KR20220125519A

KR20220125519A - 동물세포의 배양 및 분석시스템

Info

Publication number: KR20220125519A
Application number: KR1020210029455A
Authority: KR
Inventors: 김철
Original assignee: 김철
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-09-14

Abstract

본 발명의 동물세포의 배양 및 분석시스템은 웰플레이트를 내장하는 챔버와; 상기 챔버를 포함한 이산화탄소 배양기와; 상기 웰플레이트에 빛은 조사하는 광학필터를 포함한 LED 조명장치와; 상기 웰플레이트에 탑재된 동물세포들을 전체적으로 또는 부분적으로 관찰하는 도립현미경과; 상기 도립현미경을 통해서 얻어진 이미지를 촬영하는 카메라와; 상기 카메라에서 촬영된 이미지를 적어도 하나 이상의 디지털 이미지를 유선 또는 무선으로 전송하는 제어부를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 챔버는 상부챔버와 하부챔버로 구성되고, 상기 상부챔버위에 패턴 글라스와 글라스 히팅보드가 적층되고, 상기 패턴 글라스는 저항을 통하여 열을 발생시켜서 결로를 제거하는 것을 특징으로 한다
본 발명에 의하면, 웰플레이트에 탑재된 동물세포의 배양을 관찰하거나 실시간으로 세포의 동태 이미지를 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 원격으로 동물세포의 배양상태를 실시간으로 분석할 수 있는 장점이 있다.

Description

동물세포의 배양 및 분석시스템{Incubation and Analysis System for Animal Cells}

본 발명은 동물세포의 배양 및 분석시스템에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 세포를 분석하거나 세포 배양과정을 모니터링(monitering)할 수 있는 장치로, 전체 웰(well)을 거시적으로 관찰하거나 하나의 웰의 관심영역을 고배율로 미시적으로 모니터링할 수 있는 동물세포 배양 및 분석 시스템에 관한 기술이다.

동물세포 배양이란 체외에서 인공적으로 체내와 유사한 조건을 제공하여 세포를 대량 증식시키는 것이다. 동물세포를 배양하는 목적은 효소, 호르몬, 백신, 면역 조절인자, 항암제 등 여러 유형의 생산하는 것과 장기나 조직을 만들어 내는 일이다. 유전자 재조합된 기생충을 사용해 생산할 수도 있다. 이때 동물세포는 현탁상태나 단층부착 상태로 생장한다. 동물세포 배양은 기생충이나 식물세포의 배양에 비하여 더 까다로운 편이다.

동물세포를 배양하기 위해서는 동물의 특정 장기 또는 조직에서 떼어 낸 조직들을 처리하여야 한다. 우선 무균상태에서 T-플라스크나 롤러 병 (roller bottle)에서 생장시키는 데 이것을 1차 배양이라 한다. 이때 얻어지는 세포는 1차 배양세포(primary cell line)라 하며 부착의존성 세포(anchorage-dependent cell)이다. 1차 배양은 배지에 의해 크게 영향을 받는다. 처리의 두 번째 단계는 EDTA, 트립신, 콜라게나아제 (collagenase) 등이 포함된 용액을 사용하여 1차 배양세포를 플라스크 표면에서 분리하여 배양하는 것이다. 이때 얻어지는 2차 배양세포(secondary cell line)는 현탁액상에서 자라도록 적응되어진 비부착의존성 (anchorage independent) 세포가 될 수 있다. 하이브리도마 같은 몇몇 동물세포는 부착의존성이 아니며 현탁배양 (suspension culture)에서 생장한다. 배양에 사용되는 동물세포의 형태는 비부착의존성 세포인 림프구 (lymphocyte), 부착의존성 세포인 상피세포(epithelial), 그리고 섬유아세포 (fibroblast)가 있다.

동물세포의 배양에 필요한 장치로는 무균실험대 (clean bench), 이산화탄소 배양기 (CO2 incubator), 원심분리기, 도립현미경 (inverted lens microscope)이 있다.

무균실험대는 동물세포 배양용 배지가 박테리아나 곰팡이 등에 의해 오염되는 것을 방지하기 위해 꼭 필요한 장비이다. 무균실험대는 사용 전후에 70% 에탄올로 내부를 소독하고, 사용하지 않는 동안에는 자외선 살균등 (UV lamp)을 켜서 무균상태를 유지해야한다. 이산화탄소 배양기는 공기에 5%의 이산화탄소가 추가된 기체조성이 유지되도록 고안한 장치로서 대개 100%의 습도와 37℃를 유지한다. 이산화탄소를 공급하는 이유는 배지 내에 있는 탄산 완충용액에 의한 수소이온 농도(pH) 조절을 돕기 위해서이다.

원심분리기는 배지 중에 부유하는 동물세포를 분리하기 위해 사용되며, 분당 3,000 rpm (1,500 g)이내의 범위에서 작동하여 세포가 파괴되지 않도록 한다.

도립현미경은 대물렌즈 (objective lens)가 시료판 아래에 장착되어 있어 배양기 바닥에 부착되어 있는 동물세포의 상태를 관찰하기 위해 사용된다.

종래기술 1은 등록특허공보 제10-1377694호(공고일: 2014. 3. 27) “세포 분석 및 세포배양 모니터링 장치 및 이를 이용한 세포 분석 및 세포배양 모니터링 방법”에 관한 발명이다. 개시된 세포 분석 및 세포배양 모니터링 장치는 세포배양기가 수납되는 지지체 하단부에 M×매트릭스 형태의 카메라 모듈을 구비함으로써 96 웰 플레이트와 같은 다중 웰(well) 세포배양기를 적용하여 다양한 배양 조건 또는 외부 환경 변화 등에 대한 다양한 세포들의 변화를 동시에 분석할 수 있다. 특히 목적하는 특정 부위의 카메라 모듈들만을 선택적으로 스위치온(switch-on)함으로써 부분적 관찰이 가능할 수도 있고, 전체 웰을 거시적으로 관찰하거나 하나의 웰의 관심영역을 고배율로 미시적으로 관찰할 수 있는 특징을 가진다. 실시간으로 세포의 동태 이미지를 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 분석 및 배양을 수행하는 동안 오염의 문제를 해결하고 원격으로 배양상태를 실시간으로 체크하고 필요 시 특정 작동을 하도록 제어할 수 있다.

종래기술 2는 등록특허공보 제10-2205900(공고일: 2021. 1. 21.) “분석장치 및 분석장치의 카트리지 장착상태를 판단하는 방법”에 관한 발명이다. 개시된 분석장치는 검체가 담기는 웰(well)들을 구비한 카트리지를 장착하는 장착부와, 카트리지의 웰들을 측정하는 측정부와, 측정부에서 측정된 상기 웰들에 대한 측정신호들을 처리하는 연산처리부를 포함하며, 연산처리부는 웰들에 대한 측정신호들의 편차를 이용하여 카트리지의 장착상태를 판단하는 것이 특징이다.

일반적으로 세포는 플라스틱 재질의 용기 또는 유리 접시 들어 있는 배양중에 있는 세포의 관찰은 인큐베이터로부터 플라스틱 재질의 용기 또는 유리 접시 및 플라스크 등을 꺼내어 위상차 현미경 등의 도립형 현미경을 이용한 방법이 적용된다.

그러나 이러한 종래의 배양 중에 있는 세포의 관찰 방법은 가능한 신속히 세포의 관찰을 수행하여야 하며, 관찰 종료 후 세포를 인큐베이터내에 되돌려야하므로 세포의 활성이 손상되는 문제점이 있다. 이는 세포의 활성이 불안정하여 정확한 평가를 수행하는 것이 곤란한 문제를 내포하며, 세포를 인큐베이터로부터 꺼낼 경우 기타 유해물질에 의한 오염을 배제할 수 없다. 또한, 배양 세포는 보통 무색투명에 가까워 투과형 현미경에서는 관찰이 곤란하다.

또한 종래의 인큐베이터는 배양과정 중에 있는 세포를 관찰하거나 이미지화하기 위해서는 인큐베이터 및 세포 배양용기를 모두 개방하여야 하기 때문에 배양조건을 무너지게 하여 실시간 세포의 배양과정을 관찰하거나 이미지화할 수 없는 문제점이 존재하고, 측정자의 전문성에 의존하게 되어 측정자에 따른 편차가 발생한다. 따라서 세포 분화 과정을 분석하는 것이 필수적으로 요청되는 줄기세포 등의 세포 배양과정을 실시간으로 관찰하기 위해서는, 기존 장비의 문제점들을 해소하고 용이하게 실시간 세포의 배양과정을 관찰하거나 이미지화할 수 있는 새로운 시스템의 개발이 요청되었다. 이에 본 발명은 새로운 구조의 세포 분석 및 세포배양 모니터링 장치를 제작함으로써 다양한 조건에서 많은 다른 종류의 세포들의 분석할 수 있도록 하는 세포의 배양 및 분석시스템에 관한 것이다.

등록특허공보 제10-1377694호 등록특허공보 제10-0567535호 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0013857호 미국 공개특허공보 20130038717호

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 종래기술의 문제점들을 해소하고 웰플레이트에서 배양되는 세포를 실시간으로 세포의 동태 이미지를 분석할 수 있고, 원격으로 배양 상태를 분석할 수 있도록 하는 동물세포의 배양 및 분석시스템을 제공하는 데에 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 동물세포의 배양 및 분석시스템은 웰플레이트를 내장하는 챔버와; 상기 챔버를 포함한 이산화탄소 배양기와; 상기 웰플레이트에 빛은 조사하는 광학필터를 포함한 LED 조명장치와; 상기 웰플레이트에 탑재된 동물세포들을 전체적으로 또는 부분적으로 관찰하는 도립현미경과; 상기 도립현미경을 통해서 얻어진 이미지를 촬영하는 카메라와; 상기 카메라에서 촬영된 이미지를 적어도 하나 이상의 디지털 이미지를 유선 또는 무선으로 전송하는 제어부를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 챔버는 상부챔버와 하부챔버로 구성되고, 상기 상부챔버위에 패턴 글라스와 글라스 히팅보드가 적층되고, 상기 패턴 글라스는 저항을 통하여 열을 발생시켜서 결로를 제거하는 것을 특징으로 한다.

상기 이산화탄소 배양기는 세포의 배양을 위하여 온도, 습도 및 CO2 가스를 공급하기 위하여 상기 챔버 측면에 CO2 가스 주입관, 배양액 공급관, CO2 가스 배출관 및 배양액 배출관을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 웰플레이트에 탑재된 동물세포의 배양을 관찰하거나 실시간으로 세포의 동태 이미지를 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 원격으로 동물세포의 배양상태를 실시간으로 분석할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 배양하는 동물세포를 탑재한 웰플레이트 사시도이다.
도 2는 본 발명의 동물세포의 배양 및 분석시스템에 대한 개략도이다.
도 3은 본 발명의 이산화탄소 배양기 단면도이다.
도 4는 본 발명의 이산화탄소 온도조절장치 단면도이다.
도 5는 본 발명의 동물세포의 배양장치 구조도이다.
도 6은 본 발명의 동물세포의 분석시스템 구성도이다.
도 7은 동물세포를 검출할 수 있는 파라미터를 조절하는 이미지이다.
도 8은 딥러닝(deep learning) 학습 파라미터를 이용하여 검출한 이미지이다.
도 9는 딥러닝 학습 파라미터를 이용하여 검출한 또 다른 이미지이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명의 실시예를 상세하게 설명한다.

도 1은 배양하는 동물세포를 탑재한 웰플레이트 사시도이고, 도 2는 본 발명의 동물세포의 배양 및 분석시스템에 대한 개략도이다. 도 3은 본 발명의 이산화탄소 배양기 단면도이고, 도 4는 본 발명의 이산화탄소 온도조절장치 단면도이다.도 5는 본 발명의 동물세포의 배양장치 구조도이고, 도 6은 본 발명의 동물세포의 분석시스템 구성도이다.

도 1은 배양하는 동물세포를 탑재한 웰플레이트 사시도이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 배양할 동물세포를 탑재한 세포배양용기를 '웰플레이트(well plate' 라 한다. 웰플레이트(1)는 챔버(2) 내에 탑재된다. 상기 챔버(2) 측면에는 CO2 가스 주입관(3), 배양액 공급관(4), CO2 가스 배출관(5) 및 배양액 배출관(6)이 구비된다. 상기 챔버(2)는 상부챔버와 하부챔버로 구분된다. 본 발명의 일 실시예에서 웰플레이트는 4세트가 적재된다.

도 2는 본 발명의 동물세포의 배양 및 분석시스템에 대한 개략도이다.

동물세포의 배양 및 분석시스템은 프레임(27)에 메인베이스(26)가 결합되고, 상기 프레임(27)의 4곳 하단에 바퀴(41)가 장착된다. 상기 프레임(27) 상부에 커버(11)가 구비되고, 상기 프레임(27)의 하단부에 전기장치, 영상전송장치를 포함하는 제어부(40)가 있다. 상기 X 축(20)의 좌측에 기둥(22)과 Y축(21)이 이산화탄소배양기(10)에 결합되고, 상기 X 축(20)의 우측에 기둥(25)과 레일(23)이 이산화탄소배양기(10)에 결합된다. Z축에 있는 이산화탄소 배양기(10)를 중심으로 상부에서는 LED 조명장치(30)가 결합되고, 하단에는 X 축(20)이 있고, 상기 이산화탄소 배양기(10) 하단에는 도립현미경(50)이 X 축(20)위에 장착된다. 상기 LED조명장치(30)에 과학필터(31)가 결합된다.

상기 도립현미경(50) 통해서 얻어진 이미지를 촬영하는 카메라 초점조절장치(24)가 연결된다. 카메라에서 촬영된 이미지를 적어도 하나 이상의 디지털 이미지를 유선 또는 무선으로 전송하는 제어부(40)에 디스플레이부(60)가 연결된다,

상기 디스플레이부(60)는 PC, 휴대용 단말기 또는 스마폰이 될 수 있다.

도 3은 본 발명의 이산화탄소 배양기 단면도이다.

도 3에 도시된 바와 같이, 웰플레이트(1)는 쳄버(2) 안에 탑재된다. 도면 부호 7은 캡톤히터로 챔버(2)의 직사각형 상면부에 내장된다. 도 4는 본 발명의 이산화탄소 온도조절장치 단면도이다.

세포는 인큐베이터(incubator) 내에서 배양된다. 이와 같은 인큐베이터의 내부는 일례로 이산화탄소 농도 5%, 온도 37℃, 습도 60% 이상에 설정되어 세포의 배양에 적당한 환경으로 유지된다. 또한, 인큐베이터 내부에는 동물세포에 양분을 주는 것과 동시에 배양에 적당한 산도(pH)를 지키기 위하여 매일 혹은 수일에 한 번씩 배양액의 교환이 이루어진다.

차가운 이산화탄소(CO2)를 동물세포 배양온도로 조절하여 챔버에 CO2가스를 공급한다. 플라스틱 컵(31) 안에 물(35)이 들어 있고, 히터(30)가 중간에 구비된다.

상기 CO2가스 공급관(32)를 통해서 차가운 CO2 가스가 히터(30)와 물(35)을 통과하여 CO2 가스 주입관(34)으로 나와서 이산화탄소 배양기(10)로 주입된다.

이산화탄소 배양기(10)는 공기에 5%의 이산화탄소가 추가된 기체조성이 유지되도록 고안한 장치로서 대개 100 %의 습도와 37 ℃를 유지한다. 이산화탄소를 공급하는 이유는 배지 내에 있는 탄산 완충용액에 의한 수소이온 농도(pH) 조절을 돕기 위해서이다.

도 5는 본 발명의 동물세포의 배양장치 구조도이다. 카버(11)위에 온도센서(16)가 부착되고 챔버(2)는 상부챔버(14)와 하부챔버(15)로 구성된다. 상기 상부챔버(14)위에 패턴이 된 글라스(12)와 글라스 히팅보드(13)가 적층된다. 웰플레이트(1)는 상부챔버(14)와 하부챔버(15)사이에 내장된다.

상기 패턴이 된 글라스(12)는 저항을 통하여 열을 발생시켜서 결로를 제거하는 역할을 한다. 본 발명의 일실시예에서 결로를 제거하는 기술이 특징이다.상기 상부챔버(14)에 캡톤히터를 설치하여 일정한 온도로 히팅할 수 있다.

도 6은 본 발명의 동물세포의 분석시스템 구성도이다.

광원부는 LED 조명장치(30)와 광학필터(31)로 구성된다. 상기 LED 조명장치(30) 하단에 이산화탄소 배양기(10)가 장착된다. LED 조명장치(30)에서 발산된 빛이 광학필터(31)를 통과하여 상기 이산화탄소 배양기(10)를 비춘다.

상기 이산화탄소 배양기(10) 아래에 설치된 도립현미경(50)을 통해서 얻어진 이미지를 카메라(52)가 촬영한다. 상기 도립현미경(50) 상단에 대물렌즈(51)가 부착되고, 내부에는 배율렌즈와 필터가 내장된다. 상기 도립현미경(50)의 대물렌즈(51)가 이산화탄소 배양기(10) 아래에 장착되어 있어 배양기 바닥에 부착되어 있는 동물세포의 상태를 관찰하기 위해 사용된다.

상기 도립현미경(50) 좌측은 Z축으로 영상초점 조절장치(52)가 구비된다.

상기 영상초점조철장치(52)는 개발된 프로그램으로 영상을 판독하여 자동으로 영상 초점을 조절한다. 상기 카메라(52)에서 촬영된 세포이미지 영상은 케이블(54)을 통하여 PC(60)로 전송된다.

동물세포 분석 및 세포배양 모니터링 장치는 세포배양기가 수납되는 지지체 하단부에 M×매트릭스 형태의 카메라 모듈을 구비함으로써 96 웰 플레이트와 같은 다중 웰 세포배양기를 적용하여 다양한 배양 조건 또는 외부 환경 변화 등에 대한 다양한 세포들의 변화를 동시에 분석할 수 있다.

특히 목적하는 특정 부위의 카메라 모듈들만을 선택적으로 스위치온(switch-on)함으로써 부분적 관찰이 가능할 수도 있고, 전체 웰을 거시적으로 관찰하거나 하나의 웰의 관심영역을 고배율로 미시적으로 관찰할 수 있는 특징을 가진다. 실시간으로 세포의 동태 이미지를 관찰할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은, 바람직하게는 자동 이미지 캡처 및 저장이 가능하도록 모니터링 스케줄 프로그램 서비스를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 프로그램된 스케줄을 가지고 장기간 동물세포(배양물)을 관찰할 수 있다

도 7은 동물세포를 검출할 수 있는 파라미터를 조절하는 이미지이고, 도 8은 딥러닝 학습 파라미터를 이용하여 검출한 이미지이고, 도 9는 딥러닝 학습 파라미터를 이용하여 검출한 다른 이미지이다.

도 7은 그림과 같이 촬영된 세포 이미지를 딥러닝 학습기법을 이용하여 활성화된 세포와 비활성화된 세포를 검출할 수 있는 파라미터를 조절하는 이미지이다.

도 8과 도 9는 도 7과 같이, 딥러닝 학습 파라미터를 이용하여 검출한 이미지이다 , 우측의 도면은 딥러닝 학습에 의하여 계수된 이미지를 나타낸 것이다.

도 8와 도 9에서 검출된 이미지의 개수를 파악하여 활성화된 세포의 개수와 비활성화 된 세포의 개수를 PC를 통하여 확인시켜 사용자가 세포의 거동 특성을 쉽게 파악할 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 아니하며 본 발명의 실시예와 실질적으로 균등한 범위에 있는 것까지 본 발명의 권리범위가 미치는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 실시가 가능하다.

1: 웰플레이트 2: 챔버
3: CO2 가스 주입관 4: 배양액 공급관
5: CO2 가스 배출관 6: 배양액 배출관
10: 이산화탄소 배양기 13: 글라스 히팅보드
14: 상부챔버 15: 하부챔버
30: LED 조명장치 40: 제어부
50: 도립현미경 53: 카메라
60: 디스플레이부

Claims

동물세포의 배양 및 분석장치에 있어서,
웰플레이트(1)를 포함하는 챔버(2)와; 상기 챔버(2)를 포함한 이산화탄소 배양기(10)와; 상기 웰플레이트(1)에 빛은 조사하는 광학필터(31)를 포함한 LED 조명장치(30)와; 상기 웰플레이트(1)에 탑재된 동물세포들을 전체적으로 또는 부분적으로 관찰하는 도립현미경(50)과;
상기 도립현미경을 통해서 얻어진 이미지를 촬영하는 카메라(53)와;
상기 카메라(53)에서 촬영된 이미지를 적어도 하나 이상의 디지털 이미지를 유선 또는 무선으로 전송하는 제어부(40)를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양 및 분석시스템.
제1항에 있어서, 상기 챔버(2)는 상부챔버(14)와 하부챔버(15)로 구성되고, 상기 상부챔버(14)위에 패턴 글라스(12)와 글라스 히팅보드(13)가 적층되고, 상기 패턴 글라스(12)는 저항을 통하여 열을 발생시켜서 결로를 제거하는 것을 특징으로 하는 동물 세포의 배양 및 분석시스템.
제2항에 있어서, 상기 상부챔버(14)에 캡톤히터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양 및 분석시스템.
제1항에 있어서, 상기 이산화탄소 배양기(10)는 세포의 배양을 위하여 온도, 습도 및 CO2 가스를 공급하기 위하여 상기 챔버(2) 측면에 CO2 가스 주입관(3), 배양액 공급관(4), CO2 가스 배출관(5) 및 배양액 배출관(6)을 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양 및 분석시스템.
제4항에 있어서, 상기 배양액 공급관(4)에 주입되는 약물은 배양액, 세척액 또는 독성평가용 약물인 것을 특징으로 동물세포의 배양 및 분석시스템.
제1항에 있어서, 상기 카메라(53)는 동물세포의 실시간 거동특성을 확인할 수 있도록 사진을 촬영하거나 동영상을 촬영하는 것을 특징으로 동물세포의 배양 및 분석시스템.
제1항에 있어서, 상기 유선 또는 무선으로 전송된 디지털 이미지를 분석하여 세포계수를 관찰할 수 있는 디스플레이부(60)를 더 포함하는 것을 특징으로 동물세포의 배양 및 분석시스템.
제7항에 있어서, 상기 디스플레이부(60)는 PC 또는 휴대용 단말기인 것을 특징으로 동물세포의 배양 및 분석시스템.