한 가장 효과적인 유닛 작동으로서, 단백질 A 크로마토그래피는 정화된 매질 내 >90%의 HCP를 제거할 수 있다. 따라서, 친화성 크로마토그래피 단계 동안에 불순물의 제거를 최적화하는 것이 특히 중요하다.

불순물 중에, HCP는 유기체에 의해 생산되거나 그에 의해 인코딩되고 의도된 재조합 생성물과 관련되지 않은 것들이다. HCP는 공정-관련된 불순물의 주류를 형성하고, 낮은 수준에서도, 이들은 잠재적으로 바이오약제(biopharmaceuticals)의 안전성 및 효능을 저하시킬 수 있다. 안전성 우려에 추가로, HCP의 존재는 또한 제품 품질에 영향을 주는 것으로 공지되어 있다. HCP가 안전성 및 효능 문제 둘 모두를 유발시키기 때문에, 하류 공정에서 이들을 가능한 한 완전히 제거하는 것이 바람직하다.

이하 성분들 중 하나를 함유하는 세척 용액을 포함한, 단백질 A 컬럼으로부터 불순물을 제거하기 위한 다양한 세척 용액이 기재되었다: 소수성 전해질(예, pH 5.0-7.0의 테트라메틸암모늄 클로라이드, 테트라에틸암모늄 클로라이드, 테트라프로필암모늄 클로라이드 또는 테트라부틸암모늄 클로라이드), 용매(예, 5-20% 이소프로판올 또는 폴리프로필렌/헥실렌 글리콜), 우레아(예, 1-4 M의 농도), 세정제(예, 0.1-1% PS 20 또는 PS 80), 폴리머(예, 5-15% 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대, PEG400 또는 PEG8000) 또는 고도로 농축된 완충제 용액, 예컨대, 0.8-2.0 M의 농도 및 5.0 내지 7.0의 pH의 Tris-HCI, 아세테이트, 설페이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제.

일 양태에서, 본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법으로서,

1) 단백질 샘플을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하는 단계,

2) 컬럼을 화학식(I)의 화합물 및 pH-조절제(pH-adjusting agent)를 포함하는 세척 완충wp 용액으로 세척하는 단계를 포함하는,

방법을 제공한다:

[화학식(I)]

상기 식에서, R¹은 H 또는 C_1-6 알킬이고; 여기에서, C_1-6 알킬은 치환되지 않거나 카르복시, 아미노, 수소 또는 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개 또는 3개의 치환체에 의해 치환된다.

일 구현예에서, 상기 화합물은 히스티딘 또는 이미다졸이다.

본 개시는 또한 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법으로서,

2) 컬럼을 세린 및/또는 시스테인 및 pH-조절제를 포함하는 세척 완충제 용액으로 세척하는 단계를 포함하는,

방법을 제공한다.

일 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography), Capto Blue(High Sub) 크로마토그래피(Capto Blue (High Sub) chromatography)，단백질 G 크로마토그래피，단백질 L 크로마토그래피，Lambda Fab Select 크로마토그래피(Lambda Fab Select chromatography), Kappa Select 크로마토그래피, lg Select 크로마토그래피, Blue Sepharose 크로마토그래피, Capto Heparin 크로마토그래피, VII Select 크로마토그래피, VIII Select 크로마토그래피, XSelect 크로마토그래피 및 Capto L 크로마토그래피로부터 선택된다.

일 구현예에서, pH-조절제는 아세테이트 완충제, 예컨대, NaAc 및/또는 HAc, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 또는 Tris-HCl을 포함한다.

특이적 일 구현예에서, 세척 완충제 용액의 부피 중의 화합물의 몰 질량(molar mass)의 백분율은 약 100 mM 이상이고, 바람직하게는 약 100 mM 내지 약 1 M이고, 더욱 바람직하게는 약 300 mM 내지 약 700 mM, 예를 들어, 약 100 mM, 약 200 mM, 약 300 mM, 약 400 mM, 약 500 mM, 약 600 mM, 약 700 mM, 약 800 mM, 약 900 mM, 또는 약 1 M이다.

특이적 일 구현예에서, 세척 완충제 용액의 pH는 약 pH 5.5 이하, 예를 들어, 약 pH 5.0, 약 pH 4.5, 약 pH 4.0, 약 pH 3.5이다.

또 다른 구현예에서, 상기 언급된 방법은 단계 2) 후의 용리 단계(elution step)를 포함하지 않는다.

특이적 일 구현예에서, 단백질 샘플은 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 또는 융합 단백질(fusion protein)이다. 융합 단백질은 단백질 A에 의해 인식 가능한 Fc 도메인(domain)을 함유하는 Fc-융합 단백질이다. Fc-융합 단백질은 목적한 펩타이드 또는 단백질에 결합된 IgG의 Fc 도메인으로 구성된다. 또 다른 특정의 구현예에서, 융합 단백질은 HAS(인간 혈청 알부민)-융합 단백질이다. HAS-융합 단백질은 목적한 펩타이드 또는 단백질에 결합된 HAS로 구성된다.

특이적 일 구현예에서, 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP)를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는데 사용하기 위한 조성물로서, 적어도 하나의 화학식(I)의 화합물을 포함하는, 조성물을 제공한다:

화학식(I)

일 구현예에서, R¹은 H이고, 상기 화합물은 이미다졸이다.

일 구현예에서, R¹은 카르복시 및 아미노에 의해 치환된 C₃ 알킬이다.

본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는데 사용하기 위한 조성물로서, 세린 및/또는 시스테인을 포함하는, 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피, Capto Blue (High Sub) 크로마토그래피，단백질 G 크로마토그래피，단백질 L 크로마토그래피，Lambda Fab Select 크로마토그래피, Kappa Select 크로마토그래피, lg Select 크로마토그래피, Blue Sepharose 크로마토그래피, Capto Heparin 크로마토그래피, VII Select 크로마토그래피, VIII Select 크로마토그래피, XSelect 크로마토그래피 및 Capto L 크로마토그래피로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는데 사용하기 위한 키트(kit)로서, 화학식(I)의 화합물, 세린, 또는 시스테인을 포함하는 조성물을 포함하는, 키트를 제공한다:

화학식(I)

일 구현예에서, R¹은 H이고, 상기 화합물은 이미다졸이다.

일 구현예에서, 상기 화합물은 히스티딘 또는 이미다졸을 포함한다.

일 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피, Capto Blue (High Sub) 크로마토그래피，단백질 G 크로마토그래피，단백질 L 크로마토그래피，Lambda Fab Select 크로마토그래피, Kappa Select 크로마토그래피, lg Select 크로마토그래피, Blue Sepharose 크로마토그래피, Capto Heparin 크로마토그래피, VII Select 크로마토그래피, VIII Select 크로마토그래피, XSelect 크로마토그래피 및 Capto L 크로마토그래피이다.

일 구현예에서, 키트는 pH-조절제를 추가로 포함한다.

본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 세척 용액의 제조에서 상기 언급된 조성물의 사용을 제공한다.

특징 및 이점

본 개시는 친화성 크로마토그래피를 위한 효율적이고 강력한 세척 용액을 제공한다. 이러한 세척 용액은 생성물 회수를 저하시키지 않으면서 용리 단계 전의 세척 단계에서 적용되는 히스티딘 또는 이미다졸(방향족 헤테로사이클, 히스티딘의 작용기)의 존재를 특징으로 한다.

본 개시가 더욱 용이하게 이해될 수 있게 하기 위해서, 특정의 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐서 기재되어 있다. 본원에서 사용된 용어는 특정의 구현예를 단지 설명하는 목적을 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된, 단수 형태는, 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩타이드"의 언급은 둘 이상의 폴리펩타이드의 조합 등을 포함한다.

측정 가능한 값, 예컨대, 양, 및 기간 등을 언급하는 때에, 본원에서 사용된 "약"은, 특정된 값으로부터 ±5%, ±1%, 및 ±0.1%를 포함한, ±20% 또는 ±10%의 변화를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적절하다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 개시가 관련되는 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 비록, 본원에 기재된 것들과 동일하거나 유사한 임의의 방법 및 재료가 본 개시의 시험을 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기재된다. 본 개시를 기재하고 청구하는데 있어서, 이하 용어가 사용될 것이다.

본 개시에서 사용된 용어 "단백질 샘플"은 단백질 A에 의해 인식 가능한 Fc 도메인을 함유하는 단백질을 나타낸다. 이러한 단백질은 항체 및 Fc-융합 단백질을 포함한다. 항체는 모노클로날 항체, 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 항체는 일특이적, 이중 특이적 또는 다중 특이적일 수 있다. 항체는 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 항체는 천연 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. Fc-융합 단백질은 항체의 Fc 도메인 및 유전적으로 결합된 활성 단백질로 구성된다.

"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내기 위해서 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 폴리펩타이드는 천연 (조직-유래된) 기원, 원핵 또는 진핵 세포 제제로부터의 재조합 또는 천연 발현이거나, 합성 방법을 통해서 화학적으로 생성될 수 있다. 이들 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 의태체(mimetic)인 아미노산 폴리머 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산 폴리머 및 비-천연 발생 아미노산 폴리머에 적용된다. 아미노산 의태체는 아미노산의 일반적인 화학적 구조와는 상이하지만 천연 방생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 나타낸다. 비-천연 잔기는 과학 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있으며; 천연 아미노산 잔기의 의태체로서 유용한 몇 가지 예시적인 비-천연 조성물 및 가이드라인이 이하 기재된다. 방향족 아미노산의 의태체는, 예를 들어, D- 또는 L-나프틸알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2 티에닐알라닌; D- 또는 L-l, -2,3-, 또는 4-피레닐알라닌; D- 또는 L-3 티에닐알라닌; D- 또는 L- (2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신 : D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌: D-p-플루오로-페닐알라닌; D- 또는 L-p-바이페닐페닐알라닌; K- 또는 L-p-메톡시-바이페닐페닐알라닌: D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌; 및, D- 또는 L-알킬알라닌으로 대체시킴으로써 생성될 수 있고, 여기서 알킬은 치환된 또는 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, 2차-이소틸(sec-isotyl), 이소-펜틸, 또는 비-산성 아미노산일 수 있다. 비-천연 아미노산의 방향족 고리는, 예를 들어, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴, 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "펩타이드"는 본원에서 구체적으로 예시된 펩타이드의 보존성 변이체인 펩타이드를 포함한다. 본원에서 사용된 "보존성 변이체(conservative variation)"는 아미노산 잔기의 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체를 나타낸다. 보존성 변이체의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 하나의 소수성 잔기, 예컨대, 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 시스테인, 글리신, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 노르류신 또는 메티오닌의 또 다른 것에 대한 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또 다른 것에 대한 치환, 예컨대, 아르기닌의 라이신에 대한 치환, 글루탐산의 아스파르트산에 대한 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴에 대한 치환 등을 포함한다. 서로 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌을 포함한다. "보존성 변이체"는 또한 비치환된 모체 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함하며, 이는 치환된 폴리펩타이드에 대해서 유발된 항체가 또한 비치환된 폴리펩타이드와 면역반응함을 단서로 한다. 이러한 보존성 치환은 본 개시의 펩타이드의 부류의 정의 내에 있다. 본원에서 사용된 "양이온성"은 pH 7.4에서 순수한 양성 전하를 보유하는 임의의 펩타이드를 나타낸다. 펩타이드의 생물학적 활성은 본 기술분야에서의 통상의 기술자에게는 공지되고 본원에서 기재된 표준 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 개시에서 사용되는 용어 "Fc 도메인"은 항체의 단편 결정 가능 영역(fragment crystallizable region)을 나타낸다. Fc 도메인은 항체의 중쇄의 불변 도메인으로부터 유래된다. "Fc 도메인"은 단백질 A에 의해 인식되고 결합될 수 있다.

일 구현예에서, 단백질은 항원 결합 단백질이다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 IgG 부류이다. 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.

본 개시에서 사용될 수 있는 예시적인 항체는 아달리무맙(Adalimumab), 베즐로톡수맙(Bezlotoxumab), 아벨루맙(Avelumab), 두필루맙(Dupilumab), 더발루맙(Durvalumab), 오크렐리주맙(Ocrelizumab), 브로달루맙(Brodalumab), 레슬리주맙(Reslizumab), 올라라투맙(Olaratumab), 다라투무맙(Daratumumab), 엘로투주맙(Elotuzumab), 네시투무맙(Necitumumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오빌톡사시맙(Obiltoxaximab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 세큐키누맙(Secukinumab), 메폴리주맙(Mepolizumab), 리볼루맙(Nivolumab), 알리로쿠맙(Alirocumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 디누툭시맙(Dinutuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 펩브롤리주맙(Pembrolizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 실툭시맙(Siltuximab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 인플릭시맙(Infliximab), 오미누투주맙(Obinutuzumab), 브렌툭시맙(Brentuximab), 락시바쿠맙(Raxibacumab), 벨리무맙(Belimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 데노수맙(Denosumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 베실레소맙(Besilesomab), 토실리주맙(Tocilizumab), 카나키누맙(Canakinumab), 골리누맙(Golimumab), 우스테키누맙(Ustekinumab), 세톨리주맙(Certolizumab), 카투막소맙(Catumaxomab), 에큘리주맙(Eculizumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 카투막소맙(Catumaxomab), 베바시주맙(Bevacizumab), 오말리주맙(Omalizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 에팔리주맙(Efalizumab), 이브리투모맙(Ibritumomab), 파놀레소맙(Fanolesomab), 토시투모맙(Tositumomab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 겜투주맙(Gemtuzumab), 인플릭시맙(Infliximab), 팔리비주맙(Palivizumab), 네시투무맙(Necitumumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 리툭시맙(Rituximab), 카프로맙(Capromab), 사투모맙(Satumomab), 누로모납(Muromonab) 등을 포함한다.

본 개시에서 사용될 수 있는 예시적인 Fc-융합 단백질은 에타네셉트(Etanercept), 알레파셉트(Alefacept), 아바타셉트(Abatacept), 릴로나셉트(Rilonacept), 로미플로스팀(Romiplostim), 벨라타셉트(Belatacept), 아플리버셉트(Aflibercept) 등을 포함한다.

용어 "크로마토그래피"는 혼합물에 존재하는 다른 분자들로부터 목적한 분석물들(예, Fc 도메인 함유 단백질, 예컨대, 면역글로불린)을 분리하는 임의의 종류의 기술을 나타낸다. 일반적으로는, 목적한 분석물은 혼합물의 개별적인 분자들이 이동상의 영향 하에, 또는 결합 및 용리 과정으로 고정상 매질을 통해서 이동하는 속도에서의 차이의 결과로 다른 분자들로부터 분리된다.

본 개시에서 사용되는 용어 "단백질 A"는 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로 생산된 단백질 A(예, 펩타이드 합성에 의해 또는 재조합 기술에 의해), 및 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 단백질 A는 Fc 도메인에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 단백질 A는 Repligen, Pharmacia 및 Fermatech으로부터 상업적으로 구매될 수 있다. 단백질 A는 일반적으로는 고형상 지지 재료 상에 고정될 수 있다. 용어 "단백질 A"는 또한 단백질 A가 공유결합되는 크로마토그래피 고형물 지지 매트릭스(chromatographic solid support matrix)를 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지 또는 컬럼을 나타낸다.

"완충제"는 산-염기 컨주게이트 성분(acid-base conjugate component)의 작용에 의해 pH의 변화에 견디는 용액이다. 예를 들어, 완충제의 요망되는 pH에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충제가 문헌[Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation, 1975]에 기재되어 있다. 청구된 개시의 방법의 일부 단계에서, 완충제는 2.0 내지 4.0, 또는 2.8 내지 3.8의 범위의 pH를 갖는다. 청구된 개시의 다른 단계에서, 완충제는 5.0 내지 9.0의 범위의 pH를 갖는다. 청구된 개시의 다른 단계에서, 완충제는 4.0 내지 6.5의 범위의 pH를 갖는다. 청구된 개시의 방법의 또 다른 단계에서, 완충제는 4.0 미만의 pH를 갖는다. 본 범위에서 pH를 조절할 수 있는 완충제의 비-제한 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 석시네이트, 및 암모늄 완충제 뿐만 아니라, 이들의 조합물을 포함한다. 용어 "pH-조절제"는 수용액에서 약 1.0 내지 약 14.0의 선택된 pH를 생성시킬 수 있는 완충제 용액이다. pH-조절제는 아세테이트 완충제, 예컨대, NaAc 및/또는 HAc, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제액, 또는 Tris-HCl일 수 있다.

용어 "세척 완충제"는 샘플 로딩(sample loading) 후 및 용리 전에 크로마토그래피 컬럼을 세척하기 위해서 사용되는 완충제를 나타낸다.

용어 "용리 완충제"는 고형상으로부터 표적 단백질을 용리시키기 위해서 사용되는 완충제를 나타낸다. 용리 완충제의 전도성 및/또는 pH는 일반적으로는 표적 단백질이 크로마토그래피 수지로부터 용리되게 한다.

재료

소듐 아세테이트 트리하이드레이트, 소듐 클로라이드, 소듐 하이드록사이드, 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄, 소듐 디하이드로겐 포스페이트 및 디소듐 포스페이트를 Merck(Darmstadt, Germany)로부터 구매하였다. 아세트산, L-히스티딘, L-히스티딘 모노하이드로클로라이드, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-시스테인, 세린, 프롤린 및 염산(6.0N 용액)을 J. T. Baker, Millipore(Bedford, MA, America)로부터 구매하였다. 이미다졸을 Sigma(Saint Louis, America)로부터 구매하였다.

장비

Unicorn 소프트웨어 버젼 6.3(Unicorn software version 6.3)((GE Healthcare, Uppsala, Sweden))이 설치된 AKTA 퓨어 150 시스템(AKTA pure 150 system)을 모든 크로마토그리피 가동을 위해서 사용하였다. pH 및 전도성을 SevenExcellence S470 pH/전도성 계량기(Mettler-Toledo, Columbus, OH, USA)를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도를 NanoDrop One 분광계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. Agilent 1260 액체 크로마토그래피 장비(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 SEC-HPLC 분석을 위해서 사용하였다.

방법

단백질 A/Capto Blue 크로마토그래피

Eshmuno A(단백질 A 친화성 매질)/Capto Blue(high-sub)를 15 cm 층 높이를 갖는 0.5 cm 직경 컬럼에 충진하였다. 컬럼 부피(CV)는 약 3 ml이었다. 로드(load)는 정화된 배양 채취물(culture harvest)이다. 모든 가동을 위해서 컬럼을 로딩(loading)하고 결합-용리 모드(bind-elute mode)로 가동시켰다. 표적 단백질을 용리 완충제로 용리시켰다. 모든 가동을 위해서, 샘플 로딩 후에, 컬럼을 상이한 완충제로 용리 전에 3 CV에 대해서 세척하였다. 모든 크로마토그래피 가동을 위해서, 시스템을 180 cm/hr(체류 시간: 5 min)의 유속으로 가동시켰다. 모든 크로마토그램을 280 nm에서 UV 흡광도를 모니터링함으로써 기록하였다. 선택된 가동으로부터의 용리물을 분획들로 수거하고 모노머 순도를 위한 SEC-HPLC, HCP 및/또는 PLBL2 분석에 의해 분석하였다.

크기-배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)

모든 샘플을 Tosoh TSKgel G3000SWxl 스테인리스 스틸 컬럼(7.8 x 300 mm)을 사용하여 분석하였다. 100 μg의 샘플을 가동 당 주입하였다. 이동상은 pH 6.8의 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로라이드로 이루어진다. 각각의 샘플을 1.0 mL/min의 유속에서 20 분 동안 등용매 용리시켰다. 단백질 용리물을 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 모니터링하였다. 모노머 및 응집물에 상응하는 피크를 적분하여 각각의 종의 백분율을 계산하였다.

숙주 세포 단백질(HCP) 분석

잔류 CHO 숙주 세포 단백질의 측정은 Cygnus Technologies로부터의 CHO 숙주 세포 단백질 F550 키트를 사용하여 달성된다. CHO HCP를 함유하는 샘플은 HRP 표지된 항-CHO 항체 및 마이크로 역가 스트립에 코팅된 캡처 항-CHO 항체(capture anti-CHO antibody)와 동시에 반응한다. 면역학적 반응은 고형상 항체-HCP-효소 표지된 항체의 샌드위치 복합체(sandwich complex)의 형성을 초래한다. 이어서, 기질, TMB를 HRP과 반응시킨다. 반응을 종료하고 450 nm 및 650 nm에서 OD 값을 읽었다. 측정된 OD 값은 샘플에 존재하는 잔류 CHO 숙주 세포 단백질의 수준을 측정하기 위한 샘플에 존재하는 CHO HCP의 농도와 직접 비례한다.

햄스터 포스포리파아제 B-유사 2(Hamster phospholipase B-like 2; PLBL2) 분석

샘플을 MyBioSource로부터의 햄스터 포스포리파아제 B-유사(PLBL2) ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 이러한 분석에서, 샘플에 존재하는 PLBL2는 폴리스티렌 미세역가 웰(polystyrene microtiter well)의 표면에 흡착된 항-PLBL2 항체와 반응한다. 세척에 의한 미결합된 단백질의 제거 후에, 검출 항체, 비오틴 컨주게이션된 항-PLBL2(biotin conjugated anti-PLBL2)를 첨가하고 복합체를 형성시켰다. 세척 단계 후에, 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP) 컨주게이션된 스트렙타비딘(Streptavidin)을 첨가하고 복합체를 형성시켰다. 또 다른 세척 단계 후에, 복합체를 TMB의 첨가에 의해 분석하였다. 시험 샘플 중의 PLBL2의 양은 표준으로부터 구성된 표준 곡선으로부터 보간(interpolate)될 수 있고, 샘플 희석을 위해서 보정될 수 있다.

방법

본 개시는,

1) 단백질 샘플을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고,

2) 컬럼을 적어도 하나의 화학식(I)의 화합물 및 pH-조절제를 포함하는 세척 완충제 용액으로 세척하는 단계를 포함하여, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법을 제공한다:

화학식(I)

일 구현예에서, 상기 조성물은 히스티딘 및/또는 이미다졸을 포함한다.

본 개시는 또한,

1) 단백질 샘플을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고,

2) 컬럼을 세린 및/또는 시스테인 및 pH-조절제를 포함하는 세척 완충제 용액으로 세척하는 단계를 포함하여, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피, Capto Blue(High Sub) 크로마토그래피，단백질 G 크로마토그래피，단백질 L 크로마토그래피，Lambda Fab Select 크로마토그래피, Kappa Select 크로마토그래피, lg Select 크로마토그래피, Blue Sepharose 크로마토그래피, Capto Heparin 크로마토그래피, VII Select 크로마토그래피, VIII Select 크로마토그래피, XSelect 크로마토그래피 및 Capto L 크로마토그래피로부터 선택된다.

특이적 일 구현예에서, 세척 완충제 용액의 부피 내의 화합물의 몰 질량의 백분율은 약 100 mM 이상, 바람직하게는 약 100 mM 내지 약 1 M, 더욱 바람직하게는 약 100 mM 내지 약 900 mM, 100 mM 내지 약 800 mM, 100 mM 내지 약 700 mM, 100 mM 내지 약 600 mM, 100 mM 내지 약 500 mM, 100 mM 내지 약 400 mM, 100 mM 내지 약 300 mM, 100 mM 내지 약 200 mM, 200 mM 내지 약 1 M, 300 mM 내지 약 1 M, 400 mM 내지 약 1 M, 500 mM 내지 약 1 M, 600 mM 내지 약 1 M, 700 mM 내지 약 1 M, 800 mM 내지 약 1 M, 900 mM 내지 약 1 M, 250 mM 내지 약 750 mM, 또는 500 mM이다.

특이적 일 구현예에서, 세척 완충제 용액의 pH는 약 pH5.5 이하, pH5 이하, pH4.5 이하, pH4 이하, pH3.5 이하, pH3 이하이다.

또 다른 구현예에서, 상기 언급된 방법은 단계 2) 후의 용리 단계를 포함하지 않는다.

특이적 일 구현예에서, 단백질 샘플은 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 또는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 단백질 A에 의해 인식 가능한 Fc 도메인을 함유하는 Fc-융합 단백질이다. Fc-융합 단백질은 목적한 펩타이드 또는 단백질에 결합된 IgG의 Fc 도메인으로 구성된다. 또 다른 특이적 일 구현예에서, 융합 단백질은 HAS(인간 혈청 알부민)-융합 단백질이다. HAS-융합 단백질은 목적한 펩타이드 또는 단백질에 결합된 HAS로 구성된다.

조성물

일 양태에서, 본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 조성물로서, 적어도 하나의 화학식(I)의 화합물을 포함하는, 조성물을 제공한다:

화학식(I)

상기 식에서, R¹은 H 또는 C_1-6 알킬이고; 여기에서, C_1-6 알킬은 치환되지 않거나 카르복시, 아미노, 수소 또는 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개 또는 3개의 치환체에 의해 치환된다. 일 구현예에서, R¹은 H이고, 상기 화합물은 이미다졸이다. 일 구현예에서, R¹은 카르복시 및 아미노에 의해 치환된 C₃ 알킬이다. 일 구현예에서, 조성물은 히스티딘 및/또는 이미다졸을 포함한다.

본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 조성물로서, 세린 및/또는 시스테인을 포함하는, 조성물을 제공한다.

본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 세척 용액의 제조에서의 조성물의 사용을 제공한다.

키트

또 다른 양태에서, 본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 키트로서, 화학식(I)의 화합물을 포함하는 조성물을 포함하는, 키트를 제공한다:

화학식(I)

상기 식에서, R¹은 H 또는 C_1-6 알킬이고; 여기에서, C_1-6 알킬은 치환되지 않거나 카르복시, 아미노, 수소 또는 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개 또는 3개의 치환체에 의해 치환된다. 일 구현예에서, R¹은 H이고, 상기 화합물은 이미다졸이다. 일 구현예에서, R¹은 카르복시 및 아미노에 의해 치환된 C₃ 알킬이다. 일 구현예에서, 조성물은 히스티딘 및/또는 이미다졸을 포함한다. 일 구현예에서, 친화성 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피, Capto Blue (High Sub) 크로마토그래피，단백질 G 크로마토그래피，단백질 L 크로마토그래피，Lambda Fab Select 크로마토그래피, Kappa Select 크로마토그래피, lg Select 크로마토그래피, Blue Sepharose 크로마토그래피, Capto Heparin 크로마토그래피, VII Select 크로마토그래피, VIII Select 크로마토그래피, XSelect 크로마토그래피 및 Capto L 크로마토그래피로부터 선택된다. 일 구현예에서, 키트는 추가로 pH-조절제를 포함한다. 일 구현예에서, pH-조절제는 아세테이트 완충제, 예컨대, NaAc 및/또는 HAc, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 또는 Tris-HCl을 포함한다.

본 개시는 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키기 위한 키드로서, 세린 및/또는 시스테인을 포함하는, 키트를 제공한다.

실시예

실시예 1: 다른 세척 용액에 대한 히스티딘 세척 용액의 비교

미국 특허 제6,090,382호에 개시된 바와 같은 항-hTNFα를 발현시키기 위한 cDNA 서열을 각각 블라스티사이딘(Blasticidin) 및 제오신(Zeocin) 내성 마커를 함유한 두 벡터내로 클로닝시켰다. 안정한 형질감염을 리포솜을 사용하여 수행하였다. 형질감염 후에, 세포를 푸울 선택(pool selection)을 위한 선택적 배지(9 μg/mL 블라스티사이딘 및 400 μg/mL 제오신을 함유하는 CD CHO 배지)에서 계대배양하였다. 약 2 주의 푸울 선택 후에, 푸울을 FACS 소팅(FACS sorting)에 의해 클로닝시켰다. 클론을 스핀 튜브(spin tube) 내의 페드-배치 배양물(fed-batch culture)에 의해 스크리닝하였다. 선택된 세포 클론을 배양하고, 채취물을 항-hTNFα IgG4 함유 세포 배양물로부터 정화시켰다.

본 실시예에서는, 친화성 크로마토그래피 동안의 IgG4 (항-hTNFα) 함유 세포 배양물로부터 불순물의 제거에 대한 히스티딘 함유 세척 용액의 효과가 분석된다. 구체적으로는, 세 개의 세척 용액을 비교하였다: pH 5.5의 1 M NaCl을 함유한 첫 번째 세척 용액, pH 5.5의 0.5 M 히스티딘을 함유한 두 번째 세척 용액, pH 5.5의 0.5 M 아르기닌을 함유한 세 번째 세척 용액.

IgG4를 함유하는 세포 배양물 상청액으로부터의 정화된 채취물을 원심분리에 의해 채취하고, 이하 표 1에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다. 로드 용량(load capacity)은 30 g/L이다.

[표 1]

단백질 A 컬럼을 위한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 표 2에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 표 2에 나타내어져 있다.

[표 2]

제2 세척을 위한 다양한 성분을 갖는 세척 용액

세 가지의 상이한 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 표 3에 나타내어져 있다.

[표 3]

다른 세척 용액에 대한 히스티딘 세척 용액의 비교

표 3에 나타낸 바와 같이, 결과는 상이한 세척 2 용액이 더 높은 생성물 회수율을 유지하면서 단계 수율 및 응집물 수준에 영향을 주지 않음을 입증하고 있다. 또한, NaCl 세척은 대조군에 비해 HCP에서 유의미한 감소를 나타내지 않음을 주지해야 한다. 그러나, 히스티딘 및 아르기닌 세척 용액은 NaCl 세척 및 대조군에 비해 유의미한 HCP 및 PLBL2 제거를 나타냈다. 더욱이, 히스티딘은 아르기닌 용액에 의한 HCP 제거에서 유사한 능력을 나타낸 반면에, 히스티딘 세척은 아직 보고되지 않았다. 구체적으로는, 히스티딘 세척은, 대조군에 비해 2.5-배의 HCP 감소를 제공하면서, > 95%의 허용 가능한 회수율을 초래한다.

실시예 2: 세척 용액 중의 다양한 히스티딘 농도의 비교

본 실시예에서, 친화성 크로마토그래피 동안의 IgG4-함유 세포 배양물로부터의 불순물의 제거에 대한 히스티딘-함유 세척 용액의 농도 효과가 조사된다. 세척 2 용액 중의 히스티딘의 4 가지 상이한 농도가 비교된다.

IgG4를 함유한 정화된 세포 배양물 상청액을 원심분리에 의해 채취하고, 표 2에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다.

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 이하 표 5에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 표 4에 나타내어져 있다.

[표 4]

세척 2를 위한 다양한 히스티딘 농도를 갖는 세척 용액

4 가지의 상이한 농도의 히스티딘-함유 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 표 5에 나타내어져 있다.

[표 5]

세척 2를 위한 다양한 히스티딘 농도의 비교

표 5에 나타낸 바와 같이, 결과는 히스티딘 함유 용액이 비-히스티딘 함유 완충제에 비해 수율에 영향을 주지 않음을 입증하고 있다. 또한, 히스티딘 용액은 HCP 및 PLBL2를 제거하는데 있어서 효율적임이 입증된다. 세척 용액의 더 높은 히스티딘 농도는 용리액 푸울 중의 더 낮은 HCP 및 PLBL2를 초래한다. 구체적으로는, 700 mM의 높은 농도의 히스티딘-함유 세척 용액의 사용은 pH 5.5의 비-히스티딘 함유 완충제에 비해 HCP의 3-배 감소, PLBL2의 적어도 4-배 감소를 초래한다.

실시예 3: 세척 용액 중의 다양한 이미다졸 농도의 비교

본 실시예에서, 친화성 크로마토그래피 동안의 IgG4-함유 세포 배양물로부터의 불순물의 제거에 대한 이미다졸-함유 세척 완충제의 농도 효과가 조사된다. 4 가지 상이한 농도의 세척 용액이 비교된다.

IgG4를 함유한 정화된 세포 배양물 상청액을 원심분리에 의해 채취하고, 표 6에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다.

[표 6]

단백질 A 컬럼에 대한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 이하 표 7에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 동일한 세포주에 대해서 전개된 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 표 8에 나타내어져 있다.

[표 7]

세척 2를 위한 다양한 이미다졸 농도의 세척 용액

4 가지의 상이한 농도의 히스티딘-함유 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 표 8에 나타내어져 있다.

[표 8]

세척 용액 중의 다양한 이미다졸 농도의 비교

표 8에 나타낸 바와 같이, 결과는 이미다졸을 함유하는 세척 용액이 비-이미다졸 함유 완충제에 비해 단계 수율에 영향을 주지 않음을 입증하고 있다. 또한, 이미다졸-함유 용액은 HCP 및 PLBL2를 제거하는데 있어서 효율적임이 입증된다. 더 높은 이미다졸 농도의 세척 용액은 용리액 푸울 중의 더 낮은 HCP를 초래한다. 구체적으로는, 700 mM의 높은 농도의 이미다졸-함유 세척 용액의 사용은 pH 5.5의 비-이미다졸 함유 완충제에 비해 HCP의 3-배 감소, PLBL2의 적어도 4-배 감소를 초래한다. 마지막 표에서 나타낸 데이터와 비교하여, 이미다졸(방향족 헤테로사이클, 히스티딘의 작용기)은 HCP를 제거하는데 있어서 히스티딘보다 더 효율적임이 명백하다.

실시예 4: 히스티딘-함유 세척 용액 중의 산성 내지 염기성 pH 및 생리학적 pH의 비교

본 실시예에서, 친화성 크로마토그래피 동안의 IgG4-함유 세포 배양물로부터의 불순물의 제거에 대한 이미다졸-함유 세척 완충제의 pH 효과가 조사된다. 구체적으로는, 4 가지 상이한 pH의 세척 용액이 비교된다.

IgG4를 함유한 정화된 세포 배양물 상청액을 원심분리에 의해 채취하고, 이하 표 9에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다.

[표 9]

단백질 A 컬럼을 위한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 이하 표 10에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 이하 표 10에 나타내어져 있다.

[표 10]

다양한 pH 값을 갖는 히스티딘 함유 세척 용액

3 가지의 상이한 pH의 히스티딘-함유 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 표 11에 나타내어져 있다.

[표 11]

히스티딘-함유 세척 용액 중의 산성 내지 염기성 pH 및 생리학적 pH의 비교

표 11에 나타낸 바와 같이, 산성(pH 5.0)으로부터 염기성(pH 9.0)으로의 pH의 변화는 비-히스티딘 함유 세척 용액에 비해 수율 및 응집물 수준에 영향을 주지 않는다. 히스티딘-기반 용액은 낮은 pH에서 HCP를 제거하는데 있어서 유의미하게 효과적임이 입증되어서, 친화성 크로마토그래피에 대한 산성 pH의 히스티딘-함유 세척 용액의 효능을 강조하고 있다. 더욱이, 이러한 경우에, 히스티딘 단독이 요망되는 HCP 감소를 초래하며, 이는 낮은 pH를 갖는 조성물에서만 효과적임이 명확하다.

실시예 5: 이미다졸-함유 세척 완충제 중의 산성 내지 염기성 pH 및 생리학적 pH의 비교

IgG4를 함유한 정화된 세포 배양물 상청액을 원심분리에 의해 채취하고, 표 12에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다.

[표 12]

단백질 A 컬럼을 위한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 이하 표 14에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 이하 표 13에 나타내어져 있다.

[표 13]

다양한 pH 값을 갖는 이미다졸 함유 세척 용액

3 가지의 상이한 pH의 히스티딘-함유 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 표 14에 나타내어져 있다.

[표 14]

이미다졸-함유 세척 용액 중의 산성 내지 염기성 pH 및 생리학적 pH의 비교

표 14에 나타낸 바와 같이, 산성(pH 5.0)으로부터 염기성(pH 9.0)으로의 pH의 변화는 비-이미다졸 함유 세척 용액에 비해 수율 및 응집물 수준에 영향을 주지 않는다. 이미다졸-기반 용액은 낮은 pH에서 HCP를 제거하는데 있어서 유의미하게 효과적임이 입증되어서, 친화성 크로마토그래피에 대한 산성 pH의 이미다졸-함유 세척 용액의 효능을 강조하고 있다. 더욱이, 이러한 경우에, 이미다졸 단독이 요망되는 HCP 감소를 초래하며, 이는 낮은 pH를 갖는 조성물에서만 효과적임이 명확하다.

실시예 6: 다른 아미노산 세척에 대한 히스티딘 세척 용액의 비교

본 실시예에서, 친화성 크로마토그래피 동안의 IgG4-함유 세포 배양물로부터의 불순물의 제거에 대한 히스티딘-함유 세척 용액의 효과가 분석된다. 구체적으로는, 7 가지의 세척 용액이 비교된다.

IgG4를 함유한 정화된 세포 배양물 상청액을 원심분리에 의해 채취하고, 이하 표 15에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다.

[표 15]

단백질 A 컬럼에 대한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 표 16에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 이하 표 17에 나타내어져 있다.

[표 16]

제2 세척을 위한 다양한 성분을 갖는 세척 용액

7 가지의 상이한 세척 용액을 사용한 모노클로날 항체의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 이하 표 17에 나타내어져 있다.

[표 17]

IgG4 항체에 대한 상이한 세척 용액의 비교

표 17에 나타낸 바와 같이, 결과는 히스티딘 및 아르기닌이 대조군에 비해 유의미한 HCP 제거를 나타냄을 입증하고 있다. 또한, 시스테인 및 세린이 또한 대조군에 비해 HCP 제거를 나타냈다.

실시예 7: 이중특이적 항체에 대한 상이한 세척 용액의 비교

WO 2019/057124A1에 개시된 바와 같은 이중특이적 항-CD3 × CD19 항체를 발현시키기 위한 cDNA 서열을 각각 블라스티사이딘 및 제오신 내성 마커를 함유한 두 벡터내로 클로닝시켰다. 안정한 형질감염을 리포솜을 사용하여 수행하였다. 형질감염 후에, 세포를 미니푸울 선택(minipool selection)을 위한 선택적 배지(9 μg/mL 블라스티사이딘 및 400 μg/mL 제오신을 함유하는 CD CHO 배지) 중의 96-웰 플레이트에 평판시켰다. 약 2 주의 미니푸울 선택 후에, 높은-생성 미니푸울(high-producing minipool)들을 개별적으로 팽창시켰다. 미니푸울을 1 라운드의 FACS에 의해 클로닝시켰다. 클론을 스핀 튜브 내의 페드-배치 배양물(fed-batch culture)에 의해 스크리닝하였다. 선택된 세포 클론을 배양하고, 채취물을 이중특이적 항-CD3 × CD19 항체 함유 세포 배양물로부터 정화시켰다.

본 실시예에서는, 친화성 크로마토그래피 동안의 이중특이적 항체 함유 세포 배양물로부터 불순물의 제거에 대한 히스티딘/이미다졸-함유 세척 완충제의 효과가 분석된다.

이중특이적 항체를 함유한 정화된 세포 배양물 상청액을 여과에 의해 채취하고, 이하 표 18에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다.

[표 18]

단백질 A 컬럼을 위한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 표 19에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 이하 표 19에 나타내어져 있다.

[표 19]

제2 세척을 위한 다양한 성분을 함유한 세척 용액

상이한 세척 용액을 사용한 이중 특이적 항체의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 이하 표 20에 나타내어져 있다.

[표 20]

정제 공정 성능에 대한 세척 용액 성분들의 비교

표 20에 나타낸 바와 같이, 결과는 상이한 세척 2 용액들이, 더 높은 생성물 회수율을 유지시키면서, 단계 수율 및 응집물 수준에 영향을 주지 않음을 입증하고 있다. 500 mM의 농도의 히스티딘-함유 세척 용액의 사용은 대조군에 비해 HCP의 2.5-배 감소, PLBL2의 2-배 감소를 초래한다.

실시예 8：다른 세척 용액에 대한 히스티딘/이미다졸 세척 용액의 비교

PD1을 표적하는 모노클로날 항체(Keytruda)를 발현시키기 위한 cDNA 서열이 특허 출원 번호 WO2008/156712 A에서 개시되어 있다. VEGF를 표적하는 융합 단백질(Eylea)을 발현시키기 위한 cDNA 서열이 미국 특허 제7,070,959B1에 개시되어 있다. cDNA 서열을 각각 블라스티사이딘 및 제오신 내성 마커를 함유한 두 벡터내로 클로닝시켰다. 안정한 형질감염을 리포솜을 사용하여 수행하였다. 형질감염 후에, 세포를 푸울 선택(pool selection)을 위한 선택적 배지(9 μg/mL 블라스티사이딘 및 400 μg/mL 제오신을 함유하는 CD CHO 배지)에서 계대배양하였다. 약 2 주의 푸울 선택 후에, 푸울을 FACS 소팅(FACS sorting)에 의해 클로닝시켰다. 클론을 스핀 튜브 내의 페드-배치 배양물에 의해 스크리닝하였다. 선택된 세포 클론을 배양하고, 채취물을 항-PD1 IgG4 또는 항-VEGF 융합 단백질 함유 세포 배양물로부터 정화시켰다.

본 실시예에서는, 친화성 크로마토그래피 동안의 항-PD1 IgG4 또는 항-VEGF 융합 단백질 함유 세포 배양물로부터의 정화된 채취물로부터 불순물의 제거에 대한 이미다졸 함유 세척 용액의 효과가 분석된다. 구체적으로는, 네 개의 세척 용액을 비교하였다: pH 5.5의 1 M NaCl을 함유한 첫 번째 세척 용액, pH 5.5의 0.5 M 히스티딘을 함유한 두 번째 세척 용액, pH 5.5의 0.5 M 아르기닌을 함유한 세 번째 세척 용액, pH 5.5의 0.5 M 이미다졸을 함유한 네 번째 세척 용액.

항-PD1 IgG4 또는 항-VEGF 융합 단백질를 함유하는 세포 배양물 상청액으로부터의 정화된 채취물을 원심분리에 의해 채취하고, 이하 표 21에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, 단백질 A 컬럼(Millipore, Eshmuno A, 1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다. 로드 용량(load capacity)은 항-PD1 IgG4의 경우에 30 g/L이고, 항-VEGF 융합 단백질의 경우에 19 g/L이다.

[표 21]

단백질 A 컬럼을 위한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 표 22 또는 표 23에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 세척하였고, 이어서, 낮은 pH에서 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 항체 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 표 22 또는 표 23에 나타내어져 있다.

[표 22]

제2 세척을 위한 다양한 성분을 함유한 세척 용액(항-PD1 IgG4)

[표 23]

제2 세척을 위한 다양한 성분을 함유한 세척 용액(항-VEGF 융합 단백질)

네 개의 상이한 세척 용액을 사용한 항-PD1 IgG4 및 항-VEGF 융합 단백질의 단백질 A 정제에 대한 공정 성능이 표 24 및 표 25에 별도로 나타내어져 있다.

[표 24]

다른 세척 용액에 대한 히스티딘 세척 용액의 비교(항-PD1 IgG4)

[표 25]

다른 세척 용액에 대한 히스티딘 세척 용액의 비교(항-VEGF 융합 단백질)

표 24 및 표 25에 나타낸 바와 같이, 결과는 상이한 세척 2 용액들이, 더 높은 생성물 회수율을 유지시키면서, 단계 수율 및 응집물 수준에 영향을 주지 않음을 입증하고 있다. 또한, NaCl 세척은 대조군에 비해 HCP에서 유의미한 감소를 나타내지 않음을 주지해야 한다. 그러나, 히스티딘 및 이미다졸 세척 용액은 NaCl 세척 및 대조군에 비해 유의미한 HCP 제거를 나타냈다. 더욱이, 히스티딘 및 이미다졸은 아르기닌 용액에 의한 HCP 제거에서 유사한 능력을 나타냈다.

실시예 9: HSA (인간 혈청 알부민) 융합 단백질에 대한 상이한 세척 용액의 비교

미국 특허 출원 제15/557358호에 개시된 바와 같은 항-CD40 HSA 융합 단백질을 발현시키기 위한 cDNA 서열(SEQ ID NO: 145 참조)을 클로닝시키고, 래트(rat)에서 훈련된 기술들과 친숙한 기술을 이용하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현시킨다.

본 실시예에서는, 친화성 크로마토그래피 동안에 HSA 융합 단백질-함유 세포 배양물로부터의 불순물의 제거에 대한 히스티딘 또는 이미다졸-함유 세척 완충제의 농도 및 pH 효과가 조사된다. 구체적으로는, 상이한 pH를 갖는 4 개의 상이한 농도의 세척 용액(0.1M, 0.3M, 0.5M, 및 0.7M)이 비교된다.

HSA 융합 단백질을 함유하는 정화된 세포 배양물 상청액을 원심분리 + 심층 여과에 의해 채취하고, 표 26에 기재된 조건에 따라서 AC 컬럼, 특히, Capto Blue(High Sub) 컬럼(1 CV: 3 mL)을 사용하여 정제하였다.

[표 26]

Capto Blue 컬럼을 위한 작동 조건

평형된 컬럼에 정화된 채취물을 로딩하고, 먼저, 세척 1 용액, 이어서, 이하 표 27에 기재된 세척 2 용액에 의한 제2 세척으로 그리고 제3 세척으로 세척하였고, 이어서, 용리 완충제로 용리시켰다. 용리액을 UV 280에 의한 이의 농도, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 HMW/LMW, 및 효소-결합 면역흡착 측정법에 의한 HCP 함량에 대해서 분석하였다. 제2 세척에 비교한 다양한 세척 용액이 표 27에 기재되어 있다.

[표 27]

세척 2 (HSA 융합 단백질)에 대한 다양한 히스티딘/이미다졸 농도/pH를 갖는 세척 용액

네 가지의 상이한 농도의 히스티딘 또는 이미다졸-함유 세척 용액을 사용한 HAS-융합 단백질의 Capto Blue 정제에 대한 공정 성능이 이하 표 28에 나타내어져 있다.

[표 28]

세척 용액 중의 다양한 히스티딘/이미다졸 농도/pH의 비교

표 28에 나타낸 바와 같이, 결과는 히스티딘 및 이미다졸 용액이 HCP를 제거하는데 있어서 유의미하게 효율적임을 입증하고 있다. 더 높은 히스티딘 및 이미다졸 농도의 세척 용액은 용리액 푸울에서 더 낮은 HCP를 초래한다. 히스티딘 또는 이미다졸을 함유하는 더 높은 세척 용액 pH는 용리액 푸울에서 더 낮은 HCP를 초래하지만, 더 낮은 단계 수율을 초래한다.

Claims

친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법으로서,
1) 단백질 샘플(protein sample)을 친화성 크로마토그래피 컬럼(affinity chromatography column)에 로딩(loading)하고,
2) 컬럼을 화학식(I)의 화합물 및 pH-조절제(pH-adjusting agent)를 포함하는 세척 완충제 용액(wash buffer solution)으로 세척하는 단계를 포함하여, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법:
[화학식(I)]

상기 식에서, R¹은 H 또는 C_1-6 알킬이고; 여기에서, C_1-6 알킬은 치환되지 않거나 카르복시, 아미노, 수소 또는 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개 또는 3개의 치환체에 의해 치환된다.
청구항 1에 있어서,
화합물이 히스티딘 또는 이미다졸인, 방법.
친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법으로서,
1) 단백질 샘플을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고,
2) 컬럼을 세린 및/또는 시스테인 및 pH-조절제를 포함하는 세척 완충제 용액으로 세척하는 단계를 포함하여, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는 방법:
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
친화성 크로마토그래피가 단백질 A 크로마토그래피(Protein A chromatography), Capto Blue (High Sub) 크로마토그래피，단백질 G 크로마토그래피，단백질 L 크로마토그래피，Lambda Fab Select 크로마토그래피, Kappa Select 크로마토그래피, lg Select 크로마토그래피, Blue Sepharose 크로마토그래피, Capto Heparin 크로마토그래피, VII Select 크로마토그래피, VIII Select 크로마토그래피, XSelect 크로마토그래피 및 Capto L 크로마토그래피로부터 선택되는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
pH-조절제가 아세테이트 완충제, 예컨대, NaAc 및/또는 HAc, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, Tris-HCl 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
세척 완충제 용액의 부피 내의 화합물의 몰 질량(molar mass)의 백분율이 약 100 mM 이상, 바람직하게는 약 100 mM 내지 약 1 M, 더욱 바람직하게는 약 300 mM 내지 700 mM인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
세척 완충제 용액의 pH가 약 pH 5.5 이하인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
단계 2) 후의 용리 단계(elution step)를 추가로 포함하지 않는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
단백질 샘플이 Fc 도메인(domain)을 포함하는 항체이거나 융합 단백질이고, 바람직하게는 융합 단백질이 Fc-융합 단백질 또는 HAS-융합 단백질인, 방법.
청구항 9에 있어서,
Fc-융합 단백질이 목적한 펩타이드 또는 단백질에 결합된 IgG의 Fc 도메인으로 구성되는, 방법.
청구항 9에 있어서,
HAS-융합 단백질이 목적한 펩타이드 또는 단백질에 결합된 HAS로 구성되는, 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
불순물이 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는, 방법.
친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는데 사용하기 위한, 적어도 하나의 화학식(I)의 화합물 및 pH-조절제를 포함하는 조성물 또는 키트(kit):
화학식(I)

상기 식에서, R¹은 H 또는 C_1-6 알킬이고; 여기에서, C_1-6 알킬은 치환되지 않거나 카르복시, 아미노, 수소 또는 하이드록시로부터 독립적으로 선택된 1개 또는 2개 또는 3개의 치환체에 의해 치환되고; 바람직하게는, 상기 화합물은 히스티딘 또는 이미다졸이다.
친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에서 불순물 제거를 개선시키는데 사용하기 위한, 세린 및/또는 시스테인 및 pH-조절제를 포함하는 조성물 또는 키트.